MRSA og antimikrobielle peptiderEmma Paydari Unge Forskere - Life Science Egaa Gymnasium Side 2 af...

MRSA og antimikrobielle peptider

Unge Forskere 2019

Kategori: Life Science

Navn: Emma Paydari

Klasse: 3.Z

Egaa Gymnasium

Emma Paydari Unge Forskere - Life Science Egaa Gymnasium

Side 2 af 73

Abstract

In recent years, the number of people suffering from multi-resistant infections has increased. If new

treatment methods are not developed, many people will die in the future. This paper examines how

bacteria become resistant to antibiotics, and whether antimicrobial peptides (AMPs) can be

alternatives to conventional antibiotics in the future. Furthermore, it examines whether the SIS-

model can be used to describe the spread of MRSA in Denmark.

The paper explains the structure of bacteria, the mechanism of action of antibiotics, resistance of

antibiotics, and the mechanism of action of AMPs against bacteria. Additionally, the paper

investigates the antibacterial effect of novicidin and some antibiotics against E.coli. The

effectiveness of the antibacterial agents is tested by using the disk diffusion method. Novicidin is

also tested by comparing an agar plate with only E.coli, and an agar plate with E.coli and novicidin,

which have been mixed before spreading on the agar plate. Moreover, numerical methods for a

differential equation have been tested in MATLAB. The SIS-model has been examined using real

data of MRSA in Denmark and ODE45 in MATLAB. Finally, the paper discusses the advantages

and challenges of AMPs.

In the experiment novicidin has not displayed antibacterial effect. This may be ascribable to the fact

that novicidin should be examined on minimal media, where there is less chance for binding to

chemical combinations. Among the differential methods, the Runge-Kutta method has been more

precise than Euler’s method and Heun’s method. The modeling shows the generally increasing

MRSA-infections in Denmark from 2007-2018, but it can not show the rise and fall of MRSA-

infections during the period of time. When scientists want to design new AMPs for therapeutic

applications, they have to consider many factors such as the charge, hydrophobicity and length of

the AMPs. However, AMPs are a potential alternative to antibiotics because of their mechanism of

action.

Forsidebillede er hentet fra:

https://www.europeanpharmaceuticalreview.com/news/75642/treatment-for-mrsa-no-longer-more-

costly-than-for-susceptible-staph-aureus-infections/


Side 3 af 73

Indholdsfortegnelse

Abstract .............................................................................................................................................................. 2

Indledning ........................................................................................................................................................... 5

Bakterier ............................................................................................................................................................. 6

Bakteriers opbygning....................................................................................................................................................... 6

Grampositive og gramnegative bakterier ........................................................................................................................ 7

Antibiotika .......................................................................................................................................................... 8

Antibiotikas virkningsmekanismer................................................................................................................................... 8

Antibiotikaresistens ............................................................................................................................................. 9

Bakteriers resistensmekanismer ....................................................................................................................................10

Overførsel af resistens mellem bakterier .......................................................................................................................10

Forebyggelse af resistens ..............................................................................................................................................11

Antimikrobielle peptider ................................................................................................................................... 12

Undersøgelse af novicidins og antibiotikas virkning på E.coli ............................................................................ 14

Metode ...........................................................................................................................................................................14

Resultater .......................................................................................................................................................................15

Diskussion af resultater .................................................................................................................................................17

MRSA ............................................................................................................................................................... 18

Numeriske løsninger af differentialligninger...................................................................................................... 19

Eulers metode ................................................................................................................................................................19

Heuns metode ................................................................................................................................................................21

Runge-Kuttas metode.....................................................................................................................................................22

Numerisk og analytisk løsning af en differentialligning ..................................................................................... 23

Analytisk løsning ...........................................................................................................................................................23

Eulermetoden og skridtlængde ......................................................................................................................................23

Eulers-, Heuns- og Runge-Kuttas metode sammenlignet med analytisk løsning ..........................................................24

Koblede differentialligninger ............................................................................................................................. 26

Forudsætninger for epidemimodeller ................................................................................................................ 27

SIS-modellen ..................................................................................................................................................... 27

Modellering af MRSA-spredning ....................................................................................................................... 30


Side 4 af 73

Undersøgelse af MRSA-spredning med SIS-model .......................................................................................................30

Udviklingen af MRSA-tilfælde i fremtiden ....................................................................................................................33

Vurdering af SIS-modellens anvendelighed ..................................................................................................................35

Vil AMP’er blive alternativ til antibiotika i fremtiden? ..................................................................................... 37

Anticancer peptider ........................................................................................................................................... 38

Konklusion ........................................................................................................................................................ 40

Videre arbejde................................................................................................................................................... 41

Litteraturliste .................................................................................................................................................... 42

Bilag .................................................................................................................................................................. 45

Bilag 1: Data fra Statens Serum Institut: Overvågning i tal, grafer og kort - MRSA ...................................................45

Bilag 2: Bakteriers vækst...............................................................................................................................................45

Bilag 3: Journal: Virkningen af novicidin og antibiotika mod E.coli ...........................................................................47

Bilag 4: Analytisk løsning af en differentialligning ......................................................................................................67

Bilag 5: Funktionsfil for Eulers metode ........................................................................................................................68

Bilag 6: Beregning af højre side af differentialligningen .............................................................................................68

Bilag 7: Scriptfil for numerisk løsning med Eulers metode ..........................................................................................68

Bilag 8: Funktionsfil for Heuns metode ........................................................................................................................69

Bilag 9: Funktionsfil for Runge-Kuttas metode.............................................................................................................70

Bilag 10: Scriptfil der sammenligner numeriske metoder med analytisk løsning .........................................................70

Bilag 11: Funktionsfil for SIS-model til MRSA .............................................................................................................71

Bilag 12: Funktionsfil for SIS-model til MRSA i fremtiden ...........................................................................................72


Side 5 af 73

Indledning

Når vi i dag bliver syge pga. en bakterieinfektion, kan vi i mange tilfælde behandles med

antibiotika. Før opdagelsen af antibiotika har der været en risiko for, at personer med svagt

immunforsvar døde af simple infektioner som lungebetændelse. I de seneste år har det store forbrug

af antibiotika i sundhedsvæsenet og landbrugt ført til, at flere bakterier har udviklet resistens over

for forskellige antibiotika. Hvis denne resistensudvikling fortsætter, kan vi risikere at stå i en

situation, hvor mennesker igen kan dø af simple infektioner, derfor må der forskes i alternativer til

antibiotika. Et alternativ, der forskes i, er antimikrobielle peptider (AMP’er), hvilket dette projekt

vil handle om.

I projektet vil jeg redegøre for bakteriers opbygning og antibiotikas virkningsmåder. Jeg vil

beskrive bakteriers resistensmekanismer, overførsel af resistens mellem bakterier samt hvordan

resistens forbygges. Derefter vil jeg forklare, hvad AMP’er er og om deres virkningsmekanismer

mod bakterier. I den forbindelse vil jeg udføre et eksperiment, hvor jeg undersøger virkningen af

det antimikrobielle peptid novicidin og nogle antibiotika mod E.coli.

Herefter vil jeg arbejde med MRSA, hvor jeg opstiller den valgte SIS-model og analyserer et

datasæt over MRSA-tilfælde i Danmark. Forinden vil jeg prøve forskellige numeriske metoder til

løsning af en differentialligning. Desuden vil jeg vurdere SIS-modellens anvendelighed. Til sidst vil

jeg diskutere anvendelsen af AMP’er som alternativ til antibiotika. Derudover perspektiverer jeg til

anticancer peptider, som er en anden medicinsk anvendelse af peptider.

Mine primære kilder er bogen Mikrobiologi - Hånden på hjertet, der giver teoretisk viden om

bakterier, resistens og antibiotika, bogen Lærebog i matematik bind 4, der giver viden om

epidemimodeller samt hjemmesiden Biotech Academy, som giver viden om AMP’er. Desuden har

foredraget Biofilm: Hvordan almindelige bakterier overlever enhver antibiotikabehandling ved

lektor Rikke Louise Meyer fra Aarhus Universitet og et møde med hende givet mig inspiration til

projektet.

Tak til: Rikke Louise Meyer (lektor på AU), Line Elnif Thomsen (lektor på KU), Thomas Vorup-

Jensen (professor på AU), Bettina Winther Grumsen (laborant på AU) samt mine to lærere Jesper

Melchjorsen og Pia Møller Jensen.


Side 6 af 73

Bakterier

Bakteriers opbygning

Bakterier er encellede organismer og prokaryoter dvs. uden cellekerne. De fleste bakterier har en

størrelse på mellem 0,2 til 2 𝜇𝑚 og kan være kugleformede, spiralsnoede eller stavformede.

Bakterier er afgrænset af en cellevæg uden på cellemembranen.1 Cellemembranen består af lipider,

proteinmolekyler og carbohydrater. Lipider indeholder både en hydrofob del og en hydrofil del. Når

de danner en membran, vil deres hydrofobe del interagere med hinanden, mens den hydrofile del

vender ud mod omgivelserne. Den hydrofile del indeholder ladede grupper. Et eksempel er

phosphat, der er negativt ladet og findes i phospholipider. De lipider, som findes i bakteriers

membran, er mest negativt ladede.2 Inde i bakteriecellen er cytoplasma, som er en væske, hvor

bakteriecellens strukturer befinder sig (se figur 1). Der findes ribosomer, som står for at producere

proteiner, og arvematerialet, der er dobbeltstrenget DNA pakket i et ringformet kromosom. Udover

kromosomet har de fleste bakterier mindre ringformede DNA-molekyler kaldet plasmider, som

indeholder gener, der normalt ikke er nødvendige for bakterierne, men de kan være en fordel som fx

et antibiotikaresistensgen.3

Figur 1 Bakteriens opbygning4

Desuden har nogle bakterier uden på cellevæggen en slimlignende substans kaldet en kapsel, som

består af polysaccharider. Kapslen virker som en beskyttelsesdragt, der giver bakterien øget evne til

1 (Hulgard & Madsen, 2017) 2 (Biotech Academy, u.d.) 3 (Hulgard & Madsen, 2017) 4 Lånt fra https://bioteknologi.systime.dk/index.php?id=519


Side 7 af 73

at modstå udtørring samt stoffer og celler i omgivelserne, der kan skade bakterien fx menneskets

immunforsvar. En del bakterier kan have flageller, som består af proteiner. Flageller sidder fast i

bakteriens cellemembran og strækker sig gennem cellevæggen ud i omgivelserne. De gør det muligt

for bakterien at bevæge sig i en bestemt retning fx væk fra en negativ påvirkning eller mod et mere

fordelagtigt miljø. Endvidere har nogle bakterier pili, som er hårlignende strukturer af protein

stikkende ud fra bakteriecellen. 5

Grampositive og gramnegative bakterier

Bakteriers cellevæg er primært opbygget af peptidoglycan. Peptidoglycanlaget består af

peptidoglycan monomerer sat sammen til polymer, hvilket danner en ensartet struktur omkring

bakteriens cellemembran (se figur 2).6

Figur 2 Bakteriers cellevæg er opbygget af peptidoglycan, som er polymere molekyler (venstre), hvor rygraden er N-

acetylmuraminsyre og N-acetylglucosamin. Til højre ses byggestenene af peptidoglycan, hvor de fire aminosyrer kan danne

tværbindinger til en nabokæde.7

Tykkelsen af cellevæggen varerier fra bakterie til bakterie, derfor er bakterier inddelt i to forskellige

typer, hvilket er de grampositive bakterier og gramnegative bakterier. Cellevæggen hos

grampositive bakterier består af et tykt lag peptidoglycan på ca. 20-40 nm, mens peptidoglycanlaget

hos gramnegative bakterier er tyndere ca. 2-7 nm. Grampositive bakterier har negativt ladede

teichoidsyrer bundet til cellevæggen. Teichoidsyrer består af glycerol eller ribitol og phosphat.8

Gramnegative bakterier har en ydre membran, der minder om en cellemembran. På den ydre

5 (Nielsen & Østergaard, 2012) 6 (Biotech Academy, u.d.) 7 Lånt fra https://bioteknologi.systime.dk/index.php?id=519 8 (Biotech Academy, u.d.)


Side 8 af 73

membran sidder lipopolysaccharider, der er sammenbundne lipider og polysaccharider, hvorpå der

er negativ ladede phosphatgrupper (se figur 3).9

Figur 3 Gramnegativ bakterie til venstre og grampositiv bakterie til højre10

Antibiotika

Antibiotika er en fællesbetegnelse for forskellige kemiske stoffer, som virker giftige på bakterier,

men de er ugiftige for mennesker, fordi de angriber strukturer i bakteriecellen. De fleste antibiotika

er oprindeligt fundet i mikroorganismer bl.a. i visse arter af skimmelsvampe og bakterier, som

bruger dem i konkurrence med andre mikroorganismer. I dag produceres de fleste antibiotika

syntetisk.11 Nogle typer antibiotika virker bakteriostatisk (bakteriehæmmende) og forhindrer, at

bakterierne deler sig, mens andre typer antibiotika er baktericide (bakteriedræbende) og slår hurtigt

patientens patogene bakterier ihjel. Et antibiotikum kan enten være bredspektret eller smalspektret,

hvilket betyder, at det virker på henholdsvis mange eller få typer af bakterier.12

Antibiotikas virkningsmekanismer

Antibiotika har forskellige virkningsmekanismer. Nogle antibiotika kan hæmme dannelsen af

bakteriecellevæggen ved at hæmme enzymet transpeptidase, der danner bindinger mellem de

enkelte lag i peptidoglycanlaget. Derved sprænges cellevæggen, når bakterien deler sig.13

Penicilliner indeholder en 𝛽-lactamring (se figur 4), som binder sig til enzymet glycopeptid

transpeptidase, der katalyserer dannelsen af tværbroerne i cellevæggen. Penicilliner inaktiverer

9 (Hulgard & Madsen, 2017) 10 Lånt fra https://biologibogen.systime.dk/index.php?id=686 11 (Nielsen & Østergaard, 2012) 12 (Bidstrup & Schou, 2011) 13 (Ahlborn, Blæsild, & Kragelund, 2013)


Side 9 af 73

enzymet, så tværbroerne ikke dannes, hvilket gør cellevæggen skrøbelig, så den går i stykker, når

bakterierne optager vand ved osmose. 14

Figur 4 Penicillins kemiske struktur. Beta-lactamringen er firkantet og dannet af tre C-atomer og et N-atom. R står for en variabel

gruppe, da der findes mange forskellige typer af penicilliner.15

Andre antibiotika hæmmer bakteriernes proteinsyntese ved at binde sig til bakteriernes ribosomer. I

dette tilfælde dræbes bakterierne ikke direkte, men de hæmmes, så immunforsvaret kan overtage.16

Desuden kan nogle antibiotika ødelægge cellemembranen ved at indsætte sig i membranen som en

pore og dermed dannes en kanal gennem membranen, så forskellige stoffer kan trænge ind og ud af

bakteriecellen, hvilket medfører celledød.17

Antibiotikaresistens

I løbet af de seneste mange år er forbruget af antibiotika steget, hvor især den omfattende brug af

bredspektrede antibiotika har forårsaget et stort selektionstryk på bakterierne og fremmet de

resistente bakteries overlevelse på bekostning af de ikke-resistente bakterier.18 Når en bakterie er

resistent over for fem eller flere typer af antibiotika, siges det, at den er multiresistent.19

Grundlæggende findes der to former for antibiotikaresistens, hvilket er medfødt resistens og

erhvervet resistens. Medfødt resistens betyder, at en bestemt bakterieart fra naturens side er resistent

over for et bestemt antibiotikum. Erhvervet resistens betyder, at en bakteriestamme tilhørende en

bakterieart, der fra naturens side er sensitiv, har udviklet evnen til at modstå et bestemt

antibiotikum.20

14 (Nielsen R. H., 2007) 15 Lånt fra http://bioteknologibogen.dk/includes/uploaded_files/1458120350josp.pdf#page=6 16 (Ahlborn, Blæsild, & Kragelund, 2013) 17 (Ahlborn, Blæsild, & Kragelund, 2013) 18 (Ahlborn, Blæsild, & Kragelund, 2013) 19 (Hulgard & Madsen, 2017) 20 (Nielsen & Østergaard, 2012)


Side 10 af 73

Bakteriers resistensmekanismer

Mutationer, som er ændringer i gener, kan medføre, at bakterien kan modstå antibiotika og

videregive egenskaben til sine efterkommere. Resistens for antibiotika skyldes forskellige

resistensmekanismer, der kan variere fra bakterie til bakterie afhængig af hvilket antibiotikum, de er

resistente overfor (se figur 5). Bakterier kan have enzymer, som nedbryder antibiotikamolekylerne

eller ændrer ribosomerne, så antibiotika ikke kan bindes til dem.21 Nogle resistente bakterier kan

have membranpumper, som pumper antibiotikamolekyler ud af bakterien. Endvidere kan den

resistente bakterie få ændret antibiotikummets angrebssted, så antibiotikummet ikke længere kender

det sted, hvor det plejer at angribe og dermed vil bakterien overleve.22

Figur 5 Bakterier kan ødelægge antibiotikas funktion ved at pumpe antibiotikum ud, inaktivere antibiotikummet eller ændre

antibiotikummets angrebssted.23

Overførsel af resistens mellem bakterier

Bakterier kan overføre resistens til andre bakterier. Overførsel af resistens kan ske på tre forskellige

måder, hvilket er konjugation, transformation og transduktion (se figur 6).24

21 (Nielsen & Østergaard, 2012) 22 (Ahlborn, Blæsild, & Kragelund, 2013) 23 Lånt fra https://www.science.ku.dk/oplev-science/gymnasiet/undervisningsmaterialer/boeger/bog_biotek_forsk/filer/13_multiresistente_bakterier.pdf 24 (Egebo, 2006)


Side 11 af 73

Figur 6 Resistensoverførsel mellem bakterier: a. transformation, b. konjugation og c. transduktion.25

Ved transformation kan en bakterie optage noget af en anden bakteries DNA i dette tilfælde med

resistensgen og indsætte det i kromosomet. Konjugation er en anden måde, hvor bakterier kan opnå

nyt DNA med resistensgen. Dette sker ved, at den ene bakterie danner et parringsrør (sex pilus) til

den anden bakterie og derved overfører et plasmid med resistensgen til den. Ved transduktion sker

genoverførsel via en bakteriofag (virus), der inficerer en bakterie og får denne bakterie til at

producere nye bakteriofager, hvor nogle kommer til at indeholde noget af bakteriens DNA her med

resistensgen. Når de nye bakteriofager inficerer bakterier, overfører de resistensgenet til

bakterierne.26

Forebyggelse af resistens

En måde at modvirke forekomsten af antibiotikaresistens kan gøres ved at begrænse forbruget af

antibiotika, specielt bredspektrede antibiotika, både til mennesker og dyr. Dette opnås, hvis lægerne

kun skriver recepter på antibiotika, når det er nødvendigt. Det bedste vil være at give en patient et

antibiotikum, der kun virker på den bakterie, som har forårsaget infektionen. Tit er lægen nødt til at

bruge antibiotika, der rammer mange bakterier, indtil lægen ved, hvilken bakterie, som er skyld i

infektionen. Smitte af resistente bakterier kan begrænses ved at isolere de ramte patienter på

25 Lånt fra http://bioteknologibogen.dk/includes/uploaded_files/1458120350josp.pdf#page=6 26 (Bidstrup & Schou, 2011)


Side 12 af 73

sygehusene. Derudover kan hygiejnen på sygehusene fastholdes og forbedres, så spredningen af de

resistente bakterier mindskes.27

Antimikrobielle peptider

Da overforbruget af antibiotika har medført multiresistente bakterier, forskes der i nye typer af

medicin, herunder antimikrobielle peptider (AMP’er). Alle planter, dyr og mennesker danner

AMP’er, der indgår i immunforsvaret, hvor de fungerer som en vigtig forsvarsmekanisme over for

patogene mikroorganismer som bakterier og vira. AMP’er er forskellige i deres struktur og længde,

men de består af mellem 10 og 80 aminosyrer. Sammensætningen af aminosyrer giver AMP’er en

positiv ladning. Desuden er de amphipatiske, hvilket betyder, at de polære aminosyrer er adskilt fra

de upolære aminosyrer, og dermed vil AMP’er bestå af en hydrofob og hydrofil del.28

AMP’er kan inddeles i tre grupper på baggrund af deres sekundære proteinstruktur, hvilket er 𝛼-

helix AMP’er, 𝛽-hairpin AMP’er og defensiner (se figur 7). 𝛼-helix AMP’er virker ved at bore sig

ind i cellemembranen på bakterier. 𝛽-hairpin AMP’er findes på en inaktiv form, som aktiveres ved

en infektion, hvor stoffet får fremmede celler til at lysere (sprænges). Defensiner er en blandet

gruppe med forskellig virkemåde fx virker nogle hæmmende på bakterier ved at trænge ind og

blokere for vitale processer som DNA- eller RNA-syntese.29

Figur 7 a: 𝛼-helix og b: 𝛽-hairpin30

AMP’er kan skelne mellem bakterieceller og menneskeceller, da menneskecellers cellemembran

oftest er neutral, mens bakteriers cellemembran er negativ ladet. Derudover har bakterierne en

cellevæg, som ligeledes er negativ ladet. Den negative overflade hos bakterier er grunden til, at

27 (Henrik, 2018) 28 (Biotech Academy, u.d.) 29 (Bidstrup & Schou, 2011) 30 Lånt fra http://bioteknologibogen.dk/includes/uploaded_files/1458120350josp.pdf#page=49


Side 13 af 73

AMP’er har en effekt på bakterier, da AMP’er overordnet har en positiv ladning, vil de tiltrækkes af

bakteriers negativ ladede overflade. Efter tiltrækning til bakteriecellens overflade, begynder de at

bore sig ned i cellemembranen, hvor de binder sig sammen og danner en transmembran kanal,

derved skabes hul i cellemembranen (se figur 8). AMP’er sættes sammen, så peptidernes hydrofobe

side vender ud mod cellemembranens hydrofobe fedtsyrer, mens deres hydrofile side vender ind

mod andre peptiders hydrofile side. Hullet i cellemembranen medfører, at hydrofile stoffer og ioner

kan bevæge sig frem og tilbage, hvilket resulterer i celledød.31

Figur 8 AMP'er tiltrækkes af bakteriens cellemembran og de borer hul i membranen.32

Et eksempel på et AMP er novicidin, som stammer fra det syntetiske AMP ovispirin, der er meget

cytotoksisk. Ovispirin stammer fra cathelicidin SMAP-29, som er et AMP fra får. Novicidin er en

modificering af de eksisterede AMP’er, hvor novicidin angriber bakterier mere effektivt og

forårsager mindre hæmolyse (nedbrydning af røde blodlegemer). Som det kan ses på figur 9, har

novicidin en 𝛼-helix struktur, er overordnet positiv ladet, og den interagerer med negative dele af

bakteriens cellemembran.33

31 (Biotech Academy, u.d.) 32 Lånt fra https://www.biotechacademy.dk/undervisning/gymnasiale-projekter/find-fremtidens-antibiotika/#1513683818501-40ad21be-7eff20b8-d7c9 33 (Dorosz, et al., 2010)


Side 14 af 73

Figur 9 Novicidins interaktion med cellemembranen på en bakterie34

Undersøgelse af novicidins og antibiotikas virkning på E.coli

I et eksperiment er virkningen af novicidin og fire antibiotika (penicillin, ampicillin,

chloramphenicol og tetracyclin) mod Escherichia coli (E.coli) undersøgt (se bilag 2 og 3).

E.coli er en gramnegativ bakterie, som er en del af normalfloraen i tarmen hos mennesker og dyr.

Der findes nogle stammer, der er meget mere patogene end flertallet. Colibakterier kan give

urinvejsinfektioner, sårinfektioner og lungebetændelse.35

Metode

Når bakterier dyrkes i et laboratorium, skal de være i et vækstmedie, som indeholder alle de

grundstoffer, som bakterierne har brug for til deres vækst. Derfor fremstilles et flydende medie ved

at blande LB Broth Base pulver med demineraliseret vand, hvorefter opløsningen varmes op og

steriliseres i en mikroovn. Et fast medie fremstilles ved at blande LB Agar pulver i demineraliseret

vand, hvilket ligeledes steriliseres i mikroovnen. Efter afkøling af medier, er agaropløsningen

fordelt i petriskåle, hvor det kan størkne. Det flydende medie hældes i kolber/rør, så der kan tilføjes

en E.coli koloni til hver kolbe/rør. De flydende bakteriekulturer i kolberne stilles i rystevandbad og

rørene i et varmeskab ved 37 grader, så bakterierne kan formere sig og blive til flere, hvilket går

hurtigt, da E.coli deler sig hvert tyvende minut.36 Agarpladerne stilles i køleskabet.

34 Lånt fra http://soft-matter.seas.harvard.edu/index.php/File:Dorosz1.gif 35 (Nielsen & Østergaard, 2012) 36 (Jørgensen, 2017)


Side 15 af 73

Dagen efter undersøges virkningen af novicidin ved at udplade E.coli kultur på en agarplade og på

en anden agarplade udplade E.coli og novicidin, som først har været blandet sammen i et

eppendorfrør i 15 minutter. Her undersøges bl.a., om novicidin kan dræbe bakterier inden

udpladning, så der er færre bakterier, som har mulighed for at vokse frem på agarpladen

sammenlignet med den anden agarplade.

Desuden udføres en agardiffusionstest ved at udplade E.coli kultur på agarplader, hvorefter der

placeres antibiotika tabletter på pladerne (se figur 10). Antibiotika vil ved diffusion sprede sig ud i

agaren. Hvis bakterierne er følsomme over for et antibiotikum, vil der dannes en zone uden om

tabletten uden bakterievækst (inhiberingszone). Er bakterierne resistente, vil de også vokse rundt

om tabletten. I hver agarplade laves to brønde, hvor der i det ene pipetteres flydende ampicillin og i

det andet novicidin.

Endvidere vælges en agarplade uden noget tilføjet, da det fungerer som kontrol for eksperimentet.

Denne plade kan vise, hvor sterilt der er arbejdet med fx fremstilling af medie alt efter om der

vokser bakteriekolonier frem på agarpladen og antallet af kolonier.

Alle agarplader stilles i varmskabet ved 37 grader, hvilket ligger inde for det temperaturinterval,

hvor bakterier vokser bedst.

Figur 10 Agardiffusionstest og undersøgelse af novicidin klar til at komme i varmeskab

Resultater

Nedstående billeder viser resultater fra undersøgelse af novicidin. På kontrol-agarpladen ses små

bakteriekolonier, som har forskellige farver (gul og grå). På agarpladen med E.coli ses et lag af

bakterie, som ikke er lige tykt fordelt på agarpladen. På agarpladen med E.coli og novicidin ses


Side 16 af 73

ligeledes et lag af bakterier, der ikke er lige tykt fordelt på agarpladen. Der ses ikke forskel i

bakterielaget, da begge plader er næsten helt tildækket af bakterier.

Figur 11 Kontrol-agarplade (venstre), agarplade med E.coli (midt) og agarplade med E.coli + novicidin (højre)

Resultater over radius af inhiberingszonerne for de antibakterielle midler på alle agarplader kan ses

i bilag 3. Nedstående tabel viser resultaterne for de to agarplader, hvor der er brugt E.coli flydende

kultur fra samme kolbe, derfor kan gennemsnittet af radius af inhiberingszone for hver

antibakterielt middel beregnes. Der laves et søjlediagram i Excel, hvor x-aksen angiver

antibakterielt middel og y-aksen angiver radius af inhiberingszone målt i mm.

Tabel 1 Radius af inhiberingszone for de undersøgte antibakterielle midler på to af agarpladerne


Side 17 af 73

Figur 12 Søjlediagram over gennemsnitlig radius af inhiberingszone for de antibakterielle midler

Søjlediagram for gennemsnitlig radius af inhiberingszonerne på agarplade 1+2 samt værdierne i

tabellen viser, at det kun har været antibiotikaene tetracyclin og chloramphenicol, der har hæmmet

bakterievækst, da der er en inhiberingzone for disse to antibiotika, mens inhiberingszonen for de

andre undersøgte antibakterielle midler er nul. Gennemsnitlig radius af inhiberingszone for

tetracyclin er 8 mm, mens den for chloramphenicol er 12,5 mm.

Diskussion af resultater

I eksperimentet har novicidin ikke vist antibakteriel effekt. Der kan være flere usikkerheder og

fejlkilder, som har haft indflydelse på resultaterne. Det brugte novicidin har ligget omkring 10 år i

en fryser, da det er ubrugte rester givet af en forsker fra Aarhus Universitet. Derfor kan novicidin

have mistet sin antibakterielle effekt. Desuden kan det være, at der skal bruges en større

koncentration og/eller volumen af novicidin ift. koncentrationen af E.coli i kulturerne. En tredje

usikkerhed er, at peptidet kan have bundet sig til stoffer i det rige medie og derved blevet

inaktiveret. Til en anden gang kan det undgås ved at bruge et minimalmedie, som er sammensat

sådan, at det lige netop indeholder de stoffer, som skal til for at sikre bakteriers vækst.

I agardiffusionstesten har der været en inhiberingszone ved tetracyclin og chloramphenicol, så de

har haft en virkning mod E.coli. De er bredspektrede antibiotika og hæmmer begge bakteriers


Side 18 af 73

proteindannelse.37 38 Colibakterier er resistente over for penicillin (smalspektret antibiotikum), da

de har en cellevæg, som penicillin ikke kan trænge igennem.39 Dette stemmer overens med

resultaterne, da der ingen inhiberingszoner ses for penicillin. Ampicillin er et bredspektret

antibiotikum med virkning på mange grampositive og gramnegative bakterier.40 Det har ikke haft

en virkning på E.coli, hvilket kan skyldes, at stammen er resistent over for ampicillin, eller at

massen af tabletten er lille ift. bakteriekoncentrationen.

Selvom størstedelen af eksperimentet er udført i en LAF bænk og handsker er skiftet/sprittet i løbet

af eksperimentet, er der ikke arbejdet helt sterilt. Der er bakteriekolonier på kontrol-agarpladen,

hvilket betyder, at de andre plader ligeledes kan have samme mængde bakterier fra start. I andre

eksperimenter kan det have betydning for det undersøgte, at der arbejdes helt sterilt. Hvis det er

muligt, er det bedst at sterilisere medie i en autoklave fremfor en mikroovn.

MRSA

Staphylococcus aureus er en bakterie, der kan give hudinfektioner, betændte bylder og i mere

alvorlige tilfælde lungebetændelse eller blodforgiftning. Desuden findes de som en del af

normalfloraen hos mange mennesker. I 1940erne er de første penicillinresistente stafylokokker set.

Deres resistens skyldes et enzym, som kan nedbryde penicillinmolekylet. Enzymet hedder beta-

lactamase, da det klipper beta-lactamringen i stykker, så penicillinet mister sin virkning. I 1959

indføres methicillin, tilhørende gruppen penicilliner, som enzymet ikke kan nedbryde. To år efter er

der fundet de første bakterier, som har været resistente over for methicillin.41 De

methicillinresistente S. aureus (MRSA) har erhvervet sig et ændret enzym, som kan opbygge

cellevæggen uden at hæmmes af penicilliner, cefalosporiner eller carbapenemer.42

De fleste, der smittes med MRSA, vil være raske smittebærere, hvilket betyder, at de har bakterien

på sig fx i næsen eller på huden, men de har ikke tegn på infektioner. Hvis MRSA-bakterier

kommer i kontakt med et sår, er der risiko for, at der udvikles infektion. Ved operation er der

ligeledes risiko for infektion. Tidligere har MRSA mest været et problem på hospitaler, men de

37 (Netdoktor, 2009) 38 (Den Store Danske, 2017) 39 (Nielsen & Østergaard, 2012) 40 (Pubchem, u.d.) 41 (Worning, 2014) 42 (Nielsen & Østergaard, 2012)


Side 19 af 73

sidste 15 år har sygdomsmønstret ændret sig og i dag findes flere positive uden at have særlige

risikofaktorer (samfundserhvervet MRSA), dvs. personer, der er blevet smittet andre steder end på

hospitalet eller i en svinestald. I starten af år 2000 er der opstået den type af MRSA, der findes hos

husdyr hovedsageligt svin, hvorfra de kan spredes til mennesker. MRSA smitter ved kontakt med

mennesker eller dyr, der bærer MRSA, eller ved berøring af overfalder fx håndtag.43 Der findes

ingen vaccine, som kan beskytte folk fra MRSA-infektion. Det vigtigste, der kan gøres for at undgå

MRSA-infektion, er at have en god hygiejne specielt håndhygiejne.44

I Danmark er der fokus på at forebygge MRSA-infektioner ved, at smittede kommer på enestue.

Når der er tale om let betændelse i sår, kan det behandles ved vask med vand og sæbe. Ved

alvorlige infektioner, kræver det antibiotika.45

Inden MRSA-spredning i Danmark undersøges med en epidemimodel, ses der i de næste afsnit på

forskellige numeriske løsningsmetoder, så der efter en afprøvning kan vælges en metode.

Numeriske løsninger af differentialligninger

Der findes tilfælde, hvor der ikke kan bestemmes analytiske løsninger til en differentialligning. I

disse tilfælde løses differentialigningen numerisk, hvor den numeriske løsning svarer til en tabel

med funktionsværdier, som bruges til at få tegnet grafen.46

Eulers metode

I dette afsnit vil der ses på Eulers metode til numerisk løsning af differentialligninger.47 Der ses på

følgende differentialligning:

𝑑𝑦

𝑑𝑡= ℎ(𝑡, 𝑦)

Nu vil der findes en numerisk tilnærmelse til løsningen 𝑦 = 𝑓(𝑡), hvor begyndelsesbetingelsen er

𝑓(𝑡0) = 𝑦0. For grafen 𝑓 vides der, at den går gennem punktet (𝑡0, 𝑦0) i planen og i dette punkt må

grafen have en tangent med ligningen:

43 (Statens Serum Institut, 2017) 44 (HealthLinkBC, 2017) 45 (Statens Serum Institut, 2017) 46 (Brydensholt & Ebbesen, 2012) 47 Afsnit er baseret på (Brydensholt & Ebbesen, 2012)


Side 20 af 73

𝑦 = 𝑓′(𝑡0) · (𝑡 − 𝑡0) + 𝑦0

Da 𝑓′(𝑡0) = ℎ(𝑡0, 𝑦0) ifølge den øverste differentialigning, kan grafens tangent omskrives til

nedstående ligning.

𝑦 = ℎ(𝑡0, 𝑦0) · (𝑡 − 𝑡0) + 𝑦0

Der vælges nu en lille positiv skridtlængde, der kaldes ∆𝑡. Når der gås et skridt ud fra 𝑡0, bliver

𝑡1 = 𝑡0 + ∆𝑡. Ved brug af tangentligningen kan 𝑓(𝑡1) tilnærmes.

𝑓(𝑡1) ≈ 𝑦1 = ℎ(𝑡0, 𝑦0) · (𝑡0 + ∆𝑡 − 𝑡0) + 𝑦0 = ℎ(𝑡0, 𝑦0) · ∆𝑡 + 𝑦0

Hermed er der fundet et punkt (𝑡1, 𝑦1) på grafen for den numeriske løsning. I dette punkt er

tangenthældningen for en løsning givet ved ℎ(𝑡1, 𝑦1) og dermed bliver tangentligningen:

𝑦 = 𝑦1 + ℎ(𝑡1, 𝑦1) · ∆𝑡

Hvis der gås et skridt ud af 𝑡1 fås 𝑡2 = 𝑡1 + ∆𝑡. Ved brug af nedstående tangentligning kan 𝑓(𝑡2)

approksimeres.

𝑓(𝑡2) ≈ 𝑦2 = 𝑦1 + ℎ(𝑡1, 𝑦1) · ∆𝑡

Følgende illustration viser approksimationerne:

Figur 13 Eulers metode48

48 Lånt fra (Brydensholt & Ebbesen, 2012)


Side 21 af 73

Sådan kan der fortsættes med at finde den næste approksimation ved at bruge nedstående

ligningerne, som er opskrevet som generelle formler.

𝑡𝑛+1 = 𝑡𝑛 + ∆𝑡

𝑦𝑛+1 = 𝑦𝑛 + ℎ(𝑡𝑛, 𝑦𝑛) · ∆𝑡

Heuns metode

Eulers metode er en simpel metode, men den er ikke så præcis. Heuns metode er en forbedring af

Eulers metode.49 Heuns metode er baseret på at finde gennemsnittet af hældningerne ℎ(𝑡𝑛, 𝑦𝑛) og

ℎ(𝑡𝑛+1, 𝑦𝑛+1), hvor ℎ(𝑡𝑛, 𝑦𝑛) er hældningen til tangenten i startpunktet (𝑡𝑛 , 𝑦𝑛), og ℎ(𝑡𝑛+1, 𝑦𝑛+1) er

hældningen til tangenten i et midlertidigt punkt (𝑡𝑛+1, 𝑦𝑛+1). Først findes tangentligningen til det

midlertidige punkt med formlen:

𝑦𝑛+1∗ = 𝑦𝑛 + ℎ(𝑡𝑛, 𝑦𝑛) · ∆𝑡

Derefter er det muligt at bruge Heuns nedstående formel til at finde 𝑦𝑛+1 på den numeriske

løsningskurve.

𝑦𝑛+1 = 𝑦𝑛 +1

2· ∆𝑡 · (ℎ(𝑡𝑛, 𝑦𝑛) + ℎ(𝑡𝑛+1, 𝑦𝑛+1

∗ ))

Ved at indføre notationen 𝑘1 = ∆𝑡 · ℎ(𝑡𝑛, 𝑦𝑛) og 𝑘2 = ∆𝑡 · ℎ(𝑡𝑛+1, 𝑦𝑛+1∗ ) kan de to numeriske

metoder omskrives. 𝑘-værdierne er ændring i 𝑦-værdi.

𝑦𝑛+1 = 𝑦𝑛 + 𝑘1 (Eulers metode)

𝑦𝑛+1 = 𝑦𝑛 +1

2· (𝑘1 + 𝑘2) (Heuns metode)

49 Afsnit er baseret på (Kreyszig, 1998) og (Rasmussen, 2013)


Side 22 af 73

Runge-Kuttas metode

En endnu mere præcis metode er Runge-Kutta metoden, som går ud på at beregne en række 𝑘-

værdier, der alle er udtryk for ændringer i 𝑦.50 Med nedstående formel beregnes 𝑦𝑛+1 på den

numeriske løsningskurve.

𝑦𝑛+1 = 𝑦𝑛 +1

6· (𝑘1 + 2 · 𝑘2 + 2 · 𝑘3 + 𝑘4)

I formlen kan det ses, at der bruges et vægtet sum af ændringer i 𝑦-værdi for at beregne 𝑦𝑛+1.

𝑘1 = ∆𝑡 · ℎ(𝑡𝑛, 𝑦𝑛)

𝑘2 = ∆𝑡 · ℎ (𝑡𝑛 +1

2· ∆𝑡, 𝑦𝑛 +

1

2· 𝑘1)

𝑘3 = ∆𝑡 · ℎ (𝑡𝑛 +1

2· ∆𝑡, 𝑦𝑛 +

1

2· 𝑘2)

𝑘4 = ∆𝑡 · ℎ(𝑡𝑛 + ∆𝑡, 𝑦𝑛 + 𝑘3)

𝑘1 er ændring i 𝑦-værdi i begyndelsen af intervallet (begyndelsespunktet).

𝑘2 og 𝑘3 er ændringer i 𝑦-værdi, når der gås det halve af skridtlængden ud af 𝑥-aksen, hvorefter der

findes to punkter, hvor det ene ligger over og den anden under funktionen. Hvis det er en voksende

funktion er 𝑘3 større end 𝑘2.

𝑘4 er ændring i 𝑦-værdi i slutningen af intervallet (endepunktet), når der gås hele skridtlængden ud

af 𝑥-aksen.

50 Afsnit er baseret på (Kreyszig, 1998) og (Britz, 2010)


Side 23 af 73

Numerisk og analytisk løsning af en differentialligning

Analytisk løsning

Der er valgt en differentialligning:

𝑦′ = 4 · 𝑡 + 𝑦

Differentialligningen kan løses med WordMat’s Løs differentialligning, hvor der er valgt

begyndelsesbetingelsen 𝑦(0) = 2.

𝑦′ = 4 · 𝑡 + 𝑦

Differentialligningen løses vha. CAS-værktøjet WordMat's 'Løs differentialligning' funktion med startbetingelsen y(0)=2

𝑦 = −4 · 𝑡 + 𝑒𝑡 · 6 − 4

I bilag 4 kan der ses en mere detaljeret løsning af differentialligning.

Eulermetoden og skridtlængde

Eulers metode kan implementeres i en MATLAB funktionsfil (se bilag 5).51 Dette afprøves nu ved

at løse ovenstående differentialligning. For at kunne bruge den nye funktion eulerApprox er der

brug for en funktionsfil, hvor højre side af differentialligningen beregnes (se bilag 6). Herefter laves

en MATLAB scriptfil, som løser ligningen numerisk for to forskellige skridtlængder, beregner den

analytiske løsning samt laver et plot, hvor løsningerne kan sammenlignes (se bilag 7). I alle

MATLAB filer svarer 𝑛 fra de numeriske metoder til 𝑛 = 𝑖 − 1 og 𝑛 + 1 = 𝑖.

51 Brugen af MATLAB er lært gennem (Jensen, 2015)


Side 24 af 73

Plot 1 Eulers metode med skridtlængde 0,1 (grøn graf) og 0,2 (blå graf) sammenlignet med analytisk løsning (rød graf)

På plottet kan det ses, at der er en stor afvigelse mellem den analytiske løsning (rød) og den

numeriske løsning ved en skridtlængde på 0,2 (blå). Forskellen kan mindskes ved at gøre

skridtlængden mindre. Når skridtlængden er 0,1 (grøn) ses, at den numeriske løsning kommer til at

ligge tættere på den analytiske løsning (rød).

Eulers-, Heuns- og Runge-Kuttas metode sammenlignet med analytisk løsning

Der laves en MATLAB funktionsfil for både Heuns metode og Runge-Kuttas metode (se bilag 8 og

9). Derefter laves en scriptfil, som sammenligner de forskellige numeriske løsninger med den

analytiske løsning samt laver et plot for løsningerne (se bilag 10). Der benyttes den lille

skridtlængde på 0,1.


Side 25 af 73

Plot 2 Eulers metode (blå graf), Heuns metode (grøn graf) og Runge-Kuttas metode (lyseblåt kryds) sammenlignet med analytisk

løsning (rød graf)

Som det kan ses på plottet, er der en stor afvigelse mellem Eulers numeriske løsning (blå) og den

analytiske løsning (rød). På ovenstående plot ligger de andre numeriske løsninger oveni den

analytiske løsning, derfor zoomes der ind på plottet, så de andre numeriske løsninger kan

sammenlignes med den analytiske løsning.


Side 26 af 73

Plot 3 Der er zoomet ind på plot, så de numeriske metode bedre kan sammenlignes med den analytiske løsning.

På ovenstående plot kan der ses en afvigelse mellem Heuns numeriske løsning (grøn) og den

analytiske løsning (rød), men afvigelsen er mindre sammenlignet med Eulers numeriske løsning

(blå). Runge-Kuttas numeriske løsning (lyseblå kryds) ligger stadig oveni den analytiske løsning,

hvilket betyder, at den må være meget tæt på den analytiske løsning.

Dermed er der ud fra ovenstående plot kommet frem til, at Runge-Kutta metoden er den mest

præcise metode, derefter kommer Heuns metode og til sidst Eulers metode.

Koblede differentialligninger

For modeller med flere variable findes der et indbyrdes afhængighedsforhold mellem dem. Disse

systemer kan beskrives ved nogle sammenhørende differentialligninger. Et system af koblede

differentialligninger kan sammenlignes med 2 ligninger med to ubekendte, hvor der er brug for

begge ligninger for at kunne bestemme de to ubekendte.52 I en epidemimodel beskrives antallet af

individer i forskelle grupper med funktioner. En epidemimodel svarer til differentialligningerne,

som udgør et differentialligningssystem med koblede differentialligninger.

52 (Undervisningsministeriet, 2014)


Side 27 af 73

Forudsætninger for epidemimodeller

Når der skal modelleres udbredelsen af en sygdom hos en population, kan der for simple modeller

gælde nedstående forudsætninger. 53

Den population, der arbejdes med, skal være stor og konstant. Der tages ikke hensyn til fødsler,

naturlige dødsfald, immigration og emigration.

Der er ingen latenstid, så et smittet individ smitter med det samme.

Populationen er homogent blandet og homogen, hvilket betyder, at alle par af individer fra

populationen har samme sandsynlighed for at møde hinanden på tværs af grupperne, samt at de alle

er lige modtagelige for sygdommen.

Sygdommen skal smitte direkte fra individ til individ.

Desuden må sygdommen ikke få populationen til at ændre adfærd.

SIS-modellen

Da der ikke findes vaccine for MRSA-infektion, er der valgt at arbejde med SIS-modellen, som kan

benyttes til at modellere en sygdom, man ikke bliver immun overfor.54 Når et inficeret individ er

behandlet og kureret for sygdommen, bliver individet igen modtagelige for sygdommen.

I modellen opdeles populationen med 𝑁 individer i to grupper, hvilket er individer 𝑆 (susceptibles),

som er smittemodtagelige, og individer 𝐼 (infected), der er smittede og derfor også smittende. Der

sker en udveksling af individer mellem grupperne 𝑆 og 𝐼. Sygdommen bliver spredt ved et møde

mellem et modtageligt individ fra 𝑆 og et smittende individ fra 𝐼. Da der er antaget en homogen

blanding, vil det mulige antal af disse møder til tiden 𝑡 være 𝑆(𝑡) · 𝐼(𝑡). Det er en lille del af disse

møder, der resulterer i overførsel af smitte. Derfor vil antallet af smittede på det givne tidspunkt

vokse med en hastighed, som er proportional med antallet af møder mellem en rask og en smittet,

dvs. med hastigheden 𝛼𝑆𝐼, hvor 𝛼 er en positiv konstant, der kaldes infektionsraten. Samtidig vil

nogle af de smittede blive raske, hvilket antages, sker med en hastighed, som er proportional med

antallet af smittede, dvs. med hastigheden 𝛾𝐼, hvor 𝛾 er en positiv konstant, der kaldes

helbredelsesraten.

53 Afsnit er baseret på (Brydensholt & Ebbesen, 2012) 54 Afsnit er baseret på (Brydensholt & Ebbesen, 2012) og (Baktoft, 2010)


Side 28 af 73

Flowdiagrammet kommer til at se således ud:

Figur 14 Flowdiagram for SIS-model55

Der fås differentialligningerne:

𝑑𝑆

𝑑𝑡= −𝛼𝑆𝐼 + 𝛾𝐼

𝑑𝐼

𝑑𝑡= 𝛼𝑆𝐼 − 𝛾𝐼

Eftersom 𝑆(𝑡) = 𝑁 − 𝐼(𝑡) kan differentialligning 𝑑𝐼

𝑑𝑡 omskrives til:

𝑑𝐼

𝑑𝑡= 𝛼(𝑁 − 𝐼)𝐼 − 𝛾𝐼 = (𝛼𝑁 − 𝛼𝐼)𝐼 − 𝛾𝐼 = 𝛼𝑁𝐼 − 𝛼𝐼2 − 𝛾𝐼 = 𝛼𝐼(𝑁 −

𝛾

𝛼− 𝐼)

Ovenstående differentialligning er en logistisk ligning med løsningerne:

𝐼(𝑡) =𝑁 −

𝛾𝛼

1 + 𝑐𝑒−𝛼(𝑁−𝛾𝛼)𝑡

=𝛼 · (𝑁 −

𝛾𝛼

)

𝛼 (1 + 𝑐𝑒−𝛼(𝑁−𝛾𝛼)𝑡)

=𝛼𝑁 −

𝛼𝛾𝛼

𝛼 + 𝛼𝑐𝑒−𝛼(𝑁−𝛾𝛼)𝑡

=𝛼𝑁 −

𝛼𝛾𝛼

𝛼 + 𝛼𝑐𝑒−(𝛼·𝑁−𝛼·𝛾𝛼)𝑡

=𝛼𝑁 − 𝛾

𝛼 + 𝛼𝑐𝑒−(𝛼𝑁−𝛾)𝑡

Når 𝑡 bliver stor, vil eksponentialfunktionen i nævneren nærme sig 0. Dermed vil der være følgende

tilbage:

𝐼∞ =𝛼𝑁 − 𝛾

𝛼=

𝛼𝑁

𝛼−

𝛾

𝛼= 𝑁 −

𝛾

𝛼

𝐼∞ = 𝑁 −𝛾

𝛼 er lig med tærskelværdien, som er det tal antallet af smittede ifølge en model vil nærme

sig.

55 Lånt fra (Brydensholt & Ebbesen, 2012)


Side 29 af 73

Desuden vil antallet af smittemodtagelige stabilisere sig på

𝑆∞ = 𝑁 − 𝐼∞ = 𝑁 − (𝑁 −𝛾

𝛼) =

𝛾

𝛼

Helbredelsesraten 𝛾 kan beregnes ud fra den gennemsnitlige varighed af sygdommen hos det

enkelte individ.

𝛾 =1

𝑠𝑦𝑔𝑑𝑜𝑚𝑚𝑒𝑛𝑠 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑔ℎ𝑒𝑑

Konstanten 𝛼 er hensigtsmæssig, når differentialligningerne opskrives, men det er ikke det, som

benyttes til at beskrive sygdomme inden for infektionsepidemiologi og biologi. Her arbejdes i stedet

med kontaktraten 𝑘, som er givet ved:

𝑘 = 𝛼 · 𝑁 ⇔ 𝛼 =𝑘

𝑁

Kontaktraten 𝑘 beskriver det antal personer en enkelt smittende smitter pr. tidsenhed, hvis hele

populationen er modtagelig.

Infektionsraten, som bliver en brøk, beskriver hvor stor en del af den samlede befolkning, der bliver

smittet af en enkelt smittende pr. tidsenhed.

Når 𝛼 erstattes med 𝑘

𝑁 i differentialligningerne, fås nu nedstående differentialligninger.

𝑑𝑆

𝑑𝑡= −

𝑘

𝑁· 𝑆𝐼 + 𝛾𝐼

𝑑𝐼

𝑑𝑡=

𝑘

𝑁· 𝑆𝐼 − 𝛾𝐼


Side 30 af 73

Modellering af MRSA-spredning

På hjemmesiden for Statens Serum Institut er der fundet data over antal tilfælde af MRSA blandt

befolkningen i Danmark fra 2007 til 2018 (bilag 1). Som det kan ses, er antallet af MRSA-tilfælde

blandt befolkningen i Danmark steget gennem årene.

Figur 15 Søjlediagram over MRSA-tilfælde fra 2007-2018 i Danmark

Der kan findes data over antal tilfælde af MRSA for hver måned fra januar 2007 til og med

november 2018 (143 måneder)56, hvilket skrives i en Excel fil, da det vil blive brugt til

undersøgelsen af MRSA-spredningen med SIS-modellen.

Undersøgelse af MRSA-spredning med SIS-model

I MATLAB findes der en funktion kaldet ODE45, hvor ODE står for ordinary differential equation,

4 står for RK4 (Runge-Kutta fourth order method) og 5 står for RK5 (Runge-Kutta fifth order

method). ODE45 kan bruges til at løse koblede differentialligninger, hvilket vil blive brugt til at

løse differentialligningerne fra SIS-modellen. Data over antal MRSA-tilfælde vil blive brugt til at

undersøge om MRSA-spredningen kan beskrives med SIS-modellen.

56 (Statens Serum Institut, u.d.)


Side 31 af 73

I MATLAB laves en funktionsfil for SIS-modellen (se bilag 11), som kan finde værdierne af

konstanterne 𝑘 og 𝛾, så fejlfunktionen bliver mindst mulig. Der er indskrevet følgende konstanter i

modellen:

𝑁 = 5806015 (population i Danmark for 1. oktober 2018)57

𝐼0 = 51 (antallet af smittede i januar 2007)

𝑆0 = 𝑁 − 𝐼0 = 5806015 − 51 = 5805964 (antallet af smittemodtagelige i januar 2007)

I funktionsfilen er der gættet en løsning til kontaktraten til 𝑘 = 19, mens helbredelsesraten er

beregnet ud fra nedstående formel til 𝛾 = 1,5 , hvor varigheden af en MRSA-infektion er valgt til at

være på 20 dage, men infektionens varighed varierer fra person til person og alt efter hvilken type

infektion, der er tale om. Eksempelvis kan en person have MRSA i sår, som kan tage uger eller år

om at hele.58 I andre tilfælde kan en person være rask efter 10 dage, hvis MRSA-infektionen er

opdaget og behandlet tidligt af en læge.59 I nedstående beregning huskes der at tage højde for, at

tiden i modellen er måneder, mens varigheden af infektionen er indsat som dage.

𝛾 =1

𝑖𝑛𝑓𝑒𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛𝑒𝑛𝑠 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑔ℎ𝑒𝑑=

1

2030

= 1,5

For at kunne finde konstanterne i modellen minimeres fejlfunktionen mellem kendte data og

beregnede løsninger, hvilket svarer til følgende:

∑(𝐼𝑑𝑎𝑡𝑎(𝑖) − 𝐼𝑚𝑜𝑑𝑒𝑙(𝑖))2

𝑛

𝑖=1

I formlen er 𝐼𝑑𝑎𝑡𝑎(𝑖) smittede af MRSA fra dataene (Statens Serum Institut) og 𝐼𝑚𝑜𝑑𝑒𝑙(𝑖) er

smittede fundet fra modellen. Der beregnes fra begyndelsespunktet 𝑖 = 1, dvs. 𝐼0, til n’te 𝐼 værdi.

Der kvadreres, da der ikke skal være forskel på om punktet fra modellen ligger over eller under

data.

57 (Danmarks Statistik, 2018) 58 (HealthLinkBC, 2017) 59 (MRSA Research Center, u.d.)


Side 32 af 73

Efter differentialligningerne er skrevet i filen, kan der laves et plot over de smittede ud fra dataene

og de smittede fået fra SIS-modellen samt et plot for smittede og smittemodtagelige begge fået fra

SIS-modellen.

Nedstående er et plot over smittede fra data, som er den blå graf og smittede fået fra SIS-model, der

er den røde graf. På x-aksen er tiden angivet i måneder og y-aksen angiver antal smittede individer.

Ud fra den blå graf kan det ses, at MRSA-tilfældene i Danmark samlet set er steget i løbet af de 143

måneder med start i januar 2007. I løbet af hele perioden ses der mange svingninger for grafen, da

der i nogle måneder er flere MRSA-tilfælde. Den røde graf for smittede modelleret ud fra SIS-

model ligger midt i den blå graf og viser ligeledes en stigning af MRSA-tilfælde i løbet af de 143

måneder. Som tidligere nævnt er differentialligningen 𝐼′(𝑡) logistisk og har en analytisk løsning.

Grafen ligner grafer for logistisk vækst, derfor ses ingen svingninger for grafen.

Plot 4 Antal smittede individer fra data (blå graf) sammenlignet med SIS-model (rød graf)

Plottet herunder viser SIS-modellering for MRSA-spredningen, hvor den grønne graf viser de

smittemodtagelige og den røde graf viser de smittede. På x-aksen er tiden angivet i måneder og y-

aksen angiver antal individer. De to grafer er vandrette, og der er en stor afstand mellem dem,


Side 33 af 73

hvilket skyldes, at y-aksens skala er stor pga. den store forskel mellem antallet af smittede og

smittemodtagelige, dvs. en lille del af befolkning er smittede.

Plot 5 SIS-model - smittemodtagelige (grøn graf) og smittede (rød graf)

I MATLAB er konstanternes værdier fundet, hvor kontaktraten 𝑘 = 248,1764 og helbredelsesraten

𝛾 = 248,1554. Derefter kan infektionsraten beregnes med følgende formel:

𝛼 =𝑘

𝑁=

248,1764

5806015≈ 4,274471 · 10−5

Dermed er infektionsraten 𝛼 = 4,2745 · 10−5.

Udviklingen af MRSA-tilfælde i fremtiden

Der laves en ny funktionsfil, der kan forudsige udviklingen af MRSA-infektion blandt den danske

befolkning i fremtiden (se bilag 12). Som før bruges data fra Excel over MRSA, konstanterne i

modellen er opskrevet inklusiv den fundne være for kontaktraten og helbredelsesraten. Der vælges

at antal data skal være tre gange så meget som tidligere. Differentialligningerne løses med ODE45

og de to plot laves.


Side 34 af 73

Nedstående er et plot over smittede fra data (blå graf) og smittede fået fra SIS-modellen (rød graf).

På x-aksen angives tiden målt i måneder og y-aksen angiver antal smittede individer. Den røde graf

fortsætter længere end 143 måneder, dvs. kommer med et bud på antal smittede individer i

fremtiden. Her ses det tydeligere, at differentialligningen 𝐼′(𝑡) er logistisk, da den røde graf ligner

grafer for logistisk vækst, der nærmer sig et maksimum og flader ud. Maksimummet er i dette

tilfælde tærskelværdien, som er aflæst til, at antallet af smittede ifølge modellen vil nærme sig til

490 individer efter 414 måneder målt efter januar 2007. Med følgende formel kan det beregnes i

hvilket årstal antallet af MRSA-tilfælde nærmer sig 490 individer.

å𝑟𝑠𝑡𝑎𝑙 =𝑚å𝑛𝑒𝑑𝑒𝑟

𝑚å𝑛𝑒𝑑𝑒𝑟 𝑝å 𝑒𝑡 å𝑟+ 𝑠𝑡𝑎𝑟𝑡 å𝑟𝑠𝑡𝑎𝑙 =

414

12+ 2007 = 2041,5

Dermed vil antallet af smittede individer om måneden være 490 individer efter 2041 ifølge

modellen.

Plot 6 Smittede individer i fremtiden - data (blå graf) sammenlignet med SIS-model (rød graf)


Side 35 af 73

Plottet herunder viser SIS-modellering for MRSA-spredningen ud i fremtiden, hvor den grønne graf

viser de smittemodtagelige og den røde graf viser de smittede. På x-aksen er tiden angivet i

måneder og y-aksen angiver antal individer. Disse grafer er ligeledes vandrette, og der er en stor

afstand mellem dem, hvilket skyldes, at y-aksens skala er stor pga. den store forskel mellem antallet

af smittede og smittemodtagelige, dvs. en lille del af befolkning er smittede.

Plot 7 SIS-model for fremtiden - smittemodtagelige (grøn graf) og smittede (rød graf)

Vurdering af SIS-modellens anvendelighed

Ud fra SIS-modelleringen for MRSA-spredningen i Danmark er kontaktraten bestemt til 𝑘 =

248,1764, hvilket betyder, at et smittet individ smitter 248 individer på en måned, hvilket ikke er et

stort tal, hvis man tænker på, at et smittet individ både er sammen med familie, kollegaer på

arbejdet og berører mange offentlige overflader i løbet af bare en dag. Selvom MRSA kan smitte

ved, at man rører ved overflader, som en MRSA-positiv person har været i berøring med, er denne

smittevej ikke så hyppig som ved direkte kontakt, som oftest er tæt social kontakt, fordi MRSA kan

være på huden.60 En anden smittevej er gennem deling af fx håndklæde, seng eller andre personlige

60 (Statens Serum Institut, 2017)


Side 36 af 73

ejendele med en MRSA-positiv person.61 Da befolkningstætheden ikke er særlig stor i Danmark ift.

et land som fx Singapore og sundhedssystemet er veludviklet til at opdage en MRSA-infektion og

isolere patienten, vil en smittet person ikke kunne nå at smitte mange individer.

Infektionsraten beskriver her, hvor stor en del af befolkningen i Danmark en smittet smitter om

måneden. Den er bestemt til 𝛼 = 4,2745 · 10−5, som er et meget lille tal, hvilket kan skyldes, at der

ikke smittes mange individer og dermed er smittede individer lavt ift. befolkningstallet.

Helbredelsesraten er bestemt til 𝛾 = 248,1554. Med nedstående formel kan MRSA-infektionens

varighed i dage ifølge modellen beregnes.

𝛾 =1

𝑖𝑛𝑓𝑒𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛𝑒𝑛𝑠 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑔ℎ𝑒𝑑

248,1554 =1

𝑖𝑛𝑓𝑒𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛𝑒𝑛𝑠 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑔ℎ𝑒𝑑· 30

⇕ Ligningen løses for infektionens varighed vha. CAS-værktøjet WordMat.

𝑖𝑛𝑓𝑒𝑘𝑡𝑖𝑜𝑛𝑒𝑛𝑠 𝑣𝑎𝑟𝑖𝑔ℎ𝑒𝑑 = 0,120891989

Der fås et meget lille tal for varigheden af infektionen, som er urealistisk ift. virkeligheden. Dette

kan forklares ved, at helbredelsesraten kan have en anden betydning for MRSA-spredning. I dette

tilfælde med MRSA smitter et smittet individ ikke længere, når individet er blevet rask, men et

individ smitter heller ikke, når det er isoleret på sygehuset. Her beskriver helbredelsesraten, hvor

lang tid der går, før en smittet ikke aktivt smitter andre mere.

SIS-modellen har kunnet beskrive den samlede stigning i MRSA-tilfælde, men den er ikke

deltaljeret nok til at kunne modellere svingningerne, der skyldes ændringer i antallet af smittede.

Desuden skal der huskes, at der ved brug af epidemimodel er lavet nogle forudsætninger som at

populationen er konstant, hvilket den ikke er i virkeligheden, når man arbejder med en tidsperiode

på omkring 12 år. Endvidere kan epidemimodeller bruges til at forudsige antal smittede i fremtiden.

Det er et godt redskab for fx sundhedsvæsenet, da de ud fra data kan se i hvor høj grad, der skal

arbejdes med fx forebyggelse af sygdomme/infektioner, hvilket kan være mere i fokus, hvis der i

fremtiden vil blive mange smittede af en sygdom/infektion.

61 (HealthLinkBC, 2017)


Side 37 af 73

Vil AMP’er blive alternativ til antibiotika i fremtiden?

I modsætningen til antibiotika er fordelen ved AMP’er, at de har flere virkningsmekanismer, da de

har mange targets på bakterier, hvilket gør det svære for bakterierne at udvikle resistens. AMP’ers

primære virkningsmekanisme er at lave huller i bakteriers cellemembraner, så de bliver permeabel

for forskellige molekyler, hvilket medfører celledød.62 Hvis bakterierne skal udvikle resistens, skal

de omstrukturer hele deres cellemembran, hvilket kræver, at et stort antal gener muterer samtidigt.63

Derudover kan AMP’er ligesom antibiotika udøve effekt på intracellulære områder ved at påvirke

dannelsen af cellevæggen eller DNA-syntesen. Selvom udviklingen af resistens for AMP’er er

mindre, har det vist sig, at bakterier kan bruge forskellige mekanismer til at modstå AMP’er. De

kan ændre deres celleoverflade, hvilket vil frastøde AMP’er og mindske permeabilitet over for

dem.64

Hvis AMP’er vil benyttes som lægemidler er det vigtigt, at de udviser selektivitet over for

bakterieceller. En ulempe med AMP’er er, at de kan have svært ved at skelne mellem bakterieceller

og humane celler. Som tidligere nævnt er den hydrofobe del af AMP’er vigtig i ødelæggelsen af

bakteriers cellemembraner. Der kan opstå et problem, hvis der er for mange hydrofobe aminosyrer i

dem, da specificiteten over for bakterielle cellemembraner mindskes. Årsagen til det er, at de

hydrofobe regioner på peptidet tiltrækkes af hydrofobe regioner på humane cellemembraner.

Risikoen vil blive, at humane cellemembraner vil blive ødelagt sammen med eller i stedet for

bakteriernes cellemembraner. Når AMP’er har sådan en effekt på humane celler, betyder det, at de

er toksiske over for mennesker. Toksiciteten af AMP’er over for mennesker måles i form af deres

hæmolytiske effekt, dvs. hvor meget de ødelægger røde blodlegemer. Størstedelen af de naturlige

AMP’er er ikke hydrofobe nok til at udvise toksicitet over for mennesker, hvilket er en fordel.65

Desuden skal AMP’er have en passende længde, før de kan udøve deres antibakterielle effekt. For

at kunne lave huller i cellemembranen, skal de gennemkrydse hele cellemembranen, derfor skal

62 (Biotech Academy, u.d.) 63 (Nielsen R. H., 2007) 64 (Biotech Academy, u.d.) 65 (Biotech Academy, u.d.)


Side 38 af 73

længden af AMP’er være omkring samme tykkelse som cellemembranen. Der kan opstå et problem,

hvis AMP’er er for korte, da de vil være inaktive.66

Selvom AMP’er har gode egenskaber som lægemidler, vil der gå tid, før de vil komme på markedet.

Dette skyldes, at lægemiddeludviklingsprocessen både er tidskrævende og dyr, fordi der stilles

mange krav. Et potentielt lægemiddel skal igennem en del forsøg i laboratorier, før de må testes på

mennesker i kliniske studier. Undervejs kan der forekomme forhindringer. Når AMP’er indtages

oralt, skal de undgå at blive nedbrudt for hurtigt i kroppen. Da de er peptider, er der risiko for, at de

bliver nedbrudt af enzymet protease, så de ikke forbliver til at udøve deres effekt. AMP’er skal

være i kroppen længe nok til at udøve en effekt men ikke for lang tid, da det får en toksisk effekt for

kroppen. En ulempe for nogle naturligt forekomne AMP’er er, at de kan miste deres antibakterielle

effekt, når de kommer ind i kroppen. Eftersom AMP’er generelt er pH- og saltfølsomme, mister

nogle AMP’er deres aktivitet, hvis saltkoncentrationen er høj, og når de kommer ind i blodet.67

Desuden er der den ulempe, at nogle peptider kan medføre større risiko for bivirkninger end

konventionelle antibiotika fx allergiske reaktioner.68

Anticancer peptider

I løbet af de seneste år har der været fokus på forskning i AMP’er som et alternativ til

konventionelle antibiotika brugt til behandling af bakterieinfektion. Samtidig forskers der i andre

medicinske anvendelser af peptider. Set i et andet perspektiv har nogle AMP’er vist at have effekt

som anticancer peptider (ACP’er). Som tidligere beskrevet er AMP’er positive ladede, hvilket har

en stor betydning for deres antibakterielle effekt, da bakterier har negativ ladede cellemembraner,

hvilke fører til tiltrækning af AMP’er. En lignende mekanisme er set for ACP’ers aktivitet mod

cancerceller. Hos normale celler er der på indersiden af cellemembranen et negativ phospholipid

kaldet phosphatidylserin (PS), mens der hos cancerceller også er PS på ydresiden af

cellemembranen, hvilket fremmer specifik aktivitet af ACP’er mod cancerceller. Ligesom der med

AMP’er er fundet andre virkningsmekanismer end cellemembranen som target, er der for ACP’er

undersøgt om de ligeledes har andre virkningsmekanismer. ACP’er kan inhibere eller aktivere

essentielle proteiner, inhibere angiogenesis, som er væsentlig for vækst af tumor, eller rekruttere

66 (Biotech Academy, u.d.) 67 (Biotech Academy, u.d.) 68 (Nielsen R. H., 2007)


Side 39 af 73

immunceller til at angribe cancerceller (se figur 16). Da der er fundet ACP’er med selektivitet for

cancerceller og udvikling af mindre resistens sammenlignet med konventionelle kemoterapeutiske

stoffer, kan de blive et muligt alternativ i behandlingen af cancer i fremtiden.69

Figur 16 De forskellige virkningsmekanismer for anticancer peptider70

69 (Felício, Silva, Gonçalves, Santos, & L. Franco, 2017) 70 Lånt fra (Felício, Silva, Gonçalves, Santos, & L. Franco, 2017)


Side 40 af 73

Konklusion

I forbindelse med mit projekt har jeg studeret gramnegative og grampositive bakterier. Jeg har sat

mig ind i antibiotikas virkningsmekanismer mod bakterier, og hvordan de kan udvikle resistens.

Derudover har jeg arbejdet med AMP’er. Da de er positivt ladede, tiltrækkes de af bakteriers

negative cellemembran, hvor de borer hul i bakteriers cellemembraner.

Ud fra det udførte eksperiment kan jeg konkludere, at novicidin ikke har vist antibakteriel effekt

mod E.coli. Der kan være flere usikkerheder, som har haft indflydelse på resultatet fx kan det brugte

novicidin have været for gammelt, eller det kan være inaktiveret ved at binde sig til stoffer i mediet.

Af de undersøgte antibiotika har E.coli været følsom over for chloramphenicol og tetracyclin.

Desuden har jeg udledt og afprøvet forskellige numeriske metoder til løsning af en

differentialligning i MATLAB, hvor Runge-Kutta metoden har været den mest præcise. Inden jeg

har valgt SIS-modellen til undersøgelse af et datasæt over MRSA-tilfælde i Danmark, har jeg læst

om MRSA. Jeg er kommet frem til, at SIS-modellen kan beskrive den samlede stigning i MRSA-

tilfælde for perioden, men den viser ikke de mange svingninger, der er i datasættet, fordi

differentialligningen i modellen er logistisk. Ud fra de fundne værdier for kontaktraten og

helbredelsesraten har jeg lavet en simulering for MRSA-spredning i fremtiden.

Endvidere har jeg fundet ud af, at den antibakterielle aktivitet af AMP’er er bestemt af deres

ladning, hydrofobicitet, længde og miljø, hvilket der fokuseres på i design af AMP’er som

lægemidler. Hvis svaghederne og udfordringerne overvindes, kan AMP’er blive et godt alternativ

mod bakterie infektioner, da det er svære for bakterier at udvikle resistens mod dem.


Side 41 af 73

Videre arbejde

Frem mod finalen vil jeg arbejde videre på mit projekt. Jeg har taget kontakt til forskeren Thomas

Vorup-Jensen fra Aarhus Universitet, som har undersøgt den antibakterielle effekt af bl.a. det

antimikrobielle peptid LL-37, hvilket er publiceret i det videnskabelige tidskrift Scientific

Reports.71

I det følgende afsnit beskrives ideer til et eksperiment, som jeg tænker at udføre, inden finalen.

Jeg vil undersøge den antibakterielle effekt af det antimikrobielle peptid LL-37 mod E.coli eller en

anden bakterie, som LL-37 har vist antibakteriel effekt mod. I forbindelse med udførslen af

eksperimentet vil jeg først fremstille et flydende medie til dyrkning af bakterier. Dagen efter kan jeg

fremstille en fortyndingsrække i rør, hvor jeg laver fortyndinger af bakteriekulturen, hvorefter

fortyndingerne spredes på agarplader. Ud fra agarpladerne, som bliver inkuberet i et varmeskab,

kan det ses, hvilken/hvilke agarplader, der har et passende antal CFU’er (colony forming units). På

den måde kan der vælges, hvilken fortynding af bakteriekulturen, som jeg vil arbejde videre med.

Bakteriekulturen kan centrifugeres, hvorefter pellet i bunden af røret beholdes, mens supernatanten

pipetteres væk. Pellet kan blandes med PBS (phosphate buffered saline), derved genopløses

bakterierne i røret. Herefter kan der laves forskellige prøverør, hvor der er en kontrolprøve (PBS +

bakterier) samt prøver (PBS + bakterier + peptid) med varierende koncentration af peptidet, så den

antibakterielle effekt undersøges med forskellige koncentrationer af peptidet. Inden spredning af

alle prøverne på agarplader, lades prøverne stå i 30 minutter. Agarpladerne, som benyttes, er enten

et minimalmedie eller en anden form for agarplader fx blodagarplader. Efter inkubation af

agarpladerne i varmeskab kan jeg se, om LL-37 har haft antibakteriel effekt ved at sammenligne

prøverne med kontrolprøven.

71 (Vorup-Jensen, et al., 2017)


Side 42 af 73

Litteraturliste

Ahlborn, L. B., Blæsild, H., & Kragelund, B. B. (2013). Multiresistente bakterier - en trussel mod

mennesket. I Bioteknologisk forskning. Københavns Universitet.

Baktoft, A. (2010). Matematik i virkeligheden. Forlaget Natskyggen.

Bidstrup, B. B., & Schou, B. (2011). Bioteknologi 4. Nucleus.

Biotech Academy. (u.d.). Fremtidens antibiotika. Hentet December 2018 fra biotechacademy.dk:

https://www.biotechacademy.dk/undervisning/gymnasiale-projekter/find-fremtidens-

antibiotika/#1510836432703-5a79d92e-e6f74653-8bdd20b8-d7c9

Britz, D. (2010). Noter til elementær numerisk regning. Hentet December 2018 fra chem.au.dk:

http://chem.au.dk/fileadmin/www.chem.au.dk/Undervisningsmateriale/Dieter_Britz/numco

mp-dk.pdf

Brydensholt, M., & Ebbesen, G. R. (2012). Lærebog i matematik bind 4. Systime.

Danmarks Statistik. (2018). Folketal. Hentet December 2018 fra dst.dk:

https://www.dst.dk/da/Statistik/emner/befolkning-og-valg/befolkning-og-

befolkningsfremskrivning/folketal

Den Store Danske. (24. August 2017). Antibiotika. Hentet December 2018 fra denstoredanske.dk:

http://denstoredanske.dk/Krop,_psyke_og_sundhed/Sundhedsvidenskab/Farmakologi/antibi

otika

Dorosz, J., Gofman, Y., Kolusheva, S., Otzen, D., Ben-Tal, N., Nielsen, N. C., & Jelinek, R. (8.

Juni 2010). Membrane Interactions of Novicidin, a Novel Antimicrobial Peptide:

Phosphatidylglycerol Promotes Bilayer Insertion. J. Phys. Chem. B.

Egebo, L. A. (2006). Mikroskopisk liv - biologi med fokus på mikroorganismer. Nucleus.

Felício, M. R., Silva, O. N., Gonçalves, S., Santos, N. C., & L. Franco, O. (Februar 2017). Peptides

with Dual Antimicrobial and Anticancer Activities. Frontiers in Chemistry.

Gasbjerg, P. K., Jensen, G. S., & Sørensen, A. B. (2011). Bioteknologi - en basisbog. Systime.

HealthLinkBC. (Oktober 2017). Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA). Hentet

December 2018 fra healthlinkbc.ca: https://www.healthlinkbc.ca/healthlinkbc-

files/methicillin-resistant-staphylococcus-aureus

Henrik, F. (11. Oktober 2018). Udvikling af resistente bakterier. Hentet December 2018 fra

min.medicin: https://min.medicin.dk/Indledningsafsnit/Afsnit/3051


Side 43 af 73

Hulgard, K., & Madsen, C.-M. V. (2017). Biologibogen. Systime.

Jørgensen, F. G. (2017). Mikrobiologi. I M. Frøsig, K. Hede, F. G. Jørgensen, Paludan-M, & P.

Paludan-Müller, Biologi i udvikling. Nucleus.

Jensen, P. M. (2015). MSD Forår 2015.

Kreyszig, E. (1998). Advanced Engineering Mathematics. Wiley.

MRSA Research Center. (u.d.). Frequently Asked Questions about MRSA. Hentet December 2018

fra mrsa-research-center.bsd.uchicago.edu: http://mrsa-research-

center.bsd.uchicago.edu/patients_families/faq.html

Netdoktor. (21. Januar 2009). Antibiotika. Hentet December 2018 fra netdoktor.dk:

https://netdoktor.dk/medicin/antibiotika.htm

Nielsen , R. H. (2007). Antibiotika. I Det medicinerede menneske. Københavns Universitet.

Nielsen, L. A., & Østergaard, C. (2012). Mikrobiologi - hånden på hjertet. Munksgaard.

pro.medicin. (22. Februar 2018). Virkemåde (antibiotika til systemisk brug). Hentet December 2018

fra pro.medicin.dk: https://pro.medicin.dk/Laegemiddelgrupper/Grupper/315712

Pubchem. (u.d.). Ampicillin. Hentet December 2018 fra pubchem.ncbi.nlm.nih.gov:

https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/ampicillin#section=Top

Rasmussen, M. G. (2013). Matematisk modellering og numeriske metoder. Hentet December 2018

fra people.math.aau.dk:

http://people.math.aau.dk/~morteng/Homepage_files/E13MMNM/Lecture18.pdf

Statens Serum Institut. (24. August 2017). Methicillin resistente Staphylococcus aureus (MRSA).

Hentet December 2018 fra ssi.dk: https://www.ssi.dk/sygdomme-beredskab-og-

forskning/sygdomsleksikon/m/methicillin-resistente-staphylococcus-aureus

Statens Serum Institut. (u.d.). Overvågning i tal, grafer og kort. Hentet December 2018 fra

statistik.ssi.dk:

https://statistik.ssi.dk//sygdomsdata#!/?sygdomskode=MRSA&xaxis=Aar&show=Graph&d

atatype=Laboratory

Thougaard, H., Varlund, V., & Madsen, R. M. (2007). Praktisk mikrobiologi. Nyt Teknisk Forlag.

Undervisningsministeriet. (2014). Koblede differentialigninger. Hentet December 2018 fra hyl.fi:

http://hyl.fi/~mrahikka/itk15/StxA2014internetpreparationmaterial.pdf

Vorup-Jensen, T., Christiansen, S. H., Murphy, R. A., Juul-Madsen, K., Fredborg, M., Hvam, M.

L., . . . Nyengaard, J. R. (15. November 2017). The Immunomodulatory Drug Glatiramer

Acetate is Also an Effective Antimicrobial Agent that Kills Gram-negative Bacteria.

Scientific Reports.


Side 44 af 73

Worning, P. (2014). Der er flere bakterier i et gram lort end der er mennesker i verden. Fadl's

Forlag.


Side 45 af 73

Bilag

Bilag 1: Data fra Statens Serum Institut: Overvågning i tal, grafer og kort - MRSA

Bilaget er supperet med mere detaljerede data hentet direkte fra databasen på:

https://statistik.ssi.dk//sygdomsdata#!/?sygdomskode=MRSA&xaxis=Aar&show=Graph&d

atatype=Laboratory

Bilag 2: Bakteriers vækst

Bakterier formerer sig ved ukønnet formering, hvilket betyder, at der ved mitose dannes en klon af

den oprindelige bakterie. Processen, hvor en celle dannes, vokser og deler sig, kaldes en

cellecyklus. Generationstiden er den tid en cellecyklus tager, hvilket for bakterier kan vare fra ca.

20 minutter til flere dage alt efter hvilken bakterie der er tale om. En cellekultur af bakterier består

af et afgrænset system som fx en kolbe, hvor bakterierne kan formere sig.72

72 (Gasbjerg, Jensen, & Sørensen, 2011)


Side 46 af 73

Figur 17 Bakteriers vækstkurver består af fire faser.73

Den generelle vækstkurve er vist i figur 17. Den første fase er nølefasen, hvor bakterierne danner de

nødvendige enzymer og tilpasser deres livsprocesser til miljøet. Denne periode kan have forskellige

varighed og er kendetegnet ved, at antallet af bakterier næsten er konstant. Når bakterierne vokser i

antal, befinder de sig i den eksponentielle fase, hvor bakterierne deler sig hurtigere. Der dannes

flere nye bakterier end der dør med nogenlunde konstant vækstrate, derfor følger antallet af

bakterier en eksponentiel vækstfunktion, indtil væksten bliver begrænset. I den stationære fase er

populationsstørrelsen nogenlunde konstant, fordi antallet nydannede bakterier svarer til antallet af

døde bakterier. I den her fase opbruger bakterierne næringsstoffer og udskiller affaldsstoffer. Når

forholdene ikke er gode til, at bakterierne kan vedligeholde deres nødvendige livsprocesser,

bevæger bakterierne sig over i dødsfasen, som er kendetegnet ved, at antallet af bakterier der dør

overstiger antallet af nye bakterier og dermed falder antallet af levende bakterier. Der findes nogle

bakterier, som kan gå i en dvaletilstand i stedet for at dø. De forbliver i denne tilstand i lang tid,

indtil miljøforholdene eventuelt bliver passende igen.74

73 Lånt fra https://www.nucleus.dk/images/material/Mikrobiologi%20-%20Biologi%20i%20udvikling%20B-niveau%20-%20Nucleus%20Forlag%20ApS.pdf 74 (Jørgensen, 2017)


Side 47 af 73

Bilag 3: Journal: Virkningen af novicidin og antibiotika mod E.coli

Før eksperimentet

Indledende idéer og hypoteser

Når man dyrker bakterier i et laboratorium, skal man have et vækstmedie, som indeholder alle de

grundstoffer, som bakterierne har brug for til deres vækst. Grundstofferne skal indgå i kemiske

forbindelse, som kan udnyttes af bakterierne. Mediet skal indeholde en N-kilde, som fx kan bestå af

protein, peptider eller N-holdige uorganiske forbindelser. Det skal indeholde en energikilde, som

kan bestå af carbohydrat eller protein. Desuden skal mediet indeholde vand, nødvendige

vækststoffer som fx aminosyrer og vitaminer samt have en passende pH. Flydende medier består af

en vandig opløsning af næringsstoffer, mens faste medier er gjort faste ved at tilsætte agar som

geleringsmiddel til det flydende medie.75 Agar er et polysaccharid, som er udvundet fra alger, hvor

det fungerer som en del af algernes cellevæg. En opløsning af agar er fast stof ved stuetemperatur

og flydende ved opvarmning.76

En måde hvor der kan undersøges resistens hos bakterier er ved at inkubere dem på agarplader,

hvorefter der placeres antibiotika tabletter på pladerne. Antibiotika vil ved diffusion sprede sig ud i

agaren. Hvis bakterierne er følsomme overfor et antibiotikum, vil der dannes en zone uden om

tabletten uden bakterievækst (inhiberingszone). Er bakterierne resistente vil de også vokse rundt om

tabletten. Denne metode kaldes agardiffusionsmetoden.

I dette eksperiment undersøges virkningen af et antimikrobielt peptid kaldet novicidin og fire

antibiotika (penicillin, ampicillin, chloramphenicol og tetracyclin) mod E.coli bl.a. ved brug af

agardiffusionsmetoden.

E.coli er en gramnegativ bakterie og en del af normalfloraen i tarmen hos mennesker og dyr. De er

oftest bevægelige, har flageller og kan også have pili. Nogle stammer er mere patogene end andre.

75 (Thougaard, Varlund, & Madsen, 2007) 76 (Gasbjerg, Jensen, & Sørensen, 2011)


Side 48 af 73

Colibakterier kan bl.a give urinvejsinfektioner, sårinfektioner og lungebetændelse. Derudover

forekommer der øget resistens i colibakterier.77

Først kan der fremstilles flydende medier, hvorefter en koloni af E.coli, udtaget fra en agarplade,

tilføjes til det flydende medie, så bakterierne kan formere sig til flere bakterier, hvilket går hurtigt,

da E.coli under optimale forhold deler sig hvert 20 minutter78. Derudover kan der fremstilles fast

medie til støbning af agarplader i petriskåle. Dagen efter spredes E.coli fra det flydende medie på

agarpladerne, hvor der placeres antibiotika tabletter på pladerne, i en brønd (hul i pladerne) kan der

tilsættes flydende antibiotika og i en anden brønd novicidin. Virkningen af novicidin kan også

undersøges ved at blande noget af peptidet med E.coli fra det flydende medie, hvorefter det spredes

på en agarplade. Til en anden agarplade spredes kun E.coli fra det flydende medie, så de to plader

kan sammenlignes med hinanden, og dermed vil der kunne ses om novicidin har en virkning på

E.coli.

Hypotese: I agardiffusionstesten er inhiberingszonen et mål for, hvor godt et antibiotikum hæmmer

en bakterie, derfor forventer jeg, at effekten af antibiotika og novicidin vil kunne ses. Hvis der er en

inhiberingszone rundt om en tablet/brønd, har det antibakterielle middel haft en virkning. Desuden

forventer jeg, at novicidin kan have en virkning på E.coli, da novicidin har vist antibakteriel effekt

og er en modificering af andre eksisterende peptider.79

Metodebeskrivelse

Det flydende medie vil blive fremstillet ved blande LB Broth Base pulver med demineraliseret

vand, hvorefter opløsningen varmes op og steriliseres i en mikroovn. Det faste medie fremstilles

ved at blande LB Agar pulver i demineraliseret vand, hvorefter denne opløsning også varmes op og

steriliseres i en mikroovn. På hjemmesiden Frederiksen findes ud af i hvilket forhold pulver skal

opløses vandet. Efter afkøling af alle medierne, vil agaropløsningen fordeles i petriskåle, hvor de vil

få lov til at størkne, mens det flydende medie hældes i kolber/rør, hvorefter en E.coli koloni vil

blive tilføjet til hver kolbe/rør. De flydende bakteriekultur vil blive stillet i rystevandbad eller i et

77 (Nielsen & Østergaard, 2012) 78 (Jørgensen, 2017) 79 (Dorosz, et al., 2010)


Side 49 af 73

varmeskab, så bakterierne kan formere sig og blive til flere. Agarpladerne vil blive stillet i

køleskabet.

Dagen efter vil agardiffusionstesten blive udført, hvor der udplades bakterier på agarpladerne og

derefter pipetteres flydende ampicillin i en brønd i pladerne, novicidin (vandig opløsning) pipetteres

i en anden brønd i pladerne og de valgte antibiotika placeres på pladerne. Agarpladerne vil blive

stillet i et varmeskab ved 37 grader, da det ligger inde for den temperaturinterval, hvor bakterier

vokser bedst. Der vil blive lavet fire agarplader, hvor to af dem er udpladet med E.coli fra kolber,

og de andre to er udpladet med E.coli fra rør, hvor bakterie koncentrationen er størst. Da

agarpladerne vil blive ens to og to, kan der for hvert par beregnes en gennemsnitlig radius af

inhiberingszone for hvert antibakterielt middel. Herefter vil der laves to søjlediagrammer, hvor x-

aksen angiver det antibakterielle middel og y-aksen angiver radius af inhiberingszone målt i mm.

Samme dag hvor agardiffusionstesten vil blive udført, vil novicidins virkning også undersøges ved

at udeplade E.coli kultur på en agarplade, og på en anden agarplade udplade E.coli + novicidin, som

først har været blandet sammen i et eppendorfrør i 15 minutter. De to agarplader sættes også i

varmeskabet ved 37 grader til næste dag, hvorefter de to plader kvalitativt vil blive sammenlignet

med hinanden i forhold til bakterielaget. Her undersøges også bl.a. om peptidet kan dræbe bakterier

inden udpladning, så der er færre bakterier, som har mulighed for at vokse på agarpladen

sammenlignet med den anden agarplade. I agardiffusionstesten undersøges peptidets virkning, når

bakterierne er under bedre vækstforhold fra start, da de er på agarpladen, mens novicidin er i

brønden.

Desuden stilles en agarplade uden noget tilføjet ligeledes i varmeskabet, da det skal fungere som

kontrol for hele eksperimentet. Denne plade kan bl.a. vise, hvor sterilt der er arbejdet med fx

fremstilling af det faste medie alt efter om, der vokser bakteriekolonier frem på agarpladen og

antallet af bakteriekolonierne.

Materialer/apparatur

Dag 1- Mediefremstilling

Vægt, nøjagtighed ± 0,01 𝑔


Side 50 af 73

Plastikbæger

Plastikskeer

Engangshandsker

Sprit

Demineraliseret vand

LB Broth Base (indhold: trypton, gærekstrat, NaCl)

LB Agar, pulver

Mikroovn

Sprittusch

Gaffatape

Plastikpose

Petriskåle

Podenåle

LAF bænk

Køleskab

Rystevandbad

Varmeskab

5 Blue Cap flasker

2 rør

2 kolber

Sølvpapir

Dag 2 - Agardiffusionstest og undersøgelse af novicidins virkning

Podenåle

Pincet

Propbor sæt

Ethanol

Bægerglas

Mikropipette og pipettespidser

Ske

Morter med pistil

LB flydende medie


Side 51 af 73

Agarplader

Novicidin (i eppendorfrør udleveret af forsker på AU, koncentration på 500 mg/L)

Ampicillin

Penicillin

Tetracyclin

Chloramphenicol

Engangshandsker

Autoklave

Parafilm

Dag 3 - Observationer og måling af inhiberingszonens radius

Lineal

Skriveredskaber

Sikkerhedsmæssige overvejelser

Det er vigtigt, at der arbejdes korrekt med at udplade E.coli, lave brønde samt håndtering af de

antibakterielle midler og agarpladerne, så risikoen for kontaminering minimeres og spredning af

bakterier og antibakterielle midler til uønsket sted undgås. Når der arbejdes i laboratoriet, skal jeg

have kittel, sikkerhedsbriller og engangshandsker på, derved undgås, at der spildes på tøjet, fås

noget i øjnene eller på hænderne. Til sidst skal alt udstyr og affald, der har været i kontant med

E.coli, novicidin og antibiotika autoklaveres, da fx novicidin er cytotoxisk. Det er en god ide at

spritte arbejdspladsen af før og efter eksperimentet. Med hensyn til eksperimentets resultater, er det

bedst ikke at putte hænder i kolber og petriskåle, så undgås en overførsel af uønskede

mikroorganismer til og fra kolber/petriskåle. Undervejs i eksperimentet kan engangshandskerne

udskiftes, hvis der spildes noget på dem. Derudover kan de sprittes, før arbejdet med agarpladerne.

Desuden skal der huskes at skifte pipepettespids, når der arbejdes med en ny opløsning og/eller

agarplade. Arbejdet med agarpladerne og E.coli kan foregå i en LAF bænk, derved kan der arbejdes

sterilt, da luften filtreres igennem et filter.

Efter eksperimentet


Side 52 af 73

Fremgangsmåden

Dag 1

Fremstilling af flydende medie og fast medie:

• Der afvejes 8 gram LB Broth Base, som hældes ned i en Blue Cap flaske, hvorefter der

fyldes op med demineraliseret vand til 400 mL. Det samme gøres i tre andre Blue Cap

flasker.

Figur 18 Afvejning af LB Broth Base pulver

• En af gangen kommer Blue Cap flaskerne i mikroovnen i ca. 10-12 min., hvor de rystes en

gang undervejs. Mediet i flaskerne skal boble, men det må ikke koge, derfor slukkes

mikroovnen og startes igen, hvis det bobler for meget. Flaskernes låg skal være løst, når

flasken er i mikroovnen.

Figur 19 Sterilisering af medie


Side 53 af 73

• Der afvejes 14 gram LB agar pulver, som hældes ned i en Blue Cap flaske, hvorefter der

fyldes op med demineraliseret vand til 400 mL. Som de andre Blue Cap flasker sættes

flasken i mikroovnen, hvor pulveret opløses i vandet og mediet steriliseres.

• Derefter sættes alle Blue Cap flaskerne med medie til afkøling.

• Der rykkes over til en LAF bænk, hvor bordet og de iklædte engangshandsker sprittes af.

Petriskålene åbnes og låget lægges halvt på. Petriskålene påfyldes med agarmedie, så de er

halv fyldte, og låget lægges halvt på.

Figur 20 Påfyldning af medie i petriskåle

• Når agarmediet størkner, sættes låg på petriskålene. Petriskålene lægges med bunden opad i

en pose og posen lukkes med tape.

• En af Blue Cap flaskerne med flydende medie vælges, så der kan hældes 100 mL i to kolber.

Derudover afmåles 6 mL af det flydende medie i to rør.

• Med en podenål tages en E.coli koloni fra en agarplade og puttes i et af rørene. Det samme

gøres med det andet rør bare med en anden podenål.

• Med en podenål tages en lille E.coli koloni fra agarpladen og puttes i en af kolberne. Med en

ny podenål tages en større E.coli koloni fra agarpladen og puttes i den anden kolbe. Ved at

dreje podenålen mellem hænderne i kolben overføres E.coli kolonien til det flydende medie.


Side 54 af 73

Figur 21 Flydende kulturer af E.coli

• Agarpladerne placeres i køleskabet, kolberne med det flydende medie i et rystevandbad ved

37 grader og rørene med det flydende medie i et varmeskab ved 37 grader.

Figur 22 Flydende kultur af E.coli i rystevandbad

Dag 2

Agardiffusionstesten:

• På to agarplader udplades 120 𝜇𝐿 E.coli kultur fra kolben med den lille start koloni. Dette

gøres ved at suge E.coli kultur op fra kolben med en mikropipette, tømme det ud på

agarpladen og sprede kulturen ud.

• På to andre agarplader udplades der 120 𝜇𝐿 E.coli kultur fra et af rørene på samme måde

som før bare med en ny pipettespids.

• Med en propbor laves der to huller i de fire agarplader. Der skal ikke bores ned til bunden.

Hvis det sker, laves et nyt hul i agarpladerne.


Side 55 af 73

• En tablet ampicillin på 10 𝜇𝑔 knuses i en morter med en pistil og opløses i 25 𝑚𝐿 flydende

LB vækstmedie. 40 𝜇𝐿 ampicillin suges op med mikropipetten og tømmes ned i et hul i en

agarplade. Det samme gøres i det andre agarplader.

• Med en ny pipettespids suges 20 𝜇𝐿 novicidin op og tømmes ned i et hul i en agarplade. Det

samme gøres i det andre agarplader.

• En pincet dyppes ned i ethanol og lægges til at tørre. Pincetten bruges til at tage et

antibiotikum og placerer den på en agarplade. Der placeres en tablet chloramphenicol på

hver plade. Det samme gøres med de andre antibiotika tabletter.

Figur 23 De brugte antibiotika

• Agarpladerne placeres i et varmeskab ved 37 grader.

Test af det antimikrobielle peptid novicidins virkning på E.coli:

• Med en mikropipette suges der 100 𝜇𝐿 E.coli kultur op fra kolben med den lille start koloni

og tømmes ned i et eppendorfrør. Det samme gøres i et andet eppendorfrør. Til et af

eppendorfrørene tilsættes ca. 50 𝜇𝐿 novicidin med en ny pipettespids. Eppendorfrøret rystes.

• 15 minutter senere udplades de 100 𝜇𝐿 E.coli kultur fra eppendorfrøret til en agarplade med

en mikropipette.

• Med en ny pipettespids udplades 100 𝜇𝐿 fra det andet eppendorrør med både kultur og

novicidin til en anden agarplade.

• En tredje agarplade gøres der ikke noget ved, da den skal bruges som kontrol.


Side 56 af 73

Figur 24 Agardiffusionstest og test af novicidin

• Agarpladerne placeres i et varmeskab ved 37 grader.

Figur 25 Agarpladerne i varmeskabet

Udstyr og affald der har været i kontakt med novicidin, antibiotika og E.coli autoklaveres.


Side 57 af 73

Figur 26 Affald i autoklave

Dag 3

Agarpladerne tages ud af varmeskabet. Iagttagelser og resultater fra agarpladerne skrives ned og

radius af inhiberingszonerne måles med en lineal. Der måles midt fra tabletten eller hullet til kanten

af inhiberingszonen. Når zonen er ujævn, vælges et sted, som er repræsentativt.

Observationer/Måleresultater/Databehandling

Test af det antimikrobielle peptid novicidins virkning på E.coli:

Agarplade Foto Kommentar


Side 58 af 73

Kontrol (uden noget)

Figur 27 Kontrol-agarplade

På agarpladen ses små

bakteriekolonier, der har

forskellige farver (gul og grå).

Da bakteriekolonier er vokset

frem på agarpladen, har arbejdet

ikke været helt sterilt.

E.coli (uden novicidin)

Figur 28 Agarplade med E.coli

På agarpladen ses et lag af

bakterier, som ikke er lige tykt

fordelt på agarpladen.


Side 59 af 73

E.coli + novicidin

Figur 29 Agarplade med E.coli og novicidin

På agarpladen ses et lag af

bakterier, som ikke er lige tykt

fordelt på agarpladen.

Agardiffusionstest:

Antibakteriel middel Radius af inhiberingszone

(mm)

Foto

Agarplade 1 (kolbe med flydende E.coli kultur - lille startkoloni)

Novicidin 0

Figur 30 Agarplade 1

Flydende ampicillin 0

Ampicillin 0

Penicillin 0

Tetracyclin 8,0

Chloramphenicol 15


Side 60 af 73

Agarplade 2 (kolbe med flydende E.coli kultur - lille startkoloni)

Novicidin 0



Ampicillin 0

Penicillin 0

Tetracyclin 8,0

Chloramphenicol 10

Agarplade 3 (rør med flydende E.coli kultur)

Novicidin 0



Ampicillin 0

Penicillin 0

Tetracyclin 9,0

Chloramphenicol 10

Agarplade 4 (rør med flydende E.coli kultur)

Novicidin 0


Ampicillin 0

Penicillin 0

Tetracyclin 8,0


Side 61 af 73

Chloramphenicol 10


Da der er brugt samme E.coli flydende kultur fra en kolbe til agarplade 1 + 2, kan gennemsnittet af

radius af inhiberingszonerne for hvert antibakteriel middel beregnes. I agarplade 3 + 4 er der brugt

samme E.coli flydende kultur fra rør, så her kan gennemsnittet af radius af inhiberingszonerne

ligeledes findes. Der kan laves to søjlediagram i Excel, hvor x-aksen angiver antibakteriel middel

og y-aksen angiver radius af inhiberingszone målt i mm.

Tabel 2 Radius af inhiberingszone for de undersøgte antibakterielle midler på agarplade 1 + 2


Side 62 af 73

Nedstående søjlediagram for gennemsnitlig radius af inhiberingszonerne på agarplade 1+2 samt

værdierne i tabellerne viser, at det kun har været tetracyclin og chloramphenicol, der har hæmmet

bakterievækst, da der er en inhiberingszone for disse to antibiotika, mens inhiberingszonen for de


tetracyclin er 8 mm, mens den for chloramphenicol er 12,5 mm.

Figur 34 Søjlediagram over gennemsnitlig radius af inhiberingszone for de antibakterielle midler på agarplade 1 + 2

Tabel 3 Radius af inhiberingszone for de undersøgte antibakterielle midler på agarplade 3 + 4


Side 63 af 73

Nedstående søjlediagram for gennemsnitlig radius af inhiberingszonerne på agarplade 3+4 samt

værdierne i tabellerne viser, at det kun har været tetracyclin og chloramphenicol, som har hæmmet

bakterievækst, da der er en inhiberingszone for disse to antibiotika, mens inhiberingszonen for de


tetracyclin er 8,5 mm, mens den for chloramphenicol er 10 mm.

Figur 35 Søjlediagram over gennemsnitlig radius af inhiberingszone for de antibakterielle midler på agarplade 3 + 4

Belæg

Resultater for den del af eksperimentet, hvor en agarplade er udpladet med E.coli kultur og en

anden agarplade er udpladet med E.coli + novicidin, som har været blandet sammen først, viser ikke

forskel i bakterielaget, da begge plader er næsten helt tildækket af bakterier. Agarpladen uden noget

tilføjet, der har fungeret som kontrol, viser, at der er vokset små bakteriekolonier frem.

Agardiffusionstesten viser, at E.coli har været mest følsom for chloramphenicol og derefter

tetracyclin, da der ved disse to antibiotika ses en inhiberingszone, hvilket gælder på alle agarplader.

Den gennemsnitlige radius af inhiberingszone for chloramphenicol er lig med 12,5 mm for

agarplade 1 + 2 og lig med 10 mm for agarplade 3 + 4. Den gennemsnitlige radius af

inhiberingszone for tetracyclin er lig med 8 mm for agarplade 1 + 2 og 8,5 mm for agarplade 3 + 4.

Ved de andre antibiotika og novicidin ses ingen inhiberingszone.


Side 64 af 73

Diskussion

I dette eksperiment har novicidin ikke vist antibakteriel effekt, da der ikke ses færre E.coli bakterier

på agarpladen med E.coli + novicidin sammenlignet med agarpladen med kun E.coli samt ingen

inhiberingszone på de andre agarplader. Der kan være flere usikkerheder og fejlkilder, som har haft

indflydelse på resultaterne. Det brugte novicidin har ligget omkring 10 år i en fryser, da det er

ubrugte rester givet af en forsker fra Aarhus Universitet, hvor de ikke har haft brug for det længere.

Derfor kan novicidin være blevet for gammelt og mistet sin antibakterielle effekt. Desuden kan det

være, at der skal bruges en større koncentration og/eller volumen af novicidin ift. de brugte E.coli

kulturer. En tredje usikkerhed er, at peptidet kan have bundet sig til stoffer i det rige medie og

derved blevet inaktiveret eller mistet sin virkning. Til en anden gang kan det måske undgås ved at

bruge et minimalmedie, når der arbejdes med peptider. Et minimalmedie er sammensat sådan, at det

lige netop indeholder de stoffer, der skal til for at sikre en bakteries vækst, dvs. det opfylder

bakteriernes minimale vækstkrav. Derudover kan det være, at E.coli og novicidin skal have stået i

længere tid i eppendorfrøret inden spredning på agarpladen, så virkningen af novicidin på

bakterierne kan nås.

Når der udføres et eksperiment, er det vigtigt at sikre sig, at der kun måles på en ting ad gangen

(variabelkontrol). I agardiffusionstesten er der anvendt forskellige koncentrationer og volumen af

novicidin og ampicillin i brøndene samt antibiotika har haft forskellig masse bortset fra

chloramphenicol og tetracyclin, der har været det samme. Derfor er det kun de to antibiotika, der

kan sammenlignes med hinanden ift., hvad der er mest effektivt. På alle agarpladerne har

inhiberingszonen for chloramphenicol været størst, så den har haft størst effekt på E.coli.

Tetracyclin og chloramphenicol hæmmer begge bakteriers proteindannelse.80 Derudover er de

bredspektrede antibiotika, da de er virksomme over for mange forskellige bakterier både

grampositive og gramnegative.81

For de andre brugte antibakterielle midler mod E.coli kan der ses på, om de har haft en effekt,

hvilket de ikke har, da der ikke er nogen inhiberingszone.

80 (Netdoktor, 2009) 81 (Den Store Danske, 2017)


Side 65 af 73

Colibakterier har altid været resistente over for penicillin, der er et smalspektret antibiotikum, fordi

de som mange andre gramnegative bakterier har en cellevæg, som penicillin ikke kan trænge igen.82

Dette stemmer overens med resultaterne, da der ikke ses nogen inhiberingszone.

Ampicillin er et bredspektret antibiotikum, derfor virker det på mange grampositive og

gramnegative bakterier.83 I eksperimentet har ampicillin ikke haft nogen virkning på E.coli, da der

ikke er nogen inhiberingszone. Resultatet kan skyldes, at E.coli stammen er resistent over for

ampicillin, eller massen af ampicillin i tabletten kan have være lille ift. bakteriekoncentrationen på

agarpladerne. Derudover er ampicillin fortyndet for meget, så der ikke har været så meget af

antibiotikummet i brøndene.

Inhiberingszonerne er ikke helt runde, hvilket kan skyldes, at E.coli ikke er blevet fordelt over hele

pladen. Til en anden gang skal der huskes, at bakterierne kan spredes ved udstrygning med

drigalski-spatel. Desuden er der ikke arbejdet helt sterilt, da der på agarpladen uden noget tilføjet

(kontrol) er vokset små bakteriekolonier frem, hvilket betyder, at de andre plader ligeledes kan have

ca. samme mængde bakterier fra start. Dette har ikke haft en stor betydning for det undersøgte i

eksperimentet, men i mange andre eksperimenter skal der arbejdes helt sterilt. Hvis der er mulighed

for det, er det bedst at sterilisere i en autoklave fremfor en mikroovn.

Refleksion

Ved en agardiffusionstest er virkningen af antibiotikaene chloramphenicol, tetracyclin, ampicillin

og penicillin samt det antimikrobielle peptid novicidin undersøgt. Ud fra resultaterne er der set

inhiberingszoner for chloramphenicol og tetracyclin, så E.coli har kun været følsom over for de to

antibiotika. Virkningen af peptidet er også undersøgt ved at sammenligne en agarplade udpladet

med E.coli kultur med en agarplade udpladet med E.coli kultur + novicidin, som først har været

blandet sammen i et eppendorfrør. Resultaterne har ikke vist forskel i bakterielaget på de to

agarplader, så her har novicidin heller ikke vist en antibakteriel effekt.

I forbindelse med eksperimentet har jeg fået et bedre indblik i, hvordan der fremstilles fast og

flydende medie samt udførslen af en agardiffusionstest. Jeg er kommet frem til, at der er mange

overvejelser i planlægningen af et eksperiment med et antimikrobielt peptid. Hvis jeg har haft mere

novicidin og et andet antimikrobielt peptid, kan eksperimentet med peptidet udføres igen, hvor der

82 (Nielsen & Østergaard, 2012) 83 (Pubchem, u.d.)


Side 66 af 73

fx bruges et minimalmedie til agarpladerne, en større koncentration af peptidet, testes på flere

forskellige bakterier eller virkningen af peptidet undersøges i flydende kultur af bakterier.

Teoretisk har jeg bl.a. lært, hvad der er vigtigt for bakteriers vækst, om forskellige antibakterielle

midler og deres virkemåde samt antibiotikaresistens.


Side 67 af 73

Bilag 4: Analytisk løsning af en differentialligning

Der er valgt en differentialligning:

𝑦′ = 4 · 𝑡 + 𝑦

Differentialligningen kan omskrives til nedstående ved brug af panserformlen med

differentialligning 𝑦′ + 𝑎(𝑡) · 𝑦 = 𝑏(𝑡).

𝑦′ − 𝑦 = 4 · 𝑡

𝑦′ − 1𝑦 = 4 · 𝑡

Funktionerne 𝑎(𝑡) og 𝑏(𝑡) identificeres og stamfunktionen 𝐴(𝑡) findes.

𝑎(𝑡) = −1

𝑏(𝑡) = 4 · 𝑡

𝐴(𝑡) = −𝑡

Værdierne indsættes i panserformlen

𝑦 = 𝑒−𝐴(𝑡) · ∫ 𝑏(𝑡) · 𝑒𝐴(𝑡)𝑑𝑡 + 𝑐 · 𝑒−𝐴(𝑡)

𝑦 = 𝑒−(−𝑡) · ∫ 4𝑡 · 𝑒−𝑡𝑑𝑡 + 𝑐 · 𝑒−(−𝑡) = −4 · 𝑡 + 𝑒𝑡 · 𝑐 − 4

Der er valgt startbetingelsen 𝑦(0) = 2, derfor indsættes 𝑡 = 0 og 𝑦 sættes til 𝑦 = 2. Derefter

isoleres 𝑐.

2 = −4 · 0 + 𝑒0 · 𝑐 − 4

⇕ Ligningen løses for c vha. CAS-værktøjet WordMat.

𝑐 = 6

Derefter indsættes 𝑐 i løsningen for 𝑦.

𝑦 = −4 · 𝑡 + 𝑒𝑡 · 𝑐 − 4 = −4 · 𝑡 + 𝑒𝑡 · 6 − 4

Dermed er løsningen for differentialligningen lig med 𝑦 = −4 · 𝑡 + 𝑒𝑡 · 6 − 4.


Side 68 af 73

Bilag 5: Funktionsfil for Eulers metode

function [t,y] = eulerApprox(t0,deltat,endt,y0,func) % fil: eulerApprox.m %------------------------------------------------------------------- % Denne MatLab funktion vil finde approximationen til en ODE givet ved % y' = func(t,y) % y(t0) = y0 % % Input til denne fil er: % t0 : startværdi for t % deltat : skridtlængden % endt : slutværdi for t % y0 : begyndelsesværdi for funktionen % func : navn på den funktionsfil der indeholder højresiden % % Output er: % t : vektor med de punkter funktionsværdier er beregnet i % y : vektor med den approximative løsning til ODE

% Her oprettes vektor med alle t-værdier t = [t0:deltat:endt];

% Oprette en y-vektor fyldt med 0-nuller for at få samme størrelse som t y = 0*t;

% Genmer y0 i y(1) y(1) = y0;

for i=2:max(size(y)), k1 = deltat*feval(func,t(i-1),y(i-1)); y(i) = y(i-1) + k1; end end

Bilag 6: Beregning af højre side af differentialligningen

function [h] = h(t,y) % Beregning af højreside af differentialligning h = 4*t+y;

Bilag 7: Scriptfil for numerisk løsning med Eulers metode

% Scriptfil der sammenligner Euler med forskellig skridtlængde

% definition af variabler t0 = 0; % begyndelsestid y0 = 2; % y-værdi for begyndelsestiden delta1 = 0.2; % skridtlængde 1 delta2 = 0.1; % skridtlængde 2


Side 69 af 73

endt = 5; % sluttid

% Beregn af numeriske løsninger [t1,y1] = eulerApprox(t0,delta1,endt,y0,@h); % med skridtlængde 1 [t2,y2] = eulerApprox(t0,delta2,endt,y0,@h); % med skridtlængde 2

% Beregning af analytisk løsning ya=-4*t2+exp(t2)*6-4;

%Plot plot(t1,y1,'b',t2,y2,'g',t2,ya,'r') title('Euler - løsning til differentialligningen h = 4*t+y') legend('skridtlængde=0.2','skridtlængde=0.1','analytisk') xlabel('t') ylabel('y') grid on

Bilag 8: Funktionsfil for Heuns metode

function [t,y] = heunApprox(t0,deltat,endt,y0,func) % fil: heunApprox.m %------------------------------------------------------------------- % Denne MatLab funktion vil finde approximationen til en ODE givet ved % y' = func(t,y) % y(t0) = y0 % % Input til denne fil er: % t0 : startværdi for t % deltat : skridtlængden % endt : slutværdi for t % y0 : begyndelsesværdi for funktionen % func : navn på den funktionsfil der indeholder højresiden % % Output er: % t : vektor med de punkter funktionsværdier er beregnet i % y : vektor med den approximative løsning til ODE



% Genmer y0 i y(1) y(1) = y0;

for i=2:max(size(y)), k1 = deltat*feval(func,t(i-1),y(i-1)); k2 = deltat*feval(func,t(i),y(i-1)+k1); y(i) = y(i-1) +0.5*(k1+k2); end end


Side 70 af 73

Bilag 9: Funktionsfil for Runge-Kuttas metode function [t,y] = RungeKuttaApprox(t0,deltat,endt,y0,func) % fil: RungeKuttaApprox.m %------------------------------------------------------------------- % Denne MatLab funktion vil finde approximationen til en ODE givet ved % y' = func(t,y) % y(t0) = y0 % % Input til denne fil er: % t0 : startværdi for t % deltat : skridtlængden % endt : slutværdi for t % y0 : begyndelsesværdi for funktionen % func : navn på den funktionsfil der indeholder højresiden % % Output er: % t : vektor med de punkter funktionsværdier er beregnet i % y : vektor med den approximative løsning til ODE



% Genmer y0 i y(1) y(1) = y0;

for i=2:max(size(y)), k1 = deltat*feval(func,t(i-1),y(i-1)); k2 = deltat*feval(func,t(i-1)+0.5*deltat,y(i-1)+0.5*k1); k3 = deltat*feval(func,t(i-1)+0.5*deltat,y(i-1)+0.5*k2); k4 = deltat*feval(func, t(i-1)+deltat,y(i-1)+k3); y(i) = y(i-1)+ (k1+2*k2+2*k3+k4)/6; end end

Bilag 10: Scriptfil der sammenligner numeriske metoder med analytisk løsning % Scriptfil der sammenligner forskellige numeriske metoder med analytisk % løsning

% definition af variabler t0 = 0; % begyndelsestid y0 = 2; % y-værdi for begyndelsestiden delta = 0.1; % skridtlængde endt = 5; % sluttid

% Beregn af numeriske løsninger [t1,y1] = eulerApprox(t0,delta,endt,y0,@h); [t2,y2] = heunApprox(t0,delta,endt,y0,@h); [t3,y3] = RungekuttaApprox(t0,delta,endt,y0,@h);

% Beregning af analytisk løsning


Side 71 af 73

ya=-4*t2+exp(t2)*6-4;

%Plot plot(t1,y1,'b',t2,y2,'g',t3,y3,'cx',t2,ya,'r') title('Euler, Heun, RK og analytisk - løsning til differentialligningen h =

4*t+y') legend('Euler','Heun','Runge-Kutta','analytisk') xlabel('t') ylabel('y') grid on

Bilag 11: Funktionsfil for SIS-model til MRSA

function [k,g,t,ymin]=SISmodel % Finder værdi af konstanter, så fejlfunktionen bliver mindst mulig. % Hent data fra Excelfil Data = xlsread('MRSA Data'); % Gem y og t variable hver for sig tinfected = Data(:,1); yinfected = Data(:,2);

% Konstanter i modellen N = 5806015; % Population i Danmark S0 = N-Data(1,2); % smittemodtagelige I0 = Data(1,2); % smittede/inficerede

n = length(Data); % Antal data

% Lokal funktion der beregner fejlfunktionen mellem kendte data og beregnede

løsning function ERR = objfun(x); k = x(1);% kontaktraten g = x(2);% helbredelsesraten

[t,ymin] = ode45(@(t,y)[-(k/N)*y(1)*y(2)+g*y(2);(k/N)*y(1)*y(2)-

g*y(2)],[1:1:n],[S0;I0]); ERR = sum((yinfected - ymin(:,2)).^2); end;

% Gæt løsning X = [19,1.5]; % Minimerer fejlfunktionen for at finde konstanterne i modellen Xmin = fminsearch(@objfun,X);

% Endelige løsning k = Xmin(1); g = Xmin(2); [t,ymin] = ode45(@(t,y)[-(k/N)*y(1)*y(2)+g*y(2);(k/N)*y(1)*y(2)-

g*y(2)],[1:1:n],[S0;I0]);

% Plot inficerede/smittede sammenlignet med modellen figure(1) plot(t,ymin(:,2),'r')


Side 72 af 73

hold on; plot(tinfected,yinfected,'b'); legend('Model','Data') xlabel('t (måneder)') ylabel('Antal individer') title('Smittede - data sammenlignet med SIS-model')

% Plot SIS data til endelige løsning figure(2) plot(t,ymin(:,1),'g',t,ymin(:,2),'r') legend('S(t)','I(t)') xlabel('t (måneder)') ylabel('Antal individer') title('SIS-model') end

Bilag 12: Funktionsfil for SIS-model til MRSA i fremtiden

function [t,ymin]=SISsim % Hent data fra Excelfil Data = xlsread('MRSA Data'); % Gem y og t variable hver for sig tinfected = Data(:,1); yinfected = Data(:,2);

% Konstanter i modellen N = 5806015; % Population i Danmark S0 = N-Data(1,2); % smittemodtagelige I0 = Data(1,2); % smittede/inficerede

% Modelkonstanter k =248.1764; % kontaktraten g = 248.1554; % helbredelsesraten

n = 3*length(Data); % Antal data

% Løs differentialligningerne

[t,ymin] = ode45(@(t,y)[-(k/N)*y(1)*y(2)+g*y(2);(k/N)*y(1)*y(2)-

g*y(2)],[1:1:n],[S0;I0]);

% Plot inficerede/smittede sammenlignet med modellen figure(1) plot(t,ymin(:,2),'r') hold on; plot(tinfected,yinfected,'b'); legend('Model','Data') xlabel('t (måneder)') ylabel('Antal individer') title('Smittede - data sammenlignet med SIS-model')

% Plot SIS data til endelige løsning figure(2) plot(t,ymin(:,1),'g',t,ymin(:,2),'r')


Side 73 af 73

legend('S(t)','I(t)') xlabel('t (måneder)') ylabel('Antal individer') title('SIS-model') end

Date post:	13-Feb-2020
Category:	Documents
Upload:	others
View:	13 times
Download:	0 times

MRSA og antimikrobielle peptiderEmma Paydari Unge Forskere - Life Science Egaa Gymnasium Side 2 af...

Documents