Arbeitsanleitung/Manual MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium real time PCR kit Test für den qualitativen in-vitro-Nachweis von Mycoplasma-hominis-/-genitalium-DNA in klinischen Proben Test for the qualitative in vitro detection of Mycoplasma hominis/genitalium DNA in clinical specimens Gültig ab / Valid from 2018-07-17 Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, 64625 Bensheim, Germany Tel.: +49 6251 70190-0 Fax: + 49 6251 849430 e.mail: [email protected]www.immundiagnostik.com KS293196 96 -18 °C
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Arbeitsanleitung/Manual
MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium
real time PCR kitTest für den qualitativen in-vitro-Nachweis von
Mycoplasma-hominis-/-genitalium-DNA in klinischen Proben
Test for the qualitative in vitro detection of Mycoplasma hominis/genitalium DNA
10 VORBEREITUNG DER REAGENZIEN UND PROBEN _________________________ 4
10.1 Vorbereitung und Lagerung der Reagenzien ______________________________ 410.2 Vorbereitung der Proben _____________________________________________ 4
1 VERWENDUNGSZWECKDer MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium Real-time-PCR-Kit dient dem Nach-weis von Mycoplasma-hominis-/-genitalium-DNA in klinischen Proben mittels Real-time-PCR in offenen Real-time-PCR-Systemen (z. B. LightCycler 480 [Roche], Rotor-Gene 3000/6000/Q [Qiagen], MyGo Pro [IT-IS Life Sciences, erhältlich bei LTF]).Nur für Forschungszwecke.
2 EINLEITUNGDie Mycoplasmataceae sind die einzige Bakterienfamilie der Ordnung Mycoplasma-tales. Die meisten Arten sind Parasiten und oft humanpathogen. Sie besitzen keine Zellwand und leben intrazellulär. In der Familie sind zwei Gattungen vertreten: My-coplasma und Ureaplasma.Die parasitären Mycoplasmen verursachen meist chronische Infektionen (Mykoplas-mosen). Nicht alle Arten sind obligat pathogen und zählen oft zu der natürlichen Bakterienflora. Sie sind somit nicht immer bzw. nur unter speziellen Umständen krankheitserregend. Dies gilt z. B. für Mycoplasma hominis und Ureaplasma urealyti-cum: diese Arten besiedeln normalerweise den Darm. Durch das Fehlen der Zellwand sind Mycoplasmataceae resistent gegen die Zellwand angreifende oder Murein-Synthese hemmende Antibiotika wie z. B. Penicillin.Mycoplasma hominis und Ureaplasma urealyticum sind Erreger von unspezifischen Infektionen des Urogenitaltrakts. Sie besiedeln als Parasiten ausschließlich Men-schen und Tiere. Der Urease-Test verläuft bei Ureaplasma positiv, im Gegensatz zu Mycoplasma ist Ureaplasma in der Lage, Harnstoff abzubauen.
3 TESTPRINZIPDer MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium Real-time-PCR-Kit enthält spezi-fische Primer und fluoreszenzfarbstoffmarkierte Sonden sowie zusätzliches Material für den Nachweis von Mycoplasma-hominis-/-genitalium-DNA in klinischem Proben-material.Die Detektion der Amplifikation erfolgt in Echtzeit durch die Hybridisierung und an-schließende Hydrolyse der erregerspezifischen Fluoreszenzsonden. Die Detektion erfolgt im JOE/ROX-Kanal (gelb, 554 bzw. 602 nm). Zusätzlich verfügt der MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium Real-time-PCR-Kit über eine Kontroll-DNA, die während der Extraktion zugefügt und in einem hete-rologen Amplifikationssystem nachgewiesen wird. Dies ermöglicht zum Einen das Aufdecken von Fehlern bei der DNA-Extraktion, zum Anderen kann eine mögliche Inhibition der PCR identifiziert werden. Dadurch wird das Risiko von falsch negativen
Ergebnissen reduziert. Die Detektion der DNA-Extraktionskontrolle erfolgt im FAM-Kanal (grün, 515 nm).
4 INHALT DER TESTPACKUNGDie mitgelieferten Komponenten sind ausreichend für den Ansatz von 96 Nachweis-reaktionen.
Tabelle 1: Inhalt des MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium Real-time-PCR-Kits
Bezeichnung Abkürzung Deckel farbe Inhalt
Master-Mix, lyophilisiert MM weiß 5 vials
Rekonstitutionslösung für Ma-ster-Mix RECSOL 1 gelb 2 ml
Positivkontrolle PC rot 300 µl
Interne Kontrolle, lyophilisiert IC hellbraun 1 vial
Negativkontrolle NC grün 300 µl
Rekonstitutionslösung für IC RECSOL 2 violett 1,1 ml
5 ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL• DNA-Extraktionskit (z. B. MutaCLEAN® Universal DNA/DNA, KG1038)• Sterile Reaktionsgefäße• Pipetten (variable Volumina)• sterile Pipettenspitzen mit Filter• Tischzentrifuge• Vortex-Wirbelmischer• Real-time-PCR-Gerät• optische PCR-Gefäße mit Deckel• optional: Pipettiergeräte zur Automation
6 TRANSPORT, LAGERUNG UND STABILITÄTDer Transport des MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium Real-time-PCR-Kit er-folgt gekühlt bei 2–8 °C. Alle Komponenten sind direkt nach Erhalt lichtgeschützt bei 2–8 °C zu lagern. Den Kit nach Ablauf des auf der Packung angegebenen Haltbar-keitsdatums nicht mehr verwenden.Nach Anbruch der Reagenzien sind diese für maximal zwölf Monate verwendbar.
Schützen Sie den Test während der gesamten Testlaufzeit vor direkter Sonnenein-strahlung.
7 WICHTIGE HINWEISE• Die MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium Real-time-PCR muss in für
diesen Zweck geeigneten Laboratorien und von speziell geschultem Personal durchgeführt werden.
• Die Richtlinien der Good Laboratory Practice (GLP) sind einzuhalten.
• Alle Proben müssen als potentiell infektiös betrachtet werden und alle mit den Proben in Berührung kommenden Gegenstände müssen als potenti-ell kontaminiert erachtet werden. Es sollte daher mit Schutzhandschuhen, Schutzkleidung und Schutzbrille gearbeitet werden.
8 ALLGEMEINE HINWEISE• Der Assay ist immer nach der im Kit beigefügten Arbeitsanleitung durchzu-
führen.
• Areale für die Probenvorbereitung und den Ansatz des PCR-Master-Mix sollten strikt getrennt sein.
• Pipetten, Röhrchen und andere Arbeitsmaterialien dürfen nicht von einem Bereich in den anderen zirkulieren.
• Immer Pipettenspitzen mit Filtern verwenden.
• Pipetten und Arbeitsflächen regelmäßig mit geeigneter Dekontaminationslö-sung reinigen (keine ethanolhaltigen Mittel).
• Reagenzien der Testpackung dürfen nicht mit anderen Chargen gemischt werden.
• Beachten Sie bei der Entsorgung nationale und regionale Richtlinien.
9 PROBENMATERIALDas Ausgangsmaterial für die Nachweisreaktion ist DNA, die aus klinischen Proben isoliert wurde.
10.1 Vorbereitung und Lagerung der Reagenzien• Bitte achten Sie bei mehrfachem Einsatz des Kits darauf, dass die Reagenzien
wie angegeben gelagert und nur die für den jeweiligen Ansatz benötigten Reagenzienmengen frisch angesetzt werden.
• Reagenzien mit einem Volumen kleiner 100 µl sollten vor Gebrauch kurz an-zentrifugiert werden, um Volumenverluste zu vermeiden.
• Nehmen Sie den Kit vor Gebrauch aus dem Kühlschrank und lassen Sie ihn für mindestens 30 min ungeöffnet Raumtemperatur erreichen. Entnehmen Sie die benötigte Menge an Reagenzgefäßen und lagern Sie die übrigen Rea-genzgefäße umgehend wieder bei 2–8 °C.
• Vorbereitung des Master-Mix: Der lyophilisierte Master-Mix (MM) wird vor Gebrauch mit 300 µl Rekonstitutionslösung für Master-Mix (RECSOL 1) re-konstituiert, vorsichtig gemischt, zum Lösen 15 Minuten stehen gelassen und anschließend gründlich gemischt. Rekonstituierter Master-Mix ist für zwei Wochen bei 2–8 °C haltbar.
• Rekonstitutionslösung für Master-Mix (RECSOL 1) ist nach dem Öffnen drei Monate bei 2–8 °C haltbar.
• Vorbereitung der internen Kontrolle: Die lyophilisierte interne Kontrolle (IC) wird vor Gebrauch mit 1 ml Rekonstitutionslösung für IC (RECSOL 2) rekonstituiert, vorsichtig gemischt, zum Lösen 15 Minuten stehen gelassen und anschließend gründlich gemischt. Rekonstituierte interne Kontrolle ist für vier Wochen bei 2–8 °C haltbar.
• Die Negativkontrolle (NC) ist nach dem Öffnen vier Wochen bei 2–8 °C halt-bar.
• Alle anderen Testreagenzien sind gebrauchsfertig und, bei 2–8 °C gelagert, bis zum angegebenen Verfallsdatum verwendbar.
10.2 Vorbereitung der ProbenDie MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium Real-time-PCR ist geeignet für den Nachweis von Mycoplasma-hominis-/-genitalium-DNA, die zuvor mit Hilfe geeigneter Methoden aus Proben isoliert wurde. Kommerziell erhältliche Extraktionskits kön-nen zur DNA-Isolierung verwendet werden. Immundiagnostik empfiehlt MutaCLE-AN® Universal DNA/DNA (KG1038).
Falls die Real-time-PCR nicht sofort durchgeführt wird, müssen die DNA-Extrakte entsprechend den Angaben des DNA-Extraktionskitherstellers aufbewahrt werden.
11 KONTROLL-DNADer MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium Real-time-PCR enthält eine Kontroll-DNA (IC), die zum einen als DNA-Extraktionskontrolle dient, zum anderen als interne Kontrolle mögliche Inhibitionen der Real-time-PCR aufzeigt.
DNA-Isolation aus klinischen Proben
a) Kontroll-DNA als ExtraktionskontrolleMutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium Kontroll-DNA zur DNA-Extraktion ge-ben. Kontroll-DNA zu jeder Extraktion zugeben, gut mischen. Führen Sie die DNA-Isola-tion gemäß der Anleitung des Herstellers durch. Das dem Lysepuffer zuzugebende Kontroll-DNA-Volumen richtet sich nach dem jeweils verwendeten Volumen an DNA-Elutionspuffer: 1 µl Kontroll-DNA pro 10 µl Elutionspuffer. Setzen Sie anschließend die Real-time-PCR nach Protokoll A an.Die Kontroll-DNA muss dem Lysepuffer des Extraktionskits zugesetzt werden.
b) Kontroll-DNA als interne Kontrolle der Real-time-PCRSollte keine Kontrolle der DNA-Extraktion gewünscht sein, sondern lediglich eine Kontrolle der PCR, so kann die Kontroll-DNA erst beim Ansetzen der PCR zugegeben werden. In diesem Fall ist die Real-time-PCR nach Protokoll B anzusetzen.
12 REAL-TIME-PCR
12.1 Wichtige Hinweise vor Beginn• Bevor Sie die PCR ansetzen, machen Sie sich mit dem Real-time-PCR-Gerät
vertraut.
• Die Programmierung des Temperaturprofils sollte abgeschlossen sein, bevor die PCR angesetzt wird.
• Beachten Sie, dass in jedem PCR-Lauf mindestens eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle enthalten sein sollte.
• Alle Reagenzien müssen auf Raumtemperatur gebracht, gemischt (Reaktions-Mix nicht vortexen, sondern durch wiederholtes Auf- und Abpipettieren mi-
schen) und ggf. kurz anzentrifugiert werden, um die Reagenzien am Gefäß-boden zu sammeln.
12.2 DurchführungFalls die Kontroll-DNA als echte Extraktionskontrolle verwendet wird, bitte Protokoll A folgen. Wird die Kontroll-DNA lediglich zur Kontrolle einer möglichen Inhibition der Real-time-PCR verwendet, bitte Protokoll B befolgen.
Ansetzen der Real-time-PCR
• Benötigte Anzahl optischer PCR-Reaktionsgefäße in den Kühlblock des Real-time-PCR-Geräts stellen.
• DNA-Eluate, die Positivkontrolle und die Negativkontrolle in die entspre-chenden Gefäße pipettieren:Protokoll A (Kontroll-DNA bereits zur Extraktion hinzugegeben): pipettieren Sie die Ansätze nach Tabelle 4aProtokoll B (Kontroll-DNA ausschließlich Real-time-PCR-Kontrolle): pipettie-ren Sie die Ansätze nach Tabelle 4b
• Die Reaktionsgefäße sofort nachdem die Probe zugefügt wurde verschließen, um das Kontaminationsrisiko zu minimieren.
Tabelle 4a: Ansetzen der Real-time-PCR nach Protokoll A
Tabelle 4b: Ansetzen der Real-time-PCR nach Protokoll B
KomponenteVolumen
Probe Positiv-kontrolle
Negativ-kontrolle
Master-Mix 12,5 µl 12,5 µl 12,5 µl
Interne Kontrolle 2,5 µl 2,5 µl 2,5 µl
Positivkontrolle – 2,5 µl –
Probe 10 µl – –
Negativkontrolle ad 25 µl – 7,5 µl 10 µl
Gesamtvolumen 25,0 µl
12.3 GeräteeinstellungenFür die Real-time-PCR ist das in Tabelle 5 beschriebene Temperaturprofil zu benut-zen.
Tabelle 5: Real-time-PCR-Temperaturprofil
Beschreibung Dauer Temperatur Zyklenanzahl
Vorheizen 2 min 50 °C 1
Initiale Denaturierung 2 min 95 °C 1
cDNA-Amplifikation50
Messung am Ende dieses Schrittes
Denaturierung 10 s 94 °C
Annealing und Verlängerung 40 s 60 °C
Kühlen (optional) 1 min 10 °C 1
13 INTERPRETATION DER ERGEBNISSEDie Mycoplasma-hominis-/-genitalium-spezifische Amplifikation wird im JOE/ROX-Kanal detektiert. Die Amplifikation der Kontroll-DNA wird im FAM-Kanal gemessen.
Folgende Ergebnisse können auftreten:
• Im JOE-Kanal wird ein Signal detektiert:Das Ergebnis ist positiv, die Probe enthält Mycoplasma-hominis-DNA.In diesem Fall ist die Detektion eines Signals im FAM-Kanal nicht notwendig, da eine hohe Mycoplasma-hominis-DNA-Konzentration zu einem verminder-
ten bzw. fehlenden Fluoreszenzsignal der Kontroll-DNA führen kann (Kompe-tition).
• Im ROX-Kanal wird ein Signal detektiert:Das Ergebnis ist positiv, die Probe enthält Mycoplasma-genitalium-DNA.In diesem Fall ist die Detektion eines Signals im FAM-Kanal nicht notwen-dig, da eine hohe Mycoplasma-genitalium-DNA-Konzentration zu einem ver-minderten bzw. fehlenden Fluoreszenzsignal der Kontroll-DNA führen kann (Kompetition).
• Im JOE/ROX-Kanal wird kein Signal detektiert, jedoch im FAM-Kanal:Das Ergebnis ist negativ, die Probe enthält keine Mycoplasma-hominis-/-genitalium-DNA.Das detektierte Signal der Kontroll-DNA schließt die Möglichkeit einer feh-lerhaften DNA-Extraktion aus (falls die Kontroll-DNA als Extraktionskontrolle benutzt wurde). Außerdem ist die PCR nicht inhibiert.
• Weder im JOE/ROX- noch im FAM-Kanal wird ein Signal detektiert: Es kann keine diagnostische Aussage getroffen werden.Die Real-time-PCR wurde inhibiert oder es trat ein Fehler bei der DNA-Extrak-tion auf. Wurde die Kontroll-DNA während der DNA-Extraktion zugefügt und nicht direkt in den PCR-Master-Mix gegeben, dann ist die negative Kontrolle in beiden Kanälen negativ.
Abbildung 1 und Abbildung 2 zeigen Beispiele für positive und negative Real-time-PCR-Ergebnisse.
Abb. 1: Die positive Probe zeigt eine starke Amplifi kation im Mycoplasma-genitalium-spezifi schen ROX-Kanal, während bei der negativen Probe kein Fluoreszenzsignal detektiert wird.
Abb. 2: Die positive Probe zeigt eine starke Amplifi kation im Mycoplasma-hominis-spezifi schen JOE-Kanal, während bei der negativen Probe kein Fluoreszenzsignal detektiert wird.
Abb. 3: Im FAM-Kanal zeigen sowohl die positive als auch die negative Probe ein Signal. In diesem Fall liegt keine Inhibition der Real-time-PCR vor, auch verlief die DNA-Extraktion erfolgreich. Die negative Probe ist somit als tatsächlich negativ zu werten.
14 VALIDIERUNGSDATENStellen Sie die Grenzwerte des Real-time-Geräts wie im Folgenden beschrieben ein.
NegativkontrollenAlle Negativkontrollen sollten unter dem Grenzwert liegen. Im Falle einer möglichen Kontamination (Auftreten einer Kurve in der Negativkontrolle oder einer Anhäufung von Kurven in Proben mit hohem CT) sind die erhaltenen Ergebnisse nicht interpre-tierbar und der gesamte Lauf (inklusive der Extraktion) muss wiederholt werden.
PositivkontrollenAlle Positivkontrollen müssen eine positive, d. h. exponentielle Amplifi kationskurve aufweisen. Die Positivkontrollen müssen unter einen CT-Wert von 40 (HEX) bzw. 32 (ROX) fallen.
Interne KontrollenAlle internen Kontrollen müssen eine positive, d. h. exponentielle Amplifi kations-kurve aufweisen. Der CT-Wert der internen Kontrolle muss unter 40 liegen. Falls der CT-Wert der internen Kontrolle über 40 liegt, deutet dies auf ein DNA-Aufreinigungs-
problem oder eine stark positive Probe hin, welche die interne Kontrolle inhibieren kann. In letzterem Fall ist das Testergebnis valide.
15 EINSCHRÄNKUNGENDie Ergebnisse müssen stets im Kontext der klinischen Symptome betrachtet wer-den. Therapeutische Entscheidungen sollten unter Berücksichtigung klinischer Da-ten getroffen werden.Ein negatives Testergebnis schließt eine Mycoplasma-hominis-/-genitalium-Infektion nicht aus.
16 PROBLEMBEHANDLUNGDie folgenden Problembeschreibungen sollen bei eventuell auftretenden Proble-men mit der Real-time-PCR behilflich sein. Sollten Sie weitere Fragen, haben wenden Sie sich bitte direkt an Immundiagnostik.
Kein Fluoreszenzsignal im JOE/ROX-Kanal der Positivkontrolle
Der gewählte entspricht nicht dem im Protokoll angegebenen KanalWählen Sie den JOE/ROX-Kanal für die Analyse der Mycoplasma-hominis-/-geni-talium-spezifischen Amplifikation und den FAM-Kanal für die Amplifikation der Kontroll-DNA .
Fehlerhaftes Ansetzen der Real-time-PCRÜberprüfen Sie Ihre Arbeitsschritte und vergleichen Sie diese mit den im Kapitel „Durchführung“ beschriebenen Schritten.
Fehlerhaftes Real-time-PCR-TemperaturprofilVergleichen Sie das Temperaturprofil mit dem Protokoll (Tabelle 5).
Falsche Lagerbedingungen des Kits oder abgelaufenes HaltbarkeitsdatumÜberprüfen Sie die Lagerbedingungen und das Haltbarkeitsdatum auf dem Kit-etikett. Falls nötig, benutzen Sie einen neuen Kit und lagern Sie alle Komponen-ten wie im Kapitel „Transport und Lagerung“ beschrieben.
Schwaches oder kein Signal der Kontroll-DNA und gleichzeitiges Ausbleiben eines Signals im JOE/ROX-Kanal
Die Real-time-PCR-Bedingungen stimmen nicht mit den im Protokoll be-schriebenen übereinÜberprüfen Sie die Real-time-PCR-Bedingungen (Kapitel 12).
Real-time-PCR-InhibitionStellen Sie sicher, dass Sie eine geeignete Extraktionsmethode benutzen (sie-he Kapitel „Probenvorbereitung“). Beachten Sie die Herstellerangaben. Stellen Sie sicher, dass ethanolhaltige Waschpuffer vollständig entfernt wurden (ein zusätzlicher Zentrifugationsschritt bei hoher Geschwindigkeit vor der DNA-Elution wird empfohlen).
Verlust der DNA während des AufarbeitungsprozessesFalls die Kontroll-DNA vor der Extraktion zugefügt wurde, kann das Ausbleiben des Signals auf eine fehlerhafte DNA-Extraktion hinweisen. Stellen Sie sicher, dass Sie eine geeignete Extraktionsmethode verwenden und beachten Sie die Herstellerangaben.
Falsche Lagerbedingungen des Kits oder abgelaufenes HaltbarkeitsdatumÜberprüfen Sie die Lagerbedingungen und das Haltbarkeitsdatum auf dem Kit-etikett. Falls nötig, benutzen Sie einen neuen Kit und lagern Sie alle Komponen-ten wie im Kapitel „Transport und Lagerung“ beschrieben.
Detektion eines Signals im JOE/ROX-Kanal der Negativkontrolle
Kontamination des Real-time-PCR-AnsatzesWiederholen Sie die Real-time-PCR in Replikaten. Falls das Ergebnis der Wieder-holungen negativ sein sollte, so ereignete sich die Kontamination während der Befüllung der Reaktionsgefäße. Stellen Sie sicher, dass Sie die Positivkontrolle zuletzt pipettieren und verschließen Sie die Reaktionsgefäße sofort nachdem Sie die jeweilige Probe zugegeben haben. Falls die Negativkontrolle in der Wie-derholung wieder ein Signal im JOE/ROX-Kanal ergibt, deutet dies darauf hin, dass eine oder mehrere Kitkomponenten kontaminiert sind. Stellen Sie sicher, dass die Arbeitsbereiche und die Geräte regelmäßig dekontaminiert werden. Wiederholen Sie die Real-time-PCR mit einem neuen Kit.
17 ABBREVIATIONS AND SYMBOLS _______________________________________ 27
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Manual MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium
1. INTENDED USEThe MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium real time RT-PCR is an assay for the detection of Mycoplasma hominis/genitalium DNA in clinical specimens using real time PCR microplate systems (e. g. LightCycler 480 [Roche], RotorGene 3000/6000/Q [Qiagen]).For research use only. Not for use in diagnostic procedures.
2 PATHOGEN INFORMATIONMycoplasmataceae are the only family of bacteria in the order Mycoplasmatales. Most species are parasites and often pathogenic for humans. They have no cell wall and live intracellularly. The family contains two genera: Mycoplasma and Ureaplasma.Parasitic mycoplasms usually cause chronic infections (mycoplasmoses). Not all spe-cies are not obligatory pathogenic and often belong to the natural microbial flora and therefore are not always or only under certain circumstances causing disease. This is e. g. true for the species Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum which usually grow in the gut.Due to the lack of a cell wall, Mycoplasmataceae are resistent against antibiotics that attack the cell wall or inhibit murein synthesis like e. g. penicillin.Mycoplasma hominis and Ureaplasma urealyticum are pathogens causing unspecific infections of the urogenital system. These parasites only use humans and animals as hosts. The urease test is positive for Ureaplasma: in contrast to Mycoplasma, it is capable of metabolising urea.
3 PRINCIPLE OF THE TESTThe MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium real time PCR kit contains specific primers and dual-labelled probes for the amplification and detection of Mycoplasma hominis/genitalium DNA in clinical specimens. The presence of nucleic acid is detect-ed by an increase in fluorescence due to hydrolysis of the probes during amplifica-tion.The fluorescence of the pathogen-specific probes is measured in the JOE/ROX chan-nel (yellow, 554 and 602 nm, respectively).Furthermore, MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium real time PCR kit contains a control DNA, which is added during DNA extraction and detected in the same re-action by a differently labelled probe. The control DNA allows the detection of PCR inhibition and acts as control for the isolation of the nucleic acid from the clinical specimen. The fluorescence of the control DNA is measured in the FAM channel (green, 515 nm).
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4 PACKAGE CONTENTSThe reagents supplied are sufficient for 96 reactions.
Table 1: Components of the MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium real time PCR kit .
Label Abbreviation Lid colour Content
Master mix, lyophilised MM white 5 vials
Reconstitution solution for master mix RECSOL 1 yellow 2 ml
Positive control PC red 300 µl
Internal control, lyophilised IC light brown 1 vial
Negative control NC green 300 µl
Reconstitution solution for IC RECSOL 2 violet 1.1 ml
5 EQUIPMENT AND REAGENTS TO BE SUPPLIED BY USER• DNA isolation kit (e. g. MutaCLEAN® Universal DNA/RNA, KG1038)• Sterile microtubes• Pipets (adjustable volume)• Sterile pipet tips with filter• Table centrifuge• Vortex• Real time PCR instrument• Optical PCR reaction tubes with lid• Optional: Liquid handling system for automation
6 TRANSPORT, STORAGE AND STABILITYThe MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium real time PCR-Kit is shipped on cool packs at 2–8 °C. All components must be stored at 2–8 °C in the dark immediately after receipt. Do not use reagents after the date of expiry printed on the package.For convenience, opened reagents can be stored at 2–8 °C for up to 12 months.Protect kit components from direct sunlight during the complete test run.
7 IMPORTANT NOTES• The MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium real time PCR must be per-
formed by qualified personnel only.
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Manual MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium
• Good Laboratory Practice (GLP) has to be applied.
• Clinical samples must always be regarded as potentially infectious material and all equipment used has to be treated as potentially contaminated.
8 GENERAL PRECAUTIONS• Stick to the protocol described in the instructions for use.
• Set up different laboratory areas for the preparation of samples and for the set up of the PCR in order to avoid contaminations.
• Pipettes, tubes and other materials must not circulate between those differ-ent laboratory areas.
• Always use filter tips.
• Regulary decontaminate equipment and benches with ethanol-free decon-taminant.
• Do not interchange different lot numbers of any kit component within the same assay.
• For waste disposal, please follow national and regional guidelines.
9 SAMPLE MATERIALStarting material for the real time PCR is DNA isolated from clinical specimens.
10 PREPARATION OF REAGENTS AND SAMPLES
10.1 Preparation and storage of reagents• To run the assay more than once, ensure that reagents are stored at the condi-
tions stated on the label. Prepare only the appropriate amount necessary for each run.
• Reagents with a volume less than 100 µl should be centrifuged before use to avoid loss of volume.
• Before use, take the kit out of the refrigerator and bring it to room tempera-ture by letting it sit for at least 30 min. Take the reagents needed from and put the rest immediately back to 2–8 °C.
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• Preparation of the master mix: Before use, the lyophilised master mix (MM) has to be reconstituted with 300 µl reconstitution solution for mas-ter mix (RECSOL 1) and mixed by gentle inversion to ensure complete re-constitution. Allow the vial content to dissolve for 15 minutes and then mix thoroughly. Master mix (reconstituted MM) is stable at 2–8 °C for 2 weeks.
• Once opened, reconstitution solution for master mix (RECSOL 1) is stable for up to 3 months at 2–8 °C.
• Preparation of the internal control: Before use, the lyophilised interal control (IC) has to be reconstituted with 1 ml reconstitution solution for IC (RECSOL 2) and mixed by gentle inversion to ensure complete reconstitution. Allow the vial content to dissolve for 15 minutes and then mix thoroughly. Internal control (reconstituted IC) is stable at 2–8 °C for 4 weeks.
• Once opened, negative control (NC) is stable for up to 4 weeks at 2–8 °C.
• All other test reagents are ready-to-use. Test reagents are stable until the ex-piry date (see label) when stored at 2–8 °C.
10.2 Sample preparationThe MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium real time PCR is suitable for the de-tection of DNA of Mycoplasma hominis/genitalium isolated from clinical specimens with appropriate isolation methods. Commercial kits for DNA isolation such as Muta-CLEAN® Universal DNA/RNA (KG1038) are recommended.If the real time PCR is not performed immediately, store extracted DNA according to the instructions given by the DNA extraction kit’s manufacturer.
11 CONTROL DNAAn internal control DNA (IC) is supplied and can be used as extraction control or only as inhibition control. This allows the user to control the DNA isolation procedure and to check for possible real time PCR inhibition.
DNA isolation from clinical specimen
a) Control DNA used as extraction controlMutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium control DNA is added to the DNA extrac-tion.Add control DNA to each extraction. Mix well. Perform the DNA isolation according to the manufacturer’s instructions. The volume of control DNA that has to be added
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Manual MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium
to the lysis buffer depends on the volume of DNA elution buffer used: 1 µl control DNA per 10 µl elution buffer.Please follow protocol A. The control DNA must be added to the lysis buffer of the extraction kit.
b) Control DNA used as internal control of the real time PCRIf not DNA extraction, but only real-time PCR inhibition will be checked, the control DNA is added directly to the PCR reaction. Please follow protocol B.
12 REAL TIME PCR
12.1 Important points before starting• Before setting up the real time PCR, familiarise yourself with the real time PCR
instrument and read the user manual supplied with the instrument.
• The programming of the thermal profile should take place before the PCR set up.
• In every PCR run, one positive control and one negative control should be included.
• Before each use, all reagents should be brought to room temperature, thour-oughly mixed (do NOT vortex the reaction mix but mix by pipetting up and down repeatedly), and centrifuged very briefly to collect the reagent at the bottom of the tube.
12.2 ProcedureIf the control DNA is used to control both, the real time PCR and the DNA isolation procedure, please follow protocol A. If the control DNA is solely used to detect pos-sible inhibition of the real time PCR, please follow protocol B.
Real time PCR set up
• Place the number of optical PCR reaction tubes needed into the respective tray of the real time PCR instrument.
• Pipet DNA eluates, positiv and negative control in the respective optical PCR reaction tubes.Protocol A (control DNA has been added to the extraction): prepare the reac-tion according to table 4a.
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Protocol B (controll DNA only for real-time PCR control): prepare the reaction according to table 4b.
• Immediately after adding the samples, close the PCR tubes to minimise the risk of contamination.
Table 4a: Preparation of the real-time PCR according to protocol A
ReagentVolume
Sample Positive control Negative control
Master mix 12.5 µl 12.5 µl 12.5 µl
Positive control – 2.5 µl –
Sample 10 µl – –
Negative control ad 25 µl 2.5 µl 10 µl 12.5 µl
Total volume 25.0 µl
Table 4b: Preparation of the real-time PCR according to protocol B
ReagentVolume
Sample Positive control Negative control
Master mix 12.5 µl 12.5 µl 12.5 µl
Internal control 2.5 µl 2.5 µl 2.5 µl
Positive control – 2.5 µl –
Sample 10 µl – –
Negative control ad 25 µl – 7.5 µl 10 µl
Total volume 25.0 µl
12.3 Instrument settingsFor the real time PCR, use the thermal profile shown in table 5.
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Table 5: real time PCR thermal profile
Description Time Temperature No of cycles
Pre-heating 2 min 50 °C 1
Initial denaturation 2 min 95 °C 1
DNA amplification50
Measurement at the end of this step
denaturation 10 s 94 °C
Annealing and ex-tension 40 s 60 °C
Cooling (optional) 1 min 10 °C 1
13 DATA ANALYSISThe bacteria-specific amplification is measured in the JOE/ROX channel. The amplifi-cation of the control DNA is measured in the FAM channel.
The following results can occur:
• A signal in the JOE channel is detected: The result is positive, the sample contains Mycoplasma hominis DNA. In this case, detection of a signal of the control DNA in the FAM channel is in-essential, as high concentrations of Mycoplasma hominis/genitalium DNA may reduce or completely inhibit amplification of the control DNA (competition).
• A signal in the ROX channel is detected: The result is positive, the sample contains Mycoplasma genitalium DNA. In this case, detection of a signal of the control DNA in the FAM channel is in-essential, as high concentrations of Mycoplasma hominis/genitalium DNA may reduce or completely inhibit amplification of the control DNA (competition).
• No signal in the JOE/ROX channel, but a signal in the FAM channel is de-tected: The result is negative, the sample does not contain Mycoplasma hominis/genitalium DNA.The signal of the control DNA excludes the possibilities of DNA isolation fail-ure (in case the control DNA is being used as an extraction control) and/or real time PCR inhibition.
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• Neither in the JOE/ROX nor in the FAM channel a signal is detected:A diagnostic statement cannot be made.The DNA isolation was not successful or an inhibition of the PCR has occurred. In case the control DNA was added during DNA isolation and not directly to the PCR master mix, the negative control is negative in both channels.
Figures 1–3 how examples for positive and negative real time PCR results.
Figure 1: The positive sample shows Mycoplasma genitalium-specifi c amplifi cation in the ROX channel, whereas no fl uorescence signal is detected in the negative sample.
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Manual MutaPLEX® Mycoplasma hominis/genitalium
Figure 2: The positive sample shows Mycoplasma hominis-specifi c amplifi cation in the JOE channel, whereas no fl uorescence signal is detected in the negative sample.
Figure 3: The positive sample as well as the negative sample show a signal in the control DNA-specifi c FAM channel. The amplifi cation signal of the control DNA in the negative sample shows that the missing signal in the bacteria-specifi c JOE/ROX channel is not due to PCR inhibition or failure of DNA isolation, but that the sample is a true negative.
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14 ASSAY VALIDATIONSet the thresholds as follows:
Negative controlsAll negative controls should be below the threshold. If there is a potential contami-nation (appearance of a curve in the negative control or a cluster of curves in speci-mens at high CT), results obtained are not interpretable and the whole run (includ-ing extraction) has to be repeated.
Positive controlsAll the positive controls must show a positive (i. e. exponential) amplification curve. The positive controls must fall below a CT of 40 (JOE and ROX).
Internal controlsAll internal controls must show a positive (i. e. exponential) amplification curve. The internal control must fall below a CT of 40. If the internal control is above CT 40, this points to a purification problem or a strong positive sample that can inhibit the inter-nal control. In the latter case, the result is valid.
15 LIMITATIONS OF THE METHODThe results must always be considered in relation to the clinical symptoms. Thera-peutical consequences should be made in consideration of clinical data. A negative test result does not exclude an Mycoplasma hominis/genitalium infection.
16 TROUBLESHOOTINGThe following troubleshooting guide is included to help you with possible problems that may arise when performing a real time PCR. For further questions, please con-tact Immundiagnostik AG.
No fluorescence signal in the JOE/ROX channel of the positive control
The selected channel for analysis does not comply with the protocolSelect the JOE/ROX channel for analysis of the bacteria-specific amplification and the FAM channel for the amplification of the control DNA .
Incorrect configuration of the real time PCRCheck your work steps and compare with chapter “Procedure”.
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The programming of the thermal profile is incorrectCompare the thermal profile with the protocol (table 5).
Incorrect storage conditions for one or more kit components or kit expired Check the storage conditions and the date of expiry printed on the kit label. If necessary, use a new kit and make sure kit components are stored as described in chapter “Transport, Storage and Stability”.
Weak or no signal of the control DNA and simultaneous absence of a signal in the bacteria-specific JOE/ROX channel
real time PCR conditions do not comply with the protocol Check the real time PCR conditions (chapter 12).
real time PCR inhibited Make sure that you use an appropriate isolation method (see “Sample prepara-tion”) and follow the manufacturer’s instructions. Make sure that the ethanol-containing washing buffer of the isolation kit has been completely removed. An additional centrifugation step at high speed is recommended before elution of the DNA.
DNA loss during isolation processIn case the control DNA was added before extraction, the lack of an amplifica-tion signal can indicate that the DNA isolation was not successful. Make sure that you use an appropriate isolation method (commercial kits are recommend-ed) and stick to the manufacturer’s protocol.
Incorrect storage conditions for one or more components or kit expiredCheck the storage conditions and the date of expiry printed on the kit label. If necessary, use a new kit and make sure kit components are stored as described in chapter “Transport, Storage and Stability”.
Detection of a fluorescence signal in the JOE/ROX channel of the negative control
Contamination during preparation of the PCR Repeat the real time PCR in replicates. If the result is negative in the repetition, the contamination occured when the samples were pipetted into the optical PCR reaction tubes. Make sure to pipet the positive control last and close the op-tical PCR reaction tube immediately after adding the sample. If the same result occurs, one or more of the kit components might be contaminated. Make sure
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that work space and instruments are decontaminated regularly. Use a new kit and repeat the real time PCR.
17 ABBREVIATIONS AND SYMBOLS
DNA Deoxyribonucleic acid Research use only
CT Cycle threshold Control DNA
nn not known To be used with
PCR Polymerase chain reaction Catalog number
Negative control Contains suffi cient for <n> test
