Date post: | 18-Feb-2016 |
Category: |
Documents |
Upload: | raymond-andre-muzetta |
View: | 227 times |
Download: | 0 times |
1Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
CYTOTOXICITY TEST OF SYNTHESIZED 7-3,4’-TRIHYDROXYISOFLAVONE ON BREAST CANCER CELL LINE MCF-
7
Raymond Andre Muzetta1, Sri Herwiyanti2, Eti Nurwening Sholikhah3
1Undergraduate Student of Faculty of Medicine, Gadjah Mada University, Yogyakarta
2Department of Histology and Biology Cell, Faculty of Medicine, Gadjah Mada University, Yogyakarta
3Departement of Pharmacology, Faculty of Medicine, Gadjah Mada University, Yogyakarta
ABSTRACT
Background: Cancer has been the ten most leading cause of death in the world. Many studies develop the effective anticancer treatments, including the use of isoflavone derivates because isoflavones have a chemical structure that is similar to that of 17β-estradiol. They may compete with estrogens for binding to estrogen receptors and act as partial estrogen agonists or antagonists. Numerous experimental studies have been shown that isoflavones exert anticarcinogenic effects on hormone related cancers and in particular cancer of the breast. Therefore might be also have cytotoxic activity on breast cancer cell line of MCF-7.
Objectives: Knowing the cytotoxic activity of 7-3,4’-trihydroxyisoflavone on breast cancer cell line MCF-7.
Method: MTT assay was used to measure the effect of growth inhibitory of MCF-7 cells, by giving 7-3,4’-trihydroxyisoflavone to MCF-7 cells for 24 hours. The treatment was conducted after growing the cells in RPMI media culture for 24 hours. Cytotoxic activity of 7-3,4’-trihydroxyisoflavone and doxorubicin as positive control defined by IC50 using probit analysis.
Result: The IC50 value of 7-3,4’-trihydroxyisoflavone was … μg/mL and IC50
value of doxorubicin was … μg/mL.
Conclusion: The compound of 7-3,4’-trihydroxyisoflavone doesn’t have cytotoxic effect on MCF-7 cells.
Keywords: cytotoxic activity, isoflavone, breast cancer, MCF-7, IC50.
2Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
UJI SITOTOKSISITAS SENYAWA 7-3,4’-TRIHIDROKSIISOFLAVON HASIL SINTESIS PADA KULTUR SEL KANKER PAYUDARA MCF-7
Raymond Andre Muzetta1, Sri Herwiyanti2, Eti Nurwening Sholikhah3
1Fakultas Kedokteran Gadjah Mada, Yogyakarta 2Departemen Biologi dan Histologi, Fakultas Kedokteran, Universitas
Gadjah Mada, Yogyakarta3Departemen Farmakologi, Fakultas Kedokteran, Universitas Gadjah Mada,
Yogyakarta
INTISARI
Latar Belakang: Kanker telah menjadi sepuluh penyebab utama kematian di dunia. Banyak penelitian mengembangkan pengobatan antikanker yang efektif, termasuk penggunaaan turunan isoflavon karena isoflavon mempunyai struktur kimia yang mirip dengan 17β-estradiol. Sehingga senyawa tersebut mungkin akan bersaing dengan estrogen untuk mengikat reseptor estrogen dan bertindak sebagai agonis estrogen parsial atau antagonis. Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa isoflavon memiliki efek terhadap kanker yang berkaitan dengan hormon, terutama kanker payudara. Oleh karena itu diharapkan juga memiliki aktivitas sitotoksik pada kultur cell line kanker payudara MCF-7.
Tujuan: Mengetahui aktivitas sitotoksik senyawa 7-3,4’-trihidroksiisoflavon terhadap kultur cell line kanker payudara MCF-7.
Metode: MTT assay digunakan untuk mengukur efek penghambatan pertumbuhan sel MCF-7, dengan memberikan senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon selama 24 jam. Pemberian senyawa uji dilakukan setelah menumbuhkan sel MCF-7 dalam media kultur RPMI selama 24 jam. Aktivitas sitotoksik senyawa 7-hidroksi-3,4-dimetoksiisoflavon dan doksorubisin sebagai kontrol positif ditentukan oleh nilai IC50 dengan menggunakan analisis probit.
Hasil: Nilai IC50 senyawa 7-3,4’-trihidroksiisoflavon sebesar … μg/mL dan nilai IC50 doksorubisin sebesar … μg/mL.
Kesimpulan: Senyawa 7-3,4’-trihidroksiisoflavon tidak memiliki efek sitotoksik terhadap sel T47D.
Kata Kunci: aktivitas sitotoksik, isoflavon, kanker payudara, MCF-7, IC50.
3Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
PENDAHULUAN
Kanker adalah sel-sel yang berproliferasi dan berdiffensiasi secara cepat
yang berbeda dengan sel normal dan akan menyebar ke selirih tubuh. Proses ini
disebut sebagai metastasis. Di dunia, kanker merupakan penyebab kematian
tertinggi. Diperkirakan sekitar 7,6 juta orang atau sekitar 13% dari seluruh
kematian disebabkan oleh kanker. Pada tahun 2030, diperkirakan akan terjadi 27
juta kasus kanker (WHO, 2008).
Berbagai macam pengobatan kanker seperti pembedahan, penyinaran,
kemoterapi, dan imunoterapi, namun setiap metode tersebut mempunyai
kelemahan sehingga keberhasilannya masih belum memuaskan (Hoffmann, 1999).
Dikarenakan hasil dari setiap pengobatan yang disebutkan diatas masih belum
memuaskan, maka perlu diadakannya pencarian obat alternatif yang efektif dan
efisien.
Berbagai senyawa hasil sintesis telah banyak dimanfaatkan sebagai
antikanker, salah satunya adalah senyawa isoflavon. Isoflavon, sebuah sub-kelas
dari flavonoid, yang secara fitokimia menyerupai struktur kimia β estrogen
hormon wanita. Beberapa varietas dari isoflavon ini seperti daidzein, glycitein dan
genistein (Trifolium pretense) yang terdiri dari biochanin A and formononetin
terbukti mempunyai khasiat dalam pencegahan kanker (Wang, 2008).
Di Indonesia, tanaman cengkeh (Syzygium aromaticum (L) Merr & Perry)
lebih kurang 95 % diusahakan oleh rakyat dalam bentuk perkebunan rakyat yang
tersebar di seluruh propinsi, sisanya sebesar 5% diusahakan oleh perkebunan
swasta dan perkebunan negara. Cengkeh merupakan tanaman rempah yang
4Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
termasuk dalam komoditas sektor perkebunan yang mempunyai peranan cukup
penting antara lain sebagai penyumbang pendapatan petani dan sebagai sarana
untuk pemerataan wilayah pembangunan serta turut serta dalam pelestarian
sumber daya alam dan lingkungan (Nurdjannah, 2004).
Minyak bunga cengkeh biasa digunakan untuk makanan, minuman dan
parfum, minyak gagang cengkeh digunakan sebagai subsitusi minyak bunga
cengkeh, dan minyak daun cengkeh digunakan sebagai bahan baku untuk isolasi
eugenol dan caryophyllen (Weiss, 1997). Eugenol disamping digunakan sebagai
bahan penambah aroma juga mempunyai sifat antiseptik, karena itu bisa
digunakan dalam sabun, ditergen, pasta gigi, parfum dan produk farmasi
(Nurdjannah, 2004).
Oleh karena banyaknya manfaat yang kita peroleh dari senyawa eugenol
ini, perlu diadakannya penelitian menggunakan manfaat senyawa eugenol
terhadap kanker payudara. Struktur kimia dari kanker payudara yaitu 17β-
estradiol sangat mirip dengan sintesis isoflavon, sehingga kanker payudara
dijadikan subyek penelitian. Diharapkan sintesis dari isoflavon akan berkompetisi
dengan estrogen terhadap reseptor estrogen dan bertindak sebagai agonis atau
antagonis dari estrogen. Pada penelitian ini akan diuji aktivitas senyawa 7-3,4’-
trihidroksiisoflavon yang merupakan turunan dari eugenol sebagai antikanker
yang akan dilakukan uji sitotoksik senyawa tersebut secara in vitro pada kultur
cell line MCF-7.
5Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
METODE PENELITIAN
Uji sitotoksisitas dilakukan dengan memasukkan suspensi sel MCF-7
dalam media kultur RPMI dengan kepadatan 1,5 x 104 sel/100μL ke dalam
masing-masing sumuran (microwell plate) 96 dan diinkubasikan pada inkubator
dengan suhu 370 C 5% CO2 selama 24 jam. Selanjutnya dibuat larutan stok
senyawa uji (7-3,4’-trihidroksiisoflavon) dan kontrol positif (doksorubisin)
dengan melarutkan 5 mg senyawa turunan isoflavon dalam 1 mL larutan DMSO.
Larutan senyawa uji selalu dibuat baru sebelum uji aktivitas dilakukan. Dari
larutan stok senyawa uji dan doksorubisin selanjutnya dibuat berbagai konsentrasi
larutan uji mulai dari kadar 0,5; 1; 5; 10; 25; 50; dan 100 μg/mL. Sebanyak 100
μL larutan senyawa uji atau doksorubisin dari masing-masing konsentrasi
dimasukkan ke dalam suspensi sel dalam sumuran (microwell plate) 96 yang telah
diinkubasikan selama 24 jam tersebut. Sebagai kontrol negatif ditambahkan media
kultur sebanyak 100 μL ke dalam sumuran. Uji dilakukan secara triplikat untuk
setiap perlakuan dan diulang 3 kali. Kultur yang telah diberi bahan uji
diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 370 C dalam inkubator 5% CO2. Setelah
inkubasi selesai, media kultur dibuang dan dicuci dengan PBS dan ditambahkan
100 μL larutan MTT (1 mL MTT dalam 10 mL media kultur) ke dalam setiap
sumuran dan kemudian diinkubasikan lagi pada suhu 370 C 5% CO2 selama 4 jam.
Setelah 4 jam ditambahkan 100 μL stopper SDS 10% dalam HCL 0,1 N ke dalam
setiap sumuran (untuk melarutkan purple formazan). Selanjutnya dibungkus rapat
dan dibiarkan dalam suhu kamar selama 24 jam, pembacaan absorbansi dilakukan
dengan microplate ELISA reader pada panjang gelombang (λ) 595 nm.
6Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
HASIL
Gambar 1. Invasi tumor limfovaskular (LVI) pada karsinoma duktal invasif
payudara
Gambar 2. Ekspresi VEGF-C pada sitoplasma sel karsinoma duktal invasif
payudara
Tabel 1. Karakteristik penderita karsinoma duktal invasif payudara
Jumlah Persentase (%)Rata-rata usia (tahun) 52,8 Jangkauan 34-74Usia (tahun) <50 20 43,8 ≥51 26 56,2
7Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
Ukuran tumor (cm) <2 2 4,3 2-5 24 52,2 >5 20 43,5Keterlibatan limfonodi Negatif 15 32,6 1-3 20 43,5 4-9 11 23,9 >10 0 0Derajat Histologis Baik (1 dan 2) 23 50 Buruk (3) 23 50
Tabel 2. Frekuensi ekspresi VEGF-C dan invasi tumor limfovaskular pada karsinoma
payudara.
Variabel Jumlah spesimen
Ekspresi VEGF-C 1 : <10% 2 : 10% -50% 3 : >50%
2 (4,34%) 30 (65,22%) 14(30,44%)
Invasi Tumor
Limfovaskular(LVI)
Negatif Positif
7 (15,22%) 39 (84,78%)
Tabel 3. Hubungan Antara Invasi Tumor Limfovaskular (LVI) dengan Ekspresi VEGF-C
pada Karsinoma Duktal Invasif Payudara.
Variabel N LVI
Negatif Positif
Ekspresi
VEGF-C
<10% 2 1 (50%) 1(50%)
10%-50% 30 5 (16,7%) 25 (83,3%)
>50% 14 1 (15,2%) 13 (84,8%)
Pearson Chi-Square. Monte Carlo Sig. p=0,326
8Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
Keterangan : Tabel 3 menunjukkan tidak adanya hubungan antara invasi tumor
limfovaskular (LVI) dengan ekspresi VEGF-C p>0,05.
Tabel 4. Hubungan antara ekspresi VEGF-C dengan ukuran tumor dan derajat histologis
karsinoma duktal invasif payudara.
Variabel NEkspresi VEGFC
P<10% 10%-50% >50%
Ukuran tumor
<2cm 2 0 (0%) 2 (100%) 0 (0%) 0,776
2-5cm
>5cm
22
22
1 (4,5%)
1 (4,5%)
15 (68,2%)
13 (59,1%)
6 (27,3%)
8 (36,4%)
Derajat Histologis
Baik (1&2) 23 1 (4,4%) 19 (82,6%) 3 (13%) 0,037
Buruk (3) 23 1 (4,4%) 11 (47,8%) 11(47,8%)
Keterangan : Tabel 4 menunjukkan ekspresi VEGF-C tidak berhubungan dengan
ukuran tumor p>0,05, namun berhubungan dengan derajat histologi p<0,05.
Tabel 5. Hubungan antara invasi tumor limfovaskular (LVI) dengan ukuran tumor dan
derajat histologis karsinoma duktal invasif payudara.
Variabel NLVI P
Negatif Positif
Ukuran tumor
<2cm 2 1 (50%) 1 (50%) 0,584
2-5cm 22 3 (13,6%) 19 (86,4%)
9Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
>5cm 22 3 (13,6%) 19 (13,6%)
Derajat histologis
Baik (1&2) 23 7 (30,4%) 16 (69,6%) 0,009+
Buruk (3) 23 0 (0%) 23 (100%)
+Uji Fisher
Keterangan : Tabel 5 menunjukkan invasi tumor limfovaskular tidak berhubungan
dengan ukuran tumor p>0,05, namun berhubungan dengan derajat histologi
p<0,05.
PEMBAHASAN
Pada penelitian ini, frekuensi karsinoma payudara dengan ekspresi VEGF-
C <10% : 4,34%, 10%-50% : 65,22%, dan >50% : 30,44%. Frekuensi karsinoma
payudara dengan invasi tumor limfovaskular (LVI) adalah 84,78% dan tanpa
invasi tumor limfovaskular 15,22% (tabel 2). Penelitian Kinoshita et al. (2001)15,
frekuensi karsinoma payudara dengan ekspresi VEGF-C <10% : 61,2% dan >10%
: 39,8%. Frekuensi karsinoma payudara dengan invasi tumor limfovaskular (LVI)
adalah 44,89% dan dengan invasi tumor limfovaskular (LVI) adalah 55,11%.
Pada penelitian ini, invasi tumor limfovaskular tidak menunjukkan
hubungan dengan ekspresi VEGF-C (tabel 3). Hasil ini sama didapatkan oleh
penelitian lainnya16,18. Pada penelitian ini, ekspresi tinggi VEFG-C (>50%) lebih
banyak dijumpai pada karsinoma payudara dengan invasi tumor limfovaskular
positif daripada karsinoma payudara tanpa invasi tumor limfovaskular (tabel 3).
Ekspresi rendah VEGF-C (<10%) lebih banyak ditemukan pada karsinoma
10Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
payudara tanpa invasi tumor limfovaskular. Hal ini menunjukkan bahwa semakin
tinggi ekspresi VEGF-C maka semakin besar kemungkinan karsinoma payudara
untuk invasi ke pembuluh limfatik. Penelitian lain mendapatkan bahwa ekspresi
VEGF-C pada karsinoma payudara dengan ataupun tanpa invasi tumor
limfovaskular adalah sama18.
Pada penelitian Kinoshita et al. (2001)15, mendapatkan hasil adanya
hubungan antara ekspresi VEGF-C dengan invasi tumor limfovaskular. Ekspresi
VEGF-C dinyatakan dalam bentuk positif dan negatif. Ekspresi positif >10% sel
neoplasma yang tercat positif, dan negatif jika <10% sel neoplasma yang tercat
positif. Pada penelitian ini, ekspresi VEGF-C dinilai menggunakan skor 1, 2 dan
3, sesuai persentase sel tumor yang mengekspresikan VEGF-C. Deteksi invasi
tumor limfovaskular (LVI) menggunakan pewarnaan hematoxylin-eosin (H&E).
Identifikasi invasi tumor limfovaskular menggunakan H&E dapat membuat bias
antara pembuluh limfatik yang benar dengan artefak yang lepas dari isolasi tumor
akibat jaringan yang menyusut saat fiksasi8,9,19. Perbedaan lainnya adalah
spesimen yang digunakan adalah semua tipe kanker payudara, sedangkan pada
penelitian ini menggunakan karsinoma duktal invasif payudara.
Faktor subyektifitas pengamat/peneliti tidak dapat dikesampingkan
mengingat metode penelitian ini dipengaruhi oleh persepsi pengamat / peneliti
dalam menilai skor ekspresi VEGF-C. Namun hal ini dapat diminimalisisr dengan
menggunakan dua orang pengamat yang independen, dan hasil yang didapat
merupakan hasil pengamatan langsung oleh dua pengamat secara bersamaan
setelah didapatkan hasil pengamatan secara independen.
11Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
Power pada penelitian ini adalah 28%. Hal ini menunjukkan power yang
rendah. Untuk mendapatkan power sebesar 80% dengan signifikansi yang sama
dibutuhkan sampel sebanyak 170. Kurangnya sampel dalam penelitian ini juga
berpengaruh terhadap hasil penelitian.
VEGF-C meningkatkan invasi sel tumor ke pembuluh limfatik melalui
tiga jalur: (a) direct paracrine signaling, dimana VEGF-C berikatan dengan
VEGFR-3 pada sel endotelial limfatik untuk menginduksi limfangiogenesis, (b)
indirect paracrine signaling, dimana VEGF-C meningkatkan sekresi CCL21
(secondary lymphoid chemokine) dari sel endotelial limfatik, sehingga
meningkatkan kemoatraksi sel tumor disekitar pembuluh limfatik, dan (c) direct
autocrine signaling, dimana VEGF-C berikatan dengan VEGFR-3, yang
kemudian akan meningkatkan aktivitas proteolitik sel tumor, sehingga
memperkuat potensi migrasi12,13,14. Pada penelitian ini, ekspresi VEGFR-3 dan
sekresi kemokin tidak diteliti, sehingga belum diketahui patogensi VEGF-C
terhadap invasi tumor ke pembuluh limfatik.
Pada penelitian ini, ekspresi VEGF-C tidak berhubungan dengan ukuran
tumor, namun berhubungan dengan derajat histologis. Penelitian lain
mendapatkan adanya hubungan antara ekspresi VEGF-C dengan ukuran tumor
dan derajat histologis20. Ekspresi VEGF-C lebih tinggi pada tumor dengan ukuran
kecil (<2cm) dan dengan derajat histologis baik. Metode penelitian Bando
menggunakan ELISA kuantitatif untuk deteksi antibodi VEGF-C. Penelitian lain
mendapatkan hasil tidak ada hubungan antara ekspresi VEGF-C dengan ukuran
tumor dan derajat histologis11,15,16. VEGF-C bertanggung jawab dalam tahap awal
12Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
metastasis limfatik, terutama pada karsinoma in situ15. Pada penelitian ini,
spesimen yang digunakan adalah karsinoma invasif yang berukuran relatif besar.
Pada penelitian ini, invasi tumor limfovaskular (LVI) tidak berhubungan
dengan ukuran tumor, namun berhubungan dengan derajat histologis. Penelitian
lain mendapatkan hasil adanya hubungan antara invasi tumor limfovaskular
dengan ukuran tumor21. Penelitian Gadjos et al. (1999)21, sampel yang digunakan
adalah karsinoma payudara invasif dengan ukuran tumor ≤2cm, sedangkan pada
penelitian ini, sampel yang digunakan adalah karsinoma payudara invasif yang
berukuran relatif besar. Semakin besar ukuran tumor, maka area tumor yang
diperiksa secara histologis akan lebih kecil. Hal ini menyebabkan area perifer
tumor, yang merupakan tempat paling relevan untuk adanya invasi tumor
limfovaskular, semakin tidak terekspos21.
Penelitian Scoppmann et al. (2004)22, mendapatkan hasil bahwa adanya
hubungan derajat histologis dengan invasi tumor limfovaskular. Hal ini
menunjukkan bahwa semakin tinggi derajat histologis tumor maka semakin besar
kemungkinan karsinoma payudara untuk invasi ke limfovaskular. Tumor dengan
derajat histologis buruk mengandung bermacam-macam klonal sel sehingga lebih
agresif dan lebih invasif ke pembuluh limfatik9,22.
KESIMPULAN
Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa tidak ada hubungan antara
invasi tumor limfovaskular (LVI) dengan ekspresi VEGF-C pada karsinoma
duktal invasif payudara; ekspresi VEGF-C tidak berhubungan dengan ukuran
13Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
tumor, namun berhubungan dengan derajat histologis; invasi tumor limfovaskular
(LVI) tidak berhubungan dengan ukuran tumor, namun berhubungan dengan
derajat histologis.
DAFTAR PUSTAKA
1. Parkin M, Pisani P, Ferlay J. 2008. Global Cancer Statistic. CA: A Cancer J for Clin 49: 33–64
2. Tjindarbumi D, Mangunkusumo R. 2002. Cancer in Indonesia, Present and Future. Jpn Clin Oncol 32: 17-21
3. Kumar V, Abbas AK, Fausto N, Mitchell RN. 2007. Robbins Basic Pathology 8th Edition. Saunders : Philadelphia
4. American Cancer Society, 2009. Breast Cancer Facts and Figures 2009-2010. Atlanta : American Cancer Society, Inc
5. Harris JR, Lippman ME, Morrow M. 2010. Disease of the Breast, fourth edition. Lippincott Williams and Wilkins
6. Beasley NJ, Prevo R, Banerji S, Leek RD, Moore J, van Trappen P, Cox G, Harris AL, Jackson DG. 2002. Intratumoral lymphangiogenesis and lymph node metastasis in head and neck cancer. Cancer Res 62: 1315–1320
7. Tobler NE, Detmar M. 2006. Tumor and Lymph Node Lymphangiogenesis – Impact on Cancer Metastasis. J Leukocyte Biol 80: 691-696
8. Ito M, Moriya T, Ishida T, Usami S, Kasajima A, Sasano H, Ohuchi N. 2007. Significance of Pathological Evaluation for Lymphatic Vessel Invasion in Invasive Breast Cancer. Breast Cancer 14(2): 381-387
9. Marinho VF, Metze K, Sanches F, Rocha G, Gobbi H. 2008. Lymph Vascular Invasion in Invasive Mammary Carcinomas Identified by
14Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7
Endothelial Lymphatic Marker D2-40 is Assosiated with Other Indicators of Poor Prognosis. BMC Center 8:64
10. Vleugel MM, Bos R, van der Groep P, Greijer AE, Shvarts A, Stel HV, van der Wall E, van Diest PJ. 2004. Lack of lymphangiogenesis during breast carcinogenesis. J Clin Pathol 57(7):746-751
11. Nakamura Y, Yasuoka H, Tsujimoto M, Yang Q, Tsukiyama A, Imabun S, et al. 2003. Clinicopathological Significance of Vascular Endothelial Growth Factor-C in Breast Carcinoma with Long-Term Follow-Up. Mod Pathol 16(4):309-314
12. Issa A, Le TX, Shoushtari AN, Shields JD, Swartz MA. 2009. Vascular Endothelial Growth Factor-C and C-C Chemokine Receptor 7 in Tumor Cell – Lymphatic Cross talk Promote Invasive Phenotype. Cancer Res, 69(1):349-357.
13. Karpanen T, Alitalo K. 2008. Molecular Biology and Pathology of Lymphangiogenesis. Ann Rev of Path : Mechanism of disease 3:367-397
14. Nathanson D. 2003. Insights into the Mechanisms of Lymph Node Metastasis. Am Cancer Soc 98(2) : 413-423
15. Kinoshita J, Kitamura K, Kabashima A, Saeki H, Tanaka S, Sugimachi K. 2001. Clinical significance of vascular endothelial growth factor-C (VEGF-C) in breast cancer. Breast Cancer Res & Treat 66: 159–164
16. Watanabe O, Kinoshita J, Shimizu T, Imamura H, Hirano A, Okabe T, et al. 2005. Expression of a CD44 variant and VEGF-C and the implications for lymphatic metastasis and long-term prognosis of human breast cancer. J Exp Clin Cancer Res 24(1):75–82
17. Filho AL, Martins A, Costa SMA, Schmitt FC. 2005. VEFR3 and VEGFC expression in breast cancer tissue is not restricted to lymphatic vessels. Pathol-Res Practice 201:93-99
18. Koyama Y, Kaneko K, Akazawa K, Kanbayashi C, Kanda T, Hatakeyama K. 2003. Vascular endothelial growth factor-C and vascular endothelial growth factor-d messenger RNA expression in breast cancer: association with lymph node metastasis. Clin Breast Cancer 4(5): 354–360
19. Arnaout-Alkarain A, Kahn HJ, Narod SA, Sun PA, Marks AN. 2007. Significance of lymph vessel invasion identified by the endothelial lymphatic marker D2-40 in node negative breast cancer. Mod Pathol 20:183-191
20. Bando H, Weich HA, Horiguchi S, Funata N, Ogawa T, Toi M. 2006. The association between VEGF-C, its corresponding receptor, VEGFR-3, and prognosis in primary breast cancer: A study with 193 cases. Oncol Reports 15:653-659
21. Gadjos C, Tartter P, Bleiwess IJ. 1999. Lymphatic invasion, tumor size and age are independent predictors of axillary lymph node metastasisin women with T1 breast cancer. Ann Surg 230(5):692-696
22. Schoppmann SF, Bayer G, Aumayr K, Taucher S, Geleff S, Rudas M, et al. Austrian Breast and Colorectal Cancer Study Group. 2004. Prognostic value of lymphangiogenesis and lymphovascular invasion in invasive breast cancer. Ann Surg 240:306-312
15Raymond Andre Muzetta, Sri Herwiyanti, Eti Nurwening. 2012.Uji Sitotoksisitas Senyawa 7-3,4’-Trihidroksiisoflavon Sintesis Pada Kultur Sel Kanker Payudara MCF-7