Establecimiento de un cultivo de celulas en suspensionde Eucalyptus cinerea

Establishment of cell suspension culture ofEucalyptus cinerea

Fernando Orozco Sencnez", Rodrigo Hoyos Sencnez"; Mario Arias Zabala ***

RESUMENSe desarrolla un protocolo para la obtencion y establecimiento de suspensiones celulares de E. cinerea. La con-centra cion de las hormonas 2,4 D Y BAP tienen un efecto significativo en la forrnacion de callos friables de E.cinerea, obteniendo una respuesta periodica en la forrnacion de callos friables con respecto a la concentracion delas hormonas. Puede obtenerse hasta un 90% de forrnacion de callos friables con varias cornbinaciones horrno-nales; primero, con concentraciones alrededor de 3,0 rng/L de 2,4 D Y 1,0 mg/L de BAp, y segundo, alrededor de6,0 mg/L de 2,4 D Y1,0 mgIL de BAP. A partir de los callos anteriores, se obtienen suspensiones celulares con unactivo crecimiento celular, con tiempos de duplicacion entre cuatro y siete dias, y alcanzando densidades celula-res de 15 g celulas secas/L. Las suspensiones de E. cinerea ofrecen una herramienta importante para la propaga-cion de esta especie via ernbriogenesis sornatica, estudio de biorreactores, produccion de metabolitos secunda-rios y procesos de biotransforrnacion.

Palabras clave: Biorrcactores, terpenoides, biotransforrnacion, metabolismo secundario.

ABSTRACTA protocol is developed for obtaining and establishment of E. cinerea cell suspension. The concentration ofhormones 2,4 D and BAP have a significant effect in the formation of friable callus of E. cinerea, obtaining aperiodic answer in the formation of friable callus with regard to hormones concentration. It can be obtaineduntil 90% of formation of friable callus in several hormone combinations, first with concentrations around 3,0mg/L of 2,4 D and 1,0 mg/L of BAP; and second, around 6,0 mgIL of 2,4 D and 1,0 mg/L of BAP. Using the lastcallus, cell suspensions are obtained with an active cellular growth, with times of duplication between 4 and 7days and obtaining cell densities of 15 g of dry cells/L. The suspensions of E. cinerea offer an important tool forthe propagation of this specie by somatic embryogenesis, bioreactors study, production of secondary metabolitesand biotransformation processes.

Key words: Bioreactors, terpenoids, biotransformation, secondary metabolism.

INTRODUCCION

Las celulas de las plantas son importantesbiocatalizadores que pueden ser usados parala obtenci6n de productos tarrnaceuticos,bioinsecticidas, saborizantes, fragancias y colo-rantes para alimentos, como antocianina y aza-fran. Las celulas de las plantas tarnbien puedenutilizarse para metabolizar un amplio conjuntode compuestos suministrados ex6genamente

(proceso conocido como biotransformaci6n), atraves de varias reacciones para obtener com-puestos de mayor valor agregado, con una ma-yor complejidad estructural y mas tacilmente canrespecto a la sfntesis qufmica (Lee, 1996;Yokoyama, 1996). La productividad de los ante-riores compuestos, en base seca de celulas ve-getales, 5e puede incremental' considerablemen-

* Profesor, Escuela de Quimica. Universidad Nacional de Colombia, sede Medellin. Autopista Norte x Calle 65. Medellin,Colombia. E-mail: feorozco@unalmed.edu.co** Profesor, Departamento de Agronomia. Universidad Nacional de Colombia, sede Medellfn.*** Profesor, Escuela de Geociencias. Universidad Nacional de Colombia, sede Medellin.

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te en los cultivos celulares con respecto a la productivi-dad con plantas intactas. Sin embargo, la producci6nde los compuestos anteriores implica manipular unaserie de variables y requiere un control y conocimientocuidadosos de los medios de cultivo, biorreactores yde las rutas metab61icas secundarias. EI primer pro-ceso comercial que utiliz6 celulas vegetales fue laproducci6n del colorante y compuesto antibacterianoshikonina, utilizando Lithospermum erythrorhizon, en1983. Otros procesos comerciales a escala indus-trial inciuyen la producci6n de fosfodiesterasa, acidorosmarfnico, gingseng y berberina (Kreiss y Reinhard,1989; Sajc et et., 2000; Z ong et et., 1995).

Las especies del qenero Eucalyptus producenalgunos metabolitos secundarios de interes comercial,como los aceites esenciales, con aplicaciones indus-triales, medicinales, farmacol6gicas y en control biol6-gico de plagas. Este genero se constituye en un buencandidato para un proceso productivo no tradicional,pero es precise desarrollar inicialmente la tecnica decalloqenesis y suspensi6n de celulas para estudiar laproducci6n de estos compuestos. Entre sus metabolitosde interes se encuentran terpineno, cimeno, pineno,timol, carvacrol, cineol, eudesmol, macrocarpales,sideroxilonales, entre otros. (Menut et al., 1995; Murataet al., 1992; Singh et al., 1995; Singh et al., 1996). EI1,8-cineol es el principal componente del aceite esen-cial del eucalipto. EI eucalipto ha side utilizado tarnbienpara la biotransformaci6n de acido tr6pico, precursorde los alcaloides tropanicos (Ushiyama y Furuya, 1989);acido 1,8-I3-glicirretfnico (Orihara y Furuya, 1990); oxi-do de cariofileno (Orihara et al., 1994), 1,8-Cineol(Orihara y Furuya 1994), 13-Thujaplicina, con actividadantitunqica y antibacteriana (Furuya et al. 1997); men-tol y esteviol, para la obtenci6n de gentiobi6sidos;mentano glic6sidos, trigluc6sidos y estevi6sidos(Yokohama, 1996) y acido k6jico para la producci6n defitoestr6genos (Nakajima et al., 2001).

EI rendimiento de los aceites esenciales en lashojas de eucalipto puede alcanzar 3,5% en base seca,como en E. cinerea. Este rendimiento es superior alde E. globulus, E. citriodora y E. grandis, con valoresde 2,5, 2,0 Y 0,25%, respectivamente (Mora et al.,2002). En un estudio comparativo entre las cuatroespecies anteriores, E. cinerea result6 ser la mejorfuente de 1,8-cineol, tanto por su rendimiento comopor la concentraci6n de este monoterpeno, el cual es72,42% en los respectivos aceites esenciales (Moraet et., 2002). Con la presente investigaci6n se defi-

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nen los procedimientos para establecer las suspen-siones celulares de E. cinerea, que puedan ser utili-zadas en la producci6n de metabolitos secundariosy procesos de biotransformaci6n.

METODOLOGIA

Para establecer el cultivo in vitro de E. cinerea se pro-cedi6 a la germinaci6n de semillas in vitro. Luego, es-tas plantulas fueron micropropagadas utilizando unmedio de cultivo desarrollado por los investigadores(articulo en proceso de publicaci6n). La micropro-pagaci6n se realiz6 utilizando microesquejes en me-dios dosificados con 1,1 giL de sales de Murashige ySkoog (1962), acido indol butfrico (ISA: 0,1 mg/L), sa-carosa (20 giL), polivinilpirrolidona (PVP: 1,0 giL), aci-do nicotfnico (0,5 mg/L), piridoxina (0,5 mg/L), glicina(2,0 mg/L) y agar (9,0 giL). EI pH se ajust6 entre 5,6 y5,8. Las hojas juveniles fueron utilizadas comoexplantes para la formaci6n de callos. Los medios decultivo utilizados en esta etapa correspondieron a unacombinaci6n de auxina (2-4 diclorotenoxiacetico: 2-4D entre 0,0 y 7,5 mg/L) y citoquinina (benzilami-nopurina: SAP entre 0,0 y 1,5 mg/L), pH (5,6 - 5,8),agar (9 giL), sacarosa (30 giL), sales inorqanicas (Me-dio de Murashige y Skoog, 4,4 giL), glicina (2,0 mg/L),acido nicotfnico (5,0 mg/L), tiamina (0,5 mg/L),piridoxina (0,5 mg/L) y PVP (1,0 giL). Los callos obte-nidos fueron establecidos en medios hquidos con unacomposici6n similar al medio de inducci6n de callos,libre de citoquinina. Las suspensiones celulares seiniciaron mediante la incubaci6n de trozos de callosfriables en el medio llquido continuamente agitado, deacuerdo con la metodologia general de Szabados etal. (1991), 110 r.p.m., subcultivos peri6dicos (cada 15dlas), en erlenmeyers de 100 ml y 250 ml, y ocupandos610el 20 % de este volumen con medio de cultivo. Seconservaron en la oscuridad y una temperatura de24QC. Inicialmente, las suspensiones celulares sonheteroqeneas, observando grandes agregados, celu-las libres, alargadas, de gran tamafio y celulas peque-rias isodiametricas. Despues de repetir los subcultivos(seis meses), se obtuvo una suspensi6n celular fina ydispersa con alta velocidad de crecimiento. Para cons-truir las curvas de crecimiento fueron utilizadas comoin6culo suspensiones tamizadas con una malla deacero inoxidable No. 40 (tarnario de abertura 0,42 mm).Se evalu6 el crecimiento mediante la determinaci6ndel peso seco de la biomasa contenida en 10 ml demedio (24 horas a 70QC) sequn el procedimiento deTorres (1989).

ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO DE cELULAS EN SUSPENSION DE Eucalyptus cinerea

Resultados y Discusi6n

La fotograffa 1 presenta plantulas micropropagadasde E. cinerea. Las fotograffas 2 y 3 muestran callosobtenidos a partir de hojas juveniles.

Fotograffa 1. Plantulas de E. cinerea utilizadas para el experimentode formaci6n de callos.

Fotografla 2. Callo friable de E. cinerea obtenido mediantecombinaciones de 2,4 0 Y BAP.

Fotograffa 3. Diferentes callos de E. cinerea obtenidos mediantec9mbinaciones de auxin a y citoquinina.

Mediante experimentos factoriales se deter-rnino el efecto que tiene la concentracion de 2,4 DY BAP sabre diferentes variables respuesta (for-

macron de callos, callos friables, callos can raicesy brotes multiples). En el presente trabajo s610 sepresenta el porcentaje de torrnacion de callosfriables, ya que este material es el utilizado parael establecimiento de las suspensiones. La tabla1 presenta el anal isis de varianza de este experi-menta y las figuras 1 y 2, el porcentaje de forma-ci6n de callos friables a diferentes concentracio-nes de 2,4 D Y BAP.

Tabla 1. Analisis de varianza para el porcentaje deformaci6n de callos friables de E. cinerea

Factor GI' Suma Media Hazon NS'cuadrados cuadrados F'

2-40 4 36806 9202 10,5822 1,3E-06

BAP 3 21858 7286 8,3791 9,1E-05

2-40:BAP 12 11418 951 1,0943 0,3806

Residuales 63 54780 870

1 GI. Grados de Iibertadz Hazen F. Relaci6n entre las variaciones debidas a los cam-bios de cad a variable y las variaciones no controladas 0 errorexperimental.3 NS. Nivel de significancia. Mayor que 0,05: el efecto de lavariable es no significativo. Menor que 0,05: el efecto de lavariable sf es significativo.4 Residuales. Variacion deb ida al error experimental.

Del nivel de significancia se deduce que tantolas concentraciones de 2,4 D como el BAP tienen unefecto significativo sabre el porcentaje de tormacionde callos friables (nivel de significancia < 0,001) Yestadfsticamente no hay evidencia de que exista unainteraccion entre los contenidos de las hormonas (2-4 D: BAP), es decir, la interaccion no tiene un efectosignificativo sabre la variable respuesta.

En las figuras 1 y 2 se aprecia el efecto quetienen el 2,4 D Y el BAP sabre el porcentaje de for-macron de callos friables. Se observa un efecto pe-ri6dico tanto de la auxina como de la citoquinina sa-bre el porcentaje de torrnacion de callos friables, estoes, se encuentran rnaximos y mfnimos en la forma-cion de callos friables a medida que aumenta la con-centracion de las harmon as, siendo mas claro estecomportamiento peri6dico para la auxina. En las dosfiguras se aprecia que los mayo res valores de la va-riable respuesta se encuentran en dos zonas: prime-ro, alrededor de 3,0 mg/L de 2,4 D Y 1,0 mg/L deBAP; y segundo, alrededor de 6,0 mg/L 2,4 D y 1,0mg/L de BAP.

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~ 100III" 90i 80:.E 70] 60iO 50~ 40:S 30 • ,~ 20. 'e 10.1,'oLl. 0 -

00 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 ao

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BAPi·, '.', '1,Omg1L

.~ I BAP', i~l,5mglL" BAP,,,,

Auxin. 2,4 0 (mglq

Figura 1. Porcentaje de tormacion de callos friables de E. cinereacontra diferentes concentraciones de 2,4 D Y BAP.

100

X 90

~ BO:c 70~ 60-1

~ 50 ~iO 40-'"I:'0

I '~o

ILl. 2.0

Figura 2. Porcentaje de torrnacion de callos friables de E. cinereacontra diferentes concentraciones de BAP y 2,4 D.

Aunque los callos presentaron cierto grado defenolizaci6n (conservando el material en la oscuridad),su textura permite usarlos para el establecimiento delas suspensiones. Se requiere realizar subcultivos cadaquince dias durante seis meses para adaptar las celu-las al cultivo en suspensi6n y tener un material con uncrecimiento activo. Este tiempo se considera normal yesta acorde con el trabajo requerido 'para establecersuspensiones de otras especies vegetales, asf porejemplo, el banana puede necesitar entre 6 y 15 me-ses, desde la transferencia de callos a un medio liqui-do hasta tener un material en cantidad adecuada paracualquier aplicaci6n (Schoofs et al. 1999). EI estable-cimiento de las suspensiones de E. cinerea se logr6usando un medio de cultivo que contiene la mismacomposici6n que el medio s61ido en ausencia de SAP.La figura 3 presenta la curva de crecimiento para lassuspensiones de E. cinerea, en la cual se evatua elcrecimiento celular durante seis semanas.

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16 , - ;........ ._ )

oJ 14-~ 12sIII 10

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Tiempo, dias40

Figura 3. Curva de crecimiento de suspensiones celulares de E.cinerea. Las barras indican la desviacion estandar,

En esta curva se observa una fase lag 0 de adap-taci6n de las celulas de nueve dias, una fase de cre-cimiento exponencial entre los dfas 9 y 30, Y las fa-ses estacionaria y de muerte celular, entre los dlas30 y 44 aproximadamente, las cuales no se diferen-cian c1aramente una de otra. La forma de la curvacoincide con las curvas tfpicas para este tipo de cul-tivos (Szabados, 1991). La densidad celular alcan-zada (15 9 celulas secas/L) es adecuada para mu-chas aplicaciones, y corresponde a un cultivo condensidad celular moderada de 15 a 20 9 cel/L (Hu yZhong, 2001). La fase exponencial puede modelarsemediante la siguiente ecuaci6n:

X = Xoe/ltX = biomasa (g celulas secas/L)X = biomasa en el tiempo cero (g celulas secas / L)ofl = velocidad especffica de crecimiento (dla')t = tiempo (dfa).

La ecuaci6n obtenida para el cultivo es la siguiente:

X = 0 0793eo,1667t R2 = 0,9203,La velocidad especffica de crecimiento para un

cultivo de celulas en suspensi6n es de 0,2 dia'. EI tiem-po de duplicaci6n (tei) se obtiene de la relaci6n td= In2/fl = 4,2 dfas. En otras curvas de crecimiento, se obtu-vieron tiempos de duplicaci6n entre cuatro y siete dias,sugiriendo esto que posiblemente se han formado di-ferentes Ifneas celulares, debido probablemente a unamejor adaptaci6n fisiol6gica de las celulas 0 algunavariaci6n somaclonal. Las suspensiones se han con-servado con un crecimiento activo durante mas de docemeses, manteniendo las condiciones de cultivo esta-bles y la densidad celular baja (menor que 12 9 de

ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO DE cELULAS EN SUSPENSION DE Eucalyptus cinerea

Fotograffa 4. Celulas individuales de un cullivo de celulas ensuspension de E. cinerea. Tincion con Azul de Evans.

Fotograffa 5. Aglomerados de pocas celulas en un cullivo decelulas en suspension de E. cinerea. Tincion con Azul de Evans.

Fotograffa 6. Microcallos en un cullivo de ceiulas en suspensionde E. cinerea. Sin tincion,

Fotograffa 7. Microcallos en un cultivo de celulas en suspensionde E. cinerea. Tincion con Azul de Evans.

celutas secas por litro). Las fotograffas 4 a 7 presentandiferentes aspectos de las suspensiones celulares.

La tinci6n con Azul de Evans permite apreciarlas celulas muertas con un color oscuro y las celulasviables con un color blanco. Con este rnetodo se de-termin6 una viabilidad de las celulas en suspensi6nentre 30 y 70%. A pesar de encontrarse un cultivo enel valor de viabilidad de 30%, se pudieron establecersuspensiones con un activo crecimiento celular.

CONCLUSIONES

La concentraci6n de las hormonas 2,4 D Y SAP tieneun efecto significativo en la formaci6n de callos friablesde E. cinerea. Sin embargo, estadfsticamente no hayevidencia de que exista una interacci6n entre estasdos hormonas. Utilizando hojas juveniles comoexplantes, se obtuvo un comportamiento peri6dico enla formaci6n de callos friables con respecto a la con-centraci6n de las hormonas, es decir, el comportamien-to de la variable respuesta vari6 de forma ondulatoriacon la concentraci6n de las hormonas. Puedeobtenerse hasta un 90% de formaci6n de callos friablesen varias zonas, primero con concentraciones alrede-dor de 3,0 mg/L de 2,4 D Y 1,0 mg/L de SAP; y segun-do, alrededor de 6,0 mg/L de 2,4 D y 1,0 mg/L de SAP.A partir de los callos anteriores, se obtuvieron suspen-siones celulares con un activo crecimiento, con tiem-pos de duplicaci6n entre cuatro y siete dias, alcanzan-do densidades celulares de 15 9 celulas secas/L. Losdiferentes tiempos de duplicaci6n sugieren que posi-blemente se han formado diferentes Ifneas celulares,debido probablemente a una mejor adaptaci6n fisiol6-gica de las celulas 0 alguna variaci6n somaclonal. Lassuspensiones de E. cinerea ofrecen una herramientaimportante para la propagaci6n de esta especie viaernbrioqenesis sornatica, y un punta de partida para elestudio de biorreactores y la producci6n de importan-tes metabolitos secundarios (1,8-cineol, timol,carvacrol, macrocarpales, sideroxilonales, etc.) que sonutilizados en perlumerfa, medicina, control biol6gicode algunas plagas (hongos e insectos), y como mate-rias primas en procesos qufmicos. Adernas, estas sus-pensiones ofrecen la posibilidad de biotransformar cier-tas sustancias qulrnicas para la obtenci6n de productosde mayor valor agregado (acido tr6pico, acido 1,8 ~-glicirretfnico, ~-Thujaplicina, estevi6sidos, mentol, etc.).De acuerdo con el conocimiento de los autores, estees el primer reporte para la obtenci6n y mantenimien-to de suspensiones celulares de E. cinerea.

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AGRADECIMIENTOS

La presente investigaci6n fue financiada por la Di-recci6n de Investigaciones (DIMED) y el Laboratoriode Crecimiento y Desarrollo de las Plantas de la Uni-versidad Nacional de Colombia, sede Medellfn y laEmpresa Phyton Ltda.

BIBLIOGRAFIA

Furuya, T. et al. 1997. Biotransformation de 13-thujaplicina by Cultured Cells of Eucalyptusperriniana. Phytochemistry. 46 (8): 1355-1358.

Hu, W. W. and Zhong, J. J. 2001. Effect of BottomClearance of Performance of Airlift Bioreactorin High Density Culture of Pan ax notiginsengCells. Journal of Bioscience and Bioengineering.92 (4): 393, 2001.

Lee, H. B. 1996. Fundamentals of Food Biotechnology.VCH Publishers. United Kingdom, 431 p.

Menut, et al. 1995. Aromatic Plants of Tropical Cen-tral Africa. 23. Chemical Composition of LeafEssential Oils of Eucalyptus goniocalyx F. Muellan Eucalyptus patents Benth. Grown in Rwanda.J. Agric. FoodChem. 43: 1267-1271.

Mora, A. L. et al. 2002. Estudio comparativo de losaceites esenciales de varias especies de euca-lipto. Abstract en: IX Congreso Latinoamerica-no de Cromatograffa y Tecnices Afines,Cartagena de Indias, Colombia. Febrero 20-22,2002, trabajo PN24, p. 165.

Murashige, T. and Skoog, F. A. 1962. Revised Mediumfor Rapid Growth and Bioassays with TobaccoTissue Cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.

Murata, M. et al. 1992. Macrocarpals, antibacterialcompounds from Eucalyptus, inhibit aldosareductasa. Biosci. Biotech. Biochem. 56 (12):2062-2063.

Nakajima, N., Ishihara, K., Hamada, H. 2001. FunctionalGlucosydation of Kojic Acid and Daidzein with theEucalyptus Membrane-Associated UDP-Glucosyltransferase Reaction System. Journal ofBioscience and Bioengineering. 92 (5): 469-471.

48

Orihara, Y. et al. 1994. Biotransformation ofCaryophyliene Oxide by Cultured Celis ofEucalyptus perriniana. Phytochemistry. 35 (3):635-639.

Orihara, Y. and Furuya, T. 1994. Biotransformation of1,8 Cineole using cultured cells of Eucalyptusperriniana. Phytochemistry. 35 (3): 641-644.

Orihara, Y. and Furuya, T. 1990. Biotransformation of18 13 Glycyrretinic acid by cultured celis ofEucalyptus perriniana and Coffee arabica.Phytochemistry. 29 (10): 3123-3126.

Shoofs, H. et al. 1999. Cuellos de botella en la rege-neraci6n y mantenimiento de las suspensionescelulares mortoqenicas de banano y la regene-raci6n de las plantas vfa embrioqenesissornatica a partir de elias. Infomusa. 8 (2): 3-7.

Singh, I. P. and Etoh, H. 1995. New Macrocarpal-am-1 from Eucalyptus amplifolia. Biosci. Biotech.Biochem. 59 (12): 2330-2332.

Singh, I. P. et al. 1996. Potent attachment-inhibitingand promoting substances for the Blue Mussel,Mytilus edulis galloprovincialis, from two speciesof Eucalyptus, Biosci. Biotech. Biochem. 60 (9):1522-1523.

Szabados, L. et al. 1991. Suspensiones celulares:descripci6n, manipulaci6n y aplicaciones. En:Roca, W. y Mogrinski, L. A. Cultivo de tejidos enla agricultura. CIAT, Colombia. 969 p.

Torres, K. 1989. Tissue Culture Techniques forHorticultural Crops. Chapman & Hall. USA. 285 p.

Ushiyama, M. and Furuya, T. 1989. Biotransformationof (RS) Tropic Acid in Suspension Cultures ofCoffee arabica, Datura inn oxia , Eucalyptusperriniana y Nicotiana tabacum. Phytochemistry,28 (9): 2333-2339.

Yokohama, M. 1996. Industrial Application ofBiotransformation Using Plant Cell Culture. En.Dicosmo, F. and Misawa, M. Plant CultureSecondary Metabolism, Ed. By Frank Dicosmoand Mananaru Misawa N.Y. 232 p.