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"Notion et exemples d'optimisationdes techniques d'expérimentation

animale (Refinement)"

Académie Vétérinaire de France

"L’expérimentation animale en 2008"Session du 9 octobre : l’éthique

Patrick HARDY, DMV, DipECLAM

Directeur "Animal Science & Welfare"MERIAL – R&D Clinique EMEA

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"Notion et exemples d'optimisation des techniques d'expérimentationanimale"

! Introduction – Position du sujet

! Composante "hébergement et enrichissement" en étude

! Composante "optimisation des techniques" :• Généralités• Exemple de l'imagerie du petit animal• Exemple de la télémétrie

! Conclusions

Plan

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"Notion et exemples d'optimisation des techniques d'expérimentationanimale"

! Introduction – Position du sujet

! Composante "hébergement et enrichissement" en étude

! Composante "optimisation des techniques" :• Généralités• Exemple de l'imagerie du petit animal• Exemple de la télémétrie

! Conclusions

Plan

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"Optimisation" en expérimentation animale ?

"The Principles of Humane Experimental Techniques"(Russel and Burch,1959)

! REPLACE / REMPLACER

! REDUCE / REDUIRE

! REFINE / OPTIMISER

Principes pleinement intégrés dans la réglementation :

- Directive 86/609, article 7

- Décret français de 1987 modifié 2001, article 10

… et les autres référentiels internationaux

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"Optimisation" en expérimentation animale ?

! REFINE / OPTIMISER

Composante"hébergement et soins"

Cf. Annexe A révisée deSTE 123 (2006)

Composante "technique etmise en œuvre des

études"

-Revue éthique des protocoles

-Optimisations techniques

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"Notion et exemples d'optimisation des techniques d'expérimentationanimale"

! Introduction – Position du sujet

! Composante "hébergement et enrichissement" en étude

! Composante "optimisation des techniques" :• Généralités• Exemple de l'imagerie du petit animal• Exemple de la télémétrie

! Conclusions

Plan

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Source: C Dickson, sanofi-aventis R&D, LASW, UK

Etudes réglementaires de sécurité du médicamentExemple d'interaction et de bénéfice scientifique et éthique

Hébergement et enrichissement en étude

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"Notion et exemples d'optimisation des techniques d'expérimentationanimale"

! Introduction – Position du sujet

! Composante "hébergement et enrichissement" en étude

! Composante "optimisation des techniques" :• Généralités• Exemple de l'imagerie du petit animal• Exemple de la télémétrie

! Conclusions

Plan

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"Optimisation" des techniques

! Composantes "technique et mise en œuvre des études"

! Application des "points limites" ou "end points"

• Signes cliniques, signes de douleur ou d'inconfort, lésions

" Prédéfinis et "attendus" (protocole d'étude)

" "Non attendus", "accidentels" (formation du personnel,procédure standard)

• Décision et mise en œuvre rapide

• Actions prédéfinies ou concertées sans délai :

" Arrêt de l'étude ou du traitement

" Traitement anti-infectieux ou analgésique

" Sortie de l'étude

" Soins médicaux ou chirurgicaux

" Euthanasie…

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! Etude de la fonction et régulation des gènes, études desvariants alléliques… # analyse fonctionnelle du génôme

! Identification et validation de cibles thérapeutiques

• Ex. récepteurs CB1, angiogénèse tumorale…

! Disponibilité de modèles préalablement inexistants

• Ex. des souris cftr KO, modèles Alzheimer,de schizophrénie…

! Pertinence des modèles

• Modèles apolipoprotéines : KO ou surexpression

! Optimisation

• Hypertension d'origine rénale : remplacement del'induction chirurgicale…

Les techniques de modification génétique

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! Nouvelle génération de transpondeurs électroniques :

• 1mm x 6 mm / 7,15 mg - 7,15 mg

• Aiguille 18 G (1,2 mm)

# Souris GM au sevrage

"Optimisation" des techniques

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Exemples d'interactions et interdépendances

! Anesthésie volatile $# Imagerie médicale : gestion du stress etimmobilité

! Reproduction assistée $# Modification génétique

! Création de modèles GM $# Techniques d'imagerie

! Portoirs à cages ventilées $# Gestion sanitaire en imagerie

! Groupes sociaux & enrichissement $# Technique de télémétrie "JET®"

"Optimisation" des techniques

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"Notion et exemples d'optimisation des techniques d'expérimentationanimale"

! Introduction – Position du sujet

! Composante "hébergement et enrichissement" en étude

! Composante "optimisation des techniques" :• Généralités• Exemple de l'imagerie du petit animal• Exemple de la télémétrie

! Conclusions

Plan

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Les techniques d'imagerie

! Les champs magnétiques : Imagerie par Résonance Magnétique

! La radioactivité :

• Scintigraphie nucléaire

• Tomographie monophotonique (TEMP ou SPECT)

• Tomographie à émission de positron

! Les rayons X

• Radiographie (os, injection de produits de contraste)

• Scanner X ou tomographie (coupes infra-millimétriques)# 2D et 3D

• Scanner / ostéodensitométrie

! Les ultrasons

• Echographie simple

• Couplage doppler pour analyse de la vitesse du sang dans lesvaisseaux ou dans les cavités cardiaques

! La bioluminescence

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! Imagerie structurelle : tomographie, RMN, échographie

! Imagerie fonctionnelle : TEP, rayons gamma, traceursradioactifs, thermographie

! Utilisation combinée, simultanée ou non

! 2D (rX, gamma scintigraphie, bioluminescence) et 3D (!CT)

! En pratique :

• Contraintes de radio-protection (radio-isotopes)

• Contraintes liées au champ magnétique (IRM)

• Coûts, expertise nouvelle, locaux…

• Autres contraintes : anesthésie, température, sanitaires…

Les techniques d'imagerie

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Exemple de la tomographie d'émission depositrons : Reconstruction tridimensionnelle de la

distribution de glucose marqué au fluor 18

Les techniques d'imagerie

IMAGERIE MEDICALE

IMAGERIE DU PETITANIMAL EN R&D

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Apports de l'imagerie : science & éthique

! SANS IMAGERIE :

• Observations post-mortem(histologie, anatomie)

• Sacrifices de sous-groupesen séries

# Variations individuelles

# Nombre d'animauxrequis à chaque temps

! AVEC IMAGERIE :

• Image du "vivant", étudefonctionnelle possible (cœur)

• Suivi longitudinal sur le mêmeanimal :

" Evolution de la pathologie,traitement, effetsindésirables…

" Répétition des observations

" Réduction

• Techniques non ou faiblementinvasives

!CT Scan rX

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Imagerie par RM

Visualisation des structures cérébrales

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Imagerie par RM

! Visualisation des lésions cérébrales des modèles d'AVC, deneurodégénérescence (Huntingdon, Alzheimer…),d'encéphalomyélite, de régénération après thérapie cellulaire

! Images d'inflammation : image d'œdème par contraste,visualisation des macrophages via Ultrasmall Particles of IronOxide (USPIO)

! Obésité, évaluation de la masse graisseuse corporelle :quantification et localisation

! Visualisation dynamique du flux sanguin, de perfusiond'organe, d'œdème…

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! Contraintes chez les petitsanimaux :

• Anesthésie (stress, artefactsde mouvement)

• Contrôle de la température

• Gestion des aspects sanitaires

Imagerie par RMN

Anesthésie volatile + maintien+ régulation de température

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Croissance tumorale (lymphome) sur souris RAG-/-Administration de marqueur [18F]FDG

% ID/g = concentration de marqueur tissulaire en % de la dose injectée / g

!PET scanMicro Positron Emission Tomography

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Scintigraphie planaire

Image 1 : PI:PC (stimulation NK) Image 2 : anti-NK1.1 Image 3 : témoin

Souris C57BL/6 après injection de cellules tumorales YAS-1 marquées au 111In

La rétention du marqueur est inversément liée à la fonction cellulaire NK

Images plus brillantes dans les poumons avec déplétion NK - moins brillantes après stimulation NK

Evaluation des traitements de stimulation des cellules NK ou d'autres mécanismes anti-tumoraux

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Imagerie anatomique par rayons X

!CT en 3DLésions osseuses d'arthrite

rhumatoïde du rat(carpe – métacarpe)

!CT en 2DAnatomie cardiaque et cage

thoracique de la souris

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Luciferin

+O2

+ ATPFirefly

Luciferase

Oxyluciferin

+ AMP + Pi +CO2

+Light

LuciferaseMBP promoter SV40 pA+

Imagerie par bioluminescence

Myelin Basic Protein (MBP)promoter

1. Création dela souris Tg

Souris Tg "MBP-luciférase"

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Bioluminescence

Modèle de démyélinisation etremyélinisation : identification de

substances protectrices ou stimulatrices# programmes de maladies de

démyélinisation (ex. : sclérose multiple)

2. Utilisation dumodèle MBP-luciférase

Rasage (J-1) # Luciferin250mg/kg SC injection

# 8 minutes / isoflurane 2 % #mesure / isoflurane à 1,5 %

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Lymphomes Tumeur de la prostate orthotopique

Bioluminescence

! Bioluminescence en oncologie : principe identique maisavec cellules tumorales transfectées

• Suivi "longitudinal"

• Réduction du nombre d'animaux

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• Maintien du statut SPF ou SOPF

• Gestion du risque de contamination croisée

• Mouvements entre zones et bâtiments

Contraintes : gestion du risque sanitaire

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"Notion et exemples d'optimisation des techniques d'expérimentationanimale"

! Introduction – Position du sujet

! Composante "hébergement et enrichissement" en étude

! Composante "optimisation des techniques" :• Généralités• Exemple de l'imagerie du petit animal• Exemple de la télémétrie

! Conclusions

Plan

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"Avant la télémétrie"

! Animaux anesthésiés, implantés avant essai, réveil etmaintien en cylindre de contention, problèmestechniques, qualité du signal, interférence de l'anesthésie,douleur aigüe post-opératoire mal gérée…

! Stress de contention (améliorable par habituation)

! Durée d'observation limitée, sacrifice après étude.

Technique "non télémétrique"

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La télémétrie

! Implants : corps (transmission vers le capteur) etélectrodes / capteurs de pression pour diversenregistrements

! Grands animaux et petits animaux (rongeurs)

! Capteurs sous la cage ou dans l'enclos

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La télémétrie

Multiples possibilités de mesure et d'enregistrement :

! Pression sanguine

! Autres pressions (vessie, IVC…)

! ECG

! EEG

! EMG : diaphragme, intestin…

! Température

! Activité

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La télémétrie de "1ère génération"

! Animaux vigiles, en enclos ou cage individuelle de mesure

! Absence de contention et de stress intense, mais isolement

! Durée d'observation limitée (grands animaux en cage) maismesures répétables

! Isolement des animaux, changement d'hébergement, mobilitéréduite

! Réutilisation possible * # réduction du nombre d'animaux

* Cadre défini en revue éthique

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! Evolutions en cours

! JET® "Jacketed External Telemetry" (DSI)

• Grands animaux en hébergement de groupe, dans l'enclosd'hébergement # absence de stress et des interférencesassociées, pas de durée limite de la période de mesure…

• Application Bluetooth®, logiciel dédié

• Jusqu'à 36 dispositifs dans un même local, sans interférence

La télémétrie de "2ème génération"

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"Notion et exemples d'optimisation des techniques d'expérimentationanimale"

! Introduction – Position du sujet

! Composante "hébergement et enrichissement" en étude

! Composante "optimisation des techniques" :• Généralités• Exemple de l'imagerie du petit animal• Exemple de la télémétrie

! Conclusions

Plan

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L'optimisation, un processus continu d'amélioration :

% au service des 3 Rs et des valeurs éthiques et de respect

% au bénéfice de la R&D, de la qualité des études et de laperformance

Conclusions

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Imagerie médicale du petit animal

! RMN : résonnance magnétique nucléaire

! µCT : micro Computed Tomography (SCAN X)• Imagerie anatomique par rayons X

• Combiné avec : micro PET, scintigraphie, imagerie optique

! µPET : tomographie par émission de positron• Utilisation de marqueurs 18F, 11C, 13N, 15O… émettant des positrons

• Cellules à métabolisme élevé (tumeur, infection…)

! Scintigraphie : fixation d'un traceur• Imagerie fonctionnelle par radionucléotides : 99mTc,111In,123I, 125I

• Emission de rayons gamma, détection par caméra gamma

! Echographie par ultrasons

! Imagerie optique par bioluminescence & fluorescence

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IRM avec agents de contraste

Infarctus cérébral et ischémie chez le ratContraste par accumulation d'USPIO dans les cellules phagocytaires.

Image sans (à gauche) et avec contraste USPIO (à droite)

Image : M. Rausch et al. - Novartis Pharma AG Basel, Switzerland.

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