1
Regulation of calcium-sensing receptor by amyloid-beta-42: implications for Alzheimer’s disease
2ste Master Biomedische WetenschappenJabar Zada Freba
Academiejaar: 2012 – 2013 Promotor: Prof. Dr. K. D’Herde Co-promotor: Dr. A. Diez Fraile
2
Overzicht
1. Probleemstelling2. Hypothese3. Materiaal en methode4. Resultaten en discussie5. Conclusies
3
1. Probleemstelling
De ziekte van Alzheimer Neurodegeneratief
Microscopisch: • tau-eiwit kluwens • amyloid-β plaques
Verhoogde secretie van Amyloid-β (Aβ) peptide
Vicieuze cirkel
4
1. Probleemstelling
De pathogenese van Alzheimer Oorzaak?
Stoornis in calcium homeostase
Calcium-sensing receptor (CaSR)
Amyloid-β een agonist van CaSR
GPCR wijdverspreid in het CZS
5
2. Hypothese CaSR is betrokken in Aβ42 gemedieerde activatie van
astrocyten.
6
3. Materialen en methoden
Celcultuur• NHA = Normale Humane Astrocyten
Reagentia• Oligomere humane Aβ42 (1-20µM; 6 &12h)• CaSR agonist, NPS-R-568 (0,1-10µM; 6&12h)
Methoden• Transmissie elektronenmicroscopie (TEM)• Immunocytochemie• F-actine kleuring• RT-qPCR
4. Resultaten1. Transmissie-electronenmicroscopie
• NHA cellijn weinig gekend• Karakteristatie van NHA
subculturen• Glycogeen opstapeling• Geëlongeerde
mitochondriën• Cytoplasmatische
extensies• Gecoate Vesikels en
caveolae• Gap juncties
Astrocyten
4. Resultaten2. Immunocytochemie
Niet-gepermeabiliseerd Gepermeabiliseerd
CaSRKern
4. Resultaten
Controle Aβ42
Hu J, Akama KT, Krafft GA, Chromy BA, Van Eldik LJ (1998). Amyloid-beta peptide activates cultured astrocytes: morphological alterations, cytokine induction and nitric oxide release. Brain research 785:195-206.
3. Aβ42-gemedieerde activatie van astrocyten
3.1. F-actine kleuring en DAPI• 6h amyloïd-β-42
• Geen geactiveerde morfologie te zien
4. Resultaten
3.2. Evaluatie van iNOS, TNF-α en IL-1β door RT-qPCR
• Geen detectie van iNOS en TNF-α• Lichte upregulatie van IL-1β na 6 h incubatie met 1 µM Aβ42
4. Resultaten
Amyloid-beta-42 NPS-R-568
1.Oligomere vorm van Aβ42? Negatieve kleuring en TEM
2.GFAP (Glial Fibrillary Acidic protein)-kleuring
4. Resultaten
Ahmed M, Davis J, Aucoin D, et al (2007) Structural conversion of neurotoxic amyloid-beta(1-42) oligomers to fibrils. Nat Struct Mol Biol. 17: 561-556.
fibrillair oligomeer
4. Evaluatie van mogelijke valkuilen
5. Conclusie Astrocyten: ultrastructurele kenmerken CaSR expressie geen dosis- en tijdsafhankelijke morfologische activatie na incubatie
met Aβ42 of NPS-R-568 Geen verhoogde productie van onderzochte pro-inflammatoire
moleculen Aβ42 juist geaggregeerd GFAP negatiefOndanks de aanwezigheid van CaSR geen activatie van NHA door
Aβ42 of NPS-R-568 waargenemen.Hypothese: Mogelijks hebben de GFAP negatieve astrocyten een verlaagde responsiviteit aan Aβ42.
14
Bedankt voor uw aandacht ! Vragen?