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PAOLA ANDREA CARO HERNAacuteNDEZPAOLA ANDREA CARO HERNAacuteNDEZMicrobioacuteloga Industrial PhDMicrobioacuteloga Industrial PhD
httpwwwtaringanetpostsciencia-educacion5359230La-ciencias-naturales-en-T_html
iquestCual fue la primera interaccioacuten microbio-hospedador conocida
Margulis L Sagan D Acquiring genomes A theoryof the origins of species New York NYBasic Books2002
Margulis y la teoriacutea endosimbioacutetica
Infect Immun 2000686511-6518Host-pathogen interactionsbasic concepts of microbial commensalism colonizationinfection and disease Casadevall A Pirofski L
Interacciones hospedador-microorganismo en elcontexto de la patogenia microbiana
Traducido y modificado de Nat Rev Microbiol 2004 Dec2(12)933-45 The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria Batut J Andersson SG OCallaghan D
Infeccioacuten croacutenica bacteriana
Primer contacto con la ceacutelula hospedadora
Adherencia e invasioacuten
Vida en el medio ambiente
Establecimiento dentro de la ceacutelula hospedadora
Evitando la defensa del hospedador
Establecimiento dentro de la ceacutelula hospedadora
Adaptacioacuten al medioambiente
Extendiendo el nichoModulando la biologiacutea
del hospedador
Extendiendo el nichoMultiplicacioacuten y supervivencia en el nicho de replicacioacuten
Nat Rev Microbiol 2004 Dec2(12)933-45 The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria Batut J Andersson SG OCallaghan D
α-Proteobacterias patoacutegenas
Brucella melitensis
Brucella suis
Brucella abortus
Brucella canis
Brucella ovis Brucella neotomae
Brucella cetiBrucella pinnipedialis
Brucella microti
Geacutenero Brucella spp
Factores de virulencia involucrados con la interaccioacuten Brucella-ceacutelula hospedadora
virB
OMPs
Med Microbiol Immunol 2009 Nov198(4)221-38 Epub 2009 Sep 22 Survival of the fittest how Brucella strains adapt to their intracellular niche in the host Roop RM 2nd Gaines JM Anderson ES Caswell CC Martin DW Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La envoltura ceacutelular de Brucella spp
Int J Microbiol 20102010124509 Epub 2010 Dec 1Importance of Lipopolysaccharide and Cyclic β-12-Glucans in Brucella-Mammalian InfectionsHaag AF Myka KK Arnold MF Caro-Hernaacutendez P Ferguson GP
OMP
B ovisB ovisProteiacutenas de membrana externaProteiacutenas de membrana externa
(OMPs) (OMPs)
Cepa virulenta que no presenta cadenas O Las OMPs podriacutean tener mayor relevancia en
el proceso infeccioso
Omp31bOmp31b
Omp25bOmp25b
Omp25dOmp25d
Omp25Omp25cc
Omp22 (Omp3b)Omp22 (Omp3b)
Relaciones entre las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31
(Salhi et al 2003)
2525 100100
25b25b 3838 100100
25c25c 3939 6565 100100
25d25d 4141 5858 6060 100100
3131 3030 3535 3737 3636 100100
31b31b 2929 3838 3636 3737 6767 100100
2222 2525 2424 2323 2424 2626 2626 100100
OmpsOmps 2525 25b25b 25c25c 25d25d 3131 31b31b 2222
pIpI 6666 4646 4646 9292 5151 4848 8181
Identidad
Omp25
Omp31
Omp25cOmp25d
Omp25b
Omp31b
Omp22
10 PAM
Omp25Omp25
Omp31Omp31
Proteiacutenas de membrana externa de la familia Omp25Omp31 del geacutenero Brucella
Presencia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 en el geacutenero Brucella
Omp31Omp31 Omp31Omp31bb
Omp25Omp25 Omp25Omp25bb
Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B melitensisB melitensis ++ -- ++ ++ ++ ++ ++B abortusB abortus -- ++ ++ -- ++ ++ ++B suisB suisB neotomaeB neotomae ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
B ovisB ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B canisB canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B B pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(mayoriacutea de cepas)(mayoriacutea de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ --
Extraiacutedo deVizcaiacuteno et al 2004
Microbes Infect6 (9) 821-34 (2004) Vizcaino N Caro-Hernaacutendez P Cloeckaert A Fernandez-Lago L DNA polymorphism in the omp25omp31 family of Brucella spp identification of a 17-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 151-kb genomic island absent from Brucella ovis related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en Obtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en
B ovis PADeteccioacuten inmunoloacutegica mediante Western blot
Evaluacioacuten de la antigenicidad Evaluacioacuten de la antigenicidad de las OMPs de la familia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 Omp25Omp31 enen B ovisB ovis
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia
Omp25Omp31
INOacuteCULOceacutelulas
suspensioacuten D O = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten
Obtencioacuten de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Puncioacuten cardiaca
Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea
IPTGE coli
Adsorcioacuten de sueros
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr
∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2
S e m a n a p i
log
UF
Cb
az
o
B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
0
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2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana pi
log
UF
Cb
azo
B ovis PA
B ovis ∆omp31
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana pi
log
UF
Cb
azo
B ovis PA
B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
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Semana pi
Log
UFC
baz
o
B ovis PA
Δomp25d
Δomp25d-Com
Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
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B a
bort
us 2
308
B a
bort
us R
B51
B s
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1330
B c
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33
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PA
PA
∆om
p31
PA
∆om
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Com
PA
∆om
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PA
∆om
p25-
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p25c
PA
∆om
p25c
-Com
PA
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p25d
PA
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p25d
-Com
PA
∆om
p22
PA
∆om
p22-
Com
PA
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p31b
-Com
PA
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su
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orde
ro
NS
NS
NS NS
NS
NSNS
Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80
t(h)
DO
60
0 n
m
B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
httpwwwtaringanetpostsciencia-educacion5359230La-ciencias-naturales-en-T_html
iquestCual fue la primera interaccioacuten microbio-hospedador conocida
Margulis L Sagan D Acquiring genomes A theoryof the origins of species New York NYBasic Books2002
Margulis y la teoriacutea endosimbioacutetica
Infect Immun 2000686511-6518Host-pathogen interactionsbasic concepts of microbial commensalism colonizationinfection and disease Casadevall A Pirofski L
Interacciones hospedador-microorganismo en elcontexto de la patogenia microbiana
Traducido y modificado de Nat Rev Microbiol 2004 Dec2(12)933-45 The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria Batut J Andersson SG OCallaghan D
Infeccioacuten croacutenica bacteriana
Primer contacto con la ceacutelula hospedadora
Adherencia e invasioacuten
Vida en el medio ambiente
Establecimiento dentro de la ceacutelula hospedadora
Evitando la defensa del hospedador
Establecimiento dentro de la ceacutelula hospedadora
Adaptacioacuten al medioambiente
Extendiendo el nichoModulando la biologiacutea
del hospedador
Extendiendo el nichoMultiplicacioacuten y supervivencia en el nicho de replicacioacuten
Nat Rev Microbiol 2004 Dec2(12)933-45 The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria Batut J Andersson SG OCallaghan D
α-Proteobacterias patoacutegenas
Brucella melitensis
Brucella suis
Brucella abortus
Brucella canis
Brucella ovis Brucella neotomae
Brucella cetiBrucella pinnipedialis
Brucella microti
Geacutenero Brucella spp
Factores de virulencia involucrados con la interaccioacuten Brucella-ceacutelula hospedadora
virB
OMPs
Med Microbiol Immunol 2009 Nov198(4)221-38 Epub 2009 Sep 22 Survival of the fittest how Brucella strains adapt to their intracellular niche in the host Roop RM 2nd Gaines JM Anderson ES Caswell CC Martin DW Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La envoltura ceacutelular de Brucella spp
Int J Microbiol 20102010124509 Epub 2010 Dec 1Importance of Lipopolysaccharide and Cyclic β-12-Glucans in Brucella-Mammalian InfectionsHaag AF Myka KK Arnold MF Caro-Hernaacutendez P Ferguson GP
OMP
B ovisB ovisProteiacutenas de membrana externaProteiacutenas de membrana externa
(OMPs) (OMPs)
Cepa virulenta que no presenta cadenas O Las OMPs podriacutean tener mayor relevancia en
el proceso infeccioso
Omp31bOmp31b
Omp25bOmp25b
Omp25dOmp25d
Omp25Omp25cc
Omp22 (Omp3b)Omp22 (Omp3b)
Relaciones entre las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31
(Salhi et al 2003)
2525 100100
25b25b 3838 100100
25c25c 3939 6565 100100
25d25d 4141 5858 6060 100100
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Identidad
Omp25
Omp31
Omp25cOmp25d
Omp25b
Omp31b
Omp22
10 PAM
Omp25Omp25
Omp31Omp31
Proteiacutenas de membrana externa de la familia Omp25Omp31 del geacutenero Brucella
Presencia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 en el geacutenero Brucella
Omp31Omp31 Omp31Omp31bb
Omp25Omp25 Omp25Omp25bb
Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B melitensisB melitensis ++ -- ++ ++ ++ ++ ++B abortusB abortus -- ++ ++ -- ++ ++ ++B suisB suisB neotomaeB neotomae ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
B ovisB ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B canisB canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B B pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(mayoriacutea de cepas)(mayoriacutea de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ --
Extraiacutedo deVizcaiacuteno et al 2004
Microbes Infect6 (9) 821-34 (2004) Vizcaino N Caro-Hernaacutendez P Cloeckaert A Fernandez-Lago L DNA polymorphism in the omp25omp31 family of Brucella spp identification of a 17-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 151-kb genomic island absent from Brucella ovis related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en Obtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en
B ovis PADeteccioacuten inmunoloacutegica mediante Western blot
Evaluacioacuten de la antigenicidad Evaluacioacuten de la antigenicidad de las OMPs de la familia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 Omp25Omp31 enen B ovisB ovis
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia
Omp25Omp31
INOacuteCULOceacutelulas
suspensioacuten D O = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten
Obtencioacuten de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Puncioacuten cardiaca
Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea
IPTGE coli
Adsorcioacuten de sueros
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr
∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2
S e m a n a p i
log
UF
Cb
az
o
B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana pi
log
UF
Cb
azo
B ovis PA
B ovis ∆omp31
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana pi
log
UF
Cb
azo
B ovis PA
B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
1
2
3
4
5
6
7
8
2 9
Semana pi
Log
UFC
baz
o
B ovis PA
Δomp25d
Δomp25d-Com
Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
B a
bort
us 2
308
B a
bort
us R
B51
B s
uis
1330
B c
anis
RM
666
B n
eoto
mae
5K
33
B o
vis
PA
PA
∆om
p31
PA
∆om
p31-
Com
PA
∆om
p25
PA
∆om
p25-
Com
PA
∆om
p25c
PA
∆om
p25c
-Com
PA
∆om
p25d
PA
∆om
p25d
-Com
PA
∆om
p22
PA
∆om
p22-
Com
PA
om
p31b
-Com
PA
-pN
V99
8-10
su
perv
iven
cia
a s
uero
no
inm
une
de c
orde
ro
NS
NS
NS NS
NS
NSNS
Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80
t(h)
DO
60
0 n
m
B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Infect Immun 2000686511-6518Host-pathogen interactionsbasic concepts of microbial commensalism colonizationinfection and disease Casadevall A Pirofski L
Interacciones hospedador-microorganismo en elcontexto de la patogenia microbiana
Traducido y modificado de Nat Rev Microbiol 2004 Dec2(12)933-45 The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria Batut J Andersson SG OCallaghan D
Infeccioacuten croacutenica bacteriana
Primer contacto con la ceacutelula hospedadora
Adherencia e invasioacuten
Vida en el medio ambiente
Establecimiento dentro de la ceacutelula hospedadora
Evitando la defensa del hospedador
Establecimiento dentro de la ceacutelula hospedadora
Adaptacioacuten al medioambiente
Extendiendo el nichoModulando la biologiacutea
del hospedador
Extendiendo el nichoMultiplicacioacuten y supervivencia en el nicho de replicacioacuten
Nat Rev Microbiol 2004 Dec2(12)933-45 The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria Batut J Andersson SG OCallaghan D
α-Proteobacterias patoacutegenas
Brucella melitensis
Brucella suis
Brucella abortus
Brucella canis
Brucella ovis Brucella neotomae
Brucella cetiBrucella pinnipedialis
Brucella microti
Geacutenero Brucella spp
Factores de virulencia involucrados con la interaccioacuten Brucella-ceacutelula hospedadora
virB
OMPs
Med Microbiol Immunol 2009 Nov198(4)221-38 Epub 2009 Sep 22 Survival of the fittest how Brucella strains adapt to their intracellular niche in the host Roop RM 2nd Gaines JM Anderson ES Caswell CC Martin DW Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La envoltura ceacutelular de Brucella spp
Int J Microbiol 20102010124509 Epub 2010 Dec 1Importance of Lipopolysaccharide and Cyclic β-12-Glucans in Brucella-Mammalian InfectionsHaag AF Myka KK Arnold MF Caro-Hernaacutendez P Ferguson GP
OMP
B ovisB ovisProteiacutenas de membrana externaProteiacutenas de membrana externa
(OMPs) (OMPs)
Cepa virulenta que no presenta cadenas O Las OMPs podriacutean tener mayor relevancia en
el proceso infeccioso
Omp31bOmp31b
Omp25bOmp25b
Omp25dOmp25d
Omp25Omp25cc
Omp22 (Omp3b)Omp22 (Omp3b)
Relaciones entre las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31
(Salhi et al 2003)
2525 100100
25b25b 3838 100100
25c25c 3939 6565 100100
25d25d 4141 5858 6060 100100
3131 3030 3535 3737 3636 100100
31b31b 2929 3838 3636 3737 6767 100100
2222 2525 2424 2323 2424 2626 2626 100100
OmpsOmps 2525 25b25b 25c25c 25d25d 3131 31b31b 2222
pIpI 6666 4646 4646 9292 5151 4848 8181
Identidad
Omp25
Omp31
Omp25cOmp25d
Omp25b
Omp31b
Omp22
10 PAM
Omp25Omp25
Omp31Omp31
Proteiacutenas de membrana externa de la familia Omp25Omp31 del geacutenero Brucella
Presencia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 en el geacutenero Brucella
Omp31Omp31 Omp31Omp31bb
Omp25Omp25 Omp25Omp25bb
Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B melitensisB melitensis ++ -- ++ ++ ++ ++ ++B abortusB abortus -- ++ ++ -- ++ ++ ++B suisB suisB neotomaeB neotomae ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
B ovisB ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B canisB canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B B pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(mayoriacutea de cepas)(mayoriacutea de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ --
Extraiacutedo deVizcaiacuteno et al 2004
Microbes Infect6 (9) 821-34 (2004) Vizcaino N Caro-Hernaacutendez P Cloeckaert A Fernandez-Lago L DNA polymorphism in the omp25omp31 family of Brucella spp identification of a 17-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 151-kb genomic island absent from Brucella ovis related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en Obtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en
B ovis PADeteccioacuten inmunoloacutegica mediante Western blot
Evaluacioacuten de la antigenicidad Evaluacioacuten de la antigenicidad de las OMPs de la familia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 Omp25Omp31 enen B ovisB ovis
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia
Omp25Omp31
INOacuteCULOceacutelulas
suspensioacuten D O = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten
Obtencioacuten de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Puncioacuten cardiaca
Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea
IPTGE coli
Adsorcioacuten de sueros
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr
∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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S e m a n a p i
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B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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B ovis PA
B ovis ∆omp31
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B ovis PA
B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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2 9
Semana pi
Log
UFC
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B ovis PA
Δomp25d
Δomp25d-Com
Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B51
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RM
666
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5K
33
B o
vis
PA
PA
∆om
p31
PA
∆om
p31-
Com
PA
∆om
p25
PA
∆om
p25-
Com
PA
∆om
p25c
PA
∆om
p25c
-Com
PA
∆om
p25d
PA
∆om
p25d
-Com
PA
∆om
p22
PA
∆om
p22-
Com
PA
om
p31b
-Com
PA
-pN
V99
8-10
su
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no
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une
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orde
ro
NS
NS
NS NS
NS
NSNS
Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
0
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1
15
2
25
0 20 40 60 80
t(h)
DO
60
0 n
m
B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Traducido y modificado de Nat Rev Microbiol 2004 Dec2(12)933-45 The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria Batut J Andersson SG OCallaghan D
Infeccioacuten croacutenica bacteriana
Primer contacto con la ceacutelula hospedadora
Adherencia e invasioacuten
Vida en el medio ambiente
Establecimiento dentro de la ceacutelula hospedadora
Evitando la defensa del hospedador
Establecimiento dentro de la ceacutelula hospedadora
Adaptacioacuten al medioambiente
Extendiendo el nichoModulando la biologiacutea
del hospedador
Extendiendo el nichoMultiplicacioacuten y supervivencia en el nicho de replicacioacuten
Nat Rev Microbiol 2004 Dec2(12)933-45 The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria Batut J Andersson SG OCallaghan D
α-Proteobacterias patoacutegenas
Brucella melitensis
Brucella suis
Brucella abortus
Brucella canis
Brucella ovis Brucella neotomae
Brucella cetiBrucella pinnipedialis
Brucella microti
Geacutenero Brucella spp
Factores de virulencia involucrados con la interaccioacuten Brucella-ceacutelula hospedadora
virB
OMPs
Med Microbiol Immunol 2009 Nov198(4)221-38 Epub 2009 Sep 22 Survival of the fittest how Brucella strains adapt to their intracellular niche in the host Roop RM 2nd Gaines JM Anderson ES Caswell CC Martin DW Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La envoltura ceacutelular de Brucella spp
Int J Microbiol 20102010124509 Epub 2010 Dec 1Importance of Lipopolysaccharide and Cyclic β-12-Glucans in Brucella-Mammalian InfectionsHaag AF Myka KK Arnold MF Caro-Hernaacutendez P Ferguson GP
OMP
B ovisB ovisProteiacutenas de membrana externaProteiacutenas de membrana externa
(OMPs) (OMPs)
Cepa virulenta que no presenta cadenas O Las OMPs podriacutean tener mayor relevancia en
el proceso infeccioso
Omp31bOmp31b
Omp25bOmp25b
Omp25dOmp25d
Omp25Omp25cc
Omp22 (Omp3b)Omp22 (Omp3b)
Relaciones entre las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31
(Salhi et al 2003)
2525 100100
25b25b 3838 100100
25c25c 3939 6565 100100
25d25d 4141 5858 6060 100100
3131 3030 3535 3737 3636 100100
31b31b 2929 3838 3636 3737 6767 100100
2222 2525 2424 2323 2424 2626 2626 100100
OmpsOmps 2525 25b25b 25c25c 25d25d 3131 31b31b 2222
pIpI 6666 4646 4646 9292 5151 4848 8181
Identidad
Omp25
Omp31
Omp25cOmp25d
Omp25b
Omp31b
Omp22
10 PAM
Omp25Omp25
Omp31Omp31
Proteiacutenas de membrana externa de la familia Omp25Omp31 del geacutenero Brucella
Presencia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 en el geacutenero Brucella
Omp31Omp31 Omp31Omp31bb
Omp25Omp25 Omp25Omp25bb
Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B melitensisB melitensis ++ -- ++ ++ ++ ++ ++B abortusB abortus -- ++ ++ -- ++ ++ ++B suisB suisB neotomaeB neotomae ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
B ovisB ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B canisB canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B B pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(mayoriacutea de cepas)(mayoriacutea de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ --
Extraiacutedo deVizcaiacuteno et al 2004
Microbes Infect6 (9) 821-34 (2004) Vizcaino N Caro-Hernaacutendez P Cloeckaert A Fernandez-Lago L DNA polymorphism in the omp25omp31 family of Brucella spp identification of a 17-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 151-kb genomic island absent from Brucella ovis related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en Obtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en
B ovis PADeteccioacuten inmunoloacutegica mediante Western blot
Evaluacioacuten de la antigenicidad Evaluacioacuten de la antigenicidad de las OMPs de la familia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 Omp25Omp31 enen B ovisB ovis
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia
Omp25Omp31
INOacuteCULOceacutelulas
suspensioacuten D O = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten
Obtencioacuten de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Puncioacuten cardiaca
Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea
IPTGE coli
Adsorcioacuten de sueros
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr
∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
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∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Δomp25d-Com
Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
10
20
30
40
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60
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B a
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308
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us R
B51
B s
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1330
B c
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RM
666
B n
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mae
5K
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vis
PA
PA
∆om
p31
PA
∆om
p31-
Com
PA
∆om
p25
PA
∆om
p25-
Com
PA
∆om
p25c
PA
∆om
p25c
-Com
PA
∆om
p25d
PA
∆om
p25d
-Com
PA
∆om
p22
PA
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Com
PA
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p31b
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-pN
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no
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une
de c
orde
ro
NS
NS
NS NS
NS
NSNS
Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80
t(h)
DO
60
0 n
m
B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Nat Rev Microbiol 2004 Dec2(12)933-45 The evolution of chronic infection strategies in the alpha-proteobacteria Batut J Andersson SG OCallaghan D
α-Proteobacterias patoacutegenas
Brucella melitensis
Brucella suis
Brucella abortus
Brucella canis
Brucella ovis Brucella neotomae
Brucella cetiBrucella pinnipedialis
Brucella microti
Geacutenero Brucella spp
Factores de virulencia involucrados con la interaccioacuten Brucella-ceacutelula hospedadora
virB
OMPs
Med Microbiol Immunol 2009 Nov198(4)221-38 Epub 2009 Sep 22 Survival of the fittest how Brucella strains adapt to their intracellular niche in the host Roop RM 2nd Gaines JM Anderson ES Caswell CC Martin DW Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La envoltura ceacutelular de Brucella spp
Int J Microbiol 20102010124509 Epub 2010 Dec 1Importance of Lipopolysaccharide and Cyclic β-12-Glucans in Brucella-Mammalian InfectionsHaag AF Myka KK Arnold MF Caro-Hernaacutendez P Ferguson GP
OMP
B ovisB ovisProteiacutenas de membrana externaProteiacutenas de membrana externa
(OMPs) (OMPs)
Cepa virulenta que no presenta cadenas O Las OMPs podriacutean tener mayor relevancia en
el proceso infeccioso
Omp31bOmp31b
Omp25bOmp25b
Omp25dOmp25d
Omp25Omp25cc
Omp22 (Omp3b)Omp22 (Omp3b)
Relaciones entre las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31
(Salhi et al 2003)
2525 100100
25b25b 3838 100100
25c25c 3939 6565 100100
25d25d 4141 5858 6060 100100
3131 3030 3535 3737 3636 100100
31b31b 2929 3838 3636 3737 6767 100100
2222 2525 2424 2323 2424 2626 2626 100100
OmpsOmps 2525 25b25b 25c25c 25d25d 3131 31b31b 2222
pIpI 6666 4646 4646 9292 5151 4848 8181
Identidad
Omp25
Omp31
Omp25cOmp25d
Omp25b
Omp31b
Omp22
10 PAM
Omp25Omp25
Omp31Omp31
Proteiacutenas de membrana externa de la familia Omp25Omp31 del geacutenero Brucella
Presencia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 en el geacutenero Brucella
Omp31Omp31 Omp31Omp31bb
Omp25Omp25 Omp25Omp25bb
Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B melitensisB melitensis ++ -- ++ ++ ++ ++ ++B abortusB abortus -- ++ ++ -- ++ ++ ++B suisB suisB neotomaeB neotomae ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
B ovisB ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B canisB canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B B pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(mayoriacutea de cepas)(mayoriacutea de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ --
Extraiacutedo deVizcaiacuteno et al 2004
Microbes Infect6 (9) 821-34 (2004) Vizcaino N Caro-Hernaacutendez P Cloeckaert A Fernandez-Lago L DNA polymorphism in the omp25omp31 family of Brucella spp identification of a 17-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 151-kb genomic island absent from Brucella ovis related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en Obtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en
B ovis PADeteccioacuten inmunoloacutegica mediante Western blot
Evaluacioacuten de la antigenicidad Evaluacioacuten de la antigenicidad de las OMPs de la familia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 Omp25Omp31 enen B ovisB ovis
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia
Omp25Omp31
INOacuteCULOceacutelulas
suspensioacuten D O = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten
Obtencioacuten de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Puncioacuten cardiaca
Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea
IPTGE coli
Adsorcioacuten de sueros
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr
∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
1
2
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4
5
6
7
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2
S e m a n a p i
log
UF
Cb
az
o
B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
0
1
2
3
4
5
6
7
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana pi
log
UF
Cb
azo
B ovis PA
B ovis ∆omp31
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
1
2
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5
6
7
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana pi
log
UF
Cb
azo
B ovis PA
B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
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Semana pi
Log
UFC
baz
o
B ovis PA
Δomp25d
Δomp25d-Com
Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
10
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B51
B s
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B c
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RM
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B o
vis
PA
PA
∆om
p31
PA
∆om
p31-
Com
PA
∆om
p25
PA
∆om
p25-
Com
PA
∆om
p25c
PA
∆om
p25c
-Com
PA
∆om
p25d
PA
∆om
p25d
-Com
PA
∆om
p22
PA
∆om
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Com
PA
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NS NS
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Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
0
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0 20 40 60 80
t(h)
DO
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B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Brucella melitensis
Brucella suis
Brucella abortus
Brucella canis
Brucella ovis Brucella neotomae
Brucella cetiBrucella pinnipedialis
Brucella microti
Geacutenero Brucella spp
Factores de virulencia involucrados con la interaccioacuten Brucella-ceacutelula hospedadora
virB
OMPs
Med Microbiol Immunol 2009 Nov198(4)221-38 Epub 2009 Sep 22 Survival of the fittest how Brucella strains adapt to their intracellular niche in the host Roop RM 2nd Gaines JM Anderson ES Caswell CC Martin DW Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La envoltura ceacutelular de Brucella spp
Int J Microbiol 20102010124509 Epub 2010 Dec 1Importance of Lipopolysaccharide and Cyclic β-12-Glucans in Brucella-Mammalian InfectionsHaag AF Myka KK Arnold MF Caro-Hernaacutendez P Ferguson GP
OMP
B ovisB ovisProteiacutenas de membrana externaProteiacutenas de membrana externa
(OMPs) (OMPs)
Cepa virulenta que no presenta cadenas O Las OMPs podriacutean tener mayor relevancia en
el proceso infeccioso
Omp31bOmp31b
Omp25bOmp25b
Omp25dOmp25d
Omp25Omp25cc
Omp22 (Omp3b)Omp22 (Omp3b)
Relaciones entre las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31
(Salhi et al 2003)
2525 100100
25b25b 3838 100100
25c25c 3939 6565 100100
25d25d 4141 5858 6060 100100
3131 3030 3535 3737 3636 100100
31b31b 2929 3838 3636 3737 6767 100100
2222 2525 2424 2323 2424 2626 2626 100100
OmpsOmps 2525 25b25b 25c25c 25d25d 3131 31b31b 2222
pIpI 6666 4646 4646 9292 5151 4848 8181
Identidad
Omp25
Omp31
Omp25cOmp25d
Omp25b
Omp31b
Omp22
10 PAM
Omp25Omp25
Omp31Omp31
Proteiacutenas de membrana externa de la familia Omp25Omp31 del geacutenero Brucella
Presencia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 en el geacutenero Brucella
Omp31Omp31 Omp31Omp31bb
Omp25Omp25 Omp25Omp25bb
Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B melitensisB melitensis ++ -- ++ ++ ++ ++ ++B abortusB abortus -- ++ ++ -- ++ ++ ++B suisB suisB neotomaeB neotomae ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
B ovisB ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B canisB canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B B pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(mayoriacutea de cepas)(mayoriacutea de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ --
Extraiacutedo deVizcaiacuteno et al 2004
Microbes Infect6 (9) 821-34 (2004) Vizcaino N Caro-Hernaacutendez P Cloeckaert A Fernandez-Lago L DNA polymorphism in the omp25omp31 family of Brucella spp identification of a 17-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 151-kb genomic island absent from Brucella ovis related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en Obtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en
B ovis PADeteccioacuten inmunoloacutegica mediante Western blot
Evaluacioacuten de la antigenicidad Evaluacioacuten de la antigenicidad de las OMPs de la familia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 Omp25Omp31 enen B ovisB ovis
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia
Omp25Omp31
INOacuteCULOceacutelulas
suspensioacuten D O = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten
Obtencioacuten de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Puncioacuten cardiaca
Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea
IPTGE coli
Adsorcioacuten de sueros
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr
∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2
S e m a n a p i
log
UF
Cb
az
o
B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana pi
log
UF
Cb
azo
B ovis PA
B ovis ∆omp31
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana pi
log
UF
Cb
azo
B ovis PA
B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
1
2
3
4
5
6
7
8
2 9
Semana pi
Log
UFC
baz
o
B ovis PA
Δomp25d
Δomp25d-Com
Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
B a
bort
us 2
308
B a
bort
us R
B51
B s
uis
1330
B c
anis
RM
666
B n
eoto
mae
5K
33
B o
vis
PA
PA
∆om
p31
PA
∆om
p31-
Com
PA
∆om
p25
PA
∆om
p25-
Com
PA
∆om
p25c
PA
∆om
p25c
-Com
PA
∆om
p25d
PA
∆om
p25d
-Com
PA
∆om
p22
PA
∆om
p22-
Com
PA
om
p31b
-Com
PA
-pN
V99
8-10
su
perv
iven
cia
a s
uero
no
inm
une
de c
orde
ro
NS
NS
NS NS
NS
NSNS
Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80
t(h)
DO
60
0 n
m
B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Factores de virulencia involucrados con la interaccioacuten Brucella-ceacutelula hospedadora
virB
OMPs
Med Microbiol Immunol 2009 Nov198(4)221-38 Epub 2009 Sep 22 Survival of the fittest how Brucella strains adapt to their intracellular niche in the host Roop RM 2nd Gaines JM Anderson ES Caswell CC Martin DW Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La envoltura ceacutelular de Brucella spp
Int J Microbiol 20102010124509 Epub 2010 Dec 1Importance of Lipopolysaccharide and Cyclic β-12-Glucans in Brucella-Mammalian InfectionsHaag AF Myka KK Arnold MF Caro-Hernaacutendez P Ferguson GP
OMP
B ovisB ovisProteiacutenas de membrana externaProteiacutenas de membrana externa
(OMPs) (OMPs)
Cepa virulenta que no presenta cadenas O Las OMPs podriacutean tener mayor relevancia en
el proceso infeccioso
Omp31bOmp31b
Omp25bOmp25b
Omp25dOmp25d
Omp25Omp25cc
Omp22 (Omp3b)Omp22 (Omp3b)
Relaciones entre las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31
(Salhi et al 2003)
2525 100100
25b25b 3838 100100
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25d25d 4141 5858 6060 100100
3131 3030 3535 3737 3636 100100
31b31b 2929 3838 3636 3737 6767 100100
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OmpsOmps 2525 25b25b 25c25c 25d25d 3131 31b31b 2222
pIpI 6666 4646 4646 9292 5151 4848 8181
Identidad
Omp25
Omp31
Omp25cOmp25d
Omp25b
Omp31b
Omp22
10 PAM
Omp25Omp25
Omp31Omp31
Proteiacutenas de membrana externa de la familia Omp25Omp31 del geacutenero Brucella
Presencia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 en el geacutenero Brucella
Omp31Omp31 Omp31Omp31bb
Omp25Omp25 Omp25Omp25bb
Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B melitensisB melitensis ++ -- ++ ++ ++ ++ ++B abortusB abortus -- ++ ++ -- ++ ++ ++B suisB suisB neotomaeB neotomae ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
B ovisB ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B canisB canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B B pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(mayoriacutea de cepas)(mayoriacutea de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ --
Extraiacutedo deVizcaiacuteno et al 2004
Microbes Infect6 (9) 821-34 (2004) Vizcaino N Caro-Hernaacutendez P Cloeckaert A Fernandez-Lago L DNA polymorphism in the omp25omp31 family of Brucella spp identification of a 17-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 151-kb genomic island absent from Brucella ovis related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en Obtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en
B ovis PADeteccioacuten inmunoloacutegica mediante Western blot
Evaluacioacuten de la antigenicidad Evaluacioacuten de la antigenicidad de las OMPs de la familia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 Omp25Omp31 enen B ovisB ovis
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia
Omp25Omp31
INOacuteCULOceacutelulas
suspensioacuten D O = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten
Obtencioacuten de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Puncioacuten cardiaca
Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea
IPTGE coli
Adsorcioacuten de sueros
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
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sacB
omp22inactivado
kan r
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r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
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Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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2
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S e m a n a p i
log
UF
Cb
az
o
B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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Semana pi
log
UF
Cb
azo
B ovis PA
B ovis ∆omp31
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B ovis PA
B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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2 9
Semana pi
Log
UFC
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o
B ovis PA
Δomp25d
Δomp25d-Com
Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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10
20
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B a
bort
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B a
bort
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B51
B s
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B c
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RM
666
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5K
33
B o
vis
PA
PA
∆om
p31
PA
∆om
p31-
Com
PA
∆om
p25
PA
∆om
p25-
Com
PA
∆om
p25c
PA
∆om
p25c
-Com
PA
∆om
p25d
PA
∆om
p25d
-Com
PA
∆om
p22
PA
∆om
p22-
Com
PA
om
p31b
-Com
PA
-pN
V99
8-10
su
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no
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une
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orde
ro
NS
NS
NS NS
NS
NSNS
Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80
t(h)
DO
60
0 n
m
B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
La envoltura ceacutelular de Brucella spp
Int J Microbiol 20102010124509 Epub 2010 Dec 1Importance of Lipopolysaccharide and Cyclic β-12-Glucans in Brucella-Mammalian InfectionsHaag AF Myka KK Arnold MF Caro-Hernaacutendez P Ferguson GP
OMP
B ovisB ovisProteiacutenas de membrana externaProteiacutenas de membrana externa
(OMPs) (OMPs)
Cepa virulenta que no presenta cadenas O Las OMPs podriacutean tener mayor relevancia en
el proceso infeccioso
Omp31bOmp31b
Omp25bOmp25b
Omp25dOmp25d
Omp25Omp25cc
Omp22 (Omp3b)Omp22 (Omp3b)
Relaciones entre las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31
(Salhi et al 2003)
2525 100100
25b25b 3838 100100
25c25c 3939 6565 100100
25d25d 4141 5858 6060 100100
3131 3030 3535 3737 3636 100100
31b31b 2929 3838 3636 3737 6767 100100
2222 2525 2424 2323 2424 2626 2626 100100
OmpsOmps 2525 25b25b 25c25c 25d25d 3131 31b31b 2222
pIpI 6666 4646 4646 9292 5151 4848 8181
Identidad
Omp25
Omp31
Omp25cOmp25d
Omp25b
Omp31b
Omp22
10 PAM
Omp25Omp25
Omp31Omp31
Proteiacutenas de membrana externa de la familia Omp25Omp31 del geacutenero Brucella
Presencia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 en el geacutenero Brucella
Omp31Omp31 Omp31Omp31bb
Omp25Omp25 Omp25Omp25bb
Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B melitensisB melitensis ++ -- ++ ++ ++ ++ ++B abortusB abortus -- ++ ++ -- ++ ++ ++B suisB suisB neotomaeB neotomae ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
B ovisB ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B canisB canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B B pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(mayoriacutea de cepas)(mayoriacutea de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ --
Extraiacutedo deVizcaiacuteno et al 2004
Microbes Infect6 (9) 821-34 (2004) Vizcaino N Caro-Hernaacutendez P Cloeckaert A Fernandez-Lago L DNA polymorphism in the omp25omp31 family of Brucella spp identification of a 17-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 151-kb genomic island absent from Brucella ovis related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en Obtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en
B ovis PADeteccioacuten inmunoloacutegica mediante Western blot
Evaluacioacuten de la antigenicidad Evaluacioacuten de la antigenicidad de las OMPs de la familia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 Omp25Omp31 enen B ovisB ovis
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia
Omp25Omp31
INOacuteCULOceacutelulas
suspensioacuten D O = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten
Obtencioacuten de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Puncioacuten cardiaca
Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea
IPTGE coli
Adsorcioacuten de sueros
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr
∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B o v is ∆ o m p 2 5
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Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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B ovis PA
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Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
10
20
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50
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B51
B s
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B c
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RM
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PA
PA
∆om
p31
PA
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p31-
Com
PA
∆om
p25
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p25-
Com
PA
∆om
p25c
PA
∆om
p25c
-Com
PA
∆om
p25d
PA
∆om
p25d
-Com
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p22
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Com
PA
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p31b
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no
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une
de c
orde
ro
NS
NS
NS NS
NS
NSNS
Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80
t(h)
DO
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0 n
m
B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
B ovisB ovisProteiacutenas de membrana externaProteiacutenas de membrana externa
(OMPs) (OMPs)
Cepa virulenta que no presenta cadenas O Las OMPs podriacutean tener mayor relevancia en
el proceso infeccioso
Omp31bOmp31b
Omp25bOmp25b
Omp25dOmp25d
Omp25Omp25cc
Omp22 (Omp3b)Omp22 (Omp3b)
Relaciones entre las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31
(Salhi et al 2003)
2525 100100
25b25b 3838 100100
25c25c 3939 6565 100100
25d25d 4141 5858 6060 100100
3131 3030 3535 3737 3636 100100
31b31b 2929 3838 3636 3737 6767 100100
2222 2525 2424 2323 2424 2626 2626 100100
OmpsOmps 2525 25b25b 25c25c 25d25d 3131 31b31b 2222
pIpI 6666 4646 4646 9292 5151 4848 8181
Identidad
Omp25
Omp31
Omp25cOmp25d
Omp25b
Omp31b
Omp22
10 PAM
Omp25Omp25
Omp31Omp31
Proteiacutenas de membrana externa de la familia Omp25Omp31 del geacutenero Brucella
Presencia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 en el geacutenero Brucella
Omp31Omp31 Omp31Omp31bb
Omp25Omp25 Omp25Omp25bb
Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B melitensisB melitensis ++ -- ++ ++ ++ ++ ++B abortusB abortus -- ++ ++ -- ++ ++ ++B suisB suisB neotomaeB neotomae ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
B ovisB ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B canisB canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B B pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(mayoriacutea de cepas)(mayoriacutea de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ --
Extraiacutedo deVizcaiacuteno et al 2004
Microbes Infect6 (9) 821-34 (2004) Vizcaino N Caro-Hernaacutendez P Cloeckaert A Fernandez-Lago L DNA polymorphism in the omp25omp31 family of Brucella spp identification of a 17-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 151-kb genomic island absent from Brucella ovis related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en Obtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en
B ovis PADeteccioacuten inmunoloacutegica mediante Western blot
Evaluacioacuten de la antigenicidad Evaluacioacuten de la antigenicidad de las OMPs de la familia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 Omp25Omp31 enen B ovisB ovis
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia
Omp25Omp31
INOacuteCULOceacutelulas
suspensioacuten D O = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten
Obtencioacuten de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Puncioacuten cardiaca
Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea
IPTGE coli
Adsorcioacuten de sueros
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr
∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2
S e m a n a p i
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B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana pi
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azo
B ovis PA
B ovis ∆omp31
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B ovis PA
B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
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DO600 nm 120 160
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DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
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t(h)
DO
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B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Omp31bOmp31b
Omp25bOmp25b
Omp25dOmp25d
Omp25Omp25cc
Omp22 (Omp3b)Omp22 (Omp3b)
Relaciones entre las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31
(Salhi et al 2003)
2525 100100
25b25b 3838 100100
25c25c 3939 6565 100100
25d25d 4141 5858 6060 100100
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pIpI 6666 4646 4646 9292 5151 4848 8181
Identidad
Omp25
Omp31
Omp25cOmp25d
Omp25b
Omp31b
Omp22
10 PAM
Omp25Omp25
Omp31Omp31
Proteiacutenas de membrana externa de la familia Omp25Omp31 del geacutenero Brucella
Presencia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 en el geacutenero Brucella
Omp31Omp31 Omp31Omp31bb
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B ovisB ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B canisB canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B B pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(mayoriacutea de cepas)(mayoriacutea de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ --
Extraiacutedo deVizcaiacuteno et al 2004
Microbes Infect6 (9) 821-34 (2004) Vizcaino N Caro-Hernaacutendez P Cloeckaert A Fernandez-Lago L DNA polymorphism in the omp25omp31 family of Brucella spp identification of a 17-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 151-kb genomic island absent from Brucella ovis related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en Obtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en
B ovis PADeteccioacuten inmunoloacutegica mediante Western blot
Evaluacioacuten de la antigenicidad Evaluacioacuten de la antigenicidad de las OMPs de la familia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 Omp25Omp31 enen B ovisB ovis
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia
Omp25Omp31
INOacuteCULOceacutelulas
suspensioacuten D O = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten
Obtencioacuten de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Puncioacuten cardiaca
Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea
IPTGE coli
Adsorcioacuten de sueros
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr
∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2
S e m a n a p i
log
UF
Cb
az
o
B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana pi
log
UF
Cb
azo
B ovis PA
B ovis ∆omp31
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
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2
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4
5
6
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8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana pi
log
UF
Cb
azo
B ovis PA
B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
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2 9
Semana pi
Log
UFC
baz
o
B ovis PA
Δomp25d
Δomp25d-Com
Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
B a
bort
us 2
308
B a
bort
us R
B51
B s
uis
1330
B c
anis
RM
666
B n
eoto
mae
5K
33
B o
vis
PA
PA
∆om
p31
PA
∆om
p31-
Com
PA
∆om
p25
PA
∆om
p25-
Com
PA
∆om
p25c
PA
∆om
p25c
-Com
PA
∆om
p25d
PA
∆om
p25d
-Com
PA
∆om
p22
PA
∆om
p22-
Com
PA
om
p31b
-Com
PA
-pN
V99
8-10
su
perv
iven
cia
a s
uero
no
inm
une
de c
orde
ro
NS
NS
NS NS
NS
NSNS
Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
0
05
1
15
2
25
0 20 40 60 80
t(h)
DO
60
0 n
m
B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Presencia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 en el geacutenero Brucella
Omp31Omp31 Omp31Omp31bb
Omp25Omp25 Omp25Omp25bb
Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B melitensisB melitensis ++ -- ++ ++ ++ ++ ++B abortusB abortus -- ++ ++ -- ++ ++ ++B suisB suisB neotomaeB neotomae ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++
B ovisB ovis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B canisB canis ++ -- ++ -- ++ ++ ++B B pinnipediaepinnipediae ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(mayoriacutea de cepas)(mayoriacutea de cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ ++B cetaceaeB cetaceae(4 cepas)(4 cepas) ++ ++ ++ -- ++ ++ --
Extraiacutedo deVizcaiacuteno et al 2004
Microbes Infect6 (9) 821-34 (2004) Vizcaino N Caro-Hernaacutendez P Cloeckaert A Fernandez-Lago L DNA polymorphism in the omp25omp31 family of Brucella spp identification of a 17-kb inversion in Brucella cetaceae and of a 151-kb genomic island absent from Brucella ovis related to the synthesis of smooth lipopolysaccharide
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en Obtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en
B ovis PADeteccioacuten inmunoloacutegica mediante Western blot
Evaluacioacuten de la antigenicidad Evaluacioacuten de la antigenicidad de las OMPs de la familia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 Omp25Omp31 enen B ovisB ovis
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia
Omp25Omp31
INOacuteCULOceacutelulas
suspensioacuten D O = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten
Obtencioacuten de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Puncioacuten cardiaca
Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea
IPTGE coli
Adsorcioacuten de sueros
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr
∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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Semana pi
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UF
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B ovis PA
B ovis ∆omp31
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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log
UF
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B ovis PA
B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Semana pi
Log
UFC
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o
B ovis PA
Δomp25d
Δomp25d-Com
Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B s
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PA
PA
∆om
p31
PA
∆om
p31-
Com
PA
∆om
p25
PA
∆om
p25-
Com
PA
∆om
p25c
PA
∆om
p25c
-Com
PA
∆om
p25d
PA
∆om
p25d
-Com
PA
∆om
p22
PA
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p22-
Com
PA
om
p31b
-Com
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V99
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no
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ro
NS
NS
NS NS
NS
NSNS
Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
0
05
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0 20 40 60 80
t(h)
DO
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B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de anticuerpos policlonales en conejoObtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en Obtencioacuten de cepas mutantes y complementadas en
B ovis PADeteccioacuten inmunoloacutegica mediante Western blot
Evaluacioacuten de la antigenicidad Evaluacioacuten de la antigenicidad de las OMPs de la familia de las OMPs de la familia Omp25Omp31 Omp25Omp31 enen B ovisB ovis
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia
Omp25Omp31
INOacuteCULOceacutelulas
suspensioacuten D O = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten
Obtencioacuten de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Puncioacuten cardiaca
Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea
IPTGE coli
Adsorcioacuten de sueros
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr
∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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S e m a n a p i
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B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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B ovis PA
B ovis ∆omp31
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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B ovis PA
B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B ovis PA
Δomp25d
Δomp25d-Com
Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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PA
PA
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p31
PA
∆om
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Com
PA
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Com
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p25c
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PA
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PA
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Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
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DO600 nm 120 160
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DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Obtencioacuten de anticuerpos policlonales frente a las OMPs de la familia
Omp25Omp31
INOacuteCULOceacutelulas
suspensioacuten D O = 6
Adyuvante Incompleto de
Freund
1 SEMANA 1 SEMANA1 SEMANA
1ordf inoculacioacuten 2ordf inoculacioacuten 3ordf inoculacioacuten
Obtencioacuten de suero
Sin adyuvanteAdyuvante
Completo de Freund
Puncioacuten cardiaca
Intradeacutermica Subcutaacutenea Subcutaacutenea
IPTGE coli
Adsorcioacuten de sueros
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr
∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
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RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
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S e m a n a p i
log
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B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana pi
log
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Cb
azo
B ovis PA
B ovis ∆omp31
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B ovis PA
B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Semana pi
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B ovis PA
Δomp25d
Δomp25d-Com
Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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PA
PA
∆om
p31
PA
∆om
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p25c
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∆om
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p25d
PA
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PA
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NS
NS
NS NS
NS
NSNS
Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
0
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0 20 40 60 80
t(h)
DO
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B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
kan r
∆omp22
Cepas kanr sacr and amps
Inactivacioacuten del gen Inactivacioacuten del gen omp22omp22
Recombinacioacuten homologa doble
DenominacioacutenDenominacioacuten Genotipo Genotipo relevanterelevante
∆∆omp31omp31 omp31 kanomp31 kanrr
∆∆omp25omp25 omp25omp25 kankanrr
∆∆omp25comp25c omp25c kanomp25c kanrr
∆∆omp25domp25d omp25d kanomp25d kanrr
∆∆omp22omp22 omp22 kanomp22 kanrr
pNV22-1(9347 pb)
sacB
omp22inactivado
kan r
Amp
r
2
RsrII StuI
omp22
1
Cromosoma DE Cromosoma DE B ovisB ovis PA PA
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
pb
PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Semana pi
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B ovis PA
B ovis ∆omp31
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
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46 h 171x1010 300x108
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CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
pCVD442pNV22-IIII+VI
pb
514842683550
190417661375
Marcador PA 22-I
Δ22
PA 22-I
Δ22
Caracterizacioacuten genotiacutepicaCaracterizacioacuten genotiacutepica
21762690
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PA Δ22
22-I
IV III
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
0
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S e m a n a p i
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B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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B ovis PA
B ovis ∆omp31
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B ovis PA
B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B ovis PA
Δomp25d
Δomp25d-Com
Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B s
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PA
PA
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p31
PA
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Com
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p25c
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-Com
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NS
NS NS
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Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
0
05
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0 20 40 60 80
t(h)
DO
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B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Pruebas claacutesicasPruebas claacutesicas
PruebaPrueba B ovisB ovis PA PA ∆ ∆ompomp ∆ ∆omp-omp-
ComCom
Necesidad de suero + + +
Necesidad de CO2 + + +
Catalasa + + +
Oxidasa - - -
Actividad Ureasa - - -
Aglutinacioacuten Acriflavina + + +
Tincioacuten Cristal Violeta Oxalato + + +
Tb - - -
Wb - - -
Lisis fagos Iz - - -
RC + + +
Crecimiento en Tionina + + +
presencia de Fucsina - - -
colorantes Safranina - - -
Aglutinacioacuten A - - -
M - - -
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
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∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
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DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
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t(h)
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Omp31Omp31 Omp31bOmp31b Omp25Omp25 Omp25bOmp25b Omp25Omp25cc
Omp25Omp25dd
Omp2Omp222
B ovis PAB ovis PA ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25omp25 ++ -- -- -- ++ -- ++∆ ∆ omp25comp25c ++ -- ++ -- -- -- ++∆ ∆ omp25domp25d ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22omp22 ++ -- ++ -- ++ -- --∆ ∆ omp31omp31 -- -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25 comomp25 com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25c comomp25c com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp25d comomp25d com ++ -- ++ -- ++ -- ++∆ ∆ omp22 comomp22 com ++ -- ++ -- ++ -- --B ovis PA 25b B ovis PA 25b comcom ++ -- ++ ++ ++ -- ++
B ovis PA 31b B ovis PA 31b comcom
++ ++ ++ -- ++ -- ++
Western blot
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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S e m a n a p i
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B o v is P A
B o v is ∆ o m p 2 5
B o v is ∆ o m p 2 5 c
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
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Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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B ovis ∆omp25d
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Δomp25d
Δomp25d-Com
Δomp22
Δomp22-Com
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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no
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une
de c
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ro
NS
NS
NS NS
NS
NSNS
Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
0
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1
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0 20 40 60 80
t(h)
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B ovis PA
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
215
31
kDa
Suero anti-Omp25cMP
Omp25cOmp25cOmp25c Omp25c
Omp25
Δ25 ComPA Δ25cCom
Omp25
Vet Microbiol 28 137 (1-2) 74-82 (2009) Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Sancho P Tejedor C Cloeckaert A Fernaacutendez-Lago L Vizcaiacuteno N (2009) Analysis of the occurrence and distribution of the Omp25Omp31 family of surface proteins in the six classical Brucella species
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
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DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Efecto de la inactivacioacuten de cada Efecto de la inactivacioacuten de cada uno de los genes de la familia uno de los genes de la familia omp25omp31omp25omp31 sobre las sobre las propiedades de la membranapropiedades de la membrana
bullMicroscopia electroacutenica de transmisioacutenbullAuto aglutinacioacutenbull Porcentaje de supervivencia a Polimixina B
Deoxicolato de Na y Suero no inmune de carnero
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
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∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
1 2 3 5 7 9 y 11 pi1 2 3 5 7 9 y 11 pi
n=5n=5
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Papel de las OMPs de la familia Omp25Omp25 en las propiedades de la membrana externa de B ovis PA
Supervivencia (media plusmn DS de 3 experimentos) Diaacutemetro zona de inhibicioacuten
Cepa Polimixina B Desoxicolato de Na Suero no inmune (media plusmn DS)
(1 mgml) (01 mgml) de carnero H2O2 30
B abortus RB51 000plusmn000 8869plusmn545 25734plusmn484 428plusmn011
B ovis PA 6959plusmn526 8934plusmn93 8552plusmn520 504plusmn005
∆omp31 7007plusmn1383 7551plusmn2097 6443plusmn697 623plusmn011
∆omp25 7573plusmn2213 6381plusmn398 7167plusmn289 588plusmn002
∆omp25c 2770plusmn1165 3921plusmn792 5568plusmn732 588plusmn015
∆omp25d 6116plusmn893 5544plusmn2169 54053plusmn742 605plusmn007
∆omp22 5274plusmn397 3068plusmn36 2538plusmn398 590plusmn025
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Evaluacioacuten de virulencia en el modelo del ratoacuten BALBc
Viacutea de InoculacioacutenViacutea de Inoculacioacuten IntraperitonealIntraperitoneal
Dosis inoculadaDosis inoculada 5x10 5x10 66 UFCratoacuten UFCratoacuten
Ratones BALBcRatones BALBc 35 ratonescepa 35 ratonescepa
Semanas de sacrificioSemanas de sacrificio
Ratones sacrificadosRatones sacrificados
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
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CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
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CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
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Aacuterea de Investigacioacuten
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Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
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Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
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CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fisher
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La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
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Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
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Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
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CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
La proteiacutena Omp31 no parece tener un papel relevante en la virulencia de B ovis PA
Anaacutelisis estadiacutestico PLSD de Fischer
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
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Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
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CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
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CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
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Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 influyen en la capacidad invasiva y de proliferacioacuten en ceacutelulas HeLa y en macroacutefagos murinos J774A1
Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
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Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
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CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
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Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
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PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
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Microbes Infect 10 (6) 706-10 (2008) Importance of the Omp25Omp31 family in the internalization and intracellular replication of virulent B ovis in murine macrophages and HeLa cells Martiacuten-Martiacuten AI Caro-Hernaacutendez P Orduntildea A Vizcaiacuteno N Fernaacutendez-Lago L
Anaacutelisis de la implicacioacuten de las proteiacutenas de la familia Omp25Omp31 en la virulencia de B ovis
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Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
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Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
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Susceptibilidad al suero no inmune de carnero
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
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B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Hora B ovis PA ∆omp220 h 360x108 302x108
DO600 nm 005 005
17 h 540x109 780x109
DO600 nm 072 096
25 h 820x109 121x1010
DO600 nm 120 160
46 h 171x1010 300x108
DO600 nm 195 175
CRECIMIENTO CRECIMIENTO IN VITROIN VITRO
Medida de la DO Medida de la DO 600 nm600 nm
Recuentos UFCmlRecuentos UFCml
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0 20 40 60 80
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B ovis PA
B ovis ∆omp22
Infect Immun 75 (8) 4050-61 (2007) Role of the Omp25Omp31 Family in the Outer Membrane Properties and Virulence of Brucella ovis Caro-Hernaacutendez P Fernandez-Lago L de Miguel MJ Martin-Martin AI Cloeckaert A Grillo MJ Vizcaino N
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
Con excepcioacuten de la proteiacutena Omp25d las OMPs de la familia Omp25Omp31 de Brucella spp son antigeacutenicas Como se esperaba se confirma la ausencia de Omp31b y Omp25b en esta cepa
El balance de los miembros de la familia Omp25Omp31 es esencial para la estabilidad de la ME en B ovis
Las proteiacutenas Omp25d y Omp22 son necesarias para la virulencia de B ovis en ratoacuten por lo que seriacutea interesante analizar su papel en el establecimiento de un proceso infeccioso por B ovis en carneros y tambieacuten su implicacioacuten en la virulencia de otras especies del geacutenero Brucella
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
ldquoEl genoma de B suis revela fundamentales similaridades entre patoacutegenos y simbiontes (mutualistas) de animales y plantasrdquo Paulsen IT et al (2002) PNAS 99 (20) 13148-53
Uso de la interaccioacuten Sinorhizobium-Legumbre como modelo para la investigacioacuten de las bases moleculares de la
interaccioacuten Bacteria-Hospedador
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
Loacutepez-Lara I M Rhizobium y su destacada simbiosis con las leguminosas Asociacioacuten Mexicana de Microbiologiacutea
Paralelo entre la vida intracellular de S meliloti y Brucella spp
Flavonoides
Adherencia Enroscamiento Penetracioacuten Infeccioacuten
Desarrollo del noacuteduloNoacutedulo maduro que contiene bacteroide
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
La proteiacutena BacA es esencial para la persistencia de α-Proteobacterias dentro de la ceacutelula hospedadora
Aguda Croacutenica
Brucella dentro del macroacutefago
Enfermedad
Mutante bacABacteria Bacteroide
Mutante bacA
Simbiosis
Sinorhizobium en la ceacutelula vegetal
LeVier KL et al (2000) Science 287 2492-93
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten
PROPUESTA INVESTIGATIVA
Estandarizacioacuten del modelo de infeccioacuten bacteria leguminosa
Objetivos
Aislamiento y caracterizacioacuten de cepas autoctonas de
Rhizobium spp
Secuenciacioacuten profundaAnaacutelisis polimorfismo con respecto a secuencias de referencia de Brucella spp
Microbiologiacutea Fenotipicacioacuten
Biologiacutea MolecularBioinformaacutetica
Construccioacuten de mutantes RhizobiumQuimeras Brucella-Rhizobium
Caracterizacioacuten fenotiacutepica y genotiacutepica Biologiacutea Molecular
Microbiologiacutea
Aacuterea de Investigacioacuten