12-05-2010 1 PCR Polymerase Chain Reaction (Reazione a Catena della Polimerasi) Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65. Kary Mullis POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR Premio Nobel per la Chimica nel 1993 , Kary Mullis è divenuto una leggenda per la scoperta della R eazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction o PCR) una tecnica che ha rivoluzionato il mondo della chimica e della Biologia Molecolare, permettendo lʼamplificazione in vitro di frammenti di DNA , con innumerevoli applicazioni in campo biologico, medico, agrario, e nelle investigazioni della magistratura. 1. E’ un procedimento molto semplice che consente di ottenere un numero elevatissimo di copie di uno specifico segmento di DNA 2. La PCR è una tecnica molto sensibile che consente di rivelare la presenza del DNA o dell’RNA di interesse partendo da quantità minime di materiale biologico POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
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PCR Polymerase Chain Reaction
(Reazione a Catena della Polimerasi)
Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.
Kary Mullis
POLYMERASE CHAIN REACTION - PCR
Premio Nobel per la Chimica nel 1993, Kary Mullis è divenuto una leggenda per la scoperta della Reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction o PCR) una tecnica che ha rivoluzionato il mondo della chimica e della Biologia Molecolare, permettendo lʼamplificazione in vitro di frammenti di DNA, con innumerevoli applicazioni in campo biologico, medico, agrario, e nelle investigazioni della magistratura.
1. E’ un procedimento molto semplice che consente di ottenere un numero elevatissimo di copie di uno specifico segmento di DNA
2. La PCR è una tecnica molto sensibile che consente di rivelare la presenza del DNA o dell’RNA di interesse partendo da quantità minime di materiale biologico
POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
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Estensione - Forcina di Replicazione 5’
5’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 3’
Leading Strand (veloce)
Lagging Strand (lento)
3’
5’ 3’
5’ Single Strand Binding proteins (SSB)- Impediscono la rinaturazione del DNA
DNA Polimerasi
III
Okazaki fragment
RNA Primers
Primasi sintetizza primers di RNA
5’ 3’
5’
Elicasi- srotola il DNA (DnaB)
5’
Primers DNA polimerasi
ELEMENTI NECESSARI PER LA REAZIONE DI AMPLIFICAZIONE
DNA STAMPO
DESOSSIRIBOSIO
Base Azotata (Adenina, Timina, Citosina, Guanina,)
DesossiriboNucleotidi trifosfati (dNTP)
1) Frammento di DNA contenente il segmento da amplificare
2) Coppia di inneschi (o primers) per la DNA Polimerasi: oligonucleotidi lunghi 17-30 basi, di sequenza complementare a quelle fiancheggianti il segmento di DNA da amplificare.
3) TAQ DNA POLIMERASI
4) dNTP (N= A, C, G, T)
5) Mg2+
6) Apparecchio per PCR (es. Thermocycler)
ELEMENTI FONDAMENTALI PER LA REAZIONE DI PCR
5’ 5’ 3’ 3’
5’
5’ 3’
3’ 5’
5’ 3’
3’
Primer 1 Primer 2
1. DENATURAZIONE: il DNA viene denaturato a 94°C per separare fra loro i due filamenti che formano la doppia elica.
2. ANNEALING: la temperatura scende a 37-65°C (valore scelto in funzione della composizione in basi e della lunghezza degli inneschi) per consentire l’appaiamento fra gli inneschi e le due eliche di DNA ad essi complementari
3. ESTENSIONE: La temperatura sale a 72°C e la Taq Polimerasi sintetizza i nuovi filamenti di DNA partendo dai due inneschi in direzione 5’→3’utilizzando come stampo le due eliche di DNA.
UN CICLO DI PCR
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94°C
Fase 2: ANNEALING I primers si appaiano alle sequenze complementari sul DNA stampo
37-65°C
72°C
Fase 3: ESTENSIONE La DNA polimerasi allunga gli inneschi e produce 2 nuove catene di DNA
IL PROCESSO SI RIPETE
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Ad ogni ciclo il numero di molecole di DNA “copiato” raddoppia
1) Rappresentazione schematica dell’aumento dei prodotti di amplificazione in funzione del numero di cicli di PCR.
2) In questo caso, tra il 15 ed il 22mo ciclo esiste una relazione lineare tra il numero di cicli ed il prodotto di amplificazione ottenuto. Nei cicli successivi viene raggiunto il “plateau”.
CURVA DI REAZIONE PCR
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1. Denaturazione; 94°C 30 secs – 1min
2. Annealing; 37°C - 65°C 30 secs – 1min
3. Estensione/Polimerizzazione; 72°C 1min
OGNI CICLO DI PCR E’ COMPOSTO DA TRE FASI PCR
Elettroforesi su gel di Agarosio
Prodotto finale UV light
3-4 ore
ANALISI ELETTROFORETICHE
L’agarosio è uno zucchero che viene estratto da un’alga marina, ed è un polimero di unità costituite da D-galattosio e 3,6-anidro L-galattosio.
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LA PCR E’ UNA TECNICA DOTATA DI UNA ELEVATA SENSIBILITA’: CONTAMINAZIONI DA DNA POSSONO RAPPRESENTARE UN PROBLEMA
