i

Pertumbuhan Kultur Tunggal dan Campur Bakteri SpR3 dan SpR17 dan Kemampuannya dalam Mereduksi Cr(VI)

(The growth of Single and Mixed Bacterial Cultures of SpR3 and SpR17 and Their Potentials for Reducing Cr(VI))

Oleh

Marchelline

NIM: 412010005

SKRIPSI

Diajukan untuk memenuhi sebagian dari persyaratan untuk memperoleh gelar

Sarjana Sains (Biologi) dari Program Studi Biologi, Fakultas Biologi

Fakultas Biologi Universitas Kristen Satya Wacana

Salatiga 2015

ii

iii

iv

1

Abstract

The bacterial isolates, SpR3 and SpR17 have the ability to reduce a large

amount of Cr(VI), but the ability to reduce in single or mixed culture has not been

known yet. This study aimed to determine the growth and potential of single and

mixed bacterial cultures of SpR3 and SpR17 in reducing Cr(VI). The growth was

measured spectophotometrically (600nm) based on the biomass increase. The

potential of isolates in reducing Cr(VI) is calculated by the ability to decrease the

concentration of Cr(VI). Standard method 3500-Cr (colorimetric method) is being

used for calculating the concentration. Based on the reduced Cr(VI) concentration

and the potential reduction, SpR3 isolate was more effective than SpR17. The

value of the potential reduction of Cr(VI) SpR3 and SpR17 were 0.053 mg Cr.mg

cell-1 dry weight and 0.031 mg Cr.mg cell-1 dry weight. A mixture of two isolates

with a ratio of 1:1, 1:2 and 2:1 showed the effect of synergism because when

isolate SpR3 mixed with SpR17 potential value was increase. SpR3 synergy with

SpR17 to produce a better level of effectiveness.

Key words: Cr(VI)-reducing bacteria, mixed bacteria cultures, potential reduction

of Cr(VI).

Pendahuluan

Kromium (Cr) merupakan salah satu unsur yang paling banyak dijumpai di

lingkungan. Kontaminasi oleh senyawa kromium disebabkan oleh beragam aktifitas

dari industri yang akhirnya menyebabkan polusi berat pada tanah, air permukaan

dan atmosfer. Sumber utama dari kontaminasi kromium yaitu industri metal

finishing, penyulingan minyak, industri besi dan baja, pewarnaan tekstil, dan

penyamakan kulit. Bilangan oksidasi dari kromium yang umum dan stabil yang

terdapat di alam adalah Cr(III) dan Cr(VI) (Villegas dkk., 2008). Cr(III) secara

nutrisional merupakan komponen essensial untuk keseimbangan diet pada

manusia dan hewan, karena mencegah terjadinya efek dari metabolisme glukosa

2

dan lipid (misalnya kerusakan pada toleransi glukosa, terjadinya peningkatan

insulin, peningkatan trigliserid dan kolesterol, simptom hipoglisemik). Meskipun

Cr(III) dalam jumlah sedikit sangat dibutuhkan oleh tubuh, namun apabila jumlah

yang masuk tubuh konsentrasinya besar maka akan menimbulkan permasalahan

kesehatan (Zayed dan Terry, 2003).

Menurut Peraturan Menteri Kesehatan Republik Indonesia Nomor:

416/MENKES/PER/IX/1990, nilai ambang batas logam Cr(VI) dalam air bersih

adalah 0,05 mg.l-1 (Anonim, 1990). Cr(III) juga merupakan senyawa yang kurang

beracun, dan dalam pH netral Cr(III) mudah membentuk hidroksida kromium larut

yang dapat dengan mudah diserap oleh lingkungan. Berbeda dengan peran Cr(III)

sebagai bioelemen, Cr(VI) adalah salah satu logam berat yang paling beracun dan

merupakan kontaminan logam berat paling umum yang dapat menjadi ancaman

bagi kesehatan organisme melalui bioakumulasi (Shen dan Wang, 1993; Bennett

dkk. 2013).

Salah satu metode alternatif yang murah dan prospektif dikembangkan

untuk menangani pencemaran logam berat adalah dengan memanfaatkan

mikroorganisme melalui proses bioremidiasi (Wu dkk., 2006). Kelebihan

penggunaan bakteri pereduksi Cr(VI) ini adalah tidak membutuhkan input energi

yang tinggi, tidak ada produk samping yang nyata, serta menggunakan galur-galur

bakteri asli (Meitiniarti dkk., 2012). Berbeda dengan proses pengolahan limbah

industri yang dilakukan terhadap limbah logam berat sebelum dilepaskan ke

lingkungan, proses bioremidiasi dapat secara efektif diterapkan pada lingkungan

yang telah terkontaminasi oleh limbah logam berat. Metode alternatif ini

mempunyai fleksibilitas operasional yang cukup besar (Tambekar dan Gayakwad,

2013; Alexander, 1999).

Bakteri yang diisolasi dari tanah yang tahan terhadap kromium dapat

digunakan untuk mereduksi Cr(VI) menjadi Cr(III) dari lingkungan yang

terkontaminasi. Proses reduksi Cr(VI) oleh mikroorganisme, pada umumnya

3

membutuhkan proton dalam jumlah yang sangat besar sebagai pereduksi,

sehingga akan meningkatkan pH (Camargo dkk., 2003; Brock dan Madigan, 1991).

Isolat-isolat bakteri yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari hasil

penelitian Meitiniarti dkk. (2012) yang mendapatkan sembilan isolat, yaitu SpR1,

SpR3, SpR7, SpR9, SpR10, SpR11, SpR12, SpR17 dan SpR18 yang diperoleh dari

rhizosfer Acalypha indica yang ditumbuhkan di tanah lumpur dari pabrik

penyamakan kulit dan tekstil, dan mampu tumbuh pada konsentrasi Cr(VI)

100 mg.l-1. Meitiniarti dkk. (2012) melaporkan bahwa dari sembilan isolat tersebut,

hanya isolat SpR3 & SpR17 memiliki kemampuan mereduksi krom, masing-masing

sebesar 90,85 dan 60,75 mg.l-1. Pengukuran dilakukan setelah kultur diinkubasi

selama 7 hari. Berdasarkan hasil kajian di atas,maka dilakukan penelitan lanjut

mengenai pertumbuhan isolat SpR3 dan SpR17 dan potensinya dalam mereduksi

Cr(VI) dari masing-masing isolat dalam kultur tunggal maupun campuran.

Bahan dan Metode

Bahan Penelitian

Isolat bakteri dengan kode SpR3 dan SpR17 diperoleh dari hasil penelitian

Meitiniarti dkk. (2012). Kedua isolat dipelihara dalam medium pemeliharaan Luria

Bertani (LB) Agar yang mengandung 100 mg.l-1 Cr(VI). Sementara itu, medium yang

digunakan untuk pemeliharaan prekultur adalah medium LB cair yang

mengandung 100 mg.l-1 Cr(VI).

Tahapan Penelitian

Penelitian ini diawali dengan penyedian prekultur dari kedua isolat dalam

medium LB cair yang mengandung Cr(VI) 100 mg.l-1. Selanjutnya prekultur tersebut

digunakan untuk mempelajari (i) pertumbuhan masing-masing isolat dan

campuran kedua isolat pada medium LB cair yang mengandung 100 mg.l-1 Cr(VI),

(ii) kemampuan isolat maupun campuran kedua isolat dalam mereduksi Cr(VI)

4

pada medium LB cair yang mengandung 100 mg.l-1 Cr(VI) dengan metode

kolorimetrik, dan (iii) menghitung kecepatan mereduksi Cr(VI) dan potensi reduksi

Cr(VI).

Penyediaan Prekultur

Isolat bakteri pada medium LB agar miring sebanyak 2 ose diinokulasikan

ke dalam 50 ml medium Luria Broth steril lalu diinkubasikan untuk waktu tertentu

hingga OD kultur mencapai 0,6-0,8 (konsentrasi selnya sekitar 700 mg.l-1). Setelah

itu kekeruhannya diukur pada panjang gelombang 600 nm.

Pengukuran Pertumbuhan Bakteri dalam Medium yang Mengandung Cr(VI)

Prekultur sebanyak 10% dari volume medium pertumbuhan yang

digunakan diinokulasikan kemudian ditumbuhkan selama 24 jam pada suhu ruang

dengan penggojog pada kecepatan 120 rpm. Sementara itu, Penyediaan prekultur

untuk kultur campur dibuat 3 perbandingan komposisi antara SpR3 dan SpR17

yaitu 1:1, 1:2, dan 2:1. Kultur diinkubasi pada penggojok dengan suhu inkubasi

pada suhu ruang. Setiap selang waktu tertentu dilakukan pengambilan sampel.

Pertumbuhan diamati secara langsung berdasarkan kekeruhan kulturnya

menggunakan spektrofotometer (Shimadzu UV mini 1240) pada panjang

gelombang 600nm. Pertumbuhan diukur berdasarkan pertambahan nilai OD

sampai bakteri masuk fase stasioner. Pada setiap pengambilan sampel kultur juga

dilakukan pengukuran konsentrasi Cr(VI).

Metode Analisis

Pengukuran Kadar Biomassa Bakteri

Berat kering biomassa kultur ditentukan dengan menyaring 20 ml sampel dengan

menggunakan membrane filter (0,8 µm) yang diletakkan pada vaccum pump.

Sebelum digunakan, membrane filter dikeringkan menggunakan oven

(MemmertU10) selama 6 jam pada suhu 100⁰C. Membran bersama sel yang

5

tersaring dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 100⁰C selama 6 jam.

Membran yang sudah kering tersebut kemudian ditimbang. Persamaan yang

dipakai untuk mengkonversi nilai OD ke biomassa diperoleh dari :

Nilai biomassa = Nilai OD awal masing-masing kultur

Data biomassa setiap waktu yang diperoleh dibuat kurva pertumbuhan dengan

waktu sebagai sumbu X dan biomassa sebagai sumbu Y. Dari kurva pertumbuhan

tersebut dapat ditentukan kecepatan pertumbuhan spesifiknya.

Analisis Konsentrasi Cr (VI) dan Kecepatan Reduksi Cr(VI)

Konsentrasi Cr(VI) diukur dengan standar method 3500-Cr (colorimetric

method) (APHA, 1989). Larutan stok Cr(VI) 100 mg.l-1 dibuat dengan melarutkan

K2Cr2O7 dalam akuades. Larutan stok Cr(VI) tersebut digunakan untuk membuat

kurva standar. Supernatan kultur dari masing-masing pengambilan sampel

sebanyak 0,5 ml dimasukkan ke dalam erlenmeyer, lalu ditambahkan dengan

akuades hingga menjadi 50 ml. Setelah diasamkan dengan 0,075 ml HNO3 pekat,

ditambahkan 1 ml diphenylcarbazide. Reaksi ditandai oleh terbentuknya warna

violet. Absorbansi warna diukur pada panjang gelombang 540nm menggunakan

spektrofotometer (Shimadzu UV mini 1240). Nilai absorbansi dikonversikan ke

konsentrasi Cr(VI) menggunakan kurva standar Cr(VI). Kecepatan reduksi Cr(VI)

ditentukan dengan cara :

konsentrasi Cr(VI) yang direduksi

Kecepatan reduksi Cr(VI) =

waktu yang ditentukan

Nilai OD kultur X berat kering sel

6

Perhitungan Konsentrasi Cr(VI) yang Direduksi dan Potensi Reduksi

Konsentrasi Cr(VI) yang direduksi diperoleh dari pengurangan nilai konsentrasi

Cr(VI) pada jam tertentu. Potensi reduksi diperoleh dengan cara sebagai berikut:

nilai konsentrasi Cr(VI) yang direduksi

Potensi reduksi Cr(VI) =

Hasil dan Pembahasan

Pertumbuhan dan Reduksi Cr(VI) oleh Isolat Tunggal dalam Medium yang Mengandung Cr(VI) Kurva pertumbuhan oleh isolat tunggal dalam medium yang mengandung

Cr(VI) dan konsentrasi Cr(VI) dalam medium selama waktu inkubasi menunjukkan

bahwa isolat SpR3 dan SpR17 mampu mereduksi Cr(VI) 100 mg.l-1 (Gambar 1).

Penurunan konsentrasi Cr(VI) yang tinggi oleh isolat SpR3 terjadi pada jam ke-6

sampai jam ke-26, sedangkan penurunan konsentrasi Cr(VI) oleh isolat SpR17

terjadi pada jam ke-4 sampai jam ke-30. Pada waktu-waktu inkubasi ini

pertumbuhan bakteri sedang memasuki fase eksponensial. Hasil penelitian ini

menunjukkan bahwa reduksi Cr(VI) yang tinggi oleh isolat SpR3 dan SpR17 terjadi

bersamaan (coupling) dengan pertumbuhan sel.

nilai biomassa sel yang terbentuk

7

Gambar 1. Pertumbuhan isolat SpR3 ( ) dan SpR17 ( ) pada medium yang

mengandung Cr(VI) dan konsentrasi Cr(VI) selama waktu inkubasi. Simbol dan masing-masing menotasikan konsentrasi Cr(VI) pada medium yang ditumbuhi

oleh SpR3 dan SpR17. Walaupun kecepatan pertumbuhan isolat SpR17 lebih tinggi dibandingkan dengan

isolat SpR3 (Tabel 1), namun hasil perhitungan konsentrasi Cr yang direduksi dan

potensi reduksi Cr(VI) menunjukkan bahwa isolat SpR3 mempunyai kemampuan

yang lebih tinggi dari SpR17 (Tabel 1). Dengan demikian, hasil ini menunjukkan

bahwa sel-sel SpR3 lebih efektif dibandingkan dengan SpR17 dalam mereduksi Cr

yang ada di medium.

Tabel 1. Kecepatan pertumbuhan isolat SpR3 dan SpR17 dan kemampuannya mereduksi Cr(VI).

Kecepatan reduksi isolat SpR3 pada jam ke-24 lebih tinggi dari kecepatan

reduksi isolat SpR17 pada jam yang sama (Tabel 2). Kecepatan reduksi pada jam

ke-24 kedua isolat ini lebih tinggi dibandingkan dengan kecepatan reduksi Bacillus

sp. JDM-2-1 dan Staphylococcus capitis selama jam yang sama (Tabel 2). Akan

tetapi kecepatan reduksi Cr(VI) dari kedua isolat dalam penelitian ini menurun

pada jam ke-48 dan lebih rendah dibandingkan kecepatan reduksi Cr(VI) Bacillus

sp. JDM-2-1 dan Staphylococcus capitis. Hal tersebut diduga karena pada jam ke-48

kedua isolat bakteri telah memasuki fase stasioner dimana pertumbuhan dari sel-

sel bakteri berkurang dan beberapa sel mati. Apabila laju pertumbuhan sama

Kode isolat

Kecepatan Pertumbuhan

(jam-1)

Biomassa yang

terbentuk (g.l-1)

Konsentrasi Cr

yang Direduksi

(mg.l-1)

Potensi Reduksi

(mg Cr.mg berat kering

sel-1)

SpR17 0,045 1,503 46,693 0,031

SpR3 0,041 1,016 53,794 0,053

8

dengan laju kematian, maka secara keseluruhan jumlah sel tetap konstan hal ini

dinamakan fase stasioner (Volk dan Wheeler, 1988).

Tabel 2. Perbandingan kecepatan reduksi Cr(VI) isolat SpR3 dan SpR17 dengan Bacillus spdan Staphylococcus capitisdan kemampuannya mereduksi Cr(VI).

*= hasil penelitian Zahoor dan Rehman (2009).

Pertumbuhan dan Reduksi Cr (VI) oleh Bakteri Campur SpR3 dan SpR17 dalam Medium yang Mengandung Cr(VI)

Pada penelitian ini, kecepatan pertumbuhan spesifik dari tiap kultur

campur SpR3 dan SpR17 tidak dihitung tetapi penelitian ini lebih menitikberatkan

pada uji kemampuan bakteri campur dalam mereduksi Cr(VI). Gambar 2

menunjukkan bahwa penurunan Cr(VI) yang tinggi oleh kultur campur SpR3 dan

SpR17 dengan perbandingan 1:1 terjadi pada jam ke-8 sampai jam-32. Pada jam

tersebut pertumbuhan bakteri sedang memasuki fase ekponensial di mana terjadi

pertambahan jumlah sel menjadi 2 kali lipat (Volk dan Wheeler, 1988). Penurunan

Cr(VI) oleh kultur campur SpR3 dan SpR17 dengan perbandingan 1:2 dan 2:1

masing masing terjadi pada ke-8 sampai jam ke-50 dan jam ke-8 sampai jam ke-44.

Pertumbuhan kultur campur dalam medium yang mengandung Cr(VI) dapat dilihat

pada Gambar 2.

No. Isolat

Konsentrasi Cr(VI) (mg.l-1)

Cr(VI) yang direduksi (mg.l-1)

Kecepatan Reduksi Cr(VI) (mg l-1.jam-1)

Jam ke-24

Jam ke-48

Jam ke-24

Jam ke-48

Jam ke-24

Jam ke-48

1 Bacillus sp. JDM-2-1*

60 34 40 66 1,67 1,37

2 S. capitis* 71 47 29 53 1,21 1,10

3 Isolat SpR3 43,41 31,19 56,59 68,81 2,07 0,67

4 Isolat SpR17 49,73 32,30 50,27 67,70 1,81 0,65

9

Gambar 2. Pertumbuhan isolat campur SpR3 dan SpR17 dengan perbandingan 1:1 ( ),1:2 ( ),dan2:1 ( )pada medium yang mengandung Cr(VI). Notasi

, ,dan masing-masing menunjukkan konsentrasi Cr(VI) pada medium yang ditumbuhi oleh kultur campur SpR3 dan SpR17 dengan perbandingan 1:1, 1:2, dan 2:1.

Kecepatan reduksi Cr(VI) kultur campur SpR3 dan SpR17 dengan

perbandingan 2:1 lebih tinggi dibandingkan dengan kultur campur dengan

perbandingan 1:1 dan 1:2 (Tabel 3). Hasil ini memperkuat dugaan bahwa isolat

SpR3 memiliki kecepatan pertumbuhan dan kecepatan reduksi yang lebih besar

dibandingkan dengan SpR17. Nilai potensi reduksi Cr(VI) oleh bakteri campur

dengan perbandingan 1:1 dan 2:1 memiliki nilai yang berbeda jika dibandingkan

dengan nilai potensi reduksi oleh isolat SpR3 saja. Hal tersebut terjadi karena ada

kecenderungan bahwa efek potensi reduksi yang dimiliki oleh isolat SpR3 hampir

sama dengan kultur campur dengan perbandingan 1:1 ataupun 2:1, kemungkinan

efek yang terjadi adalah sinergisme. Dengan demikian, ketika kedua isolat SpR3

dan SpR17 dicampur maka potensi reduksinya akan lebih besar dari pada ketika

isolat SpR3 dan SpR17 ditumbuhkan masing-masing. Pada bakteri campur dengan

perbandingan 2:1 terlihat bahwa adanya peningkatan nilai potensi reduksi Cr(VI)

10

karena nilai potensi yang diperoleh lebih besar dari pada nilai potensi reduksi

Cr(VI) isolat SpR3 dan SpR17.

Tabel 3. Pertumbuhan kultur campur SpR3 dan SpR17 dan kemampuan reduksinya

Perbandingan

SpR3 & SpR17

Biomassa yang

terbentuk

(g.l-1)

Kecepatan Reduksi Cr(VI)(mg l-1.jam-1)

Konsentrasi Cr yang

Direduksi (mg.l-1)

PotensiReduksi (mg Cr.mg

berat kering sel-1)

1:1 1,082 0,050 61,672 0,057

1:2 1,335 0,011 35,437 0,027

2:1 1,269 2,693 74,737 0,059

Kesimpulan

Berdasarkan konsentrasi Cr yang direduksi dan potensi reduksi, hasil

penelitian ini menunjukkan bahwa isolat SpR3 lebih efektif dibandingkan dengan

SpR17. Pada pencampuran kedua isolat menunjukkan terjadinya efek sinergisme

pada rasio 1:1, 1:2 maupun 2:1. Dengan demikian, ketika kedua isolat SpR3 dan

SpR17 dicampur maka akan terjadi peningkatan pada potensi reduksinya dari pada

ditumbuhkan masing-masing.

Ucapan Terima Kasih

Penulis menyampaikan ucapan terimakasih sebesar-besarnya kepada Dr.

Drs. Rully Adi Nugroho, M.Sc., Ph.D. dan Dr. V. Irene Meitiniarti, M.P. yang telah

banyak membantu, baik dari sisi pendanaan maupun ilmiah.

Daftar Pustaka

Anonim. 1990. Peraturan mentri kesehatan nomor: 416/MEN.KES/PER/IX/1990

tentang syarat-syarat dan pengawasan kualitas air.

http://pppl.depkes.go.id/asset/regulasi/55_ permenkes %20416.pdf.

Diakses pada tanggal 24 Desember 2014.

11

Alexander M. 1999. Biodegradation and bioremediation. 2nd ed. Academic Press.

New York.

APHA. 1989. Standard methods for examination of water and wastewater. 18th ed.

American Public Health Association. Washington, DC.

Bennett RM, Cordero PRF, Bautista GS, Dedeles GR. 2013. Reduction of

hexavalent chromium using fungi and bacteria isolated from contaminated

soil and water samples. Chem. Eco. 29: 320–328.

Brock TD, Madigan MT. 1991. Biology of microorganism. 6th ed. Prentice-Hall

International Inc. New Jersey.

Camargo FAO, Bento FM, Okeke BC, Frankenberger WT. 2003. Chromate

reduction by chromium-resistant bacteria isolated from soils

contaminated with dichromate. Environ. Qua 32: 1228–1233.

Dantau. 2010. Fitoremediasi Logam Krom. http://digilib.its.ac.id/.../ITS-

Undergraduate-12521-bab1.pd. Diakses pada 5 Oktober 2014.

James BR. 2002. Chemical transformation of chromium in soils. Chem. Environ. 2:

46-48.

Katiyar SK, Katiyar R. 1997. Microbes in control of heavy metal pollution. Adv.

Microb. Biotechnol. 19: 330-344.

Meitiniarti VI, Krave AS, Kasmiyati S, Diyawati RM. 2012. Isolasi bakteri toleran

Cr(VI) dari rhizosfer Acalypha indica yang tumbuh pada tanah

mengandung limbah tekstil dan penyamakan kulit. Dalam: Prosiding

Seminar Nasional Biologi. Peran Biologi dan Pendidikan Biologi dalam

Pengembangan Karakter Konservasi. 31 Oktober 2012. p 86-92.

Sarangi A, Krishnan C. 2008. Comparison of in vitro Cr(VI) reduction by CFEs of

chromate resistant bacteria isolated from chromate contaminated soil.

Biorem. Technol. 10: 4130-4137.

12

Tambekar DH, Gayakwad SS. 2013. Studies on bioremediation of Chromium [VI] by

bacteria isolated from alkaline Lonar Lake (MS) India. Sci. Res. Rep. 1: 87-

90.

Viamajala S, Peyton BM, Apel WA, Petersen JN. 2002. Chromate/nitrite interaction

in Shewanella oneidensis MR-1: Evidence for multiple hexavalent

chromium [Cr(VI)] reduction mechanisms dependent on physiological

growth conditions. Biotechnol. Bioeng. 78: 770-778.

Volk WA, Wheeler MF. 1988. Mikrobiologi Dasar. 5rd ed. Erlangga. Jakarta.

Shen H, Wang YT. 1993. Characterization of enzymatic reduction ofhexavalent

chromium by Escherichia coli ATCC 33456. Appl. Environ. Microbiol.

59:3771–3777.

Wu CH, Wood TK, Mulchandani A, Chen W. 2006. Engineering plant-microbe

symbiosis for rhizoremediation of heavy metals. Appl. Environ. Microbiol.

72: 1129–1134

Zayed AM, Terry N. 2003. Chromium in the environment: Factors affecting

biological remediation. Plant and Soil 249: 139-156.