Unità di Ricerca Prof. Alfonso BarbarisiSeconda Università di Napoli
Relazione finale WP1Novembre 2006
BiomaterialiI biomateriali in studio sono:
Biomateriale Fornitore Sterilizzazione Nanostrutturato
PET tessuto Sorin Ossido di Etilene no
PTFE tessuto Sorin Ossido di Etilene no
PET film Good Fellow Ossido di Etilene no
PTFE film Good Fellow Ossido di Etilene no
PET tessuto + carbonio pirolitico
Sorin Ossido di Etilene no
PET e PTFE tessuto –Osservazione in modalità ESEM-
PET tessuto, a sinistra ingrandimento 100X; a destra ingrandimento
1000X. Campioni osservati in modalità ESEM
PTFE tessuto, a sinistra ingrandimento 100X; a destra ingrandimento
2000X. Campioni osservati in modalità ESEM
Fig. 1 Osservazione al Microscopio Elettronico di pET e PTFE tessuto.
PET rivestito con carbonio pirolitico –Osservazione in modalità ESEM-
Fig. 2. Osservazione al Microscopio Elettronico di PET rivestito con carbonio pirolitico. A sinistra ingrandimento 80X; a destra ingrandimento 1000X. Campioni osservati senza metallizzazione né disidratazione.
PET rivestito con carbonio pirolitico –Osservazione in modalità LOW Vacuum + analisi elementare (EDAX)
Fig. 3. Osservazione al Microscopio Elettronico del PET rivestito con carbonio pirolitico ed analisi elementare di superficie.
L’analisi elementare del rivestimento di carbonio pirolitico (grafico rosso) mostra la presenza di tracce di ossigeno probabilmente da attribuire a fenomeni di ossidazione.
In entrambi gli spettri si nota la presenza di alluminio come contaminante, probabilmente utilizzato nel processo di fabbricazione industriale.
Esperimento di idratazione disidratazione del PET rivestito con carbonio pirolitico –Modalità di osservazione: ESEM-
Fig. 4. L’osservazione è stata effettuata idratando il campione in acqua e diminuendo progressivamente la pressione nella camera di osservazione in modo da consentire l’evaporazione controllata dell’acqua imbibita nella matrice polimerica.
Discussione e Conclusioni
• I materiali PET e PTFE tessuto sono stati osservati in modalità ESEM, fornendo immagini di buona qualità (Figg. 1,2). Questi risultati sono interessanti in vista della futura osservazione dei materiali cellulati. Infatti, sarà possibile osservare la morfologia delle cellule adese sui biomateriali in studio senza ricorrere a metodiche di preparazione dei campioni proprie della modalità SEM che potrebbero originare degli artefatti.
• Anche l’analisi elementare in modalità ESEM (senza metallizzazione dei campioni), potrà trovarne giovamento consentendo l’osservazione di elementi di difficile identificazione e quantificazione in modalità SEM (ad esempio il picco del fosforo si sovrappone parzialmente con quello dell’oro).
• L’analisi elementare della superficie del PET rivestito con carbonio pirolitico ha mostrato la presenza di alluminio che potrebbe interferire con i fenomeni di adesione e vitalità cellulare.
• L’esperimento di idratazione/disidratazione in modalità ESEM, ha mostrato la validitàdella tecnica nel documentare fenomeni di assorbimento di liquidi, anche questo rappresenta un importante risultato in prospettiva di un futuro utilizzo della metodica su biomateriali trattati superficialmente per migliorarne l’idrofilicità.
Valutazione della proliferazione cellulare
Cellule utilizzate: Fibroblasti 3T3 swiss albino mouse
Terreno di Coltura: DMEM, High Glucose with Glutamax-I
Metodica: Dojindo’s Cell Counting Kit-8, il principio di base e quello dell’MTT, ma il cromoforo che viene ridotto dalla deidrogenasi mitocondriale delle cellule metabolicamente attive produce un sale di tetrazolio (WST-8) solubile in acqua.
Per favorire l’adesione cellulare sui biomateriali in studio, una goccia di terreno di coltura (100 μL) contenente 5x 103 Fibroblasti è stata seminata sui biomaterialiadagiati sul fondo dei pozzetti in multiwell da 24 che, successivamente, sono state incubate a 37°C e 5% di CO2 per 5 ore. Poi, i volumi di terreno sono stati portati ad 1 mL in ogni pozzetto.
Per valutare l’efficacia della metodica di adesione dei fibroblasti sui biomaterialipiuttosto che sul polistirene della piastra di coltura, osservazioni al microscopio ottico sono state effettuate a 5, 24 e 48 ore, rarissime cellule sono state evidenziate adese sulla piastra od in sospensione, indicando che la stragrande maggioranza dei Fibroblasti era adesa sui biomateriali in studio.
La proliferazione cellulare è stata valutata sui campioni a 24 e 48 ore seguendo la procedura raccomandata dal fornitore
Curva Standard proliferazione FibroblastiPer verificare la linearità dell’assorbanza del cromoforo (WST-8) in relazione alla crescita cellulare dei Fibroblasti 3T3 swiss albino mouse è stata approntata una curva standard (N° di Cellule in funzione dell’assorbanza) secondo la procedura descritta dal fornitore.
Curva Standard Fibroblasti
y = 0,0269x - 0,0424R2 = 0,9948
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
N° Cellule
O.D
. 450
nm
TEST DI PROLIFERAZIONE
(WST-8)
N = 2; StD < 5% della Media
* Biomateriali al fondo della piastra con colla di fibrina
Proliferazione Fibroblasti
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
O.D
. 450
nm
1 giorno2 giorni
Controllo *PET *PTFE PET *PTFE PET tessuto tessuto film film Carb.Pir.
Risultati e Conclusioni
•Il Kit-8 della Dojindo rappresenta un semplice e sensibile metodo per la valutazione della proliferazione cellulare, paragonabile ai risultati ottenuti con l’incorporazione di timidina triziata (dati di letteratura).
Vantaggi del Kit-8 rispetto all’MTT classico:
•Maggiore sensibilità.
•Nessun solvente organico deve essere utilizzato per solubilizzare il sale di tetrazolio.
•Nessuna interferenza del rosso fenolo, presente nei terreni di coltura, con l’assorbanza del cromoforo.
•La curva standard mostra l’ottima linearità di risposta del saggio nell’intervallo di concentrazione cellulare utilizzato.
•Gli esperimenti di proliferazione hanno evidenziato una scarsa proliferazione dei fibroblasti sul PTFE sia in forma di film che di tessuto e sul PET rivestito con carbonio pirolitico, mentre il PET, sia in forma di tessuto che di film mostra una proliferazione del 75% rispetto al controllo (valore a 2 giorni).
•In conclusione i materiali testati evidenziano una scarsa proliferazione dei fibroblasti 3T3 swiss albino mouse. Quindi, possono essere utilizzati come materiali di partenza per la nanostrutturazione sulla loro superficie di molecole capaci di aumentarne l’adesione e la crescita cellulare.
BiomaterialiBiomateriali : PET : PET nanostrutturatonanostrutturato con Acido con Acido IaluronicoIaluronico, , UnitUnitàà Operativa di Siena, Operativa di Siena, Prof.Prof. R. R. BarbucciBarbucci
Esperimenti Effettuati: Valutazione della Proliferazione cellulaEsperimenti Effettuati: Valutazione della Proliferazione cellulare;re;Organizzazione del Organizzazione del citoscheletrocitoscheletro cellularecellulare..
Dopo 24 ore di incubazione la proliferazione dei Dopo 24 ore di incubazione la proliferazione dei fibroblastifibroblasti era del 35% era del 35% rispetto al controllo;rispetto al controllo;
Dopo 48 ore di incubazione la proliferazione dei Dopo 48 ore di incubazione la proliferazione dei fibroblastifibroblasti era del 30% era del 30% rispetto al controllo.rispetto al controllo.
Mancanza di una campionatura adeguata per il prosieguoMancanza di una campionatura adeguata per il prosieguo
A (Ingrandimento 1000X), B (Ingrandimento 400X). A (Ingrandimento 1000X), B (Ingrandimento 400X). FibroblastiFibroblasti su PET su PET nanostrutturatonanostrutturato(Siena).(Siena). CitoscheletroCitoscheletro ben organizzato, che ricalca la disposizione cellulare tra due ben organizzato, che ricalca la disposizione cellulare tra due strisce strisce adiacenti di acido adiacenti di acido IaluronicoIaluronico..
ORGANIZZAZIONE DEL CITOSCHELETRO CELLULAREORGANIZZAZIONE DEL CITOSCHELETRO CELLULARE
LL’’organizzazione del organizzazione del citoscheletrocitoscheletro cellulare cellulare èè stata studiata mediante stata studiata mediante microscopia ottica a fluorescenza (microscopia ottica a fluorescenza (PhalloidinPhalloidin--TexasTexas RedRed))
Approfondimento studio dellApprofondimento studio dell’’adesione di adesione di fibroblastifibroblasti 3T3 su PET 3T3 su PET nanostrutturatonanostrutturato (Realizzato dall(Realizzato dall’’UnitUnitàà Operativa di BARI)Operativa di BARI)
UnitUnitàà di Ricerca di Ricerca Prof.Prof. Alfonso Alfonso BarbarisiBarbarisi
UniversitUniversitàà di Napolidi Napoli
Progress Progress ReportReport WP1WP1
Giugno 2005Giugno 2005
• valutazione della proliferazione cellulare (numero significativovalutazione della proliferazione cellulare (numero significativo di di campioni campioni +SD+SD) ;) ;
••Valutazione dellValutazione dell’’organizzazione del organizzazione del citoscheletrocitoscheletro e localizzazione della e localizzazione della p397 p397 fosfoFAKfosfoFAK;;
••Analisi biochimica della p397 Analisi biochimica della p397 fosfoFAKfosfoFAK e FAK totale;e FAK totale;
••Studio della morfologia cellulare in ESEM.Studio della morfologia cellulare in ESEM.
Proliferazione fibroblast 3T3
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Controllo PET PETflat PETnano
O. D
. 450
nm
4 h 24 h48 h 72 h
Proliferazione dei Proliferazione dei fibroblastifibroblasti 3T3 3T3 SwissSwiss albino mouse albino mouse su PET, su PET, PETflatPETflat e PET e PET nanostrutturatonanostrutturato
Il calcolo della Deviazione Standard Il calcolo della Deviazione Standard èè stato effettuato su 5 campioni per ogni punto sperimentalestato effettuato su 5 campioni per ogni punto sperimentale
Organizzazione del Organizzazione del citoscheletrocitoscheletro e distribuzione della p397 e distribuzione della p397 fosfoFAKfosfoFAK
FibroblastiFibroblasti 3T3 3T3 SwissSwiss albino Mouse albino Mouse piastratipiastrati su PET non trattato,su PET non trattato,
1h di incubazione.1h di incubazione.
Organizzazione del Organizzazione del citoscheletrocitoscheletro e distribuzione della p397 e distribuzione della p397 fosfoFAKfosfoFAK
FibroblastiFibroblasti 3T3 3T3 SwissSwiss albino Mouse albino Mouse piastratipiastrati su PET su PET floruratoflorurato flatflat,,1h di incubazione.1h di incubazione.
Organizzazione del Organizzazione del citoscheletrocitoscheletro e distribuzione della p397 e distribuzione della p397 fosfoFAKfosfoFAK
FibroblastiFibroblasti 3T3 3T3 SwissSwiss albino Mouse albino Mouse piastratipiastrati su PET su PET floruratoflorurato nanostrutturatonanostrutturato,,1h di incubazione.1h di incubazione.
60 minuti 90 minuti
S C P F N C P F NS C P F N C P F N
Valutazione biochimica p397FAK e FAK totaleValutazione biochimica p397FAK e FAK totale
Attivazione FAK
02468
1012141618
60 min 90 min
% A
ttiva
zion
e
ControlloPETFlatNano
FAK totFAK tot
p397FAKp397FAK
La SD La SD èè stata calcolata stata calcolata su 3 differenti su 3 differenti esperimentiesperimenti
FibroblastiFibroblasti 3T3 3T3 piastratipiastrati su su PET. A e B 1 ora, C 24 ore.PET. A e B 1 ora, C 24 ore.
FibroblastiFibroblasti 3T3 3T3 piastratipiastrati su PET su PET floruratoflorurato nanostrutturatonanostrutturato. A e B 1 . A e B 1 ora, C 24 ore.ora, C 24 ore.
FibroblastiFibroblasti 3T3 3T3 piastratipiastrati su su PET PET flatflat floruratoflorurato. A e B 1 ora, . A e B 1 ora, C 24 ore.C 24 ore.
CONCLUSIONICONCLUSIONI
•• I I FibroblastiFibroblasti aderiscono sulle aderiscono sulle nanostrutturenanostrutture con un con un meccanismo differente rispetto alle superfici meccanismo differente rispetto alle superfici flatflat, , morfologicamente si evidenziano strutture morfologicamente si evidenziano strutture podosomepodosome--likelikepiuttosto che piuttosto che fillopodifillopodi,,
•• LL’’organizazioneorganizazione del del citoscheletrocitoscheletro èè differente,differente,
•• LL’’ attivazione della FAK attivazione della FAK èè quantitativamente e quantitativamente e temporalmentetemporalmentedifferente.differente.
Studio dellStudio dell’’adesione di adesione di fibroblastifibroblasti 3T3 su PET trattato 3T3 su PET trattato con fasci ionici (Realizzato dallcon fasci ionici (Realizzato dall’’UnitUnitàà Operativa di Operativa di
CATANIA)CATANIA)
Materiali testatiMateriali testati
•• PET non trattato (P0)PET non trattato (P0)•• PET irradiato (P1)PET irradiato (P1)•• PET non trattato + RGD (P0R)PET non trattato + RGD (P0R)•• PET irradiato + RGD (P1R)PET irradiato + RGD (P1R)•• PET non trattato + FBS (P0F)PET non trattato + FBS (P0F)•• PET irradiato + FBS (P1F)PET irradiato + FBS (P1F)
•• valutazione della proliferazione cellulare (numero significativovalutazione della proliferazione cellulare (numero significativodi campioni di campioni +SD+SD) ;) ;
•• Analisi biochimica della p397 Analisi biochimica della p397 fosfoFAKfosfoFAK e FAK totale (solo su e FAK totale (solo su P0 e P1)P0 e P1)
Proliferazione fibroblasti 3T3
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
controllo P0 P1 P0R P1R P0F P1F
O.D
. 405
nm
4 ore24 ore48 ore
Proliferazione Proliferazione FibroblastiFibroblasti
Deviazione standard calcolata su 3 campioni per ogni punto speriDeviazione standard calcolata su 3 campioni per ogni punto sperimentalementale
C P0 P1 C P0 P1C P0 P1 C P0 P1
Valutazione biochimica p397FAK e FAK totaleValutazione biochimica p397FAK e FAK totale
FAK p397FAKFAK p397FAK
CONCLUSIONICONCLUSIONI
Il PET deposto su wafer di silicio e trattato con i fasci Il PET deposto su wafer di silicio e trattato con i fasci ionici non favorisce la proliferazione dei ionici non favorisce la proliferazione dei fibroblastifibroblasti,,
Qualche miglioramento della proliferazione Qualche miglioramento della proliferazione èè stato stato ottenuto sui materiali rivestiti con RGD e FBS.ottenuto sui materiali rivestiti con RGD e FBS.
