Pharmacogenetics &
Pharmacogenomics:New tools for individualized drug therapy
R.Krishnamoorthy
INSERM
If it were not for the
genetic variations among individuals
environmental differences they
encounter
Life style habits they practice
Medical practice will be much more straight forward
Almost identical but
small difference matters
The remaining 0.1 % matters for phenotype
What does mean this 0.1% difference ?
This translates into 3 million separate “spelling” differences (polymorphisms) in our genome book
Some/many of these differences predict inter individual variations
a) in disease susceptibility
b) in Clinical expression
c) in drug response
Why do Why do peoplepeople respond differently to respond differently to drugs?drugs?
Drug/drug/environment/genotype interactions
Drug receptor genotype
Drug transporter genotype
Drug metabolism genotype
Because of variability in
Present Scenario in Drug therapy
• Schizophrenia: 30 % do not respond
• Hypertension: Only 27 % adequately controlled
• ADR & under-dosage: 100 thousand patients/yr die in USA.
Cost: $ 100 billion per year
• Optimal therapy for major illness: Still elusive
• Cost of Drug Development : $ 500 – 700 million for
each drug .. 80% fails in clinical trial
Xénobiotiques:
substances étrangères à l’organisme de faible P.M.
- Médicaments (pharmacologie, toxicologie)
- Polluants (environnement)
- Aliments (nutrition)
PHARMACOGENETICS
Is the study of genetic variation underlying differentialresponse to drugs/xenobiotics
Hypothesis-driven plausible candidate gene approach
Variability may concern :
the behaviour (Pharmacokinetics) of the drug
the action (Pharmacodynamics) of the drug
both
....
0
20
40
60
80
100
120
10
Fast metabolizers
ultra-fastmetabolizers
slowmetabolizers
Log Debrisoquine / 4OH debrisoquine: RM0.1 1 100
Bertilsson and Dahl 1996
12.6Nu
mb
ero
f i
nd
ivid
ual
s
( )n
What is Pharmacogenomics?
Study of all genes in the genome that
may determine drug response.
It takes into account of genes controlling
drug metabolising enzymes, transporters,
receptors, numerous proteins, entire
signaling network etc.
Pharmacogénétique :
• connaissance du génome• développement des méthodes de génotypage à haut débit• analyse globale des transcriptomes
Pharmacogénomique
• dosage et molécule adaptés au patient
• développement de nouveaux médicaments
Variabilité interindividuelle du métabolisme des médicaments et des xénobiotiques
Prescription personnalisée du médicament
Lariboisière 99
Ultimate Goal of Pharmacogenomics ?
Giving the Right DrugAt Right Dose
To the Right Patient
At the Right Time
Patient specific selection of medication and their dosage
PHASE I
Oxydation
Réduction
Hydrolyse
PHASE II
Conjugaison
Métabolisme des médicaments et des xénobiotiques
RH RHO ROX
O2 XOH
RH : Substrat hydrophobe ROX : produits hydrophiles éliminésdans la bile ou les urines
Lariboisière 99
Lariboisière 99
ENZYME DE LA PHASE I
Co-substrat : H2OEpoxyde hydrolasesCarboxy-ester hydrolasesAmidasesCholinestérases*Arylésterases*
Co-substrats : H2AzoréductasesNitroréductasesN-oxydoréductases
Co-substrats : O2Monoamine-oxydasesAldéhydes déshydrogénases*Flavoprotéines monooxygénases*S-oxydases*P450 monooxygénases*
ENZYME DE LA PHASE II
Co-substrat : Acide glucoroniqueUDP-Glucoronosidetransferases*
Co-substrat : sulfateSulfotransférases*
Co-substrats : Acides aéminésN-acétyltransférases
Co-substrat : CH3CO-N-acétyltransférases*
Co-substrat : CH3-O-méthyltransférasesN- méthyltransférases*S- méthyltransférases*
Co-substrat :GSTS-Glutathiontransférases*
PHASE I PHASE II(fonctionnalisation) (conjugaison)
Substrathydrophobe
RH
ROHSubstrat
hydrophileROX
Polymorphisme
FAMILLEShomologie < 40%
CYP2
SOUS FAMILLES45%-60% homologie
CYP3A3CYP3A4CYP3A5
StéroïdesRifampicine
CYP1A1CYP1A2
A. B. C. D. E.
Hydrocarburesaromatiques
CYP2C8CYP2C9CYP2C19 Méphénytoïne
CYP2D6 Débrisoquine
EthanolPhénobarbital
Superfamille des cytochromes P450(Nebert et al, 1991)
Inducteur
Lariboisière 99
Phase - I enzymes known to show polymorphism
• CYP1A6: Nicotine
• CYP2C9 : Phenytoin, warfarin, NSAIDs etc
• CYP2C19: Omeprazole, proguanil, diazepam etc
• CYP2D6 : More than 60 drugs
• CYP2E1 : Ethanol
• DPD : Flurouracil
Phase II enzymes known to show polymorphism
• NAT2 : Isoniazid, hydralazine,
• GST : D-Penicillamine
• TPMT : Azathioprine, 6-MP
• Pseudocholinesterase: Succinyl choline
• UGT1A1 : Irinotecan
Relative abundance of P450 isoenzymes in human liver
CYP2E11%
CYP3A51%
CYP1A25%
CYP2C19%
CYP2D624%
Relative contribution of P450 isoenzymes to drug metabolism
Les médicaments utilisant une même voie métaboliquesont nombreux et divers dans leur nature
Exemple : Voie du CYP2D6
- Médicaments CardiovasculairesAntiarythmiques, β - Bloquants, Antihypertenseurs
- Médicaments PsychotropesNeuroleptiques, Antidépresseurs tricycliques Inhibiteurs de la MAO
- Dérivés de la morphineCodéine, Dextrométhorphane
- AutresPhenformine, Perhrexiline, Méthoxyamphétamine
Lariboisière 99
Pharmacogénétique : conséquences
Médicament = drogue ou prodrogue
métabolisme in vivodrogue métabolite inactif
enzyme(s) de transformation
Chez un sujet déficitaire en enzyme de transformation (métaboliseur lent), la drogue s'accumule
risque d'accident toxique
Lariboisière 99
Potential consequences of polymorphic drug metabolism
• Extended pharmacological effect • Adverse drug reactions • Lack of prodrug activation • Drug toxicity • Increased effective dose • Metabolism by alternative, deleterious pathways • Exacerbated drug-drug interactions
What is Genetic Polymorphism?
A genetic polymorphism is any mutant or variant allele that occurs with a frequency of more than 1% in the normal population
Molecular mechanisms that can alter drug metabolism
Polymorphic effects on drug action
time
Dru
g co
nce
ntr
atio
n
0
100
100
10030
65
99
24hr
wt/wt
wt/mut
mut/mut
Polymorphism in drug metabolising enzyme results in increased circulating drug concentrations in heterozygotes and homozygotes
Drug metabolism genotypes
From Evans and Relling, Science 286 (1999) 487
POLYMORPHISM
RECEPTORS:
For ACE : Captopril, enalapril
β2 receptor: salbutamol
5-HT2A : Clozapine
OTHERS:
P-glycoprotein – drug transporter
APOE ε4 – tacrine
Ethnic Differences in Poor Metabolizers of CYP2 enzymes
2.1
15 - 23
0 – 1
Orientals (%)
8 - 10
2.5 - 6
5 - 10
CYP2C9
CYP2C19
CYP2D6
Cauacasians (%)Enzyme
CYP2D6 – Implications for Poor metabolisers
Decreased elimination of parent compound
Beta blockers: metoprolol, timololTricylic antidepressants: nortriptyline, clomipramine
Decreased prodrug activation: Codeine, encainide
Decreased elimination of active metabolite: imipramine
Decreased elimination of parent compound &
active metabolite: Amitriptyline & nortriptyline
CYP2D6 Vs Starting dose of nortriptyline
Normal CYP2D6 : 150 mg/day
Mutant CYP2D6 : 10-20 mg/day
Why diazepam metabolism is slower in Asians compared to Caucasians?
Because Asians have high frequency of mutant alleles CYP2C19
84 hoursCYP2C19 *2/*2PM
20 hoursCYP2C19 *1/*1EM
Diazepam t1/2AlleleGenotype
CYP2C19 Vs Treatment of H.Pylori
Genotype Allele Cure rate
Wild type CYP2C19 *1/*1 29 %
Htz Mutant CYP2C19 *1/*2 60 %
Hmz Mutant CYP2C19 *2/*2 100 %
Due to higher concentration of omeprazole
Omeprazole 20 mg/day and amoxicillin 2gm/day
CYP2C9 Vs Phenytoin maintenance dose
Genotype Mean dose (mg/d)
CYP2C9 *1/*1 314 mg/d
CYP2C9 *1/*2 193 mg/d
CYP2C9 *2/*3 150 mg/d
(Source: Pharmacogenetics, 2001, 11, 287-291)
Quelques exemples actuels d'application
• Polymorphisme des NAT et traitement par l'isoniazide
• Polymorphisme de la TPMT et traitement des leucémies de l'enfant par la 6-mercaptopurine
• Megaprescription d'antidépresseurs chez les métaboliseurs ultra rapides CYP2D6
• Polymorphisme des apolipotrotéines E et traitement de la maladie d'Alzheimer
• Facteur V Leiden et pilule contraceptive
Lariboisière 99
THIOPURINE METHYL-TRANSFERASE (TPMT) :METABOLISME DE L’AZATHIOPRINE
AZATHIOPRINE
6-MERCAPTOPURINETPMT
HGPRT XO
6-MMP
6-THIOGUANINES
ACIDE THIOURIQUE
ACTIFSTOXIQUES
ACTIVITE TPMT : DISTRIBUTION TRIMODALE
5 10 15 20
Activité TPMT, Unités/ml GR
Nb
d’in
divi
dus,
%
M/M
M/Wt
Wt/Wt
Public health issue
Antivitamin K treatments
17 000 hospitalisations / year
First cause of
iatrogenic drug accident
400 000 à 580 000 treated patients
3000 death / year
Observance du traitement
Alimentation (vit. K)
Situation physiopathologique
Interactions médicamenteuses
Facteurs génétiques
Risque
hémorragique
VARIABILITE DANS LA REPONSE
Risque
thrombotique
Nbde
patients
Doses de warfarine (mg/semaine)
HYPERSENSIBILITE RESISTANCE
CONCLUSION
CYP2C9*3 + VKORC1 G-1639A = 50% de la variabilité
Variabilité dans la réponse pharmacologique de l’acénocoumarol
CYP2C9
VKORC1
POIDS
INCONNUE
4%
14%
37%
Gene UGT1A1
Irinotecan (CPT-11):Toxicity Prediction
Abacavir
Anti-HI, analogue non nucléosidique (Ziagen®)5% réaction d ’hypersensibilité quelques rares cas---> mort200 individus suivis
- HLA B5701, C4A6, -DR7, -DR3 67 % des intolérants ont cet haplotype0% des tolérants ont cet haplotypeOR 117
- HLA B570178 % des intolérants2,4 % des tolérants
Valeur prédictive positive 100% et négative 97%
Détermination haplotype avant traitement devrait permettre de réduire de 50%les réactions d’hypersensibilité.
Mellal et coll. Lancet 2002, Hetherington et coll. Lancet 2002, Martin 2004
Current methods for genetic testing
Phenotyping: requires use of a probe drug
Genotyping: DNA based assay
PCR / Restriction Fragment Length Polymorphism
Automated fluorescence based allele discrimination (e.g. Taqman assay)
DNA Chips: High throughput assays
PhenotypingAdvantages:
It reveals• Drug-drug interactions
• Defects in the overall process of drug metabolism
Disadvantages:Complicated protocols of testing
Risks of adverse drug reactions
Interaction of co-administered drugs
Confounding effects of disease itself
– Small amount of blood or tissue– Not affected by underlying disease– Independent of co-administered therapy– Specific and sensitive – Results within 4 -72 hours (rapid intervention).
Genotyping Advantages
Pre-requisite:
Phenotype and Genotype correlation needs to be established
Genotyping arrays
Lipshutz et al, Nature Genetics 1999, 21:20-24
Allele A
Allele B
MismatchPrefect matchMismatchPrefect match
GenotypeA/A B/B A/B
Tokyo 99
1
2
3
4
A
B
C
D
1
2
3
4
A
B
D
C
1
3
4
A
B
C
D
2
Drugmetabolismpathway
Diseasepathway
Patient A Patient B Patient C
Responder Non responder Non responder
Drugmetabolismpathway is deficient Disease
pathwayisdifferent
Tokyo 99
Du fait de la diversité génétique ......le métabolisme des médicaments varie d'un
individu à l'autredéfinition individuelle de la posologie
Parce que la base physiopathologique de la plupart des maladies implique différentes étapes ...
...l'étape affectée chez deux individus présentant les mêmes symptômes peut être différente
choix personnalisé du médicament
Vers une médecine personnalisée
Lariboisière 99
L'analyse des variations du transcriptome
avec et sans drogue doit permettre
- de valider la cible supposée- d'identifier la "signature" transcriptionnelle- d'identifier des voies accessoires- de cribler de nouvelles molécules produisant
la même "signature"
entre un tissu normal et un tissu pathologique
et donc participer - à la découverte de nouvelles cibles - à l'identification et la validation de nouvelles drogues
Perspectives • Génomique structurale : génotypage à haut débit
- profil pharmacogénétique individuel- typage élargi :
polymorphisme des enzymes du métabolismepolymorphisme de leur inductionpolymorphisme de l'absorption, transport, cible...drogue spécifique de populations
• Génomique fonctionnelle : analyse des transcriptomes- validation des nouvelles drogues- identification des réseaux fonctionnels et voies alternes- identification de nouvelles cibles
Homme et micro-organismesLariboisière 99
Patient requires Treatment
Examination by the Physician
Genomic testing Traditional investigations
Bio-informatics system
Decision making by Physician, assisted by an Expert System (interactive interpretation)
Prescribes individualized drug treatment
Ethical considerations in pharmacogenetics and pharmacogenomics
• ethnicity
• selection of patients for clinical trial
• families versus populations
• privacy & confidentiality
• data storage and retrieval
• discrimination
• reduction in potential drug market & economic considerations
Un espoir...... et des questions
Quelle sera la puissance exacte des marqueurs de génotypage par rapport aux facteurs nutritionnels et d'environnement, à l'âge et à l'état général du sujet,
paramètres qui participent tous à la variabilité d'efficacité des traitements ?
Lariboisière 99
Contraintes et limites du phénotypage• prise du médicament• influence de l'état hépatique, rénal, nutritionnel...• interférence avec d'autres médicaments• difficulté à distinguer les hétérozygotes• difficulté à étudier une enzyme hépatique
Lariboisière 99
Avantages du génotypage• méthode non invasive• détection directe de la mutation et de sa nature exacte• rapide (PCR)• à l'abris des interférences
Pharmacogénétique : défauts moléculaires
• Les mêmes que dans les maladies génétiques : mutations ponctuelles, délétions (insertions), reéarragements géniques
• polymorphisme de l'induction ?
Mais
• dans une maladie génétique, la mutation s'exprime en fonction de son mode spécifique de transmission et produit un phénotype anormal
• en pharmacogénétique, l'expression de la mutation est conditionnelle à l'étatde base, le phénotype est normal et un phénotype anormal n'apparaît qu'en présence d'un agent extérieur xénobiotique - médicament (ex. déficit en G6PD)
génétique environnementLariboisière 99
Réponse
Dose
Importance particulière lorsque :- la pente de la courbe dose-réponse est forte- la fenêtre thérapeutique est étroite
Lariboisière 99
Polymorphisms
Single nucleotide polymorphisms
……..G G T A A C T T G …...
……..G G C A A C T T G …...
Incidence 1 per 300 - 600bp3 billion base pairs in a haploid cell
Estimated cost of DNA testing in USA
Cost of DNA testing may be offset by:A reduction in costs associated with toxic episodes or therapeutic failure and subsequent intervention; Insurance claims
• Simple PCR for 1 mutation: $ 10
• For 50 mutations: $ 150
• By Chip for 20 mutations: $ 70
• By Chip for 100 mutations: $ 250
PHARMACOGENETICS
Is the study of genetic variation underlying differentialresponse to drugs/xenobiotics
Hypothesis-driven plausible candidate gene approach
Variability may concern :
the behaviour (Pharmacokinetics) of the drug
the action (Pharmacodynamics) of the drug
both
What is Pharmacogenomics?
Study of all genes in the genome that
may determine drug response.
It takes into account of genes controlling
drug metabolising enzymes, transporters,
receptors, numerous proteins, entire
signaling network etc.
PHARMACOGENOMICS(structural)
Involves large – scale systematicgenomics (genome-wide DNAgenotyping) to discover drugresponse markers
Overall search for drug pathways(drug targets, receptors, metabolism)
Prediction of drug effects
LINKAGE STUDIES
Genotyping in families withMultiallelique microsatellite markers
Correlate inheritance of a particularChromosomal region with inheritance ofDisease.
A large linkage study (exaggerated situation)- 1000 family members- 500 microsatellite markers- 500 000 genotypes
LINKAGE STUDIES
Are not practical for pharmacogenomicstudies
Drug response data (phenotype) canrarely be obtained from multiplemembers of a family
Association studies ofunrelated individuals in a
given population is apractical choice forPharmacogenomics.
ASSOCIATION STUDIES
Genotyping of unrelated individualsof a given population
Correlate the presence of a chromosomal region and a trait(phenotype: disease /drug response)
A large association study:- 1000 unrelated individuals- 100 000 markers (which?)- 100 million genotypes
SINGLE NUCLEOTIDEPOLYMORPHISMS (SNPs)
Simple base-pair substitutions withinand outside genes
Less polymorphic than microsatellites(commonly biallelic)
Occur much more frequently(approximately every 300bp)
Amenable to large scale automatedgenotyping
Genome-wideLinkage studies
Shared chromosomalregions are long (tens ofmillions of bases) withinfamily members
Few hundreds of evenlyspaced markers aresufficient to locatea particular region
Genome-wideAssociation studies
Shared chromosomalregions are small (lessthan 100kb) amongunrelated individuals ofan open population (distantcommon ancestry)
More than 100 000markers are required(dense map)
MULTIFACTORIALDISORDERS
(eg: cancer, atherosclerosis,Neurodegenerative disorders)
Are much more common thanmonogenic disorders
Each represent a collection of differinggenetic conditions with a similar clinicalphenotype
Hence distinct etiologies
Hence distinct responses to therapies
Pharmacogenomics
differential expression analysis
(Functional)
Cell Cell
drug
mRNA mRNA
cDNA cDNA
ValidateValidate by quantitative by quantitative PCRPCR
Relative expression Relative expression levelslevels
Fluorescent Fluorescent visualizationvisualization
FunctionalFunctional genomicsgenomics