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8/10/2019 pnas01515-0397
1/6
P r o c .
N a t l .
A c a d . S c i .
USA
V o l .
9 3 ,
p p .
3 5 4 7 - 3 5 5 2 ,
A p r i l
1 9 9 6
N c u r o b i o l o g y
V i s u a l i z a t i o n
o f t h e v e s i c u l a r
a c e t y l c h o l i n e t r a n s p o r t e r
i n
c h o l i n e r g i c
nerve t e r m i n a l s and
i t s
t a r g e t i n g
t o a
s p e c i f i c
p o p u l a t i o n
o f s m a l l
s y n a p t i c
v e s i c l e s
( v e s i c u l a r
monoamine
t r a n s p o r t e r / i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y / s m a l l s y n a p t i c v e s i c l e s / l a r g e
d e n s e - c o r e
v e s i c l e s / r e g u l a t e d
s e c r e t i o n )
EBERHARD
W E I H E * ,
JUNG-HWA
T A O - C H E N G t ,
MARTIN
K . - H .
S C H A F E R * ,
J E F F R E Y
D .
E R I C K S O N t ,
AND
L E E
E . E I D E N t
* D e p a r t m e n t
o f
A n a t o m y
a n d
C e l l
B i o l o g y , P h i l i p p s
U n i v e r s i t y ,
M a r b u r g , G e r m a n y ;
t L a b o r a t o r y
o f
N e u r o b i o l o g y ,
N a t i o n a l
I n s t i t u t e
o f
N e u r o l o g i c a l
D i s o r d e r s
a n d
S t r o k e ,
N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f
H e a l t h ,
B e t h e s d a ,
MD
2 0 8 9 2 ;
t S c c t i o n on M o l e c u l a r
N e u r o s c i e n c e ,
L a b o r a t o r y
o f
C e l l
B i o l o g y ,
N a t i o n a l
I n s t i t u t e
o f
M e n t a l
H e a l t h ,
N a t i o n a l I n s t i t u t e s
o f
H e a l t h ,
B e t h e s d a ,
MD 2 0 8 9 2
C o m m u n i i c a t e d
b y
B e r l n h a r d
W i t k o p ,
N a t i o n a l
I n s t i t u t t e s
o f
H e a l t h l ,
B e t h e s d a ,
MD,
D e c e m n b e r
2 9 ,
1 9 9 5
( r e c e i v e d f o r
r e v i e w
D e c e m b e r
1 0 ,
1 9 9 5 )
A B S T R AC T
I m m u n o h i s t o c h e m i c a l v i s u a l i z a t i o n o f
t h e
r a t v e s i c u l a r
a c e t y l c h o l i n e t r a n s p o r t e r
( V A C h T )
i n
c h o l i n -
e r g i c
neurons
a n d
n e r v e t e r m i n a l s h a s b e e n
c o m p a r e d
t o
t h a t
f o r c h o l i n e
a c e t y l t r a n s f e r a s e
( C h A T ) ,
h er e t o fo r e t he m o s t
s p e c i f i c
m a r k e r
f o r
c h o l i n e r g i c
neurons.
V A C h T - p o s i t i v e
c e l l
b o d i e s
were
v i s u a l i z e d i n c e r e b r a l
c o r t e x ,
b a s a l
f o r e b r a i n ,
m e d i a l
h a b e n u l a ,
s t r i a t u m ,
b r a i n
s t e m ,
a n d
s p i n a l
c o r d
b y
u s i n g
a
p o l y c l o n a l
a n t i - V A C h T a n t i s e r u m . VAChT-immuno-
r e a c t i v e f i b e r s a n d t e r m i n a l s were a l s o v i s u a l i z e d
i n
t h e s e
r e g i o n s
a n d i n
h i p p o c a m p u s ,
a t n e u r o m u s c u l a r
j u n c t i o n s
w i t h i n
s k e l e t a l
m u s c l e ,
a n d
i n
s y m p a t h e t i c
a n d
p a r a s y m p a -
t h e t i c
a u t o n o m i c
g a n g l i a
a n d
t a r g e t
t i s s u e s .
C h o l i n e r g i c
nerve
t e r m i n a l s
c o n t a i n m o r e VAChT
t h a n ChAT
i m m u n o r e a c t i v i t y
a f t e r
r o u t i n e
f i x a t i o n ,
c o n s i s t e n t
w i t h a
c o n c e n t r a t i o n
o f
VAChT w i th i n t er m i n a l n e u r o n a l a r b o r i z a t i o n s
i n
w h i c h
s e c r e t o r y
v e s i c l e s a r e c l u s t e r e d . T h e s e
i n c l u d e
V A C h T - p o s i t i v e
t e r m i n a l s
o f
t h e
m e d i a n e m i n e n c e
o f t h e
h y p o t h a l a m u s ,
n o t
o b s e r v e d
w i t h
ChAT a n t i s e r u m a f t e r
r o u t i n e
f i x a t i o n . S u b -
c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n
o f
VAChT i n
s p e c i f i c
o r g a n e l l e s
i n
n e u -
r o n a l
c e l l s
w as
e x a m i n e d
b y
i m m u n o e l e c t r o n
m i c r o s c o p y
i n
a
r a t n e u r o n a l c e l l
l i n e
( P C 1 2 - c 4 )
e x p r e s s i n g
VAChT
a s w e l l
a s
t h e e n d o c r i n e a n d n e u r o n a l
f o r m s
o f
t h e
v e s i c u l a r monoamine
t r a n s p o r t e r s
(VMAT1
a n d
V M A T 2 ) .
VAChT
i s
t a r g e t e d
t o
s m a l l
s y n a p t i c
v e s i c l e s ,
w h i l e
V M A T 1
i s f o u n d
m a i n l y b u t
n o t
e x c l u s i v e l y
o n
l a r g e
d e n s e - c o r e v e s i c l e s . V M A T 2 i s
f o u n d
on
l a r g e
d e n s e - c o r e
v e s i c l e s b u t n o t o n
t h e s m a l l
s y n a p t i c
v e s i c l e s
t h a t c o n t a i n VAChT i n P C 1 2 - c 4
c e l l s ,
d e s p i t e
t h e
p r e s e n c e
o f
V M A T 2
i m m u n o r e a c t i v i t y
i n c e n t r a l a n d
p e r i p h e r a l
n e r v e
t e r m i n a l s
known t o c o n t a i n
m o n o a m i n e s
i n
s m a l l
s y n a p t i c
v e s i c l e s .
T h u s ,
VAChT
a n d
V M A T 2
may
b e
s p e c i f i c
m a r k e r s
f o r
c h o l i n e r g i c
a n d
a d r e n e r g i c
s m a l l
s y n a p t i c
v e s i c l e s ,
w i t h t h e l a t t e r
n o t
e x p r e s s e d
i n
n o n s t i m u l a t e d
n e u r o n a l l y
d i f f e r e n t i a t e d
P C 1 2 - c 4
c e l l s .
M a r k e r s f o r
f u n c t i o n a l
p r e s y n a p t i c c h o l i n e r g i c
a n d
m o n o a m -
i n e r g i c
nerve t e r m i n a l s
p e r
s e w o u l d
b e u s e f u l
f o r t h e
s t u d y
o f
c h o l i n e r g i c
a n d
m o n o a m i n e r g i c s y n a p s e
f o r m a t i o n ,
l o s s o f
s y n a p s e s
i n
n e u r o d e g e n e r a t i v e
d i s e a s e s ,
a n d
n e u r o a n a t o m i c a l
d i s p o s i t i o n
o f
s y n a p s e s
t h r o u g h o u t
t h e c e n t r a l
a n d
p e r i p h e r a l
nervous
s y s t e m s .
A n t i b o d i e s
a g a i n s t
b i o s y n t h e t i c
e n z y m e s
f o r
a c e t y l c h o l i n e ( A C h )
a n d
m o n o a m i n e s h a v e
b e e n
u s e d
p r e v i -
o u s l y
f o r
t h i s
p u r p o s e .
H o w e v e r ,
t h e y
a r e
c y t o s o l i c p r o t e i n s
t h a t
a r e n o t
s p e c i f i c a l l y
c o n c e n t r a t e d
a t
nerve
t e r m i n a l s . T wo
i s o f o r m s o f t h e
v e s i c u l a r m o n o a m i n e
t r a n s p o r t e r (VMAT)
r e s p o n s i b l e
f o r v e s i c u l a r
u p t a k e
o f m o n o a m i n e s h a v e
b e e n
f u n c t i o n a l l y
c h a r a c t e r i z e d ,
a n d a n t i b o d i e s
a g a i n s t
r a t V M A T 1
a n d
VMAT2
h a v e
p r e v i o u s l y
b e e n
u s e d
t o
l o c a l i z e
t h e s e
T h e
p u b l i c a t i o n
c o s t s o f t h i s a r t i c l e w e re
d e f r a y e d
i n
p a r t
b y
p a g e
c h a r g e
p a y m e n t .
T h i s a r t i c l e must t h e r e f o r e b e
h e r e b y
m a r k e d
a d v e r t i s e m e n t
i n
a c c o r d a n c e w i t h 1 8 U . S . C .
1 7 3 4
s o l e l y
t o
i n d i c a t e
t h i s
f a c t .
3 5 4 7
t r a n s p o r t e r s
t o
n e u r o n a l a n d n e u r o e n d o c r i n e
b i o g e n i c
a m i n e -
c o n t a i n i n g
c e l l s a n d
i n
p a r t i c u l a r
t h e i r t e r m i n a l
p r o c e s s e s
( 1 - 6 ) .
W e h a v e
r e c e n t l y
c l o n e d a n d
s e q u e n c e d
t h e
r a t a n d human
h o m o l o g s
o f
a
p u t a t i v e
v e s i c u l a r
a c e t y l c h o l i n e
( A C h )
t r a n s -
p o r t e r
( V A C h T )
i n
C a e n o r h a b d i t i s
e l e g a n s
a n d
T o r p e d o ( 7 - 9 )
a n d
d e m o n s t r a t e d t h a t
t h e
r a t
V A C h T i s
a
f u n c t i o n a l t r a n s -
p o r t e r
f o r
ACh
8 ) .
V A C h T - e n c o d i n g
mRNA i s
p r e s e n t
i n a l l
k n o w n
m a j o r
c h o l i n e r g i c
c e l l
g r o u p s
o f
t h e c e n t r a l a n d
p e -
r i p h e r a l
nervous
s y s t e m s
8 ,
1 0 ,
1 1 ) .
H e r e ,
a n t i b o d i e s
s p e c i f i c
f o r
V A C h T were u s e d t o v i s u a l i z e
c h o l i n e r g i c
n e u r o n s ,
i n
p a r t i c u l a r
c h o l i n e r g i c
n e r v e t e r m i n a l s
i n
t h e c e n t r a l a n d
p e r i p h e r a l
nervous
s y s t e m s .
T h e
p u r p o s e
o f t h e s e i m m u n o -
h i s t o c h e m i c a l
i n v e s t i g a t i o n s
a t t h e
l i g h t
m i c r o s c o p i c
l e v e l was
t o
d e t e r m i n e
t h e
s u i t a b i l i t y
o f
t h e V A C h T
a n t i g e n
a s a m a r k e r
f o r
c h o l i n e r g i c
n e r v e
t e r m i n a l s ,
i n w h i c h
s e c r e t o r y
v e s i c l e s
p r e s u m a b l y
c o n t a i n i n g
V A C h T
a r e
s p e c i f i c a l l y
c o n c e n t r a t e d .
R e s u l t s
were
c o m p a r e d
w i t h t h o s e o b t a i n e d
b y
i m m u n o h i s t o -
c h e m i c a l
s t a i n i n g
f o r
c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e
( C h A T ) ,
a
c y t o s o l i c
p r o t e i n
f o r
w h i c h v i s u a l i z a t i o n
i n
nerve t e r m i n a l s h a s
b e e n
p r o b l e m a t i c
( 1 2 ) .
T h e
V A C h T
a n t i g e n
was
a l s o v i s u a l -
i z e d
b y
i m m u n o c y t o c h e m i c a l
e l e c t r o n
m i c r o s c o p y ( E M )
a t
t h e
u l t r a s t r u c t u r a l
l e v e l i n a
c e l l l i n e
e x p r e s s i n g
b o t h
V A C h T
a n d
V M A T 1 a n d VMAT2. T h e a i m
o f
i n v e s t i g a t i o n s
a t
t h e
u l t r a -
s t r u c t u r a l
l e v e l was t o
d e t e r m i n e
i f
t h e
t y p e
o f
s e c r e t o r y
v e s i c l e
t o w h i c h
V A C h T
i s
t a r g e t e d
i s
d i s t i n c t
f r o m t h e
s e c r e t o r y
v e s i c l e s
e x p r e s s i n g
t h e m o n o a m i n e
t r a n s p o r t e r s
i n
a
n e u r o n a l l y
d i f f e r e n t i a t e d c e l l l i n e
e x p r e s s i n g
a l l
t h r e e
t r a n s p o r t e r s .
M A T E R I A L S
AND
METHODS
G e n e r a t i o n
o f
A n t i - V A C h T
A n t i s e r a .
T h e
p e p t i d e
s e q u e n c e
C y s - G l u - A s p - A s p - T y r - A s n - T y r - T y r - S e r - A r g - S e r
( C E D D Y N -
YYSRS
i n
s i n g l e - l e t t e r
c o d e ) , c o r r e s p o n d i n g
t o t h e
C t e r m i n u s
o f r a t
V A C h T ,
was
c o n j u g a t e d t h r o u g h
t h e
N - t e r m i n a l
c y s -
t e i n e
t o
k e y h o l e l i m p e t
h e m o c y a n i n
( K L H )
a n d a n t i s e r a r a i s e d
i n
N e w Z e a l a n d W h i t e r a b b i t s a s d e s c r i b e d
f o r a n t i b o d i e s
g e n e r a t e d a g a i n s t
C - t e r m i n a l
p e p t i d e s
o f
r a t V M A T I a n d
VMAT2
5 ) .
S e r a
f r o m r a b b i t s i m m u n i z e d w i t h t h e
KLH-
CE D D Y N YY S R S
c o n j u g a t e
were
a s s a y e d
f o r
a n t i - V A C h T
i m m u n o r e a c t i v i t y
a n d
s p e c i f i c i t y b y
s t a i n i n g
o f C V - 1 c e l l s
e x p r e s s i n g
t h e
r a t
V AC h T
cDN A
8 ) ,
a s
d e s c r i b e d f o r
a n t i -
b o d i e s
a g a i n s t
r a t
VMAT1
a n d
VMAT2
5 ) . R e p r e s e n t a t i v e
A b b r e v i a t i o n s :
A C h ,
a c e t y l c h o l i n e ;
C h A T ,
c h o l i n e
a c e t y l t r a n s f e r a s e ;
E M ,
e l e c t r o n
m i c r o s c o p y ;
LDCV,
l a r g e
d e n s e - c o r e
v e s i c l e ;
N G F ,
n e r v e
g r o w t h
f a c t o r ;
P B S ,
p h o s p h a t e - b u f f e r e d
s a l i n e ;
S S V ,
s m a l l
s y n a p t i c
v e s i c l e ;
V A C h T ,
v e s i c u l a r
a c e t y l c h o l i n e t r a n s p o r t e r ;
V M A T ,
v e s i c u l a r
m o n o a m i n e
t r a n s p o r t e r ;
T H ,
t y r o s i n e
h y d r o x y l a s e .
T o
w h o m
r e p r i n t r e q u e s t s
s h o u l d b e
a d d r e s s e d a t : N a t i o n a l I n s t i t u t e
o f
M e n t a l
H e a l t h ,
B u i l d i n g
3 6 ,
R o o m
3 A - 1 7 , B e t h e s d a ,
MD 2 0 8 9 2 -
4 0 9 0 .
8/10/2019 pnas01515-0397
2/6
P r o c .
N a t l . A c a d . S c i .
USA
9 3
( 1 9 9 6 )
i m m u n o h i s t o c h e m i c a l
a n d
i m m u n o c y t o c h e m i c a l
EM
d a t a u s -
i n g
a n t i s e r u m
8 0 2 5 9
a r e
s h o w n
b e l o w .
G e n e r a t i o n o f
V M A T 2 - E x p r e s s i n g
PC12 C e l l
C l o n e P C 1 2 -
c 4 . PC12 c e l l s were i n f e c t e d
w i t h
r e c o m b i n a n t
v i r i o n s
p r o -
d u c e d
b y
t r a n s f e c t i o n
o f t h e P G - 1 3
p a c k a g i n g
c e l l
l i n e w i t h
t h e
p l a s m i d pLNCMAT,
w h i c h
c o n t a i n s
a
H i n d I I I - A c c
I
( b l u n t e d )
f r a g m e n t
o f
t h e
r a t VMAT2 cD N A
l i g a t e d
i n t o
t h e
v e c t o r
pLNCX ( 1 3 )
a f t e r
H i n d l I I / H p a
I
d o u b l e
d i g e s t i o n .
VMAT2
e x p r e s s i o n
i s
i n i t i a t e d
b y
a
c y t o m e g a l o v i r u s
p r o m o t e r . T h e
V M A T 2 - e x p r e s s i n g
c l o n e
P C 1 2 - c 4
w as o b t a i n e d v i a
l i m i t i n g
d i l u t i o n
c u l t u r e
i n
G418 m e d i u m .
C u l t u r e a n d
S t a i n i n g
o f
PC12
C e l l s . PC12 c e l l c l o n e PC12-G
was
c u l t u r e d
a n d
t r e a t e d
w i t h
n e r v e
g r o w t h
f a c t o r
( N G F )
a s
d e s c r i b e d
1 4 ) .
C e l l s were
g r o w n
i n f o u r -
o r
e i g h t - w e l l
p l a s t i c
c h a m b e r s l i d e s on
e i t h e r
a
M a t r i g e l
o r
p o l y ( L - l y s i n e )
m a t r i x
f o r
l i g h t m i c r o s c o p y ,
f i x e d i n
f o r m a l i n ,
a n d
p r o c e s s e d
f o r i m m u -
A
t -
.
*
,
M.
h
.t ,
-
. . .
s :
* *
.
..
n o h i s t o c h e m i s t r y
b y
u s i n g
t h e
r a b b i t
I g G
V e c t a s t a i n ABC
k i t
( V e c t o r L a b o r a t o r i e s ) .
P r e e m b e d d i n g I m m u n o c y t o c h e m i c a l
EM
f o r
V A C h T ,
V M A T 1 ,
a n d V M A T 2 i n
PC12 a n d P C 1 2 - c 4
C e l l s . C e l l s were
g r o w n
on
M a t r i g e l
w i t h NGF
t r e a t m e n t f o r 1 4
d a y s ,
f i x e d i n
4
f o r m a l d e h y d e
( E M g r a d e )
f o r
1
h r a t r o o m
t e m p e r a t u r e ,
w a s h e d
e x t e n s i v e l y ,
a n d s t a i n e d
f o r
V A C h T ,
VMAT1,
o r
VMAT2 i n
s a p o n i n / p h o s p h a t e - b u f f e r e d
s a l i n e
P B S )
a t
a n t i -
b o d y
d i l u t i o n s
f r o m
1 : 5 0 0
t o
1 : 1 0 0 0 .
VMAT1 a n d
VMAT2
a n t i b o d i e s u s e d were
t h o s e d e sc r i b e d
p r e v i o u s l y
5 ) .
C e l l s were
t h e n w a s h e d
a n d
i n c u b a t e d
w i t h a
s e c o n d a r y a n t i b o d y c o n j u -
g a t e d
w i t h a
1 . 4 - n m
g o l d
p r o b e ( N a n o p r o b e , S t o n y
B r o o k ,
N Y )
f o l l o w e d
b y
s i l v e r e n h a n c e m e n t
1 5 ) .
I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y
f o r
V A C h T , VMAT2,
C h A T ,
a n d
t y r o s i n e h y d r o x y l a s e
( T H )
was
c a r r i e d o u t
e s s e n t i a l l y
a s d e s c r i b e d
f o r VMAT1 a n d V M A T 2
VAChT
/
/
/
D
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ChAT
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V D B
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C o m p a r a t i v e
d i s t r i b u t i o n
o f
V A C h T ,
C h A T ,
a n d
V M A T 2
i m m u n o r e a c t i v i t y
i n
t h e
r a t
f o r e b r a i n .
( A - C )
A d j a c e n t
c o r o n a l s e c t i o n s
o f
r a t b r a i n
a t
t h e l e v e l
o f
t h e
s t r i a t u m
a n d b a s a l
f o r e b r a i n
s t a i n e d
f o r V ACh T
( A ) ,
ChAT
( B ) ,
a n d VMAT2
( C ) .
V ACh T
i m m u n o r e a c t i v e
n e u r o n s
a n d
f i b e r s
i n
t h e i s l a n d s
o f
C a l l e j a
a r e
m a r k e d
b y
a s t e r i s k s
i n
A .
( A - C
a r e
a t
i d e n t i c a l
m a g n i f i c a t i o n .
( B a r
i n
A
1 0 0 0
J i m . )
( D
a n d
E )
V A C h T - i m m u n o r e a c t i v e
c e l l b o d i e s a n d
nerve
f i b e r s a n d t e r m i n a l s i n
p a r i e t a l
c o r t e x
( D )
a n d
c a u d a t e
n u c l e u s
( E ) .
D
a n d
E
a r e
a t i d e n t i c a l
m a g n i f i c a t i o n .
( B a r
i n D
5 0
A i m . )
( F )
V A C h T
i m m u n o r e a c t i v e
t e r m i n a l
f i b e r s
s u r r o u n d i n g
p y r a m i d a l p e r i k a r y a
i n
t h e
CA 3
r e g i o n
o f t h e
h i p p o c a m p a l
f o r m a t i o n
a t
medium
m a g n i f i c a t i o n .
VDB
a n d
H D B ,
v e r t i c a l a n d
h o r i z o n t a l
l i m b o f
t h e
d i a g o n a l
b a n d
o f
B r o c a ; C P u ,
c a u d a t e - p u t a m e n .
3 5 4 8
N u o i lg: W i e e
l
* '
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T
1.
8/10/2019 pnas01515-0397
3/6
N e u r o b i o l o g y :
W e i h e
e t a l .
VAC
h T
A
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V M A T
2
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.. *
.
.. .
.
. .
B
F I G .
2 . V ACh T a n d VMAT2
i m m u n o r e a c t i v i t y
i n
t h e m e d i a n
e m i n e n c e .
( A ) S t r o n g
V ACh T
i m m u n o r e a c t i v i t y
i s
c o n c e n t r a t e d
i n
t h e
e x t e r n a l
l a y e r
o f t h e m e d i a n
e m i n e n c e
b u t
a l s o
i s
p r e s e n t
i n
t h e
i n t e r n a l
l a y e r . ( B )
VMAT2
i m m u n o r e a c t i v i t y
i n
t h e i n f u n d i b u l a r
d o p a m i n e r g i c
T H - p o s i t i v e
neurons
t h a t
p r o j e c t
t o
t h e
m e d i a n
e m i n e n c e .
( B a r
1 0 0
/ i m . )
i n
r a t t i s s u e s
p r e p a r e d
i n
B o u i n - H o l l a n d e f i x a t i v e
5 ) .
A n t i -
b o d y
d i l u t i o n s
were
1 : 2 0 0 0 t o 1 : 3 0 0 0 f o r
a n t i - V A C h T
a n d
1 : 2 0 0 0
f o r a n t i - V M A T 2 .
A n t i b o d i e s
a g a i n s t
ChAT a n d
TH
were
u s e d a t
t h e d i l u t i o n s
r e p o r t e d p r e v i o u s l y ( 1 6 ,
1 7 ) .
P r o c . N a t l .
A c a d .
S c i .
USA 9 3
( 1 9 9 6 )
3 5 4 9
R E SUL T S
T h e
s p e c i f i c i t y
o f r a t a n t i - V A C h T a n t i b o d i e s
was
e s t a b l i s h e d
b y s t a i n i n g
o f C V - 1 c e l l s
o n l y
i f
e x p r e s s i n g
e x o g e n o u s
recom-
b i n a n t V A C h T a n d
b y s t a i n i n g
o f
e n d o g e n o u s
VAChT-
e x p r e s s i n g
PC12 c e l l s .
T h e
s p e c i f i c s t a i n i n g
o f
PC12 c e l l s was
a d s o r b e d
b y
p r e i n c u b a t i o n
o f
a n t i b o d y
w i t h
t h e
p e p t i d e
i m -
munogen
a g a i n s t
w h i c h t h e a n t i s e r u m was
r a i s e d a t
a
concen-
t r a t i o n
o f 1 0
, u M
( d a t a
n o t
s h o w n ) .
A l l VAChT
s t a i n i n g
s h o w n
i n
F i g s .
1 - 4
was
l i k e w i s e
a b s e n t
f r o m
i n c u b a t i o n s
p e r f o r m e d
w i t h
a n t i s e r u m
p r e i n c u b a t e d
w i t h 1 0 , u M o f
t h e
p e p t i d e
i m m u n o g e n .
I m m u n o h i s t o c h e m i c a l v i s u a l i z a t i o n o f
V A C h T
i n
c h o l i n -
e r g i c
n e u r o n a l
c e l l
b o d i e s , f i b e r s ,
a n d t e r m i n a l s
o f
r a t b r a i n i s
s h o w n
i n
F i g .
1 .
S t a i n i n g
f o r
e i t h e r V A C h T
o r
ChA T r e v e a l e d
s i m i l a r
n u m b e r s o f
i m m u n o r e a c t i v e
c e l l b o d i e s i n
b a s a l
f o r e -
b r a i n
a n d
s t r i a t u m
( F i g .
1 A a n d
B ) .
H o w e v e r ,
V A C h T
s t a i n i n g
o f n e u r o n a l
p r o c e s s e s
was
much
m o r e
i n t e n s e
t h a n t h a t
f o r
ChAT
( F i g .
1
A
a n d
B ) .
V A C h T
s t a i n i n g
d e m o n s t r a t e d
i n t r i n s i c
c h o l i n e r g i c
n e r v e
t e r m i n a l s
t h r o u g h o u t
t h e
s t r i a t u m ,
r o u g h l y
c o e x t e n s i v e
i n
t h e
c a u d a t e
n u c l e u s
w i t h
t h e
d i s t r i b u -
t i o n o f e x t r i n s i c
d o p a m i n e r g i c
i n n e r v a t i o n d e m o n s t r a t e d
w i t h
VMAT2
( F i g .
1 C ) .
H i g h - p o w e r
m i c r o g r a p h s
o f V A C h T i m -
m u n o r e a c t i v i t y
i n
c e r e b r a l c o r t e x
a n d
s t r i a t u m d e m o n s t r a t e
t h e
p r e s e n c e
o f
r e l a t i v e l y
w e a k
V A C h T
i m m u n o r e a c t i v i t y
i n
s m a l l c o r t i c a l
neu r ons
( F i g .
1 D ,
a r r o w s )
a n d
s t r o n g
V A C h T
i m m u n o r e a c t i v i t y
i n
t h e
c h o l i n e r g i c
i n te r ne u r o n s o f t h e
c a u -
d a t e
n u c l e u s
( F i g . 1 E ) .
V i s u a l i z a t i o n o f
VAChT-immunore-
a c t i v e c e l l b o d i e s
i n
c e r e b r a l c o r t e x i s
c o n s i s t e n t
w i t h
p r e v i o u s
r e p o r t s
o f
s p a r s e
i n t r i n s i c
c h o l i n e r g i c
i n n e r v a t i o n
o f
t h e c o r t e x
i n a d d i t i o n
t o t h e e x t r i n s i c c o r t i c a l
c h o l i n e r g i c
i n n e r v a t i o n
a r i s i n g
f r o m t h e b a s a l
f o r e b r a i n . N o t e t h e d e n s e
c h o l i n e r g i c
t e r m i n a l
n e t s
i n
t h e
d e e p l a y e r s
o f
p a r i e t a l
c e r e b r a l
c o r t e x
a n d
i n t h e
c a u d a t e n u c l e u s
F i g s .
1 D a n d
E ) .
I n
t h e
h i p p o c a m p u s ,
s t r o n g
V A C h T
i m m u n o r e a c t i v i t y
i n
nerve t e r m i n a l s a s
w e l l
a s
f i b e r s a l l o w e d a
c l e a r d e l i n e a t i o n o f
c h o l i n e r g i c
nerve t e r m i n a l
i n v e s t i t u r e
o f
p y r a m i d a l
c e l l b o d i e s
i n
t h e
CA 3
r e g i o n
F i g .
1 F ) . V A C h T - p o s i t i v e
c e l l b o d i e s were a l s o
i d e n t i f i e d
i n
n u c l e i
o f
t h e
c h o l i n e r g i c
a s c e n d i n g
r e t i c u l a r
a c t i v a t i n g
s y s t e m a n d
i n
t h e
m ed i a l h a b e n u l a r
n u c l e u s ,
i n
w h i c h V A C h T
mRNA
was
p r e v i o u s l y
d e t e c t e d
b y
i n s i t u
h y b r i d i z a t i o n
h i s t o c h e m i s t r y 1 1 ) .
D i f f e r e n t i a l v i s u a l i z a t i o n o f
c h o l i n e r g i c
t e r m i n a l s
b y
V A C h T
a n d ChAT
i m m u n o r e a c t i v i t y
was m o s t d r a m a t i c
i n
t h e
m e d i a n e m i n e n c e . I n t e n s e V A C h T
i m m u n o r e a c t i v i t y
i n
m e -
d i a n
e m i n e n c e
F i g .
2 A )
i s
a c c o m p a n i e d b y o n l y
w e a k
s t a i n i n g
f o r ChAT
( n o t
s h o w n ) .
T h e
p r e s e n c e
o f V A C h T i m m u n o r e -
V A C h T
r
.
; :
.
t
~~ ,
1.
V
, i t .
8/10/2019 pnas01515-0397
4/6
P r o c .
N a t l .
A c a d . S c i . USA 9 3
( 1 9 9 6 )
a c t i v i t y
i n
t h e
m e d i a n e m i n e n c e
s u g g e s t s
a
c o p i o u s
c h o l i n e r g i c
i n n e r v a t i o n
o f t h i s
i m p o r t a n t
n e u r o e n d o c r i n e n e x u s . VMAT2
s t a i n i n g
o f t er m i n a l
a r b o r i z a t i o n s
o f
t h e
d o p a m i n e r g i c
t u -
b e r o i n f u n d i b u l a r
s y s t e m
i s s h o w n f o r
r e f e r e n c e i n
F i g .
2 B .
VMAT2
s t a i n i n g
o f
m o n o a m i n e r g i c
n e r v e
t e r m i n a l s
o f t h e
m e d i a n e m i n e n c e
was much
m o r e
i n t e n s e t h a n
s t a i n i n g
f o r
t h e
c y t o s o l i c
b i o s y n t h e t i c e n z y m e
TH
( n o t
s h o w n ) ,
s i m i l a r t o
t h e
r e l a t i o n s h i p
b e t w e e n
V A C h T
a n d ChA T
i m m u n o r e a c t i v i t y
i n
t h e m e d i a n e m i n en c e a n d i n
nerve
t e r m i n a l s
t h r o u g h o u t
t h e
c e n t r a l
a n d
p e r i p h e r a l
nervous
s y s t e m s .
M o t o r
neurons o f t h e
s p i n a l
c o r d s h o w e d
i n t e n s e V A C h T
i m m u n o r e a c t i v i t y
i n
c e l l b o d i e s
a n d
nu mer ou s
VAChT-
p o s i t i v e
n e r v e
t e r m i n a l s n e a r
t h e V A C h T - i m m u n o r e a c t i v e
motor
neurons
( F i g .
3 A ) .
W h e t h e r t h e s e a r e c o l l a t e r a l o r
a u t o s y n a p s e s
o r
d e r i v e
f r o m
nonmotoneuron
c h o l i n e r g i c
a f -
f e r e n t s t o t h e v e n t r a l h o r n i s
n o t
k n o w n . T h e s e t e r m i n a l s were
n o t
v i s u a l i z e d w i t h
a n t i - C h A T ,
a l t h o u g h
m o t o r neuron c e l l
b o d i e s were
( F i g . 3 B ) .
V A C h T
i m m u n o r e a c t i v i t y
i s a l s o c o n -
c e n t r a t e d
a t
m o t o r e n d
p l a t e s
i n s k e l e t a l m u s c l e r e l a t i v e
t o
ChAT
( F i g .
3 C ) .
S t a i n i n g
f o r V A C h T a l l o w s v i s u a l i z a t i o n o f
t h e
p r e s y n a p t i c
p o r t i o n
o f t h e n e u r o m u s c u l a r
j u n c t i o n
i n
s k e l e t a l
m u s c l e i n w h i c h ChAT
i m m u n o r e a c t i v i t y
i s w e a k
o r
a b s e n t ,
w h i l e ChAT
s t a i n s m o t o r neuron
f i b e r s
e n t e r i n g
mus-
c l e i n
w h i c h
V A C h T
i m m u n o r e a c t i v i t y
i s w e a k
( F i g .
3 D ) .
T h u s ,
t h e
c o m p l e m e n t a r y
v i s u a l i z a t i o n
o f
nerve f i b e r s a n d nerve
t e r m i n a l s
b y
ChAT a n d
V A C h T
o b s e r v e d
i n
c h o l i n e r g i c
i n t r i n s i c a n d
p r o j e c t i o n
neurons o f t h e
c e n t r a l
nervous
s y s t e m
i s
f o u n d i n
c h o l i n e r g i c
m o t o n e u r o n s a s
w e l l .
T h e
r e l a t i o n s h i p
b e t w e e n
V AC h T
a n d ChAT i m m u n o r e a c -
t i v i t y
i n
c h o l i n e r g i c
neurons w i t h i n
t h e a u t o n o m i c nervous
s y s t e m
i s
s h o w n
i n
F i g .
4 .
P r i n c i p a l g a n g l i o n
c e l l s
i n
t h e
s u p e r i o r
c e r v i c a l
g a n g l i o n
a r e i n v e s t e d w i t h
V A C h T - p o s i t i v e
p r e g a n g l i o n i c
c h o l i n e r g i c
n e r v e t e r m i n a l s
F i g .
4 A ) .
W h i l e
m u l t i p l e
V A C h T - i m m u n o r e a c t i v e
n e r v e
t e r m i n a l s
a r e
f o u n d
on
c e l l
b o d i e s
i n
t h e
s u p e r i o r
c e r v i c a l
g a n g l i o n ,
ChAT
i m m u -
n o r e a c t i v i t y
i s
r e l a t i v e l y s t r o n g e r
i n
i n c o m i n g
p r e g a n g l i o n i c
c h o l i n e r g i c
f i b e r s t h a n i n
t h e i r
t e r m i n a l s on
p r i n c i p a l
g a n g l i o n
c e l l s
F i g .
4 B ) .
O c c a s i o n a l
V A C h T - p o s i t i v e
p o s t g a n g l i o n i c
c e l l
b o d i e s
a r e f o u n d
i n
s u p e r i o r
c e r v i c a l
g a n g l i o n
o f
t h e r a t
( a r r o w
i n
F i g . 4 A ) ,
i n a d d i t i o n
t o t h e
m a i n l y V M A T 2 - p o s i t i v e p r i n -
c i p a l
g a n g l i o n
c e l l s
F i g .
4 C ) .
T h e s e
V A C h T - i m m u n o r e a c t i v e
c e l l s
m a y
r e p r e s e n t
s p a r s e
c h o l i n e r g i c
p r o j e c t i o n s
t o s w e a t
g l a n d s ,
s k e l e t a l
m u s c l e
v a s c u l a t u r e ,
o r
o t h e r a s
y e t
u n c h a r a c -
t e r i z e d
c h o l i n e r g i c
t a r g e t s .
I n d e e d ,
c h o l i n e r g i c
nerve t e r m i n a l s
i n n e r v a t i n g
s w e a t
g l a n d s
o f
t h e
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s e c r e t o r y
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( B )
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c o n c e n t r a t e d
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t e r m i n a l
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s y m p a t h e t i c
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s y m p a -
t h e t i c n e u r o n s .
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p r e s u m p t i v e s y m p a t h e t i c
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s p e c i f i c i t y
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d e m o n s t r a t e d
b y
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g r a i n s
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b a c k g r o u n d
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t h e
p a r e n t
PC12
c e l l
l i n e .
T h u s ,
VMAT2
i s d i r e c t e d t o
LDCVs
p r e s e n t
i n
PC12
c e l l s ,
i n
p r e f e r e n c e
t o
S S V s ,
i n d i c a t i n g
t h a t
N G F - d i f f e r e n t i a t e d
PC12
c e l l s
c o n t a i n i n g
c h o l i n e r g i c
S S V s d o
n o t ,
a t l e a s t
u n d e r
b a s a l
c o n d i t i o n s ,
h a v e t h e
c a p a b i l i t y
t o
p r o d u c e
a d r e n e r g i c
S S V s .
DISCUSSION
A n t i b o d i e s
a g a i n s t
V A C h T
h a v e
b e e n
u s e d
h e r e f o r t h e f i r s t
t i m e t o v i s u a l i z e
c h o l i n e r g i c
s y n a p s e s
i n t h e
c e n t r a l
a n d
p e r i p h e r a l
nervous
s y s t e m s . S p e c i f i c
v i s u a l i z a t i o n o f
c h o l i n -
e r g i c
n e r v e t e r m i n a l s i n v i v o
h a s
p r e v i o u s l y
b e e n
a c c o m p l i s h e d
w i t h
a n t i b o d i e s
a g a i n s t
ChAT
1 2 ) .
V A C h T
a n d
ChAT
g e n e
e x p r e s s i o n a p p e a r s
t o
b e
t i g h t l y
l i n k e d i n
m a m m a l i a n
n e u r o n s ,
w i t h b o t h
t r a n s c r i p t s
p r o d u c e d
f r o m a
c o m m o n
c h o l i n e r g i c
o p e r o n
1 9 ) .
V A C h T i s
l o c a l i z e d h e r e
b y
i m m u n o h i s t o c h e m -
i s t r y
t o
a l l
k n o w n
m a j o r
c e n t r a l a n d
p e r i p h e r a l
c h o l i n e r g i c
s y s t e m s
i d e n t i f i e d
p r e v i o u s l y
w i t h
a n t i b o d i e s
d i r e c t e d t o ChAT
( 1 2 ,
1 8 ,
2 0 - 2 2 ) .
H o w e v e r ,
ChAT
i m m u n o r e a c t i v i t y
i s
m o r e
p r o m i n e n t
i n
c h o l i n e r g i c
n e r v e f i b e r s
a n d c e l l
b o d i e s ,
w h i l e
V A C h T
i m m u n o r e a c t i v i t y
i s
m o s t
p r o m i n e n t
i n
nerve
t e r m i -
n a l s ,
c o n s i s t e n t
w i t h t h e
c y t o s o l i c
l o c a l i z a t i o n o f ChA T
a n d t h e
c l u s t e r i n g
o f
V A C h T - c o n t a i n i n g
s y n a p t i c
v e s i c l e s a t
t h e
n e r v e
t e r m i n a l .
T h u s ,
V A C h T
i m m u n o r e a c t i v i t y
c l e a r l y
d e l i n e a t e s
e x t e n s i v e i n v e s t m e n t
o f
h i p p o c a m p a l ,
s p i n a l
motor
n e u r o n a l ,
s y m p a t h e t i c p r i n c i p a l
g a n g l i o n i c
c e l l
b o d i e s ,
a n d e c c r i n e s w e a t
g l a n d s b y
c h o l i n e r g i c
n e r v e
t e r m i n a l s .
V A C h T
a n d
ChAT a r e
o v e r l a p p i n g
b u t
c o m p l e m e n t a r y
m a r k e r s f o r
c h o l i n e r g i c
n e u r o n s .
I n t e n s e
V A C h T
i m m u n o r e a c t i v i t y
i n
t h e m e d i a n
e m i n e n c e
o f
t h e
h y p o t h a l a m u s
s u g g e s t s
a
n e u r o a n a t o m i c a l
s u b s t r a t e
f o r
c h o l i n e r g i c
m o d u l a t i o n o f
n e u r o e n d o c r i n e
f u n c t i o n . T h e
c e l l
b o d i e s
o f
o r i g i n
o f t h i s
c h o l i n e r g i c
i n n e r v a t i o n o f
t h e
m e d i a n
e m i n e n c e a r e
u n k n o w n .
T e r m i n a l
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c h o l i n e r g i c
motor
neurons i n s k e l e t a l
m u s c l e ,
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i n t r i n s i c
c h o l i n e r g i c
i n n e r v a t i o n
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a u t o n o m i c
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w i t h
a n t i b o d i e s
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a n t i g e n
i n
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w i t h a n t i b o d i e s
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p r e f e r e n t i a l l y
v i s u a l i z e d i n
t e r m i n a l f i e l d s
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m o n o a m i n e r g i c
n e u r o n s ,
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m u n o g o l d p a r t i c l e s )
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mem-
b r a n e s o f
S S V s w i t h
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o c c a s i o n a l
s t a i n i n g
o f LDCVs.
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m u n o r e a c t i v i t y
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t h e s a m e d i l u t i o n
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( 1 : 5 0 0 )
b u t a f t e r
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p r e d o m i n a n t l y
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S S V s
p r e s e n t
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( 1 9 9 6 )
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s y n a p t i c
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n e u r o d e g e n e r a t i v e
d i s e a s e t h a n
p r e v i o u s l y
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b y
i m m u n o h i s t o c h e m i c a l v i s u a l i z a t i o n o f
c y t o s o l i c
b i o s y n t h e t i c e n z y m e s .
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c h o l i n e r g i c
nerve t e r m i n a l s i n
r o u t i n e l y
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t i s s u e s w i t h a n t i b o d i e s
r a i s e d
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human
V A C h T
s u g g e s t s
t h a t t h e s e w i l l b e u s e f u l
r e a g e n t s
f o r a s s e s s m e n t o f
s y n a p t i c
c h a n g e s
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human d i s e a s e s
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w h i c h
c h o l i n e r g i c
n e u r o n a l
s y s t e m s
u n d e r g o n e u r o d e g e n e r a t i o n
( 2 3 ) .
T h e
c h a r a c t e r i z a t i o n
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V A C h T
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neuron-
s p e c i f i c a n t i g e n s
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t h e
s u b c e l l u l a r
l o c a l i z a t i o n
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b i o g e n e s i s
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m o n o -
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v e s i c l e s t o b e
a d d r e s s e d . P C 1 2
c e l l s
t r e a t e d
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m o r p h o l o g i c a l
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c h a r a c t e r i s -
t i c s o f
b o t h
c h o l i n e r g i c
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( 2 4 , 2 5 ) . T h e y
p o s s e s s
b o t h
LDCV
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( 1 5 ) .
P r e f e r e n t i a l
t a r -
g e t i n g
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b o t h
V AC h T
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V M A T s t o i n d i v i d u a l v e s i c l e
t y p e s
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b e
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t h e s e c e l l s .
V A C h T a n d
V M A T 1
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d i f f e r e n t i a l l y
d i s t r i b u t e d t o
v e s i c u l a r
s u b p o p u l a t i o n s
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PC12 c e l l s b u t i s a l s o c o n t a i n e d
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S S V s ,
c o n s i s t e n t
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s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n
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LDCVs a n d t o
s o m e e x t e n t t o
m o r e
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v e s i c l e
f r a c t i o n s
i n
u n d i f f e r e n t i a t e d
P C 1 2 c e l l s
( 2 6 ) .
I n
c o n -
t r a s t ,
V A C h T
i s
h i g h l y
p r e f e r e n t i a l l y
l o c a l i z e d
t o
S S V s .
T h i s i s
c o n s i s t e n t
w i t h
t h e
p r e f e r e n t i a l u p t a k e
o f ACh
b y
s u b c e l l u l a r
f r a c t i o n s o f u n d i f f e r e n t i a t e d P C 1 2 c e l l s
c o n t a i n i n g s y n a p t i c -
l i k e
m i c r o v e s i c l e s
( 2 7 ) .
D i s t r i b u t i o n o f V A C h T
t o S S V s
a n d
n o t
LDCVs
i n
PC12 c e l l s
s u g g e s t s
t h a t
V A C h T i s a l s o
a b s e n t
f r o m
LDCVs i n
c h o l i n e r g i c
neurons i n
v i v o ,
a l b e i t
t h i s r e m a i n s
t o b e
d o c u m e n t e d
u l t r a s t r u c t u r a l l y .
T h e a b s e n c e o f ACh
u p t a k e
i n t o
LDCVs
even
i n
c h o l i n e r g i c
neurons
may
a c c o u n t
f o r t h e
d i f f e r e n t i a l r e l e a s e o f ACh a n d
v a s o a c t i v e
i n t e s t i n a l
p o l y p e p t i d e ;
m u t u a l l y e x c l u s i v e l y
s t o r e d
i n
S S V s a n d
L D C V s ,
r e s p e c t i v e l y ,
f r o m
c h o l i n e r g i c
n e u r o n s i n
v i v o
2 8 ) .
I t
i s
o f
s o m e i n t e r e s t
t h a t
P C I
2
c e l l s d i f f e r e n t i a t e d
w i t h N G F
d o
n o t
e x p r e s s
VMAT2,
s i n c e
t h e l a t t e r i s t h e
o n l y
VMAT
i s o f o r m
e x p r e s s e d
i n
neurons i n v i v o
5 ) .
VMAT2 i s
e x p r e s s e d
b o t h
c e n t r a l l y
a n d
p e r i p h e r a l l y
i n m o n o a m i n e r g i c
neurons
w h o s e n e r v e t e r m i n a l s
c o n t a i n
m a i n l y
S S V s a b o u t
5 0
nm i n
d i a m e t e r t h a t i n
t h e
a b s e n c e
o f
p r e t r e a t m e n t
w i t h
p e r m a n g a -
n a t e o r c h r o m a t e
s a l t s
a p p e a r
t o
b e
e l e c t r o n l u c e n t
r e f .
2 9 a n d
r e f e r e n c e s
t h e r e i n ) .
VMAT2
h a s
b e e n
l o c a l i z e d
b y
i m m u n o -
c y t o c h e m i c a l
EM t o b o t h
LDCVs
a n d
S S V s
i n
t h e
sa m e
c a t e c h o l a m i n e r g i c
c e l l s o f t h e
n u c l e u s t r a c t u s s o l i t a r i u s
o f t h e
b r a i n
s t e m
3 0 ) .
I t
h a s
b e e n
s u g g e s t e d
t h a t
S S V s o f
c h o l i n e r g i c
neurons
a r e
g e n e r a t e d
f r o m
c o n s t i t u t i v e
v e s i c l e s a f t e r
a c q u i -
s i t i o n o f
a n t i g e n s
f r o m
t h e
e a r l y
e n d o s o m e o f t h e n e r v e
t e r m i n a l
3 1 ) . C o n t r o v e r s y
e x i s t s o v e r
w h e t h e r
m o n o a m i n e r g i c
S S V s
a r e
d e r i v e d
f r o m
c o n s t i t u t i v e v e s i c l e s
o r
f r o m
L D C V s ,
s i n c e
t h e y
p o s s e s s a n t i g e n s
t h a t
a r e
c o n t a i n e d i n b o t h
l a r g e
a n d
s m a l l
v e s i c l e s b u t
n o t
c o m m o n t o b o t h
3 2 ) .
I f
s m a l l
a d r e n e r g i c
v e s i c l e s
c o n t a i n i n g
VMAT2
a r e
d e r i v e d
f r o m
t h e same
o r g a n e l l o g e n i c p a t h w a y
a s
c h o l i n e r g i c
S S V s
c o n t a i n i n g
V A C h T ,
t h e n
e x p r e s s i o n
o f VMAT2
i n
VAChT-
c o n t a i n i n g
neurons
s h o u l d r e s u l t i n
l o c a l i z a t i o n o f
V M A T 2
t o
V A C h T - p o s i t i v e
v e s i c l e s .
S u r p r i s i n g l y ,
VMAT2 i s
e x p r e s s e d
on
LDCVs
a n d
n o t on
S S V s i n N G F - t r e a t e d P C 1 2 - c 4
c e l l s .
T h i s
o b s e r v a t i o n
s t r o n g l y s u g g e s t s
t h a t
c h o l i n e r g i c
a n d
m o n o -
a m i n e r g i c
S S V s d i f f e r
n o t
o n l y
i n
t h e
t r a n s p o r t e r
e x p r e s s e d
i n
c h o l i n e r g i c
a n d
m o n o a m i n e r g i c
neurons b u t
a l s o
i n mor e
f u n d a m e n t a l
w a y s .
T h e
l a c k o f
m o n o a m i n e r g i c
S S V s
i n
P C 1 2 - c 4
c e l l s c o u l d b e
e x p l a i n e d
b y
t h e a b s e n c e
f r o m P C 1 2
c e l l s
o f
a d d i t i o n a l
p r o t e i n s
o r
f a c t o r s ,
p r e s e n t
i n
a d r e n e r g i c
neurons
i n
v i v o ,
w h i c h
a l l o w
VMAT2 t o r e a c h
t h e SSV
c o m p a r t m e n t
o r a l l o w
t h e
b i o g e n e s i s
o f
a
s p e c i f i c
s u b p o p u l a -
t i o n
o f
a d r e n e r g i c
S S V s .
A l t e r n a t i v e l y ,
i f
m o n o a m i n e r g i c
S S V s
a r e
p r o d u c e d
f r o m
LDCVs
o n l y
a f t e r f u s i o n o f
t h e
l a t t e r
w i t h t h e
p l a s m a
m e m b r a n e ,
s t i m u l a t i o n
o f LDCV
e x o c y t o s i s ,
r e g u l a t e d b y
c e l l
d e p o l a r i z a t i o n ,
may
b e
r e q u i r e d
f o r c o n v e r -
s i o n o f
LDCVs
t o
s m a l l
m o n o a m i n e r g i c
v e s i c l e s
i n
PC12 c e l l s .
I n
a n y
e v e n t ,
i n P C 1 2 c e l l s
a t
l e a s t ,
p r o d u c t i o n
o f
c h o l i n e r g i c
a n d
m o n o a m i n e r g i c
S S V s
a p p a r e n t l y
d o e s n o t
occur
b y
a
common
b i o s y n t h e t i c
p a t h w a y .
C h o l i n e r g i c
a n d
a d r e n e r g i c
S S V s
may r e p r e s e n t
u n i q u e
o r g a n e l l e s g e n e r a t e d b y
two
q u i t e
d i s t i n c t
p a t h w a y s
i n n e u r o n a l c e l l s .
W e
t h a n k t h e
V o l k s w a g e n
S t i f t u n g ,
t h e German
R e s e a r c h
F o u n -
d a t i o n ,
a n d
t h e
N a t i o n a l
I n s t i t u t e
o f
M e n t a l H ea l t h I n t r a m u r a l
R e s e a r c h
P r o g r a m
f o r t h e
s u p p o r t
o f
t h i s
w o r k ;
H .
P r e i b s c h ,
S .
R o s c h e r ,
S .
R o d e n b e r g e r ,
C .
B r e t t ,
a n d P .
L a t t e r m a n n f o r
p r e p a r a t i o n
o f t i s s u e s
a n d
i m m u n o h i s t o c h e m i c a l
s t a i n i n g ;
V i r g i n i a
T a n n e r
f o r
c a r r y i n g
o u t
i m m u n o c y t o c h e m i c a l
E M ;
H . S c h n e i d e r
f o r
p h o t o d o c u -
m e n t a t i o n ;
D r .
H .
S c h e m a n n f o r
p r o v i d i n g
t h e
ChAT
a n t i s e r u m ;
a n d
D r .
R .
P r u s s f o r a c r i t i c a l
r e a d i n g
o f t h e
m a n u s c r i p t .
1 .
E r i c k s o n ,
J .
D . ,
E i d e n ,
L . E .
&
H o f f m a n ,
B .
( 1 9 9 2 )
P r o c .
N a t l .
A c a d . S c i .
USA
8 9 ,
1 0 9 9 3 - 1 0 9 9 7 .
2 .
L i u , Y . ,
P e t e r ,
D . ,
R o g h a n i ,
A . , S c h u l d i n e r ,
S . ,
P r i v c ,
G .
G . ,
E i s e n b e r g ,
D . ,
B r e c h a ,
N .
E d w a r d s ,
R . H .
( 1 9 9 2 )
C e l l
7 0 ,
5 3 9 - 5 5 1 .
3 .
E r i c k s o n ,
J .
D .
E i d e n ,
L . E .
( 1 9 9 3 )
J .
N e u r o c h e m .
6 1 ,
2 3 1 4 - 2 3 1 7 .
4 .
P e t e r ,
D . , J i m e n e z ,
J . , L i u , Y . , K i m ,
J .
E d w a r d s ,
R . H .
( 1 9 9 4 ) . L .
B i o l .
C h e m .
2 6 9 ,
7 2 3 1 - 7 2 3 7 .
5 .
W e i h e , E . , S c h a f e r ,
M .
K . - H . , E r i c k s o n ,
J .
D .
E i d e n ,
L . E .
( 1 9 9 4 ) J .
M o l .
N e u r o s c i .
5 ,
1 4 9 - 1 6 4 .
6 .
P e t e r , D . ,
L i u ,
Y . ,
S t e r n i n i ,
C . ,
d e
G i o r g i o ,
R . ,
B r e c h a ,
N .
E d w a r d s ,
R .
H .
( 1 9 9 5 )
J . N e u r o s c i .
1 5 ,
6 1 7 9 - 6 1 8 8 .
7 .
A l f o n s o , A . ,
G r u n d a h l ,
K . ,
D u e r r ,
J .
S . ,
H a n ,
H . - P .
&
R a n d ,
J .
B .
( 1 9 9 3 )
S c i e n c e
2 6 1 ,
6 1 7 - 6 1 9 .
8 .
E r i c k s o n ,
J .
D . ,
V a r o q u i ,
H . ,
S c h a f e r ,
M . ,
D i e b l e r , M . - F . , W e i h e ,
E . ,
M o d i ,
W . ,
R a n d ,
J . ,
E i d e n ,
L .
E . ,
B o n n e r ,
T .
I .
U s d i n ,
T .
( 1 9 9 4 ) J .
B i o l .
C l i e n m .
2 6 9 ,
2 1 9 2 9 - 2 1 9 3 2 .
9 .
V a r o q u i ,
H . ,
D i e b l e r ,
M . - F . , M e u n i e r , F . - M . ,
R a n d ,
J .
B . ,
U s d i n ,
T .
B . ,
B o n n e r ,
T .
I . , E i d e n ,
L . E .
E r i c k s o n ,
J . D .
( 1 9 9 4 )
FEBS
L e t t .
3 4 2 ,
9 7 - 1 0 2 .
1 0 .
R o g h a n i ,
A . , F e l d m a n , J . ,
K o h a n ,
S .
A . ,
S h i r z a d i , A . , G u n d e r s e n ,
C .
B . ,
B r e c h a ,
N .
E d w a r d s ,
R . H .
( 1 9 9 4 )
P r o c . N a t l . A c a d .
S c i .
USA
9 1 ,
1 0 6 2 0 - 1 0 6 2 4 .
1 1 .
S c h a f e r ,
M .
K . - H . ,
W e i h e ,
E . ,
V a r o q u i ,
H . ,
E i d e n ,
L .
E .
E r i c k s o n ,
J . D .
( 1 9 9 4 )
J .
M o l .
N e u r o s c i .
5 ,
1 - 1 8 .
1 2 .
S o f r o n i e w ,
M .
V . ,
C a m p b e l l ,
P .
E . , C u e l l o ,
A . C .
E c k e n s t e i n ,
F .
( 1 9 8 5 )
i n C e n t r a l
C h o l i n e r g i c
N e u r o n s V i s u a l i z e d
b y
I n i m m u n o h i s t o c h e n m i c a l D e t e c -
t i o n
o f
C h o l i n e
A c e t y l t r a n s f e r a s e ,
e d .
P a x i n o s ,
G .
( A c a d e m i c ,
Ne w
Y o r k ) ,
V o l .
1 ,
p p .
4 7 1 - 4 8 5 .
1 3 .
M i l l e r ,
A . D .
R o s m a n ,
G .
J .
( 1 9 8 9 )
B i o t e c h n i q u e s
7 ,
9 8 2 - 9 8 9 .
1 4 .
R a u s c h ,
D .
M . ,
l a c a n g e l o ,
A .
L .
&
E i d e n ,
L .
E .
( 1 9 8 8 )
M o l . E n d o c r i n o l .
2 ,
9 2 1 - 9 2 7 .
1 5 .
T a o - C h e n g ,
J . - H . ,
D o s e m e c i ,
A .
S . ,
B r e s s l e r ,
J .
P . ,
B r i g h t m a n ,
M .
W .
S i m p s o n ,
D . L .
( 1 9 9 5 )
J . N e o u r o s c i .
R e s .
4 2 ,
3 2 3 - 3 3 4 .
1 6 .
R o m e o ,
H .
E . , F i n k ,
T . ,
Y a n a i h a r a ,
N .
&
W e i h e ,
E .
( 1 9 9 4 )
P e p t i d e s
1 5 ,
1 4 7 9 - 1 4 8 7 .
1 7 .
S c h e m a n n , M . , S a n n , H . ,
S c h a a f ,
C .
M a d e r ,
M .
( 1 9 9 3 ) A m .
J .
P h y s i o l .
2 6 5 ,
1 0 0 5 - 1 0 0 9 .
1 8 .
L e b l a n c ,
G .
G .
&
L a n d i s ,
S .
C .
( 1 9 8 6 )
J .
N e u r o s c i .
6 ,
2 2 0 .
1 9 .
U s d i n ,
T . ,
E i d e n ,
L .
E . , B o n n e r ,
T .
I .
E r i c k s o n ,
J .
D .
( 1 9 9 5 )
T r e n d s
N e u r o s c i .
1 8 ,
2 1 8 - 2 2 4 .
2 0 .
P a x i n o s ,
G .
&
B u t c h e r ,
L .
L .
( 1 9 8 5 )
i n
O r g a n i z a t i o n a l P r i n c i p l e s
o f
t h e B r a i n
a s R e v e a l e d
b y
C h o l i n e
A c e t y l t r a n s f e r a s e
a t i d
A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e
D i s t r i b u -
t i o n a n d
P r o j e c t i o n s ,
e d .
P a x i n o s ,
G .
( A c a d e m i c ,
Ne w
Y o r k ) ,
V o l .
1 ,
p p .
4 8 7 - 5 2 1 .
2 1 .
M o r a l e s ,
M .
A . ,
H o l m b e r g ,
K . ,
X u ,
Z . - O . ,
C o z z a r i , C . , H a r t m a n ,
B .
K . ,
E m s o n ,
P . ,
G o l d s t e i n ,
M . , E l f v i n ,
L . - G .
H o k f e l t ,
T .
( 1 9 9 5 )
P r o c . N a t l .
A c a d .
S c i . USA
9 2 ,
1 1 8 1 9 - 1 1 8 2 3 .
2 2 .
S a n n ,
H . ,
M c C a r t h y ,
P .
W . , S c h e m a n n ,
M . , J u r z a k , M . , P o e t h k e ,
R .
F i e r a u ,
F . - K .
( 1 9 9 5 )
J . A u t o n o m . N e r v .
S y s t .
5 4 ,
1 9 5 - 2 0 5 .
2 3 .
S c h a f e r ,
M .
K . - H . ,
W e i h e ,
E . , E r i c k s o n ,
J .
D .
E i d e n ,
L .
E .
( 1 9 9 5 ) J .
M o l .
N e u i r o s c i .
6 ,
2 2 5 - 2 3 6 .
2 4 .
G r e e n e ,
L . A .
&
T i s c h l e r ,
A .
S .
( 1 9 7 6 )
P r o c . N a t l .
A c a d .
S c i . USA
7 3 ,
2 4 2 4 - 2 4 2 8 .
2 5 .
T i s c h l e r ,
A .
S .
G r e e n e ,
L . A .
( 1 9 7 8 )
L a b . I n v e s t .
3 9 ,
7 7 - 8 9 .
2 6 .
L i u , Y . ,
S c h w e i t z e r ,
E .
S . ,
N i r e n b e r g ,
M .
J . ,
P i c k e l ,
V .
M . , E v a n s ,
C . J .
E d w a r d s ,
R . H .
( 1 9 9 4 )
J .
C e l l B i o l .
1 2 7 ,
1 4 1 9 - 1 4 3 3 .
2 7 .
B a u e r f e i n d ,
R . ,
R e g n i e r - V i g o r o u x ,
A . , F l a t m a r k ,
T .
H u t t n e r ,
W. B .
( 1 9 9 3 )
N e u r o n
1 1 ,
1 0 5 - 1 2 1 .
2 8 .
A g o s t o n ,
D .
V . ,
C o n l o n ,
J . M .
&
W h i t t a k e r ,
V .
P .
( 1 9 8 8 ) E x p .
B r a i n
R e s .
7 2 ,
5 3 5 - 5 4 2 .
2 9 .
H o k f e l t ,
T .
( 1 9 7 3 )
i n
N e u r o t a l C a t e c l h o l a m i n e
S t o r a g e
V e s i c l e s ,
e d s .
U s d i n ,
E .
&
S n y d e r ,
S .
( P e r g a m o n ,
S t r a s b o u r g , F r a n c e ) ,
p p .
4 3 9 - 4 4 6 .
3 0 .
N i r e n b e r g ,
M .
J . ,
L i u ,
Y . ,
P e t e r ,
D . ,
E d w a r d s ,
R .
H .
P i c k e l ,
V . M .
( 1 9 9 5 )
P r o c . N a t l .
A c a d .
S c i .
USA
9 2 ,
8 7 7 3 - 8 7 7 7 .
3 1 .
R e g n i e r - V i g o u r o u x ,
A .
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H u t t n e r ,
W . B .
( 1 9 9 3 )
N e u r o c h e m .
R e s .
1 8 ,
5 9 - 6 4 .
3 2 .
B a u e r f e i n d , R . ,
J e l i n e k ,
R . ,
H e l l w i g ,
A .
H u t t n e r ,
W.
B .
( 1 9 9 5 )
P r o c .
N a t l .
A c a d .
S c i .
USA
9 2 ,
7 3 4 2 - 7 3 4 6 .
3 5 5 2
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