Principle of PCRProf. Dr. Baron

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Principio de PCR

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PCR - Reacción en cadena de la polimerasa

primer 1 (forward primer)

primer 2 (reverse primer)

DNA polymerasePo l

3‘ 5‘

3‘

3‘

3‘

3‘

3‘

3‘

5‘

5‘

5‘

5‘

5‘

5‘3‘ 5‘

3‘

3‘

5‘

5‘

5‘5‘ 3‘

3‘

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Progresión de PCR

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Cebadores para PCR

• Los cebadores están al comienzo de la molecula para la polimerasa de ADN y están compuestos de un único ADN entrelazado (ssDNA)

• Los cebadores tienen 20-40 nucleótidos de longitud• Los cebadores han de ser sintetizados (Muchas compañias viven de eso)• Un cebador es complementario de una cadena de ADN para ser

amplificado (Molde de ADN)• Un software de cebador disponible en internet facilita la determinación del

cebador • Son necesarios dos cebadores, Cebador directo and Cebador inverso• Recocido de cebadores antiparalelos del extremo 3‘ del molde de ADN • Ambos cebadores deberían tener la misma tempreatura de recocido (Ta)• Ta depende de la longitud y contenido de carga genética• El cebador más fuerte se une al molde de ADN con la más alta Ta• Cuanto mayor es la Ta más específica es la unión del cebador al molde de

ADN.• Los rangos de la Ta son desde 52°C a 65°C

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Cycle Step Temperature Duration

1. DNA denaturation 95 °C 1 min primer annealing 50 - 65 °C 30 sec primer elongation 72 °C 45 sec - 3 min

2. - 19. DNA denaturation 92 - 95 °C 30 sec primer annealing 50 - 65 °C 30 sec primer elongation 72 °C 45 sec - 3 min

20 DNA denaturation 92 - 95 °C 30 sec primer annealing 50 - 65 °C 30 sec final elongation 72 °C 7 min hold 7 °C hours

PCR de 20 Ciclos

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Cycle Step Temperature Duration

1. DNA denaturation 95 °C 1 min primer annealing 50 - 65 °C 30 sec primer elongation 72 °C 45 sec - 3 min

2. - 19. DNA denaturation 92 - 95 °C 30 sec primer annealing 50 - 65 °C 30 sec primer elongation 72 °C 45 sec - 3 min

20 DNA denaturation 92 - 95 °C 30 sec primer annealing 50 - 65 °C 30 sec final elongation 72 °C 7 min hold 7 °C hours

PCR de 20 ciclos

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Amplificación por PCR de ADN

• Amplificación de 20 a 50 ciclos- 20 ciclos 220 copias de ADN = 106-fold amplificación- 30 ciclos 230 copias de ADN = 109-fold amplificación- 40 ciclos 240 copias de ADN = 1012-fold amplificación

• Fórmula: 2n ADN copias, n = número de ciclos de PCR• Elaborado por K. Mullis en 1985, premio nobel en 1993, uso del ADN

polimerasa de E. coli, Sin automatización posible• La automatización fue posible después de introducir ADN polimeresa a

calor estable (e.g. Taq-Polimerasa)• La automatización de la PCR por termociclador programable • El 1.er ciclo obtiene ADN de longitud indefinida, dos longitudes definidas de copias

de ADN después del 3.er ciclo.

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Taq-Polimerasa

• Origen/organismo Thermus aquaticus• Habitat geyser, Yellowstone NP ('76)• Peso molecular 94 kDa (rec. from E. coli)• pH óptimo 7 – 8• Temperatura óptima in vitro 70 - 80°C• Índice de síntesis 150 nucleotidos/s @ 75-80°C

22 nucleotidos/s @ 55°C 1.5 nucleotidos/s @ 37°C 0.25 nucleotidos/s @ 22°C

• Índice de Error in vitro 1 in 5000 nucleotides• Estabilidad/Vida media biológica 12 min @ 94°C

6 min @ 97°C• Actividad adicional enzimática 5´ 3´ exonuclease

Limitación del número de ciclos de PCR• Vida media biológica de Taq polimerasa @ 95°C • Escasez de cebadores y dNTP's• La dsDNA amplicada une los cebadores

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Fin