PROCESSAMENTO de RNA

 

Intron type Where found 

GU-AG introns Eukaryotic nuclear pre-mRNA

AU-AC introns Eukaryotic nuclear pre-mRNA

Group I Eukaryotic nuclear pre-rRNA, organelle RNAs, few bacterial RNAs

Group IIOrganelle RNAs, some prokaryotic RNAs

Group III Organelle RNAs

Twintrons Organelle RNAs

Pre-tRNA introns Eukaryotic nuclear pre-tRNA

Archaeal introns Various RNAs

 

Gene Length (kb) Number of introns

Amount of the gene taken up by the

introns (%) 

Insulin 1.4 2 69

b-globin 1.6 2 61

Serum albumin 18 13 79

Type VII collagen

31 117 72

Factor VIII186 25 95

Dystrophin 2400 7898

RNAs ribossômicos (rRNA) e RNAs transportadores (tRNA) são normalmente,processados em procariotes e eucariotes.

Adição do cap

Sinais codificados no DNA e presentes no RNAm são reconhecidos por proteínas e enzimas que se ligam ao RNA.

Poliadenilação

CPSF-AAUAAA

Cstf-GU-rich

CA – fator de clivagem

Possíveis funções do CAP Proteger o extremo 5’ do mRNA da ação de exonucleases Reconhecimento pelo ribossomo

Qual é o possível papel da poli (A)?

Estabilidade e sobrevida (remoção da poliA parece preceder a degradação de certos RNAm não evidencias). Inibe a tradução “in vitro” . Exceções: rRNA, tRNAs e mRNA (histonas)

mRNAs maturos são seletivamente exportados

Como a célula distingue entre os mRNAs relativamente maduros e a enorme quantidade de lixo A resposta esta no transporte do núcleo para o citoplasma, o qual é altamente seletivo. Introns, RNAs quebrados e mRNAs erroneamente“spliceados”: inúteis, e potencialmente danosos para a célula.

mRNAs devem estar ligados ao apropriado set de proteínas ex.:cap-binding complex, SR e polyA-binding proteins. (proteínas que sinalizam o fim do de splicing são de particular importância) Genes sem introns possuem seqüências reconhecidas por outros fatores

hnRNPs ( heterogeneus nuclear RNA): ~ 200A; 40S; 100-800bases; 6 principais grupos de proteínas (A1, A2,

B1, B2, C1, C2)

~ 30 mais abundantes no núcleo; Removem “hairpins” permitem que sinais sejam lidos mais

facilmente; Importantes em distinguir mRNas maduros de “debris”. Introns e mRNAs carregam sinais em forma de proteínas ligadas Alguns hnRNAs permanecem ligados ao mRNA no citoplasma.

Complexos pré-mRNA-proteina e mRNA-proteinas são estruturas dinâmicas formadas pela perda de numerosas proteínas durante o processamento (sínteses, processamento, exportação e tradução). Assim estas estruturas refletem os diferentes eventos relacionados com o processamento culminando com uma fibra curvada.

Muitos RNAs no-codificantes são também sintetizados e processados no núcleo• A ausência da cauda citoplasmática nos RNAs no-codantes ajudam a

diferenciar-os dos mRNAs. rRNA: E.coli 7 cópias; humanos 200x em 5 cromossomos; Xenopus 600x

• Dos 4 tipos de RNAr (18S, 5.8S e 28S) são obtidas por clivagem diferencial do mesmo transcrito.

• O 5S é sintetizado a partir de um cluster separado de genes e sintetizado pela RNApol III não requer modificações químicas

O nucléolo é uma fabrica de ribossomos Não possui membrana; Agregado de macromoléculas (genes rRNAs, precursores e rRNAs maturos,enzimas,snoRNP)O tamanho reflete o número de ribossomos na célula ( ate 25% do núcleo) Sínteses de outros complexos RNA-proteínas ex U6snRNAP; telomerase

A função do nucléolo na sínteses de ribossomos e outras ribonucleoproteínas

O núcleo possui uma variedade de estruturas sub-nucleares

Fibriliarin Protein (snoRNPs)

Grânulos de Intercromatina “splickers”

“Bulk cromatin”Coilin protein“Corpos de cajal”

Estruturas altamente dinâmicas e sem membranas (interações RNA-proteínas- DNA). Corpos de Cajal e GEMS: snRNP e snoRNA sofrem modificação e ensamble com proteínas Grânulos de intercromatina:estocagem de snRNP.

Anomalias- doenças: ex proteína SMN ( sobrevida motora de neurônios),atrofia muscular, defeito no ensamble de snRNP e o conseqüente “splicing”

Estruturas subnucleares

snRNPs e snoRNPs sofremmudanças conformacionais

Acumulo de snRNPs maduros

(20-50)

1. Sínteses e exportação de snRNAs

2. Modificação 5’ e 3’ e ensamble7 proteínas comuns (Sm proteínas).

3. Re-importação dos complexos e final modificação em “Cajal bodies”

Existem aproximadamente (2000-3000) sitios de ativa transcrição e splicing nas fibras de pericromatina

RNA splicing remove Introns do pre-mRNA recém sintetizado

O splicing acontece numa particular localização no núcleo e está conectado com outros eventos?

Como a especificidade do splicing é controlada?.

Que assegura que os extremos dos introns sejam reconhecidos para que a correta seqüência seja removida?.

Os introns são removidos numa particular ordem?

Algumas questões a respeito do splicing

Envolve reações de transferência de grupos fosfatos “transesterificações” estrutura “lariat”.

5 RNAs; 50 proteínas e muitas moléculas de ATP.

Cis-splicing

1. splicing nuclear do pré-mRNA ( introns nucleares)

2. splicing de introns do grupo I ( introns nucleares de eucariotes inferiores)

3. splicing de introns do grupo II ( introns de organelas )

Trans-splicing

- mRNAs de tripanossomatídeos - Alguns mRNAs de nematodos

Diversos tipos de sistemas de splicing:

- Os introns são removidos por um complexo de proteínas e ribonucleoproteínas (o spliceossomo) que reconhece certas seqüências consenso nas divisa entre exon-intron e no interior de cada intron.

- Eliminação dos introns é uma propriedade autonoma do próprio RNA. Dois grupos de introns com uma estrutura secundária terciária característica.

- A remoção de introns de tRNA nucleares de lev. envolve atividade enzimática.

Permitir recombinação entre exons de diferentes genes.

Permitir a produção de mais de uma proteína a partir do mesmo gene, “splicing alternativo”, incremento do potencial codificante do genoma. (60% genes apresentam splicing alternativo)

Importância do splicing

Principal impedimento para predezir a seqüência de uma proteína a partir de seu gene e conseqüentemente o numero total de seqüências codificantes no genoma

Splicing alternativo envolve uso diferencial de funções

Alguns casos o padrão de expressão é dado pelo transcrito primário: uso de diferentes “startpoint” ou seqüências de terminação.

O transcrito primário é spliciado em mais de uma forma: exons são substituídos, acrescentados ou deletados.

Certos casos múltiplos produtos são feitos na mesma célula,em outros determinado padrão acontece sob particulares condições.

Existem casos onde um sítio de excisão permanece constante, enquanto os outros variam segundo o tipo celular, o sexo.

Outros exemplos de splicing alternativo

Os elementos P de D. melanogaster mostram um padrão de splicing tecido específico

Células somáticas:2 eventos de splicing,Linha germinal: um adicional splicing remove outro intron.

Dado que um codon de terminação esta neste intron, uma proteína maior é produzida durante a fase germinal.

Edição (“RNA Editing”)Edição (“RNA Editing”)

Mudança na informação genética em nível de mRNA

Adição ou deleção de bases: - muda fase de leitura - cria códons de iniciação - cria códons de terminação

2 situações diferentes

- células de mamíferos: substituição de uma baseapolipoproteínas B diferentes entre fígado e intestino (editada)receptor de glutamato no cérebro (Glu Arg: alteração no fluxo de íons pelo neurotransmissor)

- mRNAs mitocondriais de tripanossomas: mudanças mais amplas em transcritos

de vários genes Exs: subunidade II da citocromo oxidase (adição de 4 Us); coxIII de T.brucei (mais da metade dos nucleotídeos do mRNA foram gerados pela adição de Us não codificados no genoma)

Enzima desaminase específicaEnzima desaminase específica deve reconhecer a estrutura do mRNA

Splicing de tRNAs Acontece por reações de clivagem e ligação separadas.

40 dos 400 genes para tRNAs são interrompidos 1 simples intron localizado a um nucleotídeo de extremo 3’ do anticidon entre 14 a 16 pb sem eqüência consenso.

Genes de tRNA procariotos:Uma ou poucas cópias espalhadas no genoma bacteriano e ou repetidos em tandem. Podem encontrar-se em operons policistrônicos, operons de rRNA.

Genes tRNA eucariotos:cópias múltiplas, organização varia de espécie para espécie:dispersos no genoma

(como em leveduras); agrupados (Drosophila); repetidos em tandem (Xenopus).

Todos os introns incluem uma seqüência que é complementar ao anticodon do tRNA e cria uma conformação alternativa para o braço do anticodon

O intron, não é inteiramente irrelevante: O pareamento entre uma base da alça do intron e uma base não pareada da haste é necessário para o splicing.

Introns que codificam proteínas• Em alguns fungos introns de mitocôndria codificam uma proteína que participa no splicing do próprio intron “ maturases”

Ex. citocromo b, 3 exon-2 introns, remoção do 1 intron origina uma ORF que inclui o 2 intron que poor sua vez participa na remoção do próprio intron.

• Introns do grupo I e II codificam enziams deste tipo, uma vez que eles podem sofrer auto-splicing, estas enz estabilizariam as estruturas secundárias

Origem dos Introns

Os introns foram adquiridos pelos eucariotes ou foram perdidos pelos procariotes ?

Hipoteses:Teriam surgido como conseqüência da fusão de pequenas seq. possibilitando

rearranjo de seq. codificantes sem necessidade de uma exata justaposição.

“Os introns não seriam uma necessidade para sobrevivência, mas sem uma vantagem evolutiva, permitindo uma evolução mais rápida, teoria do exon shuffling”

Evidencias dadas por exons ou grupos de exons que codificam domínios diferentes numa mesma proteína.