1
PROTEASASPROTEASAS
Dr. SinisterraBiotransformations Group
Faculty of PharmacyUniversidad Complutense
www.biotransformaciones.com
The enzymatic hydrolysis of the carboxamide bond is naturallylinked to the chemistry of amino acids and peptides.
The world production of enantiomerically pure amino acidsaccounted for more than 0.8 million tons of materials and amarket of 4.1 billion US $ per annum in 2008.
HYDROLYSIS OF THE AMIDE BOND
The three amino acids dominating this area with respect tooutput and value (L-glutamic acid, L-Lysine and D,L-methionine)are produced by fermentation or by synthesis.
However, a considerable number of other optically pure D- andL-amino acids are prepared using one of the available enzymaticmethods discussed.
HYDROLYSIS OF THE AMIDE BOND
COOR1
R
NHR2
DL
COOH
RL
H2N
RESOLUTIOM BY HYDROLYSIS (HYDROLASE)
ESTERASE METHODAMIDASE METHODACYLASE METHODHYDANTOINASE METHODLACTAMASE METHOD
2
ESTERASE METHODthe resolution is performed by hydrolysis of the ester bond
COOR1
R
NHR2
DL
COOH
RL
R2HN
ESTERASE or PROTEASE
COOH
R
NHR2
D
+
COOMe
R
NHAc
DL
COOH
RL
AcHN-chymotrypsin
COOH
R
NHAc
D
+
Structure of α-chymotrypsin Catalytic machinery: Ser-195; His-57;
Hidrólisis catalizada por proteasas
Mecanismo de acción de las proteasas dependientes de serina PASO 1
3
Mecanismo de acción de las proteasas dependientes de serina PASO 2
Mecanismo de acción de las proteaasas dependientes de serina PASO 3
Mecanismo de acción de las proteasas dependientes de serina PASO 4
4
Mecanismo de acción de las hidrolasas dependientes de serinaPASO 5
Mecanismo de acciónde las proteasasdependientes de serina PASO 6
Mecanismo de acción de las proteasas dependientes de serina PASO 7
5
COOR2
R1DL
H2NALCALASE
(Bacillus licheniformis)
COOH
R1L
H2N + R2-OHt-BuOH/H2O (19:1)
in situ racemizationpyridoxal 5-phosphate
Other examples of the ESTERASE METHOD
COOR2
R1
pyridoxal 5-phosphate
HNHC
COOR2
R1
HNH2C
NH+
HO
C
OPO3
2-
OH
Pyridoxal-5-phosphate
AMIDASE METHODThe resolution is performed by hydrolysis of the C- terminal amide bond
CONH2
R
NH2
DL
COOH
RL
H2N
AMIDASECONH2
R
NH2
D
+
ACYLASE METHODThe resolution is performed by hydrolysis of the endo-amide group
COOH
R
NHAcyl
DL
COOH
RL
H2NACYLASE
COOH
R
NHAcyl
D
+
DL
NH
HNO
O
R
COOH
R
HN NH2
O
COOH
R
HNH2N
O
D-HYDANTOINASE L-HYDANTOINASE
D N carbamoyl L-N-carbamoyl
HYDANTOINASE METHOD
D-N-carbamoyl amino acid
L N carbamoyl amino acid
COOH
R
NH2
COOH
R
NH2
CARBAMOYLASE CARBAMOYLASE
DL
6
LACTAMASE METHOD
ENHO
(R)(S)NH
O
(S)(R)NH2
O
+
OH
O O O OH
Blue: converted enantiomer; Red: non-converted enantiomer
The enzyme is selected according to the DESIRED ENANTIOMER
ENHO
(S)(R)NH
O
(R)(S)NH2
O
+
OH
Peptide synthesisPeptide synthesis
Dr. SinisterraBiotransformations Group
Faculty of PharmacyUniversidad Complutense
www.biotransformaciones.com
PEPTIDE SYNTHESIS
7
AMIDE SYNTHESIS.-Can be performed using proteasas or lipases
R1
O
O R2
R3 NH2
R NH NH
HIDROLASEORGANIC SOLVENT
R1
O
HN R3
R1
O
R2 OH+
R2 OH+
R3 NH NH2 HN NH R3
R
NH2
R
NH
R
NHor
LIPASEAcyl Donor
O
R1
O
R1
R1-COO-R2
SÍNTESIS DE PEPTIDOS
1.- Síntesis secuencial.- se usa para sintetizar fragmentos
2.- Síntesis convergente.- es la mas utilizada en procesos industriales
Ventajas de la síntesis enzimática de péptidos1.- ocurre en condiciones sostenibles.- P y T ambiente. Ausencia de disolventes contaminantes2.- no hay epimerización de centros estereogénicos3.- no hay que usar pasos de protección-desprotección4.- se obtiene un péptido homogéneo5.- permite hacer síntesis convergente con fragmentos péptidos
Desventajas de la síntesis enzimática de péptidosj p p
1.- las concentraciones a las que se trabajan son pequeñas2.- la selectividad de las enzimas hacia cierto tipo de sustratos limita su uso.
proteasaS2 S1 active S1’ S2’
site
P2 P1 union P1’ P2’
peptido
PEPTIDE SYNTHESIS
Enzyme-catalyzed peptide synthesis may be conduced via three basic ways:
REVERSAL HYDROLYSIS,
TRANSPEPTIDATION (which is used to a lesser extent)
AMINOLYSIS OF ESTERS.
8
One of the reactants is used in excess
THERMODYNAMIC APPROACH: under physiological conditions the equilibrium position in proteases catalyzed reactions is far over on the side of proteolysis. In order to create a driving force in the reverse direction towards peptides synthesis the following constraints may be applied:
PEPTIDE SYNTHESIS
Removal of product via formation of an insoluble derivative byspecific complex formation or by extraction of the product into anorganic phase by using a water-immiscible organic cosolvent.
Lowering the water-activity (concentration) of the system byaddition of water-miscible organic cosolvent.
PEPTIDE SYNTHESIS
KINETIC APPROACH: the aminolysis of esters, involves a kinetically controlledirreversible type of reaction, in which two nucleophiles (water and an amine) arecompeting for the acyl-enzyme intermediate.
As mentioned above this reaction can be regarded as irreversible.
PEPTIDE SYNTHESIS
9
CHEMO-ENZYMATIC SYNTHESIS OF AN ENKEPHALIN DERIVATIVE
CHEMO-ENZYMATIC SYNTHESIS OF AN ENKEPHALIN DERIVATIVE
ALCÁNTARA et al.: Peptide synthesis in organic-aqueous media catalysed by α-chymotrypsin immobilized on different supports.Fundamental of biocatalysis in non conventional media, Elsevier Pub., 1992, pp.443-50.
Z Asp + Phe OMe2
Z Asp Phe OMe
Phe OMe
+
Thermolysin
ENZYMATIC SYNTHESIS OF ASPARTAME
Z Asp Phe OMeAsp Phe OMe
Purificatión
Desprotection
10
OBTENCIÓN DE INSULINA CATALIZADA POR PROTEASAS
Insulina.-Aislada por primera vez en 1921 a partir de páncreas deperro.
Secuencia identificada por Sanger en 1955.
Regula los niveles de azúcar en sangre, usada para el tratamiento dela diabetes mellitus (aprox. 5% población occidental).
Es una proteína, no puede suministrarse oralmente (proteolisis)
Hoy día existen 4 rutas de obtención de insulina:
1. Extracción de páncreas humano
2. Síntesis a partir de los aminoácidos individuales
3. Conversión de insulina porcina en humana
4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
Conversión de insulina porcina en humana
Cadena A
Cadena B
Proteasa I de Achromobacter lyticus
4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
4.1. Producción de pro-insulina, transformada en insulina por transpeptidación (NovoNordisk)
Obtenida a través de fermentación
Ester de la insulina humana
de células de S. cerevisiae Genéticamente modificadas
Pro-insulina
11
4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
4.2. Producción de mono/di-arg-insulina usando células de E. coli modificadasgenéticamente y posteriores pasos de síntesis y purificación (ELI LILY)
Pro-Arg -insulina
Conversión: sobre 70 %.Reactor tipo batch
Mono/di-Arg -insulina
Mono/di-Arg -insulina
Insulina humana
12
4. Fermentación a partir de microorganismos modificados genéticamente
4.3. Producción de pre-pro-insulina usando células de E. coli modificadas genéticamente yposteriores pasos de síntesis y purificación (Hoechst, Marion Roussel)
Pre-pro-Arginsulina
Mono/di-Arg -insulina
Mono/di-Arg -insulina
Insulina humana