8/3/2019 Protein M SE

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V o l . 5 5 , N o . 1 2

M o l e c u l a r A n a l y s i s o f t h e M P r o t e i n o f S t r e p t o c o c c u s e q u i a n dC l o n i n g a n d E x p r e s s i o n o f t h e M P r o t e i n Gene i n E s c h e r i c h i a c o l iJORGE E . GALANt AND JOHN F . TIMONEY*

D e p a r t m e n t o f V e t e r i n a r y M i c r o b i o l o g y , Ne w Y o r k S t a t e C o l l e g e o f V e t e r i n a r y M e d i c i n e , C o r n e l l U n i v e r s i t y ,I t h a c a , Ne w Y o r k 1 4 8 5 3R e c e i v e d 2 1 May 1 9 8 7 / A c c e p t e d 1 5 S e p t e m b e r 1 9 8 7

A S t r e p t o c o c c u s e q u i ge n e b a n k was c o n s t r u c t e d i n t h e b a c t e r i o p h a g e A g t l l c l o n i n g v e c t o r , a n d h y b r i d p h a g ep l a q u e s were s c r e e n e d w i t h S . e q u i M p r o t e i n a n t i s e r u m . A h y b r i d p h a g e e x p r e s s i n g t h e S . e q u i M p r o t e i n( X g t l l / S E M 7 ) was i d e n t i f i e d a n d l y s o g e n i z e d i n t o E s c h e r i c h i a c o l i Y 1 0 8 9 . The c l o n e d M p r o t e i n a p p e a r e d i ni m m u n o b l o t s as t h r e e p o l y pe p t i de s w i t h r e l a t i v e m o l e c u l a r w e i g h t s o f 5 8 , 00 0 , 5 3 , 00 0 , a n d 5 0 , 0 0 0 . W h e nr e a c t e d w i t h S . e q u i M p r o t e i n a n t i s e r u m i n an agar d o u b l e - d i f f u s i o n assay, t h e c l o n e d M p r o t e i n f o r m e d a l i n eo f i d e n t i t y w i t h a p r o t e i n i n an a c i d e x t r a c t o f S . e q u i . F u r t h e r m o r e , A g t l 1 / S E M 7 p r o t e i n i n h i b i t e d o p s o n i z a t i o no f S . e q u i b y a n t i s e r u m t o S . e q u i M p r o t e i n . I n a d d i t i o n , t h e r e c o m b i n a n t p r o t e i n e x p r e s s e d d e t e r m i n a n t s o ft h e a n t i g e n i n t h e immune c o m p l e x e s o f purpura h e m o r r h a g i c a . N a t i v e M p r o t e i n o b t a i n e d f r o m S . e q u i an dr e c o m b i n a n t M p r o t e i n s h o w e d very s i m i l a r m o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t i o n s on i m m u n o b l o t s , a p p e a r i n g asm u l t i p l e c l o s e l y s p a c e d b a n d s w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s r a n g i n g f r o m 5 2 , 0 0 0 t o 6 0 , 0 0 0 . A n t i s e r a p r e p a r e ds e p a r a t e l y a g a i n s t e a c h o f t h e a c i d - e x t r a c t e d p o l y p e p t i d e s s h o w n t o b e i m p o r t a n t i n serum b a c t e r i c i d a lresponses ( m o l e c u l a r w e i g h t , 2 9 , 0 0 0 ) a n d n a s o p h a r y n g e a l l o c a l a n t i b o d y responses ( m o l e c u l a r w e i g h t s , 4 1 , 0 0 0a n d 4 6 ,0 00 ) o f t h e h o r s e e a c h r e a c t e d w i t h a l l t h r e e p o l y p e p t i d e s i n an a c i d e x t r a c t . M o r e o v e r , a n t i s e r a a g a i n s tp r o t o p l a s t s a n d a g a i n s t r e c o m b i n a n t M p r o t e i n o f S . e q u i a l s o r e a c t e d w i t h t h e s e p o l y p e p t i d e s . T h e s e r e s u l t ss u g g e s t t h a t t h e e n t i r e M p r o t e i n m o l e c u l e o f S . e q u i i s p r e s e n t i n t h e s e p r e p a r a t i o n s a n d t h a t t h e f r a g m e n t s i na c i d e x t r a c t s carry o v e r l a p p i n g s e g m e n t s .

S t r e p t o c o c c u s e q u i caus e s s t r a n g l e s , a d i s e a s e o f t h ef a m i l y E q u i d a e c h a r a c t e r i z e d b y i n f l a m m a t i o n o f t h e u p p e rr e s p i r a t o r y t r a c t a n d a b s c e s s e s o f t h e d r a i n i n g l y m p h n o d e s .The d i s e a s e i s f o u n d t h r o u g h o u t t h e w o r l d a n d caus e s h e a v ye c o n o m i c l o s s e s d e s p i t e t h e a v a i l a b i l i t y o f v a c c i n e s b a s e d onb a c t e r i n s or M p r o t e i n - r i c h e x t r a c t s . L a c k o f e f f i c a c y o fv a c c i n e s i s p r o b a b l y n o t d u e t o f a i l u r e t o s t i m u l a t e serumb a c t e r i c i d a l a n t i b o d i e s b u t t o f a i l u r e t o s t i m u l a t e p h a r y n g e a lm u c o s a l a n t i b o d i e s t o t h e S . e q u i M p r o t e i n ( 1 2 , 2 9 ) . S t u d i e si n our l a b o r a t o r y h a v e s h o w n t h a t h o t a c i d e x t r a c t s o f S . e q u ic o n t a i n a s e r i e s o f d e f i n e d M p r o t e i n f r a g m e n t s w h i c h carrye p i t o p e s i m p o r t a n t i n s t i m u l a t i o n o f b a c t e r i c i d a l or m u c o s a la n t i b o d i e s ( 1 2 , 3 1 ) . A 2 9 , 0 0 0 - t o 3 0 , 0 0 0 - M r f r a g m e n t carriesd e t e r m i n a n t s t h a t i n d u c e b a c t e r i c i d a l a n t i b o d i e s , a n d t h ee p i t o p e s i n v o l v e d i n s t i m u l a t i o n o f m u c o s a l a n t i b o d i e s areo n 4 1 , 0 0 0 - a n d 4 6 , 0 0 0 - M r f r a g m e n t s . I n a d d i t i o n , r e c e n ts t u d i e s i n ou r l a b o r a t o r y h a v e i m p l i c a t e d t h e M p r o t e i n o f S.e q u i i n t h e p a t h o g e n e s i s o f purpura h e m o r r h a g i c a , an i m -m u n e - c o m p l e x - m e d i a t e d d i s e a s e o f t h e h o r s e o f t e n s e e n as as e q u e l a o f s t r a n g l e s ( 1 1 ) . T h u s , t h e M m o l e c u l e o f S . e q u i i so f some c o m p l e x i t y , w i t h r e g i o n s t h a t are f u n c t i o n a l l y h e t -erogeneous, a n a l o g o u s t o t h e M m o l e c u l e s o f group As t r e p t o c o c c i , w h i c h h a v e d i s t i n c t a n t i g e n i c s i t e s w i t h d i f -f e r e n t i m m u n o l o g i c f u n c t i o n s ( 4 , 8 ) .U n l i k e group A s t r e p t o c o c c i , f o r which a t l e a s t 7 4 M t y p e sh a v e b e e n d e s c r i b e d ( 1 0 ) , p r e c i p i t i n , p a s s i v e p r o t e c t i o n ,i m m u n o b l o t , a n d S o u t h e r n b l o t s t u d i e s s u g g e s t t h a t t h e r e i so n l y o n e s e r o t y p e o f S . e q u i M p r o t e i n ( 1 , 2 3 , 3 0 ; J . E . G a l a na n d J . F . T i m o n e y , s u b m i t t e d f o r p u b l i c a t i o n ) . S . e q u i i s , i nf a c t , u n i q u e among t h e b e t a - h e m o l y t i c s t r e p t o c o c c i knownt o carry M p r o t e i n s i n t h e a p p a r e n t a n t i g e n i c s t a b i l i t y o f i t s

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t P r e s e n t a d d r e s s : D e p a r t m e n t o f B i o l o g y , W a s h i n g t o n Univer-s i t y , S t . L o u i s , MO 6 3 1 3 0 .

M p r o t e i n a n d i n t h e r a r i t y o f a c a r r i e r s t a t e . C l e a r l y ,k n o w l e d g e o f t h e s e q u e n c e o f t h e M p r o t e i n g e n e o f S . e q u ia n d c o m p a r i s o n s w i t h t h e s e q u e n c e s o f group A M p r o t e i ngen es s u c h as t h e M6 g e n e ( 1 6 ) c o u l d p r o v i d e v a l u a b l ei n s i g h t i n t o t h e m o l e c u l a r b a s i s o f a n t i g e n i c h e t e r o g e n e i t y i ns t r e p t o c o c c a l M p r o t e i n s s i n c e DNA h o m o l o g y i s known t oe x i s t b e t w e e n group A M p r o t e i n g e n e s a n d group C DNA( 2 6 ) . M o r e o v e r , c o m p a r i s o n o f t h e s e q u e n c e o f t h e M p r o t e i ng e n e o f S . e q u i w i t h t h o s e o f i t s c l o s e group C r e l a t i v e S .z o o e p i d e m i c u s m i g h t h e l p r ev e a l t h e m o l e c u l a r b a s i s o f t h ea b i l i t y o f t h e l a t t e r t o m a i n t a i n i t s e l f as a n o r m a l c o m m e n s a lon t h e p h a r y n g e a l mucosa o f t h e h o r s e . C o n c e i v a b l y , s i n c eM p r o t e i n s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d i n S . z o o e p i d e m i c u s( J . F . T i m o n e y a n d M. M u h k t a r , u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) , ac o u n t e r p a r t o f t h e e p i t o p e on t h e 4 1 , 0 0 0 - d a l t o n f r a g m e n t o ft h e S . e q u i M p r o t e i n a c t i v e i n m u c o s a l i m m u n i t y d o e s n o te x i s t o n t h e S . z o o e p i d e m i c u s M m o l e c u l e s .As a necessary p r e l u d e t o t h e s t u d y o f t h e s e q u e s t i o n s , wed e s c r i b e i n t h i s paper f o r t h e f i r s t t i m e b o t h t h e c h a r a c t e r i -z a t i o n o f t h e n a t i v e f o r m o f t h e M p r o t e i n o f S . e q u i a n d t h ec l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o f i t s s t r u c t u r a l g e n e i n E s c h e r i c h i ac o l i . Th e m a j o r i m m u n o l o g i c a l l y r e a c t i v e p o l y p e p t i d e f r a g -m ents i n a c i d e x t r a c t s were shown t o b e i m m u n o l o g i c a l l yc r o s s - r e a c t i v e w i t h t h e n a t i v e a n d r e c o m b i n a n t M m o l e c u l e sa n d w i t h t h e M p r o t e i n a n t i g e n f o u n d i n c i r c u l a t i n g i m m u n ec o m p l e x e s o f purpura h e m o r r h a g i c a i n t h e h o rs e .

MATERIALS AND METHODSB a c t e r i a l s t r a i n s , b a c t e r i o p h a g e , a n d g r o w t h c o n d i t i o n s . S .e q u i CF32 h a s b e e n p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 1 2 ) . E . c o l i Y 1 0 8 8 ,Y 1 0 8 9 , a n d Y1090 ( 3 4 ) were u s e d f o r g r o w i n g a n d s c r e e n i n gA g t l l a n d X g t l l r e c o m b i n a n t c l o n e s . E . c o l i BHB2688 an dB H B 2 6 9 0 , u s e d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f p a c k a g i n g m i x e s , haveb e e n d e s c r i b e d b y Hohn ( 1 5 ) . S t r e p t o c o c c a l s t r a i n s were

grown o n T o d d - H e w i t t b r o t h . E . c o l i s t r a i n s were grown on3 1 8 1

I N F E C T I O N AND I M M U N I T Y , D e c . 1 9 8 7 , p . 3 1 8 1 - 3 1 8 70 0 1 9 - 9 5 6 7 / 8 7 / 1 2 3 1 8 1 - 0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t C ) 1 9 8 7 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

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3 1 8 2 GALAN AND TIMONEYL a g a r o r i n L b r o t h . When a p p r o p r i a t e , a m p i c i l l i n wasa d d e d t o m e d i a a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 , g / m l .A n t i g e n p r e p a r a t i o n . ( i ) A c i d e x t r a c t s . T h e p r o c e d u r e o fL a n c e f i e l d a n d P e a r l m a n n ( 2 1 ) was u s e d t o p r e p a r e a c i de x t r a c t s o f S . e q u i C F 3 2 .( i i ) N a t i v e M p r o t e i n . N a t i v e M p r o t e i n was o b t a i n e d a sf o l l o w s . S . e q u i C F 3 2 was g r o w n o v e r n i g h t a t 3 7 C i n 2 0 0 m lo f T o d d - H e w i t t b r o t h , a n d t h e c e l l s were r e c o v e r e d b yc e n t r i f u g a t i o n a t 7 , 0 0 0 x g f o r 1 5 m i n a n d w a s h e d t w i c e w i t h2 0 mM p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 ) . T h e c e l l s were s u s p e n d e d i n3 m l o f 5 0 mM p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 ) c o n t a i n i n g 1 0 mg o fl y s o z y m e ( S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , M o . ) p e r m l , 3 0, u g o f N - a c e t y l m u r a m i d a s e SG ( S e i k a g a k u K o g y o C o . , L t d . ,T o k y o , J a p a n ) p e r m l , a n d 0 . 5 M s u c r o s e , a n d t h e m i x t u r ewas i n c u b a t e d a t 3 7 C f o r 1 h . F i n a l l y , p r o t o p l a s t s w e r es e p a r a t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 8 , 0 0 0 x g , a n d t h e s u p e r n a -t a n t s , c o n t a i n i n g M p r o t e i n , w e r e u s e d f o r s u b s e q u e n t s t u d -i e s .( i i i ) E . c o l i l y s a t e s . L y s o g e n s w e r e g r o w n a t 3 0 C t o a no p t i c a l d e n s i t y a t 6 0 0 n m o f 0 . 4 t o 0 . 6 a n d t h e n i n c u b a t e d a t4 2 C f o r 2 0 m i n . When r e q u i r e d , c u l t u r e s w e r e i n d u c e d b ya d d i n g i s o p r o p y l - p - D - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ( I P T G ) t o a f i n a lc o n c e n t r a t i o n o f 1 mM a n d i n cu b at e d w i t h h e a v y a e r a t i o nf o r a n a d d i t i o n a l 3 t o 5 h . C e l l s w e r e r e c o v e r e d b y c e n t r i f u -g a t i o n a t 5 , 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n a n d l y s e d b y f r e e z e - t h a w i n g i nl i q u i d n i t r o g e n . DNase I ( S i g m a ) was t h e n a d d e d t o ac o n c e n t r a t i o n o f 2 0 K i g / m l , a n d t h e l y s a t e was i n c u b a t e d a troom t e m p e r a t u r e f o r 1 5 m i n . C e l l d e b r i s was s e p a r a t e d b yc e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 , 0 0 0 x g f o r 2 0 m i n , a n d t h e s u p e r n a t a n t sw e r e s a v e d f o r f u r t h e r a n a l y s i s .E l e c t r o e l u t i o n o f p o l y p e p t i d e s f r o m S D S - p o l y a c r y l a m i d eg e l . A c i d e x t r a c t s o f S . e q u i C F 3 2 were s e p a r a t e d o n as o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( S D S ) - p o l y a c r y l a m i d e p r e p a r a t i v eg e l ( t h i c k n e s s , 1 . 5 m m ) . P r o t e i n b a n d s c o r r e s p o n d i n g t o t h e2 9 , 0 0 0 - , 4 1 , 0 0 0 - , a n d 4 6 , 0 0 0 - M r p o l y p e p t i d e f r a g m e n t s w e r el o c a t e d w i t h t h e a i d o f a c o m b i n a t i o n o f p r e s t a i n e d p r o t e i ns t a n d a r d s a n d W e s t e r n b l o t s ( i m m u n o b l o t s ) o f a p o r t i o n o ft h e g e l d e v e l o p e d w i t h S . e q u i c o n v a l e s c e n t - p h a s e h o r s ea n t i s e r u m . T h e b a n d s w e r e c u t o u t , p l a c e d i n d i a l y s i s s a c k s ,a n d e l e c t r o e l u t e d i n 2 0 mM p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 8 ) i n aT E 5 0 T r a n s p h o r a p p a r a t u s ( H o e f f e r S c i e n t i f i c I n s t r u m e n t s ) .T h e e l u t e d p r o t e i n was c o n c e n t r a t e d b y vacuum d i a l y s i s .A n t i s e r a . L y s a t e s f r o m E . c o l i 1 0 8 9 ( A g t l l ) a n d 1 0 8 9 ( X g t l l /S E M 7 ) ( a p p r o x i m a t e l y 5 0 0 K g o f p r o t e i n ) w e r e h o m o g e n i z e dw i t h a n e q u a l q u a n t i t y o f c o m p l e t e F r e u n d a d j u v a n t a n di n o c u l a t e d s u b c u t a n e o u s l y i n t o r a b b i t s . B o o s t e r d o s e s w i t hi n c o m p l e t e F r e u n d a d j u v a n t w e r e g i v e n 3 a n d 5 w e e k s l a t e r .S e r u m s a m p l e s were t a k e n a t t h e f i r s t i n o c u l a t i o n a n d a w e e ka f t e r t h e l a s t b o o s t e r . A n t i s e r u m a g a i n s t p r o t o p l a s t M p r o -t e i n was p r e p a r e d i n a s i m i l a r m a n n e r . E l e c t r o e l u t e d p r o t e i no f S . e q u i a c i d e x t r a c t s ( a p p r o x i m a t e l y 2 0 K g o f p r o t e i n ) wash o m o g e n i z e d w i t h a n e q u a l q u a n t i t y o f c o m p l e t e F r e u n da d j u v a n t a n d a d m i n i s t e r e d s u b c u t a n e o u s l y t o g u i n e a p i g s . Ab o o s t e r d o s e was g i v e n 3 w e e k s l a t e r . S e r u m s a m p l e s w e r eo b t a i n e d a t t h e f i r s t i n o c u l a t i o n a n d 2 w e e k s a f t e r t h eb o o s t e r . R a b b i t a n t i s e r u m t o S . e q u i M p r o t e i n was p r e p a r e da s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 3 1 ) . A n t i s e r u m a g a i n s t i m m u n ec o m p l e x e s i s o l a t e d f r o m serum o b t a i n e d f r o m a h o r s e w i t ha c u t e p u r p u r a h e m o r r h a g i c a was p r o d u c e d i n g u i n e a p i g s a sd e s c r i b e d e l s e w h e r e ( 1 1 ) . To r e m o v e c r o s s - r e a c t i n g a n t i b o d -i e s , a l l s e r a w e r e e x t e n s i v e l y a b s o r b e d w i t h a l y s a t e o f E .c o l i Y 1 0 8 9 (A g t l l ) p r ep a re d a s d e s c r i b e d a b o v e a n d a d s o r b e do n t o n i t r o c e l l u l o s e f i l t e r s ( S c h l e i c h e r & S c h u e l l , I n c . ,K e e n e , N . H . ) .G e n e r a l p r o c e d u r e s . L a r g e q u a n t i t i e s o f X g t l l p h a g e DNAw e r e o b t a i n e d f r o m E . c o l i Y 1 0 8 8 b y t h e p r o c e d u r e s o f

M a n i a t i s e t a l . ( 2 2 ) e x c e p t t h a t c e l l s w e r e g r o w n i n s u p e r Lb r o t h ( 3 5 g o f t r y p t o n e , 2 0 g o f y e a s t e x t r a c t , 5 g o f N a C l , a n d5 m l o f 1 N NaOH, e a c h p e r l i t e r ) . R e c o m b i n a n t p h a g e DNAw a s o b t a i n e d b y t h e m e t h o d o f I v a n o v a n d G i g o v a ( 1 7 ) .T o t a l c e l l DNA f r o m s t r e p t o c o c c a l s t r a i n s was o b t a i n e d a sf o l l o w s . C e l l s w e r e g r o w n o v e r n i g h t i n 2 0 0 m l o f T o d d -H e w i t t b r o t h , r e c o v e r e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 , 0 0 0 x g , a n dw a s h e d t w i c e w i t h T E b u f f e r ( 1 0 mM T r i s [ p H 7 . 5 ] , 1 mME D T A ) . T h e c e l l s w e r e s u s p e n d e d i n 2 m l o f T E b u f f e rc o n t a i n i n g 2 0 mg o f l y s o z y m e ( S i g m a ) p e r m l a n d 5 0 , u g o fN - a c e t y l m u r a m i d a s e SG ( S e i k a g a k u Kogyo C o . ) p e r m l a n di n c u b a t e d a t 3 7 C f o r 1 h . On e m i l l i l i t e r o f T E b u f f e rc o n t a i n i n g 1 0 mg o f p r e i n c u b a t e d p r o n a s e was a d d e d , a n dt h e m i x t u r e was i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n a t 3 7 C . T h e c e l l s w e r el y s e d w i t h 1 m l o f a 20% SD S s o l u t i o n , a d j u s t e d t o 5 0 mMN a C l , p h e n o l e x t r a c t e d t h r e e t i m e s , c h l o r o f o r m e x t r a c t e dt w i c e , a n d e t h e r e x t r a c t e d s e v e r a l t i m e s . T h e DNA wasf i n a l l y p u r i f i e d b y c e s i u m c h l o r i d e g r a d i e n t c e n t r i f u g a t i o n .P a c k a g i n g m i x e s o f b a c t e r i o p h a g e l a m b d a w e r e p r e p a r e df r o m E . c o l i BHB2688 a n d BHB2690 a s d e s c r i b e d b y Hohn( 1 5 ) . R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s w e r e p u r c h a s e d f r o m B e t h e s -d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , I n c . , G a i t h e r s b u r g , M d . , o rB o e h r i n g e r M a n n h e i m C o r p . , Ne w Y o r k , N . Y . , a n d w e r eu s e d a s r e c o m m e n d e d b y t h e m a n u f a c t u r e r s .C o n s t r u c t i o n o f p h a g e l i b r a r i e s . S . e q u i CF32 was p a r t i a l l yd i g e s t e d w i t h E c o R I , a n d f r a g m e n t s r a n g i n g f r o m 1 t o 8k i l o b a s e p a i r s w e r e i s o l a t e d o n a s u c r o s e g r a d i e n t ( 2 2 ) . A g t l lDNA was l i g a t e d w i t h T4 DNA l i g a s e ( B o e h r i n g e r Mann-h e i m ) , d i g e s t e d w i t h E c o R I , a n d t r e a t e d w i t h c a l f i n t e s t i n a la l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( B o e h r i n g e r M a n n h e i m ) b e f o r e b e i n gl i g a t e d t o t h e E c o R I f r a g m e n t s o f S . e q u i DNA. T h e l i g a t e dDNA m o l e c u l e s w e r e p a c k a g e d i n t o l a m b d a p h a g e p a r t i c l e sa s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 5 ) .I m m u n o s c r e e n i n g o f r e c o m b i n a n t p h a g e s . R e c o m b i n a n tp h a g e s w e r e p l a t e d o n E . c o l i Y 1 0 9 0 t o g i v e 1 0 0 t o 3 0 0p l a q u e s p e r p l a t e . A f t e r t h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t 4 2 C f o r4 t o 6 h , n i t r o c e l l u l o s e f i l t e r s ( 8 2 mm; S c h l e i c h e r & S c h u e l l )p r e v i o u s l y i m p r e g n a t e d w i t h 1 0 mM IPTG w e r e o v e r l a i d ,a n d t h e p l a t e s were i n c u b a t e d a t 3 7 C f o r a n a d d i t i o n a l 8 t o1 2 h . T h e f i l t e r s w e r e t h e n r e m o v e d , w a s h e d i n NET b u f f e r( 5 0 mM T r i s , 1 5 0 mM N a C l , 5 mM EDTA, 0 . 2 5 % [ w t / v o l ]g e l a t i n , 0 . 0 5 % [ w t / v o l ] T r i t o n X - 1 0 0 [ p H 7 . 4 ] ) f o r 1 h , a n di n c u b a t e d w i t h r a b b i t a n t i s e r u m t o S . e q u i M p r o t e i n f o r a na d d i t i o n a l h o u r . T h e f i l t e r s w e r e t h e n w a s h e d i n NET b u f f e rf o r 3 0 m i n , i n c u b a t e d w i t h a f f i n i t y - p u r i f i e d p e r o x i d a s e -l a b e l e d g o a t a n t i - r a b b i t s e r u m ( Z y m e d C o r p . ) f o r 2 h , a n dd e v e l o p e d w i t h 1 - c h l o r o - 4 - n a p h t h o l . P l a q u e s g i v i n g a p o s i -t i v e s i g n a l w e r e p i c k e d , s u s p e n d e d i n SM medium ( 5 0 mMT r i s [ p H 7 . 5 ] , 1 0 0 mM N a C l , 1 mM M g S O 4 , 0 . 2 % [ w t / v o l ]g e l a t i n ) s a t u r a t e d w i t h c h l o r o f o r m , a n d r e s c r e e n e d u n t i l a l lt h e p l a q u e s i n t h e f i l t e r g a v e a p o s i t i v e s i g n a l . R e c o m b i n a n tp h a g e s w e r e t h e n l y s o g e n i z e d i n t o E . c o l i Y 1 0 8 9 a s d e -s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 3 4 ) .SDS-PAGE a n d i m m u n o b l o t t i n g . S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e le l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) , i m m u n o b l o t t i n g , a n d s t a i n i n gw i t h p e r o x i d a s e - c o n j u g a t e d a n t i b o d y w e r e p e r f o r me d a sd e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 2 ) .I m m u n o d i f f u s i o n . G e l d i f f u s i o n p r e c i p i t i n a n a l y s i s w a sp e r f o r m e d i n a 1% a g a r o s e g e l i n 6 0 mM T r i s - b a r b i t a l b u f f e r( p H 8 . 8 ) . P l a t e s w e r e i n c u b a t e d a t room t e m p e r a t u r e a n dr e a d a f t e r 2 4 h .A s s a y f o r b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y . T h e a s s a y f o r b a c t e r i c i d a la c t i v i t y was p e r f o r m e d w i t h e q u i n e l e u k o c y t e s a s d e s c r i b e dp r e v i o u s l y ( 1 2 ) .A b s o r p t i o n o f t e s t s e r u m . A 1 0 0 - p A l p o r t i o n o f a 1 / 1 0d i l u t i o n o f r a b b i t a n t i s e r u m t o S . e q u i M p r o t e i n was

I N F E C T . I M M U N .

8/3/2019 Protein M SE

3/7

MOLECULAR ANALYSIS AND CLONING OF S . EQUI M PROTEIN

A B C- 97-68

- 4 5

-29

F I G . 1 . I m m u n o d i f f u s i o n r e a c t i o n s o f l y s a t e s o f E . c o l i1 0 8 9 ( A g t l l ) ( s p o t A ) a n d 1 0 8 9 ( A g t l l / S E M 7 ) ( s p o t B ) a n d a c i d e x t r a c to f S . e q u i ( s p o t C ) w i t h S . e q u i M p r o t e i n a n t i s e r u m ( D ) . L y s at e s o fE . c o l i 1 0 8 9 ( A g t l l / S E M 7 ) c o n t a i n i n g t h e M p r o t e i n o f S . e q u i f o r m e da l i n e o f i d e n t i t y w i t h t h e S . e q u i a c i d e x t r a c t , w h e r e a s l y s a t e s o f t h en e g a t i v e c o n t r o l E . c o l i 1 0 89 ( A gt l l ) d id n o t s h o w a n y r e a c t i v i t y .i n c u b a t e d w i t h 1 0 0 R I o f X g t l l / S E M 7 o r X g t l l l y s o g e nl y s a t e s ( t o t a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n , 5 m g / m l ) w i t h s l o wr o t a t i o n a t 3 7 C f o r 1 h . A n t i g e n - a n t i b o d y c o m p l e x e s w e r es e p a r a t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 0 , 0 0 0 x g f o r 2 0 m i n , a n d t h es u p e r n a t a n t s w e r e u s e d i n t h e a s s a y f o r b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y .S o u t h e r n b l o t t i n g a n d D NA h y b r i d i z a t i o n . E c o R I - d i g e s t e dc h r o m o s o m a l DNA was t r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l l u l o s e mem-b r a n e s a s d e s c r i b e d b y S o u t h e r n ( 2 7 ) . S . e q u i c l o n e d DNAf r a g m e n t s w e r e i s o l a t e d f r o m a l o w - t e m p e r a t u r e a g a r o s e g e l( S e a p l a q u e ; F MC C o r p . , M a r i n e C o l l o i d s D i v . , R o c k l a n d ,M a i n e ) a s d e s c r i b e d b y S t r u h l ( 2 8 ) a n d l a b e l e d w i t h[ 3 2 P ] d C T P b y n i c k t r a n s l a t i o n . H y b r i d i z a t i o n w a s p e r f o r m e da s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( 2 2 ) .

RESULTSC l o n i n g t h e M p r o t e i n g e n e o f S . e q u i i n E . c o l i . F r a g m e n t s( 1 t o 8 k i l o b a s e p a i r s ) o f E c o R I - d i ge s t e d S . e q u i C F 3 2 t o t a lc e l l DNA w e r e l i g a t e d i n t o t h e E c o R I s i t e o f A g t l l . A f t e r i nv i t r o p a c k a g i n g o f t h e DNA m o l e c u l e s , t h e p h a g e p a r t i c l e sw e r e p l a t e d o n E . c o l i Y 1 0 9 0 a n d s c r e e n e d f o r t h e p r o d u c t i o no f S . e q u i M p r o t e i n a s d e s c r i b e d a b o v e . A p p r o x i m a t e l y 95%o f t h e p l a q u e s o f t h e X g t l l l i b r a r y w e r e P - g a l a c t o s i d a s en e g a t i v e a s d e t e r m i n e d o n X - G a l ( 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o -l y l - o - D - g a l a c t o p y r a n o s i d e ) p l a t e s a n d w e r e t h e r e f o r e a s -s u m e d t o c o n t a i n i n s e r t s . A p p r o x i m a t e l y 1 0 , 0 0 0 p l a q u e sw e r e s c r e e n e d , a n d 3 p o t e n t i a l l y p o s i t i v e c l o n e s w e r e f o un d,r e s u s p e n d e d i n SM m e d i u m s a t u r a t e d w i t h c h l o r o f o r m , a n d

r e s c r e e n e d . On e was c l e a r l y e x p r e s s i n g t h e S . e q u i Mp r o t e i n d e t e r m i n a n t u p o n r e s c r e e n i n g a n d was l y s o g e n i z e di n t o E . c o l i Y 1 0 8 9 . T h i s h y b r i d p h a g e r e c o m b i n a n t wast e r m e d X g t l l / S E M 7 .I m m u n o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f X g t l l / S E M 7 . A g t l l /SEM7 l y s a t e s f o r m e d a l i n e o f i d e n t i t y w i t h S . e q u i a c i de x t r a c t i n t h e i m m u n o d i f f u s i o n a s s a y when r e a c t e d w i t h S .e q u i M p r o t e i n a n t i s e r u m ( F i g . 1 , w e l l s B a n d C ) . E . c o l iY 1 0 8 9 ( A g t l l ) l y s a t e s , o n t h e o t h e r h a n d , f o r m e d no p r e -c i p i t i n l i n e s when r e a c t e d w i t h a n t i - S . e q u i serum u n d e r t h esame c o n d i t i o n s ( F i g . 1 , w e l l A ) . I m m u n o b l o t a n a l y s e s o fI P T G - i n d u c e d a n d n o n i n d u c e d X g t l l / S E M 7 l y s a t e s a r e

F I G . 2 . SDS-PAGE a n d i m m u n o b l o t a n a l y s i s o f I P T G - i n d u c e d( l a n e A ) a n d n o n i n d u c e d ( l a n e B ) E . c o l i 1 0 8 9 ( A g t l l / S E M 7 ) l y s a t e sc o n t a i n i n g t h e M p r o t e i n o f S . e q u i . L a n e C c o n t a i n e d a l y s a t e f r o mt h e n e g a t i v e c o n t r o l E . c o l i 1 0 8 9 ( X g t l l ) . T h e b l o t w a s d e v e l o p e dw i t h S . e q u i M p r o t e i n a n t i s e r u m a n d p e r o x i d a s e - l a b e l e d g o a ta n t i - r a b b i t s e r u m . T h e n u m b e r s i n t h e m a r g i n a r e m o l e c u l a r w e i g h t si n t h o u s a n d s .s h o w n i n F i g . 2 . T h e c l o n e d M p r o t e i n a p p e a r e d a s t h r e ec l o s e l y s p a c e d p o l y p e p t i d e s w i t h r e l a t i v e m o l ec u l a r w e i g h t so f 5 8 , 0 0 0 , 5 3 , 0 0 0 , a n d 5 0 , 0 0 0 a n d o t h e r l o w e r - m o l e c u l a r -w e i g h t b a n d s ( F i g . 2 , l a n e s A a n d B ) . No d i f f e r e n c e i n t h el e v e l o f e x p r e s s i o n o f i n d u c e d a n d n o n i n d u c e d l y s o g e n s w a sd e t e c t e d , i n d i c a t i n g t h a t t r a n s c r i p t i o n o f t h e p r o t e i n wasi n d e p e n d e n t o f t h e P - g a l a c t o s i d a s e p r o m o t e r p r e s e n t i nA g t l l ( F i g . 2 , l a n e s A a n d B ) . E . c o l i Y 1 0 8 9 ( A g t l l ) l y s a t e sd i d n o t r e a c t w i t h t h e S . e q u i M p r o t e i n a n t i s e r u m ( F i g . 2 ,l a n e C ) . O p s o n i n a b s o r p t i o n s t u d i e s w i t h X g t l l / S E M 7 l y s -a t e s s h o w e d t h a t t h e c l o n e d M p r o t e i n e f f e c t i v e l y r e m o v e do p s o n i c a n t i b o d i e s f r o m S . e q u i M p r o t e i n a n t i s e r u m ( T a b l e1 ) . E . c o l i 1 0 8 9 ( A g t l l ) l y s a t e s d i d n o t a b s o r b o p s o n i c a n t i -b o d i e s f r o m t h e s a m e a n t i s e r u m ( T a b l e 1 ) .P u r p u r a g e n i c d e t e r m i n a n t s i n X g t l l / S E M 7 . To d e t e r m i n ew h e t h e r X g t l l / S E M 7 c o n t a i n e d e p i t o p e s i n v o l v e d i n t h ep a t h o g e n e s i s o f p u r p u r a h e m o r r h a g i c a , l y s a t e s w e r e s e p a -r a t e d i n a n S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l , t r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l -l u l o s e s h e e t s , a n d r e a c t e d w i t h a n a n t i s e r u m m a d e a g a i n s ti m m u n e c o m p l e x e s o b t a i n e d f r o m serum f r o m a h o r s e w i t ha c u t e p u r p u r a h e m o r r h a g i c a . T h e a n t i s e r u m made a g a i n s tTABLE 1 . I n h i b i t i o n o f o p s o n i c a c t i v i t y o f a n t i s e r u m t o S . e q u iM p r o t e i n b y e x t r a c t s o f E . c o l i 1 0 8 9 ( X g t l l / S E M 7 )

T r e a t m e n t CFUaNo a b s o r p t i o n .................. 6E . c o l i 1 0 8 9 ( X g t l l ) b ...................... 2 3E . c o l i 1 0 8 9 ( X g t l l / S E M 7 ) c . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 2 0No o p s o n i z a t i o n ................... 4 1 0

a CF U i n a n a s s a y f o r b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y w i t h h o r s e n e u t r o p h i l s .b N e g a t i v e c o n t r o l .c C a r r i e s t h e M p r o t e i n g e n e o f S . e q u i .

V O L . 5 5 , 1 9 8 7 3 1 8 3

8/3/2019 Protein M SE

4/7

3 1 8 4 GALAN AND TIMONEY

A B 397

2 3 . 74 5

9 . 5

U D. 2 9

F I G . 3 . I m m u n o b l o t a n a l y s i s o f p u r p u r a g e n i c d e t e r m i n a n t s e x -p r e s s e d b y E . c o l i 1 0 8 9 ( X g t l l / S E M 7 ) . L y s a t e s f r o m E . c o l i 1 0 8 9( X g t l l / S E M 7 ) ( l a n e A ) a n d t h e n e g a t i v e c o n t r o l E . c o l i 1 0 8 9 ( X g t l l )( l a n e B ) w e r e s e p a r a t e d o n a n S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l a n d t h e ne l e c t r o p h o r e t i c a l l y t r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l l u l o s e . T h e b l o t was d e -v e l o p e d w i t h a n a n t i s e r u m m a d e a g a i n s t i m m u n e c o m p l e x e s o b -t a i n e d f r o m a h o r s e w i t h ? c u t e p u r p u r a h e m o r r h a g i c a . T h e n u m b e r si n t h e m a r g i n a r e m o l e c u l a r w e i g h t s i n t h o u s a n d s .i m m u n e c o m p l e x e s r e c o g n i z e d t h e s a m e p o l y p e p t i d e s a st h o s e r e c o g n i z e d b y t h e S . e q u i M p r o t e i n a n t i s e r u m ( F i g . 3 ,l a n e A ) . No r e a c t i v i t i e s w e r e d e t e c t e d i n t h e E . c o l i Y 1 0 8 9( A g t l l ) l y s a t e ( F i g . 3 , l a n e B ) .C h ar a ct e ri z a t i o n o f X g t l l / S E M 7 i n s e r t DNA. X g t l l / S E M 7DNA w a s d i g e s t e d w i t h E c o R I a n d s e p a r a t e d o n a n a g a r o s eg e l . T h e s i z e o f t h e i n s e r t was e s t i m a t e d a s 5 . 1 k i l o b a s ep a i r s . T h e i n s e r t DNA w a s i s o l a t e d f r o m l o w - t e m p e r a t u r ea g a r o s e g e l l a b e l e d w i t h [ 3 2 P ] d C T P , a n d u s e d a s a p r o b e i nS o u t h e r n h y b r i d i z a t i o n s t u d i e s . T h e p r o b e h y b r i d i z e d w i t ho n e f r a g m e n t o f 5 . 1 k i l o b a s e p a i r s i n E c o R I d i g e s t s o f t o t a lc e l l DNA o f S . e q u i u n d e r s t r i n g e n t c o n d i t i o n s ( F i g . 4 ) .N a t i v e M p r o t e i n . D i g e s t i o n o f t h e S . e q u i c e l l w a l l w i t hl y s o z y m e a n d N - a c e t y l m u r a m i d a s e SG ( m u t a n o l y s i n ) w a su s e d t o r e l e a s e t h e M p r o t e i n . A W e s t e r n b l o t o f p r o t o p l a s tM p r o t e i n d e v e l o p e d w i t h a n t i s e r u m t o S . e q u i M p r o t e i n i ss h o w n i n F i g . 5 , l a n e B . A l y s a t e o f E . c o l i Y 1 0 8 9( X g t l l / S E M 7 ) e x p r e s s i n g t h e c l o n e d S . e q u i M p r o t e i n g e n ew a s i n c l u d e d f o r c o m p a r i s o n . M u l t i p l e b a n d s w e r e o b s e r v e di n t h e p r o t o p l a s t M p r o t e i n a s w e l l a s t h e r e c o m b i n a n t Mp r o t e i n p r e p a r a t i o n s . M o s t o f t h e r e a c t i v i t y i n t h e p r o t o p l a s tp r e p a r a t i o n w a s d i r e c t e d a g a i n s t t w o p o l y pe p t i de s w i t ha p p r o x i m a t e r e l a t i v e m o l e c u l a r w e i g h t s o f 6 0 , 0 0 0 a n d5 8 , 0 0 0 . L o w e r - m o l e c u l a r - w e i g h t b a n d s o f 5 3 , 0 0 0 a n d 4 9 , 0 0 0w e r e l e s s p r o m i n e n t . A d d i t i o n a l h i g h e r - m o l e c u l a r - w e i g h tb a n d s w e r e a l s o o b s e r v e d . I n t h e r e c o m b i n a n t M p r o t e i np r e p a r a t i o n o n l y t h r e e b a n ds , w i t h a p p r o x i m a t e r e l a t i v em o l e c u l a r w e i g h t s o f 5 8 , 0 0 0 , 5 3 , 0 0 0 , a n d 5 0 , 0 0 0 , w e r e v i s i b l e( F i g . 5 , l a n e A ) .R e a c t i v i t i e s o f a n t i s e r a a g a i n s t e l e c t r o e l u t e d p o l y p e p t i d e s .A c i d - e x t r a c t e d p o l y pe p t id es o f S . e q u i o f 2 9 , 0 0 0 , 4 1 , 0 0 0 , a n d4 6 , 0 0 0 M r S w e r e e l e c t r o e l u t e d f r o m S D S - p o l y a c r y l a m i d eg e l s , a n d a n t i s e r a w e r e p r e p a r e d . A n t i s e r u m a g a i n s t t h e

4 1 3

F I G . 4 . S o u t h e r n h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s o f E c o R I t o t a l c e l l DNAd i g e s t o f S . e q u i C F 3 2 . T h e p r o be w a s a [ 3 2 P ] d C T P - l a b e l e dX g t l l / S E M 7 i n s e r t DNA f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h e S . e q u i M p r o t e i ng e n e . T h e n u m b e r s i n t h e m a r g i n a r e s i z e s i n k i l o b a s e p a i r s .2 9 , 0 0 0 - M r p o l y p ep t i d e r e co g n i z e d s e v e r a l p o l y p e p t i d e s i na c i d e x t r a c t s o f S . e q u i , i n c l u d i n g t h e 4 6 , 0 0 0 - , 4 1 , 0 0 0 - , a n d2 9 , 0 0 0 - M r p o l y p e p t i d e f r a g m e n t s ( F i g . 6 , l a n e A ) . S i m i l a rr e s u l t s w e r e o b t a i n e d w i t h t h e a n t i s e r a a g a i n s t t h e 4 1 , 0 0 0 - M r( l a n e B ) a n d 4 6 , 0 0 0 - d a l t o n ( l a n e C ) p o l y p e p t i d e s . I n a l l

A B

- 9 7

_U.m- 6 8

- 4 5

- 2 9

F I G . 5 . SDS-PAGE a n d i m m u n o b l o t a n a l y s i s o f E . c o l i 1 0 8 9( X g t l l / S E M 7 ) l y s a t e c o n t a i n i n g S . e q u i r e c o m b i n a n t M p r o t e i n ( l a n eA ) a n d n a t i v e M p r o t e i n ( l a n e B ) . T h e b l o t w a s d e v e l o p e d w i t h S .e q u i M p r o t e i n a n t i s e r u m a n d p e r o x i d a s e - l a b e l e d a f f i n i t y - p u r i f i e dg o a t a n t i - r a b b i t s e r u m . T h e n u m b e r s i n t h e m a r g i n a r e m o l e c u l a rw e i g h t s i n t h o u s a n d s .

I N F E C T . IMMUN.

8/3/2019 Protein M SE

5/7

MOLECULAR ANALYSIS AND CLONING OF S . EQUI M PROTEIN 3 1 8 5i n s t a n c e s , p r e i n o c u l a t i o n s e r a s h o w e d n o r e a c t i v i t i e s i nW e s t e r n b l o t s w i t h a c i d e x t r a c t s o f S . e q u i .R e a c t i v i t i e s o f a n t i s e r a a g a i n s t S . e q u i p r o t o p l a s t a n dr e c o m b i n a n t M p r o t e i n . The r e a c t i v i t i e s o f t h e a nt i s er aa g a i n s t p r o t o p l a s t a n d r e c o m b i n a n t M p r o t e i n o f S . e q u i a r es h o w n i n F i g . 7 , l a n e s A a n d B , r e s p e c t i v e l y . B o t h a n t i s e r as h o w e d s i m i l a r r e a c t i v i t i e s a n d r e c o g n i z e d t h e 4 6 , 0 0 0 - ,4 1 , 0 0 0 - , a n d 2 9 , 0 0 0 - M r p o l y p e p t i d e f r a g m e n t s i n a d d i t i o n t oo t h er b a n d s . P r e i n o c u l a t i o n s e r a d i d n o t s h o w a n y r e a c t i v -i t i e s .

DISCUSSIONA l t h o u g h t h e prese nce o f M - l i k e p r o t e i n s i n S . e q u i h a sb e e n p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 2 , 3 , 6 , 2 3 , 3 1 , 3 3 ) , t h e i n f o r m a -t i o n a v a i l a b l e a b o u t t h i s m o l e c u l e h a s b e e n d e r i v e d m o s t l yf r o m s t u d i e s c a r r i e d o u t w i t h a c i d - e x t r a c t e d M p r o t e i n a n dw i t h c u l t u r e s u p e r n a t a n t p r o t e i n . T h u s , l i t t l e i s known a b o u t

t h e n at i v e or n o n d e n a t u r e d f o r m o f t h i s m o l e c u l e . To a v o i dt h e d e g r a d a t i v e e f f e c t s o f a c i d t r e a t m e n t , we u s e d twom u r a l y t i c enzymes t o e x t r a c t t h e M p r o t e i n o f S . e q u i . Mosto f t h e r e a c t i v i t y o f t h e m o n o s p e c i f i c a n t i s e r u m t o S . e q u i Mp r o t e i n was d i re c t e d a g a in s t two c l o s e l y s p a c e d b a n d s w i t ha p p r o x i m a t e m o l e c u l a r w e i g h t s o f 6 0 , 0 0 0 a n d 5 8 , 0 0 0 ( F i g . 5 ) .A d d i t i o n a l b a n d s o f s i g n i f i c a n t l y h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h twere a l s o o b s e r v e d i n t h e p r o t o p l a s t M p r o t e i n p r ep a r at i o n .No c l e a r e x p l a n a t i o n i s a v a i l a b l e f o r t h e m u l t i p l e b a n d i n gp a t t e r n o f t h e M p r o t e i n o f S . e q u i . S i m i l a r m u l t i p l e b a n d i n gp a t t e r n s h a v e b e e n o b s e r v e d f o r t h e n a t i v e M p r o t e i n s o fgroup A ( 1 0 ) a n d group G ( 1 8 ) s t r e p t o c o c c i a n d t h e group AM p r o t e i n p r o d u c e d i n E . c o l i ( 9 , 1 9 , 2 5 ) . A r e c e n t s t u d y i n

A B C

97-

68-

4 5 -t _ 4 1 ~ ~ 4

29 - i 30

18-

F I G . 6 . I m m u n o b l o t s h o w i n g r e a c t i v i t i e s o f a n t i s e r a madea g a i n s t t h e e l e ct r o el u t ed p o l y p e p t i d e s . A c i d e x t r a c t s o f S . e q u i weres e p a r a t e d on an S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l , a n d p r o t e i n s were e l e c -t r o p h o r e t i c a l l y t r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e s . D e v e l o p -me n t was w i t h a n t i s e r a a g a i n s t t h e 2 9 , 0 0 0 - M r p o l y p e p t i d e ( l a n e A ) ,t h e 4 1 , 0 0 0 - M r p o l y p e p t i d e ( l a n e B ) , a n d t h e 4 6 , 0 0 0 - M r p o l y p e p t i d e( l a n e C ) . The a r r o w h e a d s i n d i c a t e t h e l o ca ti o n s o f t h e 3 0 , 0 0 0 - ,4 1 , 0 0 0 - , a n d 4 6 , 0 0 0 - M r p o l y p e p t i d e s . T h e numbers on t h e l e f t( m o l e c u l a r w e i g h t s i n t h o u s a n d s ) i n d i c a t e t h e p o s i t i o n s o f t h em o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s .

4 5 - m 4 6#&u-iW41

29- - O 3O

1 8-. i

i iF I G . 7 . I m m u n o b l o t s h o w i n g r e a c t i v i t i e s o f a n t i s e r a madea g a i n s t n a t i v e ( l a n e A ) a n d r e c o m b i n a n t ( l a n e B ) M p r o t e i n . I n b o t hl a n es t h e a n t i g e n was an a c i d e x t r a c t o f S . e q u i . The a r r o w h e a d s

i n d i c a t e t h e l o c at i o n s o f t h e 3 0 , 0 0 0 - , 4 1 , 0 0 0 - , a n d 4 6 , 0 0 0 - M rp o l y p e p t i d e s . The n u m b e r s on t h e l e f t ( mo l e cu l a r w e i g h t s i n t h o u -s a n d s ) i n d i c a t e t h e p o s i t i o n s o f t h e m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s .ou r l a b o r a t o r y ( 3 1 ) h a s shown t h a t b o t h h i g h - a n d l o w -m o l e c u l a r - w e i g h t f o r m s o f t h e M p r o t e i n are r e l e a s e d i n t ot h e c u l t u r e m e d i u m , t h e g r e a t e s t r e a c t i v i t y b e i n g w i t hp o l y p e p t i d e s o f 6 7 , 0 0 0 a n d 5 8 , 0 0 0 M r s 5 I t i s p o s s i b l e t h a t t h epresence o f h i g h e r - mo l e c u l a r - w e i g h t p o l y p ep t i d es i s ex-p l a i n e d b y r e s i d u a l p e p t i d o g l y c a n a s s o c i a t e d w i t h t h e Mp r o t e i n . F i s c h e t t i e t a l . ( 9 ) h a v e shown t h a t t h e b a n d s o fh i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t on S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l s o f t h eS. p y o g e n e s p r o t o p l a s t M p r o t e i n as c o m p a r e d w i t h t h o s e o ft h e M p r o t e i n p r o d u c e d i n E . c o l i are d u e t o t h e presence o fv a r i o u s amounts o f r e s i d u a l p e p t i d o g l y c a n d e r i v e d f r o m t h ec o v a l e n t a t t a c h m e n t o f t h e M p r o t e i n t o t h e c e l l w a l l . Noe x p l a n a t i o n i s a v a i l a b l e , t h o u g h , f o r t h e m u l t i p l e b a n d i n gp a t t e r n o f S . pyogenes M p r o t e i n p r o d u c e d i n E . c o l i or t h ee q u i v a l e n t l o w e r - m o l e c u l a r - w e i g h t b a n d s o f n a t i v e M p r o -t e i n .We c l o n e d a n d e x p r e s s e d i n E . c o l i t h e M p r o t e i n g e n e o fS. e q u i . The r e c o m b i n a n t p r o t e i n showed a p r e c i p i t i n l i n e o fi d e n t i t y w i t h a p r o t e i n i n an a c i d e x t r a c t o f S . e q u i ( F i g . 1 ,s p o t s B a n d C ) a f t e r r e a c t i o n w i t h r a b b i t a n t i s e r u m s p e c i f i cf o r S . e q u i M p r o t e i n . F u r t h e r m o r e , i t a b s o r b e d o p s o n i ca n t i b o d i e s f r o m an o p s o n i c serum ( T a b l e 1 ) . I n Western b l o ta n a l y s i s , t h r e e c l o s e l y s p a c e d bands w i t h m o l e c u l a r w e i g h t so f 5 8 , 00 0, 5 3 , 00 0, a n d 5 0 , 0 0 0 , a l o n g w i t h o t h e r l o w e r -m o l e c u l a r - w e i g h t b a n ds , were o b s e r v e d ( F i g . 2 ) . No c l e a re x p l a n a t i o n i s a v a i l a b l e f o r t h e m u l t i p l e m o l e c u l a r w e i g h t s o ft h e M p r o t e i n . T he t o p t h r e e bands had m o b i l i t i e s s i m i l a r t ot h o s e o f t h e n a t i v e f o r m o f t h e M p r o t e i n o f S . e q u i ( F i g . 2a n d 5 ) , which s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t t h e c o m p l e t e M p r o t e i n

A B

97-

6 8 - - *

V O L . 5 5 , 1 9 8 7

8/3/2019 Protein M SE

6/7

3 1 8 6 GALAN AND TIMONEYgen e was c l o n e d , b e c a u s e t h e M m o l e c u l e e x t r a c t e d f r o mp r o t o p l a s t s can b e c o n s i de r ed t o b e t h e i n t a c t f o r m o f t h e Mp r o t e i n ( 9 , 3 2 ) . T h e l o w e r - m o l e c u l a r - w e i g h t b a n d s p r o b a b l yr e p r e s e n t d e gr a da t i o n p r o du c t s , s i n c e t h e y were much l e s sa p p a r e n t i n f r e s h p r e p a r a t i o n s ( d a t a n o t s h o w n ) . I n t e r e s t -i n g l y , very s i m i l a r m o l e c u l a r w e i g h t d i s t r i b u t i o n s h a v e b e e no b s e r v e d f o r t h e group A s t r e p t o c o c c a l M p r o t e i n t y p e s 5a n d 6 e x p r e s s e d i n E . c o l i ( 9 , 1 9 , 2 4 , 2 5 ) . F u r t h e r m o r e , weh a v e s h o w n t h a t X g t l l / S E M 7 s h a r e s DNA h o m o l o g y w i t hgroup A s t r e p t o c o c c a l M p r o t e i n t y p e s 5 , 6 , a n d 1 2 i nS o u t h e r n h y b r i d i z a t i o n s t u d i e s p e r f o r m e d u n d e r s t r i n g e n tc o n d i t i o n s ( 1 3 ; J . E . G a l a n , P h . D . t h e s i s , C o r n e l l U n i v e r s i t y ,I t h a c a , N . Y . , 1 9 8 6 ) . S i m i l a r l y , S c o t t e t a l . ( 2 6 ) h a v e shownt h a t t h e M p r o t e i n t y p e 6 gen e o f S . py og e n e s h y b r i d i z e sw i t h group C s t r e p t o c o c c a l DNA.Ou r S o u t h e r n h y b r i d i z a t i o n d a t a are c o n s i s t e n t w i t h t h eh y p o t h e s i s t h a t t h e r e i s o n l y on e copy o f t h e M p r o t e i n g e n ei n t h e genome o f S . e q u i , s i n c e t h e c l o n e d f r a g m e n t h y b r i d -i z e d w i t h on e b a n d i n t h e E c o R I c h r o m o s o m a l d i g e s t o f S .e q u i ( F i g . 4 ) . A s i m i l a r c o n c l u s i o n h a s b e e n r e a c h e d f o r t h egroup A s t r e p t o c o c c u s s e r o t y p e M6 ( 2 6 ) . H o w e v e r , Kehoee t a l . ( 1 9 ) h a v e o b s e r v e d a t l e a s t two c o p i e s o f t h e M5p r o t e i n gen e i n S . p y o g e n e s .We h a v e p r e v i o u s l y d e m o n s t r a t e d t h e presence o f t h e Mp r o t e i n o f S . e q u i i n c i r c u l a t i n g immune c o m p l e x e s o f

purpura h e m o r r h a g i c a , an i m m u n e - c o m p l e x - m e d i a t e d d i s -ease o f t h e h o r s e o f t e n s e e n as a s e q u e l a o f s t r a n g l e s ( 1 1 ) .The i m m u n o b l o t a n a l y s i s shown i n F i g . 3 p r o v i d e s c o n c l u -s i v e e v i d e n c e t h a t t h e d e t e r m i n a n t s o f t h e M p r o t e i n i n -v o l v e d i n t h i s d i s e a s e are e x p r e s s e d i n E . c o l i . E p i t o p em a p p i n g a n d s e q u e n c i n g o f t h e r e c o m b i n a n t M p r o t e i n w i l lh e l p t o b e t t e r d e f i n e t h e d e t e r m i n a n t s i n v o l v ed i n purpurah e m o r r h a g i c a .P r o t e c t i o n a g a i n s t S . pyogenes i n f e c t i o n s i n humans i sc o n s i d e r e d t o b e m e d i a t e d b y serum o p s o n i c a n t i b o d i e s t ot h e M p r o t e i n ( 2 0 ) . I n t h e h o r s e , p r o t e c t i o n a g a i n s t S. e q u ii n f e c t i o n s more c l o s e l y c o r r e l a t e s w i t h m u c o s a l n a s o p h a -r y n g e a l i m m u n o g l o b u l i n A a n d i m m u n o g l o b u l i n G a n t i b o d i e st o s p e c i f i c p o l y p e pt i d e f r a g me n t s , w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s o f4 1 , 0 0 0 a n d 4 6 , 0 0 0 , i n a c i d e x t r a c t s ( 1 2 , 1 4 ) t h a n w i t h serumb a c t e r i c i d a l a n t i b o d i e s ( 2 9 ) . D e t e r m i n a n t s o f t h e M p r o t e i na b l e t o i n d u c e b a c t e r i c i d a l a n t i b o d i e s are p r e s e n t on a2 9 , 0 0 0 - t o 3 0 , 0 0 0 O M r p o l y p e p t i d e f r a g m e n t i n a c i d e x t r a c t s o fS . e q u i . A n t i s e r a a g a i n s t t h e r e c o m b i n a n t a n d p r o t o p l a s t S .e q u i M p r o t e i n s r e c o g n i z e d s e v e r a l p o l y p ep t i de f r a g me n t s i na c i d e x t r a c t s o f S . e q u i , i n c l u d i n g t h o s e o f 4 6 , 00 0, 4 1 , 0 00 ,a n d 2 9 , 0 0 0 M r ( F i g . 7 ) . The s i m i l a r i t i e s i n t h e s p e c i f i c i t y o ft h e s e a n t i s e r a a n d t h e a nt i s er a made a g a i n s t t h e d i f f e r e n tp o l y p e p t i d e f r a g m e n t s e l u t e d f r o m p re p a r at i v e p o l y a cr y l -a m i d e g e l s ( F i g . 6 ) s u g g e s t s t h a t t h e 4 6 , 0 0 0 - , 4 1 , 0 0 0 - , a n d2 9 , 0 0 0 - M r p o l y p e p t i de s s h a r e r e g i o n s o f h o m o l o g y a n d ares i m p l y o v e r l a p p i n g f r a g me n t s o f t h e same m o l e c u l e . M o r e -o v e r , t h e s e r e s u l t s f u r t he r i n di c at e t h a t t h e e n t i r e M p r o t e i ni s p r o d u c e d b y X g t l l / S E M 7 .

A l t h o u g h t h e presence o f an M - l i k e p r o t e i n h a s b e e n w e l ld o c u m e n t e d ( 6 , 2 3 , 3 1 , 3 3 ) , i t s r o l e i n t h e v i r u l e n c e o f S . e q u ii s l e s s c l e a r . U n l i k e t h e s i t u a t i o n w i t h group A s t r e p t o c o c c i ,no M p r o t e i n - n e g a t i v e S . e q u i s t r a i n t h a t c o u l d b e u s e d t os t u d y i t s r o l e i n v i r u l e n c e h a s b e e n i s o l a t e d . T h e f a c t t h a tp r o t e c t i o n a g a i n s t s t r a n g l e s i n t h e h o r s e c o r r e l a t e s w i t h t h epresence o f m u c o s a l n a s o p h a r y n g e a l a n t i b o d i e s t o a c i d -e x t r a c t e d p o l y p e p t i d e s w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s o f 4 1 , 0 0 0 a n d4 6 , 0 0 0 ( 1 2 , 1 4 ) a n d n o t w i t h serum b a c t e r i c i d a l a n t i b o d i e ss u g g e s t s t h a t d e t e r m i n a n t s on t h e s e f r a g m e n t s o f t h e Mp r o t e i n may h a v e an i m p o r t a n t r o l e i n t h e i n i t i a l s t a g e s o fi n f e c t i o n when t h e o r g a n i s m i s a d h e r i n g t o or p e n e t r a t i n g t h e

n a s o p h a r y n g e a l o r b u c c a l m u c o s a , a p h a s e o f p a t h o g e n e s i st h a t p r o b a b l y d o e s n o t i n v o l v e t h e a n t i p h a g o c y t i c p r o p e r t i e so f t h e M p r o t e i n .K n o w l e d g e o f t h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e M p r o t e i ng e n e a n d h e n c e t h e s t r u c t u r e o f t h e M p r o t e i n w i l l a l l o wp r e d i c t i o n o f t h e s t r u c t u r e s o f t h e e p i t o p e s i n v o l v e d i nn a s o p h ar y n g e a l a n t i b o d y r e s p o n s e s . I t s h o u l d a l s o p r o v i d ea n i n s i g h t i n t o why t h e S . e q u i M p r o t e i n , u n l i k e i t s g r o u p A( 1 0 ) a n d G ( 1 8 ) s t r e p t o c o c c a l c o u n t e r p a r t s , i s a n t i g e n i c a l l yh o m o g e n e o u s a n d p r e s e n t s n o s i z e v a r i a t i o n ( G a l a n a n dT i m o n e y , s u b m i t t e d ) . F i n a l l y , i t w i l l b e h e l p f u l t o d e t e r m i n et h e p r e c i s e l o c a t i o n s a n d a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f t h ep u r p u r a g e n i c a n d o p s o n i c d e t e r m i n a n t s o f t h e M p r o t e i n .

ACKNOWLEDGMENTT h i s w o r k w a s s u p p o r t e d b y a g r a n t f r o m t h e U . S . D e p a r t m e n t o fA g r i c u l t u r e A n i m a l H e a l t h R e s e a r c h a n d D e v e l o p m e n t P r o g r a m ,S e c t i o n 1 4 3 3 .

LITERATURE CITED1 . B a z e l e y , P . L . 1 9 4 2 . S t u d i e s w i t h e q u i n e s t r e p t o c o c c i . 4 . C r o s s -i m m u n i t y t o S . e q u i . A us t . V et . J . 1 9 : 1 8 9 - 1 9 4 .2 . B a z e l e y , P . L . 1 9 4 3 . S t u d i e s w i t h e q u i n e s t r e p t o c o c c i . V . Somer e l a t i o n s b e t w e e n v i r u l e n c e o f S . e q u i a n d i m m u n e r e s p o n s e i nt h e h o s t . A us t . V et . J . 1 9 : 6 2 - 8 5 .3 . B a z e l e y , P . L . , S . B a l d w i n , H . D i c k s o n , a n d J . R . T h a y e r . 1 9 4 9 .T h e k e e p i n g q u a l i t i e s o f s t r a n g l e s v a c c i n e . A u s t . V e t . J . 2 5 :1 3 0 - 1 3 3 .4 . D a l e , J . B . , I . O f e k , a n d E . M. B e a c h e y . 1 9 8 0 . H e t e r o g e n e i t y o ft y p e - s p e c i f i c a n d c r o s s r e a c t i v e a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s w i t h i n as i n g l e M p r o t e i n o f g r o u p A s t r e p t o c o c c i . J . E x p . M e d .1 5 1 : 1 0 2 6 - 1 0 3 8 .5 . D a l e , J . B . , J . M. S e y e r , a n d E . H . B e a c h e y . 1 9 8 3 . T y p e - s p e c i f i ci m m u n o g e n i c i t y o f a c h e mi c a l l y s y n t h e si z e d p e p t i d e f r a g m e n t o ft y p e 5 s t r e p t o c o c c a l M p r o t e i n . J . E x p . M e d . 1 5 8 : 1 7 2 7 - 1 7 3 2 .6 . E r i c k s o n , E . D . , a n d N . L . N o r cr o s s . 1 9 7 5 . T h e c e l l s u r f a c ea n t i g e n s o f S t re p t o c o c c u s e q u i . C a n . J . Comp. M e d . 3 9 :1 1 0 - 1 1 5 .7 . E v a n s , D . J . , D . G . W i l l i a m s , a n d D . K . P e t e r s . 1 9 7 3 . G l o m e r u l a rd e p o s i t i o n o f p r o p e r d i n i n H e n o c h - S c h o n l e i n s y n d r o m e a n di d i o p a t h i c f o c a l n e p h r i t i s . B r . M e d . J . 3 : 3 2 6 - 3 2 8 .8 . F i s c h e t t i , V . A . , E . C . G o t s c h l i c h , G . S i v i g l i a , a n d J . B .Z a b r i s k i e . 1 9 7 6 . S t r e p t o c o c c a l M p r o t e i n e x t r a c t e d b y n o n a n i -o n i c d e t e r g e n t . I . P r o p e r t i e s o f t h e a n t i p h a g o c y t i c a n d t y p es p e c i f i c m o l e c u l e s . J . E x p . M e d . 1 4 4 : 3 2 - 4 0 .9 . F i s c h e t t i , V . A . , K . F . J o n e s , B . N . M a n j u l a , a n d J . R . S c o t t .1 9 8 4 . S t r e p t o c o c c a l M 6 p r o t e i n e x p r e s s e d i n E s c h e r i c h i a c o l i :l o c a l i z a t i o n , p u r i f i c a t i o n a n d c o mp a r i s o n w i t h s t r e p t o c o c c a l -d e r i v e d M p r o t e i n . J . E x p . M e d . 1 5 9 : 1 0 8 3 - 1 0 9 5 .1 0 . F i s c h e t t i , V . A . , K . F . J o n e s , a n d J . R . S c o t t . 1 9 8 5 . S i z e v a r i a t i o no f t h e M p r o t e i n i n g r o u p A s t r e p t o c o c c i . J . E x p . M e d . 1 6 1 :1 3 8 4 - 1 4 0 1 .1 1 . G a l a n , J . E . , a n d J . F . T i m o n e y . 1 9 8 5 . Immune c o m p l e x e s i np u r p u r a h e m o r r h a g i c a o f t h e h o r s e c o n t a i n I g A a n d M a n t i g e n o fS t r e p t o c o c c u s e q u i . J . I m m u n o l . 1 3 5 : 3 1 3 4 - 3 1 3 7 .1 2 . G a l a i n , J . E . , a n d J . F . T i m o n e y . 1 9 8 5 . M u c o s a l n a s o p h a r y n g e a li m m u n e r e s p o n s e s o f h o rs e s t o p r o t e i n a n t i g e n s o f S t r ep t o co c -

c u s e q u i . I n f e c t . I m m u n . 4 7 : 6 2 3 - 6 2 8 .1 3 . G a l a n , J . E . , a n d J . F . T i m o n e y . 1 9 8 7 . M o l e c u l a r a n d g e n e t i ca n a l y s i s o f t h e M p r o t e i n o f S t r e p t o c o c c u s e q u i , p . 1 8 1 - 1 8 4 . I nJ . J . F e r r e t t i a n d R . C u r t i s s I I I ( e d . ) , S t r e p t o c o c c a l g e n e t i c s .A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D . C .1 4 . G a l a n , J . E . , J . F . T i m o n e y , a n d F . W. L e n g e m a n n . 1 9 8 6 .P a s s i v e t r a n s f e r o f m u c o s a l a n t i b o d y t o S t r ep t o c o c c u s e q u i i nt h e f o a l . I n f e Q t . I m m u n . 5 4 : 2 0 2 - 2 0 6 .1 5 . H o h n , B . 1 9 7 9 . I n v i t r o p a c k a g i n g o f l a m b d a a n d c o s mi d DNA.M e t h o d s E n z y m o l . 6 8 : 2 9 9 - 3 0 9 .1 6 . H o l l i n g s h e a d , S . K . , V . A . F i s c h e t t i , a n d J . R . S c o t t . 1 9 8 6 .C o m p l e t e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t y p e 6 M p r o t e i n o f t h e g r o u pA s t r e p t o c o c c u s . J . B i o l . C h e m . 2 6 1 : 1 6 7 7 - 1 6 8 6 .

I N F E C T . IMMUN.

8/3/2019 Protein M SE

7/7

MOLECULAR ANALYSIS AND CLONING OF S . EQUI M PROTEIN 3 1 8 71 7 . I v a n o v , I . , a n d L . G i g o v a . 1 9 8 5 . I s o l a t i o n o f X DNA b y h y dr o x y -l a p a t i t e c h r o m a t o g r a p h y . A n a l . B i o c h e m . 1 4 6 : 3 8 9 - 3 9 2 .1 8 . J o n e s , K . F . , a n d V . A . F i s c h e t t i . 1 9 8 7 . B i o l o g i c a l a n d i m m u n o -c h e m i c a l i d e n t i t y o f M p r o t e i n o n g r o u p G s t r e p t o c o c c i w i t h Mp r o t e i n o n g r o u p A s t r e p t o c o c c i . I n f e c t . I m m u n . 5 5 : 5 0 2 - 5 0 6 .1 9 . K e h o e , M. A . , T . P . P o i r i e r , E . H . B e a c h e y , a n d K . N . T i m m i s .1 9 8 5 . C l o n i n g a n d g e n e t i c a n a l y s i s o f s e r o t y pe 5 M p r o t e i nd e t e r m i n a n t o f g r o u p A s t r e p t o c o c c i : e v i d e n c e f o r m u l t i p l e

c o p i e s o f t h e M5 d e t e r m i n a n t i n S t r e p t o c o c c u s p y o g e n e sg e n o m e . I n f e c t . I m m u n . 4 8 : 1 9 0 - 1 9 7 .2 0 . L a n c e f i e l d , R . C . 1 9 6 2 . C u r r e n t k n o w l e d g e o f t y p e - s p e c i f i ca n t i b o d i e s i n man f o l l o w i n g i n f e c t i o n w i t h g r o u p A s t r e p t o c o c c i .J . I m m u n o l . 8 9 : 3 0 7 - 3 1 3 .2 1 . L a n c e f i e l d , R . C . , a n d G . E . P e r l m a n n . 1 9 5 2 . P r e p a r a t i o n s a n dp r o p e r t i e s o f t y p e - s p e c i f i c M a n t i g e n i s o l a t e d f r o m g r o u p A ,t y p e 1 h a e m o l y t i c s t r e p t o c o c c u s . J . E x p . M e d . 9 6 : 7 1 - 8 2 .2 2 . M a n i a t i s , T . , E . F . F r i t s c h , a n d J . S a m b r o o k . 1 9 8 2 . M o l e c u l a rc l o n i n g : a l a b o r a t o r y m a n u a l . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y ,C o l d S pr i n g H ar b o r , N . Y .2 3 . M o o r e , B . O . , a n d J . T . B r y a n s . 1 9 7 0 . T y p e s p e c i f i c a n t i g e n i c i t yo f g r o u p C s t r e p t o c o c c i f r o m d i s e a s e o f t h e h o r s e , p . 2 3 1 - 2 3 8 . I nJ . T . B r y a n s a n d H . G e r b e r ( e d . ) , P r o c e e d i n g s o f t h e S e c o n dI n t e r n a t i o n a l C o n f e r e n c e o n E q u i n e I n f e c t i o u s d i s e a s e s . S .K a r g e r , B a s e l .2 4 . P o i r i e r , T . P . , M. A . K e h o e , J . B . D a l e , K . N . T i m m i s , a n d E . H .B e a c h e y . 1 9 8 5 . E x p r e s s i o n o f p r o t e c t i v e a n d c a r d i a c t i s s u ec r o s s - r e a c t i v e e p i t o p e s o f t y p e 5 s t r e p t o c o c c a l M p r o t e i n i n

E s c i h e r i c h i a c o l i . I n f e c t . I m m u n . 4 8 : 1 9 8 - 2 0 3 .2 5 . S c o t t , J . R . , a n d V . A . F i s c h e t t i . 1 9 8 3 . E x p r e s s i o n o f s t r e p t o c o c -c a l M p r o t e i n i n E s c h e r i c h i a c o l i . S c i e n c e 2 2 1 : 7 5 8 - 7 6 0 .2 6 . S c o t t , J . R . , W. M. P u l l i a m , S . K . H o l l i n g s h e a d , a n d V . A .F i s c h e t t i . 1 9 8 5 . R e l a t i o n s h i p o f M p r o t e i n g e n e s i n g r o u p As t r e p t o c o c c i . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA 8 2 : 1 8 2 2 - 1 8 2 6 .2 7 . S o u t h e r n , E . M. 1 9 7 5 . D e t e c t i o n o f s p e c i f i c s e q u e n c e s amongDNA f r a g m e n t s s e p a r a t e d b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s . J . M o l . B i o l .9 8 : 5 0 3 - 5 1 7 .2 8 . S t r u h l , K . 1 9 8 5 . A r a p i d m e t h o d f o r c r e a t i n g r e c o m b i n a n t DNAm o l e c u l e s . B i o T e c h n i q u e s 3 : 4 5 2 - 4 5 3 .2 9 . T i m o n e y , J . F . , a n d D . E g g e r s . 1 9 8 5 . S e r u m b a c t e r i c i d a l r e -s p o n s e s t o S t r e p t o c o c c u s c q i o f h o r s e s f o l l o w i n g i n f e c t i o n o rv a c c i n a t i o n . E q u i n e V e t . J . 1 7 : 3 0 6 - 3 1 0 .3 0 . T i m o n e y , J . F . , P . J . T i m o n e y , a n d K . C . S t r i c k l a n d . 1 9 8 4 .L y s o g e n y a n d t h e i m m u n o l o g i c a l l y r e a c t i v e p r o t e i n s o f S t r e p -t o c o c c u s e q l u i . V e t . R e c. 1 1 5 :1 4 8 - 1 4 9 .3 1 . T i m o n e y , J . F . , a n d J . T r a c h m a n . 1 9 8 5 . I m m u n o l o g i c a l l y r e a c -t i v e p r o t e i n s o f S t r e p t o c o c c u s e q i u i . I n f e c t . Immun. 4 8 : 2 9 - 3 4 .3 2 . Van D e R i j n , I . , a n d V . A . F i s c h e t t i . 1 9 8 1 . I m m u n o c h e m i c a la n a l y s i s o f i n t a c t M p r o t e i n s e c r e t e d f r o m c e l l w a l l - l e s s s t r e p -t o c o c c i . I n f e c t . I m m u n . 3 2 : 8 6 - 9 1 .3 3 . W o o l c o c k , J . B . 1 9 7 4 . P u r i f i c a t i o n a n d a n t i g e n i c i t y o f a n M - l i k ep r o t e i n o f S t r e p t o c o c c u s e q u i . I n f e c t . I m m u n . 1 0 : 1 1 6 - 1 2 2 .3 4 . Y o u n g , R . A . , a n d R . W. D a v i s . 1 9 8 3 . E f f i c i e n t i s o l a t i o n o f g e n e sb y u s i n g a n t i b o d y p r o b e s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U SA8 0 : 1 1 9 4 - 1 1 9 8 .

V O L . 5 5 , 1 9 8 7