+ All Categories
Home > Science > Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

Date post: 28-Aug-2014
Category:
Upload: arthur-coleman
View: 134 times
Download: 9 times
Share this document with a friend
Description:
The book will include a theoretical introduction, comprehensive practical section complete with worked examples, a unique troubles-hooting section designed to answer many of the frequently asked questions regarding proteome analysis and a thorough reference list to guide the interested reader to further detail. The theoretical section will introduce the fundamentals behind the techniques currently being used in proteomics today and describe how the techniques are used for proteome analysis.
Popular Tags:
329
Reiner Westermeier, Tom Naven Proteomics in Practice Proteomics in Practice: A Laboratory Manual of Proteome Analysis Reiner Westermeier, Tom Naven Copyright 2002 Wiley-VCH Verlag GmbH ISBNs: 3-527-30354-5 (Hardcover); 3-527-60017-5 (Electronic)
Transcript
Page 1: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������ ����������

�� ������������� � ��������

��������� � ��������� ���������� ����� �� �������� ���������� ���������� �� ����

��������� � ���� ��������� ������ ����� �! "�#�$�"�"#%�# &���'(����)* "�#�$�+��,$�# &-��(�����()

Page 2: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� ����� �� ���� ����

������ ����������

� ����������� � ������������� ������

�� "�#�$�"�"���+

Page 3: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��������� � ��������

�� ������� ������ ��������� �������

������ ������������ ����

��������� � ��������� ���������� ����� �� �������� ���������� ���������� �� ����

��������� � ���� ��������� ������ ����� �! "�#�$�"�"#%�# &���'(����)* "�#�$�+��,$�# &-��(�����()

Page 4: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� ����� ����������� �� �����.������ ���(���(�� -/���� ���0/�1����� ���2 3$3,,, 4����/��������

� ���� ���� �� �� ���� �������� �������������� ������ �� ��������� �� �������� ��� �� ������� ������� ������� ���� ��� � ������� ������ �� ������ �� ������ ���� ��� ���������� ��� ��������������������� ������ �� ����� ����� �� ������������� �� �������

������� �� ���� ��� ���� ������� ���

����� � ����������������������������������������� ����� �� ���� ���� �� ������ ��� ���������� �������

��� ���� ��� ���������� � �� ���������������������� ������ ������ ����� �� ������ ��� �� ������ �����������

���������� ����������������� ����

.�� ������ �������' &��(�/'��� ����� �5����������� �� ����� ����/����)2 � ���� �5 ���� ���6 �� �� �����'/(�' ����� 5�� 7 �� ������������� �(��5�� ����� ����� ���� 7 ��� ���������' �����������' ���� � �(���� ����/��� 8����/�8������ ��������� 5�� ��� �/�������2���������' ���� ���'���6� ��(2 /��' ������ ���6 ���� 8��� ��� ���(�5�(���� ��6�'�� �/(� ��� ��� �� �� (����'���' /������(��'�� ��82

������' �� ��� 4�'���� ���/���( �5 ������������' �� �(�'�5��� �����2

���� ���� !"�� # $���� %� ����&��'� (������������� ������ ������ &��'� ��������������� )� %�* �� &��' # +�� !&�&�"�����

� �� "�#�$�"�"#%�#

��������� � ��������� ���������� ����� �� �������� ���������� ���������� �� ����

��������� � ���� ��������� ������ ����� �! "�#�$�"�"#%�# &���'(����)* "�#�$�+��,$�# &-��(�����()

Page 5: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� ��

����� ��

� ���������� ��� ��� ����� ����

������� � ����� ����

���� �� �������� �������� �

� ���������� �

��� ���������� ������� �

��� �������� �� ����� ������� �

��� ������ �

��� ����� �������� �

��� ����� ����� ������ �

��� ��������� ��� ������ �

��! "������� ������� �

� !"������ "������� ��

��� #$%���������� &����������� ��

����� &'���� �� �%� ������� �

����� ������ ��������� �

����� "��� ��������( ��������� ������ �

����� ����� ��������( ���%)�*& �

����� ������ ����� ��� ��

����� ����� �������� ��

��� �� �������� ��

����� �� ����� ��

����� )���� ����'��� ���

��� +��� ��������� ���

����� ������� ��

����� �� �������� ���

#������

� �������� �� � ������� � ���� ��� � ������ �� � ������ ��������,����� -���������. #� /�'��

������� 0 �11� -����%2�3 2����� *�43��5/�( �%��!%�1���%� 63����'��78 �%��!%�11�!%� 6&�������7

Page 6: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��

����� #����� ���� ��������� 6+�9+�7 �

��� )���� ����� ����� 4� ���4��� ��������� �

����� )����� ���� ��������� � �

����� )����� ���� ������������ ��4���� $�� ��������� ����� � �

����� )����� ���� ��������� ��4���� $�� ������ ��:������� ����� � �

����� )���� �� +�9+� ��:����� ��� �!

����� �� �' ��:������� �!

��� +���� ����� �������� �!

����� ��%+� �!

����� ;�%+�9+� ��

����� <������'� ������� ��

���� �� #���� $����� ���

%��"����� #����� ���� &������� ��

'��" �� '��"�� "��"������ ���

� ��= ������ ���

� &������� ��

� +����������� ��

� )��������� ���

� 5���� ������ ���

� 2��� ������4�� ������ ��

! <���� ����� ��!

> ��� ������� � 3+- ������ �������� ���

'��" �� ���������� ������� ���

� ,��$������ ��� ���

� ,�������� ������ ��� �&" �� �)*��� ���� ������ ���

� �&" �� �� ��� ������ ���� ����� 6��������� ����� �����7 ��

� ��� ������ �&" ��!

� ������� �)* ����� ���

'��" (� ')' ������������� ��� �����"������ ���

� ������ ��� ������������� ���� ���

��� ��= ������ ���

��� ������� � ��4���� ���� ���� ��

��� +������ *�� ����� 6�� �� ����7 �

����� 3������� ���� �!

����� *������ ���� ��

��� *�� ����� � �� ��� ���� �

� �������� �����%���� ���� �� ������� ��

� )�������� �� ��� ������������ �:������

��������

Page 7: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���

��� ��= ������ � �� ������� 4� ���

��� ����� �� �� �������� ����%������� ��������

��� ����� �� �� ��� ��� ��������

� &:����4���� �� �)* ����� ��� ���� �� �� ��� ���� !

��� &:����4���� !

��� ��������� �� �)* ����� � �� ��� ���� !

��� ��������� �������� $���� ���=�� ������ ��� �%� ������� �

��� ���� �� �)* ���� ��� �� ��� ��� �

� #�� ��� ������������ ��� �

��� #�� �������� ����%������� �������� �

��� #�� ���%��� �������� $�� ������� �$�� ������ �

'��" *� '������� � ��� ����

� ������� ������� 5������� 5��� �������

��� ������

��� ������� !

� 3 ������� 5������� 5��� ������� !

� ���'�� �������

� "���������� ������� �

� )�����'��� ��� ������ ���� �

'��" +� '������� � ���� ��� ����� �������� �

� �������� �

��� *��� ������ $�� '���4�� ���� �

��� �������� �������� ���� !�

� �� ������ ��� 4��=����� ��������� !�

��� ������ �� ������ !�

��� �� ������� !

��� �� ������ !

��� 5��=����� ������� !

� &'������ �%� ������ !

��� ,� ������ ��� !

��� ������ ��� ������� !!

��� /��������� !

��� �� ��� +� ����4���� !

��� �� ������ ���� !�

��� �'������ ���� !�

��! <���� ����� !�

��> ������� ����� !�

��? �� ���=��� !�

'��" ,� ����������� ���������� ��� ������"������ !�

� )�������� � ���� ����� �����4�� $�� ����� ��4������ �

� ,��������� �� ��= ����� �� ������� ������� 6�+"7 �

� )�������� ����� ����� ���� ��4�� ������

��������

Page 8: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����

'��" -� '"� �!�����

'��" .� '��"�� ���������� �

'��" /� ��0��� �������� ��

'��" �1� $�������� ��������� ��� ����������� � ���"�� �

'��" ��� #������� ������������� � ��� "�"���� ������ �

'��" ��� $' �������� ��

'��" �(� #��� ����� � ��� $�2)�0�� $' �

'��" �*� ���"����� �� � ���� ��� ������ ��

'��" �+� �$� ���� ��� ������ ������������ ��

� ��� �� ������ �

� #$%���������� &����������� �

��� ��������� ������ �� �)* ����� �

��� ��� )�*& �

��� ������� ��

��� ��*& ���������� ��4������ ��

��� ,����� �� �%� ������������ ��

� +��� ��������� ��

&��������� �

����! ��

��������

Page 9: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� ������� �� � ������� � � ����� � �� � ��� ��� ���� ��� ����� ������ ��� ���� ��� ������ ���� �� ��� ���������� �������� �� � ����� �� ��� ����� ���� ��� ��� ���� ����� ���� �� ������ �� ��� ���� ��� ���� � �� ��� �������� ������� ��� ���� ����� �������� ����� � �� ��� ������� ����� �� �� ������� � �������� ����� ��� � ������ ��� ��� �� ��� ���� �� � ��� ��������� ���������� ���� ��� ������ � ���� ����� �� �������� ���� ������

� ������ ������ �������� ��� �� ��� ��������� � �� �� � ������������� ������ ������� �� ����� ���� �� ��� � � ������ ����� ������� ��� ��� � ������ ������� ��� � ��� ���� ��� ���� ����� ���� ��� ��� ����� ���� �� �� ��� ��������� ���� ����� ������ ��� �� ����� ��� ������������ ����� ���

����� ��� �� ����� ���� ���� � � ������� ����� ��� ���� ����� ��� ����� ��� � � ���� �� � ������ ��������

!���� � ��� � ������ ������� �� ��� ���� ��� ��� ��� ��� ���� ������� �������� ��� ��� ������ ����� �� ��� ��� �� ��� ������������ �� ��� ����� ���� ��� ��� ���� ����� ���� �� ��� ����� ���� ���� ���� ��� ���� ���������� ������ �� ������ � � ������ ����� ����� �� �������� ��� ���������� "�� ������� �� ��� ����������� �� �� ����� �� ��� ����� ���� ��� ��� ���� ������� ��� ����� ����� � � ������ ������ #���� ������� ��� ��� ����� �� ��������� ���� �� �� ����� ��������� ��� ��� �� ������ �� ����������� ���� ���������� ��� �� ��������� ��� � ������ ������ �� ������� � � � ����� � ��� �� ������� ���� ��� ���� ����$�� �� � ����� �� ��� �� ��� ������� �� ��� %&���� ���� ��� � � �����'���� ����� ��� ������� ���� ���� � ��� �� ������ � � ������ ������ ���� �� � � ��� ���� ��� �� ��� ������ ��� ���� �� ��� ������� ����� ������ ��� �� ������� ������ ���� � ����� ��� �������� ������ ������ �� � ������� � ��� ����� �� ����� ��� ������ ������� (� ��� ���� ���� ���������� ��� �� ������ ���� ����� ������ ��� ��� %��� ���' ������������ ���������� ����

��

�������

��������� � ��������� ���������� ����� �� �������� ����)��� *���� ��� � ��� +���

,��� ��� - �..� *����/,! /� ��� 0��!(#1+�2 3�4�5�3.346�4 7!� ���� 89 3�4�5�:..;5�4 7&���� ���8

Page 10: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�������

������ ��� ���� ������ � ����� �� � � ��� ���� �� ��� � �� �� ��������� ��� ������� �������� ���� ���������� ����� � ���� ����� ��� ������ ��� ����� ���� ��� ������� ��

������ ���������� ���������� ���� �� ������� ������ ��� ������������� � �� ���� �� ������ �� � �������� "� ���� ��� ���� �������������� ��� � ������ ����� ����� ��� �� ��� ����� � � �������� � � ����� ���� ������ "�� ������ �� ��������� � �������� � ���� � ��� ��� ���� � ����� �� � � ���� ����������� ������������ ��� �� ����� � � ���� ������

"� ��� �������� ����������� � ��� ���� � � � ������� �� �������� �������� �� ��� ���� ���� �� �� ������� �� � ��� ������� ��� ���� ��� ��� ������ �� � ������� �� *(<&=�/,!2 ����2>>���3����� ���������������>??????� ���� ��� ������ ��� ������� ������� � ��� ������

)��� *���� ��� ��� +��� @���� � �..�

��� ���@�� "�������� ��� 1� ������� ������ 1��� �� @���� 1A����� B� �<����� ��� C������ B�� ������������ #������ )������� 0A��� ����������

Page 11: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��

��������� � � � ������� ���� ������ ����� ��� � �� �� � ���������� �� ��� ���� ���� ��� ����� � ������� �� ������� ������� � ����� �������� ����� �� ������� ��� ���������� ������ �� ���� ��� ��� ��� ��������� �� ����� �� � ���������� ��������� ��� ���� ��� ���� �������� � ���� �� ������������ �� � ��� �� ���� ��������� �� �������� � ����������������� ���� � ����� �� ���������� � �� ������������ � �������������� ������� ���� ��� ����� � ������ ������ � ������� � � ���� � � ����� �� � �� �������� �� ������ � ������������ � � ������ � ����� �� ��� ������ � ��������� � ���� �� ��� �������� ���� ���������� ��� �� �� ������ ����� ������� ��� ���� ���� � �������� ���������� �� ����� �� � ����� ���������� �� ��� �� ��� ��� �� ��� ����� � ����� � ��� ���� �

��� ���� �� ��������� �� �� ��� � � �������� ��� ����� ���������! ������� ���������� �������� ��������� � �������������� ������������� ��� ���� ����� �������� � ����� ���������� � ��� ������� ���������� � �������� ������� �� ���������� ����� ��� ���� ������ ����������� ����� � � ����������� �� ������ ��� � � ����� � ������ �� � ����� ������ ������� ���� � ���� ���������� "������ ��������� ������ � ��� ��� � ��� �� �� � ��������� ��������� � � ��� ������� ������ �� ������� � ������ �������� � ����������� ���� ���� ��� ��� ������������ #������� ��� ���� �� ��������� � ������������ ������ ��� ���� �� � ������ ���� ��� �� ������ �������������� ����� � �� ��� ��� ���� �� ����� ��� � ������ �� �� ������ ��� ��� ���������� � ����� ������ ������ � ��� ���������� $�% ����� � ������ �� ����������� �������� ��������� � ����������� ���� ����� ��� ���� �� ��������� �� ���������� ������� � ��� ��� ��� ��

"�� ����� $�% ��� ���� ���� � �� ����� ������� �� � ���� ����� ����� �� �� ���������� �� ��� ���� � ��� �� ���� ���� ����������� ����� ����� $�% ��� � ��� �� ��� ���� �� ���������� � ��� ������ �������� �� $�% ��� � ����� �������� &����

��������

��������� � ��������� ���������� ����� �� �������� ����'���� &���������� ��� (���

)�������� * $++$ &�����,)- ,����� .��-�/0(! 1�2$3�1+124�2 5-�� �����67 1�2$3�8++93�2 5"��������6

Page 12: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��������

��$�% ��� ��� ��������� ��� � ������ ���������� � ������ ������� ����� ��� ��������� � ����� � 5� ����� �� �������6 �������� ��� ����� ��� ���� � � ��������� ���� � �������������� �� $�% ��� ��� ������ �������� �������� �� ��� �� �������)������� � ���� � ����� � ����� :� ������ ������; ��������� ��������� �� ������� ���� ����������� ����� $�% ��� ���� ����� ������ ��������� �� ��� ����� ���� � �� � �������� ����� �� -������ ����� ����� ����� �� ��� ���������� ����������� ��� $�% ��� � ��� �� �������� ��� ���������� � �������� ���������������� ���� ��� ��������� � �� � ���� :���; � �� � �� ���� ��� ������� $�% ���� ����� � ��� ��� �� ������ ��� ��������� �� ��� �������� �� � ��������� ���� (������ :�����; �� ���� ����� � ��� ����� ��� ���� � ����� ��������� "������� ���� � ������������� ���� �� ����� �������� ���������� ������ �� ����� � � ��� ���� ���� ��� ��������� �� ����������� ���� ������� ��������� � ���� ���� ��� ���� �� ��� � ��� �������� �� �� �� ������ ��� ��� ������� ����� ���� �� �� ������������� ����� ����� ���� �������� � ������ � ���������������� ��� ���� � ��� � �� ����������� ������������ ��� ���� ������� ��� ���� �

# �������� ���������� �� ��� ���� � ��� ���� � ����� �������� ������ �� ��� $�% ��� � �� ����������� ���� ����������� � �� � ���� �� �� ������ ���� �������� � �� ������������ ���� ��� ��� ����� ������ � ��� ��������� ����� �� ���������� ��� ���� ������� $�% ���� ��� ������ �������� ����� ��� ������ � � ����� ���� �� ����� � ��� �� ���� � ������������ � ������ ��������� �� ����� ����� ����� � �� ��������������� $�% ��� � �� ������������ � �� �� ����������� ���� ��� ���� ��� ���� ���� ���� � �������� ���������� �� ��� ������� �� ��� ���� �� ��� ���� ������� ������ � �������������� ��� ����� ��� ����������� # ��� ���� � ������� �������� ������� ������� �� ��� ���� �� �������� �� ���� ��� ���� �������

/�� -��� <%� ��%%�������� �� �� ������# 2$+ </'0�=������� �� <������# #���� <� 4>9+?=/#

���

Page 13: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����

��� ���������� � ����� ���� ��� ���������� ���� ���������� � ���� ���� ��� ���������� �� ������������ ���� ��� ���� ��� ���� ��� ���� ������ �� ������ !��"�����#��� #��� ���$% ������� � ������� � "�� ��$� ���� �� �����#����& �!��!���� �� ���'���� ���"��� �����������(���������� ��

���� ����� � �������������� ��� � )� )�����������! �������� ���*��� ��� � ���� �� ������ ������ ��! ���� � ��$� ������� !������ �+ �� ����� ��!�� �� ����� �, �� #���� -./�� ���� ����� ��� ���� #��������� ���0 �������� ��� �� # ��� ���$� 1�2������(���� �3��������#� � �� ���� ����� � !� �� ��� !������ ������������ ��+ ���4�$� 1�21������ ����3� ���������� ���

���� ���#������ �� ����� ���������� ��%� ��� � � ������ � ��� �� ���� ������������0 ���!(���������05 ������� �������� �� ��� ���,������6 ����������� ������� ���������� �� !�� ���� ������� ����!���

���������� � ����� � ���

��������� � ��������� ���������� ����� �� �������� ����7� ��� 5������� ��� �� )�+��

��� ��� 8 �99� 5 ����:�4 :����� ��!4%��)�; 1�<�=�191<>�< 24����+��3? 1�<�=�'99�=�< 2������� �3

Page 14: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������������ � ����� ����

��0 � �"!��"��(���������7� � ##����� �� � ���� ��+���� ������� � ���� � �������� ������ � ������� ���������� ������� �� ���� ��� ��� ���������� ���<��4� ��<�� ����(�!��" � �� �� �� � ���� �����0 � ������ #���� ���0�� � ���������#( ���)� ���(�� !����� � �� �� ��� �� ������ � �� ������� ����� � �� ���� ��� ��� �������� � :@������ ��������� �� ����������� � �� ���% ���������� � "�� ���� �(������ ��A����� ��� �� ��� ��� !�!������� ��%�7 �� �� �����#�� B %� ������� ���������*$ �� ��!����� ���� ���0$ �� ����#����� �� ���� ��� 4��4��� �������>�����(�� ���� � �� �4�)� 4�� �� ���4�$�� )�������(������ ���" ���)�������������

���#� � �� �405 4 �� 0������� 5� ���4$*� 4 �� $��#������ * A� � �����������% ������� ��� ��%��� %��� ���� �## � �� ����%� %������� � #��� ��%�� %������!�� � �%$� %��! � "�� 4 ���� ����%�$ %��������� �,� C �!����,�� C �������*� * A� � �����������*05 *� 0������� 5� ���*�� * � � # ������ �*5� *�!����� ��,#�� ������0 ������ 0 �� �����0�*�% 0��� ( ��� ���� ����� ����� � � "�� �� � 0 ������@* 0������� ���� �� � ���

���

Page 15: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������������ � ����� ����

�� 7���� +� ���������� � �! � ���7)� ��������� 7)�0� 0��� ����������0�� ������ ���� ���������� ����� � � �������

���� �0�@0� ������ ���� ����������0� ����� +� �������� ������� ����@������ ��� 2(��( � � � ���� �������3)� ��� )�� � � ���������)�$4�� )� �A� � !� �� 4 ���� ��� ���������� �)4� ������(� ���� � � ��)7 )� ����������6�6 �� ��� ���� ��$ $��� � 5$�� $��������� �� ���$��� $��������� �� ��� ���������� �$��%� $��������� �� ��� ������� � #��� ��$�� $������ !�##���� ��� ��$�� $���������� �����% %������� � ��C +���� � ��� �� � �������$0 $�� �� ���� # ����� ��$0� $���������������#��� #��� ��$$� $ �� � � � ��� ��� ���� �� � �� � 2������� # ���� ��������3$�� $�� ����� �����$�0 $����������� ��� �� # ��� �$:� $��+ ������� ��$:� $��+ ��� ���� � #��� ��D�� A������� � ���#�#� ���� 0������� ��� ��7# +���� 7���� +� � ������ # � ���� �7� 7���� +� ���������� � �! � ��7)� 7 !����� � �� �7$ 7�+����� $������ ��+��� �� �� � ����7��$� 7����� �� %% �� � 2!������������ ��

� ���#����3� �������� �� �� ������ ���#����@) � ����@� �� ��� � ���� ������� �� ��������� � -./� � ��� � �� � �� ���� �� � !�##���� ��� ����� �� �������� � �� �

��

Page 16: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������������ � ����� ����

��0�� )�)�)��)���������������������� �� ���4$$ �� �2����(����3��� ��� � �� # � ����� � �� )��� �2����(�������3������� ���� ���� � �� �2����(�������3��� �������& :��: :���� � *+ ���� # � ��� � � �@�+@+ :���� �� +����5 5����@+ 5� ��� �� +���� 2���� ��������� �3

���

Page 17: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����

���� ��������

������ ��� ������ ��� ��� ������������� �������� � ��������� ���� ���� �������� �������� ����� ��� ��� ����� ������������ ��� ���� ������ ��� ���� ����� ���

����� ���� ��� �������� �� ��� ������������������� ���������������

!������� ��� ������ �� ������� � "# �� "## �$�%����� ����� �& ��������� ��� ���� �� ��� ���� �����������

�����$� ������������$��

<2093.8>

average molecular weight

'�� ���� � � �������� � � $���� ��������� ���������������� ����$ ��� �����$� ������ ���$��� ������ �������� �� �����$� ���� �� �������� ��%�( )�'*+�%, ���� � ��� �� ��� �������������������� -��� ������������� ��������� ���$��.�

/��$����� ����������� '�� ������� �� ����� ��� ���$����� -�������� ����������� �����. �� ����������� ������$ ��� ���� �������� ����� �� ��� ���� ������

/��� ��� '�� ���� ������� ��� �� � ���� ��������� � ������������ �� ������� �������0�� �� ���� ���� ��� ����� ��������� � "##1�

��������� � �������� ���� �� ��� ����������� � �� ������������

����������� � ������� ����� ���� ������ ��� ����$��� �� ��������� ����� '�� ������� �� �� ������� ��� ���� ��������� � �� %, �����������

������ �� � ��

��������� � ��������� ���������� ����� �� �������� ��������� 2����������� '�� �����

������$�� 3 �##� 2�����4�& 4����$ 5��&),/��6 7�8�9�7#78:�8 -&��������.; 7�8�9�<##"9�8 -=���������.

Page 18: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�������� �� ���

���� ��������

���������� ���� ��� '�� ���������� ���� ��� �� ������� �� ��� ���$���������� � ���� � ��� ��� ��� ����

��������� ������������������� -�) .

� ������� ������� �� ��� � ��������� ��� ������������� �� ��������� ��������� ������� ��� ��$������ ������������ ���� �� ����� $�� ������ ��� ���� ��������������

����� - �. ��������$ �� ��� $��������� � ��� ,)� ��� ��� � ������� ����� �� "�<<#" > "#?�9 $ �� �� ���$�� ������������� &������ �� �� ����� � ������� ���� �� ��������������

��$���� ��� -���������� �� ��$���� ���.

�� ��� ��������$ ��� �) ��� ����� �� � ������������ �����$ � ������� ��� %,@%, ���������

�$������ ������$� � ���A��� ������� �� ����������� ��0�������������$ ������� ��� �������������

���� ������� ������ ,����� ����������� ������ �� %�( )�'*+ %,���������� �� ��������� ������� ��$���� ��� ��� ���$�����������

=����������� ����������-=,).

�� ���������� ������B��� ����� ������� ��� ��������� � ���� ��� ��������� �������� ��� ������� ����������� '�� ���� ����� �� ���� ������� ��� �������������� �������� ����$��� �������� ������� ������������� ������� � ������ ���� ������������ -%,@%,.� )� �� ������� ������� ���� &!(� �� ��������� �����������������

=���������������� )� �� �������� ����� ���� ����$�� �� ��� $�� ������ ���� � $���� ��� ��� ��� ��������� �� ��� ��������� � �������� ��$�� �� ���� ��� ����� ���� ������ ��$�����'��� ������� �� � ������������ �� ��� ������� ��� � &7*

� ���� ������� ��� ������� �� ��$����� �� *&?

���� ������� ��� ����� �� �������� ����$��� )� $�������� � ��� �� �������� �� � ����� ����

=��������� ���������� '�� ������� �������� ����� � ��$��� ������$������������� �������� ���� ��$� �����$���� ������B������ �� ��������������� ��� %�( ) �����������������

=������� ����������� � ����������� �� ��� ����� ���� � ���� ������������������� '�� ��������� ����������� ��������� - ���. ������� ������� �� � �������� �������

+��$���� ��� -��������� ���$���� ���.

,�� ������� ����

�����

Page 19: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�������� �� ���

���� ��������

+��$��������� � �������� ������� � ������������ � ��������� ���� ��$����� �� � ���� ������������� '�� ����������������� � ��$����� �� ���B�� �� ��� �������� ������ +��$��������� ���� ��� �� ���� �� ��B������������� ��� ����������� ������� ���� �� ������������� ��������

+��� ���$�� ������� �� ������ ����������� ������ �����������$ � ������� ����� ������ �� ��������� ������ '�� ��������� ���$�� � ����� ��� �� ���������� ���������� ���� %�( ) ���=,) %,�

+��������� ���������� '��� �������� �� ���� �������� ���� ������������� ������������ ��� ��B����� �� ����� ����� ���� �� ���������������� ��� %�( ) %,� � ������� ������ � ��������� �� �������� ��� ��� ��$��� ������$������ �������� ������ ��� �������� ���� ���� ������B��� ���� ����� � ��� ������� ��������� ��� ����������������������������

)�������0���& $��������

!������������� $���� ����� ������� �� �������� �&$�������� ������� �� ���������� ������������ ���������� ������ ��� ����� �� ����$ $������ /������ ����������0�� �& $������� �� ���������� ����������������� �& ��������� ��� �� ��������� ����� �������������� �����������

)��$�� ��$������ '�� �������� ������� �� ��� $�� �� ������� ����$��0���� � ���� ����� ������ ����$ ��� ���������������� ��� ������ ����� ��� ��������� ��� ��� $�� �� �����B���� ���������

)������� ����������� ����������� ����� ���� ������ �� ���� ����������� ���� �� ��������� ���� ��������� 5������ ������������ ���� �� �������� ������������

)�� ��������� � �������� ���� ����� ��� ��� �������� ���� ���� ������������ ��$���

)�� $��� '�������� �� ���������� �� ������ ���� ������� ����������� �����$� �� ����� ���$�� � ��� ������ -����.� ���� ����� �������� ���� ��� � ��� ��� � ��� ����� ����$�� � ��� ���� ������������� �������� ���� ������������� ����� -!, . �������� �� ��� ��������� � ���������� ����

)�� ������ �$��� � ��� ���� ������������ ����� $�� ��������� ��� ���������

)�� ������������� �������

� ��� �� ��� ������� � ��� ���� �������� �� ��������� ��$��� ���� �������� ������� ��� ���������

)��������� '�� ������� � ���������$ � ������ �������� ���� ����� �� � ���� �������������

���

Page 20: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�������� �� ���

���� ��������

)���������� ����� -�). '�� �& ����� ����� ��� ��� ����$� � �� ������������������� �� 0���� /������ ��� �C ������ � �� ����$$����� ��� ���������������������� ���� �� ����� ���� �� ��� �)� '�� �) � � ������� ���� ��� �� ���������

)������ ����� � ��� ���� ������� �����$ �� ����� ����������� ��� �� �� ������� �� ��� ������ � ����������

)������ ��������� '�� �������� ������ �� ������ � ������� ���������������

(��������� ��� ���������

������� ��� �������� ������ �� ��� ����$��������������� �� ������� ��� ������ ��� ��� �� ������������� �������

(����� ������ � ��$������ ��������

,������� '*+ ��������� ���������$ � � ��$�� �������� �� ��� ������ �� ��� ��� ��� � �������� �� ���������

%��� �������� '�� ������� �� ����$� ��� ������ ���� � �� ���� '��� ����������� ��������� �� �� ����� ������

%��� �������� ,����� ���� � ��� ���� ������������� ���������$ ������� ���� �� ��� ��� ������ ��������$ �� ����� ���

������ =������� � ���� ��������� ������� ��� �����B���������� ������ � ��$�� ��� ��$����� �������

%��� ���$� '�� ���� � �������� �� �� �������� �� �� �����������*� ��� ���������� � ��� ��������

%��� ������������ �� ���������� ���� �������� ��� ���� �������$������ -���. � ����0�� ����� �� ���������� �������������� �����6 �� ��� ������� � ���� ��������� ��� ����� ���������

%��� ������������-%,.

� ������B�� �� ��������$ ��� ��������� ���$�� � ��������� ����� ���� ��� ������ � � ����$�� ��������� �� �� �������� �� ��$����� �����

%��� �������� � ���� � ��� ��������� -������. �$����� ������������$� ����� -������.�

%�����������$� �����-���.

� B������� ����� �� �������$ ��� ���� � �� ��� -�� � �����. �� ��� ������ � ����$�� ������� �� �������

%����� ��������� �� ��� ���������� � ������ ��������� ��%�( )� � ������ ��$���� �������� ����� ���������$�� �� ��� �������$�� � ��� ������

%�������������� ���������������@)���������-%�( ).

)��������� ������B��� �������� ���� �� ������������� � �����$���� ���������� ,����� �� ������������� ���� ��� ������� ��������� � ��� ������ ������������� ���� ��� ��$�� ��� � ������

%��������� ��� �� ��� ���� ���������� ���� ��$���� ���� ���@��������� �������� �����$ ��� �����$� �����$� ��� �����������������

��

Page 21: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�������� �� ���

���� ��������

%����������� ������������$��

2092

.6

monoisotopic molecular weight

'�� ���� � � �������� ���������$ ���� ��� ������������ ��������� ���������� ���� ����� ���������$���� 2��� ������� �� ������� ��������� ��� ������������� ��� �� ��� "�� ���� ���� ��� ���� ��� �� ���������� �������� ���������

%������������$�� ��� )�� ���������$ ���� ���� � ���$�� ����$�� ��������������� � =,)

�������0����� ��� ���� ��� �������� ���� ��� ���$��� �������� ����� ��$���� ��� ���$�� �� ���� �� ��� ���������

������� ���� ���� � ���� � %,@%, ����������� D�� �� �� ��� ����������� � ���������� ���������� �� � ������� ��������

���������� ����� ���� '�� ����� ���� ������� �� ��� ��� � � ���������������� ���������$ ��� ��� ����� $�����

!����� ��� -��������� ���. � ��� �� ��� ��� � �� ��� ���� ���� �� �������� �� ��$��������� �� � ������� ��� %,@%, �� !, ����������

%�������� ���� -%�. '�� �������� ��������� ���� �� �������������� )��������� ��� �� ����������� ��� ��������� � - ������. �� ����� !����������� �� ��������������� ��� ����E%�������� ���$��F �� ��B������ �����

*������ ������ -*� �. '�� ����*� � �� ��� ������� ������� �� ������ ���� �������$� ��� ������������ ��� �� �� ���� �� ������6"*� � �� ��� ������ � ���������� ����� ��� ������������ � " ���� ��������� ��� �������� ��" �( �� � ������� ���� � �������� � " ���

!����������� ��$����������$

'�����B�� �� ��������$ ������� ��������� �� �������) � ,��A��� ������� �� ������� ��� ��� ��������� �������� ������� ������ ��� ���� �� � �������� �������

!�� ���� '�� ���� ������� �� ��� ��� ��� ��� ���� ����� ����� ���������� �� ����$�����$ ��� ���������� ��� ������ ����� �� ��� ��� ����

!�� ���$�� '�� �������� ������� ��� ��� ������� ��� ������������

!�� ���������� '�� ������ �� ����� ��� ���� � ��� ����������������� �� ��� ���������� ������� ���� +2&%�

!�� ����� '�� ����� � � ��� �� � $���� ���$���

���

Page 22: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�������� �� ���

���� ��������

!�������� �� ���������� -!/,.6

":# ���@( ����� ��9 ����@( C��� <�8 ����@(���&!*:� "�8 ����@( C&�!*:� �& 9�:�

!���������� ����� -!, . � ������B�� ���������$ ��$��������� � � ������������ ���� ������ �� ��� ���� ���� ��� ��$��� � ���'*+ �� ��� ��� �� ��������

!��������������������� ������� -!'%.

%��� �������� � �������� �������$ � ��� �����$; ������� �������� ������� ��������������� ���$������������� !'% �������� �� �� ����$��� ���� � �����������

!�������� ��� -������ ���. )�� �������� �� �����$� ��$��������� ������ ������� ������������ �� � ������� ��� %,@%, �� !, ���������

!�������� ��� ���� � ���� � %,@%, ����������� D�� �� �� ��� ����������� � ���������� ���������� �� � ������� ��������

!���������� �� ���������������

!������� ��� ������ �� ��� ����� �$ �������� %����������� �& ��������� ��� ���� �� ��� ���� ����������

!������ ��� -������$���� ���.

�� ��� ��������$ ��� �) ��� ����� �� � ������������ �����$ � ������� ��� %,@%, ���������

!������ ��� ���� '�� ��������� %,@%, ����������� )������� ��� ���������� � � ��������� ��� �� �����$� ��$��������������� ��� %,�

!������ ����������0����� '�� ������ ������� � ���������� ������� � � ��������)������� ����� ���� ��B������ ��������� ���$�������������������� ���������� ������������������ ����� �������� ��� �����$�� �������� � � ���������� ��������

!������ ��B������$ '�� ������������� � ��� ����� � ����� ����� �� ����A��� ������� �� ��������

!������� '�� �������� ��� ��� � �������� ��������� �� � $����������� ���� �� �����$���� ������ �� � $���� �����

!��������� ,��������� �������� � ��� ������� ���������� � �������� ��� �������� ��������

!����� ���� �������� )������� ������ � ��$��� ��� ��������� ���������� ���B��������� ��� ������ �� ������ ���� �������� �� ���������� ��� � ���$�� ����� � �����

G����� ������� )� ���� ������ ��� ���� EB�����������F �� ���������� �� ���������� )� $�� ��������������� ���� ��������B����� ������� �� ��������� ��� ��� ��A������ E��������F�� ������� �� ���� ������ �� ���� ���A����

� ������� )������� ���������� � � ���� ������������ �� �����$��� �� �� ��� ������� ����������� �� ��� ������������� ������ ����$�� ���� � ��� ���� ���� ������������ ��� �������

����

Page 23: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�������� �� ���

���� ��������

���������� '�� ������� ���� �� E�������������F� /������ �������� �� � ���$���������� ��� �� ���� ���� ����� ����� ���������� ����������� � ��� ���� ��������� ������������ ��� ��������� ���� E�����������F �� $�������������

���������

10 % valley

10 %

m∆

� ��� �� ��� ���������� � ��� ���� ����� �����������H �@��� +�� � ���$�� ��� ���� �� � ���$�� �����$�� ���� �� ���� � �� � ���� ��������� ��� ����������� ����� ��������� �� �@� ����� �� �� �������� � ��� ��� �� � ���$�� ���� �� � ����� ��� �������� � ��� ������� ��� ���$�� - �� �������� �������� �� ��� ������� ���$�� ? +2&%.� � �������� ������� �� �� ����$ ���������� �� "#1 �������'�� ���� � �B��� ���$�� �� � ���� �������� �� ������� � ��� ���� ��� ��������� �� � ������ ���� �� ��������� ����� �� A��� "#1 � ��� ���$�� � ������ ����

�������$ ����� -����.

5000

5001

mass resolution

'�� ��������� �� ������$���� ������� ���� �� ����$���$���� �� ������������$� ������

,����� ����������� � ������� ���$� �� ������� � ������� ������� �����������

, , ��������������� !������� ��� ��������� �� � �������������� $�� �� ��$�������� ����$�� �������������$��� ��������� ,������������������ B��������� ���������� ��� ��� ��������������$�� � ��� �������� ��� ���������� '�� ��$��������������� � ��� ��������$ 0���� ��� ��� ���$�� ���������� ���$��� �� ��� ��$������ � ��� %� � ��� ����������� ��������

�����

Page 24: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�������� �� ���

���� ��������

,����� ���������������� ��� %�����

� ������ ����������� ������� +����� � ���� ����� � ����� ������ �������� �� ����� �� ��� ������ ������'��� � ������� ���������$ ��� ������� �� ������ �� ���� ���� ������ '��� �� �� � �� ���� '�� ������� �� �������� ��� ��� ������ ����� �� �������� ���� ��� ���� �������������� )� � ������ ����������� � ��� ����� ��������������

,�$������������ �����-,@�.

'�� ����� � ��� ��$��� ���$�� ��� ��� ����� ���$����� ���������� � ��� ����������� � �� ���������� �����������

,��� ���������0�����%�����

� ������ ����������� ������� &���� ���$� ������ ��������� ��� $����� '�� ������� �� ����� �� � ��������������� ��������� %������������ ��� ������ '�� ������������ �� ������� ��� � ������ � �������� �� �����'�� ������ �� ���� ������� �� ��� ������ ������ ��������� ��� ��� �������� ���� ��� ���� ������������� ����� ���� ���� ��� ����� ������� ������ ��� �����

'����� ���������������� -%,@%,.

D��� �� ��������� ��������� ������ ��� ���� �������������� '���� ����� � %,@%, ���������� ��� ����� ������

'��� ����� ������ � ������ ����������� ������� �������$ ��� ���������� ��� ��������� ������� � ���� ���� ����� � �������� ������� � ��� ������� �� ���� ����� ���� ���� ������������������ ��� ��� �� ������ ���� �� ��� �����������$ ��� ������ ���� ��� ���� ������������� �������� � ��� ����� ������� �������

'�������� ������� '�� ������ ����� ������ �� ����� ������� ��� �� ��������� �� %�( )� ������ �� ������� �����������

'������� ����������-���� ��$ �������$ ��������� ����������.

)������� ���������� �� �������� �� � ����� ��� �������$� �� �������$ � ���������� ����� ������� ��� ��������� ��� ������������� ���� ������ ������� ������������

'����� � ��$�� -'*+.��������

,�������� ���� �� ���� �� ���� ������ ���� � ��$�������

'����$ '�� ������� � ���������$ ��� %�( ) ����������I������ ����� ��� ���$�� �������� �� ������ ��� ���� ��������� ����������� ��� ��$������������ ����� �� � ����� ������ � �����������

'�����������������������������

'���� ��� ���� ���� ��� ����������� �� ������� ����� ����� ��������������� ���������� ����������� ) ��� ������ ����� ���� �� ��������������� ����� ������������ ������$ ����� ���������$ ���������� ��������� , , �������������� $�� ����������������

D��� ���������� �����$������ ������� ���� ��������� �� " ��� �����

����

Page 25: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���

��� ������ ��� � � ����� ��������� ������� ��

������������� ������ ���

������ ������ ��� ������� � � �!�"�� #���� � ��

�������$� %&� ������ �!����'���� �!� �!!���'���� ��#���#� (�� ���#� (�� �)�������' ��������$����' �� *+���,��

���������' ���������� ��!�$���� �����$ �!� ���������� ����-��� ���� ����� �����-'������ ������ ��� �� ��������� � ����� ��� �.��� !�������� ���������� ������������ ������ ����������� ������� � ����'����� ������������ �!��� �� ����� �������������� ����� ���������

���$ ����'��� !������ ���������� �

������� ������ �(��#��$ $�� �� �#��$ ���� � !�#��$��$ $�� !)� !�

������ ������� ���� �� � ��

���- $�� ���-$���� (�

������������ ��������� !����-$���� ����������� ��(���-��$� ���� �� $���� � ����� � ! ����� /0� ��� ������� �0 $�� ���� (�� �)� (!����� ������� �(���� � ��� ��!� ��1�� ������ �� �)��������������� �������'������ ��1�� �))��� 2���� ���� ' ���� �� ����� ��1��������� ��� �� ������

������������ ( ������ �����-�$ ����- (

�������$ �������' ()

���������� ��� ���� �� +"� �������' ���� ���+"� �"*�% ������� ��#� � ������������ � (

��� ��� !� !�� ������ ��� !� !������� � ��)

��������' ������������ �������� ��2� (������ ������'�� �(� � �������� ���� ���� �'��� �������$� ��� $�� �!!�����'��� ������� �� ����� ���

�����

��������� � ��������� ���������� ����� �� �������� ����3��� 4������� 5�� /�#�

+��'��$�� 6 �))� 4��'�7+0 7���$ ���0%�1/�8 (��� �()(���� 90�� ��#�:; (��� ��))� �� 9���������:

Page 26: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� �����

�������� ��$�� �(��� .��#����� � �!��� <���� �!� �(������� ������������� ���� ���������� � ����$ ���� �� � � !������� ���� � �) ��������� .�����' ������������������' ���'������� ���+%� ���������� -�� ��������$� ����� ��� �� � � �!�� �!���������� �� �� ����������� 9+%�: ��������� �� +������� 1�������� 1��

�������$ �((����������� ����������� �(�����������$ �� ����� ��(�������������� ����� ���� ����#��' ���������� ������ !)��������������� -����� � � ��� !���������� �������� �����#������� ����� �������� �(�������$ ������' �+������� ��� �������$

������ �� ���� �������$ )

��#� ���� ���#� ���� (���������-� �!

��������#� �����'���'���� $�� ��

��'������������� ��� (�� (��� ��� ��$ (��)� �(� �� � � �!�������� ������ �����# ��� �������� ��)�'���� '� ��'���$� ����� �)���'�������' ��2' ��������� ��� ��(�

��(� ��!+'�' ��!

�������$ ��'����� �

� ������� ��� ���$� !� ������ �������$= �(� ��#� �.�����$ ���� �� ��� � #���� �� ����>� �� �' ������ ��� ��' 2�������� �(� �������$ ��� ������ ��

������ �� �� ����� � ��#��������� �(( ������$ �) ��$��� ���

><��������� � ���'��� ������ �) ������ $� ��� ������������ � ������ ���� !�� ��� ����������' ����� ������ ! �$����� ���

���$� ! ���� ��' ��2'��>��� ��� ��(� ��(� � ) ������������ ����� � ��������� �������� � ��������� �! ������������ ��/"�� ����� ���������� �) ���� �������$ (� �(� ������$ #��# � ��� ��$�� �(

��= ���� ��� � �� ��)� ��� �.�����$ �)��5" �(������ ��� ������

%�� ����� $��

������ ��� ()��� ����$�� �����

����� �� �������� ������� �!������ ������� ����� (�� ������������� ��� ������ !�

������$ ��������' �

���������' ���������� ���.����������� ��� �� ������� ������� � !��% ��(���������� �� �% ��������� ����� � �������$ �(���'��$�'��� ��#��������

��� $�� 2����$��� �' ��$�� �(!2���� �.��� ��$ 9��5: ���2������� ��������� ��2����� ����������� � �2�������� ���

����� ���� ������ ��� ������� ����� !

Page 27: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��������

���� ���#� �!������������� ��� $�� ������������� $� ������ (��������$� ����� !���2��$ �������� ������� ��������� )� �� ��������� �

���$��$ !)�������$ ��!�������$ �

�������$ �!����� ���� �)� ��

��� ���� ������$ � ������ ��������� ��� �'������� 9�5�%+3:

������$�������� ���������� �� �� ���< ������������ ���5�%+3 �� ��!

�$� ������ ��� �)($� ����������� �!$� ���� ! $� ���$� � $� ��>� ��� (�

����-��� �$������ �$���� $� �($����� ��� �' �� �)�$�'���� ���$�'��� �� $�'��������� ���$�'���'��� ������� ��$�'���'������ ��!$�� ��� ���� �(� (�$�� ��� $�� ��� ((� ��� � � �) $�� ��� ��-� � $��� ��$� ����� 2�������� � �$���� ����� ���$���� �� ���

�0� �����0��������� .������ (���$� ��$' +%� �� ��$� �������� <�$�� ������� ��� ( � �)��$�������$���� �� ! � ��(0�4 ������� ��� � �������$���� �(�����$���� �)�

$� �)���'���'���� $�� �!

����>����� ����-��$ �)��� +������� 1�� �������� ��� �(�

0&*+ ���'��� ����'��� 9.�� ����� ������

���$��: ��(�' ���'��� ���' �������� ��

������� � � ��

���$ ����'��� ��

����' ������� !����$ ��������$ ��� �>�� >��� �������$� %&� ����� �!���� �>�� >��� �(��������� (���������> �0 $�� ���� (�� (����$� �$����� �)���)�� ���������� -����� ��$' ���� ��)�������' ������� ����� !��� ������� ���� 2����$� (���� ��������� ����� ����� ������������� ���%&� ����� �

����� �(� �)����'���� � � � ���������� �������$ �(� ()

������� ������� ��������� �

��������+ �)!� �(��(+ �)!

%�������� �������' ��$� 9%+"5: ��)������� �)!�������� ���� �(!� ��

?��� ��� ��

�-����� ��� �( � �)�

������������� �����'���� ���� � ���

-����� ��$' ����������� ��!

����������' ����� !���������' <��-���< �'��� ��� !)� !

%�� ����� &"�� �

���$ $�� ��� � )����� ������ !)

Page 28: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� �����

���� ������ ����� �������� ��*+���,�� ���� �� � � ������ ���$ ����� 5�� ����'�� ��!���� ����� ��$ �������' (���< ��������� ������� �)��< ��$' +%� �� ��< ��������� $���� �)���< �������� <�$�� ������� �)� �'��� ��!�'��� ����� ��� ��!

�"*�% ��(�"*�% ������� ������-� ������� ���� �������' �)!� ��!����� �(�� �(!���� ��������� ���

������������' �((�������$ �((

���� ���������'� &������� �)!�������$� ����� $� !�� ���������� ��(�����2 ��(�����2 ������ ���� �������� ����������

9�"*�%: �������� ������(��������� �� �% �������� ������� �(

����� �����'� ������������ �(������ � ����� ���'��� �)� � ���������� ������������ ��(���������� (�� (���������� $� ��������� �������$ ����� ���#�$� � ��2 � ��� 2����$� � ��������' (!������������ ����� �(�������� <�$��� ���������� !�������� <�$�� ���-� ������� ����������� <�$��� � ������������ ���� � !��+ ������������ ��- ����@4�� �(��� ��(� ��!�A &%5� �� ��������������� ������'>�� � ����� ��������� *+���,�� �� ������� $� ���� �������� $��� �������$ �( �������' ����$ ���� ���

����������� �����2� ��!

���������' � )��������' ���������� �������< �0 ����#��� (�����# ��� ������ ��/�&0�� �(�� ����$ ���#� ������� ���� ���� ���� ��!������������ ��(�������� ��$�� � ������������� !�� ������������ ��� ���� �� ������ ��� �� ����� ���������� �!

����$���� �(���$��������� ����'��� � )�� ��� �������� ����#��������$ �(�#���' �������� �)��#���� ��$� ������� ���#��<����$ (�

����� ��� $ ��� ��$ ���������� ��� (� �!)��������� ���� ������ !������ ��� ���� ���&1�� ��� <�����$ �!&���� ������$ ��� ����� �������� �#��� �(����� ���� ���$������ �(���(�� �

�� ����������� ����������� �(��� �.��� ����������� �(������� <��� �����������

����������� �(������ <��� ������� �.���

����������� �(!���� �.��� ��)� �()���� �� ��������� �� $�� ������������ ���� � �0 $�� ��� �(� �

������ ������'�� � $����� ���������� �(������ ((

�������� ������ �����������'������ ��!�%� �������� �����-��$ �� !!

���� !��������- ����� �

Page 29: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�������

��2� �����2 !������ ������� �������� �������� ���&�� �(�� �(� ������'���'���� ����� ������ �(

������$ � ��� ��> �!���� ����� ��' 9&��: ��)� �()������������������ �� ��������� ! � �(�������������������' �� ��� ���� � �( ��<� �����' ��&&" ������������������ �� ������� � ������������ �)� �

����$ ����� ����������� (!����� ���������� �

�������� ��� ������ � �()�������� ��� ���� ������������������ ��������� �������$ ����������# $�� ��

������ ��� � �����#������ %&� ������ �! ����#��$� $�� �(��� ��� ���� ���

��,�� �����,�� �.��� ��� �(�� ��(���� �������������� ���� �(�

������ ���������� �������� (!������ ����' ��� ��

���#�$ �) 2������� ��!������� !)� ����������� �(���� (!� �� �� � )������'��� �)���'���� �)(

������ (����'��� ���

��������� <��-���< !�&�� �(�� ��)� �� � ���

������� �������� ������� ��

����� ����������� �

�.�� ����� ��� ��)

�������� �(���(�� ��).�� ����� ��� ���� ���� ��!� ���.�����'� �������� ��.������������� ��� � !)� !�� ��� �� .����������� �� ������ 2������� ��!.���������# ��������� ��!

.���� !� ������ !�

��� ������# �������$ �

<��� �(�� ���������$ !3�'��$� ����� ����� '��� $��� ��� &"�� ��!� ����$ �$�� � � ������� � � � � ������ �� ��-'������ �)�� �������� $� !�

����� !�� ����������� ��!� ���� �()� �(�

���#������� ����� ��� �������� ��)������ ������� �!�� �!���' ������ (�� ��� ���

�� � #����$ (!��' ������ ������ (���' ������ ��� ��$ ( � (!��)� � ��' ������ �������� (�� � ���' ������ ��� �!������� $�� !����� ��������' ��� ��� ��� !���������� ��!����

������ �(!��� $�� �)

����#��$ $� ���<����$ � ��<����$ ���' (�� �!�#�� ���� ��������$����' �) �#����� �������$ �(3/"�� ����� ���������� �)3& 0&*+ ��

����������'�� ��#���� �� � ��!����� � )����� �������$ ��!����� ���������� ��� ��(������ � !��������$ �(!��� ���

�&"�� � ���'���'���� $�� �!!������� �����2 � ����� ����� ������� ���������� �(� �(

������#��' )�.��� ����������� �������� ���� ��� ��������� �� $�� ����#��$ ������' ��

Page 30: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� �����

���#� �������$ )� �� �(���������� ��� ��(� � )���# ���� !�� ����� ��� �>� ����� ��� � �'� ������� � ����<��� ���$ ����'��� !)���������' � � (!����������� ����� ���������� �!������� ��������� �������� ��� ����� ������$ !

������ !� !�� ������-��$ ���-��$ ���� !���������� �)��������� ��� ���� ������$ !)

�������$ ! ����� ������ �������$ �����-��$ $� ��������$ ������ �� �>����� !�

����� ���������� � ����������� ����'��� !)����������� ����� !�������$ �� �������� �(������$� ��� %&� ������ �������$ �������� ���$��$ �����$ ��������'� �� $�� �������$'� %�� ������$ ��� ������ ������� ��� �� ��� �!� �!)������������� ���< ���� ������������ �������������� �(�� ������������'� ���'� ������ �((����������� ��� ������ � �������� ������ �

���� � ���� ���������' ���� �����������

��������� �������$ �)��� ����� ��� � ���������� ��������� ����� �������� ��� ����#��' ��

���#����� ������ ���� ���� ��(������� ��� �)� ��!�����$���� ���� ��$ �������$ ��)����������$�� ����'�� ����� ��' ��� 2�������� ��)����� �(�

����� �!� � �����'��� ��

��������� (���������� ���# �� (5@�,5@� �������-��$ ' ������������� �� ������ ��� ����� .�� ����� ����'�� ���5��� ��� �5��� ����� �����'���� �����'��� ��-� � (��'���� ���� � �� �<�� ��������� ������������ �

��� ��������$ �(��� � � �� ��!

�� ��� $�� ��A7 ����� ��(

�#������ ���� �������$ !�#������ ������� (#������ �'���� �#����� '� #����$ ��#����$ ������$ ��#������� ���$���� �(#�������� �(� �!(

�<��� .�����'� ��� �(�<��� ����� ��������� /0� ��� ��$��

�(�<� ���<��� ���$��$ !�<���� �������$ (�� �<��-�������� ���� ��� ���$ !

�B���' ����� !

�'���� ��'���� ���� �� � �((� �� '��� ��� �'��� � ('��� �<���'��� �������$' ��

�>��� ��� �>��� �$���# �������$ �

Page 31: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���� ��

������� ���������

��������� � ��������� ���������� ����� �� �������� ���������� ���������� �� ����

��������� � ���� ��������� ������ ����� �! "�#�$�"�"#%�# &���'(����)* "�#�$�+��,$�# &-��(�����()

Page 32: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�. �� ��� (������ �/�� ����� ��' ��� ����� ������ �������� '�(������' .� ���� �� 0�(� ��� 0�(� ���� ��� �����( ��1/��(���' ������� 0/�(���� (����� �� '���(��� (��������'2 �� � ������ (������ �(�������� ��� ���0���' �� ��������2 ���� .� .��� �� ��/'� �������.��� �0 (��� �������� ��' �'����0� �������� '�/� ������� .����� �� ������� ��� �������� &�������� �� ���,33#)! ��� (��������� �0��� �������� �4������' �� ��� ������ �0 �� �������2���� �������� ��� ���� (����4 ���� ��� (�����' �0 �������

���/���' ��������2 ��/'���� ��� ������� �0 �� ������� ��1/������ �������(�� �00��� �����' ��� (���(��� �0 � ����'��' ���������� �1/������2 ��� 0��� �(1/������� �0 ��� �/�� ����� .�� ���� ���������� ��� �����(����� �0 �� ��'/������ ������(�2 -4�(��� ��� ��� �������� ��. 0�� ������� ��������! ��� �0 ��� '��� .��� (�������� ��'�������' �� 56������(� 0�(������72 �(�/�� �0 ��� (����4��� �0 ��� ����� �.��'��������� �����

�(�����'� ��� ���(����������� ��� ���� .�'��� /����8�' �� ��� �����'��' ���������� ��' '������ ����'2 ��� ������� �� ��� � �������4�/�� �0 ��������2 �� �� ��������� �� '������ �� �� �/����� � �������.��'��������� ���(����������� ���2 9�/���� /������ ������ ������'/(�' �� '�00����� ������ �0 � ���/������ ���� '������� �� �����4��������� �� '�/� �������� �4�������� ��' ��������' �� � �/����0 ��: ���� &��� 0��/�� ,)2 ����� �������� ��' ��� ���������� �0 ����������� ��� /�/���� ���0���' ����'�� �� ����' ������� �'�0�(�����2;�(� ��� �������� ��� �������' �� ��� ��� ����4 ��� ������ ����������� /(� ��� ������ ��' (�� �� 0/����� �'����0��' ��' (����(����8�'�� ��� ���(�������2

������������

�������� � �� ���� �������������� �� ��� ��� ��������� ������� ��� ��� �� ���!����� �� ������"� #$�!�"�%�����"�&% '( )�� &����%������ *+ ,*--./ *0-01*0-2(

3��� �"�������� ��� ��� &����%������ ��� ��& ���� %�4� �4��� %��% ������&���� &%� ������� 4��� �55� ���& 5�� &��� ���� �&��� 3%� ���&���� �� 6� �&��� �� &%� ���� ��&�� 5��&%�� ����������&%��& ���� �&���(

Page 33: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

* '�&�� � &���

� '�0������� ����������� �� ��� ��/������/� �������� �0 (����4������� �4�/��� ��<� (��� ������� ��' ����/� �4���(�� �� ���< 0�� 1/����������� (������ �0 �4�������� ������2 ��� �(��� �0 �����(�������4���'� 0�� '�/� '��(����� �� '��������(� ������� �(������������(������� ��' ����� ������(�2 �� ��� ��� �/����������� 0�(�������'�� ��� ���� '�(�'� ��(�/�� �0 '���������� �� ��� ���(���������' ��� ������������ �0 �����( ��0�������2 :���������� �� ��������(� ���� ���(��'�' �� ��������!

� ��� ��(������� 0�� ����������/���� ������������ �������������� ��� ���� (����'������ ������' .��(� �<�� ��� �����' ��� �������� ��' �����'/(����2 ��� �����/���� ��� ����0/����� ��(�����' �� .���2 ���� �������� ��0�.��� �0 �����(����4 ���� �������� ��� ���� '�������' �� �/(� � '��������� ���� ����(��/��� �4����� (�� /�� �� ��' ��� �����������/���2

� ���� ����8����� ��(���1/�� ��' '���(���� 0�� �� ��������������� ���� �������' .��(� ����. ��� �������� �0 �������� ��'�����'�� .��� ���� ����������� �((/��(� ��' ����/���/�2;����� �����'� 0����������� ����.� 1/�(< ���� �(�'��1/��(� �������� �0 ��. ��/��� �0 �����'�� �� ��. �/�����(���2 =��� ��� �������� �0 ������������������ �'�0�(����� (���� �''�����' /���� ���� ��(�������2

� ������� ����<� �� ��� '��������� �0 ���� ����/���/�: = ��1/��(��� �����( '�������� �0 ��� '�00����� ��������� ���� ���� ����������' �� � ����� �����' �0 ���2 ������( ��1/��(� '��� �� ���.��� .��� ����� ����'2 9�0���/������� 0�� ��� ����� ��� 0/�(���� �� /�<��.�2 = ���� (�'�

nontreated

Cell

IEF IEF IEF3 3 310 10 10

treated: stage 1 treated: stage 2

SD

S P

AG

E

SD

S P

AG

E

SD

S P

AG

E

dd d

u

u uu u

u

d

���� �� ��������� ��������� � � ������ � ��� ���� �� ���� �������� ������� � � �� ��� � ��� � ��

�������� ���� ����� �� ��������� � ��� � �����������

7�� "��� ��� �� �����������&��� ���� ��&(

��4����"��&� �� "��� ��� &���"�&�� ���� � ��� �4����"��&5�� ���&��"� ��������(

���&��"� �������� ���� 6��"�����6�� ��&%��& ����"���8��� � �&�6����(

Page 34: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

* '�&�� � &���

0�� ��� ���� ��� ���� ���'/(� ����������� ����(��� �0 ���� = (�� ���/�� �� '�00����� ��������2 >/�������� ��� ��������� ��(�� �'�0��' �� (����4 ���� ������(����� (���/��������� ��' ������������ ��0�/��(�� ���� ���/�� �� ������������������� �'�0�(������2 ?��.��'�� �0 ��� : = ��1/��(� �0�������� �� �� �������' �� ���� �������� 0�� ������� �'����0��(����� ��' (����(����8����� .��� ��� ���(�������2

� =(�������� �� ��� '��������� 0���' �0 ������������ ���� ������������' �� '������ ����� 0�� (������� ��' �/�'���� ����/�� ��/�� �0 '��� ���'/(�' �� ��. ���� ����/���/� ��������� ����'�2 ;��� �� ���� .�� �� .��� �� �������� �� '��. �������0/� (��(�/����� 0�� ��� �/�� ��/�� �0 '��� ��������'2

=''��������� � 0�. '���������� �� ������' 0���'� ��� ���� ����0/�0�� �������(� ��������!

� ��(������� ��' ����'�(�� ������(� ��' 0�(/��' �� ��/�'���� ��� ���/(�/�� ��' 0/�(���� �0 �������� .��(� ���� �����������' �� <�� ��8��� �� ������' ����.���2 ��� ��(�������0�� �(�� (����(����8����� �0 �������� ��� ���� (�����/�/�����0���' .��� �����(� �� ����������� ��' �((/��(�2 �0 ������'���.��� ��������� �'����0�(����� �0 � ������� .�� �� ������2���� '� ���� ��1/��(��� �0 �������� �/��0��' �� �6@� �� ���(�����������( ����'� '�������� ���� ���� (�����'2 �����(�/�' �� /��' ���� 0�� (��������(��� ������� �'����0�(�����/���� ���� �(�' (��������� ��' ����� ��1/��(� ��0��������2 /� ��� ��(���1/�� ������' ��� ���������� ���. ��' ����.���� ��. ����/���/�2 �� ��� (���� ��'��/� ��' �4������� '����� ���� �(�' ��1/��(��� �� �� ������ ���'�'2 ���� ������������ �����( '�������� �� �� �/00�(���� �� �(1/��� �������1/��(� ��0������� 0�� � ������� �� ��� ���(������� ���'����0� �� ��' �� �������� ��� (������ ���� �(�' ��1/��(�.��� ��� ���� �0 �������(� ����������� �0 ��� ���� ���'��� 0�����2

� �������� �������� /���� 0�/����(��� ���� ��' ������ ������������ ���� �'� ��������� 0�� '�00�������� �������� �0 ������'������2 A/���������� (������ �� �4�������� ������ (�� ��/� �������� /�(�����'2

� �!������� �� ������������ ���������� >�� ��� �������� �0������ ������� �/����� ��� '���(���� �0 �������� �� ���� ��.�4�������� ������ '����������� ��' ����� �0 ������� 0/�(������� ����� ����'� ��� /�'�� '���������2

��� ������ �����' ����� '��(���� �� ������(� .��(� �� �0��� ����'�0���' �� �"#����� ���������� �� �$������ ����������2 ���� ����0 ��� ��(���1/�� ������' ��� �������� ��(�� '����/��'! �����

9����5��"�&� � ���� 6� �&���:� �� ���& �5 &%� ��� � ���� 5���"���4� ��"��� &�� ��� &������ ��� ��6���&��� ��� &� �(

� %��% ��4�� �5 ������ �� ��8���� 5�� &%�� &��� �5 ������ %� ���&� ������� �� &%� ���� �5 ���&��� %�"��&��(3%� &� %������ 5�� � ��4���8��� ��� ��&% "��� ��� &���"�&�� ��&����� &� 6� 5��&%�� �4����� (

'��&��� ��6����� ��8����� "������ &��"�&�� ��������(

3%� "��& �"���&��& �� ���"������ "�&%� � ���� 6� �� ��6� ��&�� �� &%� �4��4��� %��&��(

Page 35: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

* '�&�� � &���

������'��������� ��' 1/�������� ���/(�/��� ��� '�������' ��0��������� �� 0/�(����� ��' (����4��� �0 ��� �������� (����� �� '��������'2 >�� ���� �/����� �%������� ��������������'� ��� ������'.��(� '� ��� '����/�� ��� �������� ��' <��� (����4�� ����(�! �2�2�00����� (������������ ��' ���(�������� ����8�������� ���(�������2

�������������� �� �������

��� �������� �4��(������� 0�� �������(� (�� 0�� �����(�/���(�� ������(� 0�� 0����� ��. '�/� ������� ������� �'����0�(����� �� ������0���' (��� ����� �� '������' ����/��2 =��� ��� ����'����� �0 ��� '���(���' ������� �������� ��' ������� ��4�(����� ��/'��� ��' (��(<� 0�� ��'��00�(�� (�� �� ���0���' .��� ���� ������(�2 �����(�� ������(����.��� �� (����� ����� ����/� '������ ������ '������ ����/� �������' ������ 0��' ���(/��� ��<��� �� ��'� 0�/�'� 0�� '�������������� '������� ��' ����� ��������� '������� ��' (����(����8������������������� �'�0�(������2 �� (����(�� (������� �� .�/�' ������������� �� �/����� ��'���'/��� �� ���'�(� �������� �� �������2 ��������� ��/'� ����( (��� 0/�(����� ��' ���(/��� ������8������2

=������ ��� 0���' �� �(��������� 0�� �����/� ������(� �����2 6�������(� �� ���� ������' 0�� ����� ������(� 0�� ��� '�00����� �/������0�� ������(� 0�� ����'��� ������ �0 ������ ��(������ ���� (��''��/��� ��' ����� ��������(�� ��(������� ��� ����' �0 (��� ��' ������2 >�� ��� ���� ������(� � (�����' �������� .��� �����(� ��������'2

������������ �� �� ������ � ���

=� �����'� �������' ����� ����������/���� �.��'��������� ���(������������ �� ��� ����� ������' ���������� ��(���1/�2 ��� ����������� �((��'��� �� ��� �.� (�������� ��'����'��� �����(��(���(����������� �0 ��� ��������! ������(���( ����� ��' ��8� �00��� ��� �������� �����/����2 ������� ���/���' �������� (�� �� ��������' '��������' ��' �����' �� ��� ���2 ��� ������� �0 ���� ��(���1/� ���� ��(<�� � ����� �� ����� ����/��� �� �������� &,3$�) (������� �������(���( 0�(/���� &�->) ��' �:� �����(�����'� ��� ���(�����������2��� �����/���� �0 ��: ���(����������� .�� (����'������ ��(�����' ����� �����'/(���� �0 '����/���� (��'������ '/���� ����� �������������' ������(���( 0�(/���� �� ;B>������ �� ��� ���� ,3$#2 ���� ���� �'��0�(����� ��� ����' �����' � .�'� �((�����(�2 /� ���� .��� ��� ������(����� �0 ������8�' �� ���'����� & C���1���� �� ��2 ,3D�) 0�� ���

!

!���4��� ���&��"� � "��&������ 6� &%� %����&� ������ %(� ;�"��� � ���< ���&��"� ������� % ��� ��& �=��&(

�&���"��� !( �����%�" >7 ,*-?0/ +20(@AB������ �!( � 9��� %�" 7.0,*-?./ 200?1207*(9����84��& 9� )� #� ���%�&&� ��������::� )� �C�� �� ���&���"���� �� ���&�� �( � 9�� %�"9���%�� ��&%� � + ,*->7/D*?1DD-(

Page 36: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

*(2 '"��� ��������

0���� '������� ��� ��(���1/� ��(�� �����'/(���� ���/�� 0�� �������� ��������26������������� �0 (���� ���� ���������� �� (�����0/������ �� ���� /���

0/� �� ��'/(� ��� �/��� �0 �������� ��' 0�� ��(���8����� �0 � �������.����� ��� (���2 =��� ���0��(��������� �((��'��� �� �����(��(���(����������� �0 �������� ��<� ������(���( ������ �� '�������� �� ���������� ����� ���'� �� ��: ���� ��' �� ������� ��������������� ������(������2 �(�/�� �.��'��������� ���(����������� (����� ������ �� �/������' ������������ ��<� /���'��������� (������������ ��' '���(���� ���(������� ����'� ��� �����' ��' 0/����� '�������' 0�� ������������� �0 ����� (����4 ������� �4�/���2

���"������

�'����� ��� ������� �4������' �� � (��� ���/�' �� '���(�����2 ���� ���(/����� ����� �0 ��(������� ���� �� (�������� ���������2 ���� ������'���(���� ��������� ��' �������� ��(���1/�� &0�/����(��(� �� �������������� @;: (�2 , �� �������) '�.� �� ,�� �������� ��� (��� (�� �����/���8�' �� � ��: ��� .��� ,� � ����� ������� E (��������'��� 0��������(� ��,�D (��� �1/�������� �0 ������ (���� E ��� ���'�' �� ���������(���( 0�(/���� ��� &������ �� ��2 ����)2 F��� ���(������� �����'� ��� ��������� ��� ��������� ���� ����� �������� ����'� ��.����� �� ���(��(� ,� �� �� �� �0 ������� �� � ���� �� ��1/���' 0�� ���'������� �� ��� ���(�������2

������ ����� �

��� ��: �������� ��� ���� (����4 ���� .��� ��0�����(� ����� �� ���������� �� 0��' �4������' (������ �� � ������ �0 ����! ��<� /� ��''�.� ���/����' �������� ������������������ �'�0�(������2 ������������ ��� ����� ���� ��� ��������(< �� ��� �������(� ���(�'/����(�/�� ��� ���� '���(���� ��������� ��' �� �� �'C/���' ��' ������8�' ��/����2 ;��� ���(� � ���� ����� ��� ��. '�������' ��0�.���(�� ���0�� 0/��� �/�����' ��' ���'���00 ����/�����2 ��� ������������0 1/���������� '������������ �0 ������� ��/��� �� ����� �� ��������'����'��� �� ��� ������� '���(���� ��(���1/� ������'2 6������ ������0 �������� ��� ���� 0/����� �������'2

#

3��� �"�������� ��� &���%������� ���� ��"��� &%� "���� �������&��� &� %��8�� 5�� &%� ��=& � � �� 6� ���� �&� ������&����� &%� � 4��&��� �5 �&�����&%� �����&� ���&���� �� &%� ���"�&��= ��&�� 5��&%�� �������� ������4���� 6� ��� �5 &%� ��&�����&�4� &� %��8���(

!�4��� �� ��%�� !� 4��@��&��" �( )�� &���%������ 7*,7000/ 7+*?17+7*('� ��� &� � ��"����� 9�������&9���� :�� ��"� �:��� �� 5������� �� � �&���� ���� ��� ��&%%��% &%����%��& "��� ��� &���"�&�� ��������(

3%� ����&��� �5 � ���& �� &%�7�� "�� �� ��& �����% ��5���"�&��� 5�� �� �=� & � ��&�5� ��&��� �5 � ���&���( ' ��&�5� �&��� �� ���� 6� � %��4� ��&% %�"� �� �� "��� ��� &��"�&���������� �5 &%� ���&��� ���&(

Page 37: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

* '�&�� � &���

���������������� �� ������

����� � ������������� ��� ������� ��' 0������ .�� �� �'����0��������� �� ���.� �� 0��/�� �! �����'� ��� 0������������� &6F>).��(� .�� �����'/(�' �� 0�/� ��'����'��� ���/�� ��(�/'��� 6������� ��2 &,33")2 ��� ��� ��/� (��������� ��� ������� �0 �������� �� (/� �/��0 ��� ��� ���� ��� ������� �� '������' ����'� ��� ��� ��/� .��� � �����������( ��8�� ����� �������2 ��� (������� ���'/(�� ��� �����'����� ��/��' 0�� ��� ��/� ��' �/�����' �� ��� ���(������� ���������2 F����� F=@:� ��> �����/���� ��� ������' ��(�/�� ���� ��������� �� ���'�� ���� ���(�������� ������2 ��� ��� ���(��/ .������ �((/������ ���/��' �����'� ����� �� ��(��' .��� ��������(�������'� ���(��� �� �����/� '�������� /���� �'�1/��� �����0�����(������2 ���� �� ��(� �� 0�/�' �� �����'� ��' ������� '�������������( '�������� (�� �� ����(��'2 ��� : = ��1/��(� �� ��� �������'��� 0���� (�� �� ��������(���� ���������' ���� ��� ���� �(�'��1/��(� .� ���� �� ����� ���� ��(�/�� �� �� ��� ���� ���(��(�� ������(� : = .��� F=@:� '��� �� �� ��� ���(�0�( ���/��2 G�/ (�� '� �������� .��� F�HF� ���/��2 ���(� ��� (������� ����� �0 ������� ���<��.� ��������(�� ������( �����'� ����� (�� �� ��������' ��' (������' .��� ��� �4����������� '�������' �����2 �0 � �/00�(�����/��� �0 �4��������� �����'� ����� ��(� .��� ��� ��������(�������'�� .����� � ������� ���� ������� �'����0�(����� .��� ���� (��0��'��(� (�� �� �(�����'2���� ���(�'/�� .��<� ���� .��� 0�� ������� �'����0�(�����2 ��.����

��� ����' (�� �� (�������' 0�� � �/��� �0 �������2 �� �����(��(/����(�� ��� ���(�0�( ��0������� �� ���'�' 0�� /�����/�/�������� �'����0�(����� ���(�0�(���� �����'� ��1/��(� ��0�������2

���� ���� $��� ����� � =��� �(�' ��1/��(� �� ������ '��(���������� ��0������� 0�� /�����/�/� ������� �'����0�(�����2 :/������� ���(������� �������� � �����'� (�� �� ����(��' 0�� ��� ���(���/ ��' 0�������' ����'� ��� �����/��� ����' ���'� ������(�������2 ��� ���/����� 0������ ��� ����� ��� ��'�(����� �0���� �(�' ��1/��(� ��' (�� �� /��' �� �������� � ��1/��(� ��''��2=��� �(�' ��1/��(� '�����' 0�� ��� ���(������� (�� �� /��' ������(� ��� ���� ��� ������� '�������� �/� ���� ��� -�� '�������� ��'/��' 0�� �� �!� ��1/��(��� .��� ��(������2

%

������ ��� !����� ��9����6� ��( ��� 6��� D ,*--D/D7?1DD7(3%� &� %��8��� �� �&� 6� ������� ���� 6� �� ��6� �� �&��� �� &%� "�&%� %��&���(

)4�� 5�� �������"� ��&%��& �����"� �&�6���� �� ���5��� ��&�5� �&���� ��� 5����6��� ���� ��� ���� �%�� &%��� �������% ��8��� � %�"����� ��� �����4� ���� �5 &%� ��������&� �(

Page 38: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

*(? B�� &����� ���&��"� �

��!&��������'����� �� ������

���'�� ���� �(�' ��1/��(� ��0������� ���� ����� ���/(�/��� '����0 � ������� (�� �� '�������' .��� ��� ���(�������! '��/�0�'����'� ������������������ �'�0�(������ ��<� ��������������� ��/�(������ �(������� ��' ���(���������2 ��� �'����0�(����� �0 ����� �0 '��/��0�'� ���'� ��������������� ��' ���(��������� (�� ��� �� '�������'/���� ���'� ��� ���(������� ���/�� 1/���������� �0 ����� �'��0�(������ �� (����'������ ��� '�00�(/��2

��#���������� �������

��� 0����.��� �������� �� �/��/�'! =� 0���� ������ �������� ��� �'�����0��' (����(����8�' ��' (��������' .��� 5������� 0������72 ;�(� ������/(�/��� ��0�������� ��� <��.� ������ �/����� �0 �������� ����������' .��� ��'�� ���������� ��' ���/���� ��(���1/��! 0��

(

Theoretical gene product:amino acid sequence

Theoreticaltryptic peptides

Match ? !

“ ” translationIn silico

“ ” digestionIn silico

DIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLK

SEDEMKASEDLKKHGATVLTALGGILKKKGH

HEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYLEFISECII

VLQS

“ ” digestionelution of peptideswith trypsin

In vitro

Peptidemass spectrum

2-D gelspot cutting

Practical Experiment Genomic Database Search

DIPGHGQEVLIR

LFKGHPETLEK

KIHGQEVPLR

FDKFKHLK

TEGFHVPR

SEDEMK

ASEDLK

m/zm/z

Genomic database:DNA Sequence

���� �� � ���� ������������ � ���� ����� ���� ������������� ��� ����� ������ � ��� �������� ���� ��������� ���� � ���� � ��� ������ ������ � �������

����� �� �������������� ������ � � ��� �� ����������� � ��� ��� �� �������� � � ������ �������

!���4��� &%���� �"��������5�� ���� �"���=�� �� 5�� �&����� ��5��"�&���� �5 &%����&���� ��� �� ���� 6� &%� �""���� ��� ������&��� �� "��� ��� &��"�&�� "�&%� � ���&�� &���� ���&��"� � ,����6�4�/(

Page 39: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

* '�&�� � &���

������(� ��� �������� ��� 0����' �/� �0 � (��� ������ .��� �00�����(������������ ��' ���� �������� .��� ����(� �������� ���/(�/�� ����������������� (����4�� ��� �������' �0��� ���(�������� ����8�����&��� �����.� �� @���' ��' F��� ,33$ ��' 6��'�� ��' F�������)2

�)

$�"�� �'� ���� �( 3��� ���� 9��� ? ,*--?/ *D-1*27(��� �� �� ���� �( E�&���20. ,7000/ >D?1>2+(

Page 40: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��

���������� ���� ������������

���� �������� ���� ��� ����������� ���� ���� ��������� � �� ���� ��� ����������� �� �� �� ��������� ����� ��� ���������� �� ��� ���� � ��� �� �� ����� ������� ��������� ������ �� �� ����� ��� ������� ��� �� ��� ��� ����� ����� ������ ��� ���������� ������ �� ��� �������� ��������� ���������� �����! � � �� � ������ �� ���� �� ������� �������

���������

� ���� ����� ������� �� �� ��� �� ������� ��� ��� ��������� ���� ���� "#�### ��� "$#�### �� ��� ��� ������ �� � ���� �� � ���� %�� � �� ������ ������������������ ������������� �� �� � �� ������ � ��������� �� ������ ����������� &� �� �� ������� ��� �������� �� ��' �� �� ���� �� ���������� ��� �� ���������� �� �� ������� ����� ��� �� � ��! ���

� � ������ ����� ������ (������� �� ������� �������� �������� ���� ��� ���� �������� �� ���� � �� ������ �������� ������ ���� �� ���� ��� �) * �� "*� &� ������� ���� �� ��������� �� �&� �� �� �� ������������������������������ ���� ��� �� � �&� � ���� �� ���� ���� &� ������� � �) ������ * �� "* ��� ��� ����� &� �� ���������� ���������� �� ����� ��� ������� ������ ���� �& ���� �)""�$�

� ������� ����� ���� +���� ������ ��� � ������� ����������� �� �� ��� �� � �� �� �� +�+ ,(-. ������)��� ���� �� ����� ������ ���� ��'� ���� �$# /�� ����� �� ��� �� �� ��� ���������� ������

����� �� �������

������� �� ������� � �������� ������ �� ����� ����� � 0�� 1����� ��� ����

������� 2 �##� 1����3 ) 3��� -��)&+%��4 *�$�5�*#*$6�$ 7)�����89 *�$�5�:##"5�$ 7.�������8

�� �� �������� �� ����� �������� �� �� ���� ������ �� �� ���� ������ ������ ��� �� �����

� ������ �������� ���� � �������������� �� �� �� ����������� ���������

���� ������ ����� ��������� ������ ��� �� ������ ����� ����� �� � ��� ���� ��� ����������� ������� � ��� �� � �� �� �� ����� �� ��� ����������

Page 41: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

� ���������� ����� � +�� �� ���������� ������ �� ����� �� ��� ����� ���� � ���� � ��� ����� �������� ���&.;�

� �� ������� �� �������� +�� �� �� ������ � ����� ���� ��� ���� � ���� 1�� �� ���� ������� ����� <������������ < ������ � ������� �� ����� � �� � �������

� ������� ��������� ;� �� ������� �� ���� ��������� ������� ���� � �� � ������� ( ��� ������� ��� �� ��+�+ �� �� ! �� �� ���� ����� �� ������ �� ��������������

� ��������������� %�� � �������� �� � ����� �� ! �������������������� �� ������ ��� �� �� ���� � ��� ����� ��������� ��� �� �������� ������ �� ������� ����� � ����� ����� ! ��������� �����������

� ������������� &� �� �� ������ �������� ���� �� � ��� ���� ����� ������ �� �� ��������� �� ���� ��������� �������� ���� ������ �������

� ����� ����������� ��� � ���� � ��� � � �� ����� � � �� �� � ��� ��� ������������ �����������

������������� �� ��� ��� ����������

&� �� ������� ���� �� ���� ��������� �������� ��� ����� �� � �� ���� ������������ �� ��� �� ����� � ������� � ��� �� ����� ������� �� ������ � ����� ��� ��� ��������� ����� �� �) ������ �� �� ����� ����� �� ���� �� ����� �� ������ ���� �� �������� ��� �� �� �� ��� ����� ����� �� ������� �� �� ������ �� �� ����� ��������� =�>;���? �����! ��� �� �� �� ��� � ��� �����

����� � ��@� �������������� �� �������� �� �� ����� �� � ���������� ������� �� ��� � ����� ������� ��� �� �����'��� ����� (����� ��� (����� 7"A5B8 ��� ������ ���� ������� ������� ���� � �� ��� ��� � � ����� ��� ��� ���� ���� ��� ���� ����������� �� �� �� ����� � =) ��� ������ ����? 7(����� ��� (������ "AB�8�

��� �� -�� ���� ��� � �# C �# �� ��� ���� ������� �� ����! �� ������� ��� ����� &� �� ��� ��� ���� � �� "## ����� ���� ����� �� � �# �� ���� ������������� ��� � �������� ��������� ���� �� "#�### ������ �� �� � ���� �� � �� � ��� &� ����

��

"�� ������� ���������� �������

���� �������� �� ��� �� ����������� �����# ����� � �������� ����� ��� ����������

$� ������ ������� �� �� � %��� ��� � ������� �������� ���� �� ������� �� ������� ���������

���� ��������# ��� �������#��� ��� ��� ���� ������������ �����

�������&'# �������&(���� )����� *+ ,�-.*/00�10+2��������&'# �������&(�3�� 3�� �* ,�-*�/.0-1.2*�

4�� 5# 4���6 7� ������������ �8 ,�--+/ �9021�9+-�

Page 42: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

��� ���� ��� ����� �� ������ ��� � ������ 3� �� �� ������ ����� �� ����� ����� �� ��'� ��/ 6# C *# �� 7D��� ���D����'� "AA$8�

�������� ����� �� ������ ���������� �� ���� ���� ������������� E �� ������� �������� ���� �� ���� ������� ���� ������ ����� &����� ���� �� ������ � ������ ��� �� �������� �� �� ��� (� �� �� ������ ������ � ������� ���� ��� ������� �� ������������ �������� ��� ������� ���� (������� �� ���� ������� ��)����� � ��� 7�###8 ���� �� "## ����� � ��� ��� � ����� ����������� ���� �������� �� � ���

��!�� ��� ��� �� � ��� �� ��������� �� �) ������� �� ��������� ��� ���� �� ��� ���������� � ���� �� ����������� � ���� � ���� � �� � �� � ��� ������ �������� � �� �������� � ���� ����� � �������'� ����� �� �������� ����/� �� ���� � ������� � ��� ���� �������� ���������� ������ �� �� � ��� ���� � ��� �) * �� "#� ��� ������� ����� �� � ���� � ����� ��� �� ��� �������� ������ (��� �������� ��� ��� ��������� � ������ ��� � ��� ������ � ���� � 1�� �� ����� ���� �� ������� ��� ���� �� ������������� �� ��� ����� ������ �� ���� � �� ������ ���������� ��� ��� � ����������� ����� �) ������� ���� �� �������� 1�� ��� ��� ��� �&� ��� ��� ��� ����� ��� � ���� �) ��� �� ��� �&� ���� ��/� �� ��� �� ����� ����������% �� ��� � ���� ��� ���������� � ������ �� �� �������� ����� ��� �����! � ���� �������� ���� � ���� ����� ��� �� ���������'����� �� �� �������(� ���� �� �� �) ������ �� �� ���� �������� ��� ��� ����

�� ���� ��� ���������� �� �������� �� �� �����! ��� ���� ������ ��� �� ������ � ��� ��� ���� �� ��� %������ ����� ��������� �� �� ��� �������� ���� � � �� ������� ������� �� �� ������ �� �� �) �������� -����� ���� ����������� �������� ��� ���� ��� ��� �� ����� �� ������ ��� �������� ��� �� �� ������ �������

"� � ������ ( ��� ��� ���� �� �� �� �� �� ������� ������� ������4 �>;��� � ��� 7"A558 ��� ����� �� � �������������� �� ���� �������� �4 �.,)-. 7����! ����� � �) ����������������8� ) �� ����� �� ����� ���� �� ������ �� �� ���� ��� �� ������ � ������ ���� �� ������ ����� �������� ������� �� � �� ������ ��� � ����� ��� ����� )����� �� �� ��� ����� �� �� ��� �� ����� � ���� ��� ��������� �������� � ��� ��� �� ��/ �� &.;9 �� ��� ���� �� ������ �� ��� �� �� ������ ��� �������� ������� ��

�#

������ �# :�����# ���;������ 5� ����������� ��,�999/ �8�.1�8���

$� ����# ����# ��� ��� � ��������� ���� !��������<�� )��� �� 8�. ��� .��� �� �� ���� � ��< ���������� ����# ����� ���������� ��������� �� ������ � ����# ��� �� ��� ��� �� �� ���� �������

��� ����������� ���������� �� �� �� � ��������# ����� ��������������������� ������ )���� ��������� ����������# ���� ������ ������� ���� � �������� �� �����

;=%��� >?# '�������"#;=%��� >�� 3 �� ,�-../��001��2��$� ������� �� ��� ������#��� ����<� ���� �� �������� ������ ����� � ����������

Page 43: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

$�!���� �% ������� �� ����� ��� ������� ��������'��) ������� ��� �� ������ �� �� �������� �� ��� ���������� �� %@��!���� � ��! 7"AB�8� �� �) ������� �� ��� ��� � ����� �� ���������'��� �������� ������ ���� �������� ��������� ���������� ��������� ��� ����� ����� �� ��� %�� ��� � ����� �� ��� ������ �� �) ������� � ����� �� ������������ ���� ��� �� ��� ���� ��� �� �� ����� ������������ �������� ����������� �� ��������'� �) ������� ��� ������� ����������� �� �� ������� � �� �� �� �� ���/ �� 0������7"AA#8�&� ������� ��� ��������'� �) ������ ��� � ���� �� � �����

�� ��� ��/ ������� ������ ���� ���� ����� � ���������'� ����� ���� � ����� ���� � ��� ��� �� ���� �� ��������� ���� ������ (������� �� �� ���� ����� �� �� (����/� -F�� ������� ������ � ������ �� ������� �� ������ ����� ��� ��� � ��� ��� ������ ����� �� ����� 7+���� � ��! "AB5� ���-F� � ��� "ABB� �###8�

�� � �� ��������'� �) ������� �� �� ���� �������� ��������� ���� ��������� ����������� �� ��� ����������� ��������� � ������ ���� +��� �� ���� ����� ���� � �� �������� ������� ���� ���� � �������� �� �������� ��� �������� ��� �� �! ���� �� ��/ ��� ���������� � ��� ������� ����� ������ (� ������������ ��������� ��� ���������� �� ���� ��� �������� �� �� ����� 7%����� � ��! "AA$8�;���� ������ �� ��� ������� �) *<"# ��� 6<5 ��� �� �����

'�� (�� �� ������ �� ����� ��� ������ ������ ��� �� ��������� ��� �������'�� �� �������� �� ����� ����� ��� ����� ������� ��� ���� ��� �� ���� �� ���� �� �� ����� ���� ������� ����� �) ������� � ������� ( ���� �) ������ ����������� ��� ���������4 �� ��� � ���� ������� �������� ��� ������������ ������� ��� ����� �� ����� ����������� ��������� �� ������� �� ��� ������ �������� +�������� �� ����� ������� ! � ���� ��� ���� ����� �� ��������� �� ��� ������� �� ��� �������� ����� ��� ���� � ������ ����� ���� ����/���� ����������� % � ��������'� �) ������� � �� ���� ������ ��� ��� ���� �����! �� ���� ��� ������� ����� �������

�&

)@����� )# < 4# A������ >'#'����66� # 'B�� �# C������� A# >���C� 5 )�����)���� � "����� 8 ,�-*�/0�.100-�A������ >'� ��D )����� A�#��� 4�������� >�� ���������6� �� ��������D���� ��� �������� � �����# �������� ,�--9/�

������ 5A# ������ �"#������ (# C�� 5# >���C#'B�� �� ����������� *,�-*./ �8+1�.0�'B�� �# >���C# 'E���� �� ����������� - ,�-**/+0�1+28�'B�� �# ;������ 3#)�����'# ����� �# ����� )#C������� A# C���C� ������������ �� ,�999/ �90.1�9+0�

)����� �# )����� (#&����< 5# % �5# (���� >"#A�������� ># ������#)���� "# >���� �# 'B�� �� ������������ �8 ,�--+/�-0+1�-2+�

Page 44: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

�����'���� ����������

�� ����� ������ �� �� /� �� ��! �� � ���� �� ����� ������������ �� �� ��� ����� � ���� � �� � ����� �� �� ����� ���� ��� ���������� �� ����� � ��� ����� � �������������� ���� �� �� ����� � �� ��� � ����������� ���� ������ ��� ������� ��� �������� �� �� ������ = ������������ �������������?7 (G8 �� ������ � �� � ������� ���� �� ��� ������� ��� � ����� � ����������� ���������� ��� ����� �� � �� � ������ ����� � ��� ��� ��������� �� �� ����� ��� ��� �� �������������� �� ��� �� �� �������&� ��� �� � �������� ���� �� ���� ��� ������ � �������� ��

�� ��������� &� �� ������� ��� �� ���� �� ��� ��� ������ ���� �� � ����� ��� � �� ������ � ���� ������ ��� )������� ���� ������ �� �� ���� �� ���� �� � ������� � �� � ��������� ( ������ ������ ���� �� ���� �������� �� ��� ����� ���� ��������� 7%��/� � ��! "AAA8��� ����� ����� ������ �� ������ �� �� ����� � �� � /��

�� � ����� �9 �� ����� ����� ������������� �� ����� ��� �� �/�� �� ���� �� �������9 �� ����� ����� ��� �������������� �� ������ �� � /�� �� ���� �� ����������� � �� ���� �� �� ����� ���� �� �������� ��� ���� ��� ����

�� ���/� ������� (������� � ��� �� ��� � �� �� ��/ ).,.+���� �� �� ������ �� �� ��� �� ��� �&�� ����� � ��� �� ������� ���� ��� ����� � ����� ������ �� �������� �� � �� ��� �� ������ � ������ ������ ��� �� � ������ ��� ���� � ���� ������� H�!�

�� ������ ��� �� � ���� � �� ���� �� �������� �� ���������� �������� ������� ��� ����������� +�� ������ ��������� ��������� �'���� ����� � ����� ����� �� ���� ��������������

��������� ������� ( �! ���� ����� ���� �� �������� ����� �� �� ������������ �� ����� �� ����� ���� � �� ����� ����������� �� ���� ����� �� ������������� �� �� � �� �� ������� ��� � � �� �� ������ ��� ���� ���� �� � � ������ ��� ��������� � '��������� ������ � �� � ����4

� ��� ����� ����������� � ��� ��� �� �� ������ ����� ������ ������ ������������� ���� �� �� ��� �� �� �������� ��� ������ ����� �� �� ��� � ��� ���� �� ������� ��� �� � ���� � �� �� �� ������� ��� �� ������������������

�(

C��� ����� ������ �������� ���������� ������� ��� �������# ����� ����� ������������ �������������� �� ��������

)��<� A� ����"5# %����"�#���� �# >������5# &��� $#'����"# ������ ># �� >5� ����������� �9 ,�---/8*-1.99�

�� ����� �� ��� ����. ��F( ��� ���� �� ������� !��� �� �� �� ������������������

Page 45: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

� ������ ��������� ���� � �� � ����� �� �� �������� ��� � ���� �����

� (�� ������� ���� �� ���������� ���� ��� �� � �� ������� ��� ����� %�� � � ��� ��� ���� ���� �� �� ���� � ��������� ��� ����� � �������� �������� �� ��� ������� ��� �� � �� �� �� ��� ������ �� ��� �������

� ,���� ������� ��� ������� �� �� � ��� ��� �� �� ��� ������ ��� � ����� �� �� �������� �� ���� ������������� ��� � ����� �� �� ������

� ,���������� ���������� � ������ �� �������� ���� ���� �����������

� ;� �� �������� �� �� ������ �� ��� �� � ������� ������� �� ���������� ���� ���� �������� ����� �� � ���������� ���� �& �������� �� �� ��� ���� ���� �� ���� ����������� �� ������������� �� �� �� ������� ��� ���� ����� �� �� � ����� �� �� ��� �� %@��!���� � ��!��� ������ ���� ���� �� ������� ���� ��������'� �) ���������

�� ������ � ���� ������ ���� � �� ����� =����� � ��?��� ��@� ���/� �� �� ����� � �� ��� ��� ��������� �4

� ���� ��� ������ ���� ����� �������������� ���� ������ ���������� ������ ,��� ����� ��������� ,��� ����� ��������������� -� ���������� ������ ���� ��� ���� ��� /� ��� �� ��� �

������ �������� �������� ��� ��� ���� ��� ������ �����9 ����� �� ����������

�� ���� ��� � ����� �� �� �� �� ��� ��

����������� � �� ���� �� ������ ������

� � ����� ��� � � � ���� � ! � "##� $�% � � ����� ��&��'��� $�$$( � ������&��� �����

�)

��� �� �������� �� ����������� �� �������� ��������� �� � �����������������

�� �� ������������� �������������� ��� �������� �������� �����# ����� ����� � ������� �� ���)@����� )# ����� '5#>������ 3# >����&# A���� %#�����6 5�3# %������ �#����������� �� ������������2 ,�--0/ �9�01�90��

Page 46: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

*��� �� ���� � ����������� �� ��� �� ����� ������ ��������� ������������ �� ��������� �� ������� ��� ����� �� �� ��� �� �� ��� /� ���������� ������ �� ��� ����� ��� �� ���������������� ����������� ���� �� ������ ���� � ������ ��������� ����� ������� ��� �� � ���� �� � �� �� �� ������� ��� ������ �� �� ���������� ������� ��/ ����� ������4���� �� �� � ��� �� � �� �� �������4 &�������� ��� ���� ��������� � �� � ������� ��� � ��� �� �� �� � �������������� �� ������� � ����� �� ������� �� ������

��������� )(,+ �� � '��������� ������ ��� ��� �� ��������� ������ ���� � ��/ ����� I�"## ��� ������ �,�6#� ��� ��� ��� ���� � ���� &� ������ �� ��� ������ �� ���������� ��������

+������ ����� �� � ������ ��� � ��. ���� ������ ���������� ���� �� �� ������� %��� � ������������ ��������������� ��� �� ��� � ��� ��� � �� ��� � ����� ���� ���� �) B70������ � ��! "AB�8� D���� ��������������� �� ���� ���� ���������� ��� �� ���� ���/ �� ����������� ���������������� ,���� ��� ,� ��,��' �� 7�##"8� ����� ����� ��� �� ��� ����. ��� ���� ����'� ���� ��� �D �� B ��� ����� ������ ������ � ��� &.; �� ����� �) �������� ���� ���� �� ���'��������/� ������ ��� ��� ����� �� �� ����� ��� � �� ����! ���������� �� �� ����������� ������������ ����� �� �� )�� � ��! 7"AAB8� �� ������

��� ������� �� � ������� ��� � �� ��� ��� ���������� (� ���� )�� � ��� 7�##"8 ��� ��� ������ ��/������� �� ��������� �� &.;� ����� ���� �� ��������� �� ����� �) �������� )����� ���� �� ��� � ���� ��� ����� ��� � ������ ��/������� �� ��� ������� �� � ������ ���� �� ��� ��� �� ������� ���� � ��� �� ����������� ������� �� ������ �� �&� �� �� ����� ������ ���� ��������� ����� �� ����� ������������

(� �������� ��� �� ��! �� ��� ��� ���� ��� ����� ������� ������� �� � ����� �� )����� � ��! 7�##"84 �� �������� ������ ��� ��� �� ��� �� �� ��� ������ �� ��� �� � ����������� ����� ��� � �� �� ��� � ������ ��� �� �� ����������� ���� ������

������ �������� �� ���������� ����� ��� �� ������ ��������� �) �������� ����� �� ��� ������ �� ������ ����������� �� � ����� ���� ����� � ���� &� � ���� ��� � ��������� �� ��� ���� � &.; ��/ � �� ��������� ��� � ��� ����� ��

�,

7�� �� ��� ���� �� �������#����� ��6 1 ������� ����� �������

"��� ��������� �� ���������� ������� �� �������������������� ���� ������� �<$����� G��99�

A������ >'# $����'#'����66� � 5 )����� )���� �"����� 8 ,�-*�/ ��-1���>����� 5# >���>�6� 4� ���)����� �*- ,�99�/ -*1--�

����� )A# "�� ">#'�� ��# C��� )5#)� ���C'# C����� 4( ����������� �- ,�--*/*2+1*+������� )# '�����"#������"# ;����� #"��3���� 5# >���� �#A������ >'� ����������� ��,�99�/ �9281�9+.�

������ �# '����� )# :�����#"E� �# A����� A3# ���;������ 5� >�������� �,�99�/ ��.1�02�

&��D $� ����������� �������� ����� �� �� �>'������ ��� �� ������ �������

Page 47: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

��� �&�� �� ��� ���� ������� ������� �) �������� ����� �� �� �������� �� ��������'� �) �������� � ����� ��"���� �3��� � &,- � �� ���� � � ������ �� �� ������ �)

�������� +������ �� ������� �� � �� ��� �������� ���� �� �� ��� �������� ��/ ,������� �) * < "#� ������ �� �������� &,- � ���� ��� ����� ��� � ��� �� ���� ��������

��� �� ������� �� %�������� �� �� �� �� � �� � �������� �� ���� ��� ����� ����������� �� ��� ��� ��� �� �� ������� � �� ���������

����� � ��!��� +�� ������ � ���� ����� �� ���� �� � ��� �������,���� ��������� ��� ��������� ���� �� �� ��������� �������������� �� ��� ��� ������ ��� ��������� ���# �� �! ���� ��7B ����EH8� � � �� �� � ����� ����� ��� &� ��� �� � ���� �� �� ������ ��� �� �� � ������ ��� � �� �� �� ���� ���������� �������� 7(.%+;8 ������ �� $ < "# ����EH �� ��� ������ � � ����� ��� ������ ������������� �� ��� ������ 7� ��� "AA*8� ���� ��� ��������� ���� ����������� �� ����� =���/�����?� +�� ������ ��������� �� �� ���� ��� ����������� ��� �� ����� �)� ������� ��� < ���� 6# ����EH < �� ������� � ���� �� �� �������� �����,����� ��� � ���������� �� ������� �� ����� �� +�+ � ��

�� � �� ������ ��� �� �� �������� �� ������������ ����� � ���(���� ��� �� ����� ������������ �� �� �������� �� ������������ ��������� �� < �# J ���� � ( ����� � ���� �� ��������������� ���� ������ �����

-�.���� ������� ��� ��� � �� 6# ����EH � �$ ����EH ����� ��� 70������ � ���� "AA68 �� ������� ���� �� �� ����� � �� �� ������' �������������� �������� � ���� ������ � �� /� ����� ��������� �������� ��� �� ��� � ���� ��� ����� ������ � �� ����� ���� �� � �������� �� �� ��� � ��� �� � ��/� ��� ������������ ����� �� �� � �������4 �� ����� ������������� ������� ��� �����1�� ������ � ������� ���� ������� ���� �� �� ���

��� ��� ������ �� ����������� �� �) �� �� ����� � ��� ��@ ��� �� �) B�$ ���� ����) �� ���� ��� �� �� �� �� �� ������ � �) �� �� �������� 7K�� � ��! �##�8�

�/

$��� ����� � ���<� �� ��������� ������6����� !������� ��� � ������� ����� ��

)������� �� ��� � ����������� ���� ;����'�

7��������� ��� �� ������� �������� ������������� ��������������"5� ' ����������� ���������� )��� ��������� >�������� ��� >���# ;!����,�--0/�

A������ $# :��� 3#(����� 55� ����������� �+,�--2/ �++�1�++*�

?���'# (� �# �3����#3�� �# ����# '��� H#%��"# '���� 5# ��&#$� �� ># )��<" # (����� (�#>������� ��� 3# ?��� H� "�3 >�������� � ,�99�/ �������

Page 48: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

0��1������ ������ ���� �������� ���� �� ���2 3� �! ���� ������� �� ���� ���� ,%+ 7��������� ��� �����8 �� ������� ,%+ ����������� �� ��� � ���� ��������� ����� ���� �� ���'����� ���/���� &������ ����� ��� � ���� ��� �� � ������ 7"# ����EH ���� �$# ����EH � ��� �)584 "��" � ���� B$�: � � ���� ���� � �� " H ���� )������� ����� �� �)5 ���� 6 ���EH ) ��

���� � ������2 �� ����� �� ��� ����� ������ �� ������ ���� ��� �� ������ �� ����� ��� �� ������� ����� �� � �� � ����� ���� �� ������� ����� ��� ���� ����� ����� +������ ���������'� ���� � �� ��� ���� ��� ���� ���� ����� ��� ����� ;� ���������������������� $ < "# C "#: ��� ! ������� � � ���� ������� %��������� ��� � ������ �� ���� �'��� �� <�# J ��� �������� ;���� �������� ����� ����� �� ������� �� ������� �� �� ����� ����� �� ���� ��� � ���� 1�� ������ � ���� ���� �� �������� ����� +�+� �� ��� ���� � �� � ��� �� ���� ����� ��� ������ � ��� ���� #�" L 7�E�8 +�+ ��� �� &.;� +��������� ���� � ��� ���� ���� � �� ��� ����������� ;��� ��� ���� ��� ����������������'�� � ������ �� � �� �� �� ��� ����� ��� ���� ������ ��������� � ��� ������ ���� �� �� ��� ����� � ���� ���� ����

���� ��� ���� �� ��� ����� �� �� �������� �� ����� �������� ��� ! �� ����� ������ ( �� ����� ������� /�� �� ������� �� �� ������ ������� �� ����� ������ �� �� � ��� ������� ��������� �� /�� �������� �� ��������� � � �� ��� ����������� � ����� ! ������ �� ������ ������� ��� � ����� ������ .�������� ��� ���� �� ����� �� ���� �� �� � � ����� ������ ����� �� � �� ��� ( ������� ���� �� �� �� ���� �� ������� �� �� ���� ��� ������� ��� � ���� �� ����� �������&������ �� ������� � ���� ��� ���� � ����� �� �� ����������� �������� �� ��� ������ ��� �� �� �� �������� ��� �����

� � ���� #&� �������� ���&�� ��� � �������� �&� (�"� ����� #&������� �� & �� �� �����'�� � ������������� ) ' � �� �&�����&�' �������� � �&� �'� ���������

+����� �� ��������� ( � � ����� ��� � ����������� ���� ���� ����� ���������������� � ���� ������ ������ �� ���� ����� � ���/�� �� ���/����$����� ���� � ��� ���'� ���� ���� �������� �� ���'����� ���/�

�� �� ������ ��� �� �� ��� ; ����� ��� ��� ���������� ������ ������ ��� �� ����� ��� �� � ������ �� �� ����� �� ��

�3

�� �� ��������� ���� �� �������� ������� �������� �������������� �� ����� � ��� ������ ����� ������� ��� ������< ��� �� ���� �� �������

C�� � ��������� �� ���# ��������� ����� � ��������� ��� ;� ����� ������ ������ ����� �� ���� �� ����������� �� �� ����

������ ���� � ������ ��������������

Page 49: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� &.; ��� ��� ��� � ���� ���� ��(� ��� 0�(� ��������� ����� �����! �� ����������� ����� ��/� � ���� ����� ��������� �������� ,���������� ���� ���� � ���� ����������� � ���� ���� �� ���� �� ����� 7M �L8 � ���� ��

����������� ���� ��� ���� � ���������� �� ������������ ����������� �� ���� �� �������� �� ���� �� ����� ������� ���� ���� ������� ���� � ���� �� ������������ &� �� ��������� ������ ���� � � ������� �� �������

4������� �������� ���� ������������ � �� ����� ��� ���������� ���� ���� �� ���������� ( ���� �������� /�� ��� �� �������� �� �������� �� ����� ������ ���� ������� �������� ��� ����� ������ ����� .��� �������� � � �������� �� � ����� � � ���� � ������� ��������� � �������� ������ �� ���� �� ����� ���� ����� �� � ����� �� B�### �� �� ��� �� ����� �� ������ ���� ��� �� ����� �� ����� ��� ����� �� � ��/ ���������� �� ��� ����� �� ����� �� �� � �����'� �������� �� � �� � ��� �� �������� ������� +���� ��� ���� �� ����� ���� �� ���� �� ������ ����� �� �� �������� ����� ������ ������ ��� �� �� ������� ;�������� ��������� �� � � �� ����� �� ����� �� ��� ���������� �������� ��� �� � �� � �� ��������

�������������� �� ����� �� � ��� ���� �� �� ������ �� ��� � �������� ;� �����4 ,����� �� ���������� ����� ������� � ��� �� �� �� ���� �� ����� (���� �����4 �� �� ��������� ��� ���� ���������� ����� ���� � ������ �� �� � ���������� �� �� ��� -F� � ��� 7"AA$8 ����� ���� �� ����� ��� � ������������� ������ � ��� �� ���� &.; ���� �� �� ��������'��) ������ ����4 �� ������ ������ ��� �� � ������ �� "## 3 �� $�� ��

��������� ����� �� � ���� ����� �� ����� � ����� ����������� ���� 4

� ���������� �� ��� ��������� ������� ��/ �� ��������� �

� 0����� �� ���� ���� ���� ����� ��� �� �� ��� ����� &��������� �� ����� ���������

�� ������ � ��������� ���� ������� � ������� � �� ��������� ������ ������� ������� ��� � ���� ����� � ��� ����� ����� ����� �� ������ � ��� � ����� �� ����� ��� �����

4����� !� 5� �� ��� 0�6��� 7�3/&82 G������ ��� �������� ����� �� �� ������ (�� ������ ��� �� ����� � ������ ���

�9

'B�� �# )����� '# ;������� 3# >���� �# C��� C� ����������� �8 ,�--+/�9.-1�9*8�

&��D >����� ���� ��� ���� ����� �������

C�� �# %E�� 7�� ���)����� �0* ,�-*2/ �2�1�20�

Page 50: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

�� ������ � ��������� �� �� ��������<�������<��� ��������� .���� ������� �� ����� ������� �� ����� �������

4����� !� ������� �� ��� 7�3/)82 �� ����� ������ < � �� < �� ���'� �� ��! �� ������ ��� �� �� �� � ����'� ����� �� ������ ���� ���� "# L � ( �� ���� ����� 7<�# J 8 ���������� #�#5 L ��������������� ,���������� ��� � ������� �� � �'� ��������� ����� ������ ��� ���� ������� ���� ����� 7<�# J 8 ����������� #�#5 L ��������������� (�� ����� ���� ������ �� ������ � ����� �� ����� � ��� ��� ��� ��������� ��� ����� �� ����� ����� � �� ����������� ��� ����� ���� ��� ������������ �� ���� ���� ���� ���� � ��� � ��� � ��� ���������� ���� �� ����� ;�� * ����� �� ��������� �� � ��� �� � ����� ��� ������� ������

�� �������������� ��� � ����� �� #�" L ���� -F� � ��!7"AA58 ��� ������ ���� ���� �� ����� �� ����� ��������� ������� ����� ����� ��� ������ ���� �

4����� !� 4� ��� ��� %��� 7�33382 ���� ���� �� ������ �� ������������ ��� ����������� �� ��������� ������� %��������� ���������� � ����� ������ �� �� �# L �� �� ���� � ��������� ������������ ���� � ���� �� ������ ������������ ����� ���������� �� 6 J � ����� ��� ����� ���� �� ��� ���� ��� �������

��� �������� .�2 ���� ���� ��� � ������� �� �� �� ������ ��� � �� �� ���� ���� � ����� �� ������� �� ������ �� ������� �� ������ � ��! 7"AB:8� � � ���� � ����� ������������

��

0�� #2 ��� � ������������� �� ��� ��������� �� �� � �������� � ���������� �D ���� � ������� ��� ������������ ���� ��� ������� �� ���������� ���� ���!������ )D ����� ��������

'�D ��" � # �� �$% &'#( ��� )�)$�%� � � �* + , �� � �� ���- . $( ��� ����/� )� 0�� ������ "��� ���1��/� ��( �������� 1��������� )�"������� ���� /�� ����������

����� ��������� �������������I������ 3# �:����#?�� "# $������� ������������ . ,�-*8/ +01+2�

'B�� �# ;������ 3#)�����'# 3������ �# ���6 5�5#"��@�� 5�5� ����������� �*,�--./ 0�*100.�

"����� A# ��"� ���)����� �.0 ,�---/ 0�010�+�

���� < $# ����7#������ ��< � �� (�� �����&�� - ,�99�/ -1���

Page 51: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

������ � �� ��������� ��� �������� ���� ��� �� ��� ������ �� ���� � �� �������� ��� ������ �������� ���� ��������� ��� ������ � ������� �� �� ������ ���� ����� � ����� ���� ������ ���� ���� ���� � ���� �� � ��� ��+����/ � ��! 7�##"84 �� ���� ��� ���� �� � ���� ���� ��� ��� �� �� ����� ���� ������ �� � � ������ � ��� ������������ ������� ���� ����� �� ������ �� ����� �� �� �������� ����� ��� "55 ���

:��� ��������!� ������ 2G���� ������ �� ��� ����� �� ���� ��� ����� ( ��� �� ������'������ ��/ �� ! �� �� ������ �������

������� ���������2 ;� �� �������� ��� ��� ���������� �� ���������������� ������ ��/����� ������ � ����������� �� 5 ���EH � �� � � ���EH ���� � ��� �������� '��������� ������ ��/(+% "6 � � �������� �� �� ����� ��� ���� ��� � �� ���� � �� ���� ������ ���� ��� ���� 70������ �� "AAB ��� G����� �###8�-������ �������� ���� � ��� ���� � ������� ������

�� � �� �� ����� ����������� &� ��� � ����� �� �� ����� ���� ���� ����� ��� ����� �� � ���� ����������� �� ��������� �� ��� ���� �� ������� )��� �������� ��� � ����� ������ &� ��� 6 �� � ��� �� ��� ���������� �� �� ��� ������� �����4 �� ����� � �� ����� ���� �� �� �������� ��� ������ ������������ ����� ����� ���� �� ������ � � ���� � ��������� ������� �� ���� � ���4 � ������ ���/ �� �� ������ ����� �� � ����� �� �� �) ��� ���� �� ���/� +� �� � ����� ���� ���� ��� ��� �� �� ���

��

0�� &2 ��� � ������������� �� ��� �0����������� �D 2 ��� !����� ������� ,�� �2 ����� )D 2 ��� !����� ������� #�� �2 ���� �� � �� �2 ��������� '�D��" � �, �� �$% 3'�4 � ����(

)�) $�%� � �4 + �4 �� � � �� ���- .$( � �� ����/� )� 0�� ������ "������ 1��/� ��( ��������1��������� )� "������� ���� /������������

A������ $� ����������� �-,�--*/ .+*1.89�"�� ">� ��� )����� �*9,�999/�1�9�

$��� ����< ��� �� ���������� �� ��� ���� ��������

Page 52: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

'�' ���������2 &� ����� ���� �� �� ������� ����� +�+��� � ������ �� ����� ��������4 � �� � L +�+ ��� �� ��� %�� �� ����� �� ������ �� ���� ��� �������� ��� ������ +�+ ����� ��� �� � �� ���� �#����� ��� �� ���� � ��� � ����� '��������� ����� ���������� ��� ����� &� �� ����� ���� ��+�+ ���� ����� ��� �� ������ ��� ����� ���� �� ����� ����@� ����� �� ���� +�+ �4

� ;������� �� ������� ��� � ������

� �������� ���� �� �� ��� ����� ������� ! � ��������� $ ��� �� �� " �� � L +�+ ��� ��� � ��� �� ��������� � ���

� +�� �� ���������� ������ ��� ! � �������� �������� ������ �� +�+�

)���� +�+ ��� ��� ������ �������� ����� ��� �� �������� �� �� ���� ���� ������� ���� � ��� �� �� ����� �� ����������� ������ �� � �� ������ ��� � +�+ ��� � ���� ������ ��� ����� � /�� ����������� ���� �

;�� ��������� ��������� ��� ����!���� 2 ( ��� �� ���� '���������� ������ 7 ������ � ��� "AAB8 ��� ��������� � ���������� 73 ����� � ��! "AA$8 ��� �� ���� +�� ���������� ������ ������ �� �� � ��� ����'�� ����� ������ �� �� ����� ����� �� �� ��� ��� �� ��� �������� ��� ����� �� ��� ������ ���� �� ��� ����� �� ������� ���/����� ( ���� ��� ������� ��� �� �� �� ���

G� ����������� �� ����� �������� �� ��� ������������� � �� �� �� �� ��� ���������� �������/ �� %/���� ���+������ 7"AAB8� ����� ��� � ��������� ��� �� �����4 ����4EE����������������������������� ��� �� �� ����� �� 0������� � ��� ������ 7�###8�

���� ��������� ��� ������������ 3� ���������� ������ ��� ���� ���� � ��� �������� ��� ������ 1�� ����� ������ � ������ ���� �� �� ������ �� ���) ��" �� ���� �� �� �������� ����� ":�%( � ������� �� ��+�+ ���������� 7H���� � ��! �###8� ���� �� �� ��� �����

�#

$� ��� ������������ �������� ������� ���� ��� ������� �� ��� ���� ����������

%�� ������� ������ �� ������� �����

%�� ������� ����

3����"# ������� :#�>����� �# A����� �# %���� �#4���� �# A�������"#(������ 5# '��� 5# A������ $� ����������� �-,�--*/�-9�1�-9-�:����� (# "���� &# A������� $� ����������� �8,�--+/ �-+1�-.�

)�<��� $# ������� $��������<D ��� ������������� ������� )��������*9�82�-�89 ,�--*/�A������ $# 3����"� ��A������ $# �� >�����������D $������������ ������������ ��� �������������� ������� �������# )��������� &� H��< ,�999/-1�-�

(�����# $�<J�� )# ��� �#)���� ># (��� ��C# C��� )#'�� 3# %�������<��"� ����������� �� ,�999/2��12�-�

Page 53: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

������ ������ ��� � �� �� �� �� ��� �� ��� ����� ���� ����� �� ���� �� �� &.; E +�+ ,(-.� � � ���� �������� ��� ����������� ��� ������� ������ ����� � ������ ����� (������ ������� ������ ���� ":�%( ��� � ��� �� �� �������� ��� ������ ��� ��� ��� �� �� ����� �� ���������� ������ �� �� ������ 7,� N���� ������ ���� ��������8�

%�� �������� ����� ������ &� ��� ���� ���� � �@�� ��� ��� ��� ���� �� ����� ������������ ��� � ������� ��� � ��� � �� ����� �� ��������� ��� ���������� �� ���������� ���� ���� �� ����� ���������� ��'� ���� "$# /��� &� �� /����� ���� )G1 ������ �� ����� ��� �� �������� ��� ���� ���� % � ��� � ���� ��� ��� ���� @ �� � �� � ������������� +�+ ���&� ���� �� � �� �� )G1 ����� �� ��� �� ����� ���� ���

�� �� ��� � ����� �� � ������������� +�+ ,(-. ��������� &�)G1 ������ � �� ������ �� �� �� ����������� �� ��� � ������� �� �� ����� ���� +�+ ����� � �� ��� � �� �� � "�� ������� ��� �� �� ��� �� ����� ���� �� &,- ���� � �� � �����+�+ ���

<��������� ������ 1�� � ����� ����� �� ������ �� �� ���� ! ������ �� �� &,-����� �� ��������� ���� ��� ��� 4 1�� �� ����� ���� ��� ���� ����� �� �� �������� ������ �� �� ���� � ��� � ���� ��� ������ ������ 1�� �� ��� �� �� � ����� �� ��� ����� �� ��� ������� ���� � ���� � ��� �� �� ����� ��� �� �� �� � ���� ������� ���� ���� � �� �� � ��� 7� ��� $8� �� ���� ���� ������� �� ����� ���'����� ���/� �� �� ��� ���

=������������ � ���� ������ ��������� ��/ �� ������� ��� � ����������� ���� �� ������� ����� ������ 7��� %������ % (�H���8� ;��� ��� � ���� ��� �� ��� � ������������ �� �� ������ ���� ������ �� ���� 0������ 7"AAA8 ��� ������� �� ������������ �� � ������� ����� ���� �� ���������� �� ��������� #�" ���EH ) ��

�&

IEF

0�� (2 ������ ���� �0�� ���� � ������ � � �$% ������

$����� ��������� �� �������� ������ �� �� ���� ���� ����������

A����� (�� �� (��< �5� , �/��� >����� ��� ��� >��������� "����� �� "�����)���� ���� ������ >���#$�����# &5 ,�---/ --1�90�

Page 54: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

( ���� ����� ����� ��� �� ����� �� �����4 �� ���� ��/� �� ! ����������� ����������� ������ ���� ������ �������� � ������� ������ �� ����� �� ���� �� �� ������� ������� ������ ���� �� ������ ,�������� ������ � � ����� �� ���������������� ��� ���� ��� ��� �� ���� �� ��� � ���� ���������� ����� �� ���� ������ �� ������ ���� �� �� ������ ������������ �� ����� ��� � ���� ����� �� ����� �� ����� �� #<$# ���;� � ����� ��������� �� ��� ��� �� ����� ���� ��� �� �

������� ���� �� ����� ��� �� ��� �� � ���/�� 3���������� ����� ����� � �� � �� ����� ������ �� ����� �� �������� ���� ������������ � ������ �� ���� �������� 7� ���� A6 ��� �6$8��� /������ �� �� ����� ������ �� � ����� ��� � �� ��

� � �� ����� ��� � ���������� )���� ��� �� ����� ������������ �� ��������� ���� ���������� ��� ��� ��� �� � ��� (������� ����� �� � � � ������� �� ��� ��� ��/� � ��� :#L ��� �� ��������� ���� ��� �# L �� �� ����� ������ ��������� �� ����� ������ ��� ����� �� � ��������� ����� 7�����8� �� � �� � �� ����� ���� �� ����� ����� ������� ���������� �� &,- ����� �� ���������� � ���

-�������� ��� � ���������� ���� ���� +���� ����� � ���������� �� ���������� � �������� &� ������ �� �� ��� ��� �� ���������� ����� ���� ��� ���4 ( ����� ����� ���� �� �� ����������� �� ��� ������� �� �� ������ �� � �� �������� ���� ���/ ���� �� � ������� �� ��� � ��� �������� 0� ����� ��� $#�� "$# �� �� ����� ����� �� ������ �� � ��� ��� ���� � ��������� ����� �������� ������ �� �� � ������� �� �� �� ������������� ,������ ��� � ����� ���� " �� ����� ����� ��� ������ ��� � � ���� ������ ���� ������� %������� %� � ���� � ������� �� ����� ���� � '���������'���

'����� �� � -���� �� ���� !��� ���� %��� �� ��� � �� �������� �� � ��������� ��� ��������� �� ����� ��/�� �� (����� �� ���� ����� ���� ��� ��� �� ������ ���� �� �� ) ��� ��������� ���� ��� ����������� �� ������� �����'��� ������ ��� ���� ������ 7(����� � ��! "A55� "A5A8� ( ������ ����� ������ �� ���� ��������'� �) ������� ��� �� � ������ ��) ��� � ��! 7"AA�8�

�(

$� ������������ ����� �� ����� �< �� �� ��� ��������� <���

������� (# �������&'� >���&�� ���� ��� 7��� .2 ,�-../+2��1+2�+��������&'# �������&(#$��<�� �(� 3�� 3��� �+,�-.-/ ��--1���9������ '5# %������ �#>����&# A���� %# >������ 3#�����6 53# 5��� A# $����� 5�#)@����� )# ����������� �%� ����������� �0 ,�--�/.9.1.�2�

Page 55: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

%���� ������ ��� � �� ��������� �� �� �� �! ���� ���� � ����� �� ������� ��� ��������� ����� ��/�� ) �� �������� �� ���� �� ��� ���������� �� ��������� �� ��4 )�������� ��� G��� 7"ABB8� O � � ��! 7"AA�8� K � ��! 7"AA:8�% /��� � ��� 7�##"8������ ����� ���� �� �� ���� �� ��� � ������ ����� ���� �� ��

���� ������ � ���� ����� ����� ���� ���� �� ���� ���������G����������� ���E� ���������� ���� ���������� �� �������� ��� ����� � ! �� �� ����� ������� �������

-�!�� ;� � � ��� ������ � ���� �� ���� �� ����� �� ��� ���� ��� ���� ���� ����� �� ������� �������� �� �� �� �� �� �������� &� �� ��� ��� ������ �� ������ ��/ ������� � �� ������������ �� �� �� �� � � ��� �� ���������� �� ������� ����� ������ �� �� � ���������� ������� 1�� ��� ��� ������ ���� �� ����� � � +����� %� ��� ��� ���� ������ ���� ��� ������� ����� ����/ �� ��� ��� � ���� ���� ��� ���� ���� �� �� �� ���� �������� �� �� �� ����� ��� ����� � ����� �� ��� �������

���� ������ +���� �������� ��� ����� ���� � �� ����� ���� �� ��������� � ������� � ������� � �� �� �������������� � ���������� ������ ��� ������� ����� ��� � ���� �� ���� �������������� ���� �� ������ ���� �� ��� �� ������ �� ���� �� ������� ��� �� � ��������� �� ������ ���� �� ��� �"� G����������� ���� � � ! �� �� �� �������� �� ����� ������ ������ 7) /��� ��� ����/�� "AB:8� �� ����� ���� ����� � �������� ����� ��� �� ��� � � ����� �� ����� � ���� &.;�

$��������� �� ���� ���������� ��� � ��!������� ���.���� � ��&� �� �� �������� �� ���/ �� ����� �������� ���� �� ��� �� ���� �� ���� �� ���� �������� ��������� ( ���� �������� �� ���� �� �� ������ �� �� < ����� ������� < ��� ��,���� ��� ,� ��,��' 7�##"8� �� �� ����� �� �� /���� ���� ����� ����� ��� �� �� �� �� �� � ������,� ��� � ��� �� ���� �������� �������� � �� ������� ��

� ������ ���� �� �� ��� �������� ��/����� ���� �������� ���� ���� �� �� � ��� �� H��� �� �� ��� ���� ���

�)

���������� "'# "��� 3� 53��������� 2�- ,�-**/02+10+*�H��"# "�C# ���� (#���������� "'� ������������ �0 ,�--�/ �99� 1�9�0�?�� �# )����"# ;���"#>��� �# C��� ;# 4��6���������# '�� ;#C�� $� (���� 02* ,�--8/*281*2-�)��<���� >A# A������&#"� �# �6��@6 A# �����6 5�3#����������� �%# ������ #A����� �# (�����! 5�� �����

���<��� C5# $���<� 34�>��� >� ����� *� ,�-*8/*9�1*98�

>����� 5# >���>�6� 4� ���)����� �*- ,�99�/ -*1--�

Page 56: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

��� �� � ��� ����� ���� �� ����� ��� ���� �� ������� ���� �������� ��/���� ������

0������ ���������� �� ���� ���������� ��������� 1��� �� ���������� �� �� �������� ��� � �� �������� ���� ������ ��� ���� � �� ���� ����� ��� ��� ����� ���� ����� � � ��������� ���� ���� �� ��������� �� ����� ���������4

� ( �� �������� ���� �� �� ������ ����� ���� �� � �������������'����� �� ����� �������� ��� � ��������� � ������ �� ����� ��������� ��� �� ��� �����������

� ( ��� ����� �� ������ ��� ��� ��������� ����� � ����� �� ��� ������ �� ���������� ������� ��� �� �� � ��� ����� �� �������

� .������� � ������� ����� �� ��� ���� ����� �� ����� ���������� ��� ��� �� ������ ����� �� ����� �) ���������

� G ����� � ������ ����� �������� ���� � � ����� �� ���� �� ��� ����� ���� ��� ��� �� %�� � ������ �� ������ �� ������ � ���� �� ������������ �� ��������� /���� �� ��� ����� � ����������� ��� ��� ����������� ����� �� �� � ������ �� ���� ����� �����

� ( �������������� �� ������ �������� �� ��� �������������� ���� ����� ���/���� ����� � ������ �� ���� �)������ ��� �� �� � ����������� � � �� ���� �� ����� ����������� �� ��� ���� ��� �� ���� ��� � � ����� �� ��������

����30� � ��� ��2 $ �������� ���� ��

���������� !��.������&� �� �� ������� � �� ����� ��� ��� � ��� &.;� �� �� �� ��� ���/ �� ��� ����� ����� �� �������� ��� ���� ��� �� �) ����������� ������

$ �������� ���� �� &������� ��� ���� �� ����� �� � �) �������� ,����� � �������� ���� �� ���� ������ ��� ����� � ������ �� ��� ���� ���� �������� � ��������� ��������� �� �) ��������� &� ����� �������� �� ������ �� ������ �������� ������ �� ������ �������� �� ����� �� ������ ��������� ������ �� �� ���� �� � ����� �� �� � � ����� ������ � ������� ����� �� �� ����� ���� ��� ������� �� ������� ��� � ������ �� �� �) ����� .��� ����� ��� �� ��������

�,

Page 57: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� �� ���� � �� �� ��������� �� �� �� ���� � � ������ ������ �� �� �������� ����� < �� �) ��� �� �� �� ������ '�� ���� �� ����� �� ��� ���� ������ �� ��� :�1�� � ����� �� ����� �� � ����� �) ��� �� �� ������� ���

�� ����� ���� �� ������� �� ���� ���� �� ����� ������ �� ������ �� �� ������� ���� �� ��� �� ����� %�� � �� ������ ������ ������� �� ���� ��� �� � �) ��� �� ��� �������� ����� 7� ���� :8� (� �� �& �� ��� �� �� ���� ����� ��� ����� ���������+�� �� �� ���� � ���� < ���� � ���� ��� �& < �� ���� ���� ������ ����� ��� ����� ���/ �� ��� �&� ���� �� ����� �� =��� ��������?� ����� � ��� �� �� ���� ��� �����

� � ������ �*��������� ������ � +��' &��& �������� �� �� ��� ���&��� � �&� �* �� ������ � ���� �����

������� ����� ����� �� �� ���� � �� � ���� ����� =��������� ��?� �� �������� � �� �� ������ ��� � �������� �� � ���������� 70����� � ��! "A5:84 ( �! � �� < ���������� ������������� � � �� ������ < �� � ������ �� �� ����� ���� ������ ��� ��������� ��� � �) ������ * < "#� ��� �� �� ������� �� A# ���� �� ����� ������ � ������ ���� � ������ �� �� ����� �� �) ������� ��� �� ����� ���� �� ������ ������� �� �� �� �) ������4 �� ��� ��������� � �������� ��� �&� ��� ���� ��� ���� % �� �� ����� �� ��� 5� �� ���������� ����� ������ �� ������ � �� ���� �������� �� ������� ���� ��� ��������� ��� ���� �� � ��� �������� � �� 7������ � ��8�

�/

+ 3

+ 2

+ 1

0

- 1

- 2

- 3

3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 p H

net chargeA

B

sampleapplication

sampleapplication

0�� )2 ��� ������ � �� ���� ������ �������� (��D ��� ����� ���0�� �� ������� ������� � ��1� �� ��� ���� ����� ������( � �� ��0� ��� ������0�(

1 �� ��0� �� ����0� �����5�6�A����D 7������ �� � �� 1 �� ����� ���� ��� �8 ������ �� � ���� ������������ � �

A������ �# )@����� )#'������� :� ��D A���� )5#'������ �� �� ��������������� ����������������C� � '�� ��# )��� ,�-../�8+1�.��

Page 58: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

�� ������ ���� �� ������� ���� ����� � �� ���� ������ ��� ����������� ,������� ����� ��� ������ ���� �������� ��� � ��� � � ���� ��� �&� ���� �� �� ����� ��������� ����� ����������� ���� �� �� ���� � ��� �� ��� ������

�% ������� &� ������ �� � ��� ���� �� �������� � �) ������� �� � ��4

� �) ������� ����� � ���� �� �� ����� ���� �� ��������� � ���� �� ��� ����������

� &�������'� �) ������� �� ����� �� � ����� �� �� ���� �� �� �� ��� ��

������ �������� ��������� �% ������� ���� ��� �� ���� �����������! �� �������� ��� ����� +������ 7"A:"8 ��� ������ ���������� ����� �� ������ =��� ��? �) �������� ���� �� ��������� ���'����� �� �� ��/ �� 3���� 7"A:A84 �� �������� �� ������� � ���� �� ����� �� ��������� �������������������������� ������ �� � �� �� � ���� � �� ��� ���� �� ����� ���������� ���� ������ ������ ��� �������� ������� ��� ���� ���� � ������ ��� �� ��� �&��� ���� ������� ��� �� �� �� ���������4

��������������������

������ ������ �� ����

0 P ) � <7 )�8�< ��)� � P � � *

�3

0�� ,2 �������� ���0�� �� � ������� ���� ���/�� ������� ���� ���0� ���������� ��� ������� ��� ���0�( ��� ������

�� !� ��� ������� �� � ������ � ��"�����( ���� ���� ������� ��0� � � ��������0� �!�0� ����� ���

��������� ���� 3�� ������+ ,�-8�/ 0�+102��:������# ;� ���� 3�������� �0 ,�-8-/ �8+01�888�

Page 59: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

��� ��� ��������� ������ �� ��������� ������4

� )��� � ����� �������� ��� ��� ������ �� �� �&�� -��� ��� � �� ����� ���� ������� �� �� �&�� (���� �� ���������� ������� H�� ���� �� ������

��� ���� ��� ��� ��������� � �� �� ����� ����� ��� �������� ��� ��� ��� ������ � ����� �������� �� ��� �������� ��������� ��� ���� ��� � ���

�� �) ������ �� ��������� �� �� ����� ����� (� �� ���������� �� �� ���� ��� �������� ��� �� ����� ���� �)��� � (����� ��� �� ��� ��������� � �����4 ���� ���� ������ �& ���������� ���� ���� �� ��� �& ���������

1�� �� ����� ���� �� ������� �� �������� ����� ������������ ����� ������ �� ����� �� ��������� ����� ��� ���� ������� ���� �������� ������� �� ��� �� ������ �� ���� ��������� ����� ������� �� ���� �� ��� ������ ��������� �� ��� �& ��� ���� ����� �� �) �� ��� ��������� ( <������� < ������ ��� ���� �������� �) ������ ���� ��������� �) * �� "#� � ������ ��� ��������� ��� ��� �� ������� �� �� ���� ������� �� �� �� �������� �������� � ������ �� ����� �� �������� ����� ��� ����� �

������ ���� �� �� ��� �� ������� �� ���� �� �� �� ������ ��� � ��� �� �� ������� +�� ��� �� ������ �� ������ ���� �������� ��� �� ����� ��� ����� � ����� �� � �� ����! � � ������� ���� ��� �� ��� � ��� �� �� �� � ����������/ �� �� �������

������ �������� � ������ ��� ������ �� ��������� �������� �� �������� � ������4 ��� ��� �� ��� ����� ������������ ���� �� ��� ���� ���� �� ���� �� � ����� ����� ��� 7���� "58� ���� ��� � ���� ��� �� �� ��������'� �) ������� �����! �&������� ��� ���� �� � ������� ���� �������� ������ ��� �

���� �� ��� �������� ������ ������ ��� ���� � ��� �� �������� ���� ��� ��������� )��� ������� ��� ���� ! �� ���� ��������� ��������� ����� �� �� ���� �������� ��� �� ���� ������ ���� �������

#9

�������� � ������ ���������� ��� �� ��������� $� ������ ����������� ���� ��������� ������ ���������� $��� �������� �� �����# ��� �� �������� �� ���������� ��� � ��������

) ��������� �� � ������ ����� �� �� � ������ ��!����� ����������� ��� ��������� �� ���� ����� ������� ������� �����

$� ����� �� ����� ��������� �� ������� ��� ������

>�������� ���� ������������������� �� �����! �� ���� ������� ����� �� ��� ����������� ��������� # �������� ������ ������ ���� ���� � ���� ����� ��������

Page 60: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

%�� � �� ��� �������� � �� � ��� ����� �� ���������� ���� ������� � ��� ���� &.; ���4 �� ������ ������ ������� ����� ���������� ��� ���� �� �� ����� ������ �������� � � �� �� �� ����� ���� �� ����� ��� �� �� �������(���� �����4 ������ �� �� ����� ���� ��/ ���������� ���� ��������� ��� ������ �� ����� �� �� ������� �� � �� ������� ����� ���� �������������

$�!���� �% ������� ��� ������ � ����� ���� �� ����������� �� ��������'� �)������� ����� �� � ����� �������� ��������� ����� ����������� ���� �� �� ������ �� �������� �������� ����������� �� � ����� �� �� � ����� ��������� � (� &���������� � ��/ ���� � ��/ ��� ����� �� ��� �D ��� ��� ���� �� �� �� �� &�������� �� �� ���������4

����������� � �

0 �������� ��� � ��������� � �� ����� �� ���� ���� ������� �� �� � � �� �� �� �� ���/ �� 0������

7"AA#8� �� ������ � ������� ��� ������������ ��������� �� �� ������ �D #�B �� �D 6�:� �� ����� ��� �D :�� �� �D "�� &� �� ��� �� �� ���� �) ��� �� �� ���� ��� ������ &��������� �������� �� ���� ��� � ���� ;�� B ����� � ������ �� � �����

#�

0�� /2 ����!� �9�� �8 !������ )������������� �� � �� ��� ����� �����/ ���� ����� ����9�� !������ ������

3����� ����� � �������������� �� ��� ������� � �� ���� ��� ��� ���������� �� �� �����

A������ >'� ��D )����� A�#��� 4�������� >�� ���������6� �� ��������D���� ��� �������� � ����# �������� ,�--9/�$� ���� �� �� �������# ����� ������� ���������������� �� ����

Page 61: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�������� �� ���� ������'� &���������� �� �) ��� �� ������ �� �� ���� �� �� &��������� �� �� ���� �( �) ������ �� ������� �� ������ � ��� ������ �� ���� ��

&���������� �� ������� �� ���� �� �� ���� E ��� ��������� ��� ���) ��� �� ��� ���� �� ����� �� �� )������)���������! �����4

% < (�) P �D% Q ��� RRRRRRRR

(��� �� � ����� &�������� �� � ���� ( ��� % � �� ���� ������������ �� �� ����� ��� �����

&��������� ���������&� �� � ����� &�������� �� �� ����� �� ! ����� �����4

%�) P �D( Q ��� RRRRRRRR ( < %

������ � ��! 7"AB:8 ��� (������ 7"AA#8 ��� ������ , ������� �� �� ���� ������ ��� ��� ������ �� ��������'� �) �������� �� �� ������������ �� � ����� ��� ��� ����� ������ ������� ����� ,����� ��� ������ ���� � ������ ���� �) ��������� ��� ��� � ����������� � �� �� � ���� &.; ��� .�� ������ �� � ���� ��� �������� ���� �������� ��������

��������� �� �!���� �% ������� &�������� ����/ ��� ����� ���� ������������ �� #�� ���EH � ��� ��� ��� ����� ���� �������� ������� �������/� ������������ � ! �� �� ��� �� ��������'� �) ������4 ���������� �� &�������� ���/���� �� �� ������ ��� �� ��� �����/���� �� �� ����� ��� �� �� ������ ������ � ��� �� �� 6L % ��� * L & 7�� ��������� � ��� $A8� �� ���� �� ������ ��� ����� �� ��� ��� �� ������ ������� �� �� �� ���� �� ���������� �� �� ��� ������ ����� ��� ����� ���� � ��������/ 7� ��� A8� ��/ �� �� �������� &� ������� � ������������ ������ �� �� �� #�$ �� ����/ &�������� ���� ������'��� � � ���� ���� ��� ���� ���� ��������� � ��� �������������� �� � ����� ��������� ��� ����� �� �� ��������� ���� ���� �� ������ %�� � �� �� ��� ����� ���� ������� �� ���������'� �) �������� ��� ������������� ����� ���� ��/ �������������� ��� �� ���������� ��� �� � ���� �� ������� �� ������� ���� ���� ������� ����

#�

$��� ������ ������ �� ������� ���������� �� ��������

3����� %# '����66� #����� '# A������ >'� 3������� ��� (�� � ���� �,�-*./ 02-10+*������ 4� ����������� ��,�--9/ �291�2.�

Page 62: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

$�!���� �% ������� ��� -�� ���������� �� ��������'� �) ������ � �� ���� ����������� ���� ����� �� ��� ���� �� ����� � ��� �� � ��� ���� � � ���� ������ ���� �� ��� ��� �� ��� ��� �� ��� ������ �� ����� &��� ������ ��� �) ������ ���� �� ��������������'� �) ������ ����� �� �� �������� ��� � �� �� �� ����� ���/�4 -F� � ��� 7"AA6� �###8 ��� 1���� 7�##"8� ���� �� �� ������ ���� � ����� ��� ��� ����� ��� �/����

G �� �� ��� ���� � ��� � �������� ��� ������������ � ��� ��������� ��� �� ����� � ���� ���������� -G, ��� ��� ��������� ��� ��� � ! ����� ��������� ( �������� �� ������ ������� �� �������� �� �� ��/�� (���������������� � ���� ������ �� �������� ���� ��� �����

� "���� ��� ���� � �� ����� � �($ �� �%$ ,����� ���& �� '� � ������ ������������

##

acidic, densesolution

magneticstirrer

glass cassettewith

0.5 mm gasket

basic, lightsolution

0�� 32 $������ �����!� �9�� �8 �������$���� � ������ ���� � ���������

'B�� �� ��D 3�� 5# �� 3)���� D � (�������� ��������<� ������� >��� ����# �������# 3�� ,�--2/ �0�1�2��'B�� �# C���C� �� A������� $# �� >����� ������D$������������ � ������������ ��� �������������������� �������# )��������� &� H��< ,�999/�9.1��8�C������ A� ������������� >������� C�( H�:3�# C������ ,�99�/�

�� �� �� ���� ���# ��� ������� ���� �� ��� �������� �# @��� ����� �� � ��������< ��������� �� �� ��������� �

Page 63: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

-�������� �� �!���� �% ������� (� ����� ������� ������������� ��� ���� �� ����� ���� � &,- ����� �� � ������ ���� ���� ����� ������ �� ��� ���� ��� ��������� ������) �������� �� � ���� ����� �� ���� ����4

� &�� ����� ��� ����� � �� ��������� �� �� �� � ����������

� �� ������� �� �� � ����� �������� �������� �� ��������������

� �� ������ ����� �� ����� � ��� �� ������

� �� ���� ������� � ��� ������� �� �� ����� ������������� ��� ��� �� ��� ���� ���� &.; ����

� +���� ����� �) ������� ����� ��� ���� �������� ���������� �� ����� �������

�� ������ �� ��������'� �) ������� ���� � � �� �� ����������� �������� ��� �4

� ������ ���� �� ����� ������������ � ������9 �� �������� ��� � ������ ������ ���� �� ����� ��� ������

� )��� ����� ����� � ���������

� 3��� � ��������� ��/ ������ ��� � ������� ��� � ������ �� �������� ��� �����

� H�� ������ � ���� � ��� ! ��������� �� +�+ � ������ � �� ���� ����� �� �� �� �� ������ ���� �� ������� ���/ ��/ � ��/ ��� ������ 70������ ��� -����"AB68�

� ,������ �� ���� ���� � ��� �� �� ����������� �� ��������� ������� ������� ��� ���� ���� �� ���� �) ��������� ���� �� ��� �� ����� ������������� ��� �������'�������

� -������ ��� � ����� �������� �� ������ ���9 ���� ����� ��� ������ � ��

��� �� �� �������� ����� � * �� ��� ��� ��� �� �������� �� �� �� ������� ����/��� �� #�$ �� ���� �������� ���� ���� ��� �� &.;� ����/ ��� ��� ����� �� �� ��� � ���� ������ ������� ��������� ���� �� ��� ����� ��� � �� ������������ � �� +�+ ������������ �� �� �� ����� �������� �� ��

#&

A�� ��� �>' ������ ������ ������� ��������� ��'"> ��������

�� �������� �� ������ ������ ��# ����� �� ��!���� �� ����� ������ ���������

$��� � ���� ����� ���� !�������� �<��

:� ��������� ��� ���������������

�� �������� �� & >�' # ����� ����� ������� �� ��������� �� ���� ���

$��� ������� ������������� ���� ������������ ���� ���������� ������

$��� ���� ��� �� ������� ���� !����� ��������

��� �� ��� ���� ������� ��� ����������

A������ >'# '�� 3� 5 )�����)���� � "������ - ,�-*2/�901��-�

Page 64: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

���� ��������� ����� �� ������ ��� � ���� ����� ���/��� ��� ���� �� �� � ��������� �� ���� +�+ ��� ����/ ������ ����������� " �� "�$ ��� +������� �� � �� ����/ �� ����� �� ��� �� ��� ���� ���� ��� ��� ����� � �������� ��� � ���������+���� � �������� �� ���� ������ ������ ��� 5 �� �� �6 ���

;� �� �������� ������� � ���� "B ��� �6 �� ����� � ������ � �� ������ ������� ��� ���� �� ! �� �� ����� ���������� G�������� ����� ���� 5 �� ����� � ���� �� ������'����� ���� ����� �������� ������1�� ��� ���� ��� ��� ��� �� ������ ������� ��/ �� �����

������������� ���� ���� ��������� ����� �� ������ ��� 5 �� "*�� � � ��������

������� ���� �� �� �� ��������� �� ��������'� �) ��������� �� ����������� �� ��� � ����� ��� ���� ������� ��� �) * ��"#� )���� �� � ������ ���� �� ��� ������ ���� �� �������� �� �� �) ������ ��� * �� "#� �� ������� �������) * �� "# �� ���� �� �� ������ ��� �� ���������� �� ��������� ���� ������������ �� ������ ������� +� �� �� ����� ������� ��� ������ ��� ������ �� -F� � ��� 7"AAA84 �) * �� "�� ;������� ��� ���� ��� ���� ����� ����� ������ 7�) 6 �� 5� �) *�� 58 ��� ����� 7�) : �� ""� �) : �� A8 ������� � ������� ����� ������� ���� ���� �� � ��� �) ���� ����� �� ���� ���������� ��� ������ ������� ��� ����� �� ������ �������� �� ������ = ��� '��� ���? ���� #�$ �) ����� ��� �� ������ �� ������������� �� )����� � ��! 7�###8�

+��������� �� $ � ��� ����������� � �� ���� �� ���� ������ ����������

� % ����� ��� � $�- � ���� � $�( � "##� $�- �� ����� ��&��'��� !$ � .+�+/ ��'������ $�$$( �������&��� �����

� -����� � �� ������������� ������ ����� ����� ���� ��� ��� � ��������'������

� �� ������������ �� �� �������� � ��� ���� �� �� ������ ��� �� �� �� � � ������ ��� ����� ��/< ��������'����� �� ��< ����������� �� �� ������ � �� ��������� �� �� � �����

�� ��� �� �� �� ��������� ���� ��� ����������< �������� �� ������ ���� �� ������ ������ ��

�� ����� ��������� ����� ��� �� � ��/ ��� �������/�� �� ���� ��� �� �� �������� �����! � 7-F� ���� "AB5�8�

#(

C��� ���������� �� ������� ������� ���� � �� �����#���� ��� ������� ���� �� ��

'B�� �# ;������ 3#)�����'# C���C� ������������ �9 ,�---/ .��1.�.������� �# :�����#��� ;������ 5� ������������� ,�999/ �8�.1�8���

��� ������������� ���� +- �� ������ �

� ��� ��� �* ��� ����� ���>' ������ �� ������ ������ ���

Page 65: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

� �� ��������� �� ������ � ���� ������ �� �� ��! �� ������� ���� � ��� ���������

+��������� �� ���� &� �� ������� �������� ���� � ����� ������� �� � �� ��� ���������� �� ����� � ����� ���� � ����� �������� �� �� �� ������ �� �� ����/��� �� ���� �� �������7� ��� "#8� (� ���������� ������� ���/� � � ��� #�� �� ����/���� �� ���� �� ����� #�$ �� ����/ ��� �� �� #�� �� ����/ ����� �����

1��� ���� ���� ���� ����� ��� � ������ �� ������������������� �� ������������ �� �� ������ �����4

� )��� ��� � �� �������� ��� ���� ����� ������ ������� ��/ ��� � �� �� � ��� �� ���

��� �� �� ��! ���� 0�������� ������� �� ������ ������ �� ��� ��������

+� ������ ���� �� ������������ �� �� ������ �����! � ������� ��� ���� � ������� ��� 7� ��� ""8� �� � ����� �� +�����' � ��! 7"AA58� �� ��! �� ��� � ���� �� �� ����� � �� ������� ��������4

#)

0�� �92 :�� ������ �������� ����4�- �� ��/��� ���� ��� ;��������� � ����� �� �����0� 4�- �� ����/� � � �� � ���������

'B�� �# >���C# C�� 5#'E���� �# ������ 5A#������ �"# ������ (� ������������ * ,�-*.�/ 2+1+��

�� ���� 7������ ��� �� �������# �� ��� ��6 �� �������� �� � ��� ��� ��� ����������� ����� ������� ����� �� ��

��� ���������� ����# ������ ������ �� ��� �����#��� �� �� ���� �� ���������� ���� ������

�����6 5�3# A��� :#>�����"# A���� %# $��� (#"����� �"# C�<��� "A#����������� �%� ������������ �* ,�--./ 0�210�.�

Page 66: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

� &� �� ��! �� ��� � �� ��� ���� �� ���� ���� ������ �������� �� �������� �� ����� ����� ��� ��� ��� ��������� ���� ��������� ��� ���� ���� �� ������ � ������� �� �� ��� � ��� ������ �� �� ���� ������������� ����� �� ����� �� ������� �� � ���� � ��� �� ��! ��� ������ � ��� &.;� ���� �� �� �� � ����� ������� ���� � ���� � ����� �� ���/�� �� �������

� &� �� ��! �� ��� � �� ��� ������ �� � ����� �� ��' ���� ���� ����� �� ����� ��������� �� ����� ������ �� �� �����

(������� �� � �������� ���� ������ �� ��� �� �� �� * ����� ��� #�$ �� ���� ����� �� �� � *:# �H �� � �6 �� ��� �5# �H�� �� "B �� ����� &� ������ �� ������� ������� ��� �� �4

5 �� ���� "�$ �H"B �� ���� *6# �H�6 �� ���� 6$# �H

0������� �� ����� �� ��� ����� � ��� � �� ��� �� ��������' �� � ���� ���� ;�� "" ����� � ������� ����� � �� ���� ����� �� ������ ���� ����� � �� �6 ���

'���� ��������� �� $ � ��� (� ����� �� ��� "�� �� � ��� ���� �� ����� �� ����� ����� ��������'� �) ������ ������

� �������� �������� �� ����� �� ����� � �� �� ��� �� ������������ ��� ���� �� �� ����� ��� �� �� ������ 0��������� �� � ���� ��� � �� �� ������� �� ���� ���� � �� �������� ��� �� �� ������� �� ����� �� �� �� �������/� � �� �� �� ����� ���� �� ������� %�� � ����� � �� ����� �� �� ��������� �� ����� ���� ��7���� �� ������ � �����8 �� ���� �� �� ����� ����

#,

0�� ��2 �$% �� ����� ����� � ��� ������ ������ �� �$% ������ � ���0���� ���0���

$��� ��� �� ����� ��� � !��������

$��� ������ ��� ����� �������� D A������ $# :��� 3#(����� 55� ����������� �+,�--2/ �++�1�++*K ��� �������� � D �����6 5�3# A��� :#>�����"# A���� %# $��� (#"����� �"# C�<���"A#����������� �%� ������������ �* ,�--./ 0�210�.�

Page 67: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

���� �� ������� G��� �� �� ������ ���� � ���� �� � ��������� �� ���� ���� �� �� ���� �� �� � �� ������������ ��� ! �� �� �������� �������� &.; ��� ������ ���� �� �� � ��� � � �����

� &�� �������� �� ���� �� �������� ���� �������� ��� ������ �� ����� �� ������ ���� � ������� � � �� � ����� �)�� �� ������� ��� �� �� ������ � �� ����� ��� �� �������� ����������� ����� �� �������� ��� ��� �� � ������ ����� ����� ��� ��� �� ������ ��� �� ������ ��������� ���� �� ���� ��������������� &.; �� ������� �� ����� ���� �� �� � ��� ��

����� ���� �� �� ����� � ���� ���� ������� ��� � ��� ��������� ��� &.; �� ���� ����� �� �� ������ �������������� �� �� �� ��� ����� ��� ����� ������ ���/� &� ��� �� �� ������� ���� ���������� ������ ����� �� ��� �� ����������� ���� ���� �� ��� �����

+��������� ��

����� � ����� M : ����� ���� ����� M "� � � ������� S8

+��������� ������ ��� � ��� ������ �� ��� �� ����� ������� ������� �� ���� �� �� ��� ���������� ������ ���� �� ��� �� �������4 .��� ����� ��� �� ������� ���� ����� �������� � �� �� ��������� �� �� ����� �� � ���� ������� ������� �� ���� �� ���������� � ��������� ������

#/

0�� ��2 )�������� ������������ �� ��� ����� � �� ��� ��� ���� � ��� ����!� �9�� �8������ �������

&��D $��� ��� �� ��������� ������� ��� � % ���>' �������

������ �� �� ��� ��������#����� �� ��� ������� ��������! �� ��� �� �� ��� �� ������ ���� �� ������������� �� ������

L/ (��� ������ ������� � ��� ��� �� ������ ������ ������

� ��� �*# ��������� ������

Page 68: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

� 0�������� �������4 .��� ����� ����� �� ���� ����4 ��������� ��� ��������� ������ �� ������ ������� ��� �&��� ���� ���� ���� ������ ����������

� � �������4 (�� ������ � ����� �� �� ��� ���� ��� ������� ������� ��� �&� ���� ��� �� ��� ����

���� ����� ��� ������ ��� ��� ������ ���� ��� � ��� ����� � ������� ������ �� �������� �������S8�&� �� ��������� ���� �� ��������� ��� ������������ �� �� ���

������ � �����4

��!� �2 ��������� �� ��� ������ �� ��� �����

0�&'�� ��� �� ��� ��� �� ���

��� ���

�� ������ � ������ �� ������ �� ������� ����������� �� ������� ����������� ����� ������������

&.; �� �� ������ ���� ���������� �� ����� �) ������� ��/�� �� ��� ���� � � ��������

0��������� ����� ����������� ���&.; ��� � ������� �� �� ��������� � ����� �� ��� ����� �����������

�� ����� ��� ��������� ��������� ���� �� �� ��� ����� �������� �� � �� ������ �� ����� ����������� � � ��� �� ������� ���������

1�� �� ����� �� ��� ��� � ��������� ���� ��� � �������

�� ������ ��� � ����� ���� ������� �� �� ���� �� �� �� ���� ������� ���� �&� ���� �� �� �) ����� ����������� �������

3����� ��� � ������ � ��� ���������� ����� ������ �� ��� �� �������� �� ����� �������

%�� � �� ������ �/���� �����S8��� ����� ���� ������� �� �������� � � �������� ����� � ����� ������� ���� �������� ��������

��� ���

1�� ����� ������� ��/ �) : < ""��� �) : < A � ������� ��������� ������� ���� �� �� ����������� ��� � ��� ������ �� �����/ ����� ���������

,����� ���� �������� ������ ������ �� �) �� �� ����������� ����� ������ �������� ��� ��� ������� ��� ����� �������� �� �� � ��� ��� � ���� ���/ �� �� ����� �������� ���

�� ����� ���� �� /�� �� ������ � �� ��� ����� � �� � ������ �� ���� �� ����� ���������� ��� ������

(��� ��� ������ ������ �� �������� ������ �������� �� �� ������������ ������� T ������������ �� ������� ����� � ������

#3

L� ��� ���� M>��# ���������N�

Page 69: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

0�&'�� ��� �� ��� ��� �� ���

� ��� �� �������� ����� ������� ����������� � ���� �� ������ ������� ����� ��� ��� ����������� �� ������9 ���� �������� �� ���

� ��� �� ���� ���� �� &.; �� ������� ���� ��������� �� ������� �� ��� ��� ��� ��� ���������� ���������

1��� ������� ����� ������ ������� ���� ��� ��� ������ ��� �� ��������� ����� �� �� � ��� �� ������� ��� ��� �� �� � ���� ������

� ������� �� ���� ��� ��� �����������/ ���� �� ������ ��� ����������� �� �������� ��� �������������� ������ � ��� �������

&� ���� ���� �� ������� ��� � �� ��� ���� ���� ���������� ��� � ������ ���� �������� ������� ���� ���� � � ������������ ��� �� � ���/� �� ��� ����� ���� �� ��� ������ ������� � ��� ����

( ������ �� ������� �� �� ������� ���� �� ������ ����

$�0 ������� &� ����� �������� ���������� ��� �� � ��@ ��� �� �� ��� ��� ����������� �� �� ������ )��'����� ���/��� �� �� ��� ������� �� �������� ��� ��� ���� ������ �����4 ��������������� ��� ���� ��� ���� ���� ��� ���� ��� ���� ��� 7��� ������� ���� ������ �� ��� �&�8� ��������� �� �������� ��� � ������� � ���� ������ ������������� ���

���������� &� �� �� �������� �� � &.; �� � ����� ����� ��� ��� �� ������ � ���� �� &� ��� �� ��������� �������� ��������� �� ����� ������ ��� ��� ����� �� ������ �� �� �������� �� �� ����� 7-F� � ��! "AA"8� 0 ����� �� ������� �# J �� �������� ��� � �� �� ���� �� ����� �� ��������������� �� � ��� � �������� ��� �� �� ���� �������� ������ � ����� ��� �� � ������������ �� ������ � ��� &.;� .������ �� ������ ����� ���� �� ��� �� �� � �� ��� ������� ���� ��� �� &,- ������ �� �� ��� � ������� �� � &.; @ �� �� � ���������� ��� ���� �# J � (���� ����� ������ �� ������ �� ��������� ����� ��� ������ �� �� ��� ����� �� �� ����� 7=��� �����?�� ��� "*8�

%�� ��� &� �� &,- ����� �� � ������ ���� ��� � �� ���� ������ ����� ��� ��� �� ����� � �� ��� � �� �� �� �� � ������ �� �� �� �� ��������'� �) ������� ( ����� �� � ������ ����� ����� �������������

&9

%�� ��� ����� � ������� ����� �� ��� 20�

'� ���� ���� ������ ��������� ��� � � ��� ���� �������� ��# ��� ��� �� �������� ������ �� �������# ���� 2*�

� ��� +��

'B�� �# >���C# %������� 3#4���< A# ������ 5A#������ �"� ����������� ��,�--�/ 8+018+*� ����� ���������� ��� ��������� ������ �� ��� �����

Page 70: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

&� �� ����� ���� ��� ���� �� ����� ������ �� ���������� �� ������� ������ � ��� �� � ��� � ������ ������ �������� ���� �� ���� ���� ��� ��� ����������� ��� �� ��������� ���� ��� ������������ 7���� "*8� ����� � ������ ������ ��������� &�������'� �) ������� ��� �� ��� ���� ����������� � �� � ����� �� �� �� �� ������ � ���� ��� ������ ����� �� %�� � �� �� ������� �� ���� �������� �� ����� ���������� �� ��� ����� �� ������ ����������� , ��� �� ��� ��������� ��� � ����� �� ��� ������ �� ����� =��� �����?�

������� ������� (� ����� ������� ����� ��������'� �) �������� ��� �� ��� ���� �������� �� � �� �� � ���� ������ ��$# < 5# �( � ����� )��� � �� ������� � ��� ����������� � �� ����� �� �� ���� �� ����� ��� � � �� ����� ��� ���� ������� �� ����� ��� �� �� � ���� ��� ��� � ������ ���� ������� ��� �� �� ���� ��� � �� ���� �� �� ���������� ��������� � �� ����� ��� ��� �� �� ���� ���������� �� ���������� ����� ���������� � �������� ���� �� ������ ������� ;���

��� ������ �� ������ �� �� �� ����� ����� ��������� ��� ������������ �� �� ������� � � � �������� �� ��� ���� ���� �������� �� ������ ���� �� ��� ����� ���� ������ �� ���� �� �������� �� �� ��� ���� ����� �� ������ ������ � ��� �������� �� ���� � ���� ������ 7� ��� "68�

&�

-

--

--

-

---

---

- ---

---

-

-

-

--

---

-

-

--

---

- --

---

+

+

+

+

++

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

++

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

-

E

hot spots

V = E d×

salt, buffer ions

0�� �#2 )�������� ������������ ����� ������!���� �� �� � �� !����� ���� � �$% ����� ���� ��" �� ��� ���� ��� � ������ ��� � ������� ��� ��

����� ��� ������ � �� ������� ���� ��������� < = 0� ���( � = � ������ ��� �������( � = � ������� ��������

�� � %# � ���������������������� �� ���������� ����� �� ������� ������� ���������

Page 71: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

� ����#&� �� ������ � ����� �&� �&��+ ��� +��� ���)&� �&� ���� ��� � ��� ���& ��� �� )&������� �� ������� � �&� ��&'�� ��� �� �'��������

�� ����� ���������� ����� ������� ����������� � ��� ������ ���� �� ����� �� ��� "$4

��� �������� ��� � ����� �� ��� ������� ����� ������� ������������� �� ����� ��� ������� ��� ������������ ��� � � �������� � ����� ��� � ��� ������ ������

&�

Time [h]

step and hold

gradient + step and hold(ramping)

V

1000

500

1 2 3 4 5 6 7 8 9

2000

4000

6000

8000

0�� �&2 <� ��� ������ ��� ��" � �$% �������"�� ��� ������ ����� ���� �� ���� ���>���� �� �� �? ���� �� ��� ���( ��� ��� ����� ���� �� ��� >������? ���� ��� �������� ������

Time

Start Salt ions migrate Salt ions collectat the electrodes

V

0�� �(2 ��0� ����� �� ��� ����� 0� ��������� ���� ��� ����� ��" ����� � � �$%������

Page 72: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

:������� �� ������ ������ ���� �� ����� �� ������ �������73�84 �� ��� �� �� ������ ������ �� � ����� ���� ;� �����4$### 3� 7$ /3�8 ��� � $### 3 �� �� �� � "### 3 �� ��� �� ��

� �� 3� ��������� ����� �� ����� ���������� �� ���������� �������� �� ������ ����� �� �� �� ������ ����������������� ��� ���� ������

� &� ���� ���� �������� �� ������ ������� 7������8��� ���� �� ���� ������ �� � �� ����������� &� ���� ����� �������� ������ ������ �� 3� ��� �� � ���� ���� ����

*���� ���� �� 1�� �� ������ ������ � � ��� �������� ��� �������� � � ��� )��'����� ���/� � ��� �� ������� )��� ������� � ����� � ��� �� ������ ���������� �� ���� ���� ������� ��������� ���������� ������ ��� ������� ���

<��� ���� �� 1�� �� ������ � ��� �� ��� ����� ��� ��������� ����� ��� �����4

� ������ ���� �����'�� �� �& �� �� ����� �������� +�� ������ ���� ������� �� ��� �������� ������ ��

������� ������ � ��� ������� ��� ������ �& ��� ������ ����� ������ �� � ��4 ��� ���'����� ���/� ������� � ��� ��� ������

� %���� ���� ������� � ����� ���� ������� �� �� ��� ������ (����������� �� ������� ����� ��/������ �� �������� 7M �) "#8 �� �� �� ��� ���� ������� ��� � ���� �� ���� �)�

� #&� ��� ����� �� ��� ��� )��& �������& � &��� ������ � +��� �� &��& �������

+�� �� �� ������� 3����� � ��� �� ������ � ��� �� ������ ����� ��� �� �� ��������� �� ������ ��� �� � ������ �� ������� ,�� �� ����� �� ����� ��� �� ���� ����� �� ������������� ������ �� ������ �� "$ ��� ��� �� �� �� ��� � ���������� ���� �� ������

'���� ����� ������ � ��� �� ���� ���� �� &.; ���� �� � � �������� ���� �������� ����� � �����4

� &� �� ������ ������ �� �� �������� �� ��� 7"##3� "B ��&,- ����8� �� ������ �� �� ��� � � � ��� �� ��� ���������� � ��� �� �/ ������ �� ���� �� �� �� �� �������� �� ������ �� ���� �� ! ��/�� ��� ���� ����� ( ������

&#

$�� ����� �� ���� �� ������ ���# ��� �� ��� ����������

5��� )E�D ������ ���������������

C�� �� ����� �� ����� ����� �����# �� ����� � ���������� �� �� ����� ������ ������� �� ������

Page 73: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

���/� ����� �� �������� � �� ������� ��� �� ������������ ������ �� ������ �� �� ������ ����� �������� �������� ��� �� ��������� ������ � ���/� ���� �� �����

� &� �� ������ ������ �� �� ���� �� ���� 7$##3� "B �� &,-����8� � ��� �� �� ������ ��� � ��� ��� �������� �� ��� ��� �� �� ����������� ����� ��� ���� � ������ ���/ ���� ����� ��������� +������ �� ��������� ������ ���� ����������� ����� � ����� ��� � ��� ! ���������4 �����/ �� ������ �� ����

&� �� ����� ��� �� ��� �������� ����� � ��� ����� ������ �� �����

� 1��& � ���� �� ������ �2 �&� +��� �� ��+�� ����� ���� ��� �� � �&� ������ �� ���������� ���� � �&� ��� ��� �� �&� ������ �& � � &��& +��� ���

$� ������������� 4������� �� &,- ���� � ��� �� �������� �� �� G ������� ����� 7� ��� ":8� 1��� ���� ! ������ �������� ������� ��� �� �� ������� ��� � � �������� ������ � ���� ������ ���� �� �������� �� ����� �� � ��� �� � �� "� ������

&&

sample cups

cathode

IPG strip tray

anode

IPG strips

safety lid

cooling plate

0�� �)2 7� ����������!�� ���� ��� ��� ��"� �$% ������� � ������ ��������! � ��������� ��� ��� 0� ������ � ����������������� ���� �� ��@������

Page 74: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

� �� ����� � ������� �� ����� � ������ ������ �� *�$##3���� � �� �� ��� �� ��� � ��� � ���� ��� ������� � �������� �� �� ����� ��� ����� ��� � ������ �� �������� �� �� &,-����� ��� �� ��� &.; ���� � ������ �� �������� �������� ���� ��� �� &.; �� &,- ����� �� ��� �����������

��� $ ����� &� �� ���� ��� ����� �� ��� "5� �������� ���&.; ��� � �������� &� ���� ��� �� &,- ����� � � ����������� 1��� ������� �� ����� ����� ���� ������ ��� ������� �������� � �������� � ������ �� ���� ����� ���� ������� ���� ������ ������ �� �� �������� �� ��� �� ������� ������� ��� ��� ��� ��� �� �� &,- ����� ���������� �� ���������� ��� � ����� ����� ����� � �� B###3� ��� � ,���������� ����� � ������� ���� �� ���������� �������� ���� ����� ������� ������ � �������� �� ���� ��������� ��

����� ���� �� ������ �� �� �� ����� ��� �� ��� ��������� ������ ��������� �� �� ������ ������� �� �� �� ������� ����� �������� ������� �� �� ��� �� ���������� ��� ������ ������ ������ ������(� �� ������ �� �� ������ � �� � ���� ��� �� ������� ������

����� ��� �� ������ � ���� � � ���� ���� �� �� ���� ����� � ��� �� �� ����� ���������� ��� �� ��� ��� �� �� �� �� 1��� ���� ������ �� ���� ��� ��� � ������� ���� �� ��������� ��/���� ����� ��� ����� ���� � �������� �� -H,7���� �������� ������8�&� �� ��� ������� �� � ����� ���� ������ ������ ��� ����

��� �) ������� �� �� ��� ���� (���� �� ����� �������� �# J ��� �� ��� � ������� 7� ����8�

&(

Regular IPG Strip Holder

ceramics tray

plastic cover

platinum contacts

IPGphor chamber

cooledelectrode contact areas

cathode

anode

0�� �,2 �$%���� ��� �� ����� �� ��� ���$%���� ����!�� ��� ��" � �$% �������

C�� �� ����� �� ���������� �� ���������# ���� ����������� ��� � ����� ���� �������� � ���� ���� ���������� ������ ��� ������������ �����������

7� �� �2 ����� ����� �������� ���� �� ����������

%�� ������������ �� ����������������� �� ����� �� ������� ����� �������� ���� �����

Page 75: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

+������ '��� %����� &� ��� "B �� ���� ��� �� ����� �������� &,- ����� �� ������ �� ����� ��� ��� �������� ���� �� ����� � ������ � ����� �� �� ��������� ����� ���������� �� �� ��� � ����� 0�������� �� ��� �� �� &.; ��������� ���� � � �� Q�# J � ����� ������ �� �� ����� �� ������� ��� ��� ��� � ����

����� ���� �������� ��� ������� ��� ����� ���� �������� ����������� � ���� ..� �������� ��������� �4

� �� � �� �� ����� ������� ��� �������� ���� �� � ���

� �� �� �� ��� ��� ��� � �����

� 0�������� ��� � ����� �� ��� ������ 7*# < :# 38�� "# �� �� ����� ���������� �� ��� �� ���� ���� ������� ������ ��� ���� "$# /�� ���� �� ����� 7-F� � ��!"AAB8�

�� ��� ����/� �� �� ������� ���� �� ����� ����� �� ���� �������� �� ������� ���� ��� ��������� ��� �� ��� �� � ���&.;� �� ��� �� �� ����� ��� �� �� ����� ��� �� ������������ �� ���� ��� ���� � ��� � ������� ��� �� ������7������8 �� �� �� ���� �� ������ ����� �� ���� ������� ���� �������� �� �� �� ����

������� �� ��� ��� ������ �� ���� ����� � �� � ��� ��� ������ ��� ��� &.; �� �� ��� ����� � �� �� �� �� �� ���� ������ ������ �� �� ������� �� �� ���� ����� � ���� ���/� �

&)

cathodalcontact

anodalcontactceramic tray

basic end

acidic end

IPG strip

paraffinoil

pressureblock

pressureblock

transparent lid

samplesolution

0�� �/2 :�� ������ ���� ��� �$% ������ ����0���� ����� �� ���� �� ��� �$%�����

�� ���� ���������� ��������� ��� ���� ������� ��������

'B�� �# )����� '#;������ 3# ����� �#C���C� (�� ����� &�� �,�--*/ 218�

$� ������� ���� ��������� ������� ��� �� ���� �� ��� �� ������ �� ������� ���

3�� ����� ����� ����� ������ ���� ���� �� �������������������

Page 76: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

�� �� � �� � ��� ���� �� �<$L �� �� �������� � ����� ����� ����� ������ ���� �� ���� ���� ���� �� ����� ��� � ��� ���� � ������

� �� ���� � �� ���� �� ���� �� &,-��� +��� )��� ������+�� ����� ��� �� �� ���� ���� ������� ����+������ ����� ������� � ��� �� �� ������ �� �� ���� ����

� ��� &.;� ���� ������ ��� ������ �� ����� ������ ����� �! '� � � �� �� �� � ��� �� ��� �������� ����� 7� ���� "A8� &� �� ��� ������ ��� �� ��� ��� ������� ����� ������� ��� � ����/� ��/ � � ��� ���� &� ���� ��� �� ���� ������ ��� �� � ����� �� " L 7�E�8 +�+ ���� " L 7�E�8 ��� �� *#��� �� ��� �� ���� �� ����� ���� �� ������ ���

� �������� ���� &����� � ' �� � ���� ������ �� ����� +���1��� ��� �� �� �&� ���� ��' ��� ��� ��� �� �&�'��� �� �� �3���� �� ���� ��� �� � �� �������� �� ��� ���������

� ����#&� ���� &����� ��� �� ���������' ��' ���������

;� ���� ���������� ������������ ���� ���� ��/� �� ��� �������� ! �������� ���� ��� ������ ��� ���� � ���� )������ � � �� ��� ������� �� ����� �� ����� �� ��� � ��/����� &� ��� ���� � � ������� ����� �� ��� � ��� 7� ������������� �� ��� *A8�

��������� ��� &� ��� �� ������ ���� ��� �� ����� ������ ������ ��� ���������� 7��� "##��8 �� ������� 7M "��8��� ���� �� ! ����� �� �� ��� ����� ������ ��� �� ����� � � ���� �� � ��� ����� �� �������� ��� �� �� �� �������� ����� ������ �� � ���� ��������� &� �� �� ���� �� &.;�� ��� �� ����� ���� � ����� ���� ��� ����� ���� ��� ������ �� �� �� � ��� �� �� ����� ��� &.;� 1�� �� ������ ����� ������ � ��� ��� ��� ��� � �� ���� ���� ������ ��� ������� &� �� ��� �� � �� ���� ����� �� ����� ���� ����� ��� �� ��� ����� ��� �� ������ � ����� �! '�� �� ��� ������ ���� � ����� �� ������ ���� �� �� � ���� ��� �� ���� ���� ������ 7� ��� "A8� ��� ��� � ����1�� �� ����� � � ���� �� � ��� �� �� ��� �� �������� �� ����� �� �� �� � ��� � ���� ��� ������� �� ������ ���� �� � ��� � �� � �������� � � ������� ���� �����

&,

��� ������� �� ����� ������� ��� � ����� ���

%�� ��� ������ �� �� ����� � ��� � ��� ���

������ �������� �� ���������������� ����� ���� �������� �� ��# ���� �� ������� �� ���� ������� ����� �������� �� ���� ���� �������� �� ������ ��� �������� �� ���� �� ��� ��� ��������� �� � �� ������� ������������ ������ ������ �� ������ �� �� �����=� ������� ���� ����� �� �� ���� �����

Page 77: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

;����� �% ������� )��� ����� ���� ���� ���� ���� ���� �� �������������� ���� �� ����� ���� �������� �� �� �� ���� �) ��������� �� �������� �� ���� �) ������� �� �� ���� ������� ��� ������ � � ���� �� ���� ������� ��������� G��� �� �� ����� ���������� ���� ��� � ��� �� �� ������� ��� � ���� ��������� �������� ������ � ���� �� �) ��� �� �� ����� &� ��� ������� ������ ����� � � �� �� ��� ��� ���� �������� ���%�� � ��� � ������ ��� ��� �� � ������������� �����4�� � ����� ����� ��� ������� � ��� ������������� ������������ �� �� ���� ����� � ������ �� ���'����� ���/� �� ������� ���� �� �� ��� ���&� �� ����� ��� �� � �������������� ������ 7� ��� �#8

�� ���� ���� ��� �� � ������� ���� ���� ������� �� ����

��� ������ ��� ������ 7��� �98 ��� ���� ����� ������ ���� � �� �� � � �������� � � ���� ������ ����� ��� �� ����� ���������� �� ���������

� 3� ��/���� ��� �� ������ ������� ��� ��� � ��� ������� �������! ��� � ������ ���� ���� �� �� ���� �) ��� ���� ���� �������� ��������

� )��� ����� ����� 7M " ��8 ���� ! � �� ���� �� ��� ��� ������ �� �� ������ � ��� ������ ���� ��������� ������� �� �� ����� ������� ��� 7;��� ""8 � �� � ��� ���� ������

&/

paraffin oil

paraffin oil

gel

regular strip holder

cup loading strip holder

gel

pad

0�� �32 )�������� ������������ �� ������ �������� ��� �$% ������ ���� ��������� ����� ��������� �� ��� ���� ���������� ��� �� ���� ��� ������� ���

$� ��� M��� ������ ���������N �� ������� ����������

Page 78: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

6 �H ������� ��� � ������ ���� �� ���� ���� ��� ������� ���� ��� �� ������� � � � � � ���� ��������� ;��� ������� � ���/� �� ������� ��� ��� ����� ���� �� ������� ��� �� &,- ����� �� ��� ���� ����� ��� ���� ������� ����������� �&� ���� ��� ���� �� �) ������� +������ ���� ������ ������ ���� ��� ��� ���� �� � ��� ��/�� � � �� �� ���� ��������� �� ����� ���� �������� ���� *## 3 �� * �� � ��� �������������� �� ������ �� ������ �� ���� �� �� .�����4 ;��� �" ����� � ������� �� �� ������ ������ �� � � ������� �� " ��� �� ����� �� �� "B �� ���� ���� �) *<"# ��������� ���� �����$# /3��

�� �� ����� � �� ������ �� �� � � ������� ���� �������� � �� �� ��� ���� .��� ��� � ������ �� �� ���������� 7����""8 � �� �� � �� ���� ���� 7����"B8� �� �� �� ��������� ������� ��� � ������ ���� ���� �� ���� +������ ��������� �� ��� ������ ������ �� � ��� �� ����� ��� � �����

&3

cathodalcontact

movableelectrode

transparentlid

anodalcontact

samplecup

ceramic tray

0�� �92 ��� ���� ����� �� ����

Time [h]

gradient + step and hold

V

1000

500

2 4 6 8 10 12 14 16

2000

4000

6000

8000

0�� ��2 <� ��� ����� ��� � ���������0� ��� ���� ��������� � � �, �� �$% ����� �83'�4 �� �����

;� �<�� ��� �� �� ��� ���� ����� ������ ��� ��������� �� ����6����� �� ��� �� ���������

Page 79: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� �� �� ������ ��� �� ������� �������� E � ��� �� �� �� ���� ����� �� � � ������� ���� ������

������� ������ �� �� � � ������� ���� ���� �� ��� ������� ������ �� � �� ���� ����� ��� � �� �� � ��� ��� �� �������� ��� ��� ���� ������� ���� �� � ���� &� �� < ��/ �� � ������ ���� < � ��� ���� � ������ �� ���� � �� ���� �� ���� ��� &,-��� +��� )��� ������ +�� ����� ��� �� �� ���� ����������� ���� �� ������� � �� ��� � �� �� ���� �� �� ������� ��� ���� �� ������� ���� �������� ������

"� � �% ������� &� ��� ����� �� ������� ����� ���� ��������� ������� �� ����� ������� � �� � ������� ) � � ������� ��� �� ����� �� � ��� �� ����� ���4

� +����� � ������ �� � � ������� ���� �� ������ �� �� �������� �� �� �������� ���

� �� ����� ) ���� ������� � �� � ������4 ���� ��� ������ �������

� ( ���� ��� ��� ���/� �� �� ���� #�6 L ��� ��� ���� ��� ��� ����� ���� �� �� �������� ��� 7-F� � ��! �###8�

� �� �������� ��� ���� ��� �� ������� ��������� ����� � ����� ������������� �����4 "# �� ": L ���������� ���������� #�� L �������� ��� 7-F� � ��! "AA58�

"� � �% ������� ��� ��� ���� ���� ;� ���� ����� ����� ������� ���� )����� � ��! 7�##�8 � ���� ��� ���������� ��� � ������� ���� ��� ������ �� �� ������� �) :<""� :<A� ��� ��������4

� 0�������� �� �� &,- ����� ������� �� 5 ���EH �� ����EH ���� �� 6 L )(,+� ��$ L ���� "# L ����������� $L ������� � L &,- � �� �) :�""�

� � ������� �� ������ ��� �� "B �� ������� (� �� �������� ��� � = ���-�? ��� ���/ ���/� �� ��

������� ��� ���� �� � *�$ L ��� �� ����� �� ������� ���������'� �� �� G ������ ���������� ������ ;� ��� � ������� ���� ���� �� �� &,-��� � �$ C B C " �� &.;����� ���� ��� � �� ��/ �� ��� ���� �� ��� �#�� � ����� � �� �������� ����� ����

(9

'B�� �# ;������ 3#)�����'# ����� �# ����� )#C������� A# C���C� ����������� �� ,�999/�90.1�9+0�

'B�� �# ;������ 3#)�����'# 3������ �# ���6 5�5#"��@�� 5�5� ����������� �*,�--./ 0�*100.�

������ �# '����� )# :�����#"E� �# A����� A3#��� ;������ 5� >��������� �,�99�/ ��.1�02�

Page 80: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

���� !���� ������ ;� ����������� �� �� ���� ����� ��� �� ������������� �� �� � � ������� ������� ��� �� ������4 ������� �������� +�� ���� ���������� � �� $ �� ����� ��� � ������� �� "B �� ���� ���� �) ��� &,- ���� 7+��� �����+��U�� � ����###8� ( ��� ����� ��� � ! �� ���� � ��� ��� ��� ������� �� �� ��� �� �� �� &,- ���� �� ����� ���� ���� ;��� �� ����� �� ������� �� ��� ����� �� ������ �� ���� ���� ��������� ���� �� ���� ��� �� "B �� ���� &,-����� ,�� ���� ��� ����� ��� � � � ��� �� " �� ����/ ���-� ����� ����� �� � ��' �� B C 6$ �� ��� B C *$ �� �� ����� �� ������ ��� �������� �� �� �� � � ������� ���� ����� ������� ��� �� ���/� ���� �������� ��� ��� ������ ���� � ���� ��� �� ���� ����� ��� ��� +���� ��� ���� �� ������ �� ����� ���� 76$# �H �� ������ ����� ����������� ��� *$# �H ���������� ����� �����������8� �� ������ &,- ���� �� ���� ���������� �� �� ������ �� �� ��������� ��� �� ��� ����� ��� ������ ���� � ��������� �� �������� �� ��� ��� 1��� ������ ������������ �� ���� �� ��������� �� �� � � �� ������� �� �� ���������� ���� �� ������ �� ��������� ���� �� �� �� �� �� &,-���� �� �� ���� ������� ���� ����� ��� ��� &,- ����� ( :�� ���� ���� ������� � ���� �� ��������� �� ��������� 1�� ����� �� ����� �� �� ���� ����� �� ���� ��� ���� �� � ���� ����� ���� ������� ���� �� ������ ��� ���� ��� &,- �����

� ����#&� ����� ��� ���� . ���� �� � �&����/ � �������� �� �� ��� � ���� ������

'������� ��� ����� $�0 ������ �������

&� �� ��������� �� ����� �� ���� ��� �� ���� ������������ ��/��� �� ���/ �� ��������� �� �� ��������� ������ �� ����� ����������� � ���� �� �� ������� +�� �4 &������� ;�� ����� ����"A# ���

(�

anode

pad

cover

paperbridge

cup loading strip holder

IPG strip

cathode

plastictubing

0�� ��2 $���� !���� ���� �� ��� ���� � 0� �����

�������������E�� %# ����B� 5#;���� �# <��� �#'������ 5# )@����� )� ����������� �� ,�999/082-108+8�

Page 81: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

��!� �2 )����� ��� ��"

4������ �� ���

" 1�� ������ *<"# ���E�6<5 �� 5 �� ���

������������ �� ����� ��������� ��������/ �� ������� ����� ����������������

� ��� ���

� 1�� �������) *<"# ���� � ��� ����

(���������� �� ��� "## �� ����� ����� ���������� ������� �� $# 3 �� "� �� ��

* 1�� �������) *<"# ���� � ��� ����

0�������� ������� �� ������� ������ &.; �� � � ������� ���� �����

6 1�� �������) *<"# ���� � ��� ����

� ������� �� �������� ����4 ������������� �� �� ������ �� ��� �� ���� �������� ���

"����� ����2 ������� �� �&� ��� ����������

$ +������ ������� �) 6<5�:<""� ���

1�� �� ������� �� ������ �� �� � ����� �� ��� ��������

: ���� �������� ��/ ���) ����

1�� �� ������� �� ������ �� �� � ����� �� ��� ��������

5 %���� ������� ����4 � ������� �� �������� ����4�� ����������� �� �� ������ ���

4���������� ����. &� �� � �� �� ��� ���������� < ���/� ��� ���������� ���� �� � �� ����� < �� �� �������� �� ���� � � ���� ������� �� �� �� �� ����! �� ����� �������� � ����������� ���� � ��� �� ��������� �� �� �� �������� � �� �� ��������� �� ���� ���/ �� �� �� �� % � � ������ � ���� � �������� < .����� ����������� < �� ������ ��������

+�������!��� ����. 1�� �� ������� ���������� ��� �� �� ��������� ��� �� � � �� �� ���� �� ���� � ������� �� �� �����/� ���� ����� ����� ������� � �� �� �� �� ������ �� ����� � �� ��������� ���� ������ �������

-���� $�0 .��� �� ����� ���������� �� ��� �� ������ � ! �������� �� +�+ � �� ��� � �� �� ����� �������� ���� ����� ���� � ���� �� <:# �� <B# J �� � ����'�

'����� �� �� $ � ���-�� ����� �, +������ �� ��� � �� � �� ���/� ���� �� ��������� �� �� ���� �������� ��/� ��� ��� ��� �� ��/ ���� ������� �������� � �� ������ %�� � �� �� ���� � ��� ������ ������������ �� �� �� ���� ��� ������� %������� ��

(�

A����� �� �� �� ������� �������� ��� ����������� ���� ������

1�9 �� 129 O3 �� ��� �����D��� ������� ������������

Page 82: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

�������� ��� � � ��/ ���/�� ��� �� ���� ������� �����! ��(��� ����� "5 �������� �������� �� ,������ � ��� 7"ABB8� �� ������ ������ ��� 6# ��� ��� � ��� ���� ��� �� ������ �� �� �������� ��� � /�� ��� �� ���� �� ����������� �� � ��� � ���� �������� ��/ �###3�

$����� ��� ����� !�� ����� (� ������� �� �� ����� �������/ �� ���� ��� � ��� ���������� �� � ��� ��� 1�� ����� �� � �� � �� �� ������� ���� ��� ���� ���� ���� ��� � � �� ������� �� ����� ��������� +�+ ,(-.� ��� � ����������� ��� �� ���� �������� ���� � � &.; ������ �� ���� ����� ���� �� � �' �� < B# J � + �� � �' �� ��� ������ ���������� �� �������� �� �� �� �� &� � �� � ��� �� �� �� �� � �� ���� � ����� ����� ��� � ���� �� � ������ ��� �������� ����� ����� �1��� &����'�� '��� �������� �������� �� ;����'�,���� � ��!

7"AAB8 ���� &,- ����� ��� � ������ ��� ������ ���� �� �������� � ��� �������� � � ���/� ���� �� �� ���� �� �� ������'���'��� ������� �� �� �� �� �� ��� �� ����� � ���� ���� �� ������ ��� ���� ���� �� ������� ���� � � �� �� � �������� ��� � �� ���� ����� �� ���� � ��� ( �� ���� �� ��� ������ �� ������� �� ��� ����� +��� ��� � �� �����'���'��� ������� � �������� �� ������� �� ����� �� $ ��� �� ����� ������'����� � �� ���������� .��(�&� � �� � �������� ���� �� ���� ���� �� �� � ���� ��

��� � $# L �� �� ������ < �������� ��� �� ���� �� ���������� ���� ���� ��� ���� � ������� �� �� ��� ��&,- ����� ��� �� � ����� ���� �� �� �� ����� ��� �� �� ���� ��

4�� ������ �� ��� �$�� �) ������ �� �� &,- ���� ������ � ������ ���� � � ��������� ��� � �� ���� ������� �� ��� ���� �� ���� ������ �� ���) ������ ���� �� �� �D ��� � ��� �� ������������ �� ��&��������� �� ��� ������� ��� � �� ���� �� � ��� �� ����� ����� ��� �� � ��/� �� ���� ��� �� �������� �� ������ �������� �� ������ ��� �������� ��� � ����� � � ����� ��� ������ �� �� � ! ��� ��� ������ ���������� �������� � ������ ���� ��� ����� ��� �� �� �� ���������� �� ����������� ������ ���� �� �& ��� ��� � ������ �� ��� ���

��������4

(#

>������ &># %����"#A���� )5� ����������� -,�-**/ 2**12-8� ;� �����#�� ������ ����� ��� �� ������� �� ������� ���� ������� �������� ��

%�����6�>����� 3#3������������ (# ���� #'����"# ���6 # "� #%���< AC� ����������� �-,�--*/ �0-*1�298�

$� ������� �� ������ ��������� ���� ������� �� ��� ������ �� ���� ���� ���� �.�

Page 83: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� �% ������� ����� -���� �� ��������� �) ������ ������ �� ������ �� � ���� ��� �� (����� %�������� 7�###8 �� � ������� �& ���������� G� ���������� ��� ��� ����� ��� � �� ���� ���� �����4 ����4EE����������������������������� ���������� � �� ���� ���� ���� �) ������� �� �# J �� ������ B ���EH �� �� �) ��� � � ������ �� �� �� ����� ������ � ���� ��� ������ � ����� �� ��� �*�

�� �& �� � ����� �� ������� �� ������ �� �������� �� �� ������ �� �� +�+ �� �� ��� ������� �������� �� �� &,- ����� ���������� ���� �������� �� � �)� ��� �� � � �� �&� �� ����� �� ���������� �) ����� � �� �� ���4 �� ���� � �� � ������ ��� ������ �� �� �� ���� ������� ������� ��������� �� ������ ������� �� �������� &,- ����� � ���� �� �� ���� ���� ������������ ��� ������

� ����"������� ���� ����& �� ���� � ��� ������� � )��� �� &����

���� ���� �� � ���� ���� � � ���� �� ���� �������� ������� �� � ="�� ����������?�

�� $����������� !������ ������� ���� ������ ��� .���� �$ ,������� ����� ������� � �� ��� ��� ��� �� � ����� ��� ��� � �������� �� ������������� ��� ����� ���� �! �� ����������� ���������� �&� ��� ��� � �� �� /������ �� ����������� �� �&��� �� ��� ������� %@��!���� � ��! 7"AA*8 ��� � ����� ��� ������� �� ���� ���� �&� ��� �� ����� ���� �! ��� �� ������ ������ ����� �������� �� ��������'� �) ������� ��� � � �� ����� ���� ������ �� � ��� ���� 7%@��!���� � ��� "AA68��� ����� ���� �� ����� ���� �� ���� �������� �����

�� �� =��� ����������?�

(&

Immobilized pH gradient 3 - 10 L Immobilized pH gradient 3 - 10 NL

0�� �#2 �8 ������� � �$% ������ 3'�4�� 3'�4�2� ��� ����� ���� ��� �� �����!����A����A���������������������!�������������

������� )�������� ������D �������� �� ����� ������������� �� �� ��������� ,�999/�*���29�89�

)@����� )# ����� '5#>������ 3# >����&# A���� %#�����6 5�3# %������ �#����������� �� ������������2 ,�--0/ �9�01�90��)@����� )# )��� )# ;�� #3�� 5 � ����������� �+,�--2/ +�-1+0-�

Page 84: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

���� � �@�� ���� � � �� ������� �� �� ����� �� ���� ��������� �� ��� ���������� ����

������������� �� ��� ���� !� ������������ ��� �������� ���� ��&� ��� ����� �� ������� �� �� �� �� �� ����� �������������� ���� �� �� �� � ������ �� ������ ������ ��������� � �������� �� ��� �������� ������� ����� ������ �������������� ��� �� � ����� �� ������� .���������� �������������! � � �� ���� �������� ��������� �� ���� ���� ��� ���� ��� � ���� � � ���� �� ���� � ��� ������,������ ���������� �����! � � ���� ������ �� ��

������� ������������� ��� � �� N� � ��� ��� �� � ��������� ����������� &.; �����! � ��� � ��� ���� ��� � �� � �� ���� ������ �� ������ �������� ��� �� ������ � �������� �� ������! �� ���� �� ��� �����! � ������ � ��� � ���� ���������������� ����� � ��� � �� ����� �����4

0��� ���� ������������ ��� $�0 &� �� ������ �������� ��������������� �� )����� 7"AB�8� � ������ � � ���� �� � �� ����� �� �#�$ �� "�# �� ��� ��� �� � ����� ����� � ���� �� � �� �� � ������ �� �� � ��� �� �� ��� ������ (� �� �� �� ����� ����@��� �� � ����� ���� ��� �� �� ��� ��� �� �������� � �������� �� �� ��� �� � ��� �� ������� ���� �� ������ ������ ���� �� � �� ������� ������ ���������� ��������� ������ �� �� �� ����

��� �� �������� ���� � � �������� ��������� �� �� ����������� ���� ��� ��� �� �� �� �� �������� ����� �� ��������� �� ����� ��������� 7� ��� �68�

((

0�� �&2 )�������� ����� �� ��������� ���� � �� � �������������� �������� �� B��� � �� 5�C,C6�

������ 4� ����������� 0,�-*�/ �0+1�20�

C�����# 4��� A# ��������� �� ��D C�����# )����� � �� >��!�� �� <�������������� $������������������:���# ������,�-*-/ ��01�8��

Page 85: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

������ �������� ������ ��� � ������4

� �������� ���� ������������ �� ����� ��� ���� �� � ����� ��� ��� '�� ��� �� �� ����� �������� �� � �� ��� ����� �� ������ ��� �� �� ��� ��� ��� � ����� ���� ���� ���� ����������� �� ����� ��� ����� �� ����� ���� � �� � ��� ������������� ������ �� ���� � �� ������� ������� �� ��� ������� 1�� ��� ��� �� ������ ���� ����� ��� � ������� ��� ���������� �������� �� ���������� � ��� � ������ �� � ����������� �� �� ������� �� �� �������

$ �������� ���� �� .��� ��� ��������� � � �������������� ���� ����� � ���� � �� �������� ��� ������������ � ���� � ����� �� ���� ���� ������ ����� ���� �) ��������� � ��� � � �� ������ 1��� &.; � ���� � �� �� �������� ���� ������� ���� ���� �� ��������� � � ���� �����������

"������� �������� �!���� �� ������� �� ���� �����! �� ���� �� �� ������ �� ���������'� �) �������� �� �������� ��� � �� �� ��! �� ���� �� � � ������������� ������ �� ����� �� ������ �� � ����� �������������� ���� ����� �&� 71�� � ��� "AB58� �� ������ ������� �� �� ��� � � ������� �� ������ � ���� ��������'��� � ������������ �� ��� ���� ����� ��� ������ &���������� �� �� � ������� ���� � ������ ���� �� ��� ��� ��&��������� ��� �� � ����� �) ��� � ����� ���� �� ����� ��� ��/ �� �� ��������'� �) �������� ;�� �$ ������� ������� �� ������������ ���� �������� �������

&� � ���� �� ����� ������ � ������ &� �� ����� ������ ����� ���� � ���� �& �� �������� ��� ������ ��� �� �� ����������� ������ �� ������ ���� �� ���� � ����� ���� ����� �&� &� ������ ���� ��� �� ���� ������ ��� � �� ����

()

0�� �(2 $������������� �� � ������ �������� ��� �@��� ����� ���� ���� ������ ���!�����

C��� ># � ?�����"#5��� ># A������ >'� 5 )�����)���� � "����� �2 ,�-*./�-120�

Page 86: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

���� ���������� &� �� ���� �� � ������ �� ���� ��� �� ��������� ���/ ������ �� ���� ���� �� ���� �� ���� � ������ ���� � ��� �&� �� �� ���� ���� �������� ������ ��� ����� &� �� �� � ����� �� �� ����������)�� ��� 0������ 7�###8 �� �� ����� ���� ����� ����������

���� ��� � ������������ �������� ���� �������� ����������� ������ �� ���� �������� ��� ���� ��� ������� ������������ ��� ���� �� ����� ���������

����&'����� ��� ��2 '�'� -��

�� ���������� �� �� ����� �������� ��� ��� ����� �� ������������ �� �� �������� ��� ����� % � ���� �� +�+�,(-. ������������ �� ������� ��� ���� �������� ������ �� �������� �������� ��� ��� �������� �� �� ���� ����������

���������� !��.������'��� ������� ������� 7'�'8 ������������ 1��� +�+�,(-. 7+�+������������� �� ����������8 �� ���������� � �������������� �� ��� ���� �� ������ 7G8� +�+ ��� ������ ���������� ���� � ��/������/ �� �� ������� �� ������������� ������ ������� �� ���� ������ ��������� ������ 7&�� ���� "AA#8� (� � � �� �� �� ��/��� �� �� ��� ��� ��� �� +�+� ��������� �� �� +�+������ ������ �� � ���� �� ������������ "�6 � +�+E� ������ +�+ ���/� �� ���� �� �� ������������� ��� �� ���� ������� ������� ��� � � ���� ��������� �� ������ ���� � ��� ����� �� ���� � � ���� ����� �� �� ��� �� ���� �� �� ����� �� ���� �� ��� ���� ��������� ��������(�� ������ < ���� ���� ���� ����� �&� < ���� ����� ������ ��

����� �� ���������� �������� �� ������ ���� ���� +�+ ����������� ����� �� �� ���� �� ����� �� �� ������ (� � ������ ������������ ������ �� �� �� ����������� ���� ����������� ���� �� �������� �� �� ���� �� ����� ��� �� ������ �������� ������� �� �� +�+���������� ������� �� � ��������� �� ����� ���� �� ���� �� ������ �� �� ����� ������� ��� � ������� ���� �� ��� �� ��������� �������� ����/���� ���� �� �������

� ���� " ��56 � �� ����+�� �&� �3 �� ������� �� �� ������� �� ���) ��' ���� ����

(,

����� )# A������ >'� ������������ �� ,�999/ 080-1082*�

�� 4# "� A># 4������� 4#�6��<���<� �# "����� #(����� >� �� 5 )����� �-9,�--9/ 0��10�*�

"��� �� ���� $����� �� ���� �0 �� ��� ��� �� ��������������� �� �� �������� �9 ��� �99 <���

!��� ����� ��� �� � �������� ���� ���� ��������� �

Page 87: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

"����� ��� ��� �� ������� � �� ����� �� ��������������+�+�,(-. �� ���� �� �� ��������� � � ���������� E ��������������� ������ �� H����� 7"A5#8� &� �� ��������� ���� ��������� �� �>;��� �� �������� H����� ����� ��� ����������� ���� � ����/��� �� < ���� ���������� �) :�B < �������� ����� �� �� ������� ��� ����� �������� ���������� �) B�B� ;� ������������� �� ����/��� �� �� ��� ���� ��� �

� �� ������ � ����� �������� �� &.; ��� ���� ����� ��� ������ ���� ��� �� �� ������� ���

� �� ������ ����� ��� � �� ���� ����� ��� ��� ��� ���� ��! �� ���� ���� � ���

���� �� ����� � ��������� � � � �� ������ �� ����� � ��� ������� ��� � �� �� � ����/��� ���� �������� ���� �� ����������� ������ �� �� �� ��� �� ����� ����� ������ �� �� ������ � ����������� �� ����/��� �� ����� � �� �������� ������ ���

��/� �� ���� ���4

� �� �� ���� ����/��� ��� ������� �� ������� ����������� �������� �������� ������ ��� ������������� ����/ �� ������ ��� ����� ������ �������

� +�� ������ �� �� ��� ���� ����/��� ��� ������� ���� �� �� � �� ������ ���� ��� �������� �� ���������� 0������� ��� ������ ������� � ����/��� �� ���� � � ��

������ ��� �� ������� �� ��� � �� ���� ������ �� ���������� ��� �� ������'��� � ����/��� �� ���� ���

�� � �� ���������

"����� ���� ��� ��� ����� �� ����� � �� ��� �� ��� �������� #�" L +�+� +������ �� ��� � ���� ����� � +�+� ��� ��� +�+ �������� ���� �� �� ��� �� �������� � �� �� � ��������� ��� ���������� �� �������� ����� ������� +�+ ���

������ ���� ����� ������ �� ����� �� ��������� ����� ������� ����� ������ �� ������� �� � �� ����� �� �� ����������� ����� � �� � ��� �� �� �� ���� ������� �� ��� �� ����� � �� ������������ �� �� ����� � ��� � �� �������� ) � ��� ������4�� � �� ������������ �� �� ������������ � �� ����� ��

�� ������ ������ ��� �� � ��� ���� ���� ���� �� � ��! �� ���/� ���;� ���� �������� ��� � ���� ���� ����� ��� ������ ���

�� ��� �� �� �� �� < �������� < ���/� ��� �� � �� �� ��������� �� �������� �� �� ����� ���� �� � �� �� �� �� ���/

(/

(P��� 74� &���� ��.,�-.9/ 8*918*+�

$����� �� ������� ��������� ��� ������� �� �����������

Page 88: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

� �� � �� ��� � ���� �� ��� ���� �� ��������� ���� �� � ��� �� � ����������� ������ ��

��� ���� ��� ,����������� ��� � �������� ��� ��������� ������ ��� � ��������/��� ���� < � ���� ������������������������ �� ������ �� ����� ���� ������ � �� ������ ��������9 �.G.� ������ �� ����� ����� �� �� �� ��� ���������� �� �� ��' ��� � ������ ��� ��� ����� �������� ���� ����� �������� ����������� % ��� �� �� �� ��������/���&4

7� Q �8 C "## � C "##% P RRRRRRRRRRRR VLW� & P RRRRRRR VLW

3 � Q �

� �� �� ���� �� �������� �� ��� �� ���� �� ����������������� �� ��3 �� ��� � �� �H�1�� & ����� �������� ��� % ������� �� �� ��' ������

1�� % ����� �������� ��� & ������� �� �� ��' ������� ��������� � ������4 �� ���� ��� ��� ��� � �� & �� ��� � ������ ����� � ���� �� & P 6L� -�� ���� & M $ L � ����� ���������� ����������� ��� � ���� �� �� ������ �����&� �� �� �� ��� ���� ���� �� ������������ �� �� ���������

��� �� � ������� �� ���� �� � ���� �.G.� ��� � ��� ������� � �� ���� ������������ (� ����� �)� ������ � �� ������� ��� ���� �� ���9 ���� ���� �� ������'� �� ������ ���.G.�� ��� �� � ���� �� ������ � �� ���� �������

����������� � ������ ���� �������� ��� �� ��� ���� ������ � ���� �� �� ����� ����4 �� ������� ��������� �� ������ �� �� ���� ����'� �� ����� ��� � ��� � ���4 �� ������� ���� ��� ���� � ������� �� �� ����� (� ��� � ���� ���� ������ ��� ������ ������ ���� � ��� �� ����������� �� ���� �� ���� �� )*�

Q ���� ������ �� ������4 ��������������&� ���� ���� ���� �� ����� �� � ��� ���� ������ �� ������������ ���� ��� ����'� � ������� ������1�� ��������'� �) ������ ��� � ����� ���� � ��� �

����� � ���� ��� ���� ���������4 �� ��������� �� ������ �������� ������ �� ����� �� �� � � ���� �� � ��&,- ����� ��! � ������ �� ����� � ��� ! ��������� ���� ��+�+ � ��� &� ��� �� ����� ����� � ��� �� ���� �������� ����'��� ��������'� �) ������� �� ��� ����������� ���� ������� �� � ������������� ����� 71���� � ��! "AB*8� ����� �� �� ����� ����� � �� � ��� ���� ������ �� ������� ���� �:� +��� ��� � ��� �� � ��/� �� ������' ���� ����� ��� �� ����� ����� ��� �� &,- ����� �� �� +�+ ���

(3

C������ A# >���C#C�� 5# 'B�� �� 5 )�����)���� � "����� * ,�-*0/0��1009�

Page 89: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� ��� ������� �� ������'� �� ������ � ��� ������ ���� ! ��������� ��� ���� ��� � ���� �� ����� ���� � ��� ������ �� ����� ����� ���� �� ����� �������� �� 7-F� � ��!"AB$8�

'�' ��� %�������� ��� �� ���� � ������� � �� ���� "��$ L % ���*L & �� ��9 �� ������ �� ��@� ����� �� �� ��' ��� ��� "6�� "## /�� � ��������� ������ ���� �� ������ ���� �� ���������������� �� ������� �� ����� �� ��� ���� �� ����� ����� �� ��' ������� �� �� � ��4

� H�� % ��� 4 ��� ��� ���� �� ���� ���� �� ����� ��������

� )��� % ��� 4 ��� ��� ���� �� ��� ���� �� ����� ��������

( ���� ���� ������� �� ������������ �� ������ ����� ��'���� ��� � �� �� �� �� ��� )������/ �� %/���� ��� +������� 7"AAB8� )���� �� ��������� �� H���� � ��! 7"AA58� �� ����� ��� �� ����� �� ���� �������� ����������� �������� ��� ����������� � ������4 &� �� ����� ����� �� ���� ��� � �� ��� ������ ���� ��� $# /��� ����� � ����������� �� A<": L %������ ��� � ��� ����� �� � �� ���� 5�$ L %� ���� ������

)9

EEOflow

electrophoretic

migration

cathode

anode

H O3

+

H O3

+

H O3

+

H O3

+

H O3

+

H O3

+

H O3

+

H O3

+

H O3

+

H O3

+H O

3

+

H O3

+

H O3

+

H O3

+

H O3

+

H O3

+

0�� �)2 � �������������� ������ ������ ! ����0� ������ �$% ������� ��� ����� ��������� �� ���� ������� ��� ��� ��� ������� ���������

'B�� �# >���C# 'E���� �#C�� 5� ����������� 8,�-*+/ +--1892�

)�<��� $# ������� $��������<D ��� ������������������� )��������*9�82�-�89 ,�--*/�(�����# AB�� �#5������ 5�%# %�������<��"� ����������� �* ,�--./�9*+1�9-9�

Page 90: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

���� � �� ��� � ���� � �� � ������ �� ������'��������� ����� ����� �� �� �� �� � �������� ������

������� ��� -������ �� ������ ��� �� ����� �������� ������� �� ���� ���� �� ���� ������ ������ ���� �� �������� ��G ��� �� �������� ������� �� ��� ���� �� ������� � ����(��� �� ����� � ���� ��� � �� �� ��'� � ������ � ����������� ���� ���� ��� � �� �� � �� �������� ������������ � ������ ������������ �� ����� ��� ������� � ��� � � �� ������� ����������� ��� ���� ��� ���� ��������� �� ������ ��4 � ������ �� �� ��� ������� �� �������� �� ��������� �� � �� �� ��/� �� �� �� ������ �� �� ������ ��� ���� �������� ���� �� ������� � ����

����� ��� �� ��� ���� �� ������ ���� "6 /�� �� ��� � �������� �� ����������� ����������E���������� ������� �� ����������� ���� "# /�� �������� ���� �� +�+ ����� ( � �� ��������������� �� �� ������� �� ��� � �� ����� ��� �� �������� �� ������� �� �������� �� B ���EH � �� �� �� �� )��������� ��� 7"AB*8� ���� ������������� �������� �� ��� ����������� �� ���� �� " ���EH (����� � ��� 7"AB*8� �� ���� ������� �����! ��� �� ������ �� +��X�� ��� ��� N���� 7"AB584 (� �������������� �� �� ����� �� ���� ����/��� ��� ������� ��� �� ��� �� ����������� �� ������ �� " ���EH ����������� ��� �� �)���� �� B�6� ����� �� �� �� ��������� ��� ������ �� �������&� ���� ��� �� �����/��� �� ������ ��� +�+ �� � �� �� �������� ���� �� �� ������� ���������� ������ ���� ����� ����� ����� ��� ���� ��� "## �� " /���)���� �� +��X�� ����� ! �� ���� ����� ��� ��� �

�� �� ���� � �� ����������� �� �� ��� ����� ��� ���� ������� ���� ���� ����� ���� %� ������ *# L �E� ����������� ���� ����� ��� ����� �� � �� ����������� ��� � � �� ��#�5 ���EH 71����� �##"8� �� ��� ���� �� ����� �� ���� ������/��� �� ����� ����� ��� ������� ����� � �������

+���� !�� ��� ,������� ������ �� ���� �������� ���������� ����� ���� � ����� ���� ��� ������� � ������� ��� ������� ������ �� ��! �� ���� ��� ���� �� �� �� ��� %���� ������������������ � � �� �� ��� ��������/��� ����� ���������� ��� ������ �� 0������ 7"AB*8� +�� �� ��� ������ ������� ���� ����� ������ �� ��� ����� �� �� ����� ��� ����������� 7� ���� *8�

)�

��������� %# ������� $#4���� ����"# H������ 4#�������� ��� )����� ��-,�-*0/ �-�1�--�������� )(# )�� AC#$�� �� ��� )����� �0�,�-*0/ 08+1�.+����P����# ��� 5����'� ���)����� �88 ,�-*./ 08*10.-�

C������ A� ������������� >�������C�( H�:3�# C�����,�99�/ ���1��0�

A������ >'�D �������� ���������D ���� # �������� ��������������� ���� )�������� >���# �������� ,�-*0/�

Page 91: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

��!� #2 � ������0� ����� �/��� ��� �� ��� ����� � � 5����� ��6

��� �� ��� + �� ��� ��� + �� ��� ������

����������������������� 7%��8

��� ��� ������� ������� ��������/

�����7"����������������8������������ 7�).%(8

"�� ����� ,����� ����

�������������������������� 7�(��8

.�� ����� )������������ � ���

,����� �������������������������

�����%�����������������7%( 8

��� ���� ���� ����� ����� ���� �� ���������������� �������������

"����� � �� 1��� �� ��������� � � H����� � �� ������ ��� ���� ������ ����� ������ � ������� �� ���� ���� ����� ������ &���� �� � ����� ���� ������ ��������� ��� �� � ��� ���������� ������ ����� ���� ��� �� � ������� �� �� ����� ������������ 1�� �� �� � �� �� ������ ���� � �) ��� �� ��� ���� ����� ��� �� � ��� ��������� +�� ��������� ��� �� ���� ���������� ���� �� �� ��� ��%�� � �� �� �� ��/���� �) B�B �� �� �� �� �� H�����

������ �� ������������ ����� ����� �������� � ��� ������� (�� ��� ������ �� ������ ����� �� �� ����� �� ������������ &� �� ����� �������� ������ ���� ��� ��� ����� ��� ��� ��� � ���� �� ������ �� �/ ��� ��������� �� ��� ������ �� ������� ��� ������� ��� � ���

>��� ���� ��� '�' ��� ;� ���� ���� ���� �� �) ��� �� �� ��� �� ��� �� � � �� �� � ���� �) 5� ���� ! �� �� ������������� �� �� � �� ������������

�� ��������?�� ������ ��������� � �� ���� � �) �� :�5 ��� ������ ��� � ���� ����� ��������� ��� �������� �������� �� ���������� -����� ��� �� � ����� �� ����� �� �� ��������� ����+��� ����� �� �� ������� �� �� ���� �� �� �� �������� � ����� ������ � �� �������� ���������� �� ����� � �� ��� ������� �� ������������ ����� ������ ������ �� ��������� ����� �� ��! �� � ��� �� ���/�� � ���� ��� 5#� �� ���� �� ����������� ���� �� ������ ������� ���� ���� � �� ����� �� �������������� ��� ���� ������ ���� �� H����� ������

)�

$� ����� �� ��� �� ����������� �� ��� ��# ��� ����� ��< �� ������������ ����� �� �� ������� � ���� ��� �� �� �����!�

)���� �� �� ������ �� ��������� �����# ��� �� ����� �� ���� ��������� �� ����������

Page 92: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

" ��� ?" ��� ������ ���� �� ������ �� �� ���� ������ ��� ������� �� %������ �� ������ ������ � �� �������� �� � ��� �)�(��� ���� ���� � �� ����� �� ���� ������ � ������ ���H����� � �� �������

-��������?�� ������� ) �� ��� �� �� �� �� ����� �� ,,(7�������� ����������8 ��� ������ ���� ���������� ���� �� �)5� ���� �� � �� ��� � ������� ���� �� ������� ����� � ������������ �� �� �������� � ��� ;� �� ������ � �� ,,( �� ��� ! ��� %�� � ���� ����� �� �� ��� ������� �� ������� �� �� � ���� ������� �� ������������������ 7�.(8�

�� �!����� ��� ������ �������� �� ����������� -���������� ������ ��� ������ �� +�+ ����������� ���� �� � �� ����� ������ ���� +�+� 1�� � ���������.��( � �� �� ��� �� � �������� � ���� �������� ������ �� �� ��� �� �������� ������� 7,�� ���� "AB"8� �� ������ �� �� ����� � �� �� ����������� �� ���� ����� �� � �� ������ ��� �� ���� �������� ����� G1 �����������

'�' ������������ ��� 0���!�� ��� %�� � �� &,- ���� �� @ �� ����� �� �� � ��� ���� ��� � ����/��� �� ���� ��� �������� ����������� �� �������� ������� ����� ����� ��� �������� 7-��� ��� -����"AB58� 0������� ��� ����/��� �� �� � ���� �������� �� �� ������� ��� ��� ���� � ����� ��� �� ���9 ��� ��� ����/ ����#�$ �� � ��� ��� ��� � �������� ���� � � ���� �����H������ ��� � � ���� � ���� ��! �� � ���� ������� �� ��

�� ���� ��� ���/�� �� ������ � ��� ����� ���� �� � �����/�� �� H����� � ��� � ��� &��� ������ ��� ���� �������� ��� �� ������ ������ �� �� �������� ��� � �� �� ������ ���/�4 -F� � ��� 7"AA6� �###8 ��� 1���� 7�##"8�

;� ������� ��� ������������ � �� ����� � �������������� ������� �� ������ � �� ���� �� �� � 7� ������� 5#8� .����� ��� � ����� �� ��� �� ��� ����� �������� � �� ���� ������ � �� ������� ��� ��������� ��! ������ ���������� 7D��� � ��� "AA�8�

)#

$� "� ������������ �� �� ������ �� (���� ���

>����� 5%� ��� )����� ��2,�-*�/ �0�1�0-�

' �� $# ' �� � ���)����� �8+ ,�-*./ �++1�89�

'B�� �� ��D 3�� 5# �� 3)���� D � (�������� ��������<� ������� >��� ����# �������# 3�� ,�--2/ �0�1�2��'B�� �# C���C� �� A������� $# �� >����� ������D$������������ � ������������ ��� �������������������� ������� )��������� &� H��< ,�999/�9.1��8�C������ A� ������������� >������� C�( H�:3�#C����� ,�99�/�

4�� )# (B��� '# 4���������# ������� ># �����<�># C������ A#)���C'� ����������� �0,�--�/ .01.+�

Page 93: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

:������ ��� (� ����� �������� �� ����/��� �� �� ���� ��������� ����/��� �� +�+ ���� ��� � �� ������ ! ����� � "��� "�$ ��� ����� ��� ������ � ��� ��� � �� &,- �������� ���� �� ���� � ���� �� #�5 �� ����/� ��� �� ����� � ��� ! ���������� ���� +�+ � ���

��!� &2 ��������� �� � ����/���

��+ � �� �� !�$ �� ��� ��+ � �� �� !�- �� ���

;��� ��������� �������� ������ ������ �����

)��� ������� ��������

������� ������ ���� ��� ���������

)��� ��������� ���������

��� �� ��� ;��� �� ���� �� �� �� �������� �� ���� ����� ����� ���! ����� �� ���� ����� G��� �������� �������� �� �� ��������� ��� �� ������������� ���� ���� � �� �� ���� ����������� ����� ��� �� ���� � ���� D���� ������� ��� ��� ����/�� �� �� ���� �! ���� �� �� ����� �������������9 ��������� �� ����� � ����� ��� � � ����� &� ��� ���� ���������� �� ���� �������� ��������� �� ���� ��� ����� ���� �� ��� ���� ��� �� � ����� ���� ��� ��(��� �� �� +�+ ,(-. ��� ���� ���� ! ����� �������� ��� �� �

��� �� � ��� �� ���� ����� �� �� ��� � 1��������� ���/ ���������� �� �� �� ���� � ��� ������ ����� � �������� �� ����� � ���������� ���������� ,���� ���� �� � �� � ��������������� � ������ ���� ��/ ��� ���������� �� ���� �� �� ��� �� ���� �� �� �� �� � ����� ��� ��� ���� �����

� 4���������' ��� �� ������� � �� �� �� )��� &��& 7� ���' �� ��� �� �� &��& ������� ���

-�� �� ��������� ��� ��� � ��' ���� ���� ��� � ���� ������� ��� 7� ��� �58 �� ��� �� �� � ��������� ����� � � ��������� �� ���� �� �� ��� ��� 7� ��� �A8�H�� ����� ���� ����� � � ���� �� �� ��������� ��� ����

� ���� �� � ��������� ��� � �� ����� ����� �� �� ��������� �� ��� � � ��� ��� � � ��� � �� ���� � ���� ����/��� ���� ��� ���� ����� �� ����;� �� �������� �� � ����� ��� �� �� �� � �� ���������� ��

� ����� ����� ���� ����� ����� ��� ������� ���� ��������� ������� ���� ����� ��� � ���� �� �� ���� �� ����� ����� �B�

)&

$� �>' ����� �� ���� ���� ����� � ����� ��

%�� � ���� ���������� ������� ��� ����� �� ������

Page 94: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

������� �� ��� ���� ��� �� � ���� �� � ���� ������ ������ � ����� �� ����� ��� �� ������� ��� ��� �� ����������� �� ����� ��� ���� ����� ���� �� ������� ��� �� �������%�� � �� ��! �� ���� ��� ���� ���� ���� �� ������ � � �������� �� �������� ������� ���� ��� �� � ����� ���� ����������(� ����� �� ��� �A� �� ����� � ����� ��� �� ���� � � ��

��! �� ���� ���� ���� �� �� ������ �� �� ���� ���� � ����� ����� �� ������ �������� &� �� � ������� ��� �� ����� �� ������� �� ������ � �� �� �� ��� �� � ���� � ���� � ����������� ��� ���� ���������� � ���� ������ �� ������ �� ��������� � ����� 1�� �� �� ����� ��� ���� �� ����� ��� �� � �

)(

0�� �,2 ����� �� � ���������� �������� ��9� )�) �� ��� ����� � � ��� ���� ��������������

0�� �/2 % ��� �������� ��� �� ��� � )�) � ������� �� ���������� )������ ��� �����D ��� � ���� ��� ������� ���� � ����

C������ �� ������ ����# ��������� ���� ����< ����������� �� �� �� ����� �� ���

Page 95: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� ���� ��� �� ���� ��� �� ��� ��� ���� ���� ���� ������ ������ ��� ������� ����� ��� ���� �� �� �� /� �������� � ��� �������� ���

������ � ���� ��� 1�� � ����� �� ����� � ��� �� ������������ �� ��������� �� �� ������������ ��� ���� �� �� ����������� �� ����� �� �������� &� �� ������������ �� ��� ����� ��� �� ��� �� ��� �� �� �� ��� �� �� � ��������� ������ ������� ���������� ����� � ��� �� � �� �� ���� &� �� �� ����� ���� ��� ���� � ������� ��� �� �.G.� ��� ��� ������� � �� ���� ��� �� � ���� ���� �� ��� ��� ������ ����� ���� ������ ��� ����� ���� ����� ���������

1�� ������� � ��� � ���� �� �� ���� ��� '� �� ����������� ��� ���� �� ���� ��� � �� ��� ��� � �� �� ����%�� �� ������������ ������ ��� ����� �� ��� �� � ������

���� ������� ��� � ����� � 5# L 7�E�8 ���������� �� ����� �������� �� �� ���

� ����*� � +��' ������ � �� ��� � �� ��&� ��� ���� ��� ��� �� �&� *�5 ���� � �� ��� � �&� ������� �� ����2 � �&� �������� �&� ���� ������ �� � �������' ����� � � �� �� ��� �� �����) ���+�� �����

))

A B

plastic tube

filling channel

filler portsupport leg

balance chamberwith displacingsolution

0�� �32 7� ��������� ��� ��� )�) � ��� �� - �� ������ ��� �� �� �& � �( � �� " ����� �� * � � �� � ����� ����� �� ���������� � �� �����

Page 96: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

�� ! ����� ��� �� �� �� ��������� ����� ���� �� ��������������� ���� �� �� ������������ �������� �� �� ����� ��� ������

������� ��� ;� �� �������� �� ������ ��� � ������ ��/��� �� � ������� �� �� �� ����� ;� �� ���� ��� � ��� ���� �5 �� ������ ��/ �� ������� ���� � � ���� �� �� ������ � ������� �� �� ���� �� �� ���������� ��� ����� �� ������� ' ��� �� � �� � �� � ������ ���4 �� ���������� ���� � ��� �� � ���� ��� �� ���9 �� � ���� �� �� ��������/ �� ������� �� �� ������� ��� �� �� ������ �� �� ��� ������� ������ ��� ���� ��� �� � ����� �� �� ��� ������ �� ����������� < $ �� "# ��� ��� �� ��� ��� � ��@ ��� �� ���� � ��������� ��������� � ��� � �� ������� � ����� ��� �� �� ��! ����/ ��� � ���� �� ����� �� �� � ���� ���� � ��������/����� 7� ��� *#8�

��� ��� ��� ������ (�� �� ��� ������ ��� �� ������ �������� �������� ������� ������ �� ����� ��� �� � �������� ����������'�� ;� ��� � �� ������� �� �� �� �� ������������� ������ ��� �� � � � � � �� �� �� ����� ;� ���� ��� �������������� ��� � �������� �� ���� ���� ������ ���� � ��� ������� 7� ��� AB ��8� �� ���� ��� �� ��� ����� ��� �� �� � �� �E� ��������� �� �� ������ ����� ��� �� ���� ��������� � ��� �� �� � ������� ���� � ��� &� ��� ����� ��������� ������ �� ��� ��� ����� ��� ���� �� ����/��� � �������� ������ ����� ��� �� � ���� �� � ���� ���� � ����� ���� ���/����

),

magneticstirrer

pinchcockclamp

0�� #92 ����� �� ��� � ������ � ��

&��D $� ����� �� �� �� ��������� � �� ����� �� ����������

7���� � ���� ���� � �� �����<� �� ����� ��� �� � ���� �� ����< # ����� ��������� ��� �� ���� ���������� ���� � ����������� �� � ������� ������ ���� ���6� $� ������� �������� ���� � �� !��� �������� �� ����� ������������

Page 97: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

��� ���� �� � ��� ����� %�� � �� �� ��� ��� �� ���� � �� �� � ��������� ��� ��������� ��� � ����� ��������� �� �� �� �� ���� ������ ���� � ��� ������������� H������� ��� ��� � � ������������ ���� � ����� ����� ����� ��� �� ���� ���� %����+����� ���� ��������� ��������� �� �� ���� �� ��� � %�� � ��������� ��� ����� ��� ���� � ���� �� �� ���� ��� �� ���� �� ����� �� � �� ���� �� ������� �� ���� ��� ������� ��������� ������ � � ���� "�# �� ����/�1�� �� ����� ������� � �� ����� �������� �� �������

������ ����� ����� ����� � ���� %�� � ���� ��� �� ����� ���� ������� �� �� ��� �� ���� ��� �� ����� ���� ��� ����������� ��� �� ���� 1�� �� ����� ����� � ��� �� ����� �� ���� ���� � ������� ����� 0������� �� ���� �������� ��� ����� � ������ ���� � ����������� � ���

+�������� ��� ��� ������� � �� 0������� ��� � �� ������� ���� ������������� ���� )���� �� ��� �� ��� ����� ������ ������� �� � ��� �� ��/ < ����� ���� �� ������� �� ! ����� <��� ��/��� ��� ����� ���� �� ���� ��������� ��� �� ���� ���� �������� �� -G, ��� ��� ��������� ��� ��� � ! ������ ����������� � ��� ������ �������4

� "� �� ��� � ��� ��� �� �� ! �� �������� ��� ��� ������� ���� �� ������������� ���� �� ����� ������� � ������ ���/ �� �� ��� � � ��� � ������� ��� �� ��� �������� � ���� �� ������� H����� � �� ��� ��� �� � ������������

� "� �� ����� �����! �� " �� ����/ ��� � ����� ���� ��������� ������ � ���� ������� 7��� *"8� ��������������� �������� �� ����� �� ��� �B� ������ � ��� ��� ��� ���/�� ���� �� ����� ���� ��� �� ���/��� �������������� ��� �� �� ��� ������ �� �� �� �� �����

)/

glass plate

plastic frame

film-backed gel

0�� #�2 )������ �������� �� ���� ����� �� ��!��/�� 0������ � � ��� � �� ������� �� ��� ����� ���� �� ������������ ��� �$% ������

�� �� ��� �� �� ������ ��������� �� �� � ��� ������� ���� �������� # ����� ���� ��� ���� �� �!��� $��� �� � ������� � ��� ��� ������������ �� ���� ��� ���� �������� �� ��������

&����������� ������� ������ ��� ������ �� �� ������� ���< ��� �� �������

�� �� �� ���� ���# ��� ������� ���� �� ��� �������� �# @��� ����� �� � ��������< ��������� ��� ��������� ���

Page 98: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

��� "��$ L ������� � ������������ ��� ������� ,,(�������� �) 5�# ������ �� �� ������� ���������� � �� �) B�B� ���� �� ����� � ���� ���� ���� %�� � ������������ �� �) 5 ���� ������� ���� �� �) B�B� �� ��� ��� � �� ���� ������������������� ��� �� ������ � ������ ��� ����� �� ��� � ���/�������� �� ������ �� ���� � �����D��� ���� � �� ��������� ��� ����� ������ ��� ����� �

��������� �� /�� �� �� ��������/� ,,( ��� �������� ���� � ��������� �� �� � ��� �� ��� ��� �� ���� �� �� ���� �� ������ ���� ����� � ���/ �� " �H �� �� �� � �� ���� �� ����� ���� ������� ���� �� �� ������� ���� ��� ������� �� �� �� �� ����� �������� �� ����� �� � �� ���/ ���� �� ������ ��� �� �� ��������� ��� � ����� ��@ ���� ���� �� �� �� ���� ��� �� �� ������������ �� ��� ���� ��� �� ��� �� �� �� �� �� ���� �� ���� �� ����� ����� 1�� �� �� �� ���� �� �� �� �� �� ��������� ��� ���� �� �� � ���� � �� ��� ���� �� � ��� �������� ����� �� ��! �� �� �� ������� ��� ��� ��� �� � ���� <������ ���� �� �� ����� ��� < � �! '� � � ���� � ����( ���� ��� �� ��� ���� " �� ���� ���� ���� �� ����

��� �� �� ��4 ���� ���� � ���� ���� ��� ����� ��� ���� ����� &,- ���� ��� �� ������;� ���� �������� �������� � �� ���� ���������� �� ����� �����

���� �� � ���� ���� ��� �� � ����� &� ��� � � � ��� ���� � ������ ���� ��� ���� � ��� �� 7� ��� *�8� �� ��� �������� � ��� �� ����� ���� ����� � �� ��������/��� ��� � ��� ���� ���������

$� ������ ��� ��� ���� ��� ��� ����� ��� ��;�� ** ����� � G ������ ������ ����� �� �� +�+ ,(-.���� ��� ��� � ���� ������ ���������� ����� �� ������������� ��� ��� ���� ��� ���� � ��� �� ���� ��� ��� � ����� � ������ ������ �� ������'����� ��/�

)3

0�� #�2 "� � ����0�� ��� ���� ��� ����������� � � ���� �� ��!��/��

$� ������ �������� �� ����+ Q $ >>� � �� ��������� �� ���� �� �2 Q $ �� ������ ���� � (���� ������

;� �����# ��� ��� ���������� �� � �������� �������� ��� ���� ��� �� ������� ���������������� ����� � � ���� ������� ��� ���� ��� ��� ��� ������� �� ���� ��������� ������

%�� ���� ��� ��� �� ����������<� ��D ;���2 �������� �� �������<� ��� �������� ��� ������� ��� �<��

Page 99: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

&� �� ������ ������ � �� ������� �� ��' �� �$ C "A ��� ������� �������� ��� � ��@ ��� �� ���� �������� ���������;� ������ +�+ ���������� �� �� ��������� &,- ��������� 5 �� ����� ��� � � ����� �� �� �� �� �������� ����������� 7� ��� *68�

0������� ��� �� ������ ��������� ������ � ����������� ���� � ������ (� �������� �� �� � ���� ���� ���� &,-����� ����� �� � ��� ������ ��� +�� ������ ������ ��� ����� ! ���� ���� ���� ����� ������ (� ����� �� ��� * ����� �"� ��� ��������� &,- ����� ���� 5 �� ����� ��� � � ������ �� � ���� ������ ������ �� � �����' ������ ��

,9

IPG strip

SDS gel

A B

electrodestrips

IPG strip

SDS gel

strip positioner

electrodes

0�� ##2 " ��!�� �� 0������ ��� � �������������� ��������� ��� )�) $�%��

0�� #&2 ����� ��������� ��� ����������� �� � �� � ��!�� � � ��" � �����# �� �$% ������ &'#( )�) $�%� � � �-+ �� �� � ���� � ����/� 9�� �� - .$ �� � ��������� ���� 0� ���� ��

���- . $( 4�- �� ����/� )� 0�� ������"��� ��� 1��/� ��( ��������1��������� )� "������� ���� /������������

Page 100: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

��!� (2 ��������� �� ��� ���������� �� � ��!�� �� 0������ � �����

8� ���� '��� 9����� � '���

�� �� � ���� ��� G ����� �� �� ��������

�� ���� � �� �� &.; �� &,-� ������� �� +�+ ����������

-� ����/��� �� ������� ��� �������� �� ���� ������� ��� ������

)��� ����� ������� ������������ � ����/ ��� ��� � ��� ������ ����� ��� ���� ����

3� ������ �� ������ �� ��'���� ������

-� ��'� ���� �� ����� ���� ��'�

���� ��� ��� ��� � ��� �������������� �� �� &,- ������

���� ��� ������ � ��� ��� � ��&,- ���� �� �� ��� ��� ���� ������� ������

% �� ����� 7������������ � �������8 ��� � �� ������ �� ������ �� �� ��! �� � ����

%������� �� ��� ��� � �� ���� ������/����

�� &,- ���� ��� �� � ������� �� +�+ �� ��� 6# ��� ����� � �� ..� ������

�� &,- ���� ��� ��� ��� �� � ������

-F� � ��! 7"AA$8 ��� ����� � ��������� ��������� ��� ���� ������� ���� � ������ ��� � ������ ����� �� �� ��������4 �� ���� ������ � �� ������� &� �� ���������� �������� ����� � ������� �� ����� ���� ����� ��� � ������ ���� ������ ������ � � ��� �� � ������ �� ��

�� �� �� ������� � ������ �� ��������� � ������� � ��� �� �� ���� ��� �� �� �������������4

� )��� ��� ��� �� H�� �� �������� .������� ������� �� ���� �� ���� ������� ����� H�/�� �� 0��� ���� � ��� �������� ��� �� ��������� ������ �� ����/��� ��� �� � �������� .��� ��������� % �� ���� ������ ��� ��� ����

,�

7� �� 0 �� ����< �� ��� ���� �� ������ � �����

$� ����� � ��� ��� ���������� �� ������6����� ���<�

:� ���� �� ���� �������������� �� �������# �� ������ ��� ����<� �� ������

A���� ������ ������������� ����� �����

; ������ �� ���� � ����#������ ���# � ��� �� ������������� ����� ��� �������� ������ �� ����

'B�� �# )����� '# ;������� 3# >���� �# C���C� ����������� �8 ,�--+/�9.-1�9*8�

Page 101: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� ���� �������� ��� � ����� ��� ������ �� (�������� (����� 7"A5B84 �� �(H� ���� �� �� �� ������� � ������� A# ��� ��� ����� ���� ��� ������ �� ����� 7� ���� *$8� &� ������� �� ����������� ������ ������� �� ��������������� �� �� ������ �� ��� ��� �� ���� ������ �� ��� �� ����� �� ������� )������� �� �� ���� ��� �� ���� (� ���� �� ��������/ �� ��� �� �� �� ����� �� � �� ��/�� ��� �� �� �� ���� ���/�

�� ��� � � ���� � �������� ��� � �� ������� ���������� ������� �� ��� ��� �� ����� ���� ���������� � ��� �� � ����� �� ��� � �� �� ���� ���� ��� � �� ���� ���� ��������� ������ ���� ��� �� �� � ��� 1�� �� ���������� � ���������� ������ ����� �� ������� ����/��� ���� �� ���� �� < � ������ �� � ���� �� ��� ���� < ��� �� ����� ��� �� ������ ��� �� ��� � �� �# H �� ��� �����( ���������� �� �� ����� �� �� � �� ���/4 �� �������� ���

������ � �� ���� �� ��������� ���� ��/� ����� ������������� ��������� � �� �� ������� (�� < �� ����� ,,( � ������� ������ � ������� ��� � �� �� �� ! � ��� ������������� ���/� �� �� ������ ��� �� �������� � ���;� ������ ���� ���� ���� �������� ����� ���/�� ����

����� ����� ������� � �������� &� �� ��������� ��� *: �������� ������ � ������

,�

IPG stripagarose

SDS buffer

0�� #(2 ����� �� ��� ��2� ����!����� �� ��� � )�) $�%� ���� ��� �������� �������� �� ���� ��� ��� �� ���

����� ��� ��� ��!!�� � ��� ���0�������� � �� !����� ��� ����������

�������&'# �������&(���� )����� *+ ,�-.*/02�10+2�

C�� �� ����� ���<� �� ������ ������# �� ���������� ��� � ��� ����� #����� ������ ���� �� ���������� ����

Page 102: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

:������ ������������ ���!��

� &� �� � ������/ ������ 7��� �8 �� ��� � ����� ����� �������� � ��� ������ ����� � �� ��� � ���� ������� ����� � �� �� ���� �� ������� ���� �� ��������� �� ��� �� ��� G������ ��� ��� ��� � �9 ���� ��������� �� ������ ������ �� ��������� ������ ��

� �� ��� � ��'� ����� ���� ����� �� � �� ���/ 7���'8 ��� ���������� � �� �� ��� �� �� ��� ���� ��������� ����� ����� � ����� ���� ��� ��� �� ������� ��� � ����� ��� �� ������ � ��� &� ���� ������ ����� �� �� ����� ����� � �� � ����� ��� ������ �� ������/�� �� �� �� ���/�

� G ����� �� ���� ��� ��� ��� � ����� �� �������� ��� &� &� ��� ����� �������� �� ���� �� ��� ��� � ��� �� �� ��� ��� �� ����� � �� ������� �� ��� ������� ���� ����� ��� �� �� �������� ��� � �� ������������� � �� �� ����� ��� � ��� �� �� �� �� ��� ���/����� ����� �� ���� ������ �� �� ������� ����� �� ������ � �� �� �� ��� 7� ��� *58� �� � �� ������������ �� �� �� ���/ � �� � ���� � �� ��� �� ����������� �� �� ������ � ���

,#

notchedglass plate

magnetic stirrer

upper, cathodal buffer

lower, anodal buffer anode wire

cathode wire

coolingcoil cooling

coil

buffer pump,heat exchanger

same filling level

A B C

0�� #)2 ����� �������� ����� �� 0������ ����!���� � �� ���� �� !���� ��� �� 1������!��/�� ����!��� )� ����!�� ���� ���� ����� !����� ��/�3� ����!�� ��� ���� �� ��� � ����

Page 103: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

(� �� ���/��� �� �� �������� ��� ���� � ������� ���� �� ��������� ����� �� �� � ��� (� �� ���/ ���� �� �� ������ ����� �� .���� �(H�Y �� �� � ���� ��� �� ������� ������ ������ ��� �� ������ � ���� � � ���� ���� �� �� ���� ��� �� ���� �� �� ����� ���������� ��� �� ��� ��� �� �� �� ��1��� ���� ������ �� ���� ��� ��� � ������� ���� �� ��������� ��/���� ����� ��� ����� ���� � �������� �� -H, 7���� ��������� ������8��� ��������� ���� ��� �� ��� ������ ������ ���� �����

���/�4 1�� �� ��� < ������ < � �� �� ���� ���� �� �� �� < �������� < � �� ��� ��� �� �� ��� ����������� ������ �� �� �� ���� � �� ������ � ��� ���� ���� ��/ ������� ������ �� �� �� �� �������� � �� � �� � �� �� ��������������

�1��!����� �� ��� $ � ��� ,�� �� �� � �� �� ����� �������� �� ����� ��� �� � ! �������� ���� +�+ � �� �� ������� �� ��� �� ������ ���� +�+������ �������� ����� � �������� ������ ��� ��� ����������� �����

�1��!����� ���. ������

� ( � " � -$ ������ #�� ��� �� %�%� $�$!�1�����&��� 1���� : ����� ��� � ;$ � ��'�����

,&

0�� #,2 �������� ��������� ������2�E ��� 0� ��� �� ��� � ��� $�%����� ��������! � ����� ����

����� � � �� ��� $� ���� ��� � � ������ ��� ���� ��� ����� ��� ��� ����!������

$� $��� ���� ���� �� ������� �� ������� ������ ' ������� ���� �� ������� ������� �����# �� �� ��� ����� �� ����� ������

Page 104: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

.! ��������� �� ����� ���� �� � ���/4

"$ ��� "# �H ! ��������� ����/ ��� ���� �� � "L ���"$ ��� "# �H ! ��������� ����/ ��� ���� �� � ��$L �����������

'�' 1��� �� ��� �� �� � L +�+ �� �� ���� � ������� +�+ ��������� ����� ������

�� %�� !����� �% /�/ &� ��� �������� �� ��� ������ �� ��� ������/��� �� � �� �) :�B� ��� � �� � �� � ����/��� �� ��� �������� ���� � )���� �� �� ��� �� ��� �� �� ����� ��������� � �� ���� �) �� B�B �� ����� �� ��/������� �� �� ��������

� ����<��& ���� ��� ���� �&� ������ � � ��'������ ������ #&� )���� ������ �&� ���� ����� �&� " ������� ������3��

"��������� "��� �� ���/��� �� ������ � ������ �� �� ���������������� �� ���� �� �� �������� ����� ��� �� �������� ����

*��� ��� �������� ��� �������� ��� �� ����� �� �� /� �������������� ����� 7� ����8 �� ��� �� �������� �� �� ���� � �������� �� ��� ������ �� ���������� �������

����������� (�� �� ������ ��� �� ��� �� ��� ��� �� ����� ���� �� � ����� ������ 1�� �� ���� ����� ����� ��������� �� ����������� �� ������ �� � �������

$���������� �� ��/������� ���� ��� ���� � �������4

� ����� ��/������� �� �� �������� �� ����� ������ ������������� �� �������� �� ������ ���� ������� ��� ����������� ������������� ���� ���� ���������

� .���������� �� ����� ���/��� �� ������ �� -F� � ���7"AB5�8�

� (������� �� �� ������� �� ���'����� ���� ����� �� +�+�� �� �� ��' ��� �� 6# �� $# /���

�1��!����� �� ��� ���� ����� ��� �� �� �� � � ������� ���� ��� ��� ����� �� ��������� ����� �� ������ � ������ ����� (� ����� ������� �� ��� *6� ��������'� �) �������� /� ������ ���/ ��/ � ��/ ��� ������� �� �� ���� ������ ��� �� �� ������ < ���� ��� �� � ��� < � ����� � ��

,(

'B�� �# >���C# C�� 5#'E���� �# ������ 5A#������ �"# ������ (� ������������ * ,�-*.�/ ���1��2�

$� ����������� ��������� ��������� �� �� !��� ����������

Page 105: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� ���� ! ��������� ��� �� ������ �� �� ������ ��������� �� +�+������ �������� ��� � �� �������� ����� +�+�� ���� �� �� ������ ����� �� �� ��������� �� �� �� �������� &� ��� �� ������ ���� ��� ���� ! ��������� ���� �� ������� ���/� ��� ����� �� ���� ���� �� ����� ��������� ����� �������� ��� � � �� ������ �� ��� �� �� ������

������� 0������� ��� �� ���� � ���� ��� � ��� � ���������� ���� ������� ������� �� �� ������ �� &,- ����� ������� �� �� ����� �������� �� ������ ����4 �� �� �� � ����� � ������� �� �� �� �� �� �� ������ ������� � ��� *B�

���� ��� �� ��� $ � ��� ���� ��� '�' ������������ ���&� �� �� ��/ ���������� ��� ��� ����� �� ��� ���� ���� ������ ��� ����� �������� ��� �� ������ � �� ����� �� � ���������'� ���� �� ��@���� �� �� ��������� ���� ��� ���� ���� ����/� ��� �� ������ �� �� �� �� ��� �� � ������ �������������4 �� ��� ��� � � ������ �� �� ��� ������ ��� �� ���� ���� � �� �� ���� ����

� #&� *68 ��� &���� �) ' �� �� ��� � �&� " ��� � � � �� ����� ���2 ��) �� �� �&� �����&��& �� �� �&� ���&��

,)

IPG strip

SDS gel SDS gel

IPG strip

IPG strip

M

markersr

M

markersr

IPG strip

SDS gel

glassplates

glassplates

gel slab

hotagarose

film-backed gel

stacking gel zone

Flatbed system Vertical system

0�� #/2 ��� ������ �� ��� �$% ����� � ����������� � ��� �� ����� ������� � ��

Page 106: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

0���!�� � �� &� �� ������ ������� �� � �� ���� ������������ 7���� **8 ��

� &����� �������� �� �� ����� ������� ,������ �� ����� ����� �� ���� ������ 0��� ���� ����������� �� �� ����� ����� ��� �� &,-

���� �� �� +�+ ���� (������� � ������� ����� ��� � �� �� � ��� �� �����

�� ��� � ����� ������ �� � ������� ����� ����� �� ��������� � ���������� ��� ����� �� ���� �� ����� ����� ��"$ J � (�� ! ��������� �� �� &,- ����� �� ���� � �� �� ����� �� �������� �� �������� ���� ���� ���� ���� �� ���� �� ����� <�� � ��� ���� < ������ �� ��� $ �� ���� ��� �� �������� ������ ����� �� ������ �� �� �� ���� ������ �� �� ��� ����G ��/ ������ � ������ ���� &.; ����� ����������� ����

�� ����� �� ��� *B�(�� 6# ��� �� �� ��� ������ < �� ����� ��� < �� &,- ����

�� ���� ��� �� ��9 �� �������� ����� ���� �� ���� ������ ������� �������� �� �� ������� �� �� �� &,- ����� ���� ��� ����� ����� � � ��� � ���� �� �� +�+ �� ����� ���� ����������� �� �������� ��� ��� � ������ � ���� ���� ������ ���������

:������ � �� �� &,- ���� �� ����� ���� �� �� �� �� +�+ ���������� ���� ��� � ���� ���� �� ����� �� ����� ����� )�� ������������ ��� ����� ������ ���� �� ���� ��� ���� � �������4

� ����� � �� ������ ����� ���� �� � ���� ���� �� ����� ����� �������� �� �� ���� �� � �� ��� ������ ��� ���� ��� �� ���� ���� ������� ����� ��� ��

������� ����

� ����#&� � ��� ������ &���� �� �� &����� �& :$ ,�= �� ����� � �� � �� �'� ��� �� ��������� ��� �� �� �&� ������ �� ��� �

���� ��� �� ��� ����� � �!����� ������

� $�- � �� ���� " � �&��� ������ .! > ���/�$�$! � 1�����&��� 1���

4�������� ����� ��.�� ������ %�� � ��� � ������� ��� ������ �� ����� ��/ ����� ��� ���� �� ���� ���� �� ! �� ���� � �� � ��� "L ����� ��� ���� ��� �� ����������� �� �� &.; ������ ����������� ���� �� � ����� #�$L ����� ���� �� ��� ����

,,

&� ������ ����� ������� ������

�� �� ����� � ��� ; ���������� �����# ����� ������ �� ���������� ��� �� ����� � ������# ������� �� ����� �� ��� ��

3�� � �( �� ������ �������� ������� �� ������ ����

Page 107: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� ��/ ������ ��� ���� ���� ������� ��� �� �� ������������� ����� � ����� �������� �� �� ����� �� ��/� �� �� &.; ����� ��������

���� ��� ������� �� � ��� � �� "$ �� �# �H� ;� ��� ��� �� � ��� ����� ����������� ��� ������������� �� ��/� ��� �� �������� �## �� "### �� �� ��� �������� �� ������� �������� ������ � "# �� $# �� �� ��� �������� �� ���� ���������

+����� ������� ��� ������� ��� ������� ������� (��� ������ ��� � �� � � ���� ��� ������ ���� ���� 6# ��� �� �� � � �� ������������� ����� 7���� $A ��8�&� ��������� � � � �� ������� ���� �� ���� ������� �� �����

��� � �� �� �������� ������ ����� ����� ��� ���� ���������1�� �� �� �� ������ � ����� ���� < ���� ��� ��������� < ��������� ���� �� ��� �� ���� ������� ������ ��� �� ���������� ������� &� �� �� ����� �� ��� ����� �� ��� � ��N� � ��� �� �� �� �� �� �� �� ��� � � ���� � �� ��� � ��� �������� ( ����������� �� ��� � �� �������� �� �� ��@ �� ��� �� ������ ��� ��� �� ����&����� �� ��� � ���� ���� �� ��� �� � �� �������� ��

�������� ���� ��� �� � �� �� ���� �� �� �������� ��� ��� ���� �� ����� � �������� �� ��� ��� �� � ���� &� ���� ��� ��������� ��� � � ���� ���� �� ����������� �����������

���������� G ����� ��� ��� � � � ��������� ��� �� �� N� ����� ����� ��� �� � ����� &� ���� �� ��� ������� �� �� �� ������� �� =������� ����?4 ���� �������� �� �� ��� ���� �� ������� ����� &� ��� �� ���� �������� ���� +�+ ��� ��� �� � ������ �� "# �� "$ J �� ��� �� ��� ��������� �� �� �� ������ �������� ����� +�������� �� ��� �� ������ ���� �� ���� �� �� ��� ������ ��� ������ ���� ��� � ��� ��� ���� �� �������� ��� �� ��� � � �� �$ J � �� �� � �� � ���� ������ ������ ��� � �� ����� ��� � ���� ��� �� ��� ����� � ����

"����� �� 1��. ��� ;��� ��������� �� ��� ��� < ������ � ���� � ������ �� ������� < � �� �� ��� ���� �� ����� ������ ��������� ��� ���� �� ����� ���� ����� � �� �� ��� ���� ������� ��� H�� ���� �� ����� ��� �� ���������4

,/

$� ���� ������� �� ��������� �� 29 ������ ��������������

Page 108: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

� &����� ������� ��� ���� �� ������� � ����� &����� ������� �����������

� &����� �'�� /������ � ��� ������ ����� ���������

4�������� ����� ���������� ;� �� ���������� �� ���� �������� �� ��� ���������� ��� ��� ������ ���� � � ��4

�� ��������� �������� ����� ������� ������

G��� �� ����� ��/ ������ ��� � ������ �� � ����� ���/�� �� ��� ��� �� ���� �� ������ �� �� ������ �� �� ��� ���� ��� ��������� ���� �� ���� �� ����� � � ������� ����� ��������� �� �� ��/ ������� ���� ���� �� � ���� ����� � ���� �� ���� �������� ������ �� ="�� ����������?��� ����� ���� ���� ����� �� ��� ������ ��� ���� �� ��/�

��� �� � ������ �� �� ����� ���� �� �� ���� ���� �� ���� ���� ������ ��� �� ����� � � �� ��� � �� �� �� ����� ��+�+ ,(-.� ; ����� �� ��������� �� ���� �� ������ ����+�+ ,(-. �� ��� ��� �� �� ����

�� $����������� !������ ������� ���� ������ ��� .���� 4� + ���,������ ����� ������� � �� ��� ��� ��� �� � ����� ��� ���� ������� �� ������������� ��� ����� ���� �! �� ������������� �������� G ��� � ��� ��� � �� �� /������ �� ������������ �� G ��� � �� �� ��� ������� �� ����� ���� �� ������ ���� �� ���� �������� ������ �� =��� ����������?� ��������� �� � �� �� ���� ���� �� ����� ������ �����

����-�������� �� ������ ���

�� �� � ����� ���� �� ������ ! �� �� �� ���� ���� �������� �����! �� ��� ��� �� ��������4 �� ��� ��

� � ������� �� �� �� ��� ���� � �� �������� ����� ! ��������� ���������� ��� � ��� ��������� ��� � ��� ������� ����� � ��������� ���� ���� ���������� � ��� ������� � �������� �������� � ���������

,3

(�� �� ��� ������� ���

�� ���������� !���������� +9 Q ��� ����� ���� ������ �� ��� ���

)���� �� �� ����� ������������������ �� �� � ����

Page 109: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

����� ����� �� �� �� ����� ���� ������ ��� ��� ��� � ������� �� ��������� ���� ���� �� ����� �� � ���� ��������� �������� ��� ��� ��� �� +��� ������ ������������ �� ���� �� ��� ������� ���� �� ��@� �������� � ! ���� �� �� �����

����-�� ����� �� �� �������� �����

��!� )2 �������� ������� ��� ������ ����� ���� � ����������

4��&�� ��+ � �� "� �+ � ��

������� %������� %� �������� 7���������8

+���� ���� ���������� ! ���������������������� ���� ��������� ���������

H�� ����������4 H������ ��� "## �� �� %+(������ �� ������� ����� � ������ �� ������������

������� %������� %� �������� 7������� ������ ���������8

+���� ���� ����������� ���� ! ���������������������� �� ��������� ������� ������������ ���������

H�� ����������4 H������ ��� �## �� �� %+(����/�� �� ���������������

K��� �����'�� ����������

G�� � ����������4 H����� "# �� �� %+(� ������� ���� ������������� ���� ��������

%�� �� ! ������������������� �������� ������ �� ��� ��������

+��� �������� 7���� ������8

)��� ����������4 H�� ���#�$ ��� ��� � ������� �������� ����������

,�� ������� ���������� ! ������������������������� � ����������

+��� �������� 7����������8

)��� ����������4 H�� ���#�$ ��� ������ ����� ������� ��� ���� �� �������� ����

,�� ������� ���������� ! ������������������������� � ���������� � ���� ��������� ���� ������

;� ����� ������������ 0 %,+

G�� � �� ���� �����������4 H�� ��� $ �� ��%+(� �� ���� �� ! �������������� ��� ����������� ���� ��������� ���������

������� ���� ���� ������� ���� ������������ ������������� ��������� �� ������ ����� �������� �� ������� ����� � ������ �� ������������

/9

&����� :# ����&# $��� ���� �������C� ������������ - ,�-**/ �++1�8��

5���� ��<�����# ��������������������

%�����6�>����� 3# 3������������� (# ���� #'����"# ���6 # "� #%���< AC� ����������� �-,�--*/ �0-*1�298���<����� 5# �����< A� ������������ 8 ,�-*+/ �901����

A������ $� ����������� �0,�--�/ 2�-120-�

A������ $# ����� 5�"#(��� �# ��� ������� �#(������ 5� >�������� � ,�99�/8--1.92�

Page 110: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

4��&�� ��+ � �� "� �+ � ��

;� ����� �������� �������� ��� �� �����������

G�� � �� ���� �����������4 H�� ��� $ ��� ������������� �� � ���� ������ �� �� ������� �� ! ���������������� ������� �������� �������� ����������

H������� �������� � ��� ������'� �� ������� ������� �� ������ ����� �������� ������� ������

0��������� �������� )��� ����������4 H������ ��� ���� ! �������������� �� ��� �������� ��� ���� �����������

H����� �� ������ �������� ��� �� � ����������� ���� �������� ������������ ���

+���� ������ �������� )��� ����������4 H������ ��� ��� ����������� ���� ! �������������

G����� ����� ���������� ���� �� �������������� �������� ���� ����������

1��� �������� &��� �� ������ ���������� ������ ������� ������� ������� ��������� �������� �� ������������ ������ ���� �������� �� ���������� �����

(��������� ����������� ���� ��� ������� ������� ������ ������������ �������������� ��� � �� ������ ������� �������������� ��/� ������� ��������� ���������

&� ������ �� ������ ������ �����! � �� �������� ���������� � ������� %������� %� � ���� ��� �� ����� ���������

����-�� '����� ��� � !�� ��� &� �� �� �������� �� /���� ���� ������ �������� �����! � ����������� ��������� �� � ������� ����� �� ��� ����� �� ��� ���� ������� %������� %� � � � ���� ���� ��� ��� ���� (��� ���������� �������� �������� ���� ������ ������ �� �� ���������

@�� ����� ������� ����� 1�� ���� �������� �� �� ����� ����� �� ��� � ��� ���� �������� �������� �� ��� ����� �� ����@� ����� ���� ���� ��� � ��������

���� � "��� ����� �� =���������? �������E����� ���� �������%� �������� ���� ��� �� ��� � �� �� ��� �������������� � � ��� ��������� ���� �� ������������������ ��� ���� ��

/�

R�E"# "����� " #"���� 5�� ����������� �*,�--./ �9.�1�9..�

5������� A%# >��<�� �3#)��<� �(� ����������� ��,�--9/ 0++1089�

���<�"# ?����#������ A� "� 3 >��������� � ,�99�/ �-1�-�

����"5� ��� (��< �5� �� ���>����� ��� ��� >��������"����� �� "����� )���� ���� ������ >���# $�����#&5 ,�---/ 0�-10�-�

$� ������ ��� ��D������# �����# ��� ������������

Page 111: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

����� ����� � ����� ������� �� ���� +�� ������ < ��������� ������� < ��� �� �� ��� ���� �� ���/�� �� �� �� ���� �������� %�� � �� ����� ���� �� ����� ! ������������ �� �������� ��� ��� ��� �����

�������� ���� � "��� ����� �������� ������� %� ���������������� �� � ���� � ��� �������� ���� �������� � � �� ���� �������� � � ����� (����� � � ���� ������ �� ������ ������������ ���������� ���� ������ ��� ��� �� ������������� � � �� ���� �������� ������ ������� -��$# �� ���0���� �������� ������� ��� ������ � ��� �� ��� ���� �# L������ � � ���� �� ��� �� ���� ���� ���� � �������������������� ���� �� ���� ��������� % � ���� ���� ��/� � ������ ��� ��� ��� ���� ����9 �� �� ��� ���� �� ���� ��� ��� ��

%�� ���� � "��� ����� G �� ! ��/ � ��� � ������ ����� ���� ������E�������� ���� ���� ��������� �������0�*$# �� "# L ����� ���� �� ����� ����� � �� ����� ��� ���� ��� �� ��� ���� �� B# < A# J �� � ������ ��� ��� �� �� ������� ���� �� �� ��� ����� ��� �� � �������� ��� ��� ����� �� ���/��� �������� +������� ��/� "# ��� ��� �� �� ��� �� � �������� ���� "# L ����� ���� �� ��� ����� �� ���� �� �� +�������� �� ��� �� ��������� ��� ����� ��� � �� ������� �� ����� � ���� ��� �� ������ �� ������ ��� ����� �� �������� � ������� �� ��� �� �������� ����� �������� ���� �� ���������� ��� �� ������ ��� ������ � �������/�

/� ��� � ������ ���� ������� %� �

'���� ����� �� ���� ����� ������� �� ������ ��� �� ������ ������ �������� ��� � �� ��� ���� "# L �� �� ��� �� ������ ������ ��� �� �� ��� ����� � �� �� � ���� ��� �� �� ��� ���� 1�� ������ � ��������/� ��� � ������� �� ������������ ��� �� � �������� ���� ���� ����� �� �� � ���� �� ������������ ��� � �� ���/��� ����/� �� ��� �� �� ��� �� �� ��� �������+��� �������� ���� ��� �� � ����� ������ ��� �� �����

������ ���� ������� %� ��� ��� �������� ���� � ��/���� +��� 0 �� 7-F� � ��! �###8� ;�� *A ����� ��� ����������� .����� ������4 �� ������ ���� ��� ������� %� ��� �� ����� ������ ���� ���� ��������� ,���� ���� �� �� ������ �) ������� ���� �� ����� �� ������� %� ���/� � �� ���������� ������ ��� �� ������� ���� ���� ��������� ���4 �� ������ � �������� ������ ���� �� �� ���� ������ �� �� �� ��� �&E��� G ����

/�

$��� �� �� ���� �������������� �������� �������# ����� �� � �������� ���� ������������� ��� ����

3����� 3������� ������������� �� ��� ������ �< ����� �������� ��������'B�� �# ;������ 3#)�����'# ����� �# ����� )#C������� A# C���C� ������������ �� ,�999/ �90.1�9+0�

Page 112: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

���!�� ����� 1�� �� �� �� ���� ������ ���� ������� %� ��� � ��! ���� ���� ���� ��������� �� ����� ����� �� �����/ ���� ������� %� ����� �� @ �� ����� �� ����� ��� � ���� ���� ����������� � ���� 6#�

&� �� ��� �/����� ���� ��������� � �� ���� ������� %� ��������� �� ������ �� ���� ��������� � ����� �� ������ �������� ����������� (���� �������� ��� ���� �� �� �������� ����� �������� ������ ���� ��������� 1�� �� ������� %� ���������� ����� �� ��� ������ ����� ���� � ����������� ������ ���� ������ ���������

/#

0�� #32 ��� � ������������� �� ���� ��������� ��� �������A �$% 3'�4 �2 �&��( ��� ������ ����� �� �������A)�) $�%� � � �� $$� � ���- . $(3. 3� 2��� ����A ��� � ������(

���� ��������� �����D :��� ����A�,4 � ������( �� 0�� ������ � �����!�� �� ������� ��� ������ �������� ��� �������� ������ �

0�� &92 ��� � ������������� �� ���� ��������� ��� �������A �& �� �$% 3'�4 2( ��� ������ ���� �� �,4 �������� �� �������A )�) $�%�

� � �� $$� � ���- . $( 3. 3� 2�������A ��� ��������� �����D :�������A � ������ ���������� ���� �� 0���

C�� ��� �������� �� ���# �����<������ ��� �� � ������ ����

&��D �� ��� ���� ������������� �� ������� ��� ��!����� ������� ���������

Page 113: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

4� ���������� �����!��� ������� %������� %� ������ ���� � ���� ��������� ���� ���� �������� ��������� ��� � ���� ��� � �������� ���� ��� �� ������� &� �� �������� �� � � �� ���� ���� ! ����� �� ����� ������������ ������� � �� ������ ��������� ;� ��� ��������� ����� �� �� ��� ��� � ������ �� � ������� %������� %� 0�*$# �� ��� ��� ����� ���������� �� ����� ����( ����� ����� �� ������ ���� ������� %� ��������� ��������

�� �� ����� �� ������������� ��� ������������� ���� ������������� ���� ���� �� �� �������� ��������� ������� ��� ����� ���� �������� ���� �� ��� � ��� ��/�+��� �������� ��� � ������� �� ���� �������� ����������

���� �� �������� �� ���������� ��� �� ���������� ��� ����� ������������ ��� �� ���� ��� ���� 7+�����/� � ��! "AA:� O�� ���! �###8� �� ������� ���������� ����� �� ��� � �� ����� �� ������������ ���� � &� ��� ���� �� ����� ���� ������ ������ ��� ����� �� ������� �� ���� �������� 7-��������� ���! "AAA8� �� ���������� ������� � ������ ���� �� �� � ����� �� ��� �� ������� ������ ����� �� �� ��� ��� � � ����������&� ������� ����� �� ������ �� �! ����� ���� ���� ������

����� ���� �� ������� �� ���� ��������� �� ����� � ��������� �� ����� �� ������� ��� ���� �������� ��� � ����� ����� � �� ������� �� ������ ���� ���������� � �� �������� �� �� �� ���� �� ������ ��� ����(� �� ���� ���� �� �������� �� �� � ����� ���� �� � �� ��

��� ��� ���� ������� %� ��������� ���� ���� �������� �� ����� ������ ����� �� ����� �� ����� �

'������� ��� � !�� ��� �������� ��� ������ ����� ( ��� ������������� ��4

� ����� �� �� ���� ��������� � ��� ������� %� ��� ���� ���� ���� ���� �������� �� ���� �������� ����� ����� ��

� �� ���������� � � �� ����� � �� ����� �� ����� ��� ������ ���� ����

���������� ����� �� �� ���� ���� ��� ���� �� ������� ���� �� �������� ����� ���� ���� ���������� � ���� ������ �) ������ ��� �� �� �������� �)

���� ���� ���� ����� ����� �� �������� ���� �������%� ��� �� ���

/&

$� �� ���� ������ ����������

������<� �# C��"#:���;� "���"� ��� 3��8* ,�--8/ *+91*+*�H�� 5G# C��� A# )�<��� $#���� A�# C������< 5�#C�� 3�# ����"5� ������������ �� ,�999/ 0888108.��'���������� %# C����� 3A#"���� �# ���� )�#"���� �"� ����������� �9,�---/ 89�189+�

Page 114: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

����-�3 �������� ��� ������ �����0����� ����� ����� ( � �� �� �� ����� ��� � ������������ ������ � ��� ������� ��� ��� ��� � ���� �� ���� ��� �� ! ������������ �� ������� G��� �� ��� ���� ������������/ � ���� �� ������� %� ���� ;� ����� �������� �� ������������ ���������� +��� �� ��� G��� �� ,��� ��� ��������� ���� 0 %,+ ��� ���� 70������ � � ��� �##"8 � ���������� ������ �� ������� �� ���� �������� ��������� ������������ 7��� �� ���� ������� ��� �� ������8� ( ������ ������� ������ �������� ��� � �� � ��! �� ������� ���� � ���������� �� ����� ����� � ����������� ��/ ���������� ��������� ������ �� ����� � �������� ��� ���� � �� � ��� ( �� ������ ����� �� ! �� �� ��� ���'����� ��� �������� G��� ���� �� ����� ��� �� � ������ ��� ������ ��������� ����������� �� � �������� ���� ��� �3�

0����� ����� ��!����� ;� ����� �������� ���� �������������� 7���� ��� N��/���� "AA*8 � ���� ��� �� �������� ��� ����� ���� ������ ����������� ��� ������� ���� ��/ �� ������ ���������

����$�� ��� ;� ����� ������ -� .���������� 7�����-.8 �� � �����! ���� ����� ������ ����� ���� � ���� �� ������ ��� ��� �� ����������� �� ���������� �������� 7���� 6"8� �� �� �� ������ ������ ��� � ������ ��� ��������� ��� ��� ������ �� � ����� �� ��� ����� ��� � �� �� ���� �� ������ ��� ������ ������ ���� ��� �� ������� ��������� ��� ������� ��������� 7Z��U � ��� "AA5� K�� ���� �##�� -���� � ��! �##�8�

�� ��� � ������ �� ���� ��� ���� �� ����� �� ������� �� ��� ����� �� �� �� ��� ����� ���� ����� �� �� ����������� �� � ��� ��� �� �������� �� ���� ����� �� ������������ ������� �� ���� ���� �� ������ � ����� �� �� ��� �������� ��������� ��� ���������� ����������� ����������� ��� ����� �� �������� ������ ��� �� ����� ������ ��� ��������� �� ����� ������� �� ���� ���������� �� ���� �� ������������ �� ������ ������� ��� � ����� �� ��� �� ������ �������� ��� � �� �� ��� �� ������������� � ���� �� �� �� ���������� ����� ���� ��� ����� G������� ������ ���� ��������� ���� ��� ���� �� � ������ ��� � � �� �� �����

/(

A������ $# ����� 5�"#(��� �# ��� ������� �#(������ 5� >�������� � ,�99�/8--1.92�

7���� :# 5��<��� >� ����)����� �9- ,�--0/ +.18��

R�E"# "����� " #"���� 5�� ����������� �*,�--./ �9.�1�9..�?���'# (� �# �3����#3�� �# ����# '��� H#%��"# '���� 5# ��&#$� �� ># )��< " # (����� (�#>������� ��� 3# ?��� H� "�3 >�������� ,�99�/ �������'����� �# '���� ># H��� �#?���"5# 3���� A# C������� "�# $���� 5%� "� 3>�������� ,�99�/ �� �����

Page 115: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� ������� ( ������� ������ ���/�� 7� ��8 ��� �� ������� �� ������ �� ��! ��������� �� ���� ��������� �������� ��� ������ ������� �� �� �������� �� ������� �� �� ������ ������� ������ ����&-. �� ����� ��� ��� ��������� � �� ���� �����

���� ������ ��� �� ������ ��� ������'� �� ������� �������� �� ������� �� ������� �� ������ ����� �� ���� ������� �� �� ���� ��� ���� ������� ������ ��� ��� �������� �� ��� ��� ����������� ����� ��� ��� � ����� ���� ["#L������� �� ������� ���� ������ ���� MA$L ��������������� ��� ����� �������� ����� �� �� ����� �������� 7������� ��������8�

����� ����� �� ������ ��� �� ������ ����� �� � �� �������� ����� �������� ��� ������� � ����� ������� ���� �� ����

�� ���� ���� ��� ����� � ��� �� �������� ���� �� ���� ���� �� ����� �� �������� � ��� �������� ��� ���� 7&.;8 �� �������� H���� �������� �� �� �� �� ������� ����������� � �� ���� �� �� �� ����� �� /�� �� ��� �� �� ���� ������ ����� ��� ����� �� �� �� �� ���� ����� �������� � ����� ������ �� ���� ���� ���� �� ��� ����� ����� �� �� �� ������� �� ��� �� ���� ��� ��� ���� ��� �� ������� ����@���� �� ����� �������� �� �� �� ��� ��� ����� �� ��@����������� ����� ������ �� � ���� �� �������� ����� ��� �� ��� ������ ����� ��� � �� ������ ����� ��� �� ������ ��'� ;�

/)

wildtypedye 1 label

mutantdye 2 label

mix

IPG strip

2-D electrophoresis in one gel

image of dye 1 image of dye 2

0�� &�2 ��������� � ��� � ����������������� ���� � ������� ��� �!� �� ���� ��������� �������� ���� ��� ����� ��� ��@����� ����� � ��������� ����� �� �������� ��0� �����

Page 116: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

��� �� ���� ���/��� �� �� �� ������ ���� � �� ����� ��� ������� +���0 ��� ���� ���� �� ������ �� ������� ������ �������� ��� ��� �������� ��� � ������� ���/��� �� �� ������ ������� ��� � ������ H������� ��� �� � ����� �� ��/�����) ��� �� ���� �� ��� ����� ����� � ��� ������������ �� � ������ �� ���� ����� .������ ��� ��� �� ������ ���� � ��� �������� ���������� ��� �� �� ������ �� ����� ��� ���� ����������� �� ������� �� ��� ������� � ��� � ������ �� ������� �� ����� ����� ����� �� �� ����� �������� +�+�,(-.�������� ��� �� �� ����� ���� �� �� �� ����� ���� �� ����������� +���� �� �� �� �� ���� �� ������ �� �� �� �� ����� ��������� � ������ ��� �� ���� ���/����

����*$��� �����

�� ��� ����� ��� ��������� �� �� ������ ��� ������ ���� ��� �� ���������� ����� �� �� ����� ��� �� � ������ ����������� ���� ���� � ����� � ����� ��� ������� ���� � ���� ��;� � ��� ��� ����� ���� �� ���� �������� ������ �� �� ��������� �� ��! � �� ���� �� � ������� �&;; ��� ���� ��! �� ���� ���� ��� ������ �� � �� �� ": ��� ���������

� ����*� �&� �������� � ��� &��&� �&� �� �� ���� )��������� ��� ��� �� ������ ������� � �� � ���� �����

������� ��� ��� ��� ��� ��.�� 1�� �� ��� ��� �� � ��������� �� � ������� ���� ���/ ��� ���� ��������� �� ��� � �� ����� �� � ����� ���� � ������� ���� � ����� ��� ���������� ���� ��/� < �������� ���� ���� �� ����� ��� ���������������� < � �� � �� �� ������ �� ���� � ����� �� ��������� ����� ��/� � � ���� ������� �� ��/ �� ��� �� ���������/ ���� �� ���� ��� � ������������ �� ��� ��/�� ������ ����� ���� �� ������

����*�� $��� ��������&� ��� �� ������� ���� ���� ���� ��� ��� �� �� ��' ��� ���# C �# �� � �� �� ����� ��������� �� ��� ���� �� �� ��� �� � ��������� �� ��� ���� ��������� (� �� ���� ���� ���� �� �� �� �� � ���� �� �� ��/�� ����� ��� ��������� �� ��� ���� �� � ������ ���� ��� ����� �������

/,

���� �� ������� �� �����<� ���� ��� �� �������# �� �� ���� �� ����� �� ������� �������� �� �� �������� �� ���� ���<�

Page 117: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

'������ ��� � !�� ��� -�� ���� ������ ����� ��� �� � ������ ������������� ���� ������ ! ������������ �� ����� �� �� � �������� %��� ������ � ������ �� ������� ���� &� �� � ������ �������� ��� ����� ��� �� ����� �� �� ��� �� ��'�� (� (*����� ����� ����� ���������� �� ���� � ������� ( 6 ��������� ������ ����� � �� � �������� < ���� �� ������ < ���� � ��

��� ������ �� ��� � ����������� �������� �� �������������� ��� � 7� (�� �������� ����8��� ��/��� ������ ����� ! ��/ �������� ���� ��� ����

��� �� # �� *�:���� �� ����������� ��� ��� ���� ���� ���������� ����� &� ������ �� ���� ��� ���� �� ���� �� �# �� ������� ������� ��� � �� ���� ��� �� �� ���� ��� ���� +������� ��# C �# �� �� ���� *## ��� ��/� *# ������ �� " ��� ��;���� � ���������� ���/� ��� � ����� �� �� �������� ��

���� �� �� � ��� ����� ���� � ���� ��� �� ��� �� ����� ����� �� ������� ��/��� ������ ��� �� � ������� �� �������� �������� �� ������� ��! �� ��/���;� ��� �� ���/��� �� ����� �������� �� �� ���� �� ���� ������

��� �� �E� ��������� �� �� � ����� ��� ���� �� �� �� ���������� �� ���� �� �E� ���� ��� �� � �������� �� ��� ��������� �� ��� �� � ���� ��� ���������� ���� ��� �� � ���������� �� ���� ���/ ���� � �� ��� ����� ���

'������ ��� ������ ��� ���� ����� ��� ������ ���� ��� �� � �������� �� ����� ������� �������� � ������� �� ����� ��������� ��� ����� ������� ��� � ������� �� �� ���� ����

//

0�� &�2 <����! � ���� ���� ������ ����EA B��� /�� ��������� ������������ 1���������( )� 0� �( ;)��

%�� �� ��������� ��;��� ������� �

Page 118: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

H��� ���� ������ ��������� � ������� ���� ������ ������� �� ���� � �������� ����� �� ������ � � ���� �� �������� ������ �������� ;�� 6� ����� � ������ �� � �� �� ���� �����0������������ ������ �� ���� ������� �������� +���� �����

��� ��� ������ ��� � � �� ��� ���� ������� ��� ����I��� ������ �� ������� �� � �� ����� (�� �� ���� �� ���� �� � � �������� ������ �� ����� ��� �� ������ ����� )� ��� �� :** ��� ;� �� �� ��� �� ����� �� ��������� ����� �� �� �� ���������������� ������ ������ ��� � ������� �� �� ���������

���4 ���� ���� ���� ���� *$+ ��� *�, ������� � ����9 ����� ����� ���� ��� �� � ���� ���� ���� ���� *� , ������ ������� � ������+������� � �������� ������ ���� �� ����� ��� ���� ��� ���

�������� ���� ���� ��������� � � � � �� ��� ���� ������� ����G��� ���� ���� ��� � �������� ���� ��� �� ����� ���������� ������ ��������� ������ ��� �� � � �� ����� ���/��� �� ������ ��� ����� ����� ��� ��� � ������� ������� ����� ����� ����� �� �� ����� ���� � �� �� �� ����� ��9 ������� ����� �� �� ����� �������� �� � ���� ���� � ��������� ������ �������� �� �� ����� ��� �� � ��� ����� ���� 7� ���� 6*8� +������ ����� ��� ����� � ������ ����� � ����� ������ ������ � ��� �� � �� ��� ���� ��� ��� �� =�� ���?� ��� ������ � ��� � ���� ��� �� �� ��� ����� �����

/3

gel

glass plate

emissionfilter

lens

lens

lens

excitation by

stray light focused beam

laser diode

beamsplitter

fibre opticcable

“peep hole”

tophoto-multiplier

0�� &#2 )�������� ������ �� ��� ������ � ��� ��������� �������� ���� ������ �������

Page 119: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

+��� �� �� �� ���� ���� ��� � ! ���� ���� � �� �� �������� ��������� ��� �� �������� $*� �� 7��8� :** �� 7�8� ���6$5 ��� 6BB �� 7�� 8� G��� ������ �� �� ����� ������� ������� �� ����� �� � )������/ �� (����� %�������� 7�###8�+����� ���� �������� ������ ���� � �� ���� ����� ���� �E� �����

������ �� ��� �� ���� ���/��� �� ��� ! ���

����*�� $��� ����� �������(� �������� �� �� �� ��� ����� ������� ���� ������� ��������� ����� ������� ����� �� �� �� 1������ � ��&I\ ���/��� ��� �� ������ ��� �� (��� G���������&��� �������� �� ��� �� ���� � � ����4

� �������� �� ��� ����� �� ���� ���� �������� ��������

� ���� ����� �� ������� ���� ����� � ������� ��� ������� �� �� �� ��� ������

� ������� �� ����� �������� � ������� �������� T ������������ �� ����� ������� ������� �� �� � ������ ���� �������� ��������� �� ���� ��������� �� ����� ������� ������� ��� �������'����� �� ����� ������� ��� ���

��/��� +���������� �������� �� �������� � ����� .������� ������� ! ���� H��/�� �� ��� ���� �� ���� �������� ������ &�������� �� �� ���� ���� ���� � �������� ��/����

������

�� �������� �� ������ �� ��� ���������� �� ������������ �� � ������ � ��� ������� ������ �� � ������� ������ ������ ��� ���� ��� � ������ ��� �� �� ��� 1����� ����� ������ ����� �� �� ����� ������� �� ����� ��� �������� ��'�� ������ ��� �� ������ ���� )���� �� �������� ���� ���� � ��� ������ � ����� �� ��� �� �� ���������������� ������� �� �� ������4 �� ������ ������ ������� ������ ������������� ���� ������ ������� .������� ���� �������� ��/ �� ����� ! ���� %�� �������� � ��� ������� � � �� ���� ���� � ��� �� �� ��������� � �� ���� �� ��� ������� ������ �� �� ��/�4

� ��� �� � �� ���� ����� �� ����� ���� ���������� ,��������� ������� ����� ��� �� ���� ���� ��� ������

��� ��� ��� ���� ��� ��� � ������� �� ���� ��������� ������������ ��� ������ ��� �������

39

������� )�������� ��������<D %������� �������D�������� ��� ������ ,�999/80�990+��*�

Page 120: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

� )����� ������������� � ��� � ������ ������ ��� �������� ����� �� �������� ��� � ������� �������� �� ��� �����/����

��� ��� ��������� �� ��� ��� ����� �� � ���� �� ���������� ����� �� �� ��� ���� �� ������ ������ � ���������� ����� �� �������� ����������� ��������� ����� ������ �� ��@� ��� � �� �� ��������

���� �������� ���� ��� ��� �� �� ������������ ���� �� ������� ��� �����

��������� �� � ��� ����� �� ������ ���� � �� �������� ��� �� ��� ��� �� ������ ���� � ������ �����

'��� �������� �� ���� �������� ��� �� �� ���� �������� �������� ������ ��� �� � ��������4

� +�' �� ���� ����� �� �� ������� �� �� �� ���� ���� ����

� +��������� �� ���� � ����� ������ � � ���� ��� � �� ���������

� %��/�� �� ����� �� ������� ���� ��/ �������� ���� ���

���� �� �������� ��� ���� �� ��� �� � ���� ������� =��'��?������ �� �� � ������ �� ���� ������������ ����� �� ��� ������������ �������� ������� ( ��� �� ����� ����� �� �� ������ �� �������� �� � A�������� ������ �� �� ��� ��������� �� � �� �� �� ��� �� ����� ��@ ������ � � ��� ���� ���� ������ ��� ������� 7� ��� 668� 1�� �� ������� ��� �� ���� ������� ��� � � ����������� ��� �� � �� �� ����� �� ���� � �������� �� �� ����&� �� ��������� ���� �� ����� ��� ��/ ����� � ���� ��9 ���

����� ����� ��� � ��� ���� ���� ��������

'��� ������� %�� ������ �� ������ ������� ��� �� � �������� � � �� ��� �� ���� ������4

� �� �����4 ���� ���/� ��� ��� �������� ��������� G���� � ��4 ���� ���/� �� �� �� ��������� ��� +���

0 �� ���������� G���� � ��� �4 ��� �� ��/ ����� �� �� ����� �� ����

�����

3�

$� ������� �� ���� ������� � ���� �� �� ������ ��!�������

������� ����� �� ���� ���������� ���� ����� ��� ��������� ������

Page 121: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

1��� � ����� �� �� ������� ������ ����� �� �� �� ���������� ��� � ����� �� � �� ��������� ;������ ��� ���� � ���� ��� � ����� �� ������� �� ������� ���� ����� ������� ���

'��� ����� 1��� �� ������ ������� ����� ��� � ����� ��� ��������� ������ �� �� ����� �� �� ����� ��� �� ����������� �� ������ ���� ������ ��� ��/ � �� ���� �� � � ���+����� ������ �� ���� ������� ��� ��� �� ������ �� ��

�� ����� �� �������� � �� ��� ��� ���� ���� �� �� ����� % � ��! �� ����� ��� ��� ��� �� ������� ���� ��� �� �� ������� �� ��

� ����#&�� �� �&� ��� ������ � � ��������������� � ��� �� �� &�� ���������� �&���������������' � ����� ������ ��'�

"��.������ ��������� %�� � �� ���/�� �� �������� �� ���� �� �� ��� �� ��� �� � � ������ ��� ���� ! ������������������ �� ��� �� ������ ���� ������ ��� �� �� � �@���� � ����+��� ������ �������� � �� �4 �������� �� �������� ������ �� ������ =��� �� ��������? ���� �� �� ���� ����� ������ ���� � ���� ��� � �� ��/� � ��� � �������� ( ��� �� ������ �� ��� ����� ���� ��� �� ������ �� � � �� �� ������ ������ ��� �� ���������� ��� �� �������� �� ���� ����� �� ���� �������� � ��� ��� �� ��� ����� �� �� �� �� ����� �� ���/�� ��� ��������� (� � ������ �� �� � �� �� ���� ��� �� � ���������� ���/�� �� ����� � ������

����� �� �� ��� ��� ��� ��� ������� +�������� ��� ;� �� ���������� �� �� �������� �� ��� � ���� ��� � ��� �� ��� ����� ���� ������� ��� ����� ����� �� ��������� ( �� ��� �� �� ���� �� �� ����� �� �� ��������� ���� �� �� ������� (�� ���������� ����� ��� ��� ��� ���� ���� �� ���

��� ������ ��� ��� �� ������ ��� � ������ �� �� ������ ���� ��� �� ������� ��� � �� ����� �� ������ ��� � � ���� ������� � �� ����/��� � ������� �� �������/� ���� �������� ����������� ������� �� �� ���� �� ��� ��� � ������� ������������ � ���� �� ��� �� �� ������ ���� ��� ����� �� �� ������ �� ������ ���� ������ �� ��� �������� �� =����? ���� ���� � ����� 1�� �� ��� ��' �� �� �� �� ������ �� ����� ��� �� ��� �� ���� � ����������� ���� ��� ����� ��

3�

Page 122: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

� ������� �� ��� �� �� �� �������� +������ � �� �������� � ��� � �������� �� �� ������ ��� �� � ����� ���� ���� � ���� �� �� �� ������� &� �� �� ����� ���� �������� ��� ������� ����� � �������� �� ��� � ����� ������� ������ ���� ��

3#

0�� &&2 )��� �������� ��9��� ��� ��������������������� ��� ���� � �� ��� ����� �������� ���� � �� � ��� �����( ���/�� ���� � ���������

0�� &(2 %� ������� 2��� ����A %� �0�� � ���� ����� ������� �� �������������� :��� ����A ;������ �0�� � ���������� 0������ !����� �������� �� � �0� ������

Page 123: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� �� �������� ����� ��� � ��� ���� �������� �� ������������ �� ����� �����4 ����� ��������� �� ������ ����� ������ 7� ��� 6$8� 1�� ��� ����� ���/ ��/ =�����?� ���������� ��� ����9 ��� �� ��� �� �� �� ���� ������ ��������� ��������� ���� �������� �� �� ��� ��/ ��� ����

*������ ��� ��������� ��� 1�� �� ��� �� �� ������ � ������� �� �� ��� ��� �� ���� � � � �� ���� �� ���� ��� ������� �������� �� �� �� ��� �� �� ���� ���� ���������� ����� �� �� ����� ��� �� �� ��� ���

;���� ���� %�� ��� � ������ �� ������� �� �� ���������� �� ���� ��� �� �� �� ������ ��� ��� �� � ��@ ��� ��������������� ���� ��� ����� ������ ����� ����� ��� ������������������ �� �� � ����� �� ������� �� ��� �������� �� ������� ���� ��� � � �� �� ��� � �� � ����� ������� ��������� �� ������� ����� �� ��� ����� �������

�$ ��� 4� � ���� ��� �� � ��� ���� �� ������� �� ���� �� �&��� G ���������� 7� ���� ���� $* ��� 5A84

� (�) ����������� ��������� � �� � ���� ��� &,- �)������ ����� �� �& ���������� �� �� �������� ������ �� ��������� �� ��� � ���� �� ����� ��/� �� ������� �������� �� �������� � �����

� *�) ����������� �& ��� G ��� � � �������� �� �� ������ �� ����������� ���� /���� ��� �� ��� ��� � � ���� ��� ��� ���� �������� ��������� ( � �� ������� ���� /���� ����� ������ � ������ �� �& ���G ���������� � ������ ��� �� ������ ����� ������������� �� ��� ������

��������� �� �� ������ ���� ������ �� ����� � ��������� �� � ������ ���� �� �������� �������� ��������� ����� ����� � �������� �� ������ ���� �� �� ��������� ����� ��� ���� �� ����� � �� � ����� ��� ���� ��� ���� ������� ���� � < ��/ ���� �������� < �� ��� ����� ������� ����� ������ ( ������ ��� ����� ���� �� ���� ������������ ����� ������ � �����'� ���� ��������� �� ��� ��� ���� ���� ;�� 6: ����� �� ������

3&

Page 124: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� $������������ �����������

-������� ��� &� �� � ���� ������ �� �������� �� � ������ ����� �� ��� ����� �� �� ��� ����������� �� �� �� ����� � �� ���� �� �� ������ (�������� ��� ��� � ���� ��� ������������� ����������� �� ���� �� ������ ����� ��� � ���������� ��� ���� ��� ����� ��� � ���� ��� ����� ��������� �� ��� ����� ���� ���� �������� �� �� ����� �� �� ������

=���������� (�� ��� ��� ���� �� ! ��������� �������� �� ������� �� ����� �� ������ )���� �� ��� �� ��� ���� ������ �� �� �������� ���� �� ����� � ������� �����! ���� �� ���� ��� �� ! ��������� ��������� +���� ����� ��� � ��� �� ������ � �������� ����� �� ������ ������� ��� �� ����� ��! ��������� ���������� �� ������� �����

������� ��� ��� ��.�� � � �� �E� ��������� �� �� ����� ���������� ���� �� ��� ��/�� � ����� ���� � ����� �� � ���� �� �� ��� ��/� � � ����������� ���� =&0"? ���=&0�? 7������ ���8�

+������� ��� �������� �� ���� �� � ��� ��� � ����� � � �� ������ ���� � ����� � ����������� ��� ������ �� ���� ��� ���� ������ ���� .��� ��� ��� ����� �������

3(

0�� &)2 ��������� ��� �� ��� � �� 7����������� ��� ���� ���� � ! �� !����� ( ��������� ����� ��� �� �� ! ���

Page 125: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

0���� �������� ��� ����� (� ����� ������� ����� ���� ������� ��� ������ �� � � ������ ��� �������� ���� ���� � &� ����� ���� �������� ����� �������� �� � �������/ �� �� �������� ��/����� (����� � �� � ��� ������ �� ���� ������ �� ��� ����������� ��������� �� �� ���� � �������H���� � �������� � ������ ������ ��� �� ����� ���

����� ��� ����� ��� ���� ��� ������� ��� ����� ��� ����� ���������� �� ������ �� ��������� ���� ���� �� ����� �� ���� ��� �� �� ������ ����� ��� ���� ���/�� ��� ����� �� ������� ���/�� �� ���� ��� ����� ����� ��� ��� ��� ��/ ����� ����� �� ������ ��� ��� ����� �� ��� (�� ��� ����� � �� ����� � ������ ��� � �������� ��������� �� ��� ������1��� ���� ������ ����� ������� ����� �� ��������

��� ����������� ������� ���� ������� ��� �������� ����������,����� ��� ������ ���� ���� ���� � ������ ������ �� �����

�� ���� ��� � ����� ���� ���� �� ��� ���� � ����� ����� ������ �����

����*�3 ����!� � ������� ��� ��� ������������ 1�� � ���� � �� �� ��� ��� �� � ��� ���� ���� ��� ������� ��� �� � ������� �� ������� �������� ��� �� ������������ �� ������� ��� ���� ���� ������ ��� � ��� ����� ���� ����� ��� �� �� ����� ������ %���� ����������� ����� ��/ +� ����>� ����� ��� ��������� ��������� �� � ������������ �� ���� ��� ������ ! �� �� �� �� ���� ��� �������' ������������ ��� ����/�� 1��� �� ��� �� �� ��������� ������ �� ��������� �� ���� ��� �� � ��� �� ��� ��/ � ���� �� �� ������ ������ �� �� ������� ����� �� �� ���� ��� ������������ ������� ��� ���� ���������� ���� ������ ��� ���� ����

����� �������� ��� ������ �� ����� �� �� ������ ������

����*�& * � �� ��� ������������ ����G��� �� �� ���� �������� ������ ���� �� � �� ���� �� ���/� ��� �� ��� ��������� �� �� 1��� 1�� 1�� %�� � �� ���� ��������'����� �� ����� �������� ��� �� ����� ��� ������������ �� ���� ������ �� ������ ��������� � ��� ��� ������� �� �������( ����� ������ � �������� �� �� ����� �� ��� �������� �� �� ��

����� &������������ �� ���� ������� �� � �� �������� �� �� ������� �� ������� ���� ���� ��������� &� �� � ���� �������� ����� �� ���� � ����� �� � � ���� � ���� �� �� ����� �������� � ����/��� ���� ��������� &� �� �� ���� ��� ������� ����

3)

Page 126: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� ���� �������

� ������ ����� ��� ������ ��� �& � �� �������������� ������ ����������������� ������������ ��� �� ��� ������� �� ��� ���� ����� ���������� ������ �� ����� ��� �� � ������� � ��� ���� ��

��� ������ ���� ���� ��������� �� �� �� �� ���������� ������� � � � � � �� �� �� ���� � ��! ���� �� ���� ���������

���'��� �������

%��� ���� �������� ��� � �� �������� �� ��� ��� � /�� �� ������� ���� �/�� &� �� ���� ������� �� �� �� ��� �� �������� ���/ ��� �� ��� ��� ���� � ������&� �������� ��� � �������� �� �� �� �������� �� /� ���/ ��

��� ����� ��� �� ��� ����� �� � �������� %�� �� �������������� �� �� ����� ��� � ������� ���� ���� �������� � ���� �� ���� ��� �� � �����4

� +��� � ������� ��������� ��� ������� �� �� �� �� ��� &���� ���������� ,���� ���������� +������� �� ������ �� G(H�& ���� ������

� ��� ���� ���� ���� �� ��� �������������� ��� �� � ������ �� ����� ���� ����� ������&� �� �� /� ������ �� ��� ��� ���� ��� ������ �������

�� ��� �� �� � ���� ��� ������ � ������4

� ( ���������� 1�/���� ��������

���� � ��/������� ��� �� ������� ����� ������ ������� � ������������ ;�� 65 �������� � �������� ������ �� � ���� ������� ������ &� �� � ��� � ������ ����� � ������ ���������� �� ���� ������������ ��� ���� ����� ���� �� ���������� �� ��/������� �� �������� �� � �������� ��/���� ������������ ���� ������ ��� ������ �� ��� ����� ����������/���� ���� ���� ����� ��������� ��� � �������� ���� �� ��� �� ������ �� �� � ����

����� ��� �� ����� (�� ���� ���/��� �� �� �� �������� ���/ ���� �� ����� G��� ���� � ��� �� �� �������� ���� +��� � ������ ��� �������� � ������� �� � ���� � � �� �� ��� ���� �����

3,

Page 127: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� �������� ��/���� ����� ��� � ����� �� ���� � ������� ���� ��� ������ ������� �� �� ��� �������� ������������ ����� �������� �� ���� ���������&� ���� �� �� ��������� �� ������ ���� � ����� ��

���������� ���� �����

�����'��� ������

����� ����� ��� � �� ��� ���� �� � �� � ����� @��� �������� ��/� �� �� ����� � �� �� ���� �������� �� � �� ���������� ��� �� � �� �� �� �� �� ����� ��� ������ �� �� ���������� � � � ��� �� � ������� ����� +���� ������ �� ��� ������ �� ��� ����� ��� � (������������ �������������� ���� /������� ��� �� �� � �� � ������� ���� �� � ������� ��/ �� � �������������0������ ���� ���/� � � �� �� ����� �� ������� �����

����� ��� �� �� ���� ��� �������� ��� �� ����� ���� ��������� ������ ���� � ������ ���/��� ��� � �������� ���� � � ���� � �� �������� �� ���� ��������� ��� ������������ ���� �� ������ ��������� �� �� ���/ ���� ����;� �� ����� �����! � �� �� ��� �� � ��������'� �� � ����

� ���� < � ����� ���� � � ������� ���� < ��� �� ��������� ��� ���������� ��� ��/�� �� � ���� �� � ���� ���� � ����� ������� �� ���� �� ������ �� ���� ��� �� �E� ��������� �� �������� ��� �� ������ ���/��� ����� �� ��� ��/� � � ������������ ������� �� �� ���� ��� �� �� ���� ������ ������ ��

3/

imageanalysis

2-D Gelfixed on a filmor glass plate

digester

spot picker

gel hotel

spotter

drying ovenrobotic

arm

incubatorrefrigerator

trypsin

MALDI ToF MS

0�� &,2 )�������� ����� �� � ������������/������ ��� ���� ���/�( ��� �������(�� ������ �������� � � 7�2�� ����� � ����

$� ����� �� ���� � ��� ����� �� �������� �� ���� ����������� �� �� ��� ��������<���

Page 128: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� ���� �������

�� ���� ���������� ���� ���� ������ � �� ���� ���/��� ��������� ��� ��� ���� ��� � �� ������ �� ���� ��� ���� ��� ����������� �� �� �������� ����� ; ����� ���� �� ���� ������������� ���� �� ������ ��������� ��� ��������� ������ ����� ���� ������;�� 6B ����� �� ������� �� � ������ ���� ���/ ��/���

�������� ���� ������� �� �� �� ����� ���� � ��! ������������� ����� ���� ����� � ��� �� ���/��� ������ �� ����� ���� � ����� ���� �� ���� �� �� ������ �� �� ����( ���/��� ��� ��� �� � ���� �� ������ �� ���� �������� �� ��

������ ������� ���� ����

�� ���/��� ��� �� ����� ���� � ���������� ��� �� ���� ���� �� ����/��� �� �� ��� ����� ������������������� �� �� �� ��� � � � � �� � ������ ���� �� �� ���/��� ���� � ����� ��������� ��� ��� ������� �� ��� �� �� � ��� �� ���/���� %������ ���� ����� �� � ����� ��� ����� ����� �� � ������ ������� ������� ���� ������������� �� �������+ �� �� ���� ��� ��� ���� � ����� �� � ����� ������ ���

�� �� �� � � � � � �� ����� ���� � ������� &� ���� ��� ������ �� ���� ������ �� ���� �� ���� �� � ���� ��� �� ���

33

pump

picking head

camera and light

IR1 IR2

gel tray

microtiterplateracks

rinsingstation

0�� &/2 )�������� ����� �� � ����������������/��( ����� ���� ��� ����� ������� ��� �������� ���/� ��� �� �������� ��� � � �� �� ���������� � �����

Page 129: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

����� ����� ��������

(� �� ���� �������� ���� � �� �������� ��������� ����� �� ����� �� �� ���� ������� �� � ���� �������/� �������� �� �� ����� ���� ���������� �� �� ���� �������� ���� ���� ���������� � ������� ���� �������� �� ������� �� ����� ������������� ��

���� �������� ! � �� ����� �� ����� �� � ������ �������������� � ���������� ���� ��� ������� �� ������ 7������� ������� ������ � ���� 58� &� �� ������� ���������� �� ���� ���/ ������ ������ �� ����� �� ��������� ��� �� ����� ��� �������� �� �������������� �� ����������� ���� ��� �� � ������ ��� ������ �� � ��� ��� �� ����� ��@��� � �� �� ���������� �� �� )������� � ���� �'� ����� 7H���� � ����###8� ��� ������ ��� ������ �� � �� ��������� ����� ��������� �� �� ������ �� ��� ���������� 7� ������ ��$8�

�99

��!� ,2 ���� ����� ���� ����� ����� � ���������( �� ��� �� ������( � �!� � �� ����� �������������

0�����.; ? ! ������ '����/

0����� ��������.0 @ ��� �& �/

�+�� ���

4���������4

����� ������� ��� . � ���� � ������� � )���&� ������/

-�����7-�� ] -8

CHOC NH

H

$5�#$ $5�#�"6:

(�����7(�� ] (8

CHOC NH

CH3

5"�#B 5"�#*5""

+��7+ ] +8

CHOC NH

CH2OH

B5�#B B5�#*�#* ,������������� 7B#8-�������������

,����7,� ] ,8

CH NOC A5�"� A5�#$�5:

3����73�� ] 38

CHOC NH

CH2CH

2CH

3

AA�"* AA�#:B6"

������7�� ] �8

CHOC NH

CH(OH)CH3

"#"�"" "#"�#65:B ,������������� 7B#8-������������ 7+����/� � ���8

(������ $�<J�� )# ��� �#)���� ># (��� �C# C��� )#'�� 3# %�������<��"� ����������� �� ,�999/2��12�-�

Page 130: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� ���� ������� �9�

0�����.; ? ! ������ '����/

0����� ��������.0 @ ��� �& �/

�+�� ���

4���������4

����� ������� ��� . � ���� � ������� � )���&� ������/

�����7 �� ] 8

CH NH

CH2SH

OC "#*�"$ "#*�##A"A ������������� 7$58������������� 75"8������������� 7"#$8

H ���7H ] H8

CHOC NH

CH2CH(CH

3)2

""*�": ""*�#B6#:

&��� ���7&� ] H8

CHOC NH

CH(CH3)CH

2CH

3

""*�": ""*�#B6#:

(�������7(�� ] �8

CHOC NH

CH2C

O

NH2

""6�"# ""6�#6�A* �����/� �������������

7+! �� (���I�+E��8

(������ ����7(�� ] �8

CHOC NH

CH2C

O

OH

""$�#A ""$�#�:A6 .������������ ����� ��� 7"68

-� �����7-�� ] T8

CHOC NH

CH2CH

2C

O

NH

"�B�"* "�B�#$B$B

H����7H�� ] D8

CHOC NH

(CH2)4NH

2

"�B�"5 "�B�#A6A: (���������� 76�8)���������� 76�8

-� ����� ����7-� ] .8

CHOC NH

CH2CH

2C

O

OH

"�A�": "�A�#6�$A .������������ ����� ��� 7"68

G�������7G� ] G8

CHOC NH

CH2CH

2SCH

3

"*"��# "*"�#6#6A ���������� 7":8

Page 131: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

������� ����� �������� A �������� ,�������� ��� ���� �� � ��� ����� �� ����� ������ ���� �������� ���� � ��� �� �'��� �������� 7� ���� B8� ,��������� ���� ���� �������� ���������9 ���� ���� ���� ������������������ ��� ������� ��� ���� ������ ��������� &������� ��������� ������������ �� ����� �������� ���� � �� �������� � ����� ��� �)� �� �'��4� ����� ����� ����� ��� ����

�9�

0�����.; ? ! ������ '����/

0����� ��������.0 @ ��� �& �/

�+�� ���

4���������4

����� ������� ��� . � ���� � ������� � )���&� ������/

)�������7)�� ] )8

CHOC NH

CH2N

H

N

"*5�"6 "*5�#$BA"

,����������7,� ] ;8

CHOC NH

CH2

"65�"B "65�#:B6"

(�����7(� ] 08

CHOC NH

(CH2)3HN

C NHNH2

"$:�"A "$:�"#"""

������7�� ] O8

CHOC NH

OH

CH2

":*�"B ":*�#:*** ,������������� 7B#8

���������7�� ] 18

CHOC NH

CH2

NH

"B:��" "B:�#5A*" ��������� 7":8

����� +����/� ������������� < � ��� �� � ��� ��� ���/ �� +E��� ���� ���� ������7 $)"#�$8� ����� 7 :)"��:8 ��� $���������������

� G����������� �� ������ ��� ���� ����������� G����������� �� ������ ��� ���� �������� ����� G����������� �� ������ ��� ���� 6������������� $����/� ������������� < � ������������ �� ���/� �� �� (�� ��� � ���� ������ �� �� �� � ������� ��� ���� ��

(��� ����������� �� �� ������� ������� �� � �� ��� ������ (��� ���������� �� �� ������� �� � �� �� ������ � �� ��� ����� ��������� �� �������� �� �� � ������ ��� �� � �����

Page 132: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� ���� �������

��!� /2 �9 ��� ����� ���� � �����������

4��&�� �� ��������� + ��

��� �� ��� + �� 63������ �� � ��

������ ����� � �� 0�I� D�I &� I P , 5<A.����������-� � 73B��.8

����� � �� .�I� ��I &� I P , 6<B

���������� ����� � �� ;�O�1�H�&�3�G &� I P , 5�$<B�$.����������H���

����� � �� ������ D�I &� I P , B�$<B�B

(�� ����� � �� ������� 0�I &� I P , 5�$<B�$.������ ��� �� �������� �������

��� ��-� (� +� 3� H ��� &�B<B�$

,���� ����� � �� ;�H ��� . �<6,���� ,���� �� � ���� ��

���� ��� ������������&� ����� ������ ��� ����������

5<B��������� ����������

�� ��� �� �'��� ��������� �� ���� �������� �� �'�� ��������� ������ ��� ��� ����� ����������� ����� ������ ������ �� ���������� ��' �� ������� G+ �������� ��� ������ �� ����� ��� ��� �� ���� � �� �� ������ ��� �� ������ �� �������� �� ����� � ��������� �� �������� ���� �� �������� �'�� ���� ���������� �� ����������� ����������������� �� ��� � �� �� ��������������� ��������� �� ������� ��� �� ����������������� ��� ����� � ������ ������ ���� �� �������� ��' �� ������� G+ ����������� ������� �������� �� �� � �� ������ ���� ��������� )���

�� ������� ����� ���� �� � ����� ��� �� ������������ ������� ���� ��� ���� �� �������� �� ������ �� ��� ������ ������ �������� �� ����� 7(����� ��� ,������� "AA$8� �� ���������� 7��������8 �� �� ����� �� � ����� 7�� ����� �� ����� ����8 ���� � ��! �� �������� �� �� ����� � ���7(����� � ��� "AB59 ,����� � ��� "AA$8�

( � �� �������� �� �� �������� ��������� ��� ������ ��%���� � � ��� "AAA� &� ���� ����� �� ������ � ������ ��� ��� ����� �� ���������� ������� ���� � � ���� ������� �� ������� �� ������ � ����� ��� ������ ������ ��G(H�& ����� ���� ������������ ���� ��������� �� ��������������� �� �� ����� �� � �������� ����� 7%��' � ��� "AAA9 %����� � � ��� "AAA9 +��� �� )����/��� ��� +� ���� "AAA8�

�9#

A��������� �� ����� ������ ���� ��������� ���� ������������ ������������ �������� "�F"� ������� ��� !�������# � ������ ��0�0�

>������� �# ������ A� ����������� �8 ,�--+/�.-�1�*�2������� A# (����� 5#������� A�# ���� ( #4�� )�� >��� &�� ���� ���7�� *2 ,�-*./ 8-.918-.2K>����� �53# A������#����� �%# 5��� C# ������3C� "����� �� ������ ��������� ��� ��� ,�--+/ �8�1�.0�

)������ C:# �����6 53#4����� �# A��� :# A�� 4#)��6 >�# ����������� �%� ���3�� .�,�---/ 2*9912*9.�

Page 133: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

����� ��� ������ �� ����� �������� ���������� ������� � ��� �� ������ ������ �� ��� ����������� 1������ �����/�� "AA: ��� +�����/� � ��! "AA:�9 ���� �� ������������� �� ������ ��� ������� %� ��� ���� ������ �������� ��� ��������� ���� ����� ������������� �� ���� ����������

�� ����� ���� �� � ������ �� �� ��������� ��������� ������� ���� ��������� ����� ;�������� ��� ��������� �� �� ����� ����� ����� �� ����� ��� � ����� ��� �� �� ��� ���� �� ����������� ���� ���������� �������� �� ���� ���/� ��� �� ��! ���� �������� �� ��������� �� �� ����� ���� �� ����� ����� ��������� ;� �������� ������� %������� %� ����� �� ������� ��� ����� ��� ���������� ����������� �� ����� �������������� �� � ������� ���� �� � �� �� %% ��� �� ����� ��� ��� ������ 7������ ��� ����� ��� �8 ����� �� ������ ����������������� ��� �� ���� �� %% �� �� ����� ����� ��� ����G+ �������� ���� ��������� ��� ���� ������ �� ����� �� ������ ������ � �� �� +�+ ��� �� �������� ���� ����� G+ �������� 7�� ����� ������ ����� �� ���������8��� ���� �� �� ���������� �� ���� ���� ����� ���� �

��� �� �� ������ ����� ��� � ��! �� ��������� �� �� �� ����������� ���� ���� � ����� �� �� �� �� ������ )����+�����/� � ��� "AA:9 ��������� ���� ���� �������� �� �� ������� ��� �� �������� ���� ��� ����� ���� ���� ���������� ��������� ��� � ����� � G+ ��������9 O�� � �� �###9 ���� � ������� � ���� ����� ����� ��������� ���� ���� ����������� ��� �� ���� ���� ��� �� ���� ����� ���� ��� ���� �

���� ���� �� ����� ���� �� -��������� � ��� "AAA�

�9&

C��"# ������<� �#������� $# )��� �# ��������� (# %����� $# "���"�&���� 0.- ,�--8/ 288128-�������<� �# C��"#:���;# "���"� ��� 3��8* ,�--8/ *+91*+*�

.+�" �������� ����������� �� 29Q ����� �� �������� 3)) �������

H�� 5G# C��� A# )�<��� $#���� A�# C������< 5�#C�� C�# ����"5� ����������� �� ,�999/0888108.��

'���������� %# C����� 3A#"���� ��# ���� )�#"���� �"� ����������� �9,�---/ 89�189+���������� # �� ������ 6���F�����6� ����� �� ������������ ���� �������������� ����

Page 134: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� ���� �������

(� ���� ���� ���� ������ ��� ���� �� � ����� ��� ��/�������� �� ������ ��� � �������� ������ �� ����� ����� ���� �� ��� 70������� � ��! "AA�9 G���' � ��! "AA:9 +�����/� ���! "AA:�9 -��� ��� 3���/�/��� �###8� �� ������������������� ��� ����4 � ����� �� �� ��� ����� ����� ��� ��/��������� �� � ��! �� ����� ��� ����� �� �� ������� ���� ��� �� ���� ��� �� ����� �� ������� �� ������ ���������� ������ ������ ����� �� �������� ����� ������ )���� �� ����������� �� � ��� ���� ������� �� �� ����� ��� �� �� ,(-. ������ � �������� ������ +��� ��� ����� "AAB9 ���� ���� �������� �� �� ���� �� ��� ������ ���� �� ������ ��� ����� ���������� ���� �� ��� ���� �������� ���� ��� � �������� ��� ��� ���������� ��� ���� � ������ � ����������� �������� ��� � ��/��� ����� ������������� ����������� �� �������� ��� � ��� �������� �� ������ ���� ������ �������

)���� �� ������������� ����� ������ �� ���� ���/���� �� � ! ��������� � ����� ��� ��/������� ������������ ��� ���� ������ ��� � ��� �� �� ����� �������� +�+�,(-.� &��� ���� �� ���� ��������������� ��� ��� �� ������������ �� ��� ���� ��� �� � ���

�� ����� �������� �� �� ����� ����� ��� � �������� ��� ���� � � ������������ +�� ������ � ��� "AAB9 �������� �� �������� �� ������ ���� "# ����� ��� � ���� ������ ��������� )���� ��� �� ����������� ����� ���� ��$ ���� ��� �� � �� ��� ���� �� �� ������ ���� ��������������� ������� ����� ���� ���� ���� � ���� ��� �������� ���������� �������� ����� �� �� ���������+�� ��@� ������������ ������� ���� ����� �������� ���� ����

����� ����� G+ ������� ��� ���� �

� �������� ��������< + �������'�� /�������< ������� �� ��� �� �� ����� ������ ����������

� �������� �������� �������� �� ������ ��� �� ������������ ��

����� ��� ��������� ����� ��������

�9(

A������ 5# 3����� 5# '������ 53# %����� >� ���)����� �90 ,�--�/ �.01�.-�������<� �# 5��� ;&#>���@��<�� �# �������� %#C��"# :���;# "������ >#������<� �# )������ �#"���"� >��� &�� ���� ���7�� -0 ,�--8/ �2291�22+K"����6 A(# ��� 5�# A�� ' #������� A5� ����������� �.,�--8/ -9.1-�.�'���� 4# :���<��<��� 5� ����������� �� ,�999/��2+1��+2����� �# 3���� )$� ��� 3��.9 ,�--*/ +�+91+�+*

$� � ���� ������ ����������� ���� ��� ���������� �� ���� �� �������������� ��������# � ����������� �� .� ��� $� ������������� �� �� � ���� ��������������� ,� ���� �������� �� +. ��/ ��� 2���� �� �����# � ���� ������� ���9+ �� ���� �������,� ��� ./�

����������C# ���������� ># ������ �# (�����#4���6"# 5��� >� ������������ �- ,�--*/ -9�1-9*�

Page 135: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

� ����� � ��� �� �������� ���� � �� ����� ���� ������� �� �����

� ���� �� ������ � �������� ����� ���������� ������������� ���� ��� ������� � �� �� /��

����

%�� �������� �� �� �'�� �� �� �� �� �� �� �� �� � 7����������� �� ����� �����8 �� ������� ���� � ������ ������� ��������� ��� � ��! �� ��� �� ��� �� �� ����������� �� �� �� � �� � �������� �� � �����/ ������ ���� ���� �������� ���/ �� �� �'�� ��� �� �� �� � �� ������� ( � �������� ��� � �� �� �'�� �� �� �������� � �� 7������� � �� ���� ����� � �) �� �'�� ��������8 �� ������ �� ����� �� ���� �� �� �'�� ��� �� �������� ���� � ��� �� �� �� ����� �������� �� ����� ��� � ������� ��� � ����������� ����� �� ��������� ��� �� �� �������� ���� ��� � ����� �� ��7+�����/� � ��!"AA:8 �� ����� �� ������� � ������� �� �� ������� ������ �� ���� �� ��� �� �� �� � ��� �� �������� ����(������������ �� ������� ��� �� �� �'�� ��� � � ����� ��������� � ������������ ��������� �� �� ����� ������� ���� * ��� �6 �� ��

�� � ����� ������ ������ �� �� � ������ ��� �� �������� �� ����� ����� ����� �� ���� ���� �� ������ � ���� +�+� ��� �#� ����� I�"## � �,�6# �� �� �������� � �� ����� ����� )���� �� ���� �� ����� ��� �������� ��G+ ��������� ���� �� ������������� ��� �������� ���������� ����������� ���������� 7� ������ ��*�"8� &������ ���� ����� ����� ��� � ������� ��� �� �� ����� �� ������ ���� ���� ���������� ��� ������ �������� ����� ��� ����� �� ���� ������� ������� ������������� ������ �� ������ ��� �� � ����� �� �� ���� ����

���� �� � ���� ����� ����� ������� G+ �������� (������� �� ������ ��*�" ��� �� G(H�& ��� .+& G+ � ��������������� �� �� �������� �� ������� �� ��� � ���������� ������� �����! �� ! ���� ������ ����� �������� ���������G(H�& ������� �� �������� �� �� ����� ��� � ���� ����� � ���� ��� ����������������� ���� �� ������ ������ .+& �� � ��! �� ��������� ! ���� �� ����� �� � ����� �� �� ��! �� ����� �� �.+& �� �������� �� ��� ���� �������� �����! � � �� �� ������������������ ��� ����� ���� ���� ������� ��! �� ������������� 7),H 8�

�9)

������<� �# 5���;&#>���@��<�� �# �������� %#C��"# :���;# "������ >#������<� �# )������ �#"���"� >��� &�� ���� ���7�� -0 ,�--8/ �2291�22+�

Page 136: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� ���� �������

����� ������ �� ������ ������ ��� �� � �� � ��� ��� ���� �������� 7M$# �H8 ��� ���� �� ��� ���� �� G(H�& � .+& ���������� �������� �� �� ����� �� ��� �� �� ������ )�� �� �������� �� � ���������� )���� �������� �� �� ������ ������� ���� ������ ������ ������ ��� �� �� ����� ��� ����G+ ���������� ��� � � G+ �������� +����� ����������� ���� ������ �� ��� �������� �� ���� �� ������������ ��� ������ ����� ���������� (���� ����������� �� ����� �� ����� �� ��� �� �� �������������� ��� � ��������� ��� � �� ������� ������ ���� �� �� ����� �� �� �������� ����9 ���� �� ����� ���� ������ �� ���� ���������� ���������(� ������� ������� �� ������ �� ������ � ��� ��� ������

������������ ��� �� �������� ����� �� �� � ��� ���������������� 70,�),H 8 ��� ��� ��� �� G(H�& G+� &� � �� ������ ���� � 0, *## �� C "$ �� ��� ��� �� ������ �� �������� ������ � � �� ���� ��� � �� �������� �� � ������������ � 7�6<$ �H8 �� � ��! �� G(H�& G+ ��������� &� ����������� � ��� �� � �� ���� �� ���� ������� �� ������ � ��� �� .+&G+ ���������( ! ��/ ��� ���� �� ���� G(H�& ��� .+& �������� ��� � �����

�� �� ������� �� ������ ������ �� ����� ��� ��� �� ������� ��� ���/� ���� ������� ����� ���� �� � �������� � ����������� ���� ��� ���� ��� �� ���� ���� �� ��������� � � ���� ���������� �� ����� �� � � ����� ��� � �� �� G(H�& ��������7D ������ � ��� (,,-8� +�������� ���� ������� ��� � ������ �� ������� ��������� � ����� ������ �� -��� � ��� "AAB�

+������� ��� N���� �##"� ������ � ���������� �� ���������� ��� G(H�& �������� ��� ����� �� �� G(H�& ��������������� ����� ����� ������ ��� ������(��������� � ����� ���! �� 7[#�$ �H8 ��� � ������ ������ ���

�� �������� ���� ���� � ������ ��� �� ����� 7��������6���������������� ����8 ��� ������� ���� (�� �� ����� ������� �� ����� ��� �� �������� ������ ��� � �������� ������ ������� ���� #�"L�;( 73�� � ��! "AA69 N��� � ��! "AA:8�

������� ����� �������� A ������ ����� ������ ������ �� ����� ������ � ����������� �� ����������� ��� �� ��� �� �� ��������� ��� � ���� �� �� ������������������� �� �� �'�� �� �������� � ��������� �� ��� ���������� � �� �� ������� ����� ������ �� ����� �� � ������������ &� ���� �������� � ������� ����������� �� �� ������ ����

�9,

!����� ������� �� ������ �� �� ��������� ������ ������ ���� �� ������� ������ ���� �� ������������ �� �� ����������%����� � �� ���# ����� ������ ��� � ��� �� �� �������������# ���������� �� ��������� ���� ������ �� ��"� ��� ���

4�������"# &������� #A���<�&����# ��� �#A����(����"# 5�<���� (#'���� 5# "��������<� � #4�� 4������� �# >�� (#A�������� >� 5 "��� �������0� ,�--./ +-0189�'���� 4# � "��#�< ����� $# ������ $#:���<��<��� 5� ������������ �- ,�--*/ -9-1-�.�

������ �# 5��� ;&�>�������� � ,�99�/ -++1-88�

:���;# A�������� ># "���"���� 3�� 88 ,�--2/0�*�10�*.�5��� ;&# >���@��<�� �#"���"� A���� 3�����"��� ������� �9 ,�--8/�0.�1�0.*�

C�������"># C���� �#H��� 5A� &���� )����� �-,�99�/ �2�1�2.�

Page 137: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

��� ������ �� ��� �������� �� ������ �� �� �������� ��������71��� � � ��! �##"8� ������ ����� ����� ����������� ���������� ��� � ������� ������� ��� ������� +������� ��������� ��� � ����� �� ������ �� ��������� ��� � �� ������ ���� �7������������ ��������*���������8 7%�,+��/����8�(��� ��������� �� ������ ���� � ���� ����� ���� ��� ���� ���

�� ���� �� � �� ������ ������ �� ����� ���� ��� ���� �� ����� ������ �� � ���� ��� �� ������� ��� ����� � ������� ������� �� ������� ��� ��

+ ���� A �� � �� ������ �� ������� ������ �� �����������

��!� 32 ������� ������ ��� ������ � ��0���

�&���� � �� ��� ��� �� ��� + ��

������ ����� ����� � �� G�������(��� ��������� ����� �� ������� ��� �)���������� ����� �� ��������������� �����%�,+��/���� ����� �� ���������

��#4� ����������

(� ��� ����� �� ������� �� ���� � ������� ��� ����� �������������� �� ���������� ����� �� ��� ���� �� ������� ���� ������ �� � ��� ���� ������� �� � ������� ���� ����� �� ���� �� ���� ����� ��������� �� �������������� ������������ ��� ���� �� ����� � �� ��������� ( ������� �� �� ����� �� �� ������ �� ����� ������������� ��� ��������� �������� ��� ����� �� ����� ���� �� ���������� ���� � /��������� .���� �! ����� ��� �� �������� ����� �� ����� �������������� �� �� ������9 ��������� �� ������������ �� �� ��������� ����� ���� �� � ����� � ����� ���� �� � ��! �� �������� �� �������� ��� � ���� ��� ��� ���� ��� ������ � ����� ����� ���� ��� �� �� ����� �! ��� �� ������ ������ �� ����� �������� ����� ����� � ������� �� ),H � ������ ������ ���� �� � ��� �� �������� �� ����� �� �����E����� �! ��� ��� �� .���� ��� �� ���� ��������� � ����� �� � ��� ����� �������������� �� ����� �� ������� ����7�� � ��� ������ � ���8 ��� ������� ��������� 7 �� ���� <��� ���� ��� ���8 7,����� � ��� "AA$8� &� �� ����� �� � �� ����������� �� ������������ �� �������� � �� �� �������������� ������

�9/

(� �# ����� A3#������� ( # "��� �>#'�����< �5 ��� %���� A5���� 3�� .0 ,�99�/+0-+1+29��

>����� �53# A������#����� �%# )�����5���"#5��� C# )��� �5�"������������ �� �� ��������������� ,�--8/ �0+1�+9�

Page 138: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��0 "��� ���������

���� � � �� ��� ������ �� ����� ���� ���� �������� ��� ��� ����� ���������������� ����� ����� �� �� ���� ���������� ���� �������� ����

��! �� ����� ������� ��� �������� ���������� 7G(H�&8 ��� ��������� ���������� 7.+&8 ���� �������� �� �� ��� ������ ������� �� �� �� ������ + ��! �� ����� ��� ������ ���������� ��� ����� �� � ������ ��! ������� �� ���� ���� �������������� ��� ���� ��� ��� �� � �� �� ��� ������� ����� ����� ����� � �������� �� ������ ��������� �� ����� �� ������������ ���� �� �� ������� ���� ��� ��������� G+ �� ��� ��� ����� �� ����� ��������������

������G��� �������� �� �� ���������� �����! ���� ��� � �� ����� �� ����� �� ���� �� ���� ��� �� ������ �� � ����� ������� �� �� ����� � ������� ����� �� ����� ���� �� � ������� ���� ���� �� �� ��� ���� ��� ������ �������� �� ������� 4 ���� ���� 7�./8� ,������ ��� �������� ����� ���� ��� ������ ���� �����! �� ����� �� � ���� ��������G��� �������� ����� ������������� ��� �� ����������� ��

�����! � � �� �� �G0� -����� G+ ��� � �� �� ��� ���������� �� �������������4 �� ��� � �� �� ������� �� ����������� �� ������ �� ������ ��� ������� �� �� �� �� � ����� �� ��������� ���� ������� �� �� ����� �� �� ���� ��� ���� � �� G+���� �� �� ��� �� ���� �� �� ������ �� ��� � ��� �������� �� ��������� �� �� ����������� �� �� ������� ;� ����������� ���� ����������� ������ �� ���� �� ��� �� �� ������������ �� �� ���� � �� � ������� ����� &� �� ������������ �� ���� ������� �� �� �� G+EG+ ��� �� �������� �� �� ���������� ������ �� �� ������� &� ���� ���� �� ������ �� ������ �� ������ ��� �� ������ ������� ������ ������ ������� �� ���� �� �� �� ����������� ���� ����� �������� �� �� ���������� �� ����� ���� � �� �� ��� ������ �! �� 7� ������ ��*�*8�&� �� ���� �� ����� ������������� ��� ��������� � ���� ����

���� �� @ ��� ��� ����������� ���� ��� ��� ��� ����� ������������� �� ��� �� ������ �� ����������� �������� ������ �� � �� ����������� �� ����� ����� ���� ����������� ������� �� ������ ��*�*� �� ��� ��� �� ���� ��� ���� ���������� ����� �� ����� &�� �� ������ ���� �� ��� �����(���� ����� ������� �� �� ����� ������ ������� ������

��� ������ ��� �� � ��� � ��� � .��� �� ��� ����� �������� ���� �� � ���� �� �������� ;� �������� ����� ����� �� ����� �� �� "� ������ 7AB�AL8 ��� �� "* ������ 7"�"L8� (�� �� �� �� ����� �� �� ��� ������� �� � ���� ����� �� ���� �

�93

Page 139: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

����� �� � ���� ���� � �� �� ������ ����� �� �� ������ ����� � ��� ���� �� ���� ��� ��� �� � ���� ����� ��

� (��� ����� �� ��� ��� ����� ����� �� ������ ����� �� �� ������� �� �� �������� ������ �� ���� ������ ��/� �� �� ������ �� �� �������� ������

� G����������� ����� �� ���� �� �� ���� ��/ �� � ������������� ������ 1��� ���� �� ������ ���� �� ��� ��"� ��/�

;�� 6A ��� ����� �� ������ ������ ������ ���� �� �� ������ )HD�.(.GD �� ��� ���� $### 7;1)G8��� ���� � ����� ��������� ���� ���� � ������� ��� ����

�� "� ��� "* ������� � ����� ������ (� � � �� �� ������������� ����� "� ��/� ��� � ����� �������� �� ����� ��/ �� ������� ����� ���� �� �� �� ����� ����� �� �� ����� �� �"* ����� �� ���� ��/ ����� ���� ��� �� �� ����� ����� ���� ����� � � "* ����� ��� �� ��� �� ���� ������ ������ ���� ��� ������������ ����� �� #�5* ��� ���� �� � ����������������� ����� ��� � ���������� �� �� ����� ���� �������������

��9

C

C

C 2×

12

13

13

0�� &32 $�������� ������� ������!���� �� ���������� 82F����7F �� ���� ���� -4445"B876�

$��� �� ���� �� �� ���������� �������� � �03 ���� ����� ������

Page 140: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��0 "��� ���������

)���� �� "� ������������ ��/ �� ��� ������ �� ���� �� ������ ��/ �� �� ������ ������ (� �� ���� �� � ���� ����� ��������� �� ������ ���� �� �� "* ������ ������ 7� ��� $#8� (� � ����� �� ���� �� ������������ "� ��/ �� �� ���� ������� �� ���� ����� �� ���� ���� �� ���� �� �� ���� ������ ��� ���� �� �� ��� ��� �� �� �������

1��� ���� �� ������ �� ������������ ���� ��� ���� � ���� � �� �� "� ��� "* ������� �� �� ����� ����� � � ���������� ����� ��� �� �� "� ��/ �� �� ����� �� ��� ���� ������ &��� ��� ���� �� � ������� �� ����� ������ � � ��������� ���� ������������ ��/ ��� ���� ��� ��� �� ������� 0� ���������� ����� ������������ ���� �� ������ ������ �� �� ������������������ �� ���� ���������( ���� ������� ��� � �������� ����� ���� �� ������� ��

����9 �� �� �� ��� ��� ������ �� ��� �� �9 �� �� �� ��� ���������� �� ������ ��� �� �� �� ��� �������� �� ����� 7���� $"8�

���

0�� (92 ��� ��������� ���� 0�� �������� �0�� ��� ��� ��� �� ���� ��� ��� ���/ �� � ��� � ��� ��� ���� �!���� ���/ � ��� �0� ������� 0������ �3� �����!����� ��0� !����� ������� �!���� ���/��

��� ��� ��� �� � ������������� �� �����

Page 141: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

��3��$�� ����

�� ��� �� � �� �� ���� �� �� ���� ������� �� �� ������� ���� � ��� �� ��� ����� ���� ��� �� �� �� ��� ���� ������ �� ����� �� ��� ��� ����� �� ��� �� ���������� ������! � +��� ���������� �����! � ��� �� ������� �� ���������������� ���� � ����� ������ ��� ������� ���������� ������ �� � �� �������� ����� ���� �� ����� ���� ��� � � ������������ �� ��� 7���8���� ��� �� ���� ����� �� ����������� ������� �� ��� ���� �� G��;���� ��� ������ ��"A5: ���� �� �����! ������ ��������� �� ����� ����� �� �������� ��������� �� "AB" 7%�� � ��� "AB"8 ��� ������� �������� �������� ������� �� ���������� ��� ������� �� � ����� ������ ������� �� ���� ������� ���� ����������� �� ;(% �� ���� �� ��� ���� ������� ���� ������� ������� �������� ��������� ���� ������� ���� ���������� �� � �� ��� ���� ���� ���� ���� ��� G+EG+ ���������� �� �� ���� ����)���� ;(% ��� � ������� �� ��� ���������� �����! � ����

��� �� �� ��� ������� D��� ��� )����/��� ����� �� ������������ ��� �������� ���������� 7G(H�&8 �� "ABB �� � �����! ���� �� �� ����� ����� 7���8 ������� �� �� � �� ������� ����� G(H�& �� � � ��� ���������� �����! ����� ������ �� ������ � ��� �� ���� ��� ����� �� ������ ���� �� �� �� ����� �� � ����� �������� ������ (� ���� �� � � ��� ���������� ������! � ������� ���/�� �� ���� ���� ��� ��� � ��� � � ��� ������� �� ��������� ! �� �� �������� ��� ��� ���� �� �� ����� ���! ����� G(H�& �� � ����� �� ��� ���� � ������ ������ ������� 7��;8� &� ����� ��/��� ��� ;�� ��� �����/� ���������� ���� �������� ���������� �� �� ���� ����� ��� �������� �� ���� ���� ����������� .�������� �� ��������� �� ��� �� ������� ! �� ���� ��� ��� �������� 7& 08 �������� ��� ��� ����������� �����! � ���� �� �����! � �� ����� �� ����� ��� ������ �����������

���

Ion production Ion separation Ion detection

MALDIElectrospray

Time-of flight (ToF)Triple quadrupoleIon trapHybrid ToFFT-ICR

0�� (�2 � ��������� ������� ��� ���������� �� � ���� �������������

"�%���� A# $��������%������ �-� ,�-.8/ -�91-�+�)����"# )����� A�#������< A�# $ � �&� &�����-0 ,�-*�/ �.91�.��

4����" ���<��� %� ���3�� 89 ,�-**/ ��--1�09��%�� 5)# "���"# "�� 34#C��� �4# C������� 3������ �28 ,�-*-/ 821.��

Page 142: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��0 "��� ���������

��3���� 4���� - ��� >� �� �� ������ $�� ���� 74->�$8 ������ G(H�& ���� � ���� �� ������ �� ������ ���� ������� ������ ���� � ����� ������ ����� �� �� �������� �� ������ �� ������ �� ������ ����� ��������� ���� �� ������������ �� �� ����� ��� �� ��� ������� ���� � ���� �� ��� �� ��� �� �������� ��� ���������� �� �� ����� ��� ������� ��� ������������ � ����������� 7��������� ����� ����8 � �� ������������ 7�������� ����� ����8 7��� $�8� �� ���� � ��� �������� ���� �� G+ ������ 7� ������ ��*��8�

�� ������� �������� �� �� �3 ���� ������ �� **5 ��� ������ ��������� �� �������� ��� ���������� �� ����� �����-������ ��������� �� �� ������������ ����� �� �� � ����������� �� ������������ ����� ��� @����� �� � �� � �� ����� ��� ������� ���� ���� �� ��� ����� G(H�& ���� � ����� �� ������� � 7$C"#<:8� ,��/�� �� ���� � ����� ���� ��� ��� � ����� ��� ���/� �� � ��� ���� �� ������� (� G(H�& �� � � ������������� �����! � ����� �� ������ �� ��� ���� � ��; ������7� ������ ��*���"8�

( ��� ��� �� ������ �� �������� �������� ��������������� �� ������ �� � ���� �3 ���� 7� ���� "#8� �� ������� �� ������ �� ������ ��� ������ � ��������6��������������� ����� ��$�����������'��� ���� 7��$��)%8 ��� �������������� %���� ��� ���� ���� �� � �� �������� 6 ������ ��������� ���� �� ������ ��� �� �� ����� ����� �� ����� �������� �������������� ��� �������� ����� ��� �����! G��� ������ ���� �� �� �� ����� �������� �� ������� ����� ;�� $* ����� �

��#

-10 kV

3 ns laser pulse337 nm

matrix moleculesabsorb laser light

0�� (�2 )�������� �� ��� 7�2�� ��������

$����� �� ����������� �� "�(�� ����������� �� ��������� ������� ,(����� � ��# �999/ ����� ���������� ������ ,(��<�� ��# �999/ ������ �� ���(����� �# 4��������< �#)������<�"# ��C#�������� 4'� A���� 3�����"��� ������� �2 ,�999/�92.1�9+.�(��<� ::# )�����"�#)������� �(� ��� 3�� .�,�999/ 8+�18+.�

Page 143: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

G(H�&���; ���� � �� � %+( ������ ����� ��! �� ���� ��������6������� �������� �������$�����������'��� ���� �)% ��� ������ �� +� ��� � ���

"AA"� ; �� ������������ ���� � ������� �� ���� ���� �� ����������� ��� �� �������� �� �������������� ���� ��� ������������ 7G��/ � ��� "AA"9 +���� � ��� "AA"9 )��� "AA*8�

� 4��"* ������� ������� ��' ���' �& �������

��!� �92 ����� 7�2�� �������� ���� � !�� ���� ��� ��������

4 ���3 4 ���3 �������� ������ ���

��������6���������������� ����

OH

CH

CN

COOH �3 ���,���� �������� ],���� �������(������ [ "# /��

+�������� ����76��������*�$���������������������8

CH

OMeCH3O

OH

COOH(������� �� ��� ����������� ] ������M "# /��

��$�����������'������� 7��$ �)%8

COOH

OH

OH

�3 ���,���� ������ ],����� ��������������� ���� ���-����������

��6�:������������������� 7�)(,8

CH3O

OH

OH

OH

�3 ��������� �������[ * /��

*������� ��������� ����

NCOOH

OH �3 ��������� �������M */��

��&

������� 4# 4����"# ���<���� %� ��� 5 "��� ���������� >��� ��� ,�--�/ *-1�9��"��< 44# ��� "# 3���� 5��)����� )���� � A� 3������.. ,�--�/ 82218+������ )# ����"# 4����"#���<��� %� ��� 3�� 80,�--�/ �2801�288����� �5� A���� 3�����"��� ������� . ,�--0/8�218�-�

)���� A3# 3������� $#3���� )$� ;�� "��� ��������. ,�--�/ �+81�+*�

)���� A3# 3���� )$� A����3����� "��� ������� 0,�-*-/ 20�120+�

������� 4# 4����"# ���<���� %� ��� 5 "��� ���������� >��� ��� ,�--�/ *-1�9��

>�� 7# ?������C# �����"#"��� � � &���� ����� A��� ,�--0/ 0�-�10�-8�

Page 144: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��0 "��� ���������

��3���� ������� ���� �� ���� 7�'$8;�� ��� �����/� ������ �� � �� �������� �� ����������� ������� �� �� "ABA�

������ .+& ���� � ��� �� �� ��������� ��� �� ������������� �������� �� ������ �� � ���� �������� � �� ����� �� ���� ���� �� �� �� ����� ����� ( �������� ������ �� ���� ����� �� �������� ��� �� ���� �� �� ���� ������� �������� ��� ������� �� ��! �� �� ��� � ��� ��� �� �������� ������� ����� � ��� ���� �� ������ ���� �� 7����� ���� ������"A:68� �� ��� �� ���� �� � � �� �� � ���� �� ������ �������� �� ��/ ������ + ��! ����� ��������� �� �� ������� �� ����� ��' ������ �� ���� �� �� ����� ����� ���������� .��� ����� �� � ��� �� ������ ���� ��� �� � ��� ������� ��� �� ������ ������� ���� ����� ������ 7�� 0�����������8� ���� ����� ������ � ���� ������ ��'� ������ � ���� �� 7��� $68��� ����� � ������������� ������ �� �� �� ������>� ��������

���� ����� ������� �� �������� �� � ������ ����� ����� .���� ������ ����� ��� ��� � ��� � ���� ����� ��� � ������ ������ ���� ����� �� ����������� �� ��� �������� �� � ��� .+&���������

��(

0�� (#2 7�2�� � ������0� �� ������� ��� �� ��� �� � �� ���� ����� ��� � �!�� ��� �������� ��� ��@�������� ��� ���&�� ���� ������ ������ ��� ������� ���� �� ��� �������

��� � �!���0�� � ��� ���� ��� �F6,44'�-44 ����� �� ��� G7H8IH

�� ��� �� ��( ����� 7 �� ��� ���� ����� �������� � 7�2�����" �������� ��� 1)� �� ���� ������

$� �� '� >��� A� ��� (�����*9 ,�-82/ 0*010-.�

Page 145: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

� 6 * ������� ������� ��' �������'�& ���� ��

���� ��! �� ������� ������ ��� �� .+& 7�� ������ �� ����������� ���� ��� �� �� G(H�&8� ����� �� �������� � �� ������ �� ������ �� ������ +������ �� ������� ���� ��� �� ����� ������ ����������� ��������� �� �� �������� �� ��� ���� ������� �������� ����� ���� ������� ,����� ���� � ����� ������ �� � �� �� ���� ���� �� ����� ��� � ����� �� �� �������

��)

conductive fluid

liquid cone

atmospheric pressure vacuum

Taylorcone

0�� (&2 )�������� �� �)��

400

mAUTest mix:

Monoclonal antibody: 0.54 mg/mlβ-lactoglobulin: 0.90 mg/mlSample volume: 20 µl

5.0 10.0 15.0 20.0 Time (min)2 3 4 5 6 78 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 2827 29 30 31 32 3334 353637 38 39 40 41 42 43 44 45 46

350

300

250

200

150

145000140000 150000 155000 160000

2000 2200 2400 2600 2800 3000 m/z

Mass

76+

75+

74+

73+

72+

71+

70+

69+

68+

67+

66+

65+

64+ 63

+ 62+

61+

60+

59+

58+

57+

56+

55+

54+

53+

52+

51+

50+

49+

48+

140000 145000 150000 155000 160000

2200 2400 2600 2800 3000 m/z

Mass

71+

72+

70+ 69+

68+ 67

+66

+ 65+

64+ 63

+62

+61

+60

+59

+58

+57

+56

+

55+

54+

53+

52+

51+

50+

49+

48+

Monoclonalantibody variant I

Monoclonalantibody variant II

150073150132

0�� ((2 �������������� �� ��� ������ �� �� ��� ������ ��@����� ������� ���� �)���"� ;���� ��� ' �������� �� ������ ����� ����0� ����D

���� ��� ' �� ��� ��������������� ���� ��� ��!�� �� ����������� �!���0�� ��� ���� �-4/�� �������

&�� �� ���� ���� ��� ������� �� ������ ,6 ��� ���F6/ �� �� ������ �� ������������� ���� �� <���� ���� ���������# ��� ������� <������ �� �� ����� ����# ���� ���� �� �� ��� ������� ��<�����

Page 146: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��0 "��� ���������

�� ���� ��������� ;�� $$ ��������� �� � ������ ��������� "$# D�� ������ -������ ���� ���� �� ������ �� ��� ������ ��� � ������ ����� ��� �� ��� ������� �� ����� �� � ���� ����� �� ��� �������� ��� ����� ��� � ������ ��� � ����� ����� �� ����� �� �� ���� ��� �� �� � ������ ��������� �� �� ����� � �� �� � ������� ���� �������� �� ��� ����� �� ���� �� �� ���� ����� 7��� ����8� � �� �� ���������� �� � ����� ���� ����� ��� � ��� � �� �� ������� �� ������ 7�� � ���� ����8� �� ���� ��� ��� ������ �� �� ������ �� ������ �� �����;� ����� ������� �� � �� �� ������� �� ���� ���� �� ��� ����

��� ����� ��� ��� � ����� ������ �� �� ��� ���� �� � ��������(� ������ ������ ��� �� ��� � �� ��� � ����� ����� ���� ������ ���� ��� � ����� � ����� 7� ��� $:8� �� ���� ������� ���� �� ��@���� "� ��� "* ������ �� ��������� �� �� ��������� ;� � ������ ����� ��� �� ���� ������ ���� �� "� ���"* ������� �� � ����� �������� ����� ���� � " ��� &� �� ��� �� ��� ��� ����� ����� ��� 7�E' P �E�8 �� ���� ������ ������ "� ��� "* ������� ���� � #�$ ��� �� � ����� ����� ����� 7�E'P �E*8 �� ���� ������ ���� �� "� ��� "* ���� � #�** ����� �� ��� 1��� �� /������ �� �� ���� ���� �� � ���� ���� ����� ��� � ������� &� �� ��� �� �� ����� ��� �� ��� $$� �� ���� ����� � #�** �� ���� ���������� ���� �� ����� ������� ������ ����� ���� �� /������ �� �� ���� �� �� ������� �� �� ����� �� ���� �� �� ����� �� ����� �������&� ���� ������ �� ���� �� ����� ����� "� ��� ��� ��� �

�� $$B�*"� �� 7���� �� ����� Q * 7* �������� ������8E*89 � ������� ��� �� ��$�

��,

0�� ()2 �������������� �� ��� ����� ���� ���� ��������A ���� ������ �������������� ��@����� ���� ��� ���� �)����"�

Page 147: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� �������� ���������� �����! �� ����� �� ��� ���� ��������� �����! �� ���������� ),H ��� �������� �����������.��������� �� ��� ���� H � ���� ����� ���� ��� ��������� ��� �� ���������� ���� �� �������� � ��� �� �������� ���� �� ��� � ��������� �� ����� �������������� ����� ����� �� �� �������� ��� �� �� ! ��/ ���� ��� �� ����� ���� ����� �� �� � ���� ��� �� �� ���� )�� �� �� ��� ������� ��� ������ ��� �� ������ ����������� 7�� ����� � ����� G+EG+ �����8� � ����� �� ����� �� ����� �� ����� ������� &� ����� ������ � ������ �� .+& ��� ��� � ����9 � ���������� ���� ��� �� ������ � � ��� ���� �������� ����������� �������� ���������� 7.���� ��� ������� "AA68 1��� ��� G��� ������ � �� � �������� ���������� �� �� �������� ����� � ������� � � ��� ����� 71��� ��� G���� "AA:8 ���� ������ ������� �� ��������� ����� ���� ��� �� �� �� �� ��� �� �������� ���� � 7��������� �$<6# �HE���8� �� ������� �� ������ ��� � ����� �� ����� ��� 7� � "# �� ��� �����8� ; ����� ���������� �� �� ���� �������� ���� ����� ������� � ������������ �� � ������ ������ ���������� �� ���� ��������

� "6�4��"*�#A8 � ��������� ' & +� �� ������� ������ *" ���&���

��3��$�� ��������

(�� �� ��� ���� ���� ��� �� ��� ��� ��� � ���������� �� ��� �� � ��� � ��� ���� �� ������� �� ���� �� ������������ ) �� ���� � ������ �������� �� ��� ���� ������ ���� 7�./8� G��� ���� �� ������ ���� ��� ���� �������� �� �� ������� ������������ � ����� ������ �����

��3���� ����������� ����� ��������������� 7��;8 ������� � �� �� �� ������� G+ ������� �� � ������ &��� ��� �� �� �� ��� �� � � ������� �� ���������� ���� �� ��; ������� ��! ���� �� ������� ������� ���� �� ������� �� ��� ����� �� ������ ������ � ���� ���������� ������������� �� ������� ���� ���9 �� �������� ����� �� ������� �� �� ������� �������� �� �� ���� ������ �� �� �������� ������ �� � � ��� ������ ��� � ����� �� ��� ���� G(H�&�

��/

���� "A# 3������ A"� 5�� ��� "��� ������� +,�--2/ 89+18�0�C��"# "���"� ��� 3��8* ,�--8/ �1*�

Page 148: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��0 "��� ���������

������ G��� ��� ��� �� ���� �� �� ��� �� ������ �� ����� �� �� ��; ������ � �� �� ������������� �� �� ��� �� ������������ �� �! � ��� �� ��� ����E���� ����� ���� � �������� ���������� �������

��� �� ������� 0�����������/

�� ��� �� ������ �� �� ��� �� ��������� ��� � �� �� ��� ����/� �� ���� �� ������ � � �� �� ����� � � ��� ��� ����� ���� �� �� ���� ������� ����� �� � ���� ��; ������� �� ��� ��� ��

������� ���� �� ������ ���� 7�� ������ � �8 ��� ����������� �������� ������� �� ��! �� �� �� ��������� ���� �� ���� �������� 1��� ���� �� ��� ���� ��� ��� ���� ��� ���� �� �������� �� � ���� ��; ������ �� ���� �� �� �������� ���������������� �� ��� �� � ��� �� �� ����� �� �� ������ � �� (� ���������� �� G(H�& �� �� ������� /����� ��� ������ ���� ���� �� ������ ������ �� �� � �� ���� �� �� ��� �����

��� �� �� ���� ��; ������� � �� � �� ��� ������� �������������� �� ��� ���� �� ������ �� �� ��� �� ����� 7;1)G�"##<$##8� ��� � ��! �� ���� ��� ���� ������� ���� ���� ������� �� ���� ( ���� ��; ���� ��� �� �������� �� ������� �� "� ��� "* ������� �� �� ����� �������� ����� ����� �� ��� ���� ����� ������ 5##<*$## ��� (� �� ������� ������� ������ ������ ����� �������� ���� ���� �� ����� �� �� /����� ��� ������ ����� ���� ����� �� �� ���� ������� ������ �� �� � �� ��/�������� ��� ����� ��� ���� ��� ���� ��� ��� 7��� $58�1��� �� �������� ��' �� �� ����� ��������� �� ��� �������

���� ��� �������� �� �� � ! �� �� ���� ��� ���������������� ���� ����� ���� ������������ &����� ��� ������ �� ���� �� ����� �������� ����� �� � ����� ����������� �� ���� ��� ��� �� �� ������������� "� ������� ������� �� ���� ���� �� �� ������ &��� ��� ��� ���� ��� ������� �� ������� �� ������ � � �� �� ������ 7� � ��� ������� ���� �� ��/ ���� �� �� ������ � � ����� �� ������ ������������8� ��� �� �������� ��� � ��� � ��� ��� �� ��������� ��� � ��� � ���

�� $����������� �� � ���������� ��� ��� ����� ��!� 74����B �99�8�

( ������ ���� �� �� ��� ��� ����� �� ��@���� �� �� �������/ ���� �� ������ � �� �������� �������� �� ����� �� �������� � �� ; ���� �� ������ ����������� �� �� �������

��3

$���# �� ���� �� ������ ����� �� �� ���� ��������� �� �� ����� ��� ���� �������

$� ���� �� ����� ��� ������ �� ������������� �� �� ��� ���� ������� �� ������� ���� ������� �� ��� ����� ��� ��� ������� ������� ��������� �� ����� �� �����#��� �� � ������� ������ ����� ���� ����� �������<����� ����� ���� �� ���������

4 S T ���

>����� ������� ����� ��������� �� � ������� �� ����������� �� ��������

"�� ��� )�� ��� 5 "��� �������� �98 ,�99�/ �+�1�88�

Page 149: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

/����� ��� ���� �� ���� �� �� ��� ���� ����� �� ���� �� &��� �� �� ��� ���� ���� �� �� �� � ��� ��� ������� /����� ���� ��� ��� ��� �� �� � ������� ������ �������� �� �� �� � ��� �� ��������� ������ ���������� ���� � ��� �� ��� ���� �� �� ��� ���� ������ �� ������� ��� �� �������� ��� ����� ���� �� �� ��� ����� �� ����� � ���� �� ����� ����� �� � � ���� ��� ���� ��� ������� ���� �� ������ ��� ���������� ��� ����� ������� ��/����� ���9 �� ���� ���� �������� ���� /����� ��� ���� � ��� ���� �� ������ ���� �� ���� ���� �������� ��� ����0� �������� �� ���� �� �� ��� ���� � ��� ��� ��� �� �� �������� ����� �������� ��� ���� ��� � ��! ���� ���� ��� ����� 0��� ���� ������� ���� � ������ ���� ��� ��� ���$### 7;1)G8 7��� $58�( � �� �� ������ ������ � �������� �� �� ��������

���� ��������9 ���� ���� ����������� ���� ���� ��������� � �� ���� ������ 7 ����� ��� ���� "AA68 ��� �� �������� � ! ������ ���� ������ �� (����� � ��� "AAB� &� � ! ������� ���� �� �������� ������ �� ������� ����������� �� ��� ����� ! ������ ����� (� ���� �� ��� ������ ������ �� /������ ��� ������� ���� �� � ��� ��� ��� � �� �� ����� ������� ���� ����� �� ���� ��� ���� ��� ������ ���� ��� ����+ �� � ����� ��� ����������� ��������� �� ������� ������� ������ � �����! �� �� ����� ����� �! �� 7� ��������*�*�$8�

�� ��� ����� �� ���������+������� ��� ���� ��� � � �� ������ �� ������� �� ��������� �� �� ���� 7� ���� ���� ��� ��������8 ��� �� �� � �� ����� ���� �� ���� 1��� ��� G�H��� "A$* ���� � �� � ������� ��� ��� ��� ����� ��� ���� �� ������ ��� ����� ���� ��������� �� %��� ��� H����� 3���� � ���� 1������ ��� H� �� "AA$��� ������ �� G(H�&� ��� ����� ���� �� ������� �� ���������� ���� ��� �� �� � �� ���� � ������ �� ���� � � ����� ��������� ������ ��� ������ ���� ������ �� �� ��������� �������� �� ���� � �� ���� ��� �� ����� ���� ���� �� ��������� ����� ����� ����� ��� �� ����� ���� �� � ��� �� ���� ���� ������ � �� ���� ��� �� ����� ���� ���� � �� ��� �������� ���� ���� �� ���� ����� �� �� ��� � ��� ���������� �� ������������� ����� ����� � ������� ����� ���� ��� � � �� � ���� �������� ���� �� ��������� ���� ����� ��� ���� ����� � �� � �������� ������� 0� �������� �� ���� �������� � � �� ����� ���/� �� ���� ���� �� ������ ������������� ���� ��� ���� ��� ��� ���� ��� ���� 7��� $58� ���� ���� ��� �������� �� ��� ���� � ��������� ����� ��� ���� "#�### ��� ���� 7;1)G8 7��� $B8�

��9

3������ $5# 3���� A5� A����3����� "��� ������� *,�--2/ .*�1.*+�������� 7&# 3����� �C#"�<���� ��# A����<�� &#A ���� �5# �����< >5# ������3# ������� �� # $������ ��A� ��� ������� 8- ,�--*/�8+91�889�

C� C3 # "�(��� ��� A���� �������� �8 ,�-++/��+91��+.�)���� A# (���� 55� ���3��� 8. ,�--+/ �--*1�990�:��� "(# 5����6 ># "�������� A���� 3����� "���������� - ,�--+/�9221�9+9�C����� A"# (� (� ��� 3��8. ,�--+/ �-+91�-+2�

Page 150: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��0 "��� ���������

(���� �� � ��; ������ �� �������� �� ��� ���� � � ���G(H�& �� � �� ��� ����� �� ������� ���� ��������� ��.+&���; ���� ��� 7%��� ��� 1����� �� "AA�9 G������/��� ���� "AA69 3�����/�� � ��� "AA68�

���

MALDI ToFLinear MALDI ToF

Reflectron MALDI ToF

DE Reflectron MALDI ToF

Large kinetic energy spread, broad peaks

poor resolution (unresolved isotopes)

Reduced kinetic energy spread greater resolution greater mass accuracy

Reduced kinetic energy spread greater resolution greater mass accuracy

m/z

m/z

m/z

0�� (,2 )�������� ���������� ��� �������� � ��� ����� �� ����� �� � �� ���������� ���/ ����� �� ���� ���� ���� �� ����������� �

0�� (/2 )������� ���������� ��� ����� ���� ����! � ���� � 7�2�����" �@���������� � ��� ����� �� ����� �� � �� ����������� :��� ���� J��444 �� 3*-#�C��5����8 � �� #'3,6�

)� 5'# C������� 3"� ���3�� 82 ,�--�/ �9*21�9*-�"��������<� �;�#������<� ��#3���������� :# ������� �%#"�������<�� ��� ��� 3��� 88,�--2/ --1�9.�:������<��&# ��C#�������� 4'� ��� 3�� 88,�--2/ ��81�00�

Page 151: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

��3���� ����� 1��������� ����� ���� ! �� ��� ������ �������� �� �� ������ �������� ������� �� ����� �� ��� ���� ���� ��� �� ����� � ����� ��@������� ������ �� ����� �� �� ����������� �� � ������ 7��8 ��� ������������� ������ 7���� �! ���� �8 �� �� ��� �� ��� ��� � ������ �� ������� ������� ��� � ������ �� ������ ���� �� ��������� ��� �� ���� �� ��������� ����� ���� ���� �� ����������� ��������� �� ������� ����� �� ���� ���� ��� �� �� �������� �� ���� ��� ���� �� ������� ������� ������ �� �� ��� ��������� �E' ��� � � ������ �� ���� ��� �� �� ��� ��� ��� �������� �� ������� � ������ �� ����� � ��� ���� ��� �� �������( ����� ! �� ��� ������ ��� �������� ������ �� �������

��������� � � �� �� ! �� ���� � ����� �� �! ��� �� � ���! �� ���� ! �� ��� ������ �� ��� ���� .+& ��� �� ���������� �� � �� �� � �� �������� 7��� )��� � ��� �##"8���� ������ ����� �� ������ ��� ����� �� �� ����� �� �� ������������ �� ����� ���� �������� 7� ������ ��*�*8� )�� ���� ��� ���� ! �� ���� ���� �� �� ���� ����� ����������� ���� �� ����� ! �� ��� ������� �� � ��������� ��� 7���� �� �� �� ���������� �� ��� ��8� �� ������ ��� � ������� �� ���������� �� ����G+EG+������� 7� ��*�*�"<*8����� ������ ����� ��� ����� �� ����/� �� ������� ������

������� �� �� ����� ! �� ��� ��; ���� ���� &� ���� ������ ������ �� ���� �������� ! �� ��� �� ����� ���� � ������������������ ��; ������� ���� �������� ���������� ��� ��� ������ ���� G+ ��� G+EG+ ���� 7� ������ ��*���68�

��3���3 =��������� �� ������ ! �� ��� ��� ��� �� ���� �� �� ��� ���� �� �� ! �� ���� ������� ���� �� ! �� ��� ���� ����� ������ � ������������ ���� �� ��� ��� ����� �� ����� ���� ��� � ��� �������� � ��� ����� ��� ��� �� ��� ������� ������ �� ������������ ����� ���� �� �������� � ��� 0; ������ �� �� ��������� �� ������� ������ �� �� ���� �� �� ��� �� ����� ���� ��� � ������ ��� �� ������� ����� �� ���������� ���� ����� � ��� 7�� ��� � ��� � �� �� /����� ��� �� �� ������� ���� ��� � �� ���� �� �� ��� �� �� ���8� ( ���� ���� ��� ��! �� �� �! ������� @����� ������ ���� ��� ��� �./ ������ �./� ���� �� ����� �� �������� �� � ������ �� ��/ �����@����� �! ������� ���� ������� �� ���� ������ ������������ ��� ������ �� +������ � ��� "AB69 &��� � @��� ��� ������ �� �� ������( ��� �� ��� G+EG+ ���� � �� ������� ��� ������ ������

����� �� �� �� ��� �� ������� �� �� ����������� �� � ������

���

��� ��� >�# ������ �#'����� �A# ������ A#C���� 5�� >�������� � ,�99�/�9�91�9���

��������'3# 4 > #� <� 5 ># A ����C #$��� 5%5� ��� 5 "��� ���������� >��� 89 ,�-*2/ *+1-*�

Page 152: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��0 "��� ���������

������ �� �� ����� ������� ;���������� �� �� �� �� ��� ���� �� �� �� ����������� �� � ����� ������ ����� �� ����� ������� ��� ���������� ���� ��� � ���� �� � ����� ����������� �������� �� ���� ����� ��� � ���� ! �� ��� ���� �������9� ��� ��� ����������� ��� ���� ����������� ����������� ���� ����� ���� ����� 7� ������ ��*�*8� ( ������/ �� �� ���� ���� �� �� ��! ������� �� ��� �� ��� G+EG+ ����� �� ���� �������� ���� �� �� ��� ���� �� �� ���� ��� 7�����������"E* � �� �� ���� �� �� �� �� ���8 ���� ��� � ������ �������� �� �� ���� �� �� �� �� ���� ���� ������ ���� ������� �� �� ��� ����� ��� ��� ��� � ����� 7� ������ ��6�$8�(� ���������� �������� �� ! �� ��� ��� ���� 7��� ;��& 0 G+�

� ������ ��*���:8� �� ��� ��! ������� �� ���� � ����� ������� ���� �������� 7G+�8 7� ������ ��*�*�68� ;� � ������ ���� N����� ��� O���� "AA5��� ������� ������������ �� � ! �� ��� ��� ��� ��/

��� � ������ �������� ���� ��� �� ������� ������������� ������ ���� �� ����� ���� �������� ������������� ��� ����������� �������� 7)��� � ��� "AAA8 H �G+EG+ 7)� � ��! �##�8 ��H �G+EG+ 71���� � � ��! �##"8 � G(H�& 7T�� � ��! "AA:8�

��3���& %�!�� ����� �� 71��������� ����� �����8&��������� ������ �� "AA: 7G��� � ��� "AA:8 �� ��������������������� ��� �� ����� �� H����� � ��!� �###9 ��� ���� ������� ������ ���� �� ���� ��� ������� �� G+EG+ ������������� ������ �� ���� �� ��������� %� ������� � ���� �������! �� ��� ������ ��� � ��������� ��� 7� ���� ! �� ���8 ���� ������������� ������ ��; ������� �� � �� ��� �� ��! � G+���� ���� ������� G+EG+ ���� ���� ���� ���� ��� ���� ��� ������� ����������� �� ���� ��� �� ������ ���� ������� ����),H 7%�� � ��! �##"� -���� � ��� �##�8�

��#

5������ 4A# H��� 5A ���� ���)����� ��� ,�--./ �1�+�

���� " � �� �---KC�������"># C���� �#H��� 5A� &���� )����� �-,�99�/ �2�1�2.��� � ��# &���� 2�+,�99�/�*91�*0�U�� 5# �������� A55"#3���� )$� ��� 3��� 8*,�--8/ �.*21�.-��

"����� �A# >�!��� $# � �#(������� 5# )��"# )������ A�# �� � 5# )����� A��A���� 3����� "���������� �9 ,�--8/ **-1*-8�������<� �#3��������� �:# ��C# ��������� 4'# $������ )# C��"#"���"� A���� 3�����"��� ������� �� ,�--./�9�+1�9�2�) �C# C���"�# )��<�����<C># %���� �&"#3������� 5�# (��� �>#3����� �# %�6 �# '���� 5&#>����� 5� 5 )��� 3�� �.8,�99�/ +�+�1+�8+�'���� � ��# &���� 2�+,�99�/ �2�1�2.�

Page 153: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

G� ������ � G(H�& ��� �� � ��� �� ����� �� � �� � ��������� ��� ������� ������ G+EG+ ������� �� � ��������7H����� � ��� �###9 +�����/� � ��� �### %������ � ��� �##"8����� ������ ����� ����� � ����� ���� �������� ��� G+EG+

���� ���� ���� ������������� ���� �� � ��! �� ���� �� ������� ���� ������ �� �� �� � ����� �� �� ���� ���������� �� �� �������� � ���� ��� �� G+EG+ ����� ���� � ����� ��� ������ ����� G(H�& �� �� ���� �� ������ �� ���� ��� � ����� ����� �� �� ���� ����� ��� �� ������ ��������� ���� .+&�

��3���- �<0?�<0( ��;E��; ������ ��� ����� �� �� ��� ���� � G(H�& ����� � 7G�'�����'/� � ��� �###8 ������� ����� ���� ��������� ���� ��� ����� �! �� ���� �� ���� ��� ������������ �� ������������ 7�� ������ �� ��� ��� &� ������� ������ ������� ����� ����8� %��������� ��� ��; ������� � �������� � ��������� ���� ���� �� ���� ��; ������� �� �� �� �� ����������� )��� ��� ���������� ��� ������ �� ��������� ���� ����� ����� ��; ������ ����� �� ����� �� ������ ����� �������� ���� ���������� ��� ���� ��� ���� �� ���� G+ ��� G+EG+����� ��� �� ������ �� � ���� ����� ������������� �� � �� ��������

��3���* 0����� ���� ��� �� ��������� 70��$�+8+������� �� �� ��� ���� �� ;��& 0 �� ������ �� ������� ��� ����������� �� & 0 ���� �� � ����� ������� ���� ��� �������� �� ������ �� �� ������ ����� ����� �� � � �� &� �� ���� ���� �� ����� �./ ���� ��� � ���� �������� �! ��� �� � ���� ������� �� �� �������� �� � ������ �� �� ��� �! ��� �� �� ��������� �! ���� �� ������ ���� ����� ��� ��� � ��������� � ��� ���� ��� �� 1�� �� � ������ �� ���� �� ������������� ���� ����� ���� �� � �������� ��� �� &��� ����� ��� ������� �������� �! ��� ���� ������ ��� ��� ���� �� �������� ���� ��� � ������(� ;��& 0 �� �� ��� ������� ���� ������� �� ��� ��

��� ���� ��� ���� ��� ���� &� ��������� ��� ������������� ���� ����G(H�& ��� .+&� ���� ���������� ��� G+EG+ ��� G+� ������������ ������� ������������ � �������� ������ 7G���� � ����###8 �� ���� ���� ��� ��� ������� ���� ���� ������� �������� ������� ����� �� �� ����� ������� 7-������ � ��! �###8�; ���� ����� ���� ������������ 7. �8� � ��� �� ��������� �������� ����� �� ��! �� ;��& 0 ���� ����� ������� ������ � � ��������� �� ���� �� �������������� 7+�� � ��!�##"8�

��&

(����� � � �� A����3����� "��� ������� �2,�999/ �92.1�9+.�������<� � � �� ���� 3��.� ,�999/ ��0�1��2��)�����"� � �� ��� 3��.0 ,�99�/ �.9.1�.�9�

"�6������6< 4%#3���� 5"# )�����"�#%���< �"# 5����6 ># :���"(#)������� �(� ��� 3�� .�,�999/ ++�1++*�

"����� � # ����������6 5#�����%# "���� 5�� ���3�� .� ,�999/ 2�8812�.2�'����� �A# )��� 5 #������� '�# A��� )# >����$��� (# %���;# ����� A�#������ A� ��� 3�� .�,�999/ ����1���*���� ���# �����" #3��� ��# �����"# (���� �#"�(����� %C� ��� 3��� .0,�99�/ �-1���

Page 154: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��0 "��� ���������

��3�3����� � ���������� 74'?4'8

&� �� ����� ���� �������� �� ���� �������� �� ������ ��*�� ����� ������ �� ��� ���� �� ������� �� � ���� ��������� ;������ �� G+ ��� �� ���� �� ������ � ��� � �������������� ����9 ��� ������� �� �� ������ ��� �� ������� ���� ��� �� ����������� ����� ��� ������� �� �� ����������� ������� �� �� �� ����������� ;���������� ������� �� ��������� ��� �� ������������ 7 &�8 ������ �� ������������ ���� ����� �����! �� ��� ����� ���� ��������� � G+EG+��� �����! �� ����� ���� ���� ���� ������ �� �������

���� �� � ����� �� �./ ��� ��� � �@����� �� ����� ���� �� ������������ ������ �� ���� �������� -������ ��� �������� � ����� � ����� ��� �� ��� ���� �� ���� ���9 ������ ������� � �� ��� 7����� �� ����8 � �� �� �� ���� ! ��� ��� ��� ����� ! �� ������; ������ ������ ������ ����� ���� ������9 ��� ������� ���� ���� ���� ����� ����� ���������� ��������� � �� �� �� ! �� ��� ��� ��� ��� ;��& 0������ 7����� �� ���8��� ���� �� G+EG+ ������� � ����� � ����� ������

��������� �� ������ ����� �� �� ���� ! �� ��� ��� �����! �� ������; ���� ���� ���� � �� �� ������ �� �� ���� �������� 7� ��� $A8� .�������� �� ������ ���� �� ������� ���� ��� � ���� �� �� ����9 G+"� �� ��������� ������ G+��

��(

MS1 collision cell MS2

0�� (32 )�������� �� ��� ����� � ��� �� 7)�7) ���������� ��� ��� ' ������� �� ���7��� � ��� ' ����� �� ���( �� !�������� ' ����� ��� ����

Page 155: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

��3�3�� ������ �� ���&� � ��� �� ��� ����� �� ���� ��� �� �� ������� G+"� �� �� ������������� ���� �� ��� �� ������ �� �� �� ��� 7��� � �����8��� �� �� ��� �� ������ ���� �� ��������� ��� �� �� ���� ���� &� 7��� $A �� ����8� )� �� ����� �� ������ ������ ���� ���� �� �� �� ��������� ��� 7��������� ���� �������8 �� ���� �� �� �� ��� �� ������ ������� � ������ ����� �� ������ ����� � ��� �� ����� �� � ����� ��� �� ���� ������ �� �� ���� ��� �� �� ������� G+ �� ��� ������� ���� ����� ��� ���� � ��� �� ��� ���� �� 1��� ���� �� � ����� ! �� ��� ������� G+ � �� � ���� ������� ! �� ��� ������ ����� �� ����� ���� ��� �� ���� �� ������� �� ����� �� ����� &� �� ��� �� � ����� ! �� ��� ��; ������� G+ � ��� ������ ��; ������� �� ����� �� ��� ���� ��� �� ��� �������� � � ������� ��� ����� ��� ���� ����������� ��������� ������������ ��� ��� ����� 1��� ���� �� �� ��;E��; ������ �������� ���� ��; ���� �� G+" ��� �� ����� ��; ���� �� G+�� ;�� :#��������� �� ������ ��/����� �� �� ��� �� ����� ������� ��� ������� �� G+" ��� ������� ������� �� ��� ����� G+EG+ ���� ��

�� ����� �� �������� ��������� ��� ��������� ���� �� �������� � ����� �� �� � ������ �������� ���� ��� � ��������������������� �� ������� �� ���� ���� ������� �����������7+��� � ��� �###8�

&� ��� � � �� ����� �� �� ��� �� �� ���������� ������� �� ��������� ���� ;���������� ������ ���� ! �� ���� ! �� ���� ��� ��� ��� ����� ! �� ��� ��; ������� ��� � �� ������������ ���� �� �� �� �� "#<"## 3 ���� ������ ����������������� � ������� ���� � ��;E��; ������ ��� � �� �����������

��)

I

I MS/MS production spectrum

MS spectrum

isolation and fragmentationof the precurser ion

m/z

m/z

0�� )92 $������ �� 7)�7) ��������� ���/� ���

����� 3�# ����� ��# )��� 5#A������� 5�# �����"$#"�'�� "�# 4���� '#>������� ��� ������������� ,�999/ �80+1�8+9�

Page 156: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��0 "��� ���������

���� �� ���� �� �� �� ������ � ���� �� �� /3 ���� ����� �� ������ �� ��� ��� &� ������ �� ���� �� ������ ������ ��� &��(� � � �� �� �� ��� ��� ����������� ����������� �� �����

�� �� ��� ������� ��������� �� ��� ����� ���� ��������� �� ����� ���/��� ������� � ������ ���� �� ��� �� ���� ������������� ��� ��� ������ � ���� ����� �� ��������� �� ������� �! ��� ���� ����������� �������� ��� �������� 0������� ��� ;������� "AB6 7��� :"8�

�� ����� �� ������� ������ ��� ����������� ��� ���7��� :"8

� �� �������� ��� ���� � ����� ���� �� ���� �� �� ��������� ��� ��� ���� ������� �� �������� ����� ���� ����������� ��� ���� ��� 7��� :�8�

� �� �������� ��� ���� � ����� ���� �� ���� �� �� ��������� ��� ��� ���� ������� �� ������ � �� �� ����� ����������� ��� ���� ��� 7��� :�8�

�� �� �� ��� ��� � ��! �� ��� �� ���� ��� ���� ����������� ����������� ��� �� �� ���� �� ����� ���� �� � �� ��

� ������� 7��������� ��� ����� ��� � � �� �� ������ ��������� ���� 58

� ��� 7��������� ��� �� ������� ���������� ��� � ������ ������9 ��� �� ���� ���������� ��� �� �� ����� ���������� ����8

� ����� �������� ����� �� ���� ��� � ����� �� ���� �� ������� ����� ��� �� �������� ����

��,

C N

H

O

CNH2

R

H

C C N C COOH

O

HH

R R

H

a1 b1 a2 b2

y2 y1

0�� )�2 "��������� ���� ����� ������!��� ! :��������� �� "�� ��� K ��� ���� ���� �!���0�� � �� ��� ��� ��� �� ����� 5��( !� �� �� �� ���6�

A�������� ># %����� 5�)���� "��� ������� ��,�-*2/ 89��

Page 157: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

��!� ��2 ����� ������ ��� ������ ���� �� ��� ��� �� ��� ���������0� ����� �� �� �� �� ��� ��� ���� �� ���� ���

8� ���� �� 8�����

����� ����� ��� ���� �� �� ����� ����� ���� < �B7�� �� ���� �� �8

����� ����� ��� ���� �� �� ����� ����� ��������� ����� ��� ���� Q"BQ"

(� ���� ����������� ����� �� ����� �� ������������ �������� �� �� ����� ���� ��� ������ 7N������ � ��� "ABB8� ��� �� ������� �� ������ ����� ��� ����������� � �� �� �� ������� ������������� �� �� � ��� ��� ���� ��� ��� � �� ��� �� �������� ����� ��� �� ������ �� �� �� � ���� ��� ��� &� �� �� �! �� �������� �� ��������� ��� �� ��� G+EG+ ���� � ��� � �� �� ������� � �����

�� ��� ���� �������� �� ����� �! �� ��� ���� �� ������� �! �� �� ���� �� �! �� �������� � �� � ������������������� �� ����� ��� �� ��� G+EG+ ����� ���� �� �! ��������� 7� ������ ��6�68�

��3�3�� ����� �� �� ���&� ���� ������ �� ���� ��� �� �� G+ ������� G+"� �� �� ������� ��� �� ��������� �� �� ���� �� �� �� ��������� ��� ��� ���� &�� �� ���� ��� �� �� ������� G+�� �� ���� �� � ����������� ��� � �� ���� ���� ������� ����� ������ �� ��� � ������

��/

CH2N

R

H

+

a1

C N

H

O

CNH2

R

H

C

H

R+

a2

C

O

CNH2

R

H

+ C N

H

O

CNH2

R

H

C C

O

H

R

+

b1 b2

NH2 C COOH

R

H

+H

NH2 C C N C COOH

O

HH

R R

H

+H

y1 y2

0�� )�2 )�������� �� ��� ������� ��������� ����� ������ ���� � �� ��� ��� ����������

5������ A�# "����� ��#)����� 4� ��� 5 "���������� ��� >��� *8 ,�-**/�0.1�+2�

Page 158: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��0 "��� ���������

��� �� ���� ������� ���� ���� � ����� �� �� ����� 7� ��� $A����� ����8� &� ���� ���� �� �� �� ��� ���� ��� � �� ���������� ������� ����� ����� �� � ������ ���� � ���� �������� �� ���������������;� ������ �� ���� �� ���� ������ � ������ �����

�������� ������ �� � ������ ����� ����� ��� � ���������� ���� ���� ��� �� G+EG+ ������� ( ������������ ����� �������� � ��� ��� ��� ����������� ����������� �� ��� � ��������� �� 5A �� 7�� ,�*

< �� �8� ���� �� ����������� ������� ������������� ������ �� � ���� �� ���� ��� �� �� ������ �� ���� 5A� �� �� ���� �� ����� ����� ������ �� ��� � ������ ����� 5A ��� �� ����� ��� ��� ���������� �� ��������������71��� � ��1 "AA:9 � � ��!1 "AA:9 (���� � ���� �##"8�

���� ������ ��� �� ����������� ������ �� � ���� ! �� ���� ���� ���� � � ��� ������������ ��� �� ��������� ���� � ����� ! �� ��� ��; ���� ���� 7+�� � ��� �##"8� ������� ��� �� ������� �� �� ������� ������� �� ������ ������������� ������ �� ������ ���� �

��3�3�3 ;������ �� ���&� ���� ������ �� "�� ��� *� ���� �� �� ������ � �������������� ��� � � ���� � ������� �E' ������ ��� �� �� �������� �� �� ������ �� �� �� �� ��������� ��� ��� �� ��� ���� �� ������ �� �� �� ��������� ���� ���� ���� ����� ����� ������� �� ���� � ������ ���� �� ��� ���� �� �� ����� ���� ������ �� �� ����� 7� ��� :#8� ;� �������� ��� ��������� ������������ ������ ����� ��� ��������� ���� � ���� ��� ��� &�� ,�������� ���� ��� � ���� �� AB ��� �� � ������� �� � �� ��� ����� ����� �� �� � �� �� 6A� )�� ��� ������ ����� ���� 6A �� ��� � �� ��� ����� ��� �� �� � ������� �� ����� ��� � ��������� �� �������������� 7 ��� � ��� "AA"9+������ � ��� �##"8�

��3�3�& 4'�

���� ��� �� ������ �� ������ �� �� ! �� ��� ��� ���� ���;��& 0 G+� ( ������ ��� ��� �� �� �� ��� �� ��� G+EG+���� � ��� � ������ ������� ��� ������� � ����� ���������� �� � �� ���������� �� � ���� ���� �� ���� ����� � �� �� � ����� �� G+EG+EG+ ��� �� ��� ���� �� � G+*

7� ��� :*8 7H� �� � ��� "ABA8� ���� ��� �� ������ �� ����������� �� � �� �������������� � ������������� �������� �� � ������������� ������

��3

C��"# &����� '#"���"� ��� 3��� 8*,�--8/ +�.1+00K 3��� ��#��������"5# ����� A����� )����� �0- ,�--8/�*91�-������� A�# ��������"5#:��� A# ������ A5# 3��� ������ 3�� .0 ,�99�/0-01292�

����# 4E��� )#%�����6"# >��� �#"���"� >�������� �� �� �>�������� �� �� 2- �� ��"�������� �� ���� ���������� ��� ��� ������# 3������,�99�/�

3�� $A# ����� 3#����� 5�� ��� 3�� 80,�--�/ ��-01��99�������� �# >��<��� A#)���� � �# (����C����� 3�� .0 ,�99�/�.91�.8�

(����� 5&# �� 5C# A�� $H��� 3��<� A'� ��� 5 "��� �������� ��� >��� ** ,�-*-/-.1����

Page 159: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

��3�3�- 4->�$��<0 � � '����� ����� 7 '�8���� �����! ��� ������ �� +���� ��� �����/� �� �� ��������� ��� �� �� � ����� �� ������� ����� �! �� ����������� ���� � G(H�& ������ ��; ���� ��� 7+����� "AA59 �� ��� � ��� "AAA8�

+���� ��� �����/� ����� ���� G(H�& ��� ��� � �� � �������������� �����! �� ���� ����� ���� G(H�& ���� ������� ���� ������ � � ��� �� �� ������ (�� �� ������ �� ���������� �� �� � �� ������ � �� ����� ������������ � ������� ����� ������ ��� �� ���� �� �� ���� � ���� ��� �� ������� +��� �� ����������� ��� � �� �� ���� � ���� ��� ������ ��� �� �������� ��� ��� �� ��� ��� �� ��� ������� ���� �� �� ���� ��� �� � ���� ��; ���� ��� ��� ���� ��� ���� ����� �� �� ��� ���� ��� ������ � ����������� )������� � �� ��� �� ���� ��� � ��� ���� ���� �� �� �� ������ ��� � ��� /����� ���� ;�� ����� �� ��� ��� ������� �� � ������ ���� �� �� ��� �� �� ��� ���� ��������������� ��� ���� ��� /����� ��� ������� 7��� �� ���� ��������� ������� �� �� ������ �� ������� ������� ��� ������ �������� ���� ���� ���� ������ ��� �� ��� � �� �� ������ ,+� ����8�� ����� �� ������ �� �� �� ���� ��� � ����������� ����

�� ��� � ������ ���� �� ������� � ���� �������� ���� ����� ���9 ��������� �� ������� �������

�#9

I

I

I

MS/MS production spectrum

MS/MS/MS production spectrum

MS spectrum

isolation and fragmentationof the precurser ion

isolation and fragmentationof a product ion for a further stageof fragmentation

m/z

m/z

m/z

0�� )#2 )�������� ���������� ��� ���/�� �� � � 7)3 ����������

����� )� 5 "��� ��������0� ,�--./ �9�-1�908�3������� ># (��6�<����� %#����� )� 5 �� ��� "���������� �9 ,�---/ -�1�90�

4 S �F����� $��� � ���������� �� ��� � ��� ���� ������ �������� ���# ��� ���4 �

Page 160: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��0 "��� ���������

)���� � ����������� ���� ������ 7�� ���� � ��� ����8��� ���� ���������� � ����� ��� �� D. ������� �� �� ������� ���� ���� � ��� �� ��� � ���� ���� ���� � ������ �� ���� 7���� :68� &� ���� �������� ���� ,+� ���� ���� � ���� �� ���� �� ���� �� ��� ���� � ���� ��� � ������� �� �� �� ���� ,+����� � ����������� ������ �� ������ �� �� ������ ��� ����� �! ������� �� ����� �� ������ ���� �� ��� ���� 7������ D.8 �� ���� ��� ��� �� �� ������ ���� �� ��� ��������� ������� &� � ����������� ������� ���� ������ �������� ������� 7�� ���� �� "� ������ ��� � ! ��8 � ! ���� ��� � �� ��� ���� ��� �� ��� �� ���� 7��� :$�8� �� �������� �� ������ � ��� =�������? ����� ���� �� ���� ���������� ������� �� ������ ��� �� ��� ���� �� 7��� :$�8�

�#�

New harmonic reflectron

detector

ion of half mass

parent ion

focused ion

Conventional linear reflectron

detector

ion of half mass

parent ion

defocused ion

0�� )&2 )�������� ���������� ��������� �� ��� ��������� �� �� ������� �������� ��� � ��� �� ��� ������ ;���� ��� '��0����� ���� ��� �����( ���� ��� '@�������� ��� � ��� ������

Page 161: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� � �� � ! ������ ���� ������ �� ,+� �������� �������������� � �� ��� ������/�� ��� � �� �� ������ �� �������������� ���� �� ����� ������ /����� ���� �� � ����� ���� � 7���� � :6<:$8� ���� �� ��� � �� � ! ������ ���� ������ �� ������� ������ �� ������� ����������� �� ��� � ���� ! ������ ��������� �� ������� 0� �������� ��� �� ��� �� ���� ���� � ����� ���� �� � ���� �� � ����� �� �� �� ��� � ��� �� �� �������� ������� �� ��� ���� �� �� ��� ��� �� �E'�)�� � ������ ,+� ���� � �� ������� �� �� ��� ��������� ���������� ���� ��� � �� �� �� ���� ����� � �� �� ������ ���������� �� �� � ��� ��� ����� ����������� ���� ������� ��� � ,+� ������ �� ������

�� ���� ������� ���� �� G+EG+ ��� �� ��� ���� �� ����������� �� ����� ���/��� ������� ����� ���� ��� �� ������ ���� ����� ���� ��� �� ������ � � ��������� ���� ����� ����� � ����� ��� ��� ����� � �� �� ������� ������������ ������ ������ ����� ��� � �� �� ������ ��� ����� � �� �� ������ �! �� �������� ��� ����� �������������� 7+���� � ��! �###9-��� � ��! �##"8�

�#�

0 500 1000 1500 2000 2500

reso

lutio

n

0 500 1000 1500 2000 2500

reso

lutio

n

0 500 1000 1500 2000 2500

reso

lutio

n

Linear reflectron

Linear reflectron

Quadratic field reflectron

Cannot resolve fragment ions which have a wide energy range.

The reflectron can only resolve a small segment at a time.

A complete fragment spectrum cannot be recorded in one step. Thus many spectra have to be acquired by stepping the reflectron potential.

The several spectra need to be stitched together (10-12).

Time consuming

Potentially troublesome calibration

An entire spectrum acquired in a single spectrum.

Good sensitivity

Greatly enhanced speed compared to linear reflectron.

Simple calibration.

0�� )(2 )�������� �� ��� ���� ������� �� � ��0����� �� @����������� � ��� ������ ;���� ��� ' � ���� ����� �� ��� ���� ��� ��!� �������� �� �� ���� ���� � ��0������ ���� ��� ������ 7��� � ��� '

�� ��� � ������ ��@����� �� �!������ ��� � ���� ��� �� ������ ������ � ��0����� ���� ��� ������2���� ��� ' @�������� ��� � ��� ������ ��� ��� ������� �� ��� ���� ���� � �� � ��" ���������

��� # "�6��"5# '���� 4#'�����"# :���<��<���#(�� A# ������� �:� 5 )��3��� �.+ ,�999/029+21029+-�'���� 4# ����#"����� (# �����< )#>� �"# '�����"# :������ 5# � )��< �#:���<��<��� 5� ������������ �� ,�99�/ �82+1�8+��

Page 162: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��0 "��� ���������

��� ������� ���� ��� ���� G(H�& ����������� ����� ������������ ����� � ��� ,+� �� � ��� 7D� ����� � ��� "AA:8�D� �� ��� �� ��/� ������ � ������������ ����� �� ������! �� �������� �� G(H�& ,+� ���� ���������� ����������� � ���� ,+�� �������� ���������� �������������� �� ��� ��� ������ ������� ������� �������� �������� ����������� �� �� ����������� +�� ����� ��� ���� � ����� ��� ���� �� ����� ���� �� ������ �� �� ,+� ���� �� ����������� �����������

&� �� ������� ����� �� ����� ����� ��� �������� ������� ������� ����� ������� �������� �� ������� �� � �� �� ������� � �� ��� ����� 7��� �� ������� �� � �� �� ��� ����� ��������8 ���� �� �� ����� ����� � ������� ���� 7�D�[�8��� ���� ������ ���� �� G(H�& ���������� ����������� ��

����� ����� ��� �� �� ������ � �� ������ ������ 7������8�� �� � �������� ��� �� ����� ������ �� � �� �� ������ ��� �� � ��������� 7��� ::8� �� ���������� ����� 7��������� ����� G(H�& ���� �� �� ����� ���� ��� � ������ �����8�� �� ��� � � �� ������� ����� ��� � ��! ���� �������� ����� ���� ����� �� �� ����� ���/���� )�� ��� �������� ���� � ���� ���� �� ������ ���� � ����� ��� ���� ����� ������� ���� ������� �� � ����� ���� � � ������ �� �������� ���� �� �� � ������� ���� �� �� ��� ������ ���� ��� ������

<�*+�(�(�(�(�(�0Q ���

<�*+� )0� �Q V)�� )0� ��)W

Q ����" ��� �" ��� 70 P � �������

��� ����� �� ������8

0�� ))2 ��� ������ �� � ���� ������ ������ ��� �������� �� � ����� ������������������

H������� �� ���������������� ������ ������ ����� ���������������������� ����� ���� ����������� �� G(H�& ,+�� ;�� :5��������� �� ���� �� ����������� � ��� � ,+� �������&� �� ��� �� ���� �������� ������ ": ����� ��� ��� � ��� ������ ������� �� ����������� �����! �� ��������� ��������� ������ ���� ��� �� ��� 7� ������ ��6�*<��6�68�

�##

4������� A# 3������� >#4����� �# ����� )� A����3����� "��� ������� �9,�--8/ ��--1��9*�4���� $# H��������� A�#(�� ">� >��� &�� ���� ���7�� -8 ,�---/ .�0�1.�08�4���� $# (�� ">#%��� �"# '���� A�# ��� H#)���"�# )� 4)� ������������ �� ,�999/ ��+�1��8+�

Page 163: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

(� �� ������������ ������ ���� �� �� �� ������������ �� �� ������� �� � �� �� ����� ��� ������ ���� �������� �� ��������� � ����� ������ �� �� ,+� �� ����� ����������� ������ ������ ���������� �� ���� �� ������������� �� ���� ����� �� �������������� ������� �� ����� � �� ���� � ������� �� �� ����������� �������� ���� ��� ����� �� ���� �� � � �� ���� �� �� ����� ����� ������ ����� ������� �� ����� ��������������� 7%����� � ��!� �###9 D� �� � ��!� �###8� &� ���� ������������� �� �� ����� ������ �� ����� ��� �� �� � ���������������� ��� �� � ���������� ���������� �� ! ���� ��������� ������� ����������� ��������� � ���������� ����� ��� � �� �� ������ ���� �� ��

������� �� � ��� ����� � ������� �)+ �� ����� ��� :B7H������ � ��� �##"8� + ��! �� ,+� ����� ��! �� ��� ������� �������� �� ���� ���� �� ��� ��������� ������� ������������ 7 (;8�

�#&

0�� ),2 $)� �������� �� � ��" ����0������� � ������ ������� ��@����� ������� ���� 7�2�����" $�� 5�-4 ��� ��� ��� �� ��� �����6� ��� �* ���������0� �������� ��� ����� ��������������� 2����� 526 �� ��������� � �����@����( ���� ���� !� ���������

���� ��� ��������� 5��� ����� �� ����� ��� ���!����6� �78H �� ������������ ��� ���� ��� ������ �� ������������ ��� � � � ���� $)����������( ������ �� �!����� ��� 0�� �� �������� �� ��� ����������� �!������

)������ %(# ;��� �'#'��< �5� A���� 3�����"��� ������� �2 ,�999/�9.91�9.0�4���� $# (�� "># H���������� A�� A���� 3�����"��� ������� �2 ,�999/�02*1�0+8�

(������"# )��V�"# W���B� 5#3������ 7# 4���� $#"���� 5(# >����� A#H��������� �� >����������"� ������� �� ������������� ��� ��� ������#3������# 7�� ,�99�/�

Page 164: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��2 >����� �������������

�� �� �� ������/� �� �� ������� ����� ��� �� ������������� �� �� ����� ������ ����� ! ���� �� ������������ ����� �� � ����� �� ������� ���������� �� � �����! � ���������� �� ���� ������ �� ���� ������ �� ! ��������������������� �� �� ����� ����� �� � � ���� ! ������� �� ������������� ��� �� ��������� ���� �� ����� ������������ ��� ��������� �� ��� ������������ 7� ��� "#8� �� ������������ ��� �������� �� � ��������� ���� ������������ ������� ����� ������ ���� ����������� ���� ��� � ��! �� �! �� ������������ � ��! �� �� �� ��� ���� ��� ���� ���� ���������� 7� �������� ��$�"8����� ������������ ������ �� ! ���� ��������� �� ��� G+EG+

���� ���� ����� ������ G(H�& �� �� ���������� �� �� �������� �� ����� ���������� �� �� ����� �! �� ��� �� ������������ �� � ������ ����� ����

��& ����� ���������� !� ����!� � �������

(� ����� ���� G+ ��� ���� �� ��� ����� �� ����� ������� �������������� )���� �� �������� �� ���� ������������ ��� ������ � � ������� �� �! �� �������� ��� ��� ���� �� �� � ���� �� ���� �������� �� ���� �����-������ G+ ���� ��� � �� �� �� �������� �� �����

�������������

� ,���� ���� �������� 7,G;8 < G+ ���� �� ���� ���� ��� �� ��� ����� ���� ��� �� �'�� ��������� ������� ������ �� �� ������

� ,���� ���� �������� ��� ����������� ����������� ������ �� ������ �� ��� �� �� ������ ���� ��� ���'�� �������� � ������� ������ �� �� ����� ��� � �� �������� ��� ����������� ���������� ������ �� ��� �� �� �� �������

�#(

N

O

O

O

O

RS

O

O

OH NH2 Pep S

O

OOH

R

O

NH

Pep+

0�� )/2 :������ ������ ��� ��� ����� ���! ��� ����� �8) ����� ������

Page 165: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

� ,���� ���� �������� ��� �! �� ���������� �� ����� �� ������ �� ��� �� �� ������ ���� ��� �'���������� � ������� ������ �� �� ����� ��� � ������� ��� ��� ���� �! �� ���������� ������ �� ��� �� �� �� �������

� ,�� �� ��� G+EG+ �! �� ���� ��� �� � �� �����< G+EG+ ����

��&�� ����� � ���������

�� �����! ��������� ������ �� "AA* ������� ����� ���������� G(H�& ��; �������� ��� �! �� ������� ���� ����������7,����� � ��! "AA*9 )�'� 1N � ��! "AA*9 G��� � ��! "AA*9 O��� ���! "AA* ��� N��� � ��! "AA*8�+������ �� ����� �� �� ����� ������� 7� �� �� ����

�� ������������8 �� ���������� ������ ���� �� ���������� �� �� �� �������� ������� ������� ���� � ���� ����� ����� �� �������� ������� �� �������� ����� ��������� ��� �� G+ ���� �� �� ����� ���� �������� 7,G;8�� ��� ������ �� �� �������� ����� ����� ��� � ��� �� ����� ���� ��� �������� �� ��� ����� �� ����� ���� �� ����������� ��� ���������� ������ �����9 �� ����� ��������� �� �� ���� ������ �� �� �� ���� ���� �� ��� ����� ������ �������� ��� �� �������� ������� �� � �� �� ������� ����� �� �� ,G; ��� �� ��� ��� �� ����� ��� � ���� � ������ �� �������� �� �� ����� ��������������

�� ����������� �� ������ ��������� ��� ����� ��������7���� ���� ��� ��������8 ���� G(H�&���; ���� �������� ��������� �� ������� �� ����� ���� ����������� ������������ �� "� ������ �� �� ����� �������� ������ �� ���� ���� � ,G; ����� ��� � ������ � ��� ������� ����� �� ��������� ��� �� ������ ������������� �������� ���� ��� ����� ���� ��/ 7� � $# ��� ���� ��� ��� �� � ���8� �� ���������� ��� ��� � �� ��������� �� ������� ����� � ���� ���������� �� ����� � � ����� �������������� 7N��� � ��� "AA:9 �� � � ��� "AAA8�+��� ������ � �������� �� ���� ���� ��� �� �����

������ �� �� �� ���� �� �� ���/ 7���� ���� G(+ �� �������������������� ���� �� �� ������������9 G+�;&� ������ �������� ����� E8 (�� ���� ��������� ��� ��� ���� ������ �� ����� �� ������ 0������ ����� ������ �� ����� � ������� � �������� �� � ,G; �����

�#)

>����� �53# �X@��� >#)��� �� 3��� )�� 0 ,�--0/0�.100����6C5# )��� $"#����� 5$# C��� �3# '��� 3#C������ 3� >��� &�� ������� 7�� -9 ,�--0/+9��1+9�+�"���"# ��@��� >#A�������� >� )�� "��� �������� �� ,�--0/ 00*102+�H��� 5A ���# ������ �#'������ >A# ���<���� $� ���)����� ��2 ,�--0/ 0-.129*�5��� ># U�������"#3������ # '���� '� )�����)���� � A� 3����� �-+,�--0/ +*182�

5���;&# >���@��<�� �#"���"� A���� 3�����"��� ������� �9 ,�--8/�0.�1�0.*�3���� 4A# )�<� >#)������� �(� ��� 3�� .�,�---/ �*.�1�**��

Page 166: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��2 >����� �������������

� ,���� ���� ������ +����������� �� �� ������ ������ .� ������� �� ��� ��� �� ���� ��� ��� �� ���

���� �� �� ����������� �� ���� �� ���� ��� ��� ����� �� �����������

� D������ �� ����� ������������� ��� �������� ����������

;� ���� ������� �� ��� �� ������ � � � �� � ������������ �� �� ���������� ������ ����� ����� ��� �� ������� �������� ������ �� ������ ��� �� � � � �� �� �� ����� ������ ���������� �� �� ������ ���� �� ��� �� ����� ��! ����� ��� �� ���� �� �� ����� �������� 0� �������� �� ,G;������� �� ������ � ��� �� ��������� ������ ��������� �������� �� �������� ��� +�����/� � ��! "AA:9 ��������� ���� ��� A#L �� ������ ����� ��� � �� �� �� �� . ���� ����� ��������� �� ����� ���� ������������(���� �� �� ������ � � ����� ��� � � �� ��� � �����

��� ����� ��� ��� �� ������ ������ �� ����� ���� ����������� � ��������� &� ��� ��� �������� �� ������� �� ������� ��������� ����� ��/�� ����� ��� ��� ���

� �� ���� �� ��� ������ ������ ������ �� ����� 7���� ��� �� �� ��� ���������� �� �� ��� ����8�

� ,����� ������ ��� �� ��� ����� � �������� �� ������������ ������ � �� �� /�����

� &����� ������� ����� ������ �� � ���������� �������� ,������������������ ������� ������� ������ �� ���� �� ��

����� ����� ����� �� ���������� �� �� ������������

� �� �������� ����� ��� � 7������8 �������� � �� �� ������ �� �� �� 7� � � ����� ������8� � � ��� ������ ����� ��� �� � ������� ������ ���� �����

G(H�&���; ����� ���� ����������� �� ���� ��� ����� ������� ����� �������������� � � �� � ���� �� �� ����� ��� � ���������� �� � � �� �� ����4

� &�� ������� ������ � ����� �� �� ����� ���� ��������� �� � ���� �� � ������� ����� ��� ��� ������� ����������� �� ������� �� ������

� �� ����� ���� � ���� �� ������� (���� �� �� �� �������� �� ������ ����� ���� � 7(������ �� �! �##"8 �� ������ � � ����������� � �� �� ������ ��� ��� ������������� �� �� ���� �� ���� � � ����� � ��������������(� ���� ������ � ! �� �� ��� � ����������� ������ ����������� �� ��� ����� � ��� �� ������ ���� ��

�#,

������<� �# 5��� ;&#>���@��<�� �# �������� %#C��"# :���;# "������ >#������<� �# )������ �#"���"� >��� &�� ���� ���7�� -0 ,�--8/ �2291�22+�

$����� ��� <����� ��<� �������� <���� ��� ���������# �� �����# ��� ��������� ������ ���� ��������

3����� ��� ��� ����������� �������# ����� ��������� ������ ���� �� ���� ���������� ��������

�!���� 5# )���"#&��� $5># %� B��>�������� �� �� 2- �� ��"�������� �� ���� ���������� ��� ��� ������# 3������,�99�/�

Page 167: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

� .������ ����������������� ������������� �� �� ����� ���� �� �� ������ ����� � ��� ������ �� �� ���������������� �� �� ������ �� �� ������� �� ��� �� ��� ���������� ��� �� ���������

� 3� ����� �������� ��� � �� �� ���� ����� ����� �� ��������� � �� ����� �� ! ����� ��� ��� ��� ���� ���� ���� ����� ��������

� &� �� ���� �� � � ����� ���� ����������� ������ � �� ���� �������� �� ������� ������� �� .+� ��������7����� �� �� ��� ���� �� ����� ������������� �� � ���� ���� ����� ������� �� �� ����� �8� �� ���������� ���� ������������ � �� �� ������ ��� �� ����� ���� ��������� ���� ���� ������ ���� � ����� .+� ������� � ��! ����� ������������� �� ������

&� ��� �� ��� ��� ������ ���� ��� �� ������� ���������� ��! �� �� ������� �� ������

��&�� ����� � ����������� ��!��� ��� ���� ��� ��������

���������� ���������� ��� � ������ �� ,G; ���� ����������� ���������� �� ������� ����� �������� 7;��F � ��! "AAB8�;� �������� ���� � ��������� ��������� ���� ���� �� /�������� �� ���� �� � ������ ��� �� � ������ ����� �� ���� �###�� 7��� � �� #�$ �� ���� ��� ���8 �� � �� �� �������� ������� �� + ������ ��� � �� �� � ����� �� ���� ( � �� �� ��������� ��� �� ������ �� ���� ������������� ����������� &��� ����� ���� �� ,������ � ,G; �� ��! �� ��� �� ���������� ����� ( � ��! �� ����� ����������� ������ �� ������ �� � ����� ���! �� �� �� ����� ������� �� ������� �������� �� �� ������ ��� �� �� ����� ��� ������� ����� ��� �� �������� �� � �� �� �������� ��� ���� �� ��� ����� �� �������� ( ,G; ���� � �� ���! ��� �� � ��! �� ���� ������� ���� ���������� ������ � ��������� �� �� � �� �������� �� �� ��� ����� ��������� ���� ���������� ��� ����������� �� ������� ,G; ���� � G�1+. ����������� ���� ����������� �������� ���� ������������� �� ��� �� ������ � 7,������ � ��! "AA$8� ���� ��� �� ���� ��� � ����� ���� G(+ ���� �������������������

�#/

%� B�# U�� 5# 3���� )$� ����������� �- ,�--*/--*1�99+�>������# A������#������%# )�����5���"#5��� C# )��� �5� "������� )������� ������ ,�--8/�0+1�+9�

Page 168: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��2 >����� �������������

�� � �� �� ��������� ������� ������ � ����� ��������������� ����������� (����� ���� ���� ! �� �� ��! ���������� � ,G;� � ��! �� �������� �� �� ���� � � �� � ��� ����� 7���8 ��� ������� ���! ������� �� � ����� ���� �� �� ��������� �� ��� ����� �� �� � �� �� ��������� ������� ����������� �� ����� ���� ����������� 7+���� � ���� "AA*9 N��� � ��!"AA68�G� ����� -������ � ��! 7�###8 ��������� �����������

���������� ��� ���� ���� ��� ��� ��� � �� ������� ������������ ������ � ��� ���������� ������� %� �������� ������ ���� � ���� � ������� �������� ����� &�.�� 7�� ��� �������� ������������ ��� � ������� �������� ����� ����� �� �� ����� �� ������� *$ � ��� *5 �8 �� ���������� �������� ����� �� �� ������ ������� �� � ������ �������� 1��� ���� ������� ����������� ����������� ��� ���� ��� ��� ��� � �� ������ " ��� ���� �� ;��& 0G+� �� ���� �� � ����� ����� ��� � ������� �� ������ � ���������� � ����� ��� �� ���� ���� ������� 7" ����� ��� �������� �� �*6$�### ������8��� ������������ �������� �� ������ ��� � ��� ���� �� ������

�� �� ��� ����������� ����������� +��� ��� ���� 7"AAB8 ����� � ����� �� �� ������������ �� �� �������� ����� �� � ���������������� ������ ���������1�� � ,G; �� ������� ���� ����������� ���������� ����

��� � G(H�& ,+� ���� �� ������ ������������� ������������� � �������� &����� � ���� ���� �� � G(H�& ,+� ���� �������� �� ���� �� ����� ����� ���� ��� �9 ����� ���� ���� ���� �� �� � ����������� ���� �� ������ ����� 7 �� � ���� "AAA8� ���� ���������� �� ���� �������� �� � ��� �� ��� G+EG+���� � ��! �� ���� � G(H�& T��; � ��;E��; ���� ����

��&�3 ����� � ��������� ��!��� ��� ������ �1����� ��������

+ ��������� ,G; ���� ���� ��� ������ �! �� �� �� ���������������� &� �� ��� ���� �� ���� ��� � ��! �� �� �� ������� ��� ��� �� � ����� ���������� ������� �� �� �������� ����� ��� ��� � ��� ������������� ��� ��� � �������������������� ,G; ��� �! �� ���������� ��� � �� �� ����� ���� ���� �� �! �� ! � � ������ ���� �� G(+ ������ ����� (� �� ����� � ���� �� �� ����� ������� ������ ����� ���� �������� ���� ��� � ��� �� ���� ��� ������� �! �� �� �� ����� ����� �� �� ����� ���������� ���� ! �� �� ���� ��� �� ������� ���� ��� � �����

������� ���� � G(H�&���; ���� ��� ������ �� ������� � �����( ��/� ����� �� ��������� ���� ���� � ,G; �� ��! ��

�#3

�����&%# ����<���;(#(��"# �����< 4# ���� �3#( $�� A���� 3����� "����������� . ,�--0/ +*18�K5��� ># U�������"#3������ # '���� '� >�������� 0 ,�--2/ �02.1�0+9�

'����� �A# )��� 5 #������� '�# A��� )# >����$��� (# %���;# ����� A�#������ A� ��� 3�� .�,�999/ ����1���*�3 ���� ��� ����� �� ����� ����� ����� �� ���� �� �� ����� ����� ����������# ������ ����������������� ���������

���� �# 3���� )$� ��� 3��.9 ,�--*/ +�+91+�+*�

3���� 4A# )�<� >#)������� �(� ��� 3�� .�,�---/ �*.�1�**��

�������� �� ������ ����3 ������ ���� ��� ������������� ������������ ��� ��������� ������

Page 169: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� ������������ �� �� ����� ����� ��� � ��! �� (;�,+� ������� 7������ ��*�*�$8 ���� G(H�&���; ���� ��� ����� ����� ! ������ ���� ������� �� ,G;� ���� � �������� ��� �������� ���� � ����� � ������������(� �� ����� � � �� ��� ������� ��� �� ,G; ���� 7����

:A8� + ��! ���� ,+� ��� ����� �� ��� �� �� ��������������� (� �� ����� �������� 7��� � 5#� ��� 5"�8 ����������� ���� �! �� ��� � ���� �� ���� ������ ��� �� ������ ����� ��� �� ��� �� ���� 7��� � :" ��� :�� ������ ��*�*�"8�.��� �! �� �� ������� ���� �� ����� ���� �������� �� ��! �� ! � ���� ���� G(+ ��� �������� �� �������! �� ���� ��� �� ,+� ���� � �� ����� �./ "$:A�5A���� �� ������� ,G; �� � ������� �! �� ! � ����� ����� �� ������ � � ����� 7��� 5#�8� +�������� �� ������ � � ������� � �� ��� �� ������ �! �� ��� �� ����� �����7����� �./ ""$5�$58 �� ������� ���� �� ,G; �� � �! �� ! ����� 7��� 5#�8� 1�� ���� ��� �� �! �� ���� � ����������� �� ����� ���� �������� �� �������� �� �� ����� � ��� ��� �� ������� ���� ������ ����������� 7��� 5#�8� (��� ���� ��� ��! �� ���� � ! ������ ���� ������ �� ������������ �� ,+� ���� � ��� �������� ���� ������� � ����� � ������ ��������������

�&9

0�� )32 � ���������� $7" ������ �� ��������� ����!����

Page 170: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��2 >����� ������������� �&�

0�� ,9�2 $)� �������� �� ��� ����0������� �������( ��9 �-*C�#C� �����@���� ' �G�2I�� ��� ������������� ��� �������� �� ���!��� ����

��� $7" �� !������ ��� ���� � �� ������!��� ������ �� ����������� ������ #4!� � ���!����� ���� � ��������� ���� ��� �������

0�� ,9!2 7�)�K������� ���� � ���� ������!��� $7" �� ������ ��@���� ���������� ���� ��� $)� �������� � ����� #4��

Page 171: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ����������&�

0�� ,��2 $)� �������� �� ��� ����0������� �������( ��9 ��-#�-#� �����@���� ' )�<G�2I�� ��� ������������� ��� �������� �� ���!��� ����

��� $7" �� !������ ��� ���� � �� ������!��� ������ �� ����������� ������ #�!� � ���!����� ���� � ��������� ���� ��� �������

0�� ,�!2 7�)�K������� ���� � ���� ������!��� $7" �� ������ ��@���� ���������� ���� ��� $)� �������� � ����� #4 ��

Page 172: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��2 >����� �������������

��� ��������� �� �� ,+� ����� ��������� ���� ���! �� ��� ����� ������ ���� �� (; ������� ��� ��! ������ ���� ������� &� �� ��� �� �� ����� ������ �� ����� ����� ��� ���� �� ��� �� � �� ����� � � �� ��������� 7���������� ��� � ������ "�B�5 ��8 �� ��� �� �� ������� �! ��� )���� �� G(+ �� ���� ! � ������ ��������� ���� ��� � �� � ��� ��� ���� �� ���� ! � 7� ���"68� (� �� ��� � �������� � ���� ����� �� �������! �� ������� ���� �� ,G; �� � ���� � ������� �� � ����� ����� � � ����� ���������������

��&�& ������ �� 4'?4' �1����� ����

�� ����� ������� �� �� � �! �� ���� ���� ��� ��� �� ���G+EG+ � ,+� ����� ��� �� � �� ������� (� ������ �������� ��*�*� ����������� �� ������ ������ �� ���� ��������� ��� ���� 7����8 ������ �� �! �� ���������� ��� � � ���� ���� ����� ��� ����� ���� ���������� �� ����� �! ��������� �� ��������� (� � � �� ������� ������� �� ���� ������������� ���� �� �� ������ ���� ��� ��� ���� ����� ���������������� (���� � � �� �� ���� ����� ��� � �� �� ����� ���� �������� ���� ���� +.T�.+� 7�������������� E�! ��E���������8 G(+ ��� +��(0 7�����������������8 G+��(- ���������� ����� E�

�&#

0�� ,��2 7�)�K������� ���� � �� ������!��� $7" �� ������ ��@���� ���� ������������

Page 173: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

+! �� ���������� ���� ��� ��� �� ��� G+EG+ � ,+�������� ��� � �� �� �� �����

� G�� �� ���������� �� �� �! �� 7������ ��� �� ����� ����� ��� �� ������ ����8 �� �� �������! �� ��� � ��� ��� �� � ���� ! � 7,/��� � ��!"AAA8�

� G�� �� ���������� �� � ���� ����� �� �! �� �� ������ ���� �� ��� �� ���� �� �� �� �� ��� ��� ������� �� �� ���� ��� ���� ������ ���� �� �� ����� �� ���! �� 7/������ �� ��� ��� ������ ���� �� ����� ���� ������� �! �� �� �� �����8� � ����� ����� ����� �! �� ��� 7G��� ��� 1���9 "AA68�

� �� � �������� ������� G+EG+ ���� 7.�� � ��! "AA69O��� � ��! "AA$9 ,/��� � ��! "AAA8�

+! �� ���������� �� ������������� �� ������������� ���� ����� �� ���� ���� ��� �� � ��� �� ����� �� � ������� ����� ��� ������� �� ������� � ����� ��� � ��� ��������� ����7+ ��� � ��! "AAA9 +�����/� � ��!� �###8�+ �� ���������� ��� � ��! �� ���� (; ������� ��� ,+��

;�� 5� ��������� �� ,+� ���� � �� � ����� ���� ���� ����� ������ &� ���� ���� � ���� ����� ��� ��� � ���! �� ��� � ������ ��� �� ���� � � ����� ���� �� ������ � � ��� ��� �� ������� �����

(� ���� �� � ��� ������ � ������ ! �� �� ������� � ��� ������� � ����� ��� � /���� ����� ������ ���� ��� ������ � ����� ������� ���� ��� �� ��� G+EG+ ����������� � �� �� �� ,G;� � ������ ��$���

( � �� ���� �� ����� ������������� �� �� �������! ����� ��������� .+�� � ���� ������ �� � ������ �! ��� ���������� �! �� ���� ��� � �� �� ���� �������� ,�����! �� ���� ��� � �� �� ���� �� .+� �������� �� � ����������� �� ����� ������� �� �� ����� � 7G���� "AA:8� 7( ,G;���� ������� �� .+� ������� �� ����������� �� �� �� �� ��� �� ��������� ������������� �� ������ � � ��������������8

�&&

>�<��� �&# >������53#3��� �"# 3���� 5�� ������������ �9 ,�---/ 0++�10+8.�

"���"# C��"� ��� 3��88 ,�--2/ 20-9120--�

�� 54# "�3�����< �(#H��� 5A ���� 5 �� ��� "����������� + ,�--2/ -.81-*-KH��� 5A ���# �� 54#"�3�����< �(# �����6 ����� 3�� 8. ,�--+/�2�81�208�

����� ��# (���6� �4#?��6���&# "��6� �#)������ '# ����)# 5������ #3���������� ># (������� &#'����� �A# ������ A#>���'# >����� "3#�������<� �# >������ 5#4���� '� &���� 0-. ,�---/22�1228K ������<� �#(����� �# ������<� �# ��C# �������� 4'� ���3�� .� ,�999/ ��0�1��2��

;�� � 3�� ������� ��� ��������# � �������� �� ��������� �� �� �������� ��������� � ������ ��� �� ������ �� ���� �� ���� ��������� � ���<� ��� ���������

"���"� $���� )�� ���� ��,�--8/ 2-212-+�

Page 174: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��2 >����� �������������

��&�-"� �+� �1������

����� �� � ������ ����� ������ ����/� �� ��� �� ������� �� �� ����� �� ������� ��� �� ��� G+EG+ ����� ��� �� ������ �! ����� ����� ��� �� � ������ ����� ���� �� � �����! ����� ��� �! ����� �� G) ����� ������� G�� �� ������! ����� �� �������� ���� ��� ! �� ��������� �������������� ���������� �� G+EG+ ��� �� ��� ������) ���� ����� �! ����� �� ! �� �� �� ����� ���� �����

���� ��� .+�������� ����� � �� ����� � � ����� � �� ������ ���� �� ��� �� �� ���� �� �� ������� �� ! ����� �� ���� ��� �! ��� � ����� ���������� ; ��� � ���� �! �������� � ������ �� �� ������������� �� ����� �������� ��� �� ������� �! ��� ������� ���� �� �� �������� ��� ��� ��� ������ � ����� ��� ��� �� � �� �! ����� �� ������� ����� ������� ����� �� �� � �� �� � �� �������� ����� ������� 7% DU���� ������ ���� ��������8�

�&(

0�� ,�2 7�2���$)� �������� �� �����0������ �������( ��9 �#&3�* ����0������ ��� �� ���� ����� �� � � �!����� ��@���� <�L%8%���2���< ����

� �������� : �� !� ����� �������������� ��� ��@����� �� ��� ������ �� ���� ����!���( � ��@�� ����� �� !�������� ��� ���� ������� �� ��@�����

Page 175: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� ����������� ����� �� � ����� �� � ��� �� ��� G+EG+���� � �� ��������� �� ��� �! ��� �� � ����������� � �� �� ������� � � ��� � ��� � ������ ��� �� ���� � 7��� ����"� ��� �8 ������ ������ ���� ��� � ������� )���� �� ��� ��� &� ���������� �� ����� �� �� ��� �������� �� ���� �� ��� ����� ��� �� ������ ������� ���� ������ � ���� �� �� �� ���� �� � ������� ����� �� ������ � ���� � ! �� �� � ��! �� ������ ������ ��� ����� ������&� � �� ��� ������� �� �� �������� �� ���� ���� ��� ��� ���� ���� � ��� � ��� � ������������ ;� �������� �� ���� �������� �� �� ���� ������ �� �������� ��� � �"� �� ����� ��� �������� �� �� ����� ����� ��� ��� ���� &� ���� ����� �� ����������� ��� ��� ��� � � � �� ���� �� �� ���� ������� ���� �� �� �! �� �� �� �� �� ��� ����)���� �� ���� �� ��� ��� ��� ��� ��������� �� ����

������� �� �� ���� �� �� ��� �� ��� � �������������� �� �� ������� � ���� �! ����� �� �� �� ��������� �� ����������� �� � ��� �� ��������� ��� ��� ���� ��� ���� ����� ������ �� ���� �� �� ��� ��� ��� �� ��� � � ��� ������������ �� �� ���� � �� ��������� ��������������( ��� �� ������ �������� ��� �� ��/� �� ���� �

���� �! ����� �� ���� ��������� �� ���� ��� �� ����� ����� �! ����� �� .+& ���� �������� ��� ������ �� ) ����� ������ � �� ��� �� "AB:� �� ������ ������ �� ������������ % � � ����� ��� �! ��� ���� ;(%����� ! �� ������� �������� 2) �� � ��! "AB:8� &� ���� ������ �� �� � ����������� ������������ �� �� ������ �� ��������� ��� ��� ����� ����������� ���������� ��� ��������� �� ����� �! ���+����������� ��� �� ��� G+EG+ ����� � ��! �� �� �� ������������ + ��! ���� �� ����� �������� ����� ����� ������������� ��� �� ��� �� ��� G+EG+ ����� �� �� ������������������ ������ � ��! ��� ���� ������ ������ �� ������� � �� ��� ����� 7��� ��� � ��! �� ������ ���� �� ��� ������� ������� ��� �� ����� �����8� 0� �������� �� ������� ����� ���� ����� ��� 7�������� ���������� ����8� �"� ��� ������ �� "6 ��7��� ��� �� ����� �� �� ����� ���8 ������ �� ������� ������� �� ������ ��� ����� ������� 7 ���� �� �������� ���� � �"���� ��� � �� ����� � ������� ����8� )��� �� ����� ������� ��������� ��� �� ��� ��� ��� �� �� � �����������)���� ���� ���� ����� �� ����� ��� ��� � ����� ��� ���

��� �� ��� G+EG+ ������� � ! �� �� ��� ������ ������ �� ������� � �� ����� ��� � ������ �� �� �! ���� �� ���� ����� �� �� �������� ����� ��� � ��! �� �� ��������� ������ �� �� �! �� �� �� ���� ��� �� "6 ���

�&)

�����%# H��� 5A ���#����������6 5# C������ �#���� 3A� >��� &�� ����� ���7�� *0 ,�-*8/ 8�0018�0.�

Page 176: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��2 >����� �������������

( ����� ������� ������ �� ����������� �� �� �������� ����� ��� �� ����� ��������� +����������� �� ����� �� ����� �������� �� ����� � � �� � "4" ���� �� ":�4"B� �������� � ���+ ��! ���� ��� ������ ���� ���� �� ":�4"B� ������ �� ����9���� �� ���� ���� ��������� ���� �� ������� �� � �� �� ��������� ��� � 1�� ���� �������� �� ��� �� ������� � ��� ���� �� ��� G+EG+ ������� ��� �������� ��� �� ����� �� ��������� ���� ������ ���� �������� �� ��� ��� ��� ��� � ������������������� ��� �� ����� ��� ��� ��� ��� �������� ����������� ������ �����

1��� ��� �����/� ������ ���� ������� � ��� ����������� �������� �������� ���� � �����! ������� ��������� ��������������� ������ ��������� �� �� ����� ��� 7���������N���� � ��! �##"8� �� ����� ! �� ��� ��� �� ��� G+EG+����� �� � ��! ��9 �� �� �� ���� ":�4"B� ����� ������� ����� �� ����������� ��� �� ����� �� ���� �� "B� ������� ���� � ����� �� ������������ ����� � ������ ���������� ����� ��� ��� � ����� � ������������)���� ���� �������� �� ��� ����� �� ����������� �����

��� ��� �� ����� ����� ��� ����� ������ �� �� ��� �����; ����� ���� �������� � ���� ��������� �� �'������ ������� ��� �� ������ ����� ��� � ������9 �� �� ��� ��������� �� ���������� ���� � ����� � �� �� G) ����� �������( ��� ��� �� ����� ������������ �������� ��� �� ����

�� ������ �� ����� ����������� ����� ��� ����������� ��������� �� ��� ���������� �� ��� �� ��� G+EG+ ������ ������������� �� �� ����� ����� �� �� ������ � ���� ��������� �! ����� ����� �� ����� ���������� ��� ���� � ����� ��� ������ ����� ���� ��� �� ���� 70��� � ��! "AAB8� G ������� ���� �###� ���� ������ � ������������ ������� �� ��� �� � �����! ����� �� �������D� �� ��� �����/� ������ � ������ �� ������ � ����� ��

��� ���� ����� ���� �� ,+� ��������� ���� ������ � ��� 7������� ��*�*�$8� H��� ������ �� ����� ��� ������ ��� �� �������� ��� � ����� ����� ���� ���� �����! ��� ��� � �� ��� � ���� �! ������ �� ���� ��������� ��� ���������� �������� �� ������ ��� ����� � �� ��� ���� ������ � �� �������� �� � ���� �! �� �����������(���� ������������ ������� �� � ���� �! �� �������� �� ��

������������ �� ����� ������ ���� ����� �)+ ���� ,����� ! ������ �)+ �� ����� � ���� �� �� ������������ ������� ������ �� ,+� �������� ������������ ���� ������������ �� �������� �� � ��! ���� ������� ���� �� ����� ���� 7+���� ���! "AA59 ����� � ��!� "AA58� ��� �)+ �� ����� � � �

�&,

�����6�"# 5��6@��<� >#(���� C�� ������������. ,�--8/ -2+1-+0�������<� �# 3����������:# ��C# �������� 4'#$������ )# C��"# "���"�A���� 3����� "��� �������� �� ,�--./ �9�+1�9�2�U�� 5# ������ 35# ?���� G�A���� 3������ "��� �������� �� ,�--*/ �9-1��8�

7�������5���� �#&����� '# 3������������� �#?���"# C��C� >��������� ,�99�/ 88*18*��

A��� 4�C# ����� ?�#���������&# $����< C����� 5�"��� ������� A���� �.,�--*/ �++1�.2�

"��������"# U�������"#5��� >� ��� 3��� .�,�999/ 292.129+.�

����� )# (��6�<����� %#"�6�� �# 3������� ># 4�������� A# 5��� C# )�����5���"# >����� �53� ��� 5"��� ������� ��� >��� �8-,�--./ ��.1�29�3������ "�# :�� �� ��� #� 5��� �>5"� A���� ������"��� �������� �� ,�--./��.�1��.*�

Page 177: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

�� ������ �� ��� � � ��� �� ��� ���� ����� ����� ��! ����������� ���� �� ����� ����� 7��� ���������� ��������� ������ ��� ��� ���������� ������ �����9 +G( ��� +,( ��������8�.��� �� ��� ���� ����� �� ������� ������ �� ���� �� �� ��� ����� ���� ����� �� ��������� �� ���� ������ ����� ��� �������� ������ 7�� ����� ����� �� ����� �� ��� ����8 ��� ���� ������� �� �� ����� ���� )��� ���� �� ������� ��� �� ������ ���� ����� � /���� ��� �� ��� ��� � � ���� �����������(�� ���� ��� ���� �� ���������� � ���� �! ����� �� �������������� ���������� ; ����� ��� � �� ��� ��� ��� � ������������ �� ������ �! �� ��� � ����� ���/� �� ��� ������� ���� ���� ������ �������� �� �������� � ������G+EG+ ������� ������� ��� ������� �� � ���� �! �����7� ��� � ��! "AAB9 D���� � ��! "AA59 )��� � ��! "AAA8�&� ���� ������ �� ������ ������ � �� ��� ����� ��� ��

������ �� � �� �� ����� ��� ����� � ������� ���� � ����� � ������������ 7��� 5*8� �� ��������� � ����� � ����������� ������� �� ���� ���������� ������������ ��� ������ �! ������� �� ��� �� ��� G+EG+ ������ �� *# �������� ������ ���������� ���� ��� ������ �� � �� �� � �� � �����! ������ �� ��� ����� �)+ �� ����� ������ � ���������� ���� �� ��������� ������������

� ��� ��� ��� ����� ������ �� �! � � ����������� ����� ����� ���� �� 0, ������������� ���� ! ��������� ������������ �� ���� �� ������ ������

� � ��� ������ �� �� ����� ��� ������ �� ���� �� �� ��� �� � ��! � ����� ���������� ��� ��

���� �� ����� ���� ��� �� �� ��������� ���� ������ �� ������ �� � ������ �������

�� �� ��� ����� ������

�&/

N

O

O

O

O

CH2

N

Peptide NH2Peptide N

H

O

CH2

N

N

O

O

O

O

CH2

N

Peptide NH2Peptide N

H

O

CH2

N

O

0�� ,#2 :������ ������ ��� ������� ����0��������� ���� ��� !���� �8) ����� ������ ;����������� ������ ��� ��� )7� ������ 2����������� ������ ��� )$� ������

$� ����� ���� ��� ����������������� ��� ����� ������������� � �������� ��� �����

Page 178: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��2 >����� �������������

; ����� �� ����� ����� ��� ��� �� �� � ����� �� ������ �� �� ��������� ������������ ������ ��� �� ����� ��� �! ����������� �������� ��� �� ��������� ( ����� ���� ��������� �� �� ����� ��� � ��! �� �� ����� ��� � �� ���������� �� ������������ �� ����� &� �� ����� ���� �������� �� �� ������ � ��� �� �������� ������ ��� � ������� ���������7 ���/ �� ":�4"B� �������8� &� ��������� �� ����� ��� � �������� ��� ����� ������ �� �� ��� 7��� �� ����>� ���� �����'�� � ������� ������� �� �� � �� �� �'�� �� ����������� �� ���� ������8�&� �� �� �������� �� � ���� ���������� �� �� �����

�! ��� �� ������������ �� �� ��� ������� ��� /������ ������ ��� �� �� ����� � �� ��������� ����� �� ������������������� ������ �� �� ����� �! ����� �� � �� &����� ��� 0���� ; �� 7G %�����N���� 1 N����� � ����� % ������ ,�����8 ���� ��� ����� ��� � ���������1��� ���� �� ������ ������

� �� �������� ��� �� ��� �� ������ � � ����� 7������������ ��� ������ "��� ���� �8� ��� �� � ��� �� ��� G+EG+ ���� � �� �������� ��� �� ����� �� �� �" ������� ���� 0� �������� �� ������� ����� �� �� ����� ��� ���� ���� � ���� ������ � /����� 1��� /������ �� ���� �� �� � ����� 7��� ����� ���� ���� Q ��� Q " ���� �� �������� ������ ���� "" ] ��� :�8� �� �� ������ ������ �� ������ ��������� ��� �� ���� �� �� ���� � ���" ��� ���� � ����� �� "5$�" ��� &� �� ������ ����� ������� ��������� ��� �� ���� �� �� ���� �� ��� �" ����� ����� �� "65�" ��� (�� �������� �� �� �"���� �� ������ �� �� ����� ��� ��� ���� �� � ������ ������� ������ H �/��� �� �� ��� �� ��� G+EG+ ���� � �� �������� ��������� ����� �� ����� ��� �� ������ ����������

� ����� ������ /������ �� �� �������� ��� �� ��� ������ ��� �� ������ ������ ���� ��� �� �������� �" ����������� �� �������� ��� � ������ � ��������� ��������� �� �� ���� � �� �� ��� ����

�&3

Page 179: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

;�� 56 ��������� �� ���� �� ������������ �� �� ������������ ����� �� � �� ��� ����� ������ (� �� ����� �� ���������� �� �������� ��� ������ ������ � ��� � ������ ����� ���� �� ;�� �� ����������� ��� ��� �� ����� ����� ����� ����� �� �� ���� � 7����� ����� ����� �� "$5"�:8� )���� �������� ��� ������ � ������ ��� ��� ��� ��������� ���� �� �" ��� �� ����� �� "5$�"7������8 ��� ���� ������ ��� ��� � �� �! �� ��� � ������ ��� ���� �����7"5$�"� �6:��� ***�*� 6B#�*� :�5�B� :B6�5� B"*�:� A6��A� "#$5�"� ""5"�5�"�B:�#9 ���������� �� �� �! �� 0(+;;-..����8 ���� ������� �! �� �� �� � ������ ������������� �� ����� ������� ������� ��� .+� ��������� )���� �� �� ����� �B$ �� ����� ������ ��� �� ����� ������ � ���� ��� �� ����� ��� ��� �� ����� ��� ����� �����

�(9

E G V N D N E E G F F S A R

Underivatised

ymax y

1

x2

187.2

333.3

480.3

684.7

813.6

627.8 942.9

1057.1

1286.0

1369.0 1459.5

1771.7

100

80

60

40

20

500 1000 1500

500 1000 1500

ymax

Derivatised

Tag

x2

100.2

324.4

385.4

480.5

684.8

813.9

522.5

942.8

849.7

1285.6

1442.0

1571.6

1056.1

100

80

60

40

20

0�� ,&2 $������ �� 7)�7) ����������@����� ���� � ���� � @������� � �@������� ���� ������ � ;���� ��� '�����0������ G% �I���!���������� !

5���! ������ �� �F6 #,*�36( ������� ����0������ ' G% �I���!����������! 5���! ������ �� �F6 ,&C�#6�

Page 180: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��2 >����� �������������

���� ���� ���� � �� �� ���� � �� �� ���������� ��������� ������ ���� �� ����� ":AA�: 7�� ��� ����� ���� B6A�58�;�������� �� ���� ����� ����4

� ":AA�: < ���� �� �� ��� 7"�B8� ���� ��� �� �������� �� ������� ����� �� �� ���� ��

� "$5"�:� ���� ��� �� ����� ����� ��� ������ �� �� ����� �� ;�� ���� ����� �� �! �� ��� ���� �� � �������� �� ��� ��� ���� ��� �� ����� ����� ���� ������������� �� ���� �� �� ����� ���� �� �� ��� �� "66��#� � ������� �� "�A�: 7-� � .8� �� � �� ����� ������ ����� �� �� ��������� � �� �������� ��� � �� � �� ����� �����

� �� ����� ������ �� �� ��� ��� �� ����� �� "*B$�"� ������� �� $:�A 7-��� -8�

� �� ��� ��� �� �� ��� �� "�B$�:� � ������ �� AA�: 73��� 38�� �� ����� �� �� ����� ��� ��� � ������� �� �� ��

���� � �� �� ��������� ����� 7��� �� ��� ��� �� ���! �� �� �� ������ �� "5$�"8� ;�� �� ����� ��� ������ ����� �� �� �! �� ��� �� �������

� (� �� ��� ������� � ������������ �� �! �� ������� ��� �� ����� ��� ��� � ���/� ���� �� ��������� ����� ���� 1 ������ ��� �� ����� ��� ���� ���������� ��� ��� � -� 7.� "�A ��8� �� � �� �" ��� �� ������ � ��� �� � ����� �� �$5 ��� �� ��� �� ����� ������ ����� ���� �� �" ��� �B �� ���� 7�� �� �� ����� �� ����� �� "##�� ��8�

� �� �������� ��� ��� ��� � ������ ��� ���� ������(� �� ����� ��� ��� ����� �� ������� �� ��� ������ ��� � ����� ����������� �� ��� ��� ������� ��� �� ����� ��� ��� � -�� 7-� $5 ��8� �� � ���������� �� $5 �� �� �� ��� �� �$5 ��� ����� *"6 ��� ���� ����� *"6�6 ��� ��� �� ����� ������ �� ��� ��� ������� ��� �� ����� ��� ��� � 3�� 73� AA8� �� ����������� �������� ���� �*� �� 6"*�� �� ����� ����� ����� ������ ���������� �* ��� �� *B$�6� ���� ����� �� ������ ��� �� ����� �� �� ������� ����� ����

)�� �� ������������ ��������� ��� ����� �� ����� ���� �! �� �� � ������ �� �������� �� �� ������ �� �� ������ ��� ��� ������������ �� �� ��� ����������� ��� ������ �! �� ��� � �������� �� ���� �������� ������ �������� ���9 ������� �� � ���� �! ���������� ������� ��� ����������� ��������� �� � ���� �! �����

���� � ! �� ��� ��� ���� � ��� �� ��� ��� ��� �� ��� G+EG+���� � ����������� �� ������ ���� �� �� ���� ��� �� ���

�(�

�� ���� �� �� �� ������������� �� <����# ��������������� �� ��� ���� �� ����K �� ������ <���� ��� ��������������� ���� ���������

Page 181: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

����� �� �� ����� ���� �� ���� ���� ������ ���� ������� � ���� �� �� ���� ��(� ����� �� ���� ����������� �� ��������� ���� 7&������ �

��! �###8� ( ��� �� ��� G+EG+ ���� � �� � ����� �� �� ���7�"65 ��� �E' "#5��:8 ��� ��! �� ���� � ! �� ��� ��� ��� 7���� 5$ ��� ���� "�8� �� ������ ���� �� �� ���� � �� ������)���� ��������� �� �� ����� ���� �� ���� �� �� ��� ��� �� ������ ��� �� ����� ���� �� �� ����� 7�"6:<"�B P �#"B8�)���� ���� ���� �� ����� ���� �� ���� ��� �� �� ���� ��������� � � �� �� �� ��� � � �� "#" �� ���� ���� ����9 ������� �� ��������� �� �� ����� ����� 7�� �� �� �� �� �� �� ��� ��� ������ ��������� �� �� �������� ���8� ;�� ���� ��� "5 ����� ���� ������ ��� � ������ ��� �� ���� �� �� �� ����� ����(� �� ��� ��� � ������������ ��� ���� ��� � ������� ���� ����� ����

��!� ��2 "����� �� ������ �!���0�� � ��� ������� �� �������� �� ������! ������ ������� �F6 �4#��*�

*� A���+�� ��B

������ *� A���+�� ��B

������

�" �"�� *:"�* + ���* 656�$ &EH �*�6 :#*�6 . �6�$ 5":�: &EH �$ :"*�" +�: B#*�$ + �: 5##�6 +�5 BA#�5 + �5 B"*�" &EH�B "##$�: � �B A�5�6 ��A ""*6�A . �A "#"6�� +�"# "��#�5 + �"# ""6*�# .�"" "**6�: � �"" "�$5�: ��"� "665�6 &EH �"� "*66�6 +�"* "$*6�B + �"* "6*"�5 +�"6 ":�"�$ + �"6 "$66�A &EH�"$ "5*6�5 &EH �"$ ":56�6 .�": "B�"�6 + �": "5B5�* &EH�"5 "A"B�: , �"5 "B56�B +�"B � �"B D

; ���� �� ��� �� "B56�B �� �56 �� ���� �� ���� �� �� ������� �� ���� �� � �������� ������ �� �� ��� ���� ��� �� ��� ��� �� ��� �� ���� � ���� �� ������ ����� �� ����� ����������� �� � �� ������������ ����� ��� ����� � �� ������� ������� �� �� ����� �! ��� �� ��� ��� ���� ���� ���� �����

�(�

������ $# 3������>���&#"����"># &��� $5>#A�6����� # ������� '�5 )�� 3��� �.+ ,�999/2992*1299+8�

Page 182: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��2 >����� �������������

�������� �� �� ����� ���� �� "5B5�*� � ���� ������ �� B5�$7+� +8 7�� �� �� �� ����� ���8� ;�� ���� ����� "� ����� ��������� ��� � ������� �� � �� ���� �! �� �� ��� ������ �� ������������� �������� ��� ���� D+� ��� �� ��� �� � ���� ��*:"�" 7�56� ���� �� �������� ������ Q B58� �� ��� �� ���� ���� ������� ����� �� �� ���� �� �� ��� ����� ��� �� �! ������ ���� ����� 7� �� ���� �� ��/��� ���/���� ��� "B568� (�� � �� �� ��� "B ��� ����� ��� �! ��� ����� �� �������� ��� �������� ���� �� �� ����� ���� ��� �� ��� ������ ��

+����� ������� ��� �� ����� ����� ��� �� � �����! �� ������ � ������������ ����� � ���������� 7+/������ ���! "AAA8� ��� ������ �� �� ���������� ����� ��� /�������� �� ������� ��� �� ������ �� ���� ��� ��������� ���� ������������ ������� �� ����� ����� ��� ��� ��

�� � ����� �� ����� �� �� ��������� ������������ ������ ����� ����� ��� � ! ����������� �������� ��� �� ��������� (����� ���� �������� �� �� ����� ��� � �! �� �� �������� � �� �������� �� �� ������������ �� ����� ; ��� �� ������� ���� �������� �� ������� � ��� �� �������� ��������� � ������� ��������� 7 ���/ �� ":�4"B� �������8� &���������� �� ����� ��� � ������ �� ��� ����� ������ �� ������ 7�� �� �� ����>� ���� ���� �'�� � ������� ������� �� �� � �� �� �'�� �� ����� ������ �� ���� ������8�

�(#

T P S L S S L N S E D S S I E I S K

400 600 800 1000

1200 1400 1600 1800 2000

E 04+

E 03+

1220.7

1257.6

1334.6

1344.4

1534.8

1621.5

1674.4 1874.8

1918.6

1787.3

1718.8

1786.6

1447.4

1431.7

ymax 1+

1.19

1.48

x2

100

80

60

40

20

361.3 508.2 603.4 664.3

795.2

879.2

927.4

959.7

1072.6

1065.3

1015.1

100

80

60

40

20

0�� ,(2 $������ �� 7)�7) �������� �� ������! ������ ����0������ �� ���� ������� �F6�4#��*�

�<���� 5# 3���� 5# '�� )#�� � 5# 4��� # (�������� 5#)����� )� >���� 2. �� ��"�������� "��� ��������� ��� ��� ������# ����,�---/�

Page 183: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

��(4����� �� ������� �����

(� ��� �� �������� ��� �� ������ �� �������� ������������� ��� ����� �������������� (�� �� �� �������� ! ����� �������� ��� ������� ������� �� ����� ��������������� � ���� �� �� ��� �� ������ � ������ ��� �������� �������� ����� �� ���� ������ ��� � ��� ��� �� �� ����� �� ��������� ���� ��� � �������

��-�����4'

&������������ �� ������ �� ���� �������� ������ �� �������������� �� ���������� �� �� ���� �������� �� ������� �������� 7��� 5:8� �� ������ ���� ������ ���� ���������� �� ����� �� �� ��� ������� ;�������� �� �������������� ������� ������ ������ �� �������� �� � ����� �� ������ �� �� � ������ �������� �������� �������� ����������� ���� +������ �� ����� ����� �� ������ �� �������������� ���� �� ����� �� ����� ���/� ��� ��� ���� � � ������������� ��� � ��! ���� ������ ���� ������� �� ������ ������������ � ������� �� G(H�&���; G+� �� ����� ���� ������� ����� �� �� ������������� ,G; � � ������ �� � ����� ����� ����� ������� ����� ���� ������� ���� ����� �� ������� ��� � ��������� ���� �� ���� ��� ���G(H�& 7���� ���� �������� �������8 ���������� ������ � ��������� &� �� ����� ��� ����� ��� ��� ������ � ��� ��������� �� ��� ����� �� ��������� �������� )���� �� �� � �� �� ����� � � � �� ����� ���� �� ������� ���������� �� ! ��� ��������� �! ������������ ���� ��� � ��� �� ��� G+EG+ 7� G(H�&�,+�8���� �� ����� &�� ����� ���� �� ����� � ������� ����������� ������ �� ���� ������� �� ��� ��� ������ � ������� ����� ���� �! ��� ���� ���������� �� �� ������� ��� ���� �� �� ��� ���� ���� ������� �� ����� �������� � � ���� ��.+� ������� ��� �������� �� � ���� �! ����� �� �� /�����! �� ��� � ������� ���� ����� ���� �� G+ �������� ����������� ����� �� �������� G+EG+ � H �G+EG+�

�(&

Page 184: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��+ "����� �� ������ ��� ���

(���� �� � ������ � ����� � �������� �� �� ������� � ��� ��������������� ����� ! ���� ��� ������ ���� ���������1��� ���� �� ��� ��� �� � �������� ��� ������ ����������� ��������� �� �� �� � ������ ��������� � �� � ����� ����������� �� �� ������ ���� ����� ���� ����������� �������� �! �� ��������� �� ������������ ��� ��� ��� � �� �G(H�& ���� ���� ��� �� �� � �� �� ������� 7D� �� � ��!�###9 +�����/� � ��! �##"8��� �� �� ������� ������� �� D� �� � ��! �### ������ ,+�

�� ��! � ����� �! �� ���������� ��������� � ������� ������������� �� �� ����� ���� � ; �� �������� �� �� ������� ����� � ������� �� ������ �� � ����� ���� ����������������� ��� ��������� ����� �������� ��� � ��������� ����������� ������� ������ ��� � ��! �� ���������� ,+�� ���� (; G(H�&� ����� �! �� ���������� �� � ��! �� �� � �������� ��� ���� ������� �� �� ,G; ����� �� ������ � � � �� ������ � ����� ��� � ������� ���� 7��� 558��� ����������� �� G(H�& ,G; ��� ,+� �! �� ����������

���� � ����� ���� ��� �� �� �������� �������� ������� ������� ������� ������ � � ����� ������������� 7-���� � ��! �###93������ � ��! �##"8�

�((

2-D & 2-D &

Spot pick, destain, Spot pick, destain,

MALDI PMF MALDI-MS PMF&

sequence analysis

Unsuccessful

Successfulanalysis

Successfulanalysis

Desalting step with

Peptide sequencing usingESI-MS/MS

(a)

(b)

0�� ,)2 B��/� �� ��� ��� ������������ ��������� ��������� ! ��� � �������������� 5�6' ��� ���� ��������( 5!6 ' �� ���� ���������

4����$# (�� "># %����"#'���� A�# ��� H# )���"�#)� 4)� ����������� ��,�999/ ��+�1��8+�������<� �# ��� �� �#(����� �# ������<� �#)��< ># ��C# �������� 4'���� 3�� .0 ,�99�/�-�.1�-�8�

'���� 4# ������� (#����# :���<��<��� 5�5 )������� .* ,�999/�+-1�8-�:����� ))# )��<��� �#����# �����< )#3����������'#:���<��<��� 5# '���� 4� ����������� �� ,�99�/��921���0�

Page 185: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ����������()

0�� ,,2 $7" �� ��@���� �����������@����� ���� � �� � �������� ��� ���!������ ������ ������������� ��� ��� ' $7"( ���� ��� ' $)� �� �� �� ����� ���� ���$7"�

Page 186: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��+ "����� �� ������ ��� ���

��-��>��4'?4'

�� ����������� �� ��! �� ������������ ��� �������� ��������� �������� ��� � ���� � ������� �� ����� ���������(� ����� �� �� ������ ��*�* ����� ���� �������� ����� �������������� ��� ������������� �� ��������� �� ������ ���� ��0� ������� ������ ��� �� ������ ��/��� �������� �� ��������� ��� �� ������ � ����� ��� �� ��� ������ ������� ����������

��-���� 4������ ���� >��4'?4'�� ������� �� �������� �� ���������� �������������� ����������� ��������� &� � �� ����� �� ����� ���� �� ��������� �� � ����� ������ � �� ������ ��� � 0, ),H ��� ������ �� ���� �������� �� � ����� ����� ��� �� ��� G+EG+ ����� � ��! �� 7G� ����/ � ��! "AA59 H��/ � ��! "AA58)���� ���� ���� ����� ���� ���������� ������ ���� � ����/������ ���� ������ ���� ���� � ���� ����� ��� � �� ���� ��G+ ���� ���� �� ���� ��� �� ������ �� ������������ )����� ���������� ������������ ������ ��� �� �������������������� �������� �� ��� ���� �� �� ������������� ��������� ��� ����������� �� ���� ����� �� �� ���� �������7H��/ � ��! "AAA8� &� ���� ����� �� ����� ����� ����� �� ��������������� ��� � �@��� �� ������������� ������������� ���� �� ������ � � �� ���� �������� ����� ������ ���� �7��������8 0,�),H ��� ��� �� ������ � �� �� � ����� ���������� ������ ��� � ��! ���� � �� ���� �� ����������� 7��� 5B8� �� � �� �������� �� ���� ��������G��,&�� ��� �� ���� �� �� ����� ��� ���� ����� ��������� �� ���������� ��� �� 71��� � � ��! �##"8� �� ����� ����� �� ���������� ���� � ��� �� ������� ��� �� ����� �� �������7���������� ����� ������8� �� ��� ������� �� ���������� ������ ��� � �@��� �� �� ��H �G+EG+ ������ ���� ����� ����� �� ������� �� ����� ���� ������� ����� ��� ����������� ������ ��� ��H �G+EG+� ����� ���� ������� �� "6##���� ������ � ��������� ���� �� ���� ��������� �� ��� ������ �� ����� �� ������

�(,

"�3�����< �(# �����6 �"#'��� �# H���'# )���� �#�������# H��� 5A ���� ���3��� 8- ,�--./ .8.1..8�(��< �5# 3�����< # H��� 5A ������� 5 "��� ������� ��� >����89 ,�--./ 09010�8�(��< �5# �� 5# �����6 �"#3�����< # "�6'5#"����� �A# '����< )"#H��� 5A ���� &���� )����� �.,�---/ 8.818*��C�������"># C���� �#H��� 5A ���� &���� )����� �-,�99�/ �2�1�2.�

Page 187: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

(���������� � ������ ����� ���� ��� � ��������� ������������ ���� �� ����� �� �������� ������� +��� � ��! �###9���� �� ����� ������������� �� ������ ��� �� ��� ������������ �� ����������� ���������� ������� �� � ��! �� ��������� � �� ���� �� ���� ������� �� ������������� ������������ ���� �������� ��/ ����� �� �������� �� �� ���������

��� �������� � ����������� ������ �� ���� ��� �� ���� �������������� � ������� �� ���� ������� �������� ���� �������������� �� ���� ������� ! �� �� ������� �� � ����� �� ����� ���� � ������� ������ �������� �� G+ ���� � ��! �� ������������ ����������� �� ���� ��� �� ��� � ��� �� ��� G+EG+ ���� ���� � ���� ���/ �� G+ ��� �� ��� �� ������ �� ��� �������� ��! ������� ��� ���� ��������� �� �� ���� ������� ���� � �� �������� ��� �� ���� �����! �

��-���� -����� ������������� ��� >��4'?4'&������� � ��� �� �� ��� �������� ���� ������ ������� ����� ��������� ��� ��� �� ��� ���� � � �� ������� �� ��� ��� ������� �� ���� ��������� ��������� ��� ����� ��������� �� ���������� ���� ��� ������ 7;���� ��� +����"ABA3 ��� �� ��������� ��� �� ������ �� �� ����������������� �� ���������� ��� �� 2��' � ��! �###9 &�� � ��! �##"8�(��������� ����� ��������� ��� ����� �� ������� ������������ ��������� �� � ����� ���������� ��� � ��! �� �������� ���� ����� ���������� �� ���� �������� 7� �� � ��!"AAB90��� � � ��! "AAA9 ) �� � ��! �###8�

�(/

Digestion IEX RP-HPLCdata dependant

MS/MSprotein

ID

0�� ,/2 B��/� �� ��� ��� �� ���������� 2���������� �� ������ �������� ���� ��!��@��������� �� ��� ����� ���� ����������� �

����� 3�# ����� ��# )��� 5#A������� 5�# �����"$#"�'�� "�# 4���� '#>������� ��� ������������� ,�999/ �80+1�8+9�

%��� �# ����;� &���� 029,�-*-/ �2+1�28K 7�6 � ��&���� 290 ,�99/ 8�018�.���� � �� >��� &�� ���� ���7��� -* ,�99�/ 2+-12.2�&����� '# 4��� �#A������� 5# 3���� 3#C�����"# �@�� ># ���� 5#(����� �# "���"� &����'�� �9 ,�--*/ 281+9�A����� '# ������<� �#A��6 )# C��"# "���"#������� )� &���� )��������. ,�---/ �9091�90������ �# C���"#3������� 5�# )��<����<C>#'���� �'&� &���� &������ 0,�999/ 88�188-�

Page 188: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��+ "����� �� ������ ��� ���

��� ��� � ���������� ��� ������� �� �������� ���������������� ���� ������ H �G+EG+ �� �� ��������� ������������� ������� ������� �� ���������� ��� �� 7-���� � ��! �##�9 )� ���! �##�8� %��� �� �� ������ � ������ ������� 7� ��� 5A8�;������ �������� ���� � �� �� �� � ��� ����� �� �������+������� �� ��( ������� �� �������� ����� ������ ��� ����� ��� ���� ���� ����� ������ �� �������� ���� ��� � ��! ���� �� ������ ��� ���� ������� �� ��� � ������� �� �������� �������������� ;������� �� � �� ������ � ������ �� "� +�+ ,(-.������� ���� ������ ��� ������� �� H �G+EG+� �� ��� � ���������� �������� �*� �������� � �������� �������� ������ �� ������������ �� *:## ��������� �������

��-�3=��������� �������

,������� ����� ������� �� �� �������� ���� �� ������������ ���� �� �������� �� � ���� �� ���������� �� �� ������������� �� �� ��� �������� ���������� ������ �� ���������������� ������ ���� ��� 7� ��8 ������� +����� �� ��� ���� ������ �� ! ���������� �� ����� �������7,��������� � ��! "AAA9 ��� � ��! "AAA8� � � ���� ������ ���� ����������� & (��

�(3

Incorporate affinitytagged protein

Elute complexedproteins

Digest with trypsinand analyse by LC-MS/MS

0�2 ,32 B��/� �� ��� ��� ������ ���������(2��7)�7) �������� �� �����������

'���� � �� &���� 2�+ ,�99�/�2�1�2.��� � �� &���� 2�+ ,�99�/�*91�*0�

>����$��� � �� 5 �� 3����� ��� ,�---/ .-2-1.-+9�;�� H# ����� 4# 3���� %A#3�������# 3���� )$� >���&�� ���� ��� 7�� -8 ,�---/8+-�18+-8�

Page 189: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !������� ���������

$ ����������� ������ ��� 7$�-�8 ���� �����! ��� ���� �� -���� ��! "AAA9 �������� �� ��� ������� �������� �� ������ ��� ����� ����������� �������� ���� 7��� B#8� �� ���� ��� ��������� �� �� ��9 ������ ������ ����� ������ �������� �� ����������� �� ������ ��� ��� ������� � ���/ ����� ��������� ������������ ��� ������ � ����� �� �� ������������ ����� ����������� ��� �� ��� ���� ����� �� ���� �� � �� �� �� �� ����/ 7�����8 ��� �� ���� B � �� �� �� �� ���/ 7����8� �� ������� ! �� ���� � ��� ����� ���� � ������ ��� ��� � ���������� �� ����� ��� ���� ��� ��������� �� ��� �������� ��������� ��� ������� ��� ������ ��� �������� ������� ���� �� ������� ��� ��� �� ������ ������ ������ � ������ �� 0,�)H,H ��� � �� ���� �� ���� �������� �� ��� ���� �� ����� ����� ���� ���� �� ���� �� B ��� ��� �� ���� ���� ����� ������ �� ����� ! ������������� ����� ���� �������������� �� ��� �� ��� G+EG+ ���� � �� ��! �� �� ������� ������� ��� �� �������� ������

�)9

NH

OO

O NH

NHNH

S

O

OX

X

X

X XX

I

OXX

X is either hydrogen (light chain) or deuterium (heavy chain)

Biotin

Reactive group

Label with light chain Label with heavy chain

Combine, digest with trypsin

Affinity chromatography

LC-MS/MS

0�� /92 ���� ����� �� ���/� ���

' �� �># A��� )# '��� ��#$���< %# '� "�#������� A� &����)������� �. ,�---/--21---�

Page 190: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���

�������� ��������� ����� ���

��� �� ����� ��������� ���

��� �� ��������� ������� ���

��� �� ��� ������������ !� �������"����� ���

��� #� ������������ �� ��! ������ � ������ �� �" ��� ��� ���

��� $� ����� ��� � ���� ������� ���

��� �� %������� ����� �� ������"����� ���

��� &� ���� '���� �

��� (� ����� ������ ��

��� )� �*�� ������ ���

��� �+� ,�������� ������ � ��������� �� ����� ���

��� ��� "����� ��-�������� �� �" ���� ���� ��

��� ��� ,� ������� ���

��� ��� ��������� �� �" ,./��*0�% ,� ���

��� �#� ������� ��� � ������ ����" ���

��� �$� �,% ������ ����" ���������� ���

. 0����� �"����� ���

���� ��

���� ,����

�� ������ �� ��� ���� � ������ ��� ������ �� �� ���� �������������� ���������� �� ����

��������� � ���� ��������� ������ ����� �! "�#�$�"�"#%�# &���'(����)* "�#�$�+��,$�# &-��(�����()

Page 191: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����� ���������

�����������.���/�� 0�� 1� 02� 1�3��������� (�����45�� 4�� ,6# 3 �5��� �� ����� ,"��� ��������� ���(7 4�� ,6# 3 �5��� �� ����� 8# 1�9�(���������� �':5������ 4�� � �� ,��� �3

�������� ��� ����� � � ���

����(���� �����

��������9���(5��� ����'��� 7��;��������� ��<'�� 4��� ������

�����=��� ��>?� ;������������� &;��) ��������� �5� �;� �������(���� &2# @) ?��������� �� "0,� &� %� @ <A�) �?� 544��

?�5�B�� �; ������5� 7��?�5�B�� 9�(��'������� 7��?�5�B�� �; C5����4�(����� 7����'��(����'�

�������� ��� ����� � � ���

;��D������5(����� � &; ��� �)�����5(����� � &� ��� > ��' � ��� )�����5(����� � E>F &� ��� >)?�4����( &>- �.) ?9�. ?������������5��� �5�4��������

���

�������� ��������� �����

Page 192: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������ ��� ��������� �� � �� ���

�*� ������"�����

������������?����� �-. ����� 4�� ��; ���(��������������5��� ����� ���'��� 4�� ����'��' �-. �� �������� ;��������,2 ( �% (

�5�����'��� ����� 4�� ����( ���'����� ��' ���� ���� ��������'��� �% ( ���'�

���<������ ���� 4�� ����'������ ,� �?� ������ $0�% (

-���� ;>3� �<���� �;� ?>�- ����� 4�� ���������5���5� ��;���(�����������

-���� ;>3� ��D �;� ?>�- ����� 4�� �'�5�����5���5���; ���(�����������

<���!95������ ��� ����������( (��(5�����-?� "#�, G3 ���������� ��<�� �5���� "#�� ���-?� +�� ��<�� �5���� +�� �

��� ������ 4�� ,% ������� ������ 4�� + ����?������ ��� �������� ,6� ��� ������� �������� ,6� ��� ������� �������� ,6# ���7 �������� ��������������� ������ �6#.����� ������ ,6� �������� ��(7-H5���������� �5�� ��� �% (���� ������( �5��� &"�� �� #�� �)

������� ���(7 4�� ,6# 3 �5��� �� ����� 8# 1�9������( �������3��������� ���7������ ����'���' ������ �(������ ����5��� 4��(��� <��� ���� ������' ����>������' �����<���! ���7��� ���5���� (����'��� ���������� �����5��� ��(6

9������( ������� ���� �� '�44����� ��/���H5��/� ���������'5���' �������� �4 # ��' ,� 3 I ��������� '���(� &�6�6 ?���5�����)

��#

Page 193: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������ ��� ��������� �� � �� ���

9�(���������� �':5������ 4�� � �� ,��� �3���������4 ��� ���(7 ��7� -''��� "���

���������

.�������� �������5� 4�� ������� ���� 4�� �5�����4���

���'���� �7�� 4�� 5������ ��� (�����3��������� ����4�� �':5������ ?��(�(�(7 (���

���������-. ���(���'� ������;��������� ������ ����5� ����� 4����� ����� ������� ���� �(��(������45�� �5��� ���� �5��� <��� �(��< (��� ,# ��' #� 3

������?� ;�� ������ ,2 �� �% ( '�44����� �� ���'������?� ����� .�5�'�?����� ����� ���'�� �������� ���5���� &��5���� '��������)6

���� �./0 �� ��� � ����� 1���

;>3� �� ��� ,�6#@ ��������5� +A�7;>3� �� 544�� J��=��� ��>?� ;������������� &;��) ��������� �5� �;� ����?��������� �� "0,� &� %� @ <A�) �?� 544���

>(�����'� �-. ���5���� &%�@� "@�) �� >(�����'� ?>�- %� @���5���� ��������������(�����'� & ��) ���(���� &2# @)>���5 ����5�4��� �-9-; ���(��� ������� ����(��� ������>������ 9 �� >������ >

5����� �� �����������

�������� ��� ����� � � ���

;��D������5(����� � &; ��� �)�����5(����� � &� ��� > ��' � ��� )�����5(����� � E>F &� ��� >)

9���(5��� ������ 9��7��� ����� ,%%��08%��� ��'�-. ����� �����(����� ���(��

��� ������ (5� 4�� � ������' ����� �� �������' 4��6 ��'������� ;�(��K 8�����5��� ����������� '��������� �5�4�������� �����������>(�' ������ ,$ ���������( �(�' ���(������(���( �(�' ��'�/��� /��(�5������ -;�>� ��

��$

Page 194: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������ ��� ��������� �� � �� ���

������

�����������?��(����� ?�5�<��� ����� ���� �������5� 4�� �5�����' ������ ���������������� J�� <��� ��� �4 ����� 4�� 5������ ��� ��������B������ ���7��

��������� ����� �������� ������������ �������J��(��� 4��� <��'��� �������5���� '���� ��� '����� 4���� ��' ���'��� ����4��

��������;��������� ����������������� ���������� �����(���� >% �� ������ 4����

�����?������� �5� ������� �������� �������� �5� ��"#�>(���( �(�'?�5�B�� ������ �������� 7���������� �������� �5� ���#� ���� �����������( �(�' ����5�5�4��� �������

�L?�B �5��

�*� ��!�

������������������ 8��� 5���4�5����(��(� ��' ��������������

�(�����

�������;��� ;������4����'� 3����� 9������5 �(�����

����2��-���� ;���'��

�-�������

����������������(����� '��7 ��� �(����� �'�4��' 4�� ���(���������

��� ����������� 8��� 5���4�5����(��(� ��' ��������������

�(�����

���

Page 195: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������ ��� ��������� �� � �� ���

���5��� &���'�<� � ���� �� G?)?������

����2������9����� �; -���� �; ����5����� ��4�<������������ �; ;������� '������� �''���-���� ?��������� 45��� �5�����' ��; ��4�<������� ���� ������

���� ���1��

�����������-���� ���� ��(7��

��������9��5�� ���� ��(7���?�<'�� 4��� ������#�� �3 -����'��44 �5����(������5���(�� ���'���

�����>���5 ��(��������>(����������9����C <����

�������

�����������-���� '�������

��������

�����;;���'��(����'���H5��(� ���'� �������>���5 ��(�����������4�5���(���( �(�'>(����������9����C <����

��&

Page 196: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������ ��� ��������� �� � �� ���

,��� ����������

�����������-���� 9>3;����. ?��

��������-���� 9>3;����. ?�� ������ ���'����� ���'�� ������� ����M������

�������(�����%���'��D�(�����( �(�'�# ;���'��D����/��( �(�'�����4�5����5����( �(�'�? ��������4�5����(���( �(�'>(����������9�������.���( �(�'9����C <����

��(

Page 197: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� �� ��������� �� �D����� ���� ��� <��� �4 ����� ����������� ��'�����6 ��� 4����<��� �����5(����� ���5�' �� ���� �� � �������� �����69��� ��'�������( �������� ��H5��� ��� ��������(���' �D���(���� ����(�'5���6

� ����������� � ���� �� ��� �� ��� � ���� ����������� �� ���������� �� � �� � ������ �������� �� ��� ��� ������ � ���� �������������� ��� � ������� � � ���� �� ��� ��� ����������� ��� ��

����� ����������� �� ��� ��� ��������� ���� �� ��� ������ ���(��'5��6 ��� �������� <��(� ��� ���� ���� (����� �� �'����4��'6 9�'�4��(������ �4 �������� ���' �� <���� (��(�5����� �� ������� ��������6

� �� ����' ������� ������ ��� �������� �4 ��� ����� 5�� ��7��� �� � ���56

� �� ����' ������� �'�4�(������ ��� ����� ���5�' �� 7��� ��(��' �� ��������6

� �� ����' ������ ��' �'�4�(������ ��� ����������� ��� ���5�'�� 7��� �� ����� �� ��������6

�� ���5�' ���� �� ����' ���� ����� ��� ��� ���� ��� �������� ����(�'5��� �� ����� � �����6 > ,�� @ �������������� �4 ��� �������� (��������' �� � (��� <��� ����� �� ���(��' �� ���(��(�6 =�5���� ��� ����'<��(� <��� '������ ��� ������� �5��� �4 '�44����� �������� �� (������6 ���� ����� �� ���(��� �������� �� � (������ ���5� �4 ��������<��(� ��� 5�'�������������' <��� ��� '�4�5�� ����' �� ��������������(�'5�� ��� �� �� ������'6 !��"��� ���� 0 4�� � ����� ����� 0 ��� ������� �5��� �4 ����

����� ��� �D���(��' 5�'�� ��7����� (��'������ � �5��� �4 ����( ��������� <��� ��� �� ��(�5'�' ��(�5�� ����� ���5������ (���� �� ����� �������(���( ������ �� ��<6 ���� ����! .�� ��� �������� �4 ��� ����( ��������� �(�'�( �D���(���� (��'������ ���� �� �� ������'6

��)

��� �� ����� ���������

� ��� �� �� ��� �����������

! ���" ��� � �"��� � �������" ���� ��� �� �!�� "!��� � ����� � �� � ���" ��� � # �$�� � ��� ������� ����"���� ���"��" �������� �� ����� ���� ���%

Page 198: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� � �� ����� �� ��������

.���� ��� '�4�5�� ���(�'5�� ��' ����� �544�� �� '��(����' &��������� � " ��' %)6 >���������� �� �''������� �������� ���5�' ���� ��5��' <��� ��� ���5��� ��� ��� �544�(������ ���'6��� 4���� '������� ������(���( 4�(5���� �� ���������� ��������� ��

����� ��' ����� ����( (������������6 ��5� ��� 5�� �4 ����( �544���5�� �� ����'�' �� 5(� �� ��������6��� '���(���� ����'� �����' �� ����� , '��(���� (��������� �4 ���

��� ���'�6 .�� 4�(�� ��' (����� �� '���(���� ����'� ��� �����2� 4 ��' ���� %! �������� �4 ����6

0��3 �� ������ ��� �� ���� �� � � �� �� �� �� �� �� ���� ��

���� ��� �� � �� � � �� !��� ����� "

������ ����� �� �� 0 ��� �� E�������(��F�L?�B �5�� ����� ,�� �� 0 $�� �� E�������(��FM��( ��'�/�� �������� ����� ��� �� 0 #�� �� E�������(��F�������� �5� ����� #�� �� 0 � � E�����������F�������� �5� ����� , � 0 ,� � E�����������F �� �����<

�� ���������

��� �D�5 �����(���� ����� ���'� '����' �� ��� ������ �4��� �?� ;������� ��' ��� 7��' �4 �� ���'����6

� # ��� � �� $�� � ��������� � ���� �������� � ���� ������ ������� �� � �� ����

�����1 ��������

.�� ��� ��7� �4 �����'5(������� �� �� �������' �� 5�� �D�(� (��(����������� �4 ���������� ��5�6

� % &�'�( )������ � �� ����

��������� ��5� , @ &<A�) ,�� ���������� +� ������ '�������' '������� ,� 3

�&+

&!������� � ��� '&( ���� ���� ���!�� ��" ��� �"���� �� � "!��� �� ) �� ������ '�*%

�+ ,�����! ��� ��� �� � ����� ���� �������� ��!��� ���

Page 199: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� ���"- ���������

0��3 ��

*������� ��� ����� ��+��� ! �� ������" &� �,(

8 ��A3 5��� #6% �% @ &<A�) ��>?� %�� �, @ &<A�) ;�� &N +# ��A3) ,�� ��62@ &<A�) ?�������� �� " �� ,�O) ��� �3�6��� @ ��������� ��5�OO) ,� �3����� '�������' �7� 5� �� ,� 3

O) �� �?� �544�� �4 �����(���� �� ��������OO) 4�� , @ ? ��5� ���5����

� ���������-������ ��� ���� ���� �� ��+� � �� �� �������� � �� ���� �� ������ ���� . /0 � ����������� �����

���-�� �� �������� �4 ��� �5���� �4 ��� 5��� �� �� '�5��!

� '������� #6$ � 5��� �� '�������' <���� 4��� 5� �� ,� 36� ��� ��� �5�� �� ��� ��� 5��� (�������� �� ���5����! ;� ���

�D(��' "$ 1� 6� >'' ,�� � �D�' ��' ��� �D(������ >������� �� �,#�6 ����

4�� ,� ��6� .����� ����5�� �����6� >'' ��� ����� �''������ �((��'��� �� ����� �6

��� ����� �544�� (�� �� ���'5(�' �� ������ H5�������� ��' �����'4��/�� �� ���H5��� �� � �������5�� '����� ���� 0+� 1�6

0��3 ��

*������� ���������� ����

2 ��A3 5��� %62 ��6# @ &<A�) ��>?� #� ��6�2 @ &<A�) ;�� �2 �,� @ &�A�) ���(���� ,6� 3�6# @ &<A�) ?�������� "0,� ,�# �3�6��� @ ��������� ��5� ,� �3����� '�������' �7� 5� �� ,� 3

���-�� �� �������� �4 ��� �5���� �4 ��� 5��� �� �� '�5��!

� '������� %62 � 5��� �� '�������' <���� (��������� ,� @ &�A�)���(���� 4��� 5� �� ,� 36

� ��� ��� �5�� �� ��� ��� 5��� (�������� �� ���5����! ;� ����D(��' "$ 1�6

�&�

� � �� � �� ) �!���� ����� �#��� �%

Page 200: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� � �� ����� �� ��������

� >'' ,�� � �D�' ��' ��� �D(������ >������� �� �,#�6 ����4�� ,� ��6

� .����� ����5�� �����6� >'' ��� ����� �''������ �((��'��� �� ����� "6

��� ����'������ ���5���� (�� �� ���'5(�' �� ������ H5�������� ��'�����' 4��/�� �� ���H5��� �� � �������5�� �� 0�� 1� �� (��'��6

/���� ������

�� ������� ������� ���5����� �5(� �� ���5 ����� ��(6 ��� ���5��������� �D�5�� �� '��5��' �� ��� '�����' ������� (��(��������� <��� �����'������ ���5����6

4�� ���� ������� ��1 ��� ������ ����������� ������� ��� ��<�� �''����� (��(��������� ��7� �� ��� ����'���������5���� ���5�' �� �'�H5���6 ��<���� ��� ������ ���� ���'������ (��(���������� ��'�(���' �� ��� ����� ���4 �4 ����� %6

0��3 #� ����� �� �������� �� � �� ����

*��� � � �, *��� � � �,

2 ��A3 5��� �6$# � 8 ��A3 5��� �68% ��6# @ &<A�) ��>?� 2 � � @ &<A�) ��>?� "+ ��6�2 @ &<A�) ;�� # � , @ &<A�) ;�� ,2 ��6# @ &<A�) ?�������� "0,� �� �3 �62 @ &<A�) ?�������� "0,� "+ �3�6��� @ ��������� ��5� � �3 �6��� @ ��������� ��5� � �3����� ���5� ��� �� ���� ��

��'�����

��� ���5�� ��� ����� 4�� �% ( �?� ������ ����6 .�� ����� ���'�����'��� ,2 ( ������ ��� ��(���'�'6 ��� ����� <�5�' �� '��5��'�� %#� �3 4�� ���'�� ��' "#� �3 4�� (����'�� ���'���6

�'���� �� �3���� '����� 5� �� �� ��� �����6

*��� �1 ���� ��� �� � ��� � *����� ) &#200 ��. .(� *345# �0���. .

����������'-6 (��� "� � 9���5��' ������� (������!����� �544�� , 3 �,� � ������� A 3

.���/� &0�� 1�) ��' ���< �<� ���� �� � �(��(�����45���5��6 ������45�� 4�� ,� �� <��� ,"��� ��6

�&�

� � �� � �� ) �!���� ����� �#��� �%

Page 201: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

. ������ �

$6 �� 3-4 ���� *��� � ���������� ���������� ����

��� ��� ��� ����� �� ��� �������'������ ���'��� ,# �3 �D <��� %"# �3�5� ���'��� ,# �3O) �� ���'�� ��'� %#� �3 &P + ��5��

��������'������)����� ��� ��� ��� �� ��� �������'������ ���'��� 2" �3 �D <��� "+$ �3�5� ���'��� 2" �3 �� ���'�� ��'� %#� �3 &P + ��5��

��������'������)

O) �D <��� #� �3 ����'������ ���5���� ��4��� ��5 ����� ��6

.��5�� , ���<� � ����(�� ��; ���(����������� ������� �4 �� -6 (����D���(� ������' <��� ����'������ ���'���6

�'���� �� 7��� ��� ����� 5����"������� ��-����6

3�������/�' ����� "�� ������ �544�� �6# 3

����(��� 4�� ,� �� �� � 1�*(�����45�� 4�� ,� �� �� ,� 1� <��� %���� �6

�&�

%��3 �� � !�� �"����� ��#$$ �� �������� ��%&�'(���� �) *+�$� ���� &��, ��� �� �!���� �� �����

Page 202: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� � �� ����� �� ��������

$6 �� 3-4 ���� *��� � ���������� ���������� ����

��� ��� ���#�$�%�� ��� ���%��& "� �3 �D <��� %�� �3�5� ���'��� "�O) �3 �� ���'�� ��'� %#� �3 &P + ��5��

��������'������)����� ��� ���#�$�%�� ��� ���%��& "�� �3 �D <��� ,#� �3�5� ���'��� ,�� �3 �� ���'�� ��'� %#� �3 &P + ��5��

��������'������)

O) �D <��� #� �3 ����'������ ���5���� ��4��� ��5 ����� ��6

0������� ����5� �4 �������� �� ���(�' <��� � �(����� �� ������ �� ���������������/�' ���(�6 �� (�� �� 4��/�� <��� ��H5�' �������� ��' ���7�� �������� 4������� �� � ����� ��' ������6

�'���� �� ��� ��-�

,���� ������ ������ 0� �� *345# ,�7879

>(����� ��<'�� ,� ������ �544�� , 3

.�� ���� ����5� ��5��� � '��������� ����'��� 7�� �� ���� 5��45� &���4��5�� �)!

,6 ������45�� ����'��� �5��� ����4�� �� �D�5 ����' �� ��������� ����'��� �����6 =�� � �(��������� ��� �� ����� �� 5(��4 ��� ��H5�' �� �������� 4�� ��� ����'��� ����� ������6

�6 >'' #�� �3 �4 ����� �544�� �� ��� ����'��� �5��6 �����D �� ���5�����' ��� ����'��� �����6

"6 >'' # � �4 ��� �(����� ��<'�� �� ��� �5��6

�&#

%��3 �� %����� �� �� �� �������

Page 203: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

/ 0�"����������

%6 B� �� �� #� � �4 ����� �� ����� ����5�6#6 =�� � ������ �� �����5���� ����' ��� �����6+6 ������45�� ��� �5�� �� ����� ����� ��' (���5��� '�����6 ����

���45�� 4�� #0,� �� �� �D�5 ����'6$6 ����45��� �����4�� ��� �5��������� �� ������� �5��6

$6 �� 3-4 ���� *��� � ���������� ���������� ����

��� ��� �������'������ ���'��� "� �3 �D <��� %�� �3�5� ���'��� "� �3O) �� ���'�� ��'� %#� �3 &P + ��5��

��������'������)����� ��� �������'������ ���'��� "�� �3 �D <��� ,#� �3�5� ���'��� ,�� �3 �� ���'�� ��'� %#� �3 &P + ��5��

��������'������)

O) �D <��� #� �3 ����'������ ���5���� ��4��� ��5 ����� ��6

�,���� �������

;������� �4 ��� ����� �� 5�5���� ��� ��(���'�' ��(�5�� ����������� ����� (�� (�5�� �'�������� �4 ��������6 3��� �������� ������� <��� ���(����� '������' ���'������� �5��� &��� 4��5�� ")6 ��� 4������� ������ �4 ���� ���� �� �(�����' <��� �� 2 7;� (5���44 �������6���� ��' �544�� ���� (�� �� �����' �44�(������ �� '�������� ��;

������ ������� �� ����� %� Q ����� ���5� �4 2 ��A3 5��� A , @;�� ���5���� 4�� � ��5�� �� ���������6 ��� ��; ����� ���5�' �� ��������' �� ����� �544��6 B���� ��� �D������� �''������ �5(� �� ��>?���' (������ ��������� '� ��� ���' �� �� ��(�5'�' �� ��� '������� ����5����6 ����� (�������� ��� �4���<��'� �''�' ��(7 �� ��� ��������(��(����������6

,6 B��� ��� �5�� ��' ����� ��(� �5�� ����4�� <��� <���� 4�� ��H5��/� ������ �� ����� ��� ������� ���5����6 ?��(� ��� '�������� (��� �� � (���� ���7�� <��� ��� ������ ��'�� 4�(���'�<�<��' ��' (���� <��� '�������' <����6

�6 J��� ��� (��� �� <����* '� ��� ����< ��� �� '��6"6 ;���(��� ��4��� 5�� ����� �D(��� <���� 4�� ��� (�� <��� �

������� ���6%6 ?������ ��� ����� ���� ��� '������� �5��6 .�� �#� �3 '�������

�5��� 5�� ,�0�#� �3 �4 �����6 .�� � 3 '������� �5��� 5��

�&$

'� �! ���$���"�� ���� � ���� �� ���� � ����� � �!�� �1 -2����!� "�$������ ��! �! ������ �! � �� ��� ������� � ���! � �%

Page 204: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� � �� ����� �� ��������

��� �3 0 � 3 �4 �����6 ?������� ��� '������� (�� �� ��� �5����' ������� 4����6

#6 ������ ��� '������� �5�� ���5���� ���� ��� ������ ����� ������� ��� '������� ������6

� �����:��� ���� ��� � ���;���� � � �� ������ ���� � ��� ��� �� ��������� 3� ��� ��� ������ �� ���� �� � �� ����������� ����� � �� ����������� �����1 - ��� ��� ��� �� ���� �� �� �, ���������� ���� ���� ��� ��� ������ ��������� 0��������� �� � ��� �� � � *������� ����� � ����� ��� ������� ��� ��������� 0���+��� ���� � ��+� ��� ���� ��� ������ ��� � ������ �� ��� ��� �� ���������

+6 ?��(� � 4���� �� ��(� '������� �5��6 J������ ��� '������� �5���������' �5�� ��� ����� �4 ��� �5�� ����5�� ��� ���� �� ���4���� 5���� ��� 4���� ����� ������� ��� '������� (��6

$6 ?��(� ��� '������� �5�� A 4���� ��������� (�����' '�<� �� ����7�� (��������� 2 ��A3 5��� A , @ ;�� ���5����6 ���(7���� ��� '������� ������� 45��� (����(� ��� ���5���� �� ������7�� ��' ���� ����� ��� �� ����� ��� �5����� ������' ���������� '������� �������6 ���� ��� �5�� �� �H5��� ���5���� ������� ��� �5����� �4 ��(������6 =�� � ������( ������� '5����'�������6

� �����<����� ��� �� ���� �� ������ � ����� ������ ��� ����� ��� ������ ��� � ��� � ������ �� ��� 5� ������ � ��� ��� �� ����������� ��� ������������ =��� �� $ � � ����������� �� � ���������� ��� �� �� � �� ���������� �� ������������ ������� ���� �� ������ �>��

26 ;5���� '������� ��� (������� �4 ��� '������� �5�� ���5�' ���D�' �� ��������� �� ������� ��� �5�� ��(� �� �<�(�6 �4 ��(������� ������ ��� ����� (�����45������6

86 .����<��� '������� ����� ��� '������� �5�� 4�� ��� 4���� ��'��'������ (����(� ��� ����� �� ��� ����� �4 ��� �5�� ��(�����45������6 ������45�� ��� �5�� 4�� # � �� #�� ��6 ;� ������� ������ �� 4����� �� ���� ���� �5��5�� ��� ������6

,�6 ����� ��' '��(��' ��� '������� (��6 �����(� <��� � �����(�� 4�� �������6

�&�

� $�� �� �! �������� ��� �� ���� "��� �� �%

Page 205: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

3 &� "���������

#�����������

> (�5'� �D���(� (�� (������ (������������ <��� �����������'� ��'�5(���( �(�'� <��(� ��� ���5���/�' <��� ������ �������� �� ����/����������7� �� ��� �(�'�( ���� �4 ��� ���6 ?������ ���(��������� �� �����4����4��� ������' �� ����� ��� (����������� �5�����(��6 ?������ ����(��������� �� ���� 5��' �� (��(������� �������� 4�� ������ ���� ������ '��5�� 4�� �44�(���� ��; ��������6��� ��; (�����5� 7�� ���(�'5�� 5��� � (��������� �4 � 5��H5�

���(������� ��' (�����(������� �� H5������������ ���(������� ��� �������������6 ��� �������� ��� �������' �� (�����45������ ��' ��� ���(�������� �� <����' �� 45����� ����� ����������� (����������6 ��� �D��5�� �� (�����45��' ����� ��' ��� ���5����� ������ �� ���5����'�' ������� ����� �544��6��� ����� (�� (������ , �� �� , � ������� �� � ���5� �4 , ��

,�� �3 &?��(�'5�� >)6 ?������ (�� �� ���(����' 4�� ������ ���5���� �(����� 5� ��� ���(�'5�� &?��(�'5�� )6

� )���# ��� ����� ��� �������������� ���� �� ������������� ���� ��� ��� ����� ������ ������� 2����� ��� �� �� �� � ��� �� � ��� ��� ��� ���� ���� �� ��� �� ��� ����������� ������>��� �

� ����� ��� <��� �544�� �� � 0�� 1� 4���/��6� ������45�� ��� �����* �� 5�� �� 4��� �4 ����' �����(���6

���� �� .� ��� ����� -����� �� �8�++ �/?��(��� ��� ������� ������ �� ,6# 3 �(��(�����45�� �5���6 >������� ���5�' �� (�����' �5� <��� ��� �5��� �� �� �(� �5(7�� 5����������<��� ���(�4��'6,6 �����4�� ,0,�� �3 ������� ����� &(��������� , �� �� , �

�������) ���� � ,6# 3 �(��(�����45�� �5��6�6 >'' "�� �3 ���(������� ��' �D <��� �� �����D��� �� ���������6

��(5���� �� �(� &%0# 1�) 4�� ,# ��5���6"6 >'' "�� �3 (�����(������� �� ��� �D�5�� �4 ������� ��' ���(��

������6 9�D �� �����D��� ����4��6%6 ������45�� ��� �5��� �� � �(��(�����45�� ��� �� �D�5

����' &�� ����� ,���� Q �) 4�� # ��5���6#6 ����� ��� �5��� 4�� ��� (�����45�� �� ���� �� (�����45���

���� �� (������6 > ���� ������ ���5�' �� �������6 ?��(��' �����'�� �� ��� ��D� ���� �� ����' ���5�������� �� '��������� �4 ���������6

�&&

Page 206: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� � �� ����� �� ��������

+6 ����� �� 5(� �4 ��� �5��������� �� �������� �� '�(�������� (���45� ���������6 ;� ��� '���5�� ��� ������6

$6 ����45��� ���������� ��� �5�� �� ��� �(��(�����45�� �� ��4���*<��� ��� (�������� ��' ������ 4�(��� �5�<��'6 ������45�� ����5��� ����� �� ����� ��� �������� ��H5�' �� ��� ����� �4 ����5��6 > ����4 �5��� �� �544�(����6 =�� � ������� ��� �� ����� ����������� �5���������6 ����� ���5�' �� �� ������� ��H5�'�������� �� ��� �5���6

26 ?������ �# �3 �4 '�������' <���� �� ��� �4 ��(� ������6 �����D��(� �5�� 4�� #0,� ��(��'�6 ��� ������� ���5�' '������� �5���� '������� �� ��� <����6

86 >'' , � �4 ����(�����' <��� �544�� ��' # �3 <��� �''�����6�����D 5���� ��� ������� ��� 45��� '�������'6

� �����2�� ������ �� �� �� �� �� �� �� ��� ����������

,�6 ��(5���� ��� �5��� �� 0�� 1� 4�� �� ����� "� ��6 �����D 4�� ��0"� ��(��' ��(� ����� ,� ��5���6

� �����2�� ���� ��� �� ��� �� ��� ���� �� �$ /0 �� ��� � ���+ ���� ������ ������ ���������� ������������

,,6 ������45�� ��� �5��� �� � �(��(�����45�� ��� �� �D�5����' &�� ����� ,���� Q �) 4�� # ��5���6

,�6 ����45��� ����� ��' '��(��' ��� �5���������6 > <���� ���������5�' �� �������6 >���< ��� ������ �� ��� '�� �� 5���� �� �5���������5(���6

� ������ �� ��� ��� ��� �� ��� 3� �� ����� � ���� ���� �� ������� � � ��������

�&(

dialysis membrane

float

%��3 �� -�������' � ��� ������ �� �� ���� �������

Page 207: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

3 &� "���������

,"6 ���5����' ��(� ������ �� �� ����������� ���5� �4 ����� �544���� ����'������ ���5����6 �����D ��� �5�� 4�� "� �6 ��(5���� ����� �������5�� ��' ������ �����D �� <��7 5� ��' '�<� �� �������� �� 45��� '�������6

� �����3� ��� �� �� � ���� � � ���� �� ��� �� � �������� �� �� *������� � ��������� ���� ������ � �������� +�� ��� ���� ���������

,%6 ������45�� ��� �5��� �� � �(��(�����45�� ��� �� �D�5����' &�� ����� ,���� Q �) 4�� # ��5��� �� ����� ��� �����5���� ������� ��' �� ��'5(� ��� 4��6 ��� �5��������� �� �����'�' '���(��� ���� 4���� '������� �-. �� �����4����' ��������� �5�� ��' �����' �� 02� 1� 4�� ����� ��������6

���� �� 9� ��� ���� ������ �� ��� �"� �++ �/>�� ����� ���5�' �� (�����' �5� <��� ��� �5��� �� �� �(� �5(7�� 5����������<��� ���(�4��'6

,6 �����4�� ��� ������� ����� ���� � �5�� ���� (�� �� (�����45��'�� 2��� Q �6 ��� �5�� 5�� ���� � (���(��� �� ����� ,� Q ����������� ��� ���5� �4 ��� �����6 =�� ���� ������������� ����������� �� ����� �5���6

� �����2�� ?�� )����� ��� ���� �� ��� �������������+ ���� � ����� 2�� ���� ��� ����� ����������� ���� ������� �

�6 .�� ��(� ���5� �4 ����� �'' " ���5�� �4 ���(�������6 9�D<��� �� �����D��� �� ���������6 ��(5���� �� �(� &%0# 1�) 4�� ,#��5���6

"6 .�� ��(� �������� ���5� �4 ����� �'' " ���5�� �4 (�����(�������� �� ��� �D�5�� �4 ������� ��' ?��(�������6 9�D �� ������D��� ����4��6

%6 ������45�� ��� �5��&�) �� 2��� Q � 4�� ,� ��5���6 ����� ����5��� 4�� ��� (�����45�� �� ���� �� (�����45������ �� (�������6 > ���� ������ ���5�' �� �������6 ?��(��' ����'�� �� �����D� ���� �� ����' ���5�������� �� '�445���� �4 ��� ������6

#6 ����� �� 5(� �4 ��� �5��������� �� �������� �� '�(�������� (���45� ���������6 ;� ��� '���5�� ��� ������6

+6 ����45��� ���������� ��� �5��� �� ��� (�����45�� �� ��4��� <������ ������ 4�(��� �5�<��'6 ������45�� ��� �5��� ����� 4�� ������� , �� �� ����� ��� �������� ��H5�' �� ��� ����� �4 ����5��6 =�� � ������� ��� �� ����� ��� �������� �5���������6����� ���5�' �� �� ������� ��H5�' �������� �� ��� �5���6

�&)

Page 208: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� � �� ����� �� ��������

$6 ?������ ���5�� '�������' <���� �� ��� �4 ��(� ������ �� (������� ������6 �����D ��(� �5�� 4�� ������� ��(��'�6 ��� ����������5�' '������� �5� ��� '������� �� ��� <����6

26 >'' , 3 �4 ����(�����' <��� �544�� 4�� ��(� �������� ���5��4 �����6 >'' # �3 <��� �''����� &�����'���� �4 ��� ������������� ���5� 5�� ���� # �3 <��� �''�����)6 �����D 5���� ���������� ��� 45��� '�������'6

� �����2�� ������ �� �� �� �� �� �� �� ��� ����������

86 ��(5���� ��� �5��� �� 0�� 1� 4�� �� ����� "� ��6 �����D 4�� ��0"� � ��(� ����� ,� ��5���6

� �����2�� ����&( ��� �� ��� �� ��� ���� �� �$ /0 ���� � � ���+ ���� ������ ������ ���������� ������������

,�6 ������45�� ��� �5��� �� 2��� Q � 4�� ,� ��5���6,,6 ����45��� ����� ��' '��(��' ��� �5���������6 > <���� ������

���5�' �� �������6 >���< ��� ������ �� ��� '�� �� 5���� �� �5���������5(���6

� ������ �� ��� ��� ��� �� ��� 3� �� ����� � ���� ���� �� ������� � � ��������

,�6 ���5����' ������� �� ����� �544�� �� ����'������ ���5����6 ������5� �4 ����� �544�� �� ����'������ ���5���� 5��' (�� �� �������� �� ,A�� ��� ���5� �4 ��� �������� �����6 �����D ����5�� 4�� "� �6 ��(5���� �� ��� �������5�� ��' ������ �����D�� <��7 5� ��' '�<� �� � ������� �� 45��� '�������6

� �����3� ��� �� �� � ���� � � ���� �� ��� �� � �������� �� �� *������� � ��������� ���� ������ � �������� +�� ��� ���� ���������

,"6 ������45�� ��� �5��� �� 2��� Q � 4�� ,� ��5��� �� ����� ��������5��� ������� ��' �� ��'5(� ��� 4��6 ��� �5����������� �� ���'�' '���(��� ���� 4���� '������� �-. �� �����4����'�� ������� �5�� ��' �����' �� 02� 1� 4�� ����� ��������6

�(+

Page 209: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� ,���" ���� ���

$9���� ������

;������ � ��' &,82+) ���� '�������' �� �(�'�( �D���(���� A ���(���������� ���(�'5�� 4�� ����� ������ �� ��'�� �� (��(������� ��� ����������' �� ��� ��' �4 �����������6 ��� ����' �4 �������� <��� ��� ���������� �� $ �� 5(� ������ <��� �D���(��' 5�'�� �(�'�( (��'���������� <��� ����� �544��6 > �'�4�(����� �4 ���� ����' ��� ���� �5(�(���45��� ������' 4�� ��� �D���(���� �4 ����( �������� 4�� �5������� ���������� �5�� ����� ��' ����� &�R�� � ��' ,88$ ,882)6��� ���(�'5�� ��7�� ���������6 -D���(���� �4 ����( �������� (�� ������'�' 5� <��� ��� 4����<��� �����(�� 5���� ��� ��; (�����5� 7��6

�'������� �� ����� ������ 2��" �" �*� ���*�� 1��

?��(��� ��� ������� ������ �� ,6# 3 �(��(�����45�� �5���6 >������� ���5�' �� (�����' �5� <��� ��� �5��� �� �� �(� �5(7�� 5����������<��� ���(�4��'6

� )���# ��� ����� ��� �������������� ���� �� ������������� ���� ��� ��� ����� ������ ������� 2����� ��� �� �� �� � ��� �� � ��� ��� ��� ���� ���� �� ��� �� ��� ����������� ������>��� �

,6 .���/� ����� �� � '��� 4���/�� �� 02� 1�6�6 ����' ����� �� ����4��/�� ����� <��� ������6"6 �5����' ,� � �4 ��� ��<'�� �� � ,6# 3 �(��(�����45��

�5�� �� "�� �3 �4 0�� 1� (��' ���(������� ���5���� ��' �D6%6 >'' "�� �3 (�����(������� A �6, @ &<A�) ;�� �� ��� �D�5�� �4

������� ��' ���(�������6 9�D �� �����D��� ����4��6#6 ��(5���� 4�� "� �� �� 0�� 1�6+6 ������45�� ��� �5�� �� � �(��(�����45�� ��� �� �D�5

����' &�� ����� ,���� Q �) 4�� # ��5���6$6 ����� ��� �5��� 4�� ��� (�����45�� �� ���� �� (�����45���

���� �� (������6 > ���� ������ ���5�' �� �������6 ?��(��' �����'�� �� ��� ��D� ���� �� ����' ���5�������� �� '��������� �4 ���������6

26 ����� �� 5(� �4 ��� �5��������� �� �������� �� '�(�������� (���45� ���������6 ;� ��� '���5�� ��� ������6

86 ����45��� ���������� ��� �5�� �� ��� �(��(�����45�� �� ��4���*<��� ��� (�������� ��' ������ 4�(��� �5�<��'6 ������45�� ����5��� ����� �� ����� ��� �������� ��H5�' �� ��� ����� �4 ����5��6 > ����4 �5��� �� �544�(����6 =�� � ������� ��� �� ����� ���

�(�

2�� �#�� �� 2 4� �� 2�5�#�0� !� �� � ��6% �� "���$�!�� ��� 7 �89:� �/;�3%(<�� =� �� ���� � ��,����!(� ������� =� 2��) >$>�0��?�� >$>% �� "����!�� ��� �9�887� /.9;//7%(<�� =� ,����! (��� ���� � �� @ ���@% �� "���$�!�� ��� �8 �889� ���:;���8%

Page 210: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� � �� ����� �� ��������

�������� �5���������6 ����� ���5�' �� �� ������� ��H5�'�������� �� ��� �5���6

,�6 ���5����' ��� ������ �� 0�� 1� (��' <��� ���5���� A �6, @&<A�) ;��6

,,6 ��(5���� ��� �5��� �� 0�� 1� 4�� "� ��6 �����D 4�� ��0"���(��' ��(� ����� ,� ��5���

,�6 ������45�� ��� �5�� �� � �(��(�����45�� ��� �� �D�5����' &�� ����� ,���� Q �) 4�� # ��5���6

,"6 ����45��� ����� ��' '��(��' ��� �5���������6 > <���� ���������5�' �� �������6 >���< ��� ������ �� ��� '�� �� 5���� �� �5���������5(���6

� ������ �� ��� ��� ��� �� ��� 3� �� ����� � ���� ���� �� ������� � � ��������

,%6 ���5����' ��(� ������ �� �� ����������� ���5� �4 ����� �544��6�����D ��� �5�� 4�� "� �6 ��(5���� �� ��� �������5�� ��'������ �����D �� <��7 5� ��' '�<� �� � ������� �� 45��� '��������6

� �����3� ��� �� �� � ���� � � ���� �� ��� �� � �������� �� �� *������� � ��������� ���� ������ � �������� +�� ��� ���� ���������

,#6 ������45�� ��� �5��� �� � �(��(�����45�� ��� �� �D�5����' &�� ����� ,���� Q �) 4�� # ��5��� �� ����� ��� �����5���� ������� ��' �� ��'5(� ��� 4��6 ��� �5��������� ��������' '���(��� ���� 4���� '������� �-. �� (5� ���'��� �� ���������'����' ��� ����� �� �����4����' �� ������� �5�� ��' ������' �� 02� 1� 4�� ����� ��������6

�4�� "� ���"���� ������

0"����� ���� ��

.�� �������� �������� ��' ����� ���� ��'�������( �������� � (���������� ����A $������ �� ��� ���5���������� ���5���� (�� �� ���� ����45��� ��� ��� �������� ���� ���5���� &�������5' ,882)6 ��� �'�4��'����� �544�� �� ���� (�����' �� 4����<�!

$ ��A3 5��� %6� �� ��A3 ����5��� ,6# �<��� ��B'��� 4��� 5� �� 86# 3

�(�

=���� �� �� �!���� �$"������$��� ��������� ��! ��� � � ���� �"!��� �%

Page 211: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

: 4 �� !�����!���" ���� ���

���-�� �� ��������

� ��� ��� �5�� �� ��� ��� 5��� ��' ����5��� (�������� �� ���5�����! ;� ��� �D(��' "$ 1� 6

� >'' ,�� � �D�' ��' ��� �D(������ >������� �� �,#�6 ����4�� ,� ��6

� .����� ����5�� �����6� >'' ��� ����� �''������!

% @ ��>?� %�� �, @ &<A�) ;�� ,�� �� @ &<A�) ?�������� �� " �� ,�O) #�� �3�6��� @ ��������� ��5�OO) ,� �3

O) �� �?� �544��OO) 4�� , @ ? ��5� ���5����

� ���������-������ ��� ���� ���� �� ��+� � �� �� �������� � �� ���� �� ������ ���� . /0 � ����������� �����

>��� ���� ����� �544�� (�� �� ���'5(�' �� ������ H5�������� ��' ������' 4��/�� �� ���H5��� �� � �������5�� '����� ���� 0 +� 1�6

��� ���� ��

� .������� �4 �������� (�� �� ��������'6� B������� <��� ��5�� (��� <���� ������� ��H5��� �������

4�� # ��5��� �� , �� � @ �;� ��4��� ���� ��� '��5��' <�������� �544��6

� ���� ��'�������( �������� ���� ��H5��� �D���(���� <��� �������(������ �4 �;�6

�'����� :��� ������>((��'��� �� ���(��/ � ��6 &,88#)6

,� �3 �5�� ����� �D <��� +6�# �3 ,�@ �;� �6" @ ;������ 4�� # �� �� 8# 1�;��5�� <��� #�� �3 ����� �544��

� �����*�* �� �� � ��� ��� ��� � ������� ��� ��������� ������ 3�@� ���� ����� ���� ��� ��������� *�* ��� � �� ������ �� ������������� ���� ��� � ������ +���

�(�

� � �� � �� ) �!���� ����� �#��� �%

���"! ) >$�� =�� � ��&������� �� ��#� � *� ,����"! =�6�"!������ � 2*% �� "����!�$� ��� �: �88�� ��/�;����%

Page 212: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� � �� ����� �� ��������

&;�����������

��� ���(�'5�� '��(����' �� (�������� <��� �5(� (��� ���������������� �������� �� � @ �;� , @ ;�� 2 ��A3 5��� � ��A3����5��� % @ ��>?� � @ ?�������� ��' � @ �?� 544��6��� ���5� ����� �4 ��� ����� �� ,0#� �3 ��' ��� ������ ����� 4��

H5����4�(����� �� �0#� ��6 ��� ����� ��� � ����������� ��������' �4�6# ��!

� )���# ��� ����� ��� �������������� ���� �� ������������� ���� ��� ��� ����� ������ ������� 2����� ��� �� �� �� � ��� �� � ��� ��� ��� ���� ���� �� ��� �� ��� ����������� ������>��� �

��� ����� ���5�' �� ���4���' �� ��� �������5��6

��������� ����������

� ?���� �� ���4����� ��� ����� ������� �� ����������� ���5��4 <��7��� (���5� ������� �� �D��� ,�� ����� �4 (���5�������� > <��� , ���� (���5� ������� 6 -�(� ��'���'5�� �������H5���� , 3 �4 <��7��� (���5� �������6

� ���7��� (���5� ������� (�� �� �����' �� %02 1� 4�� 5� �� ������� �� �� ���� �� ��� ����(�� '������ &B;) �4 ��� ���5���������� ����< �6��# �� %2� �6

���� ��

,6 ?������ � ����'��' (5��� �((��'��� 5���� ��� � �A3 ���������5 ���5�� & �>) ����'��' ���5���� �����'�' <��� ��� 7��6��� 5� ��D �5��� ��' �'' ����'��' ���5���� �((��'��� �� ����� #6�5�� , �� ��� ����� ����7 <��(� (������� �� �������6

0��3 $� ���������� �� ������ �����

2��� ������ � $ . 6 � 9

���5� �4 � �A3 �> ����'��' ���5����

� �3 # �3 ,� �3 ,# �3 �� �3 �# �3

?������ H5������ � �� ,� �� �� �� "� �� %� �� #� ��

�(#

Page 213: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

7 A�������"�����

� �����2�� �������� � ��� ��� � ���������� �� ���� ��� � ��� ��� � � �� � ��� ��� �� ��� � � �, � �� 3� � �������� ���������� �� ��� ������� � ��� � ���� � ������� � ����

�6 ?������ �5��� (��������� ,0#� �3 �4 ��� ����� �� �� ������'6;5���(���� ��� ��(���'�'6 ��� 5��45� ����� �4 ��� ����� ���6#0#� �� ��' �� �� ���� ��(���'�' �� ����� ��� ���� �������� ���5� �� '��5���� �� ���5�� ���� ��� ����� 4���� <��������� �����6

"6 >'' #�� �3 ���(������� �� ��(� �5�� &��(�5'��� ��� ����'��'(5��� �5���)6 �����D ����4�� ��' ��(5���� ��� �5��� �0" �� ����� �������5��6

%6 >'' #�� �3 (�����(������� �� ��(� �5�� ��' �D ����4�� �� ������D��� �� ���������6

#6 ������45�� ��� �5��� �� � ���5 �4 ,���� Q � 4�� # ��6���� ��'����� ��� �������6

+6 ;�(��� ��� �5����������6 ����� ��� �5��� 4�� ��� (������45�� �� ���� �� (�����45������ �� (������6 > ���� ���������5�' �� �������6 ?��(��' ����'�� �� ��� ��D� ���� �� ����'���5�������� �� '��������� �4 ��� �������6

$6 ����45��� ���������� ��� �5��� �� ��� �(��(�����45�� �� ��4���<��� ��� (�������� ��' ������ 4�(��� �5�<��'6 ������45�� ����5��� ����� �� ����� ��� �������� ��H5�' �� ��� ����� �4 ����5��6 > ����4 �5��� �� �544�(����6 =�� � ������� ��� �� ����� ����������� �5���������6 ����� ���5�' �� �� ������� ��H5�'�������� �� ��� �5���6

26 >'' ,�� �3 �4 (����� ���5���� ��' %�� �3 �4 '�������' <������ ��(� �5��6 �����D ����4�� �� '������� ��� ���(�������' �������6

86 >'' , 3 �4 <��7��� (���5� ������� �� ��(� �5�� &��� E?���������� �����������F 4�� ��������� ��� <��7��� (���5� �������)6-��5�� �����������5� �D��� �� �����'5(��� ��� ������� ������'�� �� ��������6 9�D �� ���������6

,�6 ��(5���� �� ��� �������5�� 4�� ,#0�� ��6,,6 ���' ��� ��������(� �4 ��(� ����� ��' ����'��' �� %2� �

5���� <���� �� ��� ��4����(�6 ��� ��������(� ���5�' �� ���'<����� %� �� �4 ��� �''����� �4 <��7��� (���5� �������6

� �����A� �+� �� ������ ���� ��� �������� � ������ ���� ������� ���� ��������� ������������������ � �� ������� ��� � ��+ ���������� ��� ��� � ������� � �� ��� ��� � ��+ ���� ����������

�($

Page 214: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� � �� ����� �� ��������

,�6 �������� � ����'��' (5��� �� �������� ��� ��������(� �4 �������'��'� ������� ��� H5������ �4 �������6 =�� ���� ����'��'(5��� �� '������� ��� ������� (��(���������� �4 ��� ������6

(��� ������ ��� :,< ������ ��������

*�* ��� � ������

� @ &<A�) �;� � ��#@ ���(���� &�A�) 2#@ ���5���� "� 3#� ��A3���� ��� �� 262 ,6# ��A3 ���(7 ���5���� "6# 3�6�,@ ��������� �5� ,� ������ '�������' �7� 5� �� ,�� 3

����� �� ��� �������5��6

� ;������� #� � �4 ;�� �� ,�� �3 '�������' <����6� ;������� �� � �4 ��'��(����'� �� ,�� �3 '�������' <����6� >'' ,� �3 ;�� ���5���� �� ,�� �3 �;� ����� �544��6� 9�D �# �3 ����� �5��������� <��� �#�3 �;� ����� �544��6� >'' ,� �3 ��'��(����'� ���5���� �� ��� #� �3 �;� �����

���5����6 3���� �� �� ��� �������5�� 4�� , ��5�6� >���� �� �3 �4 ���� ���5���� �� ��� �;� ���6

�(�

0

µg BSA

standard curve with BSA dissolved in water

standard curve with BSA dissolved in first-dimensionsample solution (8mol/L urea, 4 % CHAPS, 40 mmol/L DTT,2 % Pharmalyte pH 3-10).

A4

80

10 20 30 40 50

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

%��3 #� ������ � �' .��/ �/� ��� �& 0����1������� 2�� ,/� ������ ����� �� 3(� ��4 ��� �� ��� ��� �� � ��' �� ���4���������� ��� ��� � �������

2� ��� ! �� ��� �! ����� "������� �� �B

!�� �� � �$2 �����

Page 215: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���

�� � ����� �� ��� ��� ����� ������ � ������� ��������������� ���� ���� ����� ������� ������ � ������� �� �� ������ ������� ��� ��� � ������ �� �� ����� ���������

� �������� � ! ���� � �� �� �������� ��� ������� ��� ����� �� ������� �� �� ����� ���

� ��������� ������� �� �� ����� ������� �� �� ����������� ��� ������� ��� ���"� �� �� �� ������� ���� ������� �� ����� ���

� ��������� ������� ���� ��� ������ ��� �������� �������� �� �� ������ ���� ����� �� �� � ! ����

�� �� ����� ��� ���������� ������� �� ���� �� � �� �������� ��� �������� ��� ��������� �� � ����� �� ����#�� ����� ����� ���� � ���� ������ ��� �� �� ����� ������"

������� �� �� ��� ��

� $��� �� � ! ���� � � ������� � ����� �� �� ���� ��������% ���� ��������� &����� '(�

)���� '* �� ���� � ! ���� � ������ �� +, �� ���� �� ��� ����"���� ����� ���%�� ��� '"# ��� �� ������ � � ��� ���� ��-#- ��� .� ����� ������� �� �� +,� ���� �������� ����� ������ �� ��� ��� � ����� �� +"# ���� /�� �� ��� � ���" ��� �� '"# ��� � �� �� -#- ���

���� � ��� ������ ��������

0815

���� � ��� ��� ���� ��� �� �� �������� ��� � �������� ����

��� ���� ���� ������ � ��������� ��� ��� ����������� ������ ��� � ����� �������

Page 216: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���

������ ��� ����

0��� ���� �� ��� ��� ����� ��������� ������� �� ��� �� ���������� �� � ! ���� � �� �"��������� �� � ! ���� � ��� �� ��������

���� � ������� �������� ��� ���

* ����$ ��� ,�* �1�2 3 &���( )4. - 21 ��1�+* 3 &���( #00 +* ��'1 3 &���( ������ '�+ �$1�2 3 &���( ������� 56'1 '+2 �$1�11+ 3 /���� ���� ��� '1 �$����� �������� ���� � �� '1 �$

0� ��������� �������� ��� � ������ �� ����� 7�������� �������� ���8� �� ���7���� �� � �� ����� �� 6+1 9) �� ��������� ��������� ������� ����� ��� � �����������0� ������ �� ������ ���� '6'+ �� ����� ��� � ���������"

����� /��� �� � �� �� ��� ���� ���� �� � ! ���� � ���� � ���� ���� ��

� / ��� ���� �� �������� ��� ��� �� ������� ����� ������� ���� ���

� .�:��� �� �� �� ��� �� ��� ����8������� ����� �� �������� ���� ��� �� � ������� &� ���� +(�

� � �� ��������� �������� ���������� �� ��� � ���� ������� ���� �� � ����% ������� ������ ���� �� ���� �� � ��"������

� ���� �� ���� ���� ���� �� � ! ���� �������� �� �� ������& �����( ���

� ��� �� ���� ���� �� ���� ���� �� ���� �� ��� ���� �����"��� ��� �������

��� ��� �� �� ��� � ����� ���� �� ���% �� �� ����� �� ���� � ���� ���� ������ �� �� �� �� ���� � ��� �� ������� ��� �� � ��� �� ���

� � �� 5 �$ ������� ��� ��� �� ���� � �������� �� ������� �� �� ���� � ������ �� �� �����

� � �� ���� ������ ��� ��� ��� �� �� � �������� )��� �� ��� ���� �� ������� ��������

��� ��� ������ ��� ��������� ���� � ����� ����������� ��������

������� ������ ����� � ������ ������

��� ����� ��� ��

������ � �� ��� ���� � ���������� ��� ������� ������ ���� ��� �������

!�� ������� ��� ������ ������� � ��� ����� �� ���� ���� ��������

�� ���� ���� ������������� � �"��� � ����

Page 217: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� �������� � ����

����������� ����������� ��� � ; < ���������� ��� � ; '+ � �� �������� =(

=( $��� ����� ������� �� � ���� ��� �� ������ ������ ���� �

���� �����������

� ���� �� ������ �� �� ���� � ���� �������� ���� ����� ��7�8 ����� ��� ��� ��� ��� ��� � �� ������ �� ������� �� � ��� ����� � � �� ����� ���� ��7���� �� ���� ����� �� �� ������ ��� ��� ��������8 ����

0� ���� � ��� � ��� �� �� >���� ��� ������ ������ �� ������������ �� �� �� &��� ��� � �� '+ ���� �( �� �� �� � ! ��� ������������ ����������� � �� �������

! ������ �� ��� ����� ��� ���� 0� �������� ��� �� �������������� ���� ������� ����� � ���������� �� ?"�� � ��� �� ������.��� ������� �� ���� ������� ���� �� ���� � ��� ��� �� ������ ��� ���

��"

rehydrationsolution

adjustlevel

paraffin oil

eventually removeairbubbles

protectioncover

IPG strip

gel side

���� � ��������� �� ��� ���� � ���� �� ������ � ��� �������� ����

Page 218: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���� #� $�������� ����� �

������������ ������ ��� #� �� $%���� ����� �� ����

0� ���� ������ ��� ������ �� ����� ��� � �������������� /�� ��� �� �� ��� ���� ���� �� � ! ���� � ���� �� ���� ���� �� 0�� ! ��� ������ ���� � ����8������ ���� �� �� ����� ��"������� ��� ��� � ������� �� ������ ��� �� +1 9)�

� / ���� ���� �� ���� ������ �� ������� ����� ��� ������ ��� ���� ������ �� �� ����� ������ ������� ���� �� ��

��� �� � ���� �� ����� �� �� �� ������ ������� ����� � �� ��������� �������� ���� ���� ��� � ���� �� ����

����� �� � ����% ���� ������ ������� �� ������ �������&� ����� 5(�

� ���� �� ���� ���� ���� �� � !"���� �������� �� �� ������& �����( ���

� -������� �� �� ������ ���� ��� �� � ! ���� ���� �� ����� ������ �� ���� �� ���� ����� 6 ���� �� ��� �����-���� ���� �� ����� �� ���� �� ���� ������

-����� �� ��� ����� � ������� ���� �� ���� � ���� ���� � �������� ���� �� ���� ������ @�� ����� �� �� � �� ���� ���������� ��� �� �� ��� � ����� ���� �� ���% �� �� ����� �� ���� �

���� ���� ������ �� �� �� �� ���� ��� �� ������� ��� �� � ��� �� ���

� � �� 5 �$ ������� ��� ��� �� ���� � �������� �� ������� �� �� ���� � ������ �� �� �����

� ��� �� ������ ���� �� �� ���� ������� )��� �� ���� ����� ���� �� ������� �����������

�"&

cathodalcontact

anodalcontactceramic tray

basic end

gel side

acidic end

IPG strip

paraffinoil

pressureblock

pressureblock

transparent lid

samplesolution

���� ' ��������� ������ �� ��� ��������� ��� � ��� �� �� ��� ����� �� ����������

��� ��� ������ ��� � ������������� ��� �����

%���� ��� �� ����� ������������� ��� � � ���� ��������� ����� �� �

������ � �� ��� ���� � ���������� ��� ������� ������ ���� ��� �������

��� ���� � ���� ��� ����� ��� ��� �� ��� � �� ��� ���� ��������� �� ��� � ��� ����

�� ���� ���� ������������� � �"��� � ����

Page 219: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

# ��������� ���� � � $&� � $'(���� ����� ������

���� � ���� ���� ������� �� �������� ������ � �� �� ��� ������

��������� ��� 1 �0� ����� +1 9))����� � ���� 21 �.������� ��� �� A ����-��� ����� '* �� +, �� 4 ������� 56'1 $ 56'1 B$ 56'1 $ 56'1 B$-� ' �� A ���� <1 C '+ � '+ �-� + �� A ���� 211 C ' � ' �-� 5 �� A ���� '111 C ' � ' �-� ,���������

�� A ���� *111 C +1 %C�+ � +1 ���

+1 %C�+ � +1 ���

,1 %C�, �

,1 %C�, �

0���� ��� '< � +1 ���'< � +1 ���'* � '* �

����� ������ � � � ���� ����� ����� � ��� � ���

���� !�"�� ���� ���� #��� #��� #��� #���

��� � ������ ��� � ����� &; ' ��( ������ �� ����� ���������� � '2 3 �� �� �� ��� C������������ �� �������� ��� �� ������� ��� �� �� �������� ������

�� ������ � � ���� *111 C �� �� ���� � ��� '2 ������ ����7������������ ��������� �� ������ �� �� ���� ��

(����)������ ������ ��� ����� ��� � ! ���� �� ����� ���� ��� ����%��� � ���� ����� ������� ����� � ���� �� �� �������� ��� ����� ���� ������ ������� ������� ��� ��� ��� �� ��� �� ��� ���� ������� �� ���� ��������� �� �� ��� ���� #� ��� ����D ��� �� ����� ���� �������� �� � �� ��� �� ������ ������ ���� ��� ����� �� ��#����� �� ���� �� ����� �� ���� ����� � ������ ����%� ���"

���� ���� �� ���������� ���� ���� �� �� ����� ���� �� ������ �"��� ��� ������� ��� �� �� �� �� �� ����� �� ������ ��������� ����� ���� ��� ���� �����

� /��� �� ��� �� �������� ��� � ��� ���� ������ ����������� �� �� ��������� ��� �� ���� �������

! ������ �� ��� ���� �� ����� �� ����0� ���� ������ ���� � ������� ����� ���� ��� ���� 0� ����"����� ���� ��� �� �� �� ���� ������ )������ �� �� ������� ���� ���� ������ �� ����� ���%� � �� ����� �� � �������� �� +623 ���� � ����� �� ��� ������ �� ��� �����

�"�

Page 220: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���� #� $�������� ����� �

0� ���� ����� ���� ������ � ��������� ������ ���� � �����"����� ����� � �� ��� � �� �������� � ! ��� -��� 4���� )������-�������� 0�� �� �� ����� ���� ������� �����-������ ����� � ����� �� ��� �� �� ������ �� �� ����

����� ���� ���� 0��� �� �� ��� ����� �������� ������ ����� �7�8� ��� �� �� �� ������ �� ���� ��������� ���� &� ���"�� 'E �� �� ,*(� �� �� ��� ����� �� �� ���� ��� ������� ���������� ��� �� �� ����% ��% ���� �������� �� ���� ��� ������ ������ ������ � ����� �� ' 3 &���( -#- ���� ' 3 &���( #00��� 51 ������ ���� �� ���� �� ����� ���� �� �����������

� ������������� ����� � � � � �� ���� �� ����� ������ �� �� �� �� ���� ��� �� � ���� � ������� ��� � ���� �� ������ ��� �� � ������������ �� ��� �������

� ������� ����� ���� ���� � �������� �� �������

'#� �� ��� ��� ������ ����� �� ��� *����������� ����� ������+

0� ���� ������ ��� ������ �� ����� ��� � �������������� 0�� ! ��� ������ ���� � ����8������ ���� �� �� ����� ���� ������� �� ������ ��� �� +1 9)������ , ����� ��� �� ���� ��� ��� �� �� � ������� ��

���� �� ���� ��� ��������

� / ���� ���� �� �� ������� ���� ������ �� ������������ ��� �����

� ��� ���� ������ �� �� ����� ������ ������� ���� �� �� ��� �� � ���� �� ����� �� �� �� ������ ������� ����

� -������� �� �� ����� ���� ��� �� � ! ���� 6 �� ��� ������� 6 ���� �� ���� ����� ���� �� ����� �� ������� ������ ���� / ��� ���� �� ��������� ���� �� �� ����� �������� �� �� �� �� ���� ������ 0� ������ ������������ �� % �� ���� ������

� � �� , �$ ������� ��� ��� �� ���� �

� )�� 2 �� ���� ��� ���� ��� ������ ���� � ��� ���% ������� ������� ����� /��� ��� �� ����� � � ��� ��� ����� �� �� �� ��� �� �� ���� � 0� ��� ������ ��� ��� ����� �� �� ������� �� ����� ���� � �� �7���� ��� ������ ������� ��� ���� � �� ����� ��� �� �� ���� 2 ���

�"�

)��� ����� ������ ����� ���� �� ���� ������ �� ����� ���� ���� �

�*� ������� � ���� � �������� ��� � ������ �+�

��� ��� ������ ��� ����������������� ��� �����

%���� ��� �� ����� ������������� ��� � � ���� ��������� ����� �� �

�� ���� ���� ������������� � �"��� � ����

��� ��� ���� �� ���, ������

Page 221: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

- $&� � ��� �� ���� � ����� ����� .��������� ���� ������/

� ��� �� ������� �� �� ��� �� ����� �� ����� ,�� ��� �� ������ ���� �� �� ���� ������� )��� �� ���� ����

���� ' ���� ���� ������� �� � � ������ ��� ������ �� � ��� ��������������

��������� ��� 1 �0� ����� +1 9))����� � ���� 21 �.-��� ����� '* �� +, �� 4 ������� 56'1 $ 56'1 B$ 56'1 $ 56'1 B$-� ' �� A ���� 511 C 5 � 5 �-� + ������� '111 C < � < �-� 5 ������� *111 C 5 � 5 �-� , �� A ���� *111 C '< %C�

+ �'< %C�+ �

+, %C�5 �

+, %C�5 �

0���� ��� ', � ', � '2 � '2 �

����� ������ � � � ���� �$��� �$��� �$��� �$���

� �� � ���� $��� $��� ���� ����

�!�%�� &� � '��� ( !�� � ��� � ��� � ��� � ���

0� ����� ��������� ������ � ��� ���� 21 C��

��� � ������ ��� � ����� &; ' ��( ������ �� ����� ���������� � '2 3 �� �� �� ��� C���������

�"'

cathodalcontact

movableelectrode

alignerprotrusions

transparentlid

pad

electrode

anodalcontact

ceramic tray

ceramic traycathodal side

end of film

IPG stripparaffin oil

���� , !�������� �� ��� � � ������ �������� �� ���� ��������"������ ��������

Page 222: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���� #� $�������� ����� �

��� �� �������� ��� �� ������� ��� �� �� �������� �������� ������ � � ���� *111 C �� �� ���� � ��� '2 ������ ����7������������ ��������� �� ������ �� �� ���� ��

,!�� ������ #�

0� ���� ������ ��� ������ �� ����� ��� � �������������� 0�� ! ��� ������ ���� � ����8������ ���� �� �� ����� ���� ������� �� ������ ��� �� +1 9)������ 2 ����� ��� �� ���� ��� ��� �� �� � ������� ��

���� �� ���� ��� � �� �� ��� ��������

� / ���� ���� �� �� ������� ���� ������ �� ������������ ��� �����

� ��� ���� ������ �� �� ����� ������ ������� ���� �� �� ��� �� � ���� �� ����� �� �� �� ������ ������� ����

� -������� �� �� ����� ���� ��� �� � ! ���� 6 �� ��� ������� 6 ���� �� ���� ����� ���� �� ����� �� ������� ������ ���� / ��� ���� �� ��������� ���� �� �� ����� �������� �� �� �� �� ���� ������ 0� ������ ������������ �� % �� ���� ������

� � �� , �$ ������� ��� ��� �� ���� �

� )�� 2 �� ���� ��� ���� ��� ������ ���� � ��� ���% ������� ������� ����� /��� ��� �� ����� � � ��� ��� ����� �� �� �� ��� �� �� ���� � 0� ��� ������ ��� ��� ����� �� �� ������� �� ����� ���� � �� �7���� ��� ������ ������� ��� ���� � �� ����� ��� �� �� ���� 2 ���

� ��� �� ��� � �� ���� �� �� ������ ���6 �� ���' �� �� �����6 �� ���+ �� �� �������6 �� ���5 ��� �� �� �� �� ��� �������

)������ ���� �� ��� ��� � �� �� ��� ��

���� ��� � �� ��� ���� ����� ��� ����� ����� �� ������ �� ������ �����D ��� �� ����� ���� ����� �� �� �� ������ �� ������%�� �� �� ��� ��

� ������� ��� � � ��� � �� �� ������������������� �� ���� ���

�",

��� ��� ������ ��� � ������������� ��� �����

%���� ��� �� ����� ������������� ��� � � ���� ��������� ����� �� �

�� ���� ���� ������������� � �"��� � ����

��� ��� ���� �� ���, ������

���� � �� � � ��� � �����, ���� ���� ������ ��� ����������� ���0 ��� ������� �� ��� ������

��� ��� � ��� �� ������� ��� �� ��� �������

Page 223: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

1 )�� ���� �

� #���� ��� �� ���� ��������� �������� �� 21 �� '11 �$ ���� ����� ����� ���� #���� �� ��� � ���� ��� ����� ����� ����� �� � ���������

� � �� ��� �� ���� �� �� � � ��������� ��� ���� �� ������� ����

� ��� �� ������� �� �� ��� �� ����� �� ����� 2�� ��� �� ������ ���� �� �� ���� ������� )��� �� ���� ����� F� �� ��� ������� ����������� �������� �� ���� 5� �� ��� ��

��������� ����� ���� � &���������� � ������ �������(�

@�� ��� ��� ���� � � �� ���� � ������ �� �� ������� ��������� �� �� � ������� �� ������ ������� ����������

! ������ �� ��� ��� ������ ����� �� ����

0� ���� ������ ���� � ������� ����� ���� ��� ���� 0� ����"����� ���� ��� �� �� �� ���� ������ )������ �� �� ������� ���� ���� ������ �� ����� ���%� � �� ����� �� � �������� �� +623 ���� � ����� �� ��� ������ �� ��� �����0� ���� ����� ���� ������ � ��������� ������ ���� � �����"

����� ����� � �� ��� � �� �������� � ! ��� -��� 4���� )������-�������� 0�� �� �� ����� ���� ������� �����

� �������������� ����� � � � � �� ���� �� ����� ������ �� �� �� �� ���� ��� �� � ���� � ������� ��� � ���� �� ������ ��� �� � ������������ �� ��� �������

�"-

cathodalcontact

movableelectrode

alignerprotrusions

transparentlid

pad

electrode

anodalcontact

ceramic tray

ceramic traycathodal side

end of film

IPG stripparaffin oil

paraffin oil

sample

samplecup

samplecup

���� - �������� ����� �� � � �������

$ ������ � � ����� ����������� ������ � �� �� �����2���� � �����������

)��� � � �� ��� �� ���� ������ ����� �� ������ ��� ���������� ����� ������

)��� ����� ������ ����� ���� �� ���� ������ �� ����� ���� ���� �

Page 224: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���� #� $�������� ����� �

� ������� ����� ���� ���� � �������� �� �������

0� � ! ���� � �� ������ ��������� �� 7����������� �� -#- ����"� ��� �� ����� �������� ��� �� ����� �� � � ��8� �� 6<1 ��6*1 9)�-�� �� �� ���� � ��� � ������ ��� ��� ������ ����� �� ���

�� ��� ����������

-�������� �� $% ������

��� ����� �� �� ����� �� � ! ������

53 ��� ����� ���� +' �$ *2 3 45 G, ��% � �� ' $ 4+G����

''3 ��� ����� ���� H<�' �$ *2 3 45 G, ��% � �� ' $ 4+G����

' 3 ����% � �������� ' � .��� ����� 'H �� '11 �$ 4+G����

��� �� 21 9) ��������� ������

��� ) � ������ ���� ��� ' �$ ' 3 ����% �������� ��� E �$ ��''3 ��� ����� ����

�������� ���������� ��� ��� +1 ��� �� +1 3 0).�� ���� ��� ' ��� �� 5 3 ��� ����� ������ ����� ��� '1 ��� �� 1�' 3 .��� ����� 'H �������� ���������� ���� 5 I ' ��� ���� 4+G�����

� �� ����� ���� 2 3 ������� ��� ���

� ��������� �� ����� �� ��� �������"

��)����� � �����.� � .��� �������� �� $% ������

0��� �� ��� � �� ���� �������� ������ ��� � ! ���� �� ��� �� ������� ��������� �� ���� ���� � ! ���� � ��� ����� �������� ������� �� � ��8� �� ��������� B��� ���� ��� ��������� ���� ���� ����� ����� ���� ����� �� ����� ����� ������ ���� ���"����

�"/

Page 225: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

3 ���� � � �� $'( ������

#����� ��������

1�+ ����$ �����8���1�' 3 -#- +�H+ �

J 1�+ ������8��-#- ������� �� +11 �$ 4+G����

�� ����� ��������

1�+ ����$ 8��� ������2�H, � K� -G, ������� �� +11 �$ 4+G����

$������ ���� ��������

21 �����$ �#0.�+2 �����$0���D 4 *�5 1�<' �

J 5�H+ �0����#0."B�+

������� �� +11 �$ 4+G����

��:��� �� 4 *�5���� � �� ������ �� 0���

�������� ��� ������)����� ���������� ��� ��� '2 ��� �� 1�+ ����$ �����8�� � 1�' 3 -#- �� � ���%��� ���� ��� ' ��� �� 4+G������ ����� &������( ��� 2 ��� �� 1�+ ����$ 8��� �������� ���� ��� ' ��� �� 4+G������ ���� �� � �� �$ �� �� ������ �������� ������ ' � '1 ����

������� ���� �� � ���� ����

-���� �� � ���� ���� �� ���� < ������L

0��� �������� < ��� �� '1 �$ � � ! ���� ���� �������� ���%���

B�� �� ��� ��� � 7��������� ��% � ���� �� ��8�"����� � !���� �

�"�

��� ���� �� ��� ����� �� ������4� �� �"�� ��� ���� ������5

6�0���� ������ �����,�� � ����� ������� ���� �� ���0 ��0���� �

��� ��0���� ������ ��2������� ��� ����� ��

Page 226: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���

�� ���� ��� ��� � ����� � � �� � ����� �� ����� � ���� ������������� ��� ���� � � � �� ����� �� �� ���� ���� � �� ��� ����� � ����� �� �� �� � ������� � � �� ����� � ���� �� ��

� ���� � ���� � ��� ��� � ���� ��� ������ �� �� �� � ������ ���� � �� �� � ������ �������� � �� � � ������� ���� ��� ������ �� ����� � � ����� � �� �� ����� � !�� ������ ��� ��� ��"����� ��� �� � �� � �� �� �� ����� "��� � � � �� �� �� �� � �������� �� �� � ������� ���� ��� �# �� �������� ��� � ������ �� ���� ���� ��� �

������� � � � ������������� ���

$������������� � � �� ���� �� ���� ���� �� � ����� � ���� � ������ � ���� � ����� ��� ������� � � �� ������� ���� � ���� � ��� ����������� � ����� ��� %������ � � � �� �� � ��� ��� �� ���� � �� ��������� ��� � � �� �������� �� � � "��� �"� ���� � ��� ���� �� �� � ����� �� ��� ��" �� ���� ����� �� � � "������ ������ � ���"��� �������� �� ���� � �� �� �� �������� ��& �� ���� � �� ��� &�' �� � � �� ����� ��� ����� � ���� ���� �( �� � �� ���� ��� � �" � ���� � �� ���� �� � �� �� ���� ���

������� �������

)� � � ������ *������� � !�� ���� ������� ���������� +,-���-��.� �� ���

���� �� � � ������������� ��� �������������

���� ���� ��� �� �� �������� �� ��� � � ������

Page 227: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���

��������� �� ������� ������ ����

+, - �������� /*01 ������� +, - � & $!�� � - � &2 �3�4 ��������� �� �� ����� � ����

5��� �� �� � ���� �����

� �������������� �� �� �� ����� �� �� ����������� ���� ��� ������� �� � � �� ������� ����!������� "������ �� ����� #����� �� �� �������� � ������

$�% ���&' !� (���� ��� )�� * +�+ �� , ����������

������� &�' ��6$ &7&�7 �585 ,�+ - 9"6�: + �#�� �� � ����� � ������ 7,, �$+ ��6$ ;� ������ �� �; 7�7#�� �� � ����� � �� �� �� & $

5��� �� �� � ���� �����

�������� � ����� ������� ��"-�

*������� � ������ &, - 9"6�: & �#�� �� � ����< � ������ &, �$

/� ��� �� ��

1318 �� �� � ������ � �� &,, -� � ���� �� �� ��� � �� �� ����� � ������� �� �� � ��������

$ � �#&�� ����� ���� (�� �������

!������ �� �� & - 9"6�: &,, �� ������� �, ��#�� �� � ����� � ������ &, �$

.� �����! �������

����� 9&�' ��6$� �; 7�7:� 585 ,��=' ��6$ �, �$0�� �� 97' -: ', - 9�6�: =& �$!������ �� �� 9& -: ,�,,2 - 2+, �$#�� �� � ����� � �� �� �� &2, �$

/� ��� �� ��

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� �

������ �� ����� ����� ������ ���� �� � �� ����!������ ������� �� �������"��� �� �� �� �� ���

� #$ % ���� �� � � & �� ���������������� � � �������� ���� �� ��� � '$ %���� ���

#% ���������� ���� ���� ���� �� ���� �� � ��� ( ��

Page 228: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

# )�� ��

/����� ������� �#��� ������ (�������

� �� �������� ', �#�� �� � ����� � ' �$

5�� ��� �� ��� ���� �� �� ��� �� ����� � ���������

0� ����! �������

���� 9&�' ��6$� �; 7�7:� 585 ,��=' ��6$ ',, �$#�� �� � ����� � �� �� �� 2 $

5��� �� �� � ���� �����

������������ �� �� ����� ���� ���

!���� ��������� � �������� ���� �� � �� ���� � �� �� ��� ��� ��� �������� >�� ���� �� �� �� ���� ��� � �� ���� � �� �� ���������� �� �� �/0����� ��� ��

�������� ��� �" ����������� ���� ������%�� ���� ������� �� � � � � �� � ���� ��� ����� �� �� ������� � �� ���� ��� ���� � ���� �� � �� ��� �� ��� ��� � ����� ������� � �� �� � ? �� "��� ���� �� ��� �� "�������%�� ���� �� �� � � ����� � ������ �� ��� ���������� ����

��� � �� � � �� "���� �� ����� ��� ���� ��

#������ ���� ������ "��� $���%������ � � �� ����� �� �� ���� ��� "������ ���� ��( ���� �� ��� �� � �� �� ��

� ��� �1� � �� ������ ���� !�� ��� �� �� ��������

! ��� � ��� � �� ��� � �� ��� � �� � '- 9�6�: 8 ���@ A, �������� �� ������� 8� ��� �� ��� � �������� �� ���� ������� ��� ���� � ��� � � ���� ���� "� ���� ������ �� �� �� ��� ����� �� 8 ����

� �������� "��� �� ��� �� � �� �� �� *�� � ����� ������� �� ����� � � ���� � � ��� �� � ��� �� � ����� ���� ���� ��� � � ��� ������� �� ���������� �� ���� � �������� ������� "��� �� !����5��� ���� �� ����� ����� ���������������

���

*����� �� ������� ���������� ��� � � ��� �� �����

Page 229: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� �

� �������� ���� �� ��� � "��� � ����� � "�� � �� � ��� 8 ����

� 8�� �� ��� ����� � ������ ����� �� �� �� � �� ��� ����

���)-���� #�����! �������

1����� 7 �$*� ��� ���� 2,, �$!����5��� &, �$#�� �� � ����� � &�7 �$

� /�� �� + �$ �� �� !����5��� ������� ���� �� ��� ������������ ���� �� � �� ��� "��� � ������ ����� � ��� ��� ��� �� �� � �� ���� ������������� ��� �� �� ��� ��� ���� � ��� ��� �� �����

� /���� �� ��� "��� � ������ ����� � ����� � � "��� � ��������� �� � ����� � "�� � �� ������

� � � � "� ���� ������ � �� �� ���� ������ �������� ������������ ���� ��� �� ��������� ���� ������� ��� ������ �

/� ��� �� ���� �� � "��� � �� � ��� ���� ����� � ��� � �� �� ��� �� ��� ��� � �� �� ���� � �� �� ������� �� �� ����� ��� 9� ����� &:�

���

&�' �� ��� � ���� �� ���� � � ��� � ��� ���� ��� � �� �� �� �� �����

Page 230: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

# )�� ��

���(������� ��� ������ )�� � �* ���+

����� ���������� � ��� �� ������ � � ���� � ����� � � � �� �� � ����� ��� �� � ���� ��� ��������� �� �� ���"���� > � � ���� � �� ��� �� ������ � ������� �� ��� �" � �� ���� �� �( �� � "��� ����� ���� �� ��� ��� � ��� � � ���� ��������� #� � �� ���� &+ � � ����� � �� ��� �� ��� �� ����� � ���� "��� ��� ���� �� �� ������ � ������� �� �� � �" � ��� ��� �! ��� � ���� � ���� �� � ������� �� �� ��� ���� �� � �� � �� ���

� �� ��� ����

� /�� �� � ���� � �� � ����� �� �� ���� �� �� � ��� �� �� �������� ���

*�������� �� �� ����������� ����� �� ���� � ���� �� � ������ ��� � ���� �� ���� � "��� �� �� ���� �� � �� �� ����� ��� ���� ���� ����� � ��� ��� 4� �� �� � �� � � � �������� � � ������� � "� � �� � �� ��� �� � "��� �� ���� � �� �� �� ����� ��� �

� /�� �� ���� �� � �� ������� "��� � ������� �� �� ���� �� ���� � �� ���"� �� ����� 2� �� ���� � �� � ��� �� ���� �� ����

%���� � � ������� �� � ��� � ����� ��� �� ��� �� � �� ���� � �� ���� �� �� �� �� �� �� ���� �� 8� ��� �� ��� ��� ��� "������� �� ���� �� �� � � ������ ���� ��������� "� � �� ������������� �� � � "����

� *��� � ���� ��� �� 0 5 � ������ �� �� �� �� ���� ��� �� ��� ��� ��� �� ���� �� ����� �� �� ����� ��� �

���

separator sheets

cassette

&�' �� ������ ���� �� � �� � ������� �� ����� �� ���� �� � � �� ��� � �� � �� ���� � � ������� �� ������ ��� �

� � ������� ����� +� ������, �� � � �+�!�� ��� �����

-� ���!� ���� ������� ��� ��� �� ���� �� ����

Page 231: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� �

� ��� �� ����� ���� ��� "� ���� �� ������ �� � ��� ��� �� ����� ��� �� �� ���� � "��� �� ������ ���� �� �� ��� "��*��� �� � �� �� �� ��� "� 9����� �: ��� ����� � �� � � ���8� ��� �� ��� ���� ���� ( �� � ���� ��� � ����� � ������ �� � � �� �� �� � �� ��� �

� �� �� ���� � �� �� ������� $ � �� � ���� � ����<������� /� ��� &' �$ �� �� �� ��� ��������� /� ��� &2, �$ �� ��������� ��������

�����!������ ���

B �� ���� � ���� �� ����� ������ � "��� ����� � ��� � �� ����������� "� � �� � ��� �� ��� ����� ���� �� �� �� ������� 0���� �� � �� � �� � �� ��� � �� �� ��� ��� ��

� ��� �� �� ������ ��� ���� �� �� �� �� ����������� ����� ����� �� ��� ��� ����� � ���� �� � "��� � � 4�� �������� � ���� � "���� ���� �� � ���� ������ %���� + ���"� �� "�� ��� ����

� %� �� ����������� ����� ����� � "��� &,, �$ �� �� ���������� ��������

��*

&�' �� ������ �� � � ���� ��

Page 232: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

# )�� ��

(���� �������� 1318 �� ��� � ��� �� � "��� �� ���� ��������� �� ������

������ �� ���� �������� "������ �������� � ������ �� �� ����� � � � ����� �� ��� � �� ����� � ������� � ���

�������� � ������ �� ��� ��� � �������� � ������ ����� ��� � ��� � � ��� � ���

����� �� �� ��� � � ���� �� � �� ��� ����� &, ����� � ���� ���� �� � ���� �� ������ �� � �

2����� ������� #��� ��� ��� �� � � � ��� $� !� #��� $ �� ������ �3�� �'

4�% � � $� � � $5�% � � $% � �

*������� � !�� ������� 9+,-�� �-�: &�A �$ 22' �$ 27& �$ ��7 �$&�' ��6$ ������ �; 7�7� ,�+ - 585 22' �$ 22' �$ 22' �$ 22' �$ 1318 9&,,: - +', �$ +', �$ +', �$ +', �$#�� �� � ����� �� �� �� �� A,, �$ A,, �$ A,, �$ A,, �$3�4 ��� � ��� "��� � "�� � C � ����&, - �������� � ������ ��� �$ ��� �$ ��� �$ ��� �$

� ������� �� 1318 ��� �������� � ������ �� ��� � ���� ������D� 4� �� �� � �� ��� � �� � � � �������� � � "��� ��������� �� � �� ���� �������� �� 1318 �� ���� � ��� �� ���� ��������� �� �������� � ������ �� �" � ���� �� �� ������� �������������� %���� ���� � �� ����� �;� �������� � ������ ���� ��� "��� �� ���( ���� �� �� �� ������� � �� ������ ��� 1318���� � ������ �� �������� � ������ ���� ��� %�� ���� � ���������� � "������ ��� ������������ �� �� "��� ������� � �� ����� � � �� ����� �� � ��� �� �������� � ������ ������ �� &, �� 2, -�

� *�� �� �������� � ������ �� �� ����� � ������� �����4�

� /��� �� � ������� ���� �� ���� � �������� ��� ���� � 9� ����� +:�

� 5��� ������� "� � �� � ��� � ��� � � �� � �" �� ��� � �� � �� �� ������� ���� �� ��

� E ��� �� ������ ��� "��� �� ���� ���� �� ����� ����� ��

� � �� ��������� ������� "� ��" ��" ��"� �� ���� �������� � ��� �� �� B������ � ��� �� ��� � ������ �� �� ���� �� � � ������� � "� ��� �� & �� � �" �� ���� �� �� �� * ������ �� � ����� � ����� �� �� ������ �� �� ���� �� ��5���� �� ���� �� �� ��������� ������� �� �� ����� �����

� � ��� � ������� �� �� ������ �� ���� �� �� � �� �� ���� �� ��� �� ���� � ������� ��� ��� ��� ��������� ������� ���� �� ���

��,

(� � � �� ���� � � ����� �� ������ �� ���� ���� � �������� +� ���� �������������� � �� ���� � ��������

��� ����� �� ����������� ����� ��� ��� ���

* � ����� � ��� ���� � ��.��� � �� (���� ��� ����!� �� ���������

Page 233: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� �

��� ����� � ���� �� �� �� � ��� ��������� � �� � �� ���� �������� ��� ��� � ��� ���� ������� ��� ���������� � �� � � �� �� ������� �� �� ��� ���� �� �

� ��� ���� � ��� �� & �$ �� ��� ������� ���� ��� ���� �� 9� ����� ':�

��-

plastic tube

reservoir fordisplacementsolution

&�' *� ������ � ������ ��� � ��

hydrostaticequilibrium

overlaysolution

&�' ,� ����� �� ��� �� �� ���!�� �� � � ��������

Page 234: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

# )�� ��

*���� ', �$ ����� � ������� ����� � �� �� �� $ � �� ���� ���� �� � ��� � � � � ��� ��� ������� ���

� $ � �� � ���� ��� ��� �� ������ � �� ���� �� � ��� ��� "��� �� ���� �� �� �� � � �� ��

�� �� ���� � �� ������� �� ����� �� �� �� ��� ������� "������ �� ������ �� ���� � ��� ���� ��� �� � ��� � ����� �� ������� ��� ��� "� �� ����

� 8����� ��������� ���� �� ��� ������ �� ��� � "��� ������ � "�� � �� � ��� �� ������� ��� ���� �� ���� �� � ��� ��� 4� �� ����������� �

� ��� �6�� ���!� � �����! ������� �� (� � ���� � �� � �� ��� ��� �������! !� �� ���� (����� ! �� ��� �� ���

� ���� �� ��� � ���� �� ��� � ���� ��� ���� �� 0 � "��� ������� � ����� ��� � �� ��

� 5��� �� ���� � � �� �� �������� ������� � "��� ����� &,,�$ � ������ ������� �� ���� � �� ����� �� ������� ������� � ���� ��������� #� � �� � � �� ��� �� � �������� � 4� ���� ��� �� ������� � "��� �� � � ���� � ��� ������ � � ���� ������

� E��� �� � ���� � ��� �� � ������� �� � "��� ��� � � ��� �� ��� �� � "��� � ����� � "�� ��

� $ � �� � ��� �� �� ����

������������� ���

0���� �� � � �� ��� �������� � �� �� ��� ���� ����� � ���� �� #� � ����� � ��� � � �� ��� ��� � ����� ��� ���� �� ����� � �������� � �������� ;�" � �� ��� ��� ���� �� ����� ��� � ��� ���" � � �� � ���� ������������� 3��� ������������ � ����� ��" �� ���� ����� �� � � "��� � � �������� ����� � ������ ��� 4� �� �� � ���� � �� � �������� � � �� ���� � � "������ � �����"���� ��� � � �� �� "�� "��� ����������� � ����� �� ��� � ���������� �� �� � ����� ����������� �� �� �( �� ��" ��� �� ������ � ���� � �� �� ��������� ������� �������� �� ����� �� �� � ���"��� � �������� ���� �� �� ������� * �������� ���� ��� ��� �� ������ ���� � � �� � ��� �� �� ���� �� �� ������ �� � � ���� ��� ���� � ������ �� ��" ��� �

��.

��� �� ��� �� & �������� ��� � � �� � � ��������� �� �� �� �� �� �� �� � ������� ��������� * ��������� �� ����� �� ���!�� �� �� ����

� ������, ������ �� �+� ����� � � ����� � "���

Page 235: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� �

�������� ����� ��� ��� /�� �� � �� ��� ��� ����� �� �� � "��� � ���� ��� ����� �

�� �� ��C����� ��������� ������� �� �� � �� � �����F �� � ���� � �� ��� &, �� ���� �� �� �� �� ���� ��

� ��� �7�� � �����(� !� � � ��#�� ������ �� ����� ��� �� !����� ���� � ������ 8 ��#�� �� �� ��� (��� �� �� �� �� ��� �� � ����� ��!�� �� �� !����� �����

� ��� �� �� ������ ��� ���� �� �� �� �� ����������� ����� ����� ��

� /�� � �������� ���� �� �� � 4�� ���� ����� ���������� ��� �� ���� � ��

� ���� �� �� ������ ��� "��� �� � 4�� ������ �� �� ������ �� �� ��

� %� �� ����������� ����� ����� � "��� &,, �$ �� �� ���������� ��������

� /�� � ���� ��� ���� ��� ? 2 �� � �� ��� ? ���� �� ��4�������� ��

� ��� �� ���� ����� ��� � �" � �� � � ����� ��� ��4�������� ��

(���� ������� �� ������� ���� � � �� ������� �������� 2, - ��� �� �� ������� �� ����

�� ���� 1318 �� ��� � ��� �� � "��� �� ���� ��������� �� ������

�����< �� ���� �������� "������ �������� � ������ �� �� ����� � � � ����� �� ��� � �� ����� � ������� � ���

�������� � ������ �� ��� ��� � �������� � ������ ����� ��� � ��� � � ��� � ���

����� �� �� ��� � � ���� �� � �� ��� ����� &, ����� � ���� ���� �� � ���� �� ������ �� � �

3���� � �������� "��� � �� � - �� ��� � - � ��� &+ ����� ��� � "��� & �� ����� ��F

'�!�� �������� �%� �'

+ � � $� � � $5 � � 9 � �

*������� � !�� ������� 9+,-�� �-�: A, �$ &&� �$ &�' �$ � � � �$&�' ��6$ ������ �; 7�7� ,�+ - 585 &&� �$ &&� �$ &&� �$ &&� �$ 1318 9&,, -: 22' �$ 22' �$ 22' �$ 22' �$#�� �� � ����� �� �� �� �� +', �$ +', �$ +', �$ +', �$3�4 ��� � ��� "��� � "�� � C � ����&, - �������� � ������ &�7 �$ &�7 �$ &�7 �$ &�7 �$

��/

(�� � ������, ����� � �������� �����

(� � � �� ���� � � ����� �� ������ �� ���� ���� � �������� +� ���� �������������� � �� ���� � ��������

��� ����� �� ����������� ����� ��� ��� ���

Page 236: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

# )�� ��

.� �������� �%� �'

$� � � $: � � 5� � � 9 � �

*������� � !�� ������� 9+,-�� �-�: &'7 �$ &7, �$ 22' �$ � � � �$&�' ��6$ ������ �; 7�7� ,�+ - 585 &&� �$ &&��$ &&� �$ &&� �$0�� �� 97' -: &&, �$ &&, �$ &&, �$ &&, �$ 1318 9&,, -: 22' �$ 22' �$ 22' �$ 22' �$#�� �� � ����� �� �� �� �� +', �$ +', �$ +', �$ +', �$3�4 ��� � ��� "��� � "�� � C � ����&, - �������� � ������ &�+ �$ &�+ �$ &�+ �$ &�+ �$

� ������� �� 1318 ��� �������� � ������ �� ��� � ���� ������D� 4� �� �� � �� ��� � �� � � � �������� � � "��� ��������� �� � �� ���� �������� �� 1318 �� ���� � ��� �� ���� ��������� �� �������� � ������ �� �" � ���� �� �� ������� �������������� %���� ���� � �� ����� �;� �������� � ������ ���� ��� "��� �� ���( ���� �� �� �� ������� � �� ������ ��� 1318���� � ������ �� �������� � ������ ���� ��� %�� ���� � ���������� � "������ ��� ������������ �� �� "��� ������� � �� ����� � � �� ����� �� � ��� �� �������� � ������ ������ �� &, �� 2, -�

����� � �� ������������ �� ������� ��� � ����� �� �� ���� ��������� �� ������ � "��� �� ������ �� �������� � ������ � � ������� ������ ���� ��� � ��� ���� �� ��� � �� ����� �� �� ����� ���� ���� �� � � �� ������� ���� ������� �� �������� � ���� �� ���� �������� ����� ����� �� �� ��� ��� ���� � ��"� ��"� �� �� ������� ��� �� � �� ��������� ��� �"� � �����F

� � ��� ���� ����� �� �� � �� �� "���� "��� ������� �� ������ ���

� 8����� ���� �������� �� � ���������� �� �� �" � �������"��� ���� ��� ������ �� "��� �� �� ��� � ����������"�� � ������ �� � ���� � ��� � �� �

%���� � ���"� �� � ��� ��� ������� � ����� �� � �

� *�� �� �������� � ������ �� �� ����� � �������� �����4�

� /��� �� � �� ������� ���� �� � � ������� ��� ��� �� � �� ��� ��� ��� � C��� ����� �������

��" �� �� �� ���� ���� ����� � ��� �� ��� � �� ��� �������� ��� ��"� ���� �� ��4��� ����� �� ��� �� �� ��� �� �� � � ������

� /��� �� ���� ������� ���� �� ��4��� ����� ��

���

��� ����� �� ����������� ����� ��� ��� ��� /�� �� ���� ��� � ����� � ������� ���� ��0

* � ����� � ��� ���� � ��.��� � �� (���� ��� ����!� �� ���������

(�� ����� ��� �� � ��� ������������ � �� ��� �� �������� �� ��� ���� � ��������

1��� ���� ��� �� ���� �� ���� � �� ���� �� � ����� ������ �� �����

)���, �� � ��������

Page 237: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� 5���� �� ���� ��� ����� ��� .� � �� �������� ���� �� �� � 4� � ������ �� �� � 4� ��

��� �� ������ ���� � �� � ���� ������� ����� ����� ����" ��"� �� �������

� .� � �� ������ ��� �� �� ����� �� �� �� >�" � �� �������� "� ��" ���� �� ��4��� ����� � ��� "� � ��4 � "����� ���� ��������

� *�C��� �� ��" ��� �� � ���� � �� � "��� �� ������������� !�� �� �� � ���� ��� � ��� ���� �� ����� ��4��� ���������� �� �� B����� � ����� � �� �� ������� ������� ��� ����� � ������ &, ����� ��

*�� � �� &, ����� � �� ����� �� �� � ����� � ����� �� ��� ������ � ���� �� "� �� ��� �� �� � �� �������� �� �� � 4� ����������#� � �� � ��� � ��� � � �� � �" �� ��� � �� � �� �� �����

��� ���� �� �� �� ����� �� �� � ����� � ��� �����

� ��� �� �������� ���� � ��� �� ���� ����� ������ ���� ����� ��� ��� �� � ���� �� ����� � ��� � ��� � � ��� �" �� ��� � �� � �� �� ���� �� ��

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� ����

plastic tube

pinchcockclamp

magneticstirrer

balance chamberwith displacingsolution

lightsolution

mixingchamber

reservoir

densesolution

&�' -� ������ ����� � � �� � �� ����� ���� ��

�� �� � & �� ���2 � ���������� �� �+� ����

Page 238: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� E ��� �� ������ ��� "��� �� ���� ����� ������ ���� �� ����� ����� � ��� ���� �� ���� ��� ����� ��

�� ����� � ������� �� ��� �� �� �� � � ������� ����� �( � 4���� � ��C��� �� ���� � �� �� ����� �� �������� �� �� ����������� ������� � � � "� ���� ��� ��� � ������ ���� � ����� ����� ���� ��� �� �� ��� �� � �������� ������ "� ��� ���� � ����� � � �� ��������� ������� "� ��" ��" ��"� �� ���� �����

��� � ��� �� �� B������ � ��� �� ��� � ������ �� �� ���� �� � � ������� � "� ��� �� & �� � �" �� ���� �� �� �� * ������ �� � ����� � ����� �� �� ������ �� �� ���� �� ��5���� �� ���� �� �� ��������� ������� �� �� ����� �����

� � ��� � ������� �� �� ������ �� ���� �� �� � �� �� ���� �� ��� �� ���� � ������� ��� ��� ��� ��������� ������� ���� �� ������ ����� � ���� �� �� �� � ��� ��������� � �� � �� ���� �������� ��� ��� � ��� ���� ������� ��� ���������� � �� � � �� �� ������� �� �� ��� ���� �� �

� ��� ���� � ��� �� & �$ �� ��� ������� ���� ��� ���� �� 9� ����� ':�

� $ � �� � ����� �� ��� �"� ������� � �� ���� �� � ��� ��� "��� �� ���� �� �� �� � � �� ��

�� �� ���� � �� ������� �� ����� �� �� �� ��� ������� "������ �� ������ �� ���� � ��� ���� ��� �� � ��� � ����� �� ������� ��� ��� "� �� ����

� 8����� ��������� ���� �� ��� ������ �� ��� � "��� ������ � "�� � �� � ��� �� ������� ��� ���� �� ���� �� � ��� ��� 4� �� ����������� �

� ��� �6�� ���!� � �����! ������� �� (� � ���� � �� � �� ��� ��� �������! !� �� ���� (����� ! �� ��� �� ���

� ���� �� ��� � ���� �� ��� � ���� ��� ���� �� 0 � "��� ������� � ����� ��� � �� ��

� 5��� �� ���� � � �� �� �������� ������� � "��� �����&,, �$ � ������ ������� �� ���� � �� ����� �� ���������� ���� � ���� ��������� #� � �� � � �� ��� �� � ������� �� � 4� ���� ��� �� ������� � "��� �� � � ���� � ������� �� � � ���� ������

� E��� �� � ���� � ��� �� � ������� �� � "��� ��� � � ��� �� ��� �� � "��� � ����� � "�� ��

� $ � �� � ��� �� �� ����

# )�� �� ���

��� �� ��� �� & �������� ��� � � �� � � ��������� �� �� �� �� �� �� �� � ������� ��������� * ��������� �� ����� ������� �� �� ����

Page 239: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��"��� ������ �� �� � ��0 ���

��"�� ���������� � ��� �� ������$��� � ������� � ���� � ������� ��4� ��� "� � ��� � � " � � �� �� ��� �� .�� �"�� �� � � "��� ��� �� �� � � ����� ��� �� �"��� � ���� � �� �� � �� �� � ���� � ��� � " � � �� ��� ��� ���� � ��� ��� ������� > � � ���� � �� ��� �� ������ � ��������� �� � �" � �� ���� �� �( �� � "��� ����� ���� �� ��� ��� ���� � � ���� ��������� #� � �� ���� � � � ����� � �� ��� ����� �� ����� � ���� "��� ��� ���� �� �� ������ � ��������� �� � �" � ��� ��� �! ��� � ���� � ���� �� � ������� �� �� ��� ���� �� � �� � �� ���

� �� ��� ���� ;���� � ��� � � �� ���� ������� �� ����� ����� �� �� ��� "� �� �� ���� �� ����� �� � � ���� � ���� � ��������� �� � ���� �� �� ������ �� �� ����� ��� � %�� ������� ����� �� ��� � �� �� �� B����� � ���� � ��� �� �� ��� ( ��� ����� ��� �� � ��� ���

� /�� �� ���� �� � �� ������� "��� � ������� �� �� ���� �� ���� � �������� "��� � � ������� �� �� �� ���� � �� � ��� �� ���� �� � ���

%���� � � ������� �� � ��� ? � ����� ? ����� �� �� �� ��� �� � �� ���� � �� ���� �� �� �� �� �� �� ���� �� 8� ����� ��� ��� ��� "��� ���� �� ���� �� �� � � ������ ���� ���������� "� � �� ������� ������ �� � � "����

� *��� � ���� ��� �� 0 5 � ������ �� �� �� �� ���� ��� �� ��� ��� ��� �� ���� �� ����� �� �� ����� ��� �

� ��� �� �"� ��� "� ���� �� ������ �� � ��� ��� �� �������� �� �� ���� � "��� �� ������ ���� �� �� ��� "�� *����� ��4 ����� ��� ����� � �� ��� "� � ��� 8� ��� �� ������� ���� ( �� � ���� ��� � ����� � ����� �� � � ���� �� � �� ��� �

� %�� �������� ��� �� � ���� � ������� �� � ����� ��� �� � ����� ��� ���� ����� �� �� ���"����

� /� ��� = �$ �� �� �� ��� ��������

��"�� !������ ���B �� ���� � ���� �� ����� ������ � "��� ����� � ��� � �� ����������� "� � �� � ��� �� ��� ����� ���� �� �� �� ������� 0���� �� � �� � �� � �� ��� � �� �� ��� ��� ��%�� ����� � ��� � � �� ����� � ������� �� �������� �

������� �� ����� ����� �� �� ���� �� ��������� ������� ��� � ��

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� ����

� � ������� ����� +� ������, �� � � �+�!�� ��� �����

(�� ��� � � ������� � ��� �� �� ������� ��� ��� �� �����+���

Page 240: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� ��� �� �� � ���� �� �� ������ �� �� ����� ��� "��� �� ��� �� "��� � �� � �� ������ ��� � �������� �����

(���� �������� 1318 �� ��� � ��� �� � "��� �� ���� ��������� �� ������

�����< �� ���� �������� "������ �������� � ������ �� �� ����� � � � ����� �� ��� � �� ����� � ������� � ���

�������� � ������ �� ��� ��� � �������� � ������ ����� ��� � ��� � � ��� � ���

����� �� �� ��� � � ���� �� � �� ��� ����� &, ����� � ���� ���� �� � ���� �� ������ �� � �

2����� ������� #��� ��� ��� �� � � � ��� : !� #��� $ �� ������ ��%� �'

4�% � � $� � � $5�% � � $% � �

*������� � !�� ������� 9+,-�� �-�: 7+ �$ &&� �$ &+& �$ &�A �$&�' ��6$ ������ �; 7�7� ,�+ - 585 &&� �$ &&� �$ &&� �$ &&� �$ 1318 9&,,: - 22' �$ 22' �$ 22' �$ 22' �$#�� �� � ����� �� �� �� �� +', �$ +', �$ +', �$ +', �$3�4 ��� � ��� "��� � "�� � C � ����&, - �������� � ������ &�7 �$ &�7 �$ &�7 �$ &�7 �$

� ������� �� 1318 ��� �������� � ������ �� ��� � ���� ������D� 4� �� �� � �� ��� � �� � � � �������� � � "��� ��������� �� � �� ���� �������� �� 1318 �� ���� � ��� �� ���� ��������� �� �������� � ������ �� �" � ���� �� �� ������� �������������� %���� ���� � �� ����� �;� �������� � ������ ���� ��� "��� �� ���( ���� �� �� �� ������� � �� ������ ��� 1318���� �� � ������ �� �������� � ������ ���� ��� %�� ���� ���������� � "������ ��� ������������ �� �� "��� ������� � �� ������ � � ����� �� � ��� �� �������� � ������ ������ �� &, ��2, -�

� *�� �� �������� � ������ �� �� ����� � ������� �����4�

� /��� �� � ������� ���� �� ���� � �������� ��� ���� � 9� ����� =:�

# )�� �� ���

(� � � �� ���� � � ����� �� ������ �� ���� ���� � �������� +� ���� �������������� � �� ���� � ��������

��� ����� �� ����������� ����� ��� ��� ���

* � ����� � ��� ���� � ��.��� � �� (���� ��� ����!� �� ���������

Page 241: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� 5��� ������� "� � �� � ��� � ��� � & �� � �" �� ��� � �� � �� �� ������� ���� �� ��

� ��� ���� � ��� �� & �$ �� ��� ������� ���� ��� ���� �� 9� ����� 7:�

3���� � �������� "���� ��� � � �� �� �� �� ���� ��� � �� ���� � � � � ��� �� �� ������� ��

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� ���*

filling channel

filler port

&�' .� ������ ����� ��� � ���

filler port

overlay

solution

&�' /� #� ���!�� �� � � ��������

Page 242: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� $ � �� � ���� ��� ��� �� ������ � �� ���� �� � ��� ��� "��� �� ���� �� �� �� � � �� ��

�� �� ���� � �� ������� �� ����� �� �� �� ��� ������� "������ �� ������ �� ���� � ��� ���� ��� �� � ��� � ����� �� ������� ��� ��� "� �� ����

� 8����� ��������� ���� �� ��� ������ �� ��� � "��� ������ � "�� � �� � ��� �� ������� ��� ���� �� ���� �� � ��� ��� 4� �� ����������� �

� ���� �� ��� � ���� �� ��� � ���� ��� ���� �� 0 � "��� ������� � ����� ��� � �� ��

� 5��� �� ���� � � �� �� �������� ������� � "��� �����&,, �$ � ������ ������� �� ���� � �� ����� �� ���������� ���� � ���� ��������� #� � �� � � �� ��� �� � ������� �� � 4� ���� ��� �� ������� � "��� �� � � ���� � ������� �� � � ���� ������

� E��� �� � ���� � ��� �� � ������� �� �� "��� ��� � � ��� �� ��� �� � "��� � ����� � "�� ��

� $ � �� � ��� �� �� ����

��"�� �������� ���0���� �� � � �� ��� �������� � �� �� ��� ���� ����� � ���� �� #� � ����� � ��� � � �� ��� ��� � ����� ��� ���� �� ����� � �������� � �������� ;�" � �� ��� ��� ���� �� ����� ��� � ��� ���" � � �� � ���� ������������� 3��� ������������ � ����� ��" �� ���� ����� �� � � "��� � � �������� ����� � ������ ��� 4� �� �� � ���� � �� � �������� � � �� ���� � � "������ � �����"���� ��� � � �� �� "�� "��� ����������� � ����� �� ��� � ���������� �� �� � ����� ����������� �� �� �( �� ��" ��� �� ������ � ���� � �� �� ��������� ������� �������� �� ����� �� �� � ���"��� � �������� ���� �� �� ������� * �������� ���� ��� ��� �� ������ ���� � � �� � ��� �� �� ���� �� �� ������ �� � � ���� ��� ���� � ������ �� ��" ��� �%�� ����� �� � � �� ����� � ������� ��� �� � �������� �

������� �� ����� ���� �� �� ������ �� �� ����� ��� � �� ���� ��� " � � �� �� �� � �� ���� �� �� B����� � ����� � �� �� ������� �� �� ���� � "��� ��������� ��������

� E ��� �� B����� � ���� � ��� �� ���� �� ���� ��� /� ��� 2,, �$ �� ��������� ��������

�������� ����� ��� ��� /�� �� � �� ��� ��� ����� �� �� � "��� � ���� ��� ����� �

�� �� ��C����� ��������� ������� �� �� � �� � �����F �� � ���� � �� ��� &, �� ���� �� �� �� �� ���� ��

# )�� �� ��,

��� �� ��� �� & �������� ��� � � �� � � ��������� �� �� �� �� �� �� �� � ������� ��������� * ��������� �� ����� �� ���!�� �� �� ����

� ������, ������ �� �+� ����� � � ����� � "���

Page 243: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� ��� �7�� � �����(� !� � � ��#�� ������ �� ����� ��� �� !����� ���� � ������ 8 ��#�� �� �� ��� (��� �� �� �� �� ��� �� � ����� ��!�� �� �� !����� �����

� /�� � �������� ���� �� �� � 4�� ���� ����� ���������� ��� �� ���� � ��

� ���� �� �� ����� ���� "��� �� � 4�� ������ �� �� ����� ���� ��

� /�� � ���� ��� ���� ��� ? 2 �� � �� ��� ? ���� �� ��4�������� ��

� ��� �� ���� ����� ��� � �" � �� � � ����� ��� ��4�������� ��

(���� ������� �� ������� ���� � � �� ������� �������� 2, - ��� �� �� ������� �� ����

�� ���� 1318 �� ��� � ��� �� � "��� �� ���� ��������� �� ������

�����< �� ���� �������� "������ �������� � ������ �� �� ����� � � � ����� �� ��� � �� ����� � ������� � ���

�������� � ������ �� ��� ��� � �������� � ������ ����� ��� � ��� � � ��� � ���

����� �� �� ��� � � ���� �� � �� ��� ����� &, ����� � ���� ���� �� � ���� �� ������ �� � �

3���� � �������� "��� � �� � - � ��� � - � ��� &+ ����� ��� � "��� & �� ����� ��F

'�!�� �������� �%� �'

+ � � $� � � $5 � � 9 � �

*������� � !�� ������� 9+,-�� �-�: +2 �$ '� �$ �� �$ � � � �$&�' ��6$ ������ �; 7�7� ,�+ - 585 '� �$ '� �$ '� �$ '� �$ 1318 9&,, -: &,' �$ &,'�$ &,' �$ &,' �$#�� �� � ����� �� �� �� �� 2&, �$ 2&, �$ 2&, �$ 2&, �$3�4 ��� � ��� "��� � "�� � C � ����&, - �������� � ������ 7+, �$ 7+, �$ 7+, �$ 7+, �$

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� ���-

(�� � ������, ����� � �������� �����

(� � � �� ���� � � ����� �� ������ �� ���� ���� � �������� +� ���� �������������� � �� ���� � ��������

��� ����� �� ����������� ����� ��� ��� ���

Page 244: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

.� �������� �%� �'

$� � � $: � � 5� � � 9 � �

*������� � !�� ������� 9+,-�� �-�: =+ �$ 7+ �$ &,' �$ � � � �$&�' ��6$ ������ �; 7�7� ,�+ - 585 '� �$ '� �$ '� �$ '� �$0�� �� 97' -: ', �$ ', �$ ', �$ ', �$ 1318 9&,, -: &,' �$ &,' �$ &,' �$ &,' �$#�� �� � ����� �� �� �� �� 2&, �$ 2&, �$ 2&, �$ 2&, �$3�4 ��� � ��� "��� � "�� � C � ����&, - �������� � ������ �=, �$ �=, �$ �=, �$ �=, �$

� ������ �� 1318 ��� �������� � ������ �� ��� � ���� ������D� 4� �� �� � �� ��� � �� � � � �������� � � "��� ��������� �� � �� ���� �������� �� 1318 �� ���� � ��� �� ���� ��������� �� �������� � ������ �� �" � ���� �� �� ������� �������������� %���� ���� � �� ����� �;� �������� � ������ ���� ��� "��� �� ���( ���� �� �� �� ������� � �� ������ ��� 1318��� � ������ �� �������� � ������ ���� ��� %�� ���� � ���������� � "������ ��� ������������ �� �� "��� ������� � �� ����� � � �� ����� �� � ��� �� �������� � ������ ������ �� &, �� 2, -�

����� � �� ������������ �� ������� ��� � ����� �� �� ���� ��������� �� ������ � "��� �� ������ �� �������� � ������ � � ������� ������ ���� ��� � ��� ���� �� ��� � �� ����� �� �� ����� ���� ���� �� � � �� ������� ���� ������� �� �������� � ���� �� ���� �������� ����� ����� �� �� ��� ��� ���� � ��"� ��"� �� �� ������� ��� �� � �� ��������� ��� �"� � �����F

� � ��� ���� ����� �� �� � �� �� "���� "��� ������� �� ������ ���

� 8����� ���� �������� �� � ���������� �� �� �" � �������"��� ���� ��� ������ �� "��� �� �� ��� � ����������"�� � ������ �� � ���� � ��� � �� �

%���� A ���"� �� � ��� ��� ������� � ����� �� � �� �� ���� � �����4 � ��

� *�� �� �������� � ������ �� �� ����� � �������� �����4�

� /��� �� � �� ������� ���� �� � � ������� ��� ��� �� � �� ��� ��� ��� � C��� ����� �������

��" �� �� �� ���� ���� ����� � ��� �� ��� � �� ��� �������� ��� ��"� ���� �� ��4��� ����� �� ��� �� �� ��� �� �� � � ������

� /��� �� ���� ������� ���� �� ��4��� ����� ��

# )�� �� ��.

��� ����� �� ����������� ����� ��� ��� ��� /�� �� ���� ��� � ����� � ������� ���� ��0

* � ����� � ��� ���� � ��.��� � �� (���� ��� ����!� �� ���������

(�� ������ �� �� � ��� ��������� � � +�� �� ������� �� ��� ��� � �(�����

1��� ���� ��� �� ���� �� ���� � �� ���� �� � ����� ������ �� �����

)���, �� � ��������

Page 245: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� 5���� �� ���� ��� ����� ��� .� � �� �������� ���� �� �� � 4� � ������ �� �� � 4� ��

��� �� ������ ���� � �� � ���� ������� ����� ����� ����" ��"� �� �������

� .� � �� ������ ��� �� �� ����� �� �� �� >�" � �� �������� "� ��" ���� �� ��4��� ����� � ��� "� � ��4 � "����� ���� ��������

� *�C��� �� ��" ��� �� � ���� � �� � "��� �� ������������� !�� �� �� � ���� ��� � ��� ���� �� ����� ��4��� ���������� �� �� B����� � ����� � �� �� ������� ������� ��� ����� � ������ &, ����� ��

*�� � �� &, ����� � �� ����� �� �� � ����� � ����� �� ��� ������ � ���� �� "� �� ��� �� �� � �� �������� �� �� � 4� ����������

� ��� �� �������� ���� � ��� �� ���� ����� ������ ���� �����

� ��� �� ������ ��� � �" � �� ��4��� ����� � ��� �� � � ������

� /��� �� 2,, �$ ��������� ������� ���� �� ��4��� ����� ��� �� ����� �� �� ��

� .� � �� �������� ���� �� �� ��� �������� � ��������� ����� ���

� #� � �� ����� � �������� ��� � ��� � �� � ��� � � �"���� �� & �� � �" �� ��� � �� � �� �� ���� �� �� ��� �� �������� �����

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� ���/

magneticstirrer

lightsolution

mixingchamber

reservoir

densesolution

pinchcockclamp

&�' �� ������ ����� � � �� � �� ���� � ��� ��$ � ���

�� �� � & �� ���2 � ���������� �� �+� ����

Page 246: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� ��������� ������� ? ����� � ���� �� �� ��� � ������� ��� �� ? ����� �� �� B����� � ����� � ���� � �� ��� ��� ���� ���� ������� ��� ���������� � �� � � �� �� ������ �� �� ������� �� �

� ��� ���� � ��� �� & �$ �� ��� ������� ���� ��� ���� �� 9� ����� 7:�

� $ � �� � ���� ��� ��� �"� ������� � �� ���� �� � ��� ��� "��� �� ���� �� �� �� � � �� ��

�� �� ���� � �� ������� �� ����� �� �� �� ��� ������� "������ �� ������ �� ���� � ��� ���� ��� �� � ��� � ����� �� ������� ��� ��� "� �� ����

� 8����� ��������� ���� �� ��� ������ �� ��� � "��� ������ � "�� � �� � ��� �� ������� ��� ���� �� ���� �� � ��� ��� 4� �� ����������� �

� ��� �6�� ���!� � �����! ������� �� (� � ���� � �� � �� ��� ��� �������! !� �� ���� (����� ! �� ��� �� ���

� ���� �� ��� � ���� �� ��� � ���� ��� ���� �� 0 � "��� ������� � ����� ��� � �� ��

� 5��� �� ���� � � �� �� �������� ������� � "��� �����&,, �$ � ������ ������� �� ���� � �� ����� �� ���������� ���� � ���� ��������� #� � �� � � �� ��� �� � ������� �� � 4� ���� ��� �� ������� � "��� �� � � ���� � ������� �� � � ���� ������

� E��� �� � ���� � ��� �� � ������� �� � "��� ��� � � ��� �� ��� �� � "��� � ����� � "�� ��

� $ � �� � ��� �� �� ����

�1������� �����%���� ��� ��� ���������

E ������� � � �� � ��� ������� �� ����� � �� �������� �������� ���� ��� � � �� � ��� �� � ���� �� ���� � ���� � � ���� ���� �� �� � � �� ��� �� � � ����� ��� �� �� � ����� ���� �� ������ � ��

� /�� �� ���� �� ��� � ������� � � �� �� � ��� ��� "����� ���� ��"�� ������ ���� �� �� �� � �� �� ��� � ��� �� �� ���� ��� ��������� "��� � 2 - 9"6�: 585 "�� � ��������� ���� �� "��� "�� � ��� ��� �� ���� � � "��� � ������ ����� ��� �� /�� �� & � � ���� � ���� �� ���� ��� �� ���� � ���� �� ���� � �� �� ������ ��� 9� ����� &,:�

3 *��� �� ����!���� ���� �� ������� ���

��� �� ��� �� & �������� ��� � � �� � � ��������� �� �� �� �� �� �� �� � ������� ��������� * ��������� �� ����� �� ���!�� �� �� ����

�� �� ��� ��� ��� # �4 ������� �&���� � .� � ��������� ������ ��� ����� ���� ���� �� ���+�� ��������� � ������� ��� ����� ���� ��� ��� ���+�� ��������� � � ������

Page 247: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� .� � �� � ����� �� ������� ������ �� � �� ��� ��� ��� ����� & �� ���� �� �� �� ����� ������� �� � �� �� ������� ���� E ��� �� � ���� �� ����� �

� � �� ���� ���� � ������ ������� ��� ��� �� � ��� ��� � �� ��� ���� �� � ������� ��� ������� � �����4���� � &' ��� ���� �� ��� 9? �� �������: �� �� �� � ��� �����4���� �' �� �� �� �� �� ��� ��

� E ��� �� ���� ���� ������ �� � ���� �� � � ;������ �� � ��� �� �� ��� ������� ��� �������� ��� ��� � ���� ��"�� �� � �� ���� ��� � *��� �� ����� �� �� �� � "����� ��� � �� �� �� ��� ���� � � 4� �� �� �� ���� ��� � � 4�� � ��"�"��� ������ ��� �" � �� ��"� ��"��� �� ������� ���� ����� �� �� 9� ����� &&:� � ��� ���� �� ������� �� �� �� � �� ���� �� �� ������ �� �� �� ������� � � ���������� ��� ������� ��� ������� 9��� �� � :����� � �� �� ��� �� �� ��� ���� ���

#��� ���� ���� ��� ����� �� ��� ���� � �� ������ � �" ����� ��� ��� � ������ � � � �� � �� �� �� �� ���� ��� "��� �� � � " ������� �� �� � ���� �( ���� �� � ��� � ���� ���� ��

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� ����

glass plate

1 mLgel bufferplastic frame

&�' ��� %��������� �� � �& �� ���� � � �� ����� ���� ���� �� ���� � �� �� ������ ��� �

film-backed gel

&�' ��� ������ �� ��������' � � � ��� �� ���� �� �

Page 248: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� �� �� ������ ��� � "� � � �� ����� � ������ ����� ����� �� ���� �� ���� ��

� /� �� ��� ��� ���� � �� ����� ���� � �" � �� � ��� �� ���� "��� � �� � 9����� &2:� /� �� ����� ������� �� ������������� ��� "��� �� �� � ��� �� �� � �� ���� � �

� 5��� �� ������ ���� �� �� ���� ��� ��� �� �� �� �� ������� ��� �� �� 1���� ���� �� ���� �� �� ��� � ���� � �F�� ������ � � ��� � ���� �� ���� � � ������� ���� � ������ ���� �� ���� �� ��� �

� G � �� � �� �� ���� �� ��� ����� ��"� �� �� � �� �������� �� ��� � �� � �� "���� �� �/0 ����� "� � ���� ��

3 *��� �� ����!���� ���� �� ������� ���

air bubbles

&�' ��� ����� $� �� ���� � �� ��� ����� � ���� � ���� ��

edge

&�' ��� (� ���� �� � �� ���� � ��� �� ���'����� ��� �� �� � � ��!�� �� �� ������ �

Page 249: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������� � ��� � � ������������� �2�������

������� ������� �� ��� ������ ������

� ������� ���� � �� �� ����� ��� ������������� � � ���������� ����� �; 7�7 ��� �� � ������ � � ���������� //*�� �; =�,F

������� (���� �% �� $� , ����� ; <'����� (����=>

���� ��� ,�2' ��6$ �,�+ �0���� &�A2 ��6$ &++�, �585 & - 9"6�: &, �#�� �� � ����� � �� �� �� &$

5��� �� ���� � �� ����� �

� ��� �6�� �� �� ������ �� ��� #��� ��� �������� �� �� � �(� !� ���(�� � 5 , �������(���� �� �� �� $ , (���� �� ���� (���� ������

& H ������� ���� � �� ����� �� � �� ����� ���� � ��� ����� �;7�7 � �� #� � ��� �� �� �� ���� ����� ��� ������� ���� �� �� �����4 ������ �������� ���� �� ����� ���� � ���� ����� ��� � ������ � �� ���"�F

����� (���� �$� , ����� ��� ��� )�� (���� !�

���� ��� ,�2' ��6$ �,�+ �585 & - 9"6�: &, �#�� �� � ����� � �� �� �� 7,, �$+ ��6$ ;� ������ �� �; 7�+#�� �� � ����� � �� �� �� &$

5��� �� ���� � �� ����� �

#� � �� ����� ���� � �� ��4 � "��� �� �� � ������� ���� ���� � �� ���� �� � "� � ����� ��� �� �� ���� � ��� � � �� � �� �� ����� ���� �� ��� ��� � "�� ��� � �� �� ������ .� ����� � �� ������� ���� � ���� � � " ��� ��� �������� ��� ����

3���� ����� �� �����%���� ���� � � ������� � � ������� //*��� %�� ���� ���� � ���� �� �� ����� ���� � ���� � ���� � � �� �� ��� ����� �� � ���� � �� =' �$ �� �� &,, H ���� ����� � ���� � ��

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� ����

�� �� �� �� ( �!���� �������0

*� �� ������ ������� ������ ��� �� ����� �� ������� ��� ������ ��, ������

(� � ��+�� ���� �� ���������� ���� +������ �� ����������� �� �����

���� � � � ���� ��� ��� ���,�� �� ������ ��� ���!���� ������ �� �� � & �� ���� ���

Page 250: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����� �� "���� �� ����� ��� �� ��� �� �� ����������������������� �� ��� �"� ���� �� �� ������� �� ��� �� �� ��4 � ��

����� (���� �$�� , ����� ��� ""�)�� (���� !�

8� ��������� ' ��6$ &�= �$*� ��� ���� ' ��6$ &,, �$#�� �� � ����� � �� �� �� �,, �$

5��� �� ���� � �� ����� �

��������� �� ��� ��������� ���%�������� ����������

� /�� �� � �������� ���� �� � � � � ���� �� � "��� ������� � � �� � � ������ ��C��� �� � "��� ��� ����� �������� �� � �" ��� � � �� �� � �������� �����

� ��� �� ���� ��� �� �� ��� �� �� � �������� ���� �� ��������� ��

� /��� =', �$ �������������� ����� ���� � �� ? "� � �������� ������ � � �� ��� �� � ? =' �$ 81*����������� ���� ����� ����� ���� �� �" � ���� � ����

� %� �� ��� �� �� �� ��� =�' $ "��� � ����� � "�� �( �� ����"�� ������� �� ���� � ���� ����� ��� �� ���� � � � ��������

#� � �� ����� ���� �� �� �� � ��� �� ���� ��� �� ������ � ������ ���� A', �$ ���� � ���� ����� ���� �� ��� ��� �� �� �� �� ��� A�' $ "��� � ����� � "�� ��

� 5"���� �� ������ ���� ��� � � �� � �� ����� �� 2' I�� ���� � �� ���� �� �.>�� � ���� ������ �� ������� �� ��������4 � �� ���� ����� "��� �� "�� �� ��� �� ���� � � �� ������ "� � ��C��� � �� 2' I��

��������� �� ��� ��0 �� ����������

� � �� ���� �� ����� � ��� �� ��� � ���� � ����� � ��� ���� ������� ���

� ���� �� �� ������� �� � ���������� �� �������� "���� ���� � � � �� &, I��

� /��� +', �$ �������������� ����� ���� � �� ? "� � �������� ������� � � �� ��� �� � ? +' �$ 81*����������� ���� ����� ����� ���� �� �" � ���� � ����

� %� + $ � ����� � "�� � ���� �� ����� /�� �� ��� ��� �� ���� ��� � ���� ������ �� �������

�� ������ ��4 � �� ���� ����� "��� �� "�� ��

� ����� �� �� �� ��� ���������� � �.� ���� ���

/�� � � � � � ���� + �������� ��

Page 251: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

*�2���� ����� � ��� 1�� ������ ��� �������� � ��� � � ���

"���2���� �����

?@����(������ ���� �������

� ��6$ �� � &7, ��,- ��� �� 9�6�: 7'- ������� &=� �$', ���6$ ��� ;� �; 7�7 &�' ��6$ ���� ������� &= �$,�,&- !������ �� !� ', ��#�� �� � ����� � �� �� �� ',, �$8����� ���� � � � � ���2 - 9"6�: 585 &,�, �

5��� �� ', �$ ������� �� � �� < � �� ?2, I� �� � � ��

� /�� ��� �/0 ����� ���� �� ��������� ����������� ��� ��� �������� "��� &, �$ ���� ��

?@����(������

�� � &, �$ ����������� ���� ������� ��� &,, �� 8 �� � &, �$ ����������� ���� ������� ��� 2', �� ������ �����

"��3��������� � ��� 1�� ������ �� ��� � � ���

�!��� ����! �������

,�' - *����� 3 �� >* ,�' �,�,& - !������ �� !� &, ��585 ������ ���� � 9& H ����: &,, �$

� ; �� �� � � ����� ����� � ���� ������ �� ���� � � ������ ��/�� � 2 �$ ������� ���� � ������ ���� ��� ���� �� � �� ����� �� ����� � *� ������ � �� � �����"�� �� �� %�� � ������� � � ������ � � ���� �������� �� ����� � "��� �� ���� � ���

!��� ��� � �� ���� �� � 9���� ��� ������� ��� ��� �� ����� � �:��� � ���� �� ���� ��� 9� ����� &+:�

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� ���*

�� �� ��� �� ��� ��� ����� �� ��2 ��� ��� ��� �!���� ����� ���� � ���� ��� ������ � ����+���

-� �� ����� ���� ����� ���� �� � �� ���!� � �� �� ���� ������ ���.� � ���� ����� � ������ ����

Page 252: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� $�� �� ���� �� �� �� � ��� "��� �� ��� � ���� ��� ��"�� �� ���������� �� ��� �� � ��"���� �� �� ������

� /�� �� ����� "��� �� ������ �� �� �� ��� � ������ ������ �� ���������� �� �� �� ��� � ���� ��� �� ���"� ������� &+� #� � �� ����� �� ���� � � ������ ��� "��� �� ������ �� �� �� �� ��� � �� � � �� ��� �� � ���� ��� ���� �������� ��� ������� �� ������� � �� ��� =��

%�� ������� � � � �� �� ��������� �� ��� �� �/0 ����� ���� �� ���� �� "��� ��� ������� ��"���� �� ���� ��� ��� � ������ ��"���� �� ��� ������� ��� �� � ��� ���� � ��� �� ������������� � ���� �� �� ��" � �� � ���������� � ��� ������� ����� �"���� ���� ��

� #��� �� ���� �� ��� �� ����� ���� �� ���� �� ����� /�� �� ���� �� ���� �� ���� ��" "��� �� �/0 ����������

������� �� ����� �� #��� � ���� ������ �� �� � ��� ���� �� �/0 ����� ��"� ��

���� �� ���� �" � �� �� �� �/0 ����� �� �� ������� "����� ��� ������ �� �� 585 � 9� ����� &':� 1���� ���� ����� ���� � �� ����� � � �" � �� �/0 ����� ��� �� ��� � ������ �� 8� ��� ���� �� �/0 ����� ��"� ��� ����� �� "������� � ��� � �" � � ������ ��� ���� ��� ��� ����� �� � �

' �.� � �� �� �� �� *�� � �� ��� ����� � �� ��� ���� ��,

acidic endacidic end

gel surface upgel surface up

&�' �*� %��������� �� �� )�������� � *�+ ����� ��� �� ,-, � � ���� �� �

Page 253: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

"��3��������� � �������� "���� ������ ������� ��� �% �������'

�� �� ���� " ���� ��� �� ��� &�8 ���� � ����� � ���� ������� &7 �� ��� �/0 ������ ���� �� �� 2+ �� ������� � � ����� � ��� � �� ��� &�' ������� ���� �� ���� �� �� ���� � �������� ������! �� � ���� �� ������ � "� � �� �� ���� " ���� ��� � ����

� �� ������� �� ��4 � "��� �� ��� ���� �� � ��� &- ������ �������� ����� �� ���������� �� �� �1% ���� ���������� �� � � � � ������ ,�'- ������ "� � ��� �� � �� �� ��� � ���� ��� ������������� �� ����.�� � �� ������ � �� �� ���� �� ��� �� �� � ��� � �1% ����

���������� �� � �� � ���� �� &' �� 2, �$� /�� �� �1% ������������ � �� � ���� ��� ��� ��� �� �� ��� � ������� ���� ��� �� ���� �� �� ���������� �� � "��� ���� �� ��� ���� �� �� ��� ������ �� �� � � 4� �� �� �� �� �� �/0 ������

"�"���� ��� 1�� ����� ��� ��� � � ��

� 3 � ��� ������ �� � � � �� � &,, I� � �� ��� 9 ��� � "� � ���� & �� &�' �$:� *�" �� ������ �� ��� ���� �� ��� ��� � ��� �� ���� �� 9�, I�: ��� �� � ��"� ��� �� �� ������ � ���� � �� � � �� �/0 ����� �� ��� � /�� �������"� ������ ����������� ���� ��

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� ���-

0

10

20

30

40

50

60

1-D sampleor marker

hot agarose

&�' �,� ������ �� *�+ ����� ��� �� ,-, � � ���� � ��� � �� � ���� �� ����� �� �� ��- ����� ���� � ���� ���� ��� ������ �

/���)���� � �� ������ ��� �������� ���� ���� ���������� �� ��� "�����

Page 254: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

%�� � ������� � � �� ������ "� ��� � � �� �����" ��� � ��" � �� ���� � � �� �� ���� ��� �� � �� � � ������ ������� � ��� ���� ��� � "�� �� "� ��� ��"� ������� �� ��� � ��� ��� �� *��� �� � � ��� ������������ �� ���� ��� ���� � ����� ��

,#�� � � ������������� ���

.��#�� ��������� ���%�������� ����������

� ��� �A�� #���� �� �� �� #������ ��@�� �� �������

� # � �� ������� �� �� ���� � � � "��� � ����� � "�� ��� ��� �� �� ���� �� � � �" � �� ������� �� �� ���� � � ��

�������� �� �� ���� 5�� �� � ��"� �� �� �������

8� ��� ���� �� ���� �� � ��"�( ���� ���� ����� �� ���� � � �� � ��� � ���� �� ������ ������� �� ��� � �� ��� ��� ��� � ��"�(���� "��� ���� ���� �� ��� ��� ���� � ��4���� �� ��� � � �� � �� �� ������� ��� �� ��� � �� � �� �� �"� � ���������� ���� �� ������� ��� ��� ���"���� �� � �� �� �������

� #� � �� ���� &2 � � �� ���� ��� �� ��� ���� �� � ���� �� �� ���������� �� �� ������ ��" � �� � � ���� �� ����� � ��� �� �F ���� �� � �� ��� � �� "���� �� ��������� �� �� �������� �� �� ����� ������ �� ����

#� � � ���� �� � �� �� ��� � �� � �� �� ����� ���� ������ � � �� ' �� � �" �� �" � ���� � � � �� � �� �� � ���" �� � ��� �� ���� �� � ��� ��� � ����� � "�� �� ��� ��� �� ���� �� �� �������� �� � �� ���� �� ��� ��� �� �� �� ����� ������� ���� �� ��

�� � ��� ���� �� �� ��� �� �� ����� ���� � ���� � �� ���� �� �������� ���� �F �� � �� �������� ��� ��� � � �� ����� ��� ��� ��� ������� ��� ���� � �� ���� �� 4� �� ����� ����

� 3� �� 2�' $ ������� ���� � �� ������� ��� ��4��� �� ����� ����� F? & H ������� ���� � ��� & �� � � � 92', �$ ���� �����

��� 2�2' $ � ����� � "�� �:�? 2 H ������� ���� � ��� ��� ���� � � �� �� �� � �� ���� �

� � ���� 9',, �$ ���� ����� ��� 2 $ � ����� � "�� �:�� /��� �� 2�' $ ������� ���� � ���� �� ��� � ����� ��� �� ��� �� ��� "���� �������� �� ������� ����� ��

5 (�� ��� ���������� � �� ��.

)��������� ��� ��� ���������� ������� �� ��� � ��� � �� �� � ���� ������!���

(�� �������� ��� �������� � �� ����� ����� � ����� ������� �� ���� ������ �� �� ��������

Page 255: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� ������� ���������� �� �� ��� ��� ���� � ������� ��� �������������� 585 � �F

/����!�� ��� � � �� ����� �� 5% B�

5� � & 2 # � � � .� � �����

7� � ���

5 ����� �� �� ���������� ��" � ����� 9� � � �� ����� �� 2' I�:F5� � & 2 # � � � +' ����� �5� � 2 &A �� �, # � � � � ��4���� &7, # ��' ����� �� ' �����

�� � "��� ��������� �� ���� � � �� ����� ��� ��� �� �, I�� ����� � ��� �� �� � ���� �� #� � �� � �� ����� � �� ���� �� �� ��" � � ����� ����� � � ��� ��

� ��� ��� ������! ��� � �� � ��� �� �� #���@������� 6��� #��� ��� ��� ��� ��#� ��� �

3���� ��� ���� 5"���� ��� �� ����� �� ��� .� � �� ��� �� ���� E ��� �� ���� �� ��� .� � �� ���� �� � ��� "��� � �� � �� ������� � � #��� ��

" �� @�� E ��� �� � � ���� �� ���� �� ( � � �� ��� ��� "� � � �

�� ��� ������ � �� � ���� ��� �� � ������� ���� /�� �� � � ��� ���� � ���� ��4��� ������� �� �� ��� �������� !� ������� 9� � 4� ����� �:�

� E��� �� ���� �� � "��� ��� � � �� ��� ��� "�� � ��� � ������ � "�� � ��� � �� � ��� �� �� ����

� /��� �� �� � ���� � ��� �� �� ���� �� ��� F ! ��� ������ �� �� �� ������ �� ��� � ���� � ��� � �� � ���� 5"������ ���� ��� ��� ���� � "� � �� ��� �� �����

#� � �� ����� ���� � ����� � � ��� � 9��� ������ ��� ����� � �:� ���� ��� 2�' $ ���� #� � �� //*�� � � �� ���� �� ���� � ������ � � ��� �� � ��� ���� ��� �� � ���� � �� ��� � ���� �� �" � ���� � ��� �� ����� � � �� ��� � � � "�� �� �� "�� � �� ��� ������� �� ����

� E��� �� ������ ��� � �� �� ���� � ��� �� �� "��� � ������ � "�� ��

� #��� �� �" � ���� � ��� � � �� ��� � "��� ��� "�� � ����� � "��� � ����� � "�� � �� � ��� ��� ���������� �����

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� ���/

*� ��� ��� ���� ������� �,� +�� ��� ��� ������ ������� ������

6 �� ��� � � � �!��� ���� �����

�� �� ���, ���� �� �� � ��������0

Page 256: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

.��#�� ��0%�� ���������� "��� �������� �"�� ������

� ��� �A�� ��! �� �� ��(� �� #������ ��@�� ���� �����

� ��� �� �� ���� �� � ���� �� ���� �� ����� � ��� ��� �� ������ ����

� #� � �� ���� � � � �� ���� ��� �� ��� ���� �� � ���� �� �� ���������� �� �� ������ ��" � �� � � ���� �� ����� � ��� �� �F ���� �� � �� ��� � �� "���� �� ��������� �� �� �������� �� �� ����� ������ �� ����

#� � � ���� �� � �� �� ��� � �� � �� �� ����� ���� ������ ��� � ��� � �� ��� �$!� ����� ���� �� � � ������ ��� � ������ � "�� � �� � ��� �� ���� � ����� ���� ��� �� ���"� ��� ��� �� ����� &��

� 3� �� 7,, �$ ������� ���� � �� ������� ��� ��4��� �� ���� ����� F? & H ������� ���� � ��� ������� & �� � � � 97, �$ ���� ��

���� ��� =2, �$ � ����� � "�� �:�? 2 H ������� ���� � ��� ��� ���� � � �� �� �� � �� ���� �

� � ���� 9&�, �$ ���� ����� ��� �+, �$ � ����� �"�� �:�

� /��� �� 7,, �$ ������� ���� � ���� �� ��� � ����� ��� ���� � �� ��� "�� � �� ���� � ���� �� �" � ���� �

����� � �� ��C��� �� ����� � �� �� � �� �� ��� �

5 (�� ��� ���������� � �� ���

fill in and mixanode buffer

insert cassette carrier,cassettes, and upper buffer chamber

buffer level rises to “LBC start fill” mark

premix the cathode buffer

with anode buffer orwater (PPA system)

fill in 800 mL ofcathode buffer

fill the lower buffer chamberto the same level as the upper chamber

4.5 L for 1 mm gels4 L for 1.5 mm gels

&�' �-� ,�� ����� ������ �� �� ������ �� �� ��� �� ��$�� � ����� �� *� ���������� �� ��� � �!��������� ����� � �� ��� � �� ��� � ���� ��

(�� �������� ��� �������� � �� ����� ����� � ����� ������� �� ���� ������ �� �� ��������

Page 257: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���� �� � ����������� ����� �� � � ����� �� �� � �� ��� �� �� ��� � ���� � ��� �����4��� �� �� ���� �� 9� ����� &�:�

� /�� �� ��� �� �� ���������� �� ������� ����� � �� ��� ��� ���� �� �� ��� � �� �� ��" � ������

� ������� ���������� �� �� ��� ��� ���� � ������� � � ���������������� 585 � �F

/����!�� ��� >

5� � & 2 # � � � .� � �����

7� � ���

���� �� �� � �������� ����� �����

5� � & 2 # � � � +' ��� B ��� �* �� ��45� � 2 &,, # 9��4 �, # � � � : ��' ����� �� ' ����� B ��� �* �� ��4

� ��� ��� ������! ��� � �� � ��� �� �� #���@������� 6��� #��� ��� ��� ��� ��#� ��� �

3���� ��� ���� 5"���� ��� �� ��" � ����� ��� ����� �� ���� �����

��� ��� E ��� �� ��� �� ���� E ��� �� ���� ���� �� ����� � ��� ����� �� �� � ���� � �

� ��� �� ��� � ���� � ���� ��� �� ���� �� � ���� �� ������ ��

#� � �� ����� ���� � ����� � � ��� � 9��� ������ ��� ����� � �:� �� ��� � ���� � ���� � �� �� � ��� ���� � ���� �� ������ ���� � �� ��� � �� ����� �� ��� ���� ����

� .� � �� ���� �� � ��� "��� � �� � �� ������� � � #��� ��" �� @�

� E ��� �� � � ���� �� ���� �� ( � � �� ��� ��� "� � � ��� ��� ������ � �� � ���� ��� �� � ������� ���� /�� �� � � ��� ���� � ���� ��4��� ������� �� �� ��� �������� !� ������� 9� � 4� ����� �:�

� E��� �� ���� �� � "��� ��� � � �� ��� ��� "�� � ��� � ������ � "�� � ��� � �� � ��� �� �� ����

� )���� �� ���� ��� �� /��� �� ���� � ��� ��� "��� �� �" � ���� � ��� � � ��

��� � "��� ��� "�� � ��� �� � "��� � ����� � "�� � �� � ��� ��� ���������� �����

��� �� ��� ���������� �� ��� ���������� ����

�&���� ������ � �� �#$ 7)

*� ��� ��� ���� ������� �,� +�� ��� ��� ������ ������� ������

6 �� ��� � � � �!��� ���� �����

Page 258: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

#� � �� //*�� � � �� ���� �� ���� � ������ � � ��� �� � ��� ���� ��� �� � ���� � � � ��� � ���� �� �" � ���� � ����� ����� � � �� ��� � � � " �� �� �� "�� � �� ��� ������� �� ����

� E��� �� ������ ��� � �� �� ��� �� �� "��� � ����� �"�� ��

5 (�� ��� ���������� � �� ���

Page 259: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���

���� � ������� �� ���� �������� ��� �� ��������� ���� ������� ��� ������ ��� ��� ������� ��� ������� �� � �������� ����������� ��� ���� ���������� ���������

��������� ������� ������� ��� �������

��� ����� ��� �� � ��� ������ �� ��� �������� ���� ����� ������ ���� � � ��� ����!� �� �"�� � ���� ����� � �#������� �� ��� $%&&!�

������������

������ ������

��'�������� ��� �&( )! $�� ) ��*�! ( �+,������ - ) ��*�! $ �+.���� ������� ��"� �� � ( �+

'������ �����

������� �� � ������ �

��'�������� ��� �&( )! - ) ��*�! %�( �+/������ ������ $ ) ��*�! 0 .���� ������� ��"� �� � 0 �+

�� � ������� ������ �

�������� ������ ���� 1�-( ( ) ��*�! -�( .���� ������� ��"� �� � ( �+

���� �� ������� �� ��� ����

������� �� ����� �������� �������� �������������� � ������ !!" # �

Page 260: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� ��������� ������� ��������� ,2 $ �+ �� ���" ���� ������ � �� 0 �+ �� ���"

���� ������/�� /�� $ �+ ��������

��� ���� ������ ������ ����� �� ������ ������� �� ����������� ������� ������ ��� ������ �� �� �����

����������� ������

�������� �$ , 3 .���� ������� ��"� �� � ( �+��'�������� ��� ��� � �4 3�(

������� ������

,������ $-( �+.���� ������� ��"� �� � ( �+

���������� ������

/������ ������ $ .���� ������� ��"� �� � ( �+

����������

$� 52 ��� 3 ����� � �2� �������-� 6�� ����� � �� ���� ��������� �������� �� �� ������7��� ������ ��� $ 8 � ��0� .��� �� -( ) ������� ��� ���� $ ���(� �������� �� �� ����7� �������

5�� ������ ���� � �� �� ��� � ��� � ����7� ������ ������ ���� ��� ��� ����� ���� - � (� ����� ���� ������ ������ �� ���� �"�� ���� ��� ���"� 1�� ��� ��� � ���� �� �����7� ������ ���� �� ���"��� ���� ��� ����� �� �� �������

���� ������� ������� ��� �������

����� � !"#$ ������� %&��� ������� ��������� 9������ $ '���1������ ���� � $�3 + �� $ ) ���� ����

$��� %& $������' �� ��� '������

(� �� ���� ���� �������)��* ����� ��� '��� ���)� �������' ���������� �� �����)�� +��� ��������������'�

Page 261: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�������� 4�� �� ������ � % :� ��� ���� ���� �� ��� ���� � �

� ������� ���� ����� '���� �� ��� �� � ��������� ���"�� ��� $ ���

'��������� �� � ���"� ���� � $ ) ���� ��� ��� � ���� - � � ����

���������� ���� � ������ ������� ���; ������� �� ������ ���� � � ���� ����� �� ������ ���������

6��� ��� ������ ������� ��� �� ���� ������������� ��� ��� ��� �� ������� ��� ��������� ��� ������� ���� ���

�� �� �� �� � ��� ��"���6�������� ����� ���� ��� ������ ���� ����� ����� 6����

���� �� ���� �������� ������ ���� ���� � ���� ������� ��� ���� ������� � ��� ����� ������� ���� ��� �������� ���� ���� �� � &�!�

����#�� �������

(����� �� �������

)��� 5�� ����� ���� �� ���� ����� ��� �� �������� 6������� � ��� �� �� ,��< ����� � � ������� ��� ��� �������= �������� �������� ���������� �� �� ����� �� ��� �� �2���� ����� � ��� ����� �� ��� 6������� ������� ���� � ���� �������� ���� ��� ,��< �����

����� � � ����� ��> ,2 � ��� ������� �� �� ���� �� � ���������� �� �� ����� ���� ������ ����� � ��������� ����� ����� " �� ��������������!� .��� �� ���� ������ �������� ���2��� ������� �������� ����> ��� ���� ����� �� ����� =����� �� ���� ����> ��� ������� ���� ���� �� ����� ���"��

*����� =� ���� ������ � �� �������� �� �� �2������� ���� ����� ��������>

� ��� � ��������� 0 ) ���" ������ � � ��������"�� 5���2� ?�� ��� �� ���� ����

� @�� ,AB �������� ������ ����������"���!�

+���� ������� ��� ��� �� ����� � ���� ������ ��� ��� ���������� ����� �� ����� ���� ��� ������������ � ��� ������

, $��)� �������' ���

-�����' � ���� ��+�� ���� ������������' �������� ������ ���.��/����� �*��

��� 0��+� ���� ��� ��/����0��

�� ��� ��� ����+��� ���������������� �� ��� ��� /��������

��)� ���� ��� ,1 2 ��/������*�� �� ��� ���'���� � �� ������� ��/�

Page 262: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

'��,�� �������

��� ���" ����� �� �� �������� ���� ����� �� ��� �� ���������� ������ ������� �� ���� ��� �2�� ��� �� ������ ��������� ���������� �������� �� �2� ���� ��� �� ����� ��� �� ���������� ����� �� �� ����7� ����

��� ������� �������� �� �� ����� ���� �������� ������� �� ����� �� 4��"������� ��� 9����" �$%&3! � �������� ����� ������ ��� ����������� ���� ���� �� ����� �� �� ��������� ��� �� ���� � � �� ��� ���� �� �� �� �� ���� � �2����"��� ��� ������ �� �� ����� � �� ���� � ( � �$ � *��-�

=� ���� � ��� ��� ���� � �� ������ �� ������� ����� ���� � ���� $! � ���� ������� /����� ���� � ���� ����������� ��������� ���� �

���#�� �������

$��� %& $������' �� ��� '�����-

��� ������ ����� ��� ���

,����� ��� ������������

+������������� ������� �� ��������� " ��� ������

C�+D $ �� �����"��C��D

$ �� �� ��� �� ���������� �� $�( �������"�� C��D

52� $ ) ���� ���; 0 ) A�����;�� ������� ���� �

- E -( - E $( - E 3

6����� F( �+ A�����;$ �+ #����������� �( ) �*�!;$F #�������;$�-( �+ �������������;�� ������� ���� �

-( � 3

.���� ������� ���� � � ( E -( � E $( ( E &6���� -( �+ ����� ���� � -�( )!;

$ �+ ������������;�� ������� ���� �

-( - 3

.���� ������� ���� - � 0 E -( - E $ 0 E $9������� 3�-( #����������;

$ �+ ������������;F �+ #����������� �( ) �*�!;�� ������� ���� �

-( 0 3

6���� ��3( A9�/;�� ������� ���� �

-( $ 0

.���� ������� ���� - � � E -( � E ( - E �

3��0����)�� 4� �����0 5� �������������� # ����!� �6,"�� �

Page 263: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� ����� �� � �� ����� �� #����������� � ����������������� � ������ �� ���" ����� ���� ��" ��� ��� ������������$ �� ��" ��� ��� ������

� ��������� ������ ������ ���� ����� �� ����� ��� ����� !�� ���� ��� ������" ���� ������ ������� ��� ���� �� ���� � �� ����#$ �� �������������� �� �� ��������� ��� ��

������������ �� �� ������ ������%$ �� �� ��������� �� �� ���������%&�� ������� ��� �� �� ������ !�� � ��� ������� ���������� !�� ������%

������� �� ������� ����

@� � ���� ��� ��� �� ����� � � �� �� � ������ �� �� ���� ���� �� �� ����� ���"��� �� ����� � � ��� -� ��� ��� � ���������� ����� ���� ���� � �� ���� ����� ���� ����"� �� ����$�( + ������ � ������ ��� ���� ����

, $��)� �������' ��.

glass platecover

/��� �� ������ ��� �������

/��� �� �������� �� ������� ����������� ���� �� �� ������� ��������� �� ��� ����� ���� �� ������������������ ��� �� ������ ��������� �� ��� ����

Page 264: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�/������0��0� �������

5�� � ��� ������ �� 6���� G��� �� G��'6 �� ������� ���������� � ����������� �� G������� �� ��>

52��� - ) ������� F) ���� ��� -( �� $ ����.���� - ) ������ -( �� 0 E � �����6��� 6H'G� G��� �� G��'6 F �� ����� �.���� ������� ���� -( �� - E $ �����

6�� ��� ���� �� ��� � ���" ����� ���������9� �� ��� ���� �� ���� �����

�1�����#��� �� ������ �� ����

5������"�� ��� ��� �� ����� � � ������ ���� �������� ��� ������� � ����� ������ �� ����� �� � "���� ��� ����� ����������

1��� ���� ��� ������ ��� �� ���� ������ �� ����� �� ������������ ���� ��� ������� �� �������� ��� ��� ������� �� ������ � ��� �� ��� ���������� ��� �� ������� �� $ ) ������� *���� ���� ��������

9��� ���� ��� ��� � ������ .��� � �� ���� �� � ������ � ����� �������� ��� � �� ��������" � � �� ��� �7� ��� ) ������ * $ ) ��������

��� ���� ��������� ��� ���� �� ������ �� ������������ ����

$��� %& $������' �� ��� '�����2

A B

/��� �� �� ��� �� � ��� ��� ���� � ���������� ��� ������ �� ���������� ������� ������� ������� & !��� ��� �������"�� ��� �������� # ������� ����� #�������� ���������� # ��� # ��������

���������� # ������ ������ 7& $�� ��������� ������ ���� ��� ��� ���� �������%� ���� ��� ��������& ��� ��������� ���� � '()�

5�������� � $��� 4�8�9���� $� )�� �������� �9����� 4� -����/��� � � 66��#��"16%�

Page 265: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���

��� ������� �� ���� ��� ���� ��� ������������ �� ����� � �� ������ ������� �� �������� ���� �� �� ���� ��� ����������� ����� �� ���� ������� ���� �� �������� �� � ������ ��� �� ��� ����� � �� ��� ���� ��� ���� �� �������� ����������� �� ��������

�������

����� � ������ ��� ��� � ����

� �������� �� ��� ������� ������ �� ���� ��� ���� ������ ��!� "���� �#���!� ��� ��� ������� ���������� �� ��� ������� ��

��� ������� ����� ������$ �� ���������� ������ ��� ������ �� ���

$ ������������ ����

$ %��� ��� ��$ &��� ��� ��'� �� ��� �� ������ �� �(� )* �����$ +��� ����� ,-- �� �� �����

$ %���� �����������

�� ��� �� �� �� ��� ����� �)!� ��� ��������� ���� ����� �� �� �������� ��� ����� ���� �� �� �� �� ��� �� �� �)!� ��� ���(�� ���� � ������ ��� ���� � ����� ��������� ���� ������

� ����� ���������� ��� ���� ���� �#������!�

���� �� ������ �� � � ��� ��� ��� ���

��� ������� � ���������� �� ������ ����� �� �������� ���� � � � ���

������� ��� ����� ����������� ��������������

��������� ��� ��������������

�� ���� �� ��� �� �� ��� ������ �

��� ��� �������� ��!�������� � �� � �

Page 266: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� ������ �� ��� ��������� ����� ��� ������� �������� ��� ��������� ��� �� �� ������������ ������ ������ �� ��� ./�0�1 �� �� �������� �� ��� ������� ���� ���� ���� ��� ���

� 2����� �+��� ������! �� ��� �������� #�� ��� ������ ���� �� �/����� 0������!� #��� � ��� ���� ��� ��� ���� �� � ��� �������� ���� 3��(�

����� �� ����� )�� 4���� ��� ���� ��� ����������� ���� ��� ���� ��� ����� ������� ��� ���� ��� ������� ���� � �� �� �� ���� �� �� ����

���� �� ��� ���� ������

��� �������� �� ������ � ����� �� ������� ����� ��� ���������� �� ��� ��� ������

� #� ��� �2���� �� ���!� ���� ����� �� �� ���� �� ��� ���� ��� ��������� ����� ��� �� ��� ��� ���� �����

"�� #� "������ �� � � ��� ���� ��� �������

! �� ��������� � � ������� �� � ��� � � ���� ��� �����

$��� �� �� ��� ���� �� � ������ �� ����� ���� � ��������� �� � ���� ��������

Page 267: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������ � � � "������ � ��� �� � ����� �� ����� �� ��� ������� � ��� ��

� ��� ��� � �� ��� ������ ��� ���� ��� �� �� �� �������(� � � ��� � ��� �� ��� ������� � ��� ���� ��� � �������� ���� 4'���� ����� �� ������ ���� ������ ������

��������� � "�������� ����

��� �� �������� �������� �� ��� ��������� ��� ������������ �������� ���������� ��������� ��� � � ��� ������ ���� ��� �����������

����� �������� ��� ���#��"�� ����������

� ������ ���� �� �� ������ � ��� ����� ���� �� ���� ������ � ��� �������

� �� �� ��� ���� ������ � �� �'��������!�

���$"������� ���� ��������

� #� ��� � � �� �� ��� ���� ��� � �� �� ��� ��� �� ������ ���������������� � � ��� ������ ���� �� ���� �� �� ��� ��������� �� ��� ��� ��� ����

� #� ��� �#��� 0�������� ��5��!�� ���� ��� ����� �� ��� � ������ ���� ���� �� ����� � ��'

����� ���� ���� ���� �� �� ��� ��� ���� �������� ��������� ������� ��

� 6������� �����'� ����� �� ����� 77 �� ��� 6,�� ����� �8��� ��� ��� ���������� ������������! �� ���������

��5�!�

����� ������ ����� ��� ������� ��� ���(� ���� � � �� ��� �������� ����� ��� ������ �� ����� ������ ������ ���� ��� �� ���� ������������ ��� ��� ���������� ��� � �� ��� ��� �� ��� ���� ���� ����� ������ �� ��� ���� ��� ����

� #� ��� ��� ����� ����� ����� ��� ���� �������������� �� ���������� �� � ��(�� �� ��� �� �� ���� ���� ��� ������� ���(�

% "��� ������ ��� ��&������ �������� ���

���� �� � ���� � �� ������ ���&�

'��� � �� ������� �� ���� �� �& �� ���� ������� �����

�� ������� ��� �� �� ��� ���� ��( �����( ������ � ��( �

Page 268: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���� � ���� ������ ��� ��� ���������� ��� ���� � ��� � ������ ����� ��� ��� �����������

� +����� ���� ���� ��� ��� �������� ���� ��� ���� ��

� #���� �� �8��� ��� ���� ��������� �&��(���� ������! ������� �� � �� ��� � ��� �� ��� �������

� �8��� ��� ��� ����� ��������� � ���� ��� ! �� ��� ����������

� 2 ��( �������!�

����� ��� ���������� ��� ���� ��� ���� �������� ������ ����������� �� �� ��� ���� � �� �� ��� ��� �� ��� 9��� ���� ��������� �� ���� ���������� ��� �� ��� �� �� � ������ �� � � ���� ���������������

� ������ � �������� ��� ��� ���� �� ��� ����� ������ ��������� �� � �� �� ��� ������������ ����� � ���� ������ �� �� �� ���� � ���� �� ���������� �� ����

������� � ����

�� �� ��� � ��������� �� ������� � �� ����� ������� ������ ���������� �� ���� �� ����� ���� �� ����� ��� ����� �� ��� ���� ������ ���������� �� ���� ������� ����� �� �� ������ ��� �� ���� ����� ����

����� ��� ��������

� 2���� ������� 9������ ������ 9������ �� ����

����� �� � �� ��� ������� ��� �� ����� �� ����! �� ������ ����� ����� ����� ���������� ��� �� ����� ���� ��� �� � �� � �� ���� �����

������� ����

"������ �� � �� ��� ����� �� ���� �������� ����� ��� ��� �����������:���� ���� ��������� ����� ��� �� �� ����� � ���� ���� ������ ��' �4��!� ��� ��� � ����

� 0����� 4���� ������� "��( ������

"�� #� "������ �� � � ��� ���� ��� �������

�� �� ��� �����) ��� �������� ��� ���� �������

���� �� ������� �� � ����� ��� �� ���� ���� �� ������

�� ��� � �� �����) ����� ������� �� �� �����������

Page 269: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� 4� ������� #� ���

� ������� �� � �� �� ���� ��� ������ ��� ��� �������� ��� ������ ��� ������� ��� ����� �������� ���� ������� ������� ���� ������ �� ����� ���� ���� � ����� ��� � ��� �� � ���� �� ����� ��� �� ��� ���������

���%��#��"�� ���������

&��(���� ����������� ���� �� ��� ���������� � �� �� � #����� �������� � ������� ��� �������

� #� ��� ;<����� �� &������= �� ;9�� �� �� #���=�$ ����� �� ��������� /�� ��'� ������ �� ���� �������

���� ������� �� �� ������ �� ��� ���������� ������� ���

$ ���� �� ��� ���� 4��� ���� �� �� ����� �� � �������� �� ��'� ����� ���� ��' � ����� �� ��� �� ����� �� � � ����� �� � ���������� ����� "�'� � �� ��� ������ ����� ���� �� �� �� ������� ����� �� �� ������ �� ��� ����������� ����� �� ���� ��� �� �� �� � ���� �� ������ ������� �� ��� ���� ������ � ��� �� �� �� ��������� .,-$7>1�

� 0��� �� ��� ���(���� ������� ����� �� ��� ��� !��"� ��#��� �� � ������ �

�&�� "���� �� �'( ��������

���)�������� �

� #� ��� �� ��� �4��! ���� ��� �+�������� %� ��5��! ��� ��( �2����� � ��� ��������� � !�

� 2 ��( � �'�! �� �� �� ��� ��� �� � � �� ��� �'�������� �������� � � �� ��(� � ��������� � ���� ���

* +�� ������ �� %�, ������� ���

��� �� � �� �� � ����� ����� � ���� ������ (��������

Page 270: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���$"������ � ������

� 2 ��( ��� ������� ������ �8��� ��� ������ ��' ��5� �� ��� ������ ��' ��5��

��� �������� �� ������� ����������! ����� �� �� ���! ��������� � $�����$ %���� �� �&�� 4� ���� �� � ��' �� ��� �� �� ��� ����

��� �� ��'� ��? �� � �� ������� ������ ���� �� ��� � �� � ��������� �� ������� .��� ���� ��� ���������� ���������1

$ ������ �� �&�� 4� ���� �� ��� ������ ������ ��' ����'� ����� ��������� � ������ ������ ���� ��� ���� ������ ���������� ����� �� �������� ��� ��� ���� ������� ���� *7 �� �������� �� �� �� ���������� �� � ���� � ������ ��� ��� ����� ������ ��' ��5� �� ��� �� ���� ��� ��� �� ��� %���� �� �&����������� ������� ��� ��� � ���� ���( ��� � ����� ���� ������ .��� ����� @1�

� � ��� �������

��� � �� �� ����� �� ��� ��� �������� �� ��� � ���� ������� ��� ������ �� �������� ����� ��� ������� �� ���� ���� � ���� �� �� �������� �� ���� .��� ������ @ �� ,1�

"�� #� "������ �� � � ��� ���� ��� �������

blue and open: matched, slave

connection line: vector

red and open: matched, reference

solid spotshave notbeen matched

! �� �� ��� ���� �������� � ��� �� ��� � ��� �� ����

manually matched spotsare marked with an U: user seed

! �� �� ��� ���� �������� � �������� ������ ���� ��� ���

Page 271: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� �'��� � �� ������ @ �� , ����� � ��� � ��� ��������������� ��� ��� ��������� ��� ���� ��� ������ ����� ���� ����(� � �������� �������� ���� ��� ����� ������� �� ��� ��������� �������� � ������ �� �� ��������� �� ����� � ���� ���� ������� ����� ������ �� ��� ����

� 2���( ��� ������� ������� �� ��� ���� ��� � ���� ���������� ������� ��������� ��� ������ ����� ��� �����.��� ����� 7>1�

��������� ������� ��� ���� � �� ������5�� ������� ������� �� ����� ���� �������� ��������� �� ���� �� ����� �� � ����� ����� �����

� A���� ��� ��������� � ���� ��� ��� ������ ������

���*���� �����

���� � � ��� �������� ��� ���������� �� ������� �� �� �������������������� ���� �� ���������� ���� ����� �������� ��� ������� ������ �� ��� ����� ������� ��� ���� �� ��� ���� ��� � � ������� �� �'���������

+��� ���� �� "�� ����� ������ 9� ��� � ��� �� �� �� ��� ���� ���� ���� �� �� )-- .��� �������

���1�

�� � ���� ����� ������ 2����� � ���� �� ���� ��� ����� �������� '��� ���(� 4���� ����� �5� �� ��� ��� ���� ������ "���� ��� �����������

� �� ����������� �� ��� �� ���������� �� � �� � ��� � �������� �� ��� ����� ���!���� ����� ���� � �� ���� � � �� ���������"

����, ��� -� �� ������

� 2����� ����� ��� ��� �� ���� ��������� ��������� ����� ���9�� ��������� ������� ����

�'( �� �������� �� 9� ��� �� ������ �������� ��

� 2 ��( )� ��������

* +�� ������ �� %�, ������� ���

���� �� �� ��!������ ��� ������������ ����������

"� �� �������� �� ��� �����+�� �� ������������� ������� �� ������ �� ����-./ ���

Page 272: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� �(���* �� � �� �� ������ �� � ������������ B�� ������ � �� �� �9� ��� ��� ��� ��������� � .��� � �� ���� >, �� C61� ��� �"%��� �������� ��� ����� ���� �����

� 2 ��( !���� ������� �� �� �� ��� ��� �� ��� � � ��� ������� �� ���� ����� ���� ��� ����� �� �8���� �� ����� ��� ��� �������� �� ��� � �����

� 2 ��( ��'����� ��� ������ �� ������� ��� ��� �� ��� ��� ��� ��� ������

�������� �� ��� ���������� �������� �� ��� ��������� � �

�'( �� ������������� ������ ����� �� ��� ��������� � ���� (��� �� �� 9��

� 2 ��( �� � ���� �� ��� ��������� � �� ��� ���� ����������� ���� �� ��� �� � �� �������� �������� ���� ��� ���� �� ���� :������ �� ��� � ��� �� ���������

� 2 ��( +��"� �� ��� ������� �����D �� �� ���� 2 ��( ��'����

�� ��� ������ �� ������� ��� ��� �� ��� ��� ��� ��� �������������� �� ��� ��������� � � ���� ��� ����� �� ��� ������ � � ����� �������

��!(�������� ����

� 2 ��( ��������� ��� �� ��� ��� !��"� ����� �� ��� ������������� �� ������ ������ �����(��� � ��� � � ��� ���� ���� � �� ������� ���� ���� ��������� ���������

� #�� ����� ����� ��� �� ����� ����� ���� � �� ��� �������� ��>- E �� ���� ���� ��� �������� � �����

� #�� ����� ����� ��� �� �� ��� ����� ���� � �� ��� ������� ��>- E �� �����

������ ��� �� ���� ��������� ������ ����� ��� ��� ��� ���� �� �� ��� �� ��� �� ������ ����� ��� ��� ��� �� �� � � ����� ���� ���� ��� �� ������� ��� ����� ��� ����� �� �� ����� ��

����� 7*�

"�� #� "������ �� � � ��� ���� ��� ������.

��� �� � �� ������ ������

Page 273: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��"$������ � �

� ���� ��� )� ���� �� ��� ��� +$���"�� ,�� ��5���� 2����� � ���� ��� ��� ������ � �� ��� ��� � ��

������ � � ���� ���� #�� �� ������ ���������� �� ���� �� �'� �� ��������� ������

��� �������� ���� ��� ���� ����� � � ���� ��� �� ��'��� ��������

� ���#�� ����� ��� �� ���� ��� ��� ������� ���� ���$ ���� ��� ���� ������ �� ������

��#/"���������

� 2���( ��� ������� ��� ����� ������ ��� ��� ��� :������������ ���� ������� #������� ����� �� ����� �� �� ��� ��� �� ��� ��� ���� ���

� 2 ��( �� ����������� ����� �� ���� ���� ������� �� �� ����� ��� ��� ������ � � � �� �� �'���������

� F����������� ��� ��� ������� � ���������� �� ��� -��"���������

��$������ �������

���� ������� 2 ��( �� ��� �� ���� ������ /� ��� .���� ����� ��� ��� � ��( �� ,������ ��� .�����

� ����������� �� ���� ���� ������ � �'�������� � � �� ����� ����

�� ������� 2 ��( �� ,������ ,�� .����

� ����������� �� ���� � �� �� ��� ����

&0���� �� ����� �������� A�� ���� �� ����� �� �'���� �� �� ���'�! �� ��

��%���� ��#�

��� ���� ���(�� ��� �� ������ ���������� ��

* +�� ������ �� %�, ������� ��1

���� �� ���� � �� ��� � ���� �� ��� ���� ����� ��� ���

"��� ���) �������� �������� ����� ������ ��� ������� ��� ���

Page 274: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���

�� ��� ������� ����� ������� ������� �� ���� �������� �� ����� ����� ���� �� �������� � �������� ��� ������ �������� ���������� ��� ������ ������������ ����� ���� �� ��������� ���� ��� �������������� ������� �������� �� ���� �� ����� ��������������� ����� �� ���� ����� �� ��� ������ ����� ��� ��������� ����� �� ��� ��� �� ����� ������� �� ���� ! � �� ������ �� ��������� "!! ����� �� ������

#��� ������ ������� �� �� �������� �� ���� ���� �� ��� �� ������ �� ����� ��� ������ �� ��������� ��� ��� �� ��� ������� ������ ������� �� ����� �� ���

��� ��������� �������� �� ��$� ��% ��� �� ��� �� ��&������������ �� �'����� �� � ��� ����� � ����� �������� �� ������ �� ����������� � ������ ��� ���� ��� �'����� �� ����������� ���� ����� �� � � �� ������ �� � ��������

���������� � �����((�)* �������� ��������������� +�,-. ��� ���� % ������ ����� ��� �� ������ �

���������,���������� � ����� �� �/

������� ���� ��� �� ���! ���0/ ��� +�1 )�!.� ���0/ ,� ������ �������� 2�����

��� ���� �� 3$! 4��

��� �� ��%! ���0/ ���� 5 ��0/ ���� $ ��0/ �������� "* +�0&. �126��2�7��� �� �1 )� ���� ����� 1�� ��� ������� ��� �� ����� ��3$! 4��

������! ���0/ /8/�����

��� �� ����������� �� ������ ��� ������������

Page 275: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� ����� �� �!���� ,�' �0% �� ���� �� ��� ����� ��� �������� ������ �� ����

�� ����� � ������� ������ /��� ��� ������� ����� ������$�

� /��� ��� ������� $0% �� ��� ����� ����� ���� ��%�� /��� ��� ������� $0% �� ��� �������� ����� ���� �� �

,�� �����' �'�������� ���� �� ��� �� ������� ���� ���������� ����� �� � ���

� ���������� ����� ��� ������ �� ��� ������� ���������������� ��� �� �� ��� �������� ���

"#�������� � ���� ���� ��!������ ��� ����� ���������

��� �'���� �&�� ��� ��� ���� ���� ��� ����������� �� ���� ���8���� ��� ���� ���� ������ �� �� �� ��� ��������� �� ���������� ������ 2���'������ " 9 �!�! ���� ��� �� ���� �� � �� �!� 0�/ �� ������ �� � �/ �� ���� ������

�� 6��� ��� ��� �� � ������� ������� � �� :" 4��$� 6�� ��� � ���� ������ ����� ��� ��� �� ������ ��� ��

�����%� ;�������� �� ���� �� � �/ �� ������� �� #��� ����� ��

� ����������� � �����"� 6��� ��� ��� �� � �����8��� ����������� � �� �$�!!! �� "

������� �� :" 4�� � ;���&� ��� ������ ��� �����������<� ;�������� �� ���� �� � �/ �� ������� �� #��� ����� ��

� ����������� � �����5� ;����� ����� " �� < �� ���� ���� ������)� =���� � ��� ���� ����� ��� ���� ���&���(� ;�������� ��� ������ �� ���� �� � �/ �� /���� ����� +%!�

��0/ ���� 5 ��0/ ���� $ ��0/ �������� "* >�0&? �126���1 )� . ��� ��&� �� ��� �� �! ��������

� ������� ���� ������� �� ��������� � �� ���� � ���������� ������� �������� ����� ������� ��� �� ������� !����� �� ��� ������ �� �������� ������"�����

�!� @��� ��� ��� �� ��� ��� �������� ������������ ���� ��� ����� �����

�$% ���� �� ����� �� � �������� � ��� ��� ���������

Page 276: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� ������� � ��� �� ����� �� :" 4� �� �! ������� �� �$�!!! ��� ����������� ��

�$� ������ ���������� �� � ����� ����� ���� �� ��� �� ������������ ��� �����

�%� ����� ��� �1 �� ��� �� ����� �� ��� �� �1 )� �� ������� �/ �� � �1 �������� ����� �� ��� �1 �� ��� �� ����� ������� ���� �1 )�! ���� ��� �1 �� ��� ����� �� ���� �� ����7����� ����� ����� � ��� A1�� �� ��7��� ��� �1 �� ��������� �����B�

�"� ���� �� ������ �� ������� �� 35! 4� ���� ������ ���� �� ���� ����������

����������� �� ��& ����� �� ��!���� ��!�!��� '�(�)

����� �� ���� ���&��� �� � ���� ����� ���� ���� �� �������������� �,-� =��� &�� �� ����� �� ��� ��&� �� �� ������������ �� ����,- ����� �� �� �� ���� ���� ���� �� ���� ���� �� ���� �� ��� ����������&�� ���� ������������� �� �,- ��� ����� �� �&� � ���� ��8��C ��$8����� ��%8��� �� 8����

� �����#�� ������� �� ��� �$% ��� �� ��� ���������� � ���� �� �� ����� ���� ��� ������� ��������� � � " ����� #�� �$% ��� �� �������� ��� �!��������� ����� �� ��� �� ����� �� � ��� ������"����� ��� ����� �$% ����� ������� �!�� � ����"�� �� ���� ��� ������� ��� ����� ������������ ����� ��� &���� ��� ��� � ��� ��� '()���� ����� ���� ��� ��� �� ��������� �� ����!������� ��� ������� ����������

�� ���� � ��� &���� �� �,- ��� ��� �� ��� �������� ����������� ���� � ����������� � �����

$� ���� ��� ����� ��� ��� 3$! 4� ���D� ��� ��&� �� ��� �� ������� �� ��� ���������

%� 2��� ������� ��� $ �/ �� ��� �,- �� ���� ��� &�� ��������

"� ;����� ��� ��� �� ��� ��� ����������� � ���� ��� &���'&� ����� �� %! ��������

� ������� � ��� ����������� � ���� �� %! ������� �� �$�!!! �� � �������� ����������� ��

<� ��� ��� ��� ��� �� �����

� �� ��������� ��� �� � ����� �� ���������������� ����� �$"

Page 277: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� �����*��� ��� ��� ��� ����� ��� ���� ����� ���������� �� ��� +,� -� ����.�� � ��� � ��������� ����� �� ��� ���/�

� �����&���� �� ���������� ����� � ���� ����� ��� ��"���� ����� ��� ������ ���� ����� �� ��� �����

*#�������� ����� ������ ��� � ����� ������

�� E���� ���� ���� ����� ����� �� � ����������� ��$� ����� � &���� �� ��� ����� ����� �� �� 9 &����� �� �� �

��� �,-� �� ���� "!! ��� �� ����� �� � �/C ���� $ �/ ����� ����� ��� ��� ��� % �/ �� �,- +���� $!!! ����� ����� �� �/C ������� � �/ �������� "!! ������

� �����&�� ��� �$% ���� �� ��� ������ �� �� ������������� ������� �� ������ 0 �� �� ��� ������� ����� ������ 1�� ������

+!��� � ����� ����� �� � ������ ����;������� �� ��� ! � �� ������ ���� "!! ����� �� ������

�� ���� ���� �� ����� ����&�� ���� �� �� $ ����� �� ��� ������� ���� ���������� �� $ �/ �� �,- �� ����� � ����� ����� ���8�����

2���� � �� �������� "!! ����� �� ����� �� ! � �� ��8���� �� �� ������ ������� �!! ����� ��� �!!! ����� �� ! � �������� ��� �� ����� �� ����� ��� ���� ! � �� ������ ���� ������� ���� ��� ��� �� ������ ���� ��� ���� �� � ������ �� ������� ��

���� �'����� �� ����� �������� ���� �� ����� ���� +�� ����8���� ���� ��� �� �� ���� �'����. �� ����� �� ���� ��

,��- "� ������ � ��� ������ ���� ����� ���������

2����� �� �� /����� 3��4

2����� �� ������$% 3��4

#���� !����� 3��4 ��� ��������� ������� 3��������4

� " $!!� � � ���$ $ " !!� 3 � � !!!

���� �� ����� �� � �������� � ��� ��� ����������$�

Page 278: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� ���������� �� ��� ������� ���� � ���� ����� ���, ��/ �� +,� -��

#����� �!��� ��������� ��� �� �����

� �����#�� �� �������� �� ��������� �� ��� ������������ � ������ � ��� 0� ������ )����� ��"������� � ������ � 0 ����� ��!� ���� � �������������� ���� ��� ����� �� �����

��� ������ �� ����� ���� �� ��� ����� ������� �� ��&� �� ����������� ����&����� �� ��� ���� �� ������ ����� ���� ���8����� 1�� �� ��� �'���� ���� �� ����� �� �� �� ������

�� 2�� � &���� �� ������ ����� ����&���� �� ! � �� � ���������������� � �����

$� 2�� � �/ �� ������ ����� �� ��� ����������� � ���� ���8������ ��� ������ ����� +���� ! � �� ������ �� ��������� "!! ����� �� ��� �� ��� ����� �������.�

%� ,�' ��� ������� � ����� �� � ����������� �� /��&� �� ����� %! ������� �� ��� ����

"� 2�� � �/ �� �! ���0/ ����� �� ���� ��� �������� ,�' ������� ����� �� � ����������� �� /��&� �� �! ������� �� ����� ��� ����

� /����� �� ��� ���������<� ������ ��� ��� �� ����� �� �� ���� ���� ������ �� 35! 4�

�� ��� ����

F�� ��� ���� ��� �6G ������

������� �� �!��� ��� �� .#/ ���2��� ��� ������ ������ ��&� ���� ����� ������ ��� �� ���� &�8��� �� $ 9 ����� ����� ��� ��&� �� ��� �� �! ��������

;��������� ����� �� �� �� ��� ����� ��� �� �����

��0����!�� �� ��1�./2 ������ ��� �� ���� � ���� ���� �� �� �� �� ������ � ����� ��� � ���� ����� � ���� �� ��������

�� �� ����� ���� ��� �1 ������ ������� �1 )�!3(�! � ��������� �� ���� 1���� � E��������� ����� �� ������� �� ��������� ������� �� � ������������ �� ����'������ %!�,�-���� �� ������ � ������� ����� �� ���� ���� ��� �1 ����� ������� �� �� ���� �1 )�! ������ �� ���� � �� ��8

� �������� ����� ����� ��� � ��!�� ������� �$*

Page 279: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���� ����� � ��� /���� ����� �� ������ �� ��� �� :" 4� ����� �1 ����� �� ������� ���� ��� ������� �� ������

$� ��� ������ ������� ����� ��� ������� ��� ����� ���������� ��������� E=-H;= ����� �

� �����5������ ����� � � � ��������� ��� ��������� ��� ������� ��� ������ #�� ����� ��� ������ ����� �������� ������� �� � ����� ���� ����� ���� ����� ������ ��� ��� ���� �����

��0����!�� �� � ���� ��� �� ��2 �� ���� ����� ����� ��� ��� ��� ���� ��� �� ����� ����� ������&� ��� ���� ����� � �� ���� ���� �� �� ������ � ����� ���8�� �������

� �����& ��� �� ������ ����� ��� ������ ��� �������������

2 �� � �� �� ���� �������� ���� �� 5 ���0/ 6�������� E��8���� ����� +6E�. ��� �� ���� �� ���7������� ���� ��� ��G= ������8� � �� �� �� ���� ������������ ���� ��� $�8��G= ����� ������8� � �� �&������ �� ������� �'���������

���� �� ����� �� � �������� � ��� ��� ����������$�

Page 280: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���

��������� � ������� � � ����� � ������� � ������ ����� ���� � ����� ��� � ��� ��� ��� �� �� ���� �������� �� �������������� ��� ����������� �������� ���� �������� ������� ���� � �� ���� �� ���� ��������� ��� �� �

������� ��� ��� �� ���� �� ������� �� ���� �� ����� ������������������ ������� ��� �� ������ ������ � ������ ����� �������� ���� ��� �� ��� ����� � ��������� ���� � ������ �� ���� ��� �� � ����� ���������� ��� ������ ������ ������� ��� !� �������� ������������ � ����"��� ������� ��� �� ������������� ���������� �� ��� �������� ������� # ����� $%& ������� � ������ ������ �������� ������ �� !'�() ����� ���� ������������ �������� � ��������������������*����� ������������� ��� � ��������� ���� � ���� ��� ��

���� ����� ������� �� ��� ���� ���� ���������� � � ������������ ��� ��� �������� � � ����� ������� ��������� ������� ������������� �� ������ �������� ����� �� � �������� ���������� ��������� ��� �������+ ��� � ��� �� �� � ����� � ����� ,�� � �������� ���� ����� � ��� ����� �� ������������������ �� ���� ����������� ��������� '�� ������ ���� �� ���� ����� � ����� ��� !����- ���� ��� �� ���� ������ �������������� �������� � � ���� �� �� �� ����� ������ �� ������� �� ��� ��� ��� ���� ���� ��� ������� ���� ��� � �������� ��� ������� ��������

� ��� �������� ������ ��� �� �� ��� �� ��������� �� �� ��� �

����� ��� ��� ������ ������� �� �� ������ �� ����������� ���� ���� ������� � �������� ������ ������ ������������� ��� �� ��� ������ ������� �� �������� ����.

���� �� ��� ��� ��

Page 281: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���� �� ��������� �� ��� ���� �� ����������� � ��� ����������� ���� �� �� !"#$%& ���'(��)*+ ,� -��(*� #.�!

������� � ����� ��

������� ���� ������

������������ ����

����� ��

$/0%$12 $3/4�2/ $3/3�21 #�55-�'#�)(*4$$%444 $&6&�60 $&63�6& 7,��--8(�#�9&$6%&3$ $6$2�/0 $6$0�/& -)#5�--#)#(',-9443%43/ $113�1/ $114�16 �:5�, ;�,#�)55�90$/%0&/ 43/3�10 43/4�1& <<<<<<;<#<<##;<#<<<#;<#<

<<<<<<90&1%0/6 33$4�3$ 33$$�3= <#;<#<<##;<#<<<#;<#<<<<<

<:<#;<#<###<<;9

���� �� ��� �* �)�� �/��+ (00�� !%� )1,* �� *,�+* ��� 2 3(��������� ���� �� �� !"#�"& ���'(��)*+ ,� -��(*� #.4%

������� � ����� ��

������� ���� ������

������������� ����

����� ��

4&0%403 $=36�0= $=32�&1 ;�(<��',93/$%31= $$13�2= $$14�01 ;,,�-8�8<9&2%2$ $34=�2= $3$1�01 :<<<<<<�<<<<�<#96$%14 $/3/�1= $/36�/1 <<<�<<<#<�<<<#<�<<<#<�#<

<<�<<<<�<<<913%$4/ 4/3$�4= 4/3=�$1 #)#)#8'<<<<<�<''<<�<<9

���� �� �.5. �* �)�� 5 ������� )1,* �� '1)���*�*)�� 2 3(��������� ���� �� �� !�5"4& ���'(��)*+ ,� -��(*� ".�$

������� � ����� ��

������� ���� ������

������������ ����

����� ��

433%431 /16�&= /12�31 !��((�944&%434 $=2=�2= $=01�01 ���()(5�94&4%4&1 $=22�0= $=20�&1 �,!,-5�9&&1%&6$ 40$=�$= 40=1�=1 = ,),�;:5��,<<-,(�,##<'<*23%1& 46=0�4= 46=&�$1 <<<#�<;#;<<<#<<<�#'##�<<<

�<<<#9

���� �� ���� ��������

Page 282: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���� �� ��4 �+��+ (00� �* �)�� �4� )1,* �� '1)���*�*)�� 2 3(��������� ����� "5$5�& ���'(��)*+ ,� -��(*� ".�%

������� � ����� ��

������� ���� ������

������������ ����

����� ��

&&4%&0= $$20�2= $$2&�01 �,5,)-�;9343%333 $320�2= $32&�01 #-;,-�',-59$22%$66 $3/$�2& $3/=�23 '�,,#5;,�,<*&$%01 $6=6�/= $6=2�61 <#�<<<�##<<�#<<#�#9&43%&31 4=4&�1& 4=43�13 ',�,>-5�,;--��()*4=/%44/ 4322�42 4320�40 5-)�5���(5'5)��-)(5'9

������ ��������7����� ������ � ������ �� � ���� ������ ���� �� ��� ������� ������ ���� � ������� '����� �� ��� �� ����� � � ������������ �� �� �������� ?���� � �������� ��� ����� � � ����� ����� �� � �������� 0== �� ������ ����

���� �� ���� ����� ���

Page 283: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

<������ �� ����� �� ��� �� �� �������� � 4�( ���� >�������� @�������� @��� ����� ��� #���� 9����

��� �� ����� ������ ������ �� � >@@ ���� ����� ������� ������ �� ��� !'�() ��� ,#) ���������� >@@ ���� � ���� �� ���� � �� �������� ���� ��� � �������� � �� �������� � >@@ ���� � ���������� ����� ��� ������ ����� ������ � ��������� ����� � >@@ ���� � ��� �� ������ �� ���� �� � ��������� ���� ������� ��� �� ��� 1�'�� 40 �� � 60 ����A� �������� ���������� �&=B ������ ��

� ����� >������� ������ �� ����� 8���� ��� ��� �� ������� ���������� ���� ������� ���� ���� ���� ���������� � �� �������� ��� ����� ��� � ���� ���"��� � � ������ ������������� � ����� ���� �� �������� � �� ���� �� ��� ���� �����������

��� ��� ������ ������ �� � ����� �������� ���� �� �� � ��������� ��� !# ���������#������ ����� ����� ������ �� � ���� � $%$= �� �� ���������� �9��������� $111�� ��������� �"���� � �� � ��������������� ���� � � ������������ ������� :����� ������������� �������� � ����� ������ � �������� ��� ������� ������ ��� �������� � �������+ ������������� � ������ �� � ��� ��� ��� ����� � �������� �� ������� !# �������� �#����� �� ��� $112+ ;���� ��� 4===+ #��� �� ��� 4==$�� ����� ������������ �� � ���������� ������ �� <������� �� ��� $111+ �� ������� � ����� ��������� �� ���������

'� ���� �� ��������� � ��������� ��������� �3=����A����� ������ ��������� �$== ����A���

@� ���� � $.$ �������� � � ���� ������ ��� ����� ������ ����� �� ��� ���� ������ ���������

��!

���� "� ������ �� ������#

�� ������ �� ��� ������� �������� ��� �� ��������� ����� ������� �� ��� �����

������ ���� ������� �� ������ �� ��� ����� ��� �����

Page 284: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

>� C�� � ���� ����� �� �� ������ ��� � ���� ��������

(� ,"�������� � ����� ���� �� �������� ���������� �4==����A�� �� $0 ������� ���� ���������� ��� �������� � ����� ���"��� � �������� ���������� ��� ��� ��$0 �������

,� � �� ���� �� ��� ���� �� ���������

���� �� ������ ����������$

Page 285: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� ��� � �������� ��� ���������� ��� ����� �� ��������� 9����� �� �� � ��� ���������� ����� �� ��� ��� ���� � ������� ����� ��������� � 4�( ������������

'� 9�������� '�� $= �� � ����������� �������� �0 ����A� ��40 ����A� �������� ����������� �� � �� ���� ��� �� ������ �� ���� � �� ���� ��� ������� �� 3= ������ ��2= D>�

@� '���������� '�� $= �� � ����������� �00 ����A� ��40����A� �������� ����������� �� � �� ���� ��� ������� ���� �������� �� 3= ������ �� � �����

>� 9��� � ����������� ��� ��� �������� �����������40 ����A��� ���� ���������� ��� ��� ��� �����������

(� ��� � ����� �� ���� ��� ��� ���� ������ ���� ��� ������� �4%& ��4�� ��� ���� �� � �� ���� ��� � ��������� ��� ������ � �� ���� �� ����+ �������� � �������� � ����� ����� � � �� ���� ���� �� � ����� ������� ����

,� (�������� ���� (����� �� ���� ��� ���������� �3 E 40��� $= ������ ���� � �� ���� ���� ���� �� ���� ����� �� 3 ���� �� ���� � �������� ����

�� (�� ���� ���� �� � ��� ��� �� ������ ������ ����� ������ ������ F���� ����G

<� 9�������� ���� '���� �H�� �� �� � �$= �� �� &= �� ����0= ����A� �������� ����������� �� � ���� �� ���� ���������� �� �� �� &0 �������

:� (�������� ' �� &0 ������ ���� ���������� ��� ������� �� � �������� ������� �H��� �� ���� � �������� ����

)� )������ �� 3= D>� �� ���� $ ��� ��� ������� �� ����������� ����� ���� ��������� ��� � ������� � �� $ ��� ���������� ��� � �������� ��������

���

���� !� %��#�� ��#� ���

Page 286: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

I� ,��������� ���� '�� 4= �� � 0= ����A� �������� ����������� ��� ������� �� $= ������� '�� 4= �� � '��������� .0B ��' �$.$� ��� ������� �� $= ������� 9��� ����������� ��� ������ ���� � ������ ����

*� '�� 4= �� � '��������� . 0B ��' �$.$� ��� ������� �� $=������� >����� ���������� �������� 9��� �� ��������

�� '�� $= �� ���������� ��� �������� 9��� ��� ��������� ����� ���������� ��������

���� �� �!��� ����������

Page 287: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� ����� ���������� �� !'�() ���� ,#)� �� � ������� ���� ������� ���� � ����������� ���� � ������ ��������� � ������ ����� ����� ������� ���� �� � ����� � ������������� ����� ��� �� � �� �� ���� $ �� !'�() ����A�� � ��������������� #���� ����������� ��� � ������� �� � ���������� ������� ��� ������� ��������&��������������� ���� �� �������� �� ����� #������� ������� ���� �������� ������� � ������ �������� ��� � ������ ���� � ��� ���� ��� ���� � ������ �� � !'�() ����� ���� ��� ������C�� � ���� ���� �� ����� � ���� ��� ������ ����� ����������� ��� =�$B��' �������� �� � ����� ��� ��� ������� ����� �������������� '� � ������ �� �� ����������� ���� ������� �������� �� �� �� ����� ����� ������ � ������ ��� �8����� ��� $11&�� '������� � ������������ �� � ������ �������� ������ �� ������� �������� ��� ������� ������� �� � !'�() ������#����� �� ��� $112��C� � �������� 4�0�����������H��� ���� �� � ���� ������

������� )� �� ������� �� ����� ������� ��� � ����� ������ ������� ��� ����� ���� �� ��� ����� ������ �� ��� ���������� �� ������� ������ � ������������ ��� � ��������������� ������:���� � �������� ��� � ����� ������ �� ��� ��������� ���

� ��� ������� �� ��� ���������� �� � ������ �� ������� �������� �� � ������ ����� :����� � ������� ������ �������$== ��� ��� � ��� ����� �� ������ �� �������� � � ����� �������+ �� �� �������� � ����� ���� � ���������� ����� ����������� (������� ������ ������ ������������ � ����� ���� ���������� ��� � ������������ �� ���� �� � ���� �� ��� �� ���������� *������ �� ��� $116 ������� � �� � ��������� ���� �������� ������� ����� 9 �����

���

���� �$����� ���� �� �����# ��� ����������� & �����

"������ �� ��� # $��� ���!���� %& '(���) *�%+,-(�

Page 288: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���� �� ���)67(00* '��,�)�7���)1 8�)3 ��/� ����1���

� �� �! ������ "� �� �����

����� �� �� J 4= ����A����� �� � J 0= ����A�(������ J =�$B'����� ���� ����� J $ ���A�<������� J $ ���A�'������� ���������� J 3= ����A�<������ �� � ������#(# �� � ������#����� �H�� �� � ������

���� ���� �� �����# ��� �����������

'� ��� � �������� ����� ��� ��� ��� ��� ���� ���� ������ ���� �� � � ��� ��� � ���� � ��� ���� ��H���

@� ���� � ��������� � ����� ��� ���� �� �������>� '�� 0= �� � ������ �� � ����� ���� ������ �� 4%3 �� �

� ���������(� ' ����� ��� �� � ��� �� ����� ��� � ������

���� � ������� � 9 ���� ���� � ����� ������ �� ��� � � ����

,� ,"�������� � ������ ��� =�$B ��' �4= ����� '� ��� ���� ���� � ���������� ������������ � � ���

��� ������� �� �� ������� ��� �� ����� ���� ������� � ������� �� � ������� :�� ��� � ����� ������� �� ������ � ������������ $= ���

<� ����� ������ � ������� � � ����� ������ �� ������ ���� � ������ ��� ��� ������������ ���� �:�@'�� '�� 1�� � ���� ��� $ �� � :�@' �� � �������� ������������� ������� � 00 B ������������ ��.�� � :�@'�

:� ���� � ����� �� ����� ������� ���� � ������ ����� ������� <���� ��� ����� � �������� ��� � ������'���� � ���� ���� �� � ������+ ���� 0 ���� �� ������������� � � �������

)� 7�� � ������ ��� =�$B��' �4= ���I� ,��� ������ ��� 3%0 �� � !>5. =�0B ������ ���� �$.$+

�.���

'����������� �� ������� �� �������� ����������� �K�����L�������� � ���� ������� ������������� ���� �� �� ������� �������

���� (-� $������ �������� ��� ���������� �� ���������

.��/���� ��� ��0�� �������� ������ ����� ������������� ����

1������� ����� �� ��������!��� ��� ����������2 �����!�/� ������ �����

3��������������� �� � �/��� ��������� ��!������������ ��� ��� ��0� ���������� ������� 4/��� ��0�5����/�� ����� �������� �� ���/����� ����� 1(� ������

Page 289: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

'��������� ��� ���(����� & �(� ������� ��#� ���� ���� ������� � ������� �� � ����������� � ����������� ��� � ����"��� ����������� � � ������� ����� ��� ��������� � ������ �� � ����� ������� � ����������������� 4�������������� ����������� �� ���� ���������� ����������� ���������� ���� � ��� �� ���� ��� ���� ����������������� �� � �������� �� ����� ��� � ������ ��� ������������

'� ��� ������� ����� ������� ��� ��������� �� � ��� ����� � ����� � 4= ���

@� <������� � ����� ��� ����� !�� 4�� ������������������� ������ �������� �/2 ��A�� !����- :4C� ��� /��=�40 ���A� 5�:>C3� �: $$�0 ��� ��� �� ������ ��� �� �� ���� �� 36 D> �� 4� �� ������� ��� ���� � �� ���� ������ �������� ������� �� �� 6= D> �� $= ��������

>� 9��� ������ ����� � ����� ��� ��������� ����������� ������������ ������ �� ������� �� ��� 1 ����� �������� ����� ��� ������� ������ �� �������

(� 9��������� �� $= ���:�.(),' $1.$�,� '�� 4 �� ����������� ����� �4 �� ��� ������� �� $ ��

�:���� 9��� $ �� 4 ���� �� ���� ���������<� (�� �������� �� ���� �������� ��� ���� ����:� 9��������� �� 0%$= �� � =�$B ��'�)� '���� �� !# ����� �� ������� �� ��� $$� 4�0 (:@ �� � ���

��� ������ � ����� ���� ������� & ������ ������������ ��� � ����

����(����� & �(� ������� ��#� � � ��# �(� �)* �(��� ��+��� ���� ������� ����������� � � ������� ����� �� ���������� � ������ �� � ����� ����� � ����� ���� �� ����

���

���� ��� �(������ ���� ��� ���� & �(� ������� ��#� �

'"����� �� ��� (���6 &---6&---�)

Page 290: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����� ������ #��� @ ��� > ��� � ������ � ����������� � ������ ������ �� � ����� ����� �� ��� �������

'� '���� ����� ����� ������� �� � ����� ��� ����������������� ��� ������������ ������ �� ������� �� ��� 1 ������ ���� ������ �� � ������� ������ '���������� � ������ ��� � ���� ���� �� � ������� ����� ��� ����� ������ @ ��� ( � � ����������� ��� �� �� � ��������

@� 9��������� ����� ����� �� � ����������� ����� M��� 4�� ������������������ ������ �������� �/2 ��A��!����- :4C� ��� / �� =�40 ���A� 5�:>C3� �: $$�0N�

>� ��� �� �� 36 D> �� 4 � �� ������� ��� ���� � �� ���� ������ �������� ������� �� �� 6= D> �� $= �������

(� ���� �� ������ (������ � >'������� �� =�40 !5�:>C3� �: 1�& �$= ��A$== ����

,� '���� $= �� � � >'������� �������� �� � ����� ������ �� $0 �������

�� '�� $ �� 0=B ����������� ��������� 9���� ������� ����� �������� �� � ������� ������

<� '�� / �� ���� ��� $ �� :�@' �� � ����� �������� �������� �� � ����� ��� >$/ ������ �� ������� �� ��������� 1�

:� ,��� ��������� ������ �� ���������. =�0B ����� �����$.$+�.�� $%0 ���

)� '���� �� � !'�() ����� �� ������� �� ������ 4�4�$�4�

,��� ��� ���� & ������� ��#� � -��( ��)?���� � ����������� �������� ������� ����� ��� �������������� � ������������� � ��� � ������� ����� �� � ���������� � �� ����� �� � ����� ��� � ������� ����� � � �������� �����

'� >�� ���� ��� ���� � ����� ������� ��� � �������� ��������

@� ���� � #!' ����� �� ��� ���� � 4 B �������� � �#!' ����� �� 4== � ���A� !C # �� � �: 6�/ �4 ��A$== ����

>� '�� 6 �� � � 5:# ����� �� � ����� ������(� ��� �� ���� �������� �� $0 �������,� '�� 6 �� � ����� ����� � $ �� � :�@' ��� ����� �� �

����� ��� ��������� �������� ��� ������������ �������� ���� �� � ��� ����� ��� ��������� � ����� �� �������� 4�4�$�$� '���������� � �� � ��� ����� ��� ������ ����� 9 : �>� )�O�� � ����� ���� � ���� ������ 9���� ����� � ��������� ������ �� ����� �� �9 >$/ ������ �$0 �� E 3== ���� ' 0%10B ���������� ������

���� ((� 1����� ���/������� �� ��� ������ ��������

Page 291: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�� ��� �� ����� ��� � ������ ���� ���� �� ���������� �������� �&%0 �� �� ��������� '� ���"��� �� �� �� �� !'�() ����� ���� ������������ ��� �� ���"��� ��������� � ��������� ��� �� ����"��� !#A!# ���������

�� '����������� � ��������� �������� ��� ������������ ������ � �� �����

���� ((� 1����� ���/������� �� ��� ������ ����� ���

Page 292: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������ ���������� &� �).,%�� ������� �� ������� ��� �� ����� ��� ������ ��������� '������ � ����� �� �� �������� ������������ �� � �� � ��������&���������������� ���� �� ����� ��������� 5������� 8����� ��� ������� � ��� ��� ���� ��� I��� �� ��� $112 ������������ ������������ ���� � ������� ���� �� ������� �� ���������� ������ ���� ������ � ���� ������ ����� �������� �������� �� ���� ������������ �� �� � � �� ������� ��������)� �� ��������� �� �� ��� �� �� � ��H � � ����� ���� �� ������� �������� 9���� � ���� � � ���� ��� �� ��� ��������4= �������� ��� �� ��� � ��O����� � � ����� ���� ��� ������� ��� � ���� ��� � ���� ����� �����

� #� �� ��� � $������� ����� �� %��&� &� �����'��� ��� �� �&� ���' #��(' ����� ) ��*$��������� ��+ ,��� ���� ������

���+�����(+��+��������� ����� )���+ � & ������� ��� ������� ��#� �

'� ���� � �� �������� � ��������&���������������� ���� ������������.=�$ B��' �$.$+ �.�� �$= ��A���� ���� � ���������� � ������ ���� ��������

@� ��� =�4%=�0 �� ������ ��� ��� ��� =�4%=�0 �� � ������ !���������� �� �������� ��� ���������� � ����� ��� � ������ ����� ����� ��� ���������� ��������� ������ ������� � ������ ��� ������ �� ��������

>� '���� �� � ����� ��� ��� �� ��� �� ���� ���������

(� )���� ����� ���� ���� ����������

��!

���� ��� �� ����+ �

���� 72 8��������� .2 $��� $�9��� 1��� ,, '(��:) %&�(+%&���#����� 7;2 .������<�0�/ 92$��� $� 8��� 1�����$��� ������� (- '(��,)(%�(+(%���

=����� ��� ������ � �������� ������ '��� ���������� ��������� ����� ��� ����!��� �� ������ ������������������ ��� ������ �������

� � �������� �� 0��� ��� �3�� ��� ����� ������� ����� �3:2 ���� -�(> ?9 �������������� ����

� ��� ������� ���������� ���������� ����� ���� (+& �=�� �� ���� ��� ��/���� �= ������� ��� ������������/������� ������ ������� �� ����������

@� ��� ���� ��� ������ �������� ����� �� ����� ������'���� �� � ��� �����)�

Page 293: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�/� ,�(+��+���0�� ����� )���+ � & ������� ��#� �

'� ���� � �������� � 4�0�����������H��� ���� �� =�$B ��'�$=��A���

@� ��� =�4%=�0 �� ������ ��� ��� ��� =�4%=�0 �� � ������ !���������� �� �������� ��� ���������� � ����� ��� � ������ ����� ����� ��� ���������� ��������� ������ ������� � ������ ��� ������ �� ��������

>� '���� �� � ����� ��� ��� �� ���(� )���� ����� ���� ���� ����������

4�0�����������H��� ���� �� �������� ��� �� � �������� � ��������������� ����� ��� ������������� � ���� ���� ��� � ������ �� � �������� � ���������������

��� 1 ��# ���(����� ����+ �

#��� 4�0�(:@ ���� ���� ������� ��������� �������� � ������ ��� � ������� �� ����������� � ���� ������������ ��������� '���� =�$ �� � ����� �� � ���� �����

��������� ����� )���+ � & ������

'� ���� � �������� � ��������� ���� �� ���������� ��� =�$B��' �2=.&=+ �.�+ $=��A����

@� ��� =�4%=�0 �� ������ ��� ��� ��� =�4%=�0 �� � ������ !���������� �� �������� ��� ���������� � ����� ��� � ������ ����� ����� ��� ���������� ��������� ������ ������� � ������ ��� ������ �� ��������

>� '���� �� � ����� ��� ��� �� ���(� )���� ����� ���� ���� ����������

������ ���������� &� 2�% ��

3�� ���+

)� ���������� ���� ���������� � ����� � ������ ����������� �� ��� �������� ������� �� � ����� �� � �� ��������� ��� ��������� :�� ������ � ����� � �� ����� �� ������� �� �������������� � � ��� ��� �� �������� ���� �� ���� �� ������������� ������� ������ #���"������ ���������� �� ����� ��� � �������� ��� � ���������� ��� ���� �������� � ��������� �� � ������� ����� �������� ����� ��� �������� �������� �� ����� �� ����������� ������� ��� �� �� �� � ����� � �� ��������� '� ���!'�() ��������� � ��������� �������� ��� ������������ ��� � ���������� ��� ������ ��� �� � ��� ��� ������ � ������������� � ����������

���� (&� $� ���������$

��� ���������� �� �����!���� �� �� ������� �� ��%->�

@��� �������� ��� ���� ������6���� �� �� 0��� � � ������ ��� /���� ��� �����

Page 294: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

' ��������� �������� ��� ���� ������� ������ �� ������ ��������� �� ��� 1� ����� �� ���� ���� � ��������� �������� 0=B !�����.=�0B ������ ����� �� ���� ���� � ����� ������ ������ ���� � ��������� ����

.����4����������� � ����� �������� ��� �������� � ����� ������ �� 0�� ����� �C�������� =�0 �� ��� � ��� �� !'�() !# ���������� ��������� &�0 �� �� ���� ��� &�0 �� � � =�$B �"���� ����� ������������ �� ����"��� ,#) �>�!#A!# ��������� � ������� � � ����� ������ �������� ��� � ����� �� �� ����������� ������ 0 �� �� ��O��� ���� � �����: �> ��� ����������� ����������O����� #�������� �� ��������� �� ���� ����� � 60 �� E $0= �������� >$/ �3 �� ������� ��H� �!��P ������ ��> ��������'�������� � 5�������� ��� =�$B ����� ���� �� ���� �� ������� ' ��� =�=/B ����� ���� �� /=B ���������� A 4=B ���� �� ������� @ �� �������� � �� "����������� ��� 0B ������ @ ���������������� �� �� &=B ����� 34 ��� ����� � ��� ��� � 4== ��A����� �����: �> �� ������� ������ �� � ����� ���� ���������"����� ��� ���������� ����������� ��� ���� ��� ������� ��(� 9���� >����� ������ )������� �� >���� 9�����

���� (&� $� ������� ���

9 ������� �������� ������������� ��� �� ������������ ��� ����/�� �����!������

Page 295: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

� !'�() ����� ���� ��������� ��� � ��������� ��������� �����������

%������� ���������� &� ������� ����+ � ������� ��������� ������ � �������� � � ����� ��������� ��� ���� �� �� �� ����������� �������� :����� �� �� ��������� �� ������� ����� � ������� �� ����� ���� ������ �� ������ )� �� �������� ��� � ��� ��O�� ������ ������� ��������� ���� ����� ��� ����� ���� ��������� �������� ������ � ��O����� � � �������� � ������� � ������� ����������� ������� ���� � ������� �� � !# �� ��� ��� � ������� ��� ������ �� �� ��

������� )) /&4�0=1 M!Q:NQ

������� )8 44$$�$=& M!Q:NQ

@�� � �� �������� ����� �� � ������������ >$4 ���������������� ��� � �� ������ C�� ������ ������� ������������� ������ �� � !'�() !� ������ 0$0�34� $=&0�02� 44/3�$6���� 4411�$6 �44/3�$6 ��� ������� !��?���� �� ������� ������������ ������� �������� �� �������

���� 40 ������ ����� ������ ��� � �������� ������� ����� � ������

��� ����� ������� �� ����� �� � ����� $ ��� 4�

���� �� �3*� *)�'�� ) 1,)�' ,*,)�+*� �0 ,� '��* ) 1,���� � �����9� �, �)���)*+�������)�,�' ��� ����� (�, �)���)*+ �-* �:* �����

������� � ����� ��

�� ����������� ������

����&��� ����

����� ��

04%03 424�$& 42$�4/ #90&%06 0$0�34 0$&�23 )-89$=/%$$0 /&4�0= /&4�=$ 8'�8#� 94=1%4$2 1=2�0= 1=2�=0 5* <8;�*

���

���� ��� ���������� & �(� �).,%��* ��

7������ ��� �������� ������� ����������������

Page 296: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� � ����� ��

�� ����������� ������

����&��� ����

����� ��

$&/%$06 $==2�&/ $==2�$0 ' 8�#(##>*1/%$=6 $=&0�02 $=&0�$2 �## '��5#9$3&%$&6 $&21�64 $&21�2/ ##<##; #��->�*4$6%43$ $632�/& $632�16 8>5;857)--�)''5$$2%$33 $62/�61 $62/�11 #>'''<�,>�)#<7<5�*$0/%$6/ 4$0/�=4 4$0/�&/ ##; <-)�<5!)>8<��,<<*0/%66 44$$�$= 44$$�&4 �<,:5)(8�,<5,-�)5''*6/%16 44/3�$6 44/3�23 ))�: 5�5<5��(5()!�)*$61%4=/ 3=$3�34 3=$&�33 (#>-<(#<<���#7<;<>'-*1%0$ &&60�=1 &&66�=& )8<<;�>''���88#'':>;*1%0$ &&/1�$$ &&1$�=6 )8<<;�>''���88#'':>;*

���� �� �3*� *)�'�� ) 1,)�' ,*,)�+*� �0 7�-��* ) 1,���� � ���;�<�� �, �)���)*+�������)�,�' ��� ����� (�, �)���)*+ �-* �:* �����.

������� � ����� ��

�� ����������� ������

����&��� ����

����� ��

$$=%$$$ 42=�$1 401�30 �*$06%$01 323�4= 324�&1 >�*43/%4&3 233�3$ 234�26 -�)'#52&%21 201�3/ 20/�62 #<)-89$$4%$$1 /=0�&$ /=&�/2 #''#�5#944$%44/ 1=2�0= 1=2�=0 5* <8;�*$2=%$21 $=4=�0= $=4=�$6 ' )�#(##>*441%44/ $$$$�00 $$$$�33 8>5;8#7)*$&2%$02 $$03�06 $$03�40 ##<�#; (8�*4=6%44= $&33�6$ $&33�20 �-<)8#7<#<>'-*$1$%4=2 $&10�2$ $&10�2$ (#>-<(#<< 88>#<*6=%/1 4$23�=0 4$23�33 �<,(5)588,<5,-�)#'#*$6=%$1= 4$13�11 4$1&�&6 #'; <-)�#5!�>'<;�,<<*1=%$=1 4463�$0 4463�2= #)8: #;5#5��55()!�)*$4=%$&0 4004�4& 4004�1$ 8'#)#� �#����)#<7<5�*4$%23 &00$�$4 &003�$& )8<<;�><'���88#'':>;*

� ������� � ������ ������� ������ �� � ����� ����� ���� ��� �� ������� ����������� �� ��� �������� �� ��� ��������������� �� �� �� ����� �� ������ � ������������ � ���������� �� ���+��� �� ������������ ��� ������� � ���������� � � ������ � ������� #������� � ���������� ��� �������� ��� ������ � �������� �� �� ��������� �� ������ ��� � ����"��� �������� �����

���� (%� 1�������� �� ��� $9=@ ! �? $����

7������ ��� �������� ������� ����������������

Page 297: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

2������ ���������� &� ������� ����+ � 7� �� �� ��� � � ��������� ���� �� ����� ��� � ��������� �� ������ ����������� �� �� � �� ����� ��� �� ������������� �� ����������� � ������� ��"���� ��� � ����� ������O���� �� � ����� ���� ��� ������� ��� �� � ����������:�� �� �� � �� �� �� �� �� � ����������� ����� �������� �������� �� �� ���� ��� ��� ������� :�� �� ������� ����������� ���� ���� �� � ����������� ������� � ����������� �� ���� ����� ������ �� � ������� � ������ �� ������� ���� �������� � !# ��������� ����� ��� �� � �� �� ������� ���� ����� �������� ������ ������ � ��������� ��������� ��� � �������� ��������� �����'� ������ �� � ������� ����������� �� ���� ��� ���������

���� ��� �� ��� �� � ����������� � ������ ����������� ��������� ������� ����� ���������� � ����� � ����������� ���� ��� ��������� ' ���� � �������� ���������� �� ����� �����

���� �� �(::*�)*+ ,*,)�+*� 0� (�* �� �� *=)* ��� '���7 �)��� ��=)( *.��� ���*'(�� 8*�:3)� � * )3* ��� �������)�,�' -��(*�.

������� �� ��������� ��������

'��������� ) $412�26/'��������� )) $=&2�030#������� $3&6�64/M<��N� �������� � $06=�26=9��� �������� $601�134'����� 4=42�//6:'>�: ���� $/%31 4&20�$//:'>�: ���� 6%3/ 3206�144

� ��� ���� ��� �! � ����� � ��� %�������� ��� %�� ��-��!������ +' �������� & ���� ���+ ��� � ������� �������� ��

���� (%� 1�������� �� ��� $9=@ ! �? $� ���

7�/����� � �������� ���������� ���� ��� ������� ��!������ ���� ���� ������ ����!���� ���0� �� �� ������ ����� ������� ������ ���� ����<���� ����2 ������ ��/���� ��� � �������� ��������� �� ����

Page 298: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

��� ������ ���� ������ � ������� � �� ������� ������ �� ��������� ��� ���� ���� �� ������ �� ����� ���� ������������� � ���� $��

3����� & �� �� ���� �#� � ����� ������� ���� � ������ �� � ������ � � ���������� ) � �������� �� ���� �� � �H�� ���� ���� �� � ��������� ��� ���� � ������ � ���� ��������������� :������H��� ����� ��� �� ��� �� ���� ����� ��� ������� ������ ���� ������ �� � ����� ���� ���������� ���������� �� ����������� �� ����� �� ���� #������ � ��� ����� ��� ��� ������� ��������������� �� � ��������� ����� ���� ���� ���� ������ ������� ��� �������� �������

���

���� ��� 5�������# &� � ������ � ����(

Taxonomy

Choice of enzyme/

chemical cleavage

Choice of peptide

modification:

oxidation

iodoacetamide

Select charge state

Error tolerance

Peptide mass

fingerprint

*�#� �� ������ 8*7 7 �8�* 0� ��> +�)�7��* �*� '3��:

Page 299: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

�(��� & ���� �#� �#���� ���� / �� ��� $=3 ����� � ���� � �H��� �������� �� ����������� ��������� :����� ��� ��� � � ����� �H��� �� ������� ������"��� ������ )(� ,�H��� ��� ��� ���� ������ ��������������� �������� ����� ������ ����� � ������� ������� �� ����� �������� ��� �H�� �� �� ����� ������ ������ � ����������� ����� �������� �� ���� ����� ��� ������ � ����� �������� � ��������� � � ������ ��� �� �� �� �� ����"��� !#��� !#A!# ���������

�(��� & ���� ���� ���&������ ������ ��� � ���� �� �� � ����� � ������� �������� ���� ������������������������ �����������+ � ����� ����������� ���������������� ��������� ���A�� ������� �� ���� � �� ���������� ������� �� � �������� ��� ���������� � ������ ��������� ���� �������� ��� � ������ �� ������ �� ������� �� �

������� ����� ��� �������� � �� �� ���������� ����� � "����������� ���� ������� � � ���������� ������ �� ��� � ���� �������� � ���������� ����� ����� �� ��� �� � ������� ���� ������� ��������� � ���� )� ��� �������� � ���� ���� ���� �� � ������ ��� � ����� ����� ���� ��� � ���� �� ����� ���� �� ������ ��� ������ �� � ������ �� ������ �� � ����� ��������� � ������� ������ ����� �� � ������ �� ���� �� ���������� �� �� � ���������� � ������������ C�������� � �������� ����� ������ �� � ���� ������ � $2 (� �������������� �� ��� ������� � ������� ���� ������� � � ����������� ���� ��� ���� �� � ����� �� � �� �� ������#������� � ��� ������ �������� ����� �� "������������

����� ��� � �������� ������ ������ �������� ��� ������������ ����� �� � ����� ��������� ��� � ������� ���������� �� �� ����������� �� ���������� ��� ������ ����� ��������� ��� �� � ���� � $2= ��� ��� $=3 (� �������� ������ ��� �������� ����� � ���� ���� �"���� ��� �� �������� � �� �� ���������� ����� � ��� ������ ���������� �������)� �� ��� �� ����� �� ������ � ����� � ������������������ ����

� ��������� ' ���������� ����� �� �������������� )� ����� ������ �� ������ �� � ������� ������������� ����������� �� ��� ��������� �������

5������ �� &��#���������� �� �� � ����� ��� � !� �� �������� �������� '������� �������� ����� �� �� ������ �� � /==%30== (� ��������� #��� ������ ��� ��� ����� ��� ���� ����� ?���� �������� ���� ��� ���� �� ���������� �� �� � ������ ����� �� �������� �� � ����� ����� �� � ����� ����� ���� �� ��� $11/ �����

���� (:� .������� ��� � �������� �������"

Page 300: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������ ��� � �� ���� ����� ��� �� �� �� ������������ � ��������� � ����� � ������ �������� �� � ���� ����� ���� ���������� ��� ���� ������ ��� � �� ���������� �� ��� � ������� �� ������ 4�&�3� ���� 2/�� ���� ����� ��� ������ ������ ��� � ������ ������ ���� ��������� �� � ������ � ������ ������ ��� �� �� ������� ��� ������� ��� � ����� � ������ ����� ��� ���� � ����� ������� �� �����

�(��#� ����)� � ��� � !'�() ��� � ������ ���� � ������ ������ ����� �� �� ����� � ��������� ���� � ������ ���� ���� ��� �������� �� � ���������� ��� � � ������ )� �� ������������ ����� ������ �� ����� �� ����� � ����� ��� �� ����� ����� ) �� ��� ���� � �� �������� �� �� ��� �� ������ � � $(� ����������� ��� ��� ���� ��������� � �� ������ � � ��������� ��� ����� ������� ������� � �������������� � �������� ����

��� ���� �� � � ���#� �� )� �� ��������� �� ���� ��� � ����� ����� �� � ������������� �� ����� ������ ) � �������� ������ �� ����� �� ������ ����� ���� �� �� ���� � $(�� ����� ������������ � �� ������� � � ��������� ��� ����� ������� ������� � ��������������� � � ������� �����

2��� ����������� ������ ���� ������ � ��������� � � ������� ���� ������� � ������� �� � ���� �������� � ����� ������ ������ ����� ���� ���������� >��� �� ���� ������� ���� �������� ���� ����� ��� � ������ �� ���� ����� ���� ��������� �� �������� �� � �����) � ���� ������� �� ��� �������� �� � ����� ���� �����

�� � ����� ���� ��� � ������� ����� ���� ��������� ������������� � ����� �� ���� �� ��� � � ����� ��� � ������� ������� :����� � � ���� ������� �� ��� ����� �� ������ � �������� ����� ���� ���� ������� ������� ���� ������

� ���).! /00 �� ����� ����� �� �� �������� ��� ,� $��, �! /00 �� ,��� �� ������ �� �� ��� ��������$�� ���� � ��� �����' � � ��� ������� ������ ,���� ��� ����� /00 �� �� ���� ,������ �� ������� � ��� ������

���� (:� .������� ��� � �������� ����� ��!

Page 301: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

2��� ��&������'�� ���������� �� �������� ��� �� �� ��������� � ����� �������� � ��������������� ��� �������� ���� ��� �) ��� � ����������� )� ��� � �� �� �� ����� ���� ��� ���� ������� ���� �������������������� ���� �� �� ����������� ������� ������� ����� ���A�� � �)�

����+) � ������ � � ����� �� ����� �� � ���� ��� � ������ ����� ���������� ����� �� ������ � ������ ��� �� �� �� �� �����"���� ��� ��� ���������� ������ :���� � � ����� ����� ���� �"���� �� �� ��� ��� � �� �� ��� �� ������� ����� ���� �� O��� ���� ������� ��� ������ ��� ������� � ������ � ������ �� ����� �� ��� ���� � ����������� �� ���� ����������� ��� ��� ����+ � ��������� ������ ��� � ������

���� (:� .������� ��� � �������� ������"$

Page 302: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� ������ � -��( 5�* ��� ������� �6�����) � !� ������� ���� �� �� �������� �� �� ��� ��������� ������ �"��� �� ����������� ��� � !� ��� � � �� ���������� ������������ � � �"��� ��� � ��"���� ��� � ������������ �� � ����� ���� ���������� ��� ������� ��� ��� ���� ����� � !'#>C� �"��� "��� �� �������������������� �� ������ 4�&�3 �� � ����� ������� )� ��� ����������� � ��� ��������� ����� �� �� ��� $4�� ����� ���� ��������� �� �������� ��� ��� ������� �"���

��� �� �� �� ��� ��� �"��� ������� ��� � ��������������� � ����� ���� ��� ��� �� ��� ��"���� ����� ���"� �������.

$4==�= �"�R%�����

�� ���� �� � ��������� ����� ���� �"��� ����� ��� ���������� ���� �������� ��� � � #( ������� �� ������� R%�������� ��� � �������� � � �"��� �� ������� ���������� %��������� �� ��� �����) ���������� � �� � � ������ �� ��������� �� ��� � ����

��� ���� ��������� ��� � ������� �� � ���� �� ����.

$4==�= �"�R%��M��N�H�

�� M��N S ����� ���� ������ ��� ����� ��� � �� ������� ��� � ��������� �����#�������� � ����� ����� �"��� ��� � ����� �� � ���

������ ������ � ������� � � ����� ����� ��� � !��

�"�

���� ��� 5�* ������ � ����( �� ���� &��

Page 303: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���

������� �� �� ��������������

���������� ����� ������� ���� �� ��� ���������� � �� �������

� ���������� ���� ���� �� ��������� ��� ���������� � ��� ����������� �� ������� � ������� ! ������ � ���� ��� ��� ������ "#�$%�&�$# '(&&")�

� *+��� ,�� ,� �-������� ����� ���������� � -�������������� �� ������� � .� /������� �� 0�� ������� ����� �-������� ����� ��� ���������� � ��� ��������������� ������ � ������ ����� ��������� 1�- 2�� '�###)(#34(�$�

.� ��� �����-��� ��� ���5 � �������� �� �� � �� �� ������ -�����5������5 ��� ��- ��� �����

������������� ����� � ��� �����

������� ��� ���� �

/��5������ ������ � �� ������ ��6���5-����� ��� ��� ����

���� ������� �� ��� �������� � � -������ ��5�

,� � ��� ����� ��� � �-������ ��5 -������������ �� � -��������� �� -����

7��6�� ��������� �� �����5������ �������

������ ��� ������ � � �����

/� -������ ��5 �. *��� ��� ��6������

��8 � ��� ��6�� �� ��� � �-������ ��5 � ���. *��� �� ��� ������

/��5������ ��9�� � ������ ��� � -������ ��5 � ��� ������

/��5������ ���� ��� ����

/��5���� �� ��� � �� $�� -����� ��� (��� -��� ������

� ������� ����� �

��������� � ��������� ���������� ����� �� �������� ����/���� ,� ������� ��� 1�6��

:��5���� ; �##� ,���5�<:� <���� *���.��1 � =�>�3�=#=>%�> '�����6�)? =�>�3�$##(3�> '0��������)

��������� ���� � �� �����

Page 304: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� ��� ���� �

@�9�� 6���� ��� ����� A����- ��� �������������� �� ��� ��������

. * ��� �������5 ������

��-�5 ��� . * ��� ����� ������ �� ��� ���6����� �� ��� ����� ����� �������� �� ������� �����

�� �� ��� �� ��� ������� ��� ������5�������

����� �� ����������� ���� ���6���� ��6� ����

��-�5 ��� �� ��� �������������� ��� �� ���6� �����6� �����

<������ ��� ��- '" �< ���������)

���� ��� '3 �� ���(( ��) �� ��� " �< � ������ �� ��� � ��� ���5 -��� ��� ����� ��� �B������������������ �

1������ �� -�5 �����

�� 9����5 �� �� ���C� �������

7 � ���� 9����5 �� ���������� ���6� ��� -���� ��B�� ��� ��� �B��������

��� ��� ��� �� ��� ������

/���6� ��� �5 ���������5 � � ������������������� �� �� ���� -� ����� -��� �������� ����������

�:� ���� �� ��� �������� �������������

��� ��� -� ���� ��� �

���������� ��� ���� ��� ��� ��� ��������� ���������5 ������� ������

��� ��� ��� �� ��� ������

��� ���6��

���� ��� �� �� �� ������� �� ������

��� ��� ��� �� ��� ������

��� ���6��

<� ���� ��-� ������6���� �

�� �������� �� ��� ����� ��� ��5������ �������

/� ��� ����� �� � ���������� ��� ������

:�6� ���� '������� ���)���� �� �� ��� �� �������� ��� ����� ����.0A�

���� ������ ��� ������� �� � -������ ��� ���� ���� ������ -��� ���

/���� ��� ������� 6��������� ������ ��� �� � ��-�6������ ��� �

��� � �� ���� �� ����

Page 305: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� ��� ���� �

��� �� �� ��� �� ��� ��� -��� ���� .0A ��������� �����������5�� ������

D��5 ������ �� ��� ������ �� �� ����� �� �

�6��� ������ ��� ����� ��� �� ������ �� �5������ �> ����C@ ������� �� �� ���� ��� ������ -��� ��������5 � �����5 .0A ��� �����-��� ������ �� -������-��� ��� ��� ���������� ����������� ��� �

7�� �5 �������� ��� . * ��� ���� ���� .0A�

1�� ����� ��6� ���� ���

7 � = �@ ��6� ���� ��(" ��� �% �� ���� ���% �@ �� �� ������� ���������

:�6� ���� �� ������6�� ���� �� ��� ��� ��� ������ ���

/���� ��� ������� 6��������� ������ ��� �� � ��-�6������ ��� �

/����� ��������-� ��������

��� ��� ��5������ ��� �������� �������� ���# E:�

��� ! ����

������� ��� ���� �

:� ���� ��������� ��� � 7��6�� ��� �����

.����� �6���5� :�����5 ������� -���� ������ ������ �6����� ������ ����������� ���5��������� ��� �

:� ���� ������� ��� �:6�� ��� �����

��5��������� ����� ����� ������� ��� �� �������� ���6������� �����6�� ���������� ����� ����

D��� � ���� ��� ���5���������� ��� �� ������ �5 ������ �� �����5 ��� ��� ��� � �������

7��� ���� ���� � ��������

�5�� ����� ����������-��� ��� ���� � ��� �����6���

A��� ����� ��-� �������� ��� ���� �������� ����� �� �������

D������� �� �5� ����� ��� ��-�

�� 9����5 �� ������ ��� -����

D��� �� ���� 5� ����5 ���� 9����5 �� ������� � ����� ��� -����

7��� ���� ������� ������� ��� �

�� ��� ������ ��� ����������

� �� ������� �� ������ �� ����� ��"

Page 306: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� ��� ���� �

� ���� 5 ����7��� ��� ��-� ������6� ��B�� ���� � �� �������� �� ��� ���� �����

A��� ����� ��-� �������� ��� ���� �������� ����� �� ������� �� ����6����� ��-� ��� ��������

��� �5� ���� � ��� ������ �� ��� ����������

7��6�� �������6��5��� ��� . * ��� ���������� ��� ��� ��B���� ��������

1������ �� -�5 �������� �5� ���� -��� ������ ������ -��� �� �� �������� ��� ������ �� ����� �����

��� �5� ���� ������ �6�� ���� ��� ��

:��� ������� �� ������5����� ��� �� �����

/���6� ��� �B�� ����-��� ��� ����� :�� � ����� ���� �����5�

.���� �5� ����� ���5 ���5��� �� ��� � F������� �����5 � ����� ��� � ���� 9����5 ������� �

������� ������ ���� � ���6���������

7 � ������� ���� ���� ���C� ���� �����-� �������

��� �� �

������� ��� ���� �

�������� ����� ���� �G ���H �� ��� �� �� ��� ����� ����

:�����B� ���-��� ������ �� �� ���� �������5���

.���� � ��B��� ���� ��� ������� ����� �5��������6� . * ���� ����� ������5�� �

���6� �������� ������6� ��� �

��������� �� ������ �������

����� �����5 -���:���� �� ��� �� ��

���6� �������� G����H� ����� ��� �

������ -��� �����5������� ������ �

����� �����5 -���:���� �� ��� �� ��

���6� �������� ������������

���6� ������ ����� �5 ����� ������� ����� ������ �

7 � ��� � ������ ������5 ���5�

��� -��� 9����5� :���� -��� -��� � ��-��� �� ��6� ������ ������ ����� 5� � ���� ��6� ��������

�5�� /�5 � /� � ����������5� ���������� �

1�� ���������5 -� ������ � -��� ��5��������

,� � ��� ��� ���� ��������� � ���5 ��� ���5����5���� �������� �

� �� ���� �� ������#

Page 307: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���!��� ��������� �� ������ �

������� ��� ���� �

��� �� �� ��� �������5 ��� � �� ���� �� "��� �� ����������

��� �5 � �� ��� ���� �� �� �� � ��� �� ��� ���

(� .���� � ��� ��������������5 �� 5� �5 � ���� �� %# ����C@�� �

��� ���� -� � ���� -� ��� ���������5 ���6����� �� �������� �� ����5 � �����

�� .���� � ��� �� �� ����5 � ���� �5 ��� ��������� �� � ���� 6������ ># ����C@ 1�F��F ��� �� �9�� 6����� �� ��� �5 � �������� � �� �� &�>�

��� ���� ���� ����� � -��� -��� ������ �� ��� ����

��� �5� ���� ���� �������� ��6� � ��B�� ���������� �DA ���� ��5 ��6����� �B�������

:���� ��� �B��5 ���� ��:5�5��

��� �DA �� ������ ����� :5�5� -� �� ��� 9����5 � �� ���� ������ �� ��������� = ����� �

��-�5 � ��� &&�"I���5�� �DA �� ����� ����� 5� :5�5�� �������-� ����� �� �DA������ ����� -����������� -��� ��� �������� ��� :5�5� ���������

:5�5� �� ���� �B�� ���� ����� �� ���� ����� �� �����

��-�5 ��� :5�5� �� �������

:5�5� �� ���� ���� ���� ��� 4�# E: ����� ��� ���� ����� �� �����

��-�5 ��� :5�5� ��4�# E: ��� ���5 ���6����� �� ��� ����� �����6� � ���� ���9���

��� �� �� ��� �������5 ��� � �� ���� �� "�

.���� � ��� �� �� ����5 � ���� �5 ��� ���������� � ���� 6���� �� >#����C@ 1�F�� F ��� ���9�� 6���� �� ��� �5 � ���� ���� � �� �� &�>�

���5 ����� �� � �����5�� � ������5��� �� �� ��� �� ��� ���������� ������� ���������-��� ��� ������ ��:5�5��

F��� ��� �B����� �����5 ����� ��� ������������ ��������

� �� ������� �� ������ �� ����� ��$

Page 308: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� ��� ���� �

���� ���� � ����� �� � ��� �� �� ����� ��� ��������� ��������� ��� ���� � ��������������

/���6� ��� � ����� ��� ��� ��������� ��������� ��� � ������� .� ���5 ��� ������ �� � �� ��� �������� �� ��������� ���������5��� �� ������������� �5����� ��� :5�5� ��������������

��� ������ �5 ��� ������������� � ��� ��-? ���� �� ���� � ��C�@�

D��� � ��- ����� �� ������� �5 ��� ������ ���6���� �� �5 � ���� ������� � ��� ������ �������������� F� ����� ���� ���� �� :5�5� �� �������� F� ���������� ��������� ��� � �������� �� � ����� 6������ �5 � ����? ����� ����� ��� ������������ ����� ��- ����� ���������������

���%������ ��! ��������������

������� ��� ���� �

1� � 6�5 ��- ��� � @�- ������ �������� :���� -��� ������� 9������������� ������? �����5� ����� ������ -���� ������� ���� 0� �����5���5�� ���? �5 ��������6� ����� �B������� ��������

����� -��� ��6� ��������

:����� -����� ��� ��� ������ ��6� ���� ����������5 ��� �� ��� �� ���� ���������

D� ��� ������ ��� ����� ���� �������-����� ����

���� ������� -����������� ��� ��� ������� . * ����

���� ��5������ -���># < ������� �� ��� . * ��� �� (� �� �

09��������� �� . * ���-� ��� ����

.���� � �9��������� ��� �� � J �# �����

D� ��� ������ � ������ ����������� ��. * ��� -� �������������

�5 ��� ��������6� � �� ��� ������� �� �������� ��� �

� �� ���� �� �������

Page 309: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� ��� ���� �

<������ �������� ���5 ��� �� ���� � :���� ��� ����� ��������5� ���� ���� ���5-��� ���6� �

.���������� �9����������� ��� . * ����

09������� �� ��� � � J (>����� � 7 � �������������� �� ��� ������9��������� ����

�� ��� �� �� ������ ��� ��� . * ��� ����� ��� ����

����� ��� ������ ��� ��� ��� � �� ��- ��-� ������� ����� 5� -���� ����� �������� ��������� �

���� ��������� �� ���6������ ���������

��������� �� ��� ��������

7 � � J �� ���5���� ������ ��� ��� ���� �����

�� 9����5 �� �������� � 7 � ���5 ���� 9����5 ��������� � .� �� � �� �����5 ������ ��� �� ���������6� ������

���� ��5����������������

7 � ������� ��� ��� �� ������ �� ��� �������� ������ ���� �� �� ���5�����

<������ ���� �� ��������� ���� -��������� -� �� ����� �� � ����� ����

:����������� ������� �5 ������ ����� �� ��������

<������ ���' )� �� ����� ���-��� �� ���� ����� ����� �������

���� ��� . * ��� �������5 �� ��� ��� ��� ��� ��� �� ������5 -������� ��

��������� ���� �� ������� ����� �� �� ������0 0�� ������ � ����� ��� �� ��������

�6��� ��������� ���� �

����� ��� �� 6���������������

. * ��� ��� ������� ����� ����� -�5�

�� ��� ���� �� �� �� ��������� -��� ��� ��� ������

D������ ��� �� 6�������������� �� �������6���� �

.� �������� �������� .���� � ����� �� ������� ��� �� � �9���������� ����

:��� �� ��� �� ��� ��-D ����

������ ��� ���������� �����

��� ����� � �������� ����� �����? � �� �������� � ��5������ �������� ��� 6�������

��������� ������� 7��� ��� ���� ����� ��� 6����� ����� �� � .0A ����

� �� ������� �� ������ �� ����� ��&

Page 310: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� ��� ���� �

F6� ��� ���� ������ ������� �� �������� ������ �.� ������ ���������5 �� ��� �� �� �����

������ ��� 6����� ����� �� � .0A ����

7�� ���C� �������������������� ��� ��-�

.���� � ������������ �� �� �� & ���C@ ���:�� � �� � � % I�

���� ������� � ��� ����� ���� ��� ����� -�����������5 � � ��������������

.��������� ��5�������� ��� . * ����

:���� ��� ��5��������������� �

.� �������5 �� ��� ������� ���� � �� -��� ����� ������������

�5 ��������6� � ���� ��������� �� ��� ������ ��� �� ��� �� ��� . * ����

������������ �� ����� �� ��� �� ��� ��������

����5 � ����� ���� ��� ����� �� ( I ��� ������� ���-��� ������� �������

0��������� �� � ������ �� ��� ��� �� ���-����6�� . * ��� ���� � �� ��������������� �� ����� �����-� �. �

���� ����� ���� ��� ������ �� ������ �� -������-��� �������� ��� ������� ��� �� � .0A ����

����� ��� ���������� � ���� �� ���� ����������� ���������

����������� �����5������� �� ��� ������ ���� � �� �� ���� ��� ��5������

�� ��� ���� ������ ����� ��� �� ��� ������� ������ �� ��� ���������� 7 � ���5 ����9����5 �� ��� �������/���6� ����� ������� -��� ��B�� ��� ����B�������

������ ������ �� ����� ��� �B���� �������������5 ��5�� 5������

1� �������� 1������ ��-�5 �����

:���5 ��������� D������ ���-��� ������ ��� �������� � �-���������� �������� ��6� �������

/���� ������� �� ��������� �� ��� ��5������ ������ �� ��� . * ����

���� ��� ����5 ��������� �� �������6���� �

.� �������� .0A���������

����� ��� 6����� ����� �� � .0A ��� �5 (> I�

� �� ���� �� �����&'

Page 311: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� ��� ���� �

������������ ���������6� �� �� ��� �

��� ��> I ���� �# I � ���������� > I ��5���� ����� ��5������ �����������5 ���� -��� ������� ��5������ �������� =�> I ����� �����������

���� ��� ������ �����5����� ��� �

@�9�� ���C� ����� ���-��� ���� �� ���5����� ��� ��� ��� ������

7 � ���5 ��- ����� ����� ���� ��� ��� ���B�� ���� ��� ������� ���������5�

<�5 �� �� ������ ���� ��

��� ���5 6����� ������� �� �� ��������� � ����5���5 � �� �� �� ������� ��� �� ��� ����

������ ��� 6����� ����� �� � .0A ����

G,���H ������ ������� ����� � � -���� ���� ��� �� �� ������6� ���� ���������� ����� ����

:������������ -��� ���6�� ����� � ������ ��� ��� �������5��6��������

7 � ���5 �����5 �� ������� ? ����� �9�������������5� ��������5� -������ ��5 ��� �������� �� . * ��� ?����� ������ ����� �������� ������

�(��� �����������)

������� ��� ���� �

1� ����� �� ������������ D�@�. D�

1� ����������� 6������ :���� ��� �� ������������ ����

@� � ��� ����� :������ �����@� � ��� ����� ������� �����

/����������� �� �� ��9���

@� � ��-� �� ��� ��- .���� � �� � ��-� ���������5 � ������� ��������� ������

:���� ����� �� ����������

�� ����5�� ����� .� �������� �������� ��� �� ��� ��� ������ ����

/� � ��- ��� -��� ������ ������ �����

�5� �� ������6��5 ���� �5� �� �� � ������ ���� ��5������ ����� ���0� � ����� ���� ���5� �� ����6��5�

� ��� ������ ���� �&�

Page 312: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� ��� ���� �

������ ��������������� ��-

7 � #�(4(# ����C�@ ���������

������ ��������������� ����

������ ����� ��5 �� ���� ��� ����� ����� ��#�(4(# ����C�@ ����� ����

�� �5 ����� �������� ���� �� ���C����

7 � � ����� ������������� �� �A� '� �� (I) ������6� ���� ������ �6������ ���5�����C �����������

�� �5 ����� �������� ���� �� ���C����

D��� ���� ���������� �����6� �����������

�� �5 ����� �������� ���� �� ����6������������������

0�������� ����6���������������� ��� ���������� ����5 � � �� ��� �����6������� ��������� �� ������ � ������

�� �5 ����� �������� ���� �� 6� ��� ����������? ���� :��

�� ���� ��� ��� ��� ������ ����

@� � ��-� ����-�9��� ��� ����

.���� � �� � ��-�

F�� ����B ���� �� � ����B7� ������ ����B ��� ����� (# �� �����

����B ��������K��-� ����������� �������� �������� ��� ��� ����5�� �����

���� ����� ����������� �� ���� ����� ������� �>> ��

�� ���� ���� ����B������� ���������5

.���6� ���� ���� ����B������� �������

�� � ������ ��� �� ���� �� ����� �

� � ���� ��� 6��������� ������ �� �� �� ���� �� ����� �

��� �������� �������������

@� � ��� �� ���6� ��� ����� ��6��

/���� �� � ��-� ��������� �����

.������ ��������6������

��� �������� �������������

�� �� �����5��� �� ���� ������� �

�� � ������� ������� ����� (�: ���� �� ���� ������ ��6������

.���6� � ������� �����6��

7����� �� ��������� ���� ���� ��������������� �� ���

���� �B����� ������������ .� -� � �� � �������� � ��� ����� -����������� ����� �� �����B���

� �� ���� �� �����&�

Page 313: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

������� ��� ���� �

.�������5 ��������� :���� ������� �������� ��� ���� �� � �

7� ��� �� ������� ������ .���� DA

.� �������� ������� ��9�� ��� �����������������? ������� DA -��� ����� ����� ������� �9����� ��9������� �9����

����� ��� ��� �B� ��� ��� ������ � � ��-�������5 -��� ����������

��9�� �9���� ������� ����� ��� D�CD�� �� �B�������

������ � � ��B�� ��9�� ��� ������������������

0� �������� ��� ������ �� ��� �� �����5

:�� ���� ��� ������ � ���� �5 ����6��� �� �����5

K����� ������������� /���6� ���-� ���������� ��� �� �� � ' �� ��� $) ��� ����� ����

.������ ������ � ���� ������

:���� ������ � ���5����� ��������� ��B�� ������������ ������������ ���B����5� ����� ������� ������ ������ � �6����� �� � �

:(� � ����� ��� ���������� �� �� �

1�� 9��������6����6��� ������:�A

/������ ��� �� ��5������

��-�5 ����� �������� ��5 ��� � �����������5

/� ���� �����������������

���� � ����� ��������������

.������ ���� �� �������� �����

0� � ������� ���������� �

/������� �� ��� ������� 0� � ����� ���������������� �

/������� �� ��� ������� 0� � ����� ���������������� �

� ��� ������ ���� �&�

Page 314: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

���

��������� ���� �� � ������� ��� ������������� �������� ��������� �������� ��� ���� ������� ��� ����������� �� ���������� ������� ������ !!"!##$% !&$'!&(�

����� �� ����������� )�������� ��������� )�*+���� ,������������ �� �� ���������� "-$$$% !.�!!&$�/$�

����� �� ����������� �������0� 1����������� �������� ���������� ��� ��� ���� "-$$$% /2�$$23�-.�

���������45 ����* �65 7������� � ������ �����*� �����������*���*������ ����������� ������ �*���� � �� ��������� �������� ��� �������� �� � � ���������8��� � ����� �� -53$$ �� #$5$$$� ���� ���� �� !2- "!#.2% 2/3'-(3�

�������� 45 ��������9�� ��� ���������� �8������������� �������� ������ �� ���� ������ ��������� ��� 9�� ���� +�� :+� (& "!#((% 3&-!'3&-3�

��������9�5 ��������94� ����*����� ��� ��;��� ��� ���� ��������� <<� 78������������� ����*��� �� ����� ��� ������ ��������� �������� ����������� ���������� ���� ���� �� .3 "!#(.% 22!'2&$�

��������9�5 ��������94� ����*����� ��� ��;��� ��� ���� ��������� <<� 78������������� ����*��� �� ����� ��� ������ ��������� �������� ��������������������� ������� ���� ���� �� .3 "!#(.% 2&!'23&�

��������9�5 ��������945 7����0��� +4� ������� �� ���� ������ � =������������� ��� ����*��� �* �8������������� �������� ������� =��� = �� -3 "!#(#%!!##'!-!$�

��������9�5 ��������94� 7 � ���� ������� ����>� =��� = �� -. "!#.-%(2#'(&.'!-!$�

�������� 45 +��� ���� ?�� =��������� �� �������� ��9� ��� ������� ����������� �� ���� ��,��� ������� ������ !. "!##(% 322'32(�

��������945 ��������9�� ������� ��� ����������� ��8 ��� ��������5 ��8�������� ��� ��8 8����� ������� ������ !# "!##.% !.32'!./!�

�������� :95 =������ �65 ��0���,��5 �����0�� 95 ��*�����)?5 )�����0 ?5)�,�� +=5 ������� �)5 7 �����+� �������� ����������� �� � ��������������� ���� ������������ 8�� � ������������ � ;�������������� ��� ������� ��,+�� ������ /# "!##.% !/3$'!//$�

������+5 �����������?5 @�����5 )�� ���� �?5 =��� +�A � ���������������������������* �+������ ������� �� � ��� �������� �������� ���� = �� (2"-$$!% 2#2'&$&�

�>������ ?5 ������5 9�,��7?5 1��*B)� +��������* �� �������� ����� �� ���������� ��������������� ����������� � � ��,�� �� ���� ����� �� 8 �� ����� ������� ��� ���������� ���������� �� � � &#� �+�+ ���������� �� ���� ������������* ��� ������ ������5 = ����� "-$$!%�

��������

��������� � ��������� ���������� ����� �� �������� ���������� 6����������5 7�� 9�,��

=��*��� � C -$$- 6���*�@=� @����� ����+�9�� 2�3-(�2$23&�3 "������,��%A 2�3-(�/$$!(�3 " ���������%

Page 315: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

����8����5 ����� �����0* �15 4��0=�5 1�� �� �5 +�������� 7�5 ������������4� �����>��������� ����� ����������D���������� ������� 8�� ;���������D��� ������ ������������ ������������ � ���� �����������* ��� ������� �����,��*5�������������� ��� ���������� ����*���� ���� = �� (2 "-$$!% !($('!(-$�

���0��� )����?5 1�������5 +����*�5 �����)?5 9�,��75 ���� �5 ��������5 +���* ?�7 � ��������� ��� �� ����� ������� ��������������� �� ������,��*������ �������� ����������� �� ����� ��� ��������� ����*���� ' ����������* ���������� ������� ������ -$ "!###% /.#'($$�

�������5 ������� �+5 +���8��0 �)5 7*��� �9� 1��� ���� ����������� �� �������� �� ��� ������ �� ���� �����������*� 9����� -#2 "!#.!% -($'-(!�

������� 75 ������?� 7����� ��� ������� ��������* �� ���� ������ � ������� ���������� ���� �� ���� *� ���� -#& "!#(2% !/3'!($�

���,�� �=5 = ��� �75 =������� ���� ����,���,�� �� �������� ��� �����,����� ��������������� ���� �����������* �� ��������A ����� =����� ���� +������� 2"!#.#% &2-'&23�

���,�� �=5 = ��� ��* 75 = ��� �7A ���*����&� *���>*�������� ���� �� � �����>��� �����> �������� ����� ���������� ���� �����������*� E�� ���� +�������-( "!##-% !3/'!3.�

���� �65 6�����5 ����0����0 65 1������ �9�5 = ��� ��* ?+5 4�8�� �5= ����)5 1���� �5 ��� �� ?95 ������� ?� ��������� � �������������� ���������� ����� �������� ��������� ? ����� = �� -(/ "-$$!% 3!3-'3!/3�

���0�����75 +�������� 7� �������0� -�) �������� ������ ����� ����������� ������������ ��������� F ��� ���� ����� �� ����������� .$'/&-#'/$ "!##.%�

����,���� 6@5 +��� �� ?=5 ��������5 �����@5 �����5 ���� �5 ��� ���������)1� 7�8��� � �������� ��������� ������� ��� �������� ������� � ��������������� � ������ ���������� ������ ��� ������ 8������ ����� ���� = �� (!"!###% &.$$'&.$(�

�G���;,��� �5 0�5 ��� ���� �5 �������� 5 �B���5 6���������� �5 �����6� ����������� �������� �� ����������� �� ���������� ���������5 ��� ������*5 ������� ������������� ? ���� �� ���� *� ��� ��� / "!#.-% 2!('22#�

�G���;,��� �5 ��� ���?5 ��;���� =5 �;���95 ��,��� 15 +��� �� ?�=5 1������� +5��� ��������)� 7 � �������� ��������� �� ���*�������� �� ����������� ����������� ��� �� ��������� ���� � ��� ����� ���� ��;������� ������� ������!& "!##2% !$-2'!$2!�

�G���;,��� �5 +��� �� ?�=5 ��;���� =5 ��,��� 15 �;���95 1������� +5 ��� ���?5��� ��������)� ��������������,� �8������������� �������� ������ ����8���� � ����������� �� ������� ���������� ��������� ������� �� ��������� �������� ������ !& "!##2% !2(3'!2(.�

�G���;,��� �5 ����� �5 E���� 5 =���� ? � ��������� ������ ��� ����������� �� �8������������� ���� �� �������� ���� ��������� ���� ���� �*��� ������� �� ��� ����� 8 ��� ����������� ������ ��������� 8�� ���*������� ������������� ������� ������ !3 "!##&% 3-#'32#�

���������5 �������� 45 9�����0 ?5 1�* +?5 4����� �5 ���������� 5 )������5�����*�5 ��� �5 �B���� �������������* ��������������* �� *���� ��������������� �������� �* ����������� �� �������� �8������������� ��� ��������� ������� ������� ������ !/ "!##3% !#23'!#&3�

�����*�5 ��� �5 �B���� �������������* ��������������* �� *���� ������� ��������� �������� �* ����������� �� �������� �8������������� ��� �������� �������� ������� ������ !/ "!##3% !#23'!#&3�

��*�� ?� ��� 6 ��� ����=�� 7����������� � ���� �����������* 8�� �� ������������* ��� ����� ���� = �� /& "!##-% -$.&'-$.#�

������� 145 E��,�� +�5 ���0��� +?� ����,�� �����>��������� ����� �������������� ������������� ����*��� �� ��*���� *����*����� �� �������� �����8��� ����

���

Page 316: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

�������� �� �*��������������� ��������� ����� =����� ���� +������� !&"-$$$% -$($'-$(2�

���8��+ ��� 4����� ??� ���� ���������� �����,����� �* ������������� �������� ��� �>��������D���������� ������ ������������ � ���� �����������*� ����= �� /( "!##3% !##.'-$$2�

���0 ��� �5 �������95 ��*)5 +���G��� �5 +��� �� ?�=5 ��� ��������)15 + ������ 5 ��,������5 4�����> ?+� ��������� ������������� ����� � ����� ��� � �8������������� �������� ������ ������� � ������� ������ -- "-$$!% !.-/'!.22�

=��� +�5 �����������?5 ������+A +������,� ��������� ��� ��;������� �� � ��� ��������� �� � � ��������� ��,�� �* ���� �����������*� ���� ���� �� -2#"!##/% !.$'!#-�

=��������15 �������� 5 )�����5 ��� ���� �� ������ �*����� ��� �� �������������������= ������� ���� 4�� +*����� ! "!#.(% 2&#'23.�

= ������5 4������0��� ��15 +������� �� ������ ��� ������� �������������� �*�����> �������� ����� ���������� ��� ��4) ����������� ����* ������������ ����� �����������*� ? �� +�� ���� +������� !$ "!###% #!'!$2�

= �,����� =5 +������ @� ������5 ���;���)5 1�� ��5 ������� +5 ����������54������ ?5 ����� ?5 ���������7� 9�8 �8���������� ���������� �����,� � � ����*���� �� �������� �������� �* �8������������� �������� ������� ������� ������!# "!##.% !#$!'!#$#�

=������ ��5 ��0�� 5 �����������4� ���� �� �������� ���� ����������� "� !$���% �� ������� �������������� ���������� �����*��� �+ �� �+D�+ ��� ��������� ����� ���� ���� = �� (! "!###% -.(!'-..-�

=������66� )�� ��� ������5 � ��8 ��������,� ������� ��� +� ������� ���� �������* 2 "!#/&% &.$'&.-�

=����� 7? ��� =����� �?� � ���,�� ����� ���������� ������������ � ���� ������������� ��� � � ������������ �������� �� ���������� ����� ����� =����� ����+������� . "!##&% (.!'(.3�

=�,�* 7�5 ����� =5 ������ ?)� +��������� � �������������� �� ������� ��*������������ �* ��;��� � ���������� *5 ���� �����������* ��� ��������� ������������������� �� � ��� �����* � ����� ��������� ����� ���� = �� /2 "!##!%!!#2'!-$$�

)����,�� =5 )�@�����)5 H�,*�5 7 ����������� 7�� ����� �����,������ ���8������������� �������� ������ �������� � � ��,�� �� ������� ,�������� ��������� �� 8 ������������ �������� ������� ������ ( "!#./% 32'3&�

)������+� 78������������� �������� ������ ��� ������������� ��� ��;��������� ����5 9�8 I��0 "!#.(%�

)����?5 ���� �� ���� ��� ����������� �8������������� ���*���*������ ����������� ������� � ��� ���������� ����������� ������� ������ & "!#.2�%#('!!/�

)����?5 ���� �� ���� ��� ����������� �8������������� ���*���*������ ����������� ������� � ����*��� ��� ������������� ������� ������ & "!#.2�%!(2'!.#�

)����?� ��� �������� ������ �� ��������� ���� +��������� ����� ��� ���������5 E>���� "!##2%�

)����?� )�������� �� ����� �������� �� 8������ ����� �� -�) ���*���*����������� �� 4��0 �?� �� -�) ������� ����*��� ��������� ��� ��� �� ���������������* !!-� ������ ����5 7���8�5 9? "!###% 2!#'2-#�

)����?5 �� 1��� ������ �� ��������� ��,����� �� � � �������� ��� ������������ �� ����������� 64 I�@=�5 6��� ��� "!###%�

������� ��� =������� ��� �����������������* ���� ������������*� ����� �� �������,��* ����*��� �� �������� ��� ��������� ? �� +�� ���� +������� 3"!##&% /$3'/!2�

���

Page 317: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

�� ?�5 ��=�����0�45 I���� ?� � �� ������� �� ��������� ������ ����������� ���� �� �������� 8�� ����� ���� ��;������ �� ������� ���������� ? ��+�� ���� +������� 3 "!##&% #(/'#.#�

1��� ?�5 �����5 ����=�5 6���+�5 6 ��� ����=�� ����������* ������������� ���� �����������* �� ����� ������������� +������ -&/ "!#.#% /&'(!�

1��*B)5 J�� ?5 = ��� �7� ������ �������������� ����� ���� ������������� ������������� ������� ������ !# "!##.% ##.'!$$3�

1��������������=5 =�����������+���� 45 ����* 5 �������5 ���,�� 5 �� � 51���0�6� :������������ � � ��� ����� �� � � �������� ������ �� ������������������ �� �������� ������ ����� �������������� �� � � ��,������������� ��� ���;��� ������� ������ !# "!##.% -2#.'-&$/�

1���� +5 +���E� � ��,�� ������� �*���� �� ������ ��������������� �������������9����� 2&$ "!#.#% -&3'-&/�

1��������0���5 7�0��� �5 4������� 78������������� ��� �� ����� �������� �������� ���� ���������� ������� ������ !# "!##.% (/!'(//�

��,���=5 �B�� ��5 �������5 ������ 5 ������� �5 ������5 +� ���� ?5 ���0?�5 ��� �� ��5 =������ =�5 ������5 �B���� =5 +� ������5 ���G���,���5��������5 �������5 ������5 ����0�5 )��0���)5 ���� 75 ����@5 ���� �5������0 +5 �� ���5 4���8���=5 ����������5 =����*��5 ��������5 J�������� 5 �*���@5 )��8���5 ������5 ���8������� 75 ���0 5 +���� ���5������ �5 9��������5 +�������1������ 1��������� ������������ �� � � *������������ �* �*�������� ����*��� �� ������� ������>��� 9����� &!3 "-$$-%!&!'!&(�

��,���� �5 )� ����5 +0�*���,�75 ���� ��*�75 @����0���0 �,� ?� � �������������������� ��� ������������ ��� �� ��� ������� � �������������� �� � � ������������ ����� ����� �����> �������� ����� ����������D�������������������������* "��4)�+)% ��;�������� ������� ������ !# "!##.% #$#'#!(�

��,���� �5 �������� 45 )�����5 @����0���0 �,� ?� � ���� ��� ���,��������4)��+ ����� ��������� ������� A �������������� �� ���������� ����������� �* � � ����� �*���0������ �� ����,���� ���� � ������*���� ? ������ ���(. "-$$$% -3#'-/#�

��,���� �5 )�����5 ������� 45 ��������0� �5 �*���5 ���� ����5 @�� )����� ?5 )� ����0 +5 @����0���0 �,� ?� ������ �������������� ����� �� �����>��������� ����� ����������D��������������� ������ ����*����� �����������*� ������� ������ -- "-$$!% !/&3'!/3!�

� ��� ��� � 15 6������� =�5 ���� ��)�5 ��� �+5 ���� � +�A ���� �������������� �������������� �� �������� ���� ���,���������� ���*���*������ ���� ���� �� ��� � � ����,�� �� ���,�� ���� �� �� ���� �������,��*� ������� ������-$ "!###% /$!'/$3�

� ���� +5 ������* 5 I����5 H,�������?5 =������5 6��������� �)5 7���� ?1� ,�������� �� -)������������� ��� �������� ������ ��� ��������� �>������������*��� �� � ����� ������ ������ ���� �*����� ��� =��� ��������� "-$$-% ��������

�������� )�5 ����� ? 5 �������� ��5 ���� �5 ����7���� 45 1�� �E5 +��� �)5����������� ������ �������������� 8�� � ������ �������� ���� �� � �*����������������� ������� ��� ����������� �������� ����� ���� ���� = �� (- "-$$$%!!!-'!!!.�

�B���5 �����65 �K�� �� +5 6���� ?� ����,�� ��������� �8��������������������� ������ 8�� *���� ����������� �������� �� ����������� �� ����������� � � ����� ��������� ��� ��*������ �������� �� � � ������ ���������� �������� ������ / "!#.3% 3##'/$&�

�B���5 �����65 6���� ?5 �K�� �� +5 +��� ��� ?�5 ����� +�5 +������� 4� ����������� �8������������� �������� ������ 8�� ����������� �� ��������� �� � �

��

Page 318: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

����� ��������� �� � � �������� �� �������� ���������� ������� ������ ."!#.(�% &3'3!�

�B���5 �����65 6���� ?5 �K�� �� +5 +��� ��� ?�5 ����� +�5 +������� 4� ����������� �� ����� �����0��� �� ���,�� ������� �8������������� ���� �* ���������� ������������� �� � � �;������������ ������� ������� ������ . "!#.(�%!--'!-&�

�B���5 �����65 6���� ?5 �K�� �� +5 +��� ��� ?�5 ����� +�5 +������� 45����0�� ������� ������ # "!#..�% 2('&/�

�B���5 �����65 �K�� �� +5 1������� =� ���������� �8������������� ��������� ������ 8�� ����������� �� ��������� ����� ���+*����� ������� ������# "!#..�% 3('3#�

�B���5 �����65 �K�� �� +� ��,��8� 7 � ������� ����� �� �8������������� ��������� ������ 8�� ����������� �� ���������� ������� ������ # "!#..�%32!'3&/�

�B���5 �����65 1������� =5 ����0�5 +��� ��� ?�5 ����� +�� 7��������������������� ���� ���������� ,���������* �� �8������������� ���*������� ��������� ������� ������ !- "!##!% /32'/3.�

�B���� ��� ����������� �8������������� �������� ������ �� �������� ���������������� �� ���������� �� =���� ?5 �� =��� ������*� � 4��������* ��������0� �������� ���� ���5 +�� )����5 =�� "!##&% -2!'-&-�

�B���5 ����� �5 E��������=5 ��� �5 6����6� 78������������� ���*���*������� ��� �������� ������ 8�� ����������� �� ��������� �� � � ����� ���������� "��)���%� 7 � ����� �� � � ��� ��� � � ������,���* �� ,������� ���� ���������� �*������ ������� ������ !/ "!##3% !$(#'!$./�

�B���5 E�������� =5 ����� �5 =�������5 )��� ?�?5 ���G�� ?�?� @��* ��0���������������� �� ��������� ��� �8������������� �������� ������ �� ������������ ������� ��������� ������� ������ !. "!##(% 2-.'22(�

�B���5 ����� �5 E��������=5 �������5 6���� 6� -�) �������� ������ 8�� ����������� �� ��������� ����� �� �� ����������� �������� �*����� 4���+������ 9�8� ! "!##.% &'/�

�B���5 ����� �5 E��������=5 6���� 6� 78������������� �������� ������ ���������� �� �� ����������� �� &'!- ��������� ������� ������ !# "!##.%!3!/'!3!#�

�B���5 E�������� =5 ����� �5 6���� 6� ������ ��,��������� �� 6��� �� ���������� �� �� �� !-5 ������ ���������� ��������� ��� ���������� ����������� ������� ������ -$ "!###% (!-'(!(�

�B���5 E�������� =5 ����� �5 �������5 +� �����5 6��������� �5 6���� 6�7 � ������� ����� �� �8������������� �������� ������ 8�� ����������� ������������ ������� ������ -! "-$$$% !$2('!$32�

�B���5 6����6� 78������������� �������� ������ 8�� ����������� �� ����������� � ���������75 �� ������� ������� � 78������������� ��� ��������� ������ ��� �������������� ��� ���� +�������5 ������ ���������� 9�8 I��0"-$$$% !$('!-/�

�*���� 75 �*���� � ����� �� L����0���L �� � � �����,��� ��8�� �� ������ �����*���8������������� ��� �������� ������� ���� ���� �� !/3 "!#.(% !33'!/$�

�*�� +5 ���� �5 ������ +�5 7�����0 15 ���� ��5 ����������� J���������,� �����*��� �� ������> ������� ��>����� ����� ������������� �������* ����� 9����� ������� !( "!###% ##&'###�

����� +�5 +��� ��� ?�5 9��� ?@5 ������95 ��� ���5 ����)5 H � <<5 6������)5 ����)�5 6����� ?7� ��� �* �����,��� �8������������� ���� ��� ���������;�������� ��� 9��� ���� +�� :+� .. "!##!% 3($#'3(!2�

�������� 9�8 ������� �� ���������,� ��� ����*����� ���������� ��������8 ������������ ������� ������� ������ 2 "!#.-% -23'-&2�

���

Page 319: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

����* 5 +�������5 +���5 ��������� 45 1��������������=5 =�����������+����� 4� ��������������� �����*� ���� �������� "��,���� �����% �� ������ ������*� ���� ��� ����� ���� ���� �� -&$ "!##/% !3$'!3-�

���������� ��5 ������� =� =������������ ����� ������� ����*��� �� �������� �� � ����,��� �*����� ? = �������� &-# "!#..% 2&3'23.�

���,�*)?� J���������,� ������� �� � � �����>��������� ����� ���������� ���������������* �� ������> ��������� ������� ����� =����� ���� +������� ("!##2% /!&'/!#�

��� �����15 ��������75 �����*�� ��5 I�� ����5 +������� �� �����,����� �� ��� ���������� �� ��8���������� 8��� � ���*�������� �* �������� ������� �� ������ �����*� �����������*���*������ ���� ���� ���� �� !-# "!#.2%!#-'!##�

������ 6?5 ������� 7�5 +����� ?75 6��� +=5 ������*=5 6�������=� ������*����������� ���� �8������������� ���� �* ��������� ���� ����� ��� �� ���������������� �� ������� ��;����� ���������� ��� 9��� ���� +�� :+� #$ "!##2%3$!!'3$!3�

������� ��5 �����*�5 �����*��5 6��� �?5 ��*���6�5 6������� �4 �����,�� ������� ���������* �� �8������������� �������� ������ ����� ������*� � ���� ��� �� �������� ������ ������� ������ !# "!##.% .&3'.3!�

������� �5 ��� ���� �� � ������� ����� �� �������� ����*���� +����� ����������������� ,�� ���������������� ��������*���� 8�� ����������� ���������� �������� ������ -! "-$$$% 2/2#'2/&.�

������� �5 ���,����5 �������5 E��,���� 5 ���=��� * ?5 �������+5 ��� ����� �� ��������� ��� ��0*������ �� �������� �� ����������� �� �8���������������� ����*���� 8 *5 8 ��5 ��� �8M ������� ������ -- "-$$!% -$&/'-$3(�

���0�� �,�� ?5 )�����0�� +��������� ��� �� ��� ���,�� �������� �� �������� �����*���*������ ��� � � ��� ����� �� ���,�� ��������� ������� ������ /"!#.3% !$2'!!-�

��I5 ��� ��� �5 ��������5 ����� �)5 ����� 45 �����+45 7�*��� 5 ������� �5��������� �5 I��� 45 6������=5 )�������� 5 +� ������� +5 + �8����� ?5 @��57������ ?5 �����������5 ���0�� �5 ��������=5 )�8��)5 4��H5 ��� ���� ��,��5 6����� ��5 +�����5 9�������5 ���������� �?5 �������� ?�5 ?� ������ 4 5 ������ 4�5 ?���������5 ������G��0�,�5 9������ 5 =��8���� ?5������@5 +N������ �)5 ���� ����� ?5 �������0��� �=5 �������15 �8���75����� �15 )���� ��)5 �����5 ����� =6@5 1���*�)5 7*����� +*���������������������� �� ������� ������>�� �� ������������ ��������� �* ���� ������������*� 9����� &!3 "-$$-% !.$'!.2�

������5 ������ 5 9�,��7?5 �����)?=5 +������75 4���� � 7� � ����)9� ������� ���*�� ��������� �� � � � ���� )��JD���) �������� ��E ?!. "!###% 2./.'2.(3�

��,���+5 @�� ���5 ,�� E������ ?� 7�8���� �� ����������� �8���������������� �������� ������ ����� ��������� ����� ������� ������ -! "-$$$%-/!('-/-!�

��,���+5 ������� �5 @�� ���5 �K����)5 ������� �=5 ,�� E������ ?� ��������,��8������������� ��� �������� ������ �� ��0����� �� ����� �����8 ����� ������������ �� ���������� ��������� - "-$$-% !-('!2&�

��� ���?5 1������� +5 �;���95 ��,��� 15 ��;���� =5 +��� �� ?=5 ?�����57����� ?)5 �G���;,��� �5 ��� ��������)1� ����� ������� ���� �� ������ �*�������;�������� ������� ������ !2 "!##-% ($('(!&�

����)15 I���� ?� 5 + �����8��� ?5 6������ +5 ����� =�� ������ ��;��������* ������ ���� �����������*� ��� 9��� ���� +�� :+� .2 "!#./% /-22'/-2(�

���

Page 320: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

���0��� 6?5 7���0�=�� +������������� �� ����� �������� �������� ��� ����*���� �* �8������������� ��� �������� ������� ���� *������* .! "!#./%.$-'.$/�

�����5 6����5 = ��� ��* ?+5 ����0����0 65 ����� +�9� �������� ����*����� 9�)� ����������� ����� ������� ���������� ������>��� 9����� 9������� 2"-$$$% //!'//#�

��� �5 ��* �5 ����� ����5 +���0�8�0��5 ���� �� 5 4���� � � ����������������� ������� ��������� �� ������������*��������� ������� ������>�� �� ����������� �* ������� ����������� �� ? ���� �� !#$ "!##$% 2!!'2!.�

�� 75 = ���75 E��8��5 I�� ����5 ��������5 +�0�0� I� � ������ ����,� �8�� *���� ����*��� �*���� �� �>����� � � *���� ������� ������������ ��� 9������� +�� :+� #. "-$$!% &3/#'&3(&�

������� 75 =��������� 95 ���� ����5 9�,��7?5 ��������� 5 +� ��,���������������� ��� ������� �� ������--$5 � ��,�� �������� ��������� �� �������0�����)� ? ���� = �� -(3 "-$$$% &$$&.'&$$3/�

?���� 5 J��������5 =������� ��� �������� ������ �������������� �* ����������� ��������������� ���� �� ���� *� ��� =����� !#3 "!##2% 3.'/&�

?���� 5 J��������5 =������� 5 �������� ������ �������������� �� )9� ���������� �* ������� ���� ��������������� ������ +�� 2 "!##&% !2&('!23$�

?����� E95 ������G��0�,�5 ������ )���*�� �>�������� �����,�� ����������* ���������� ����� �� �* �����>�������� ����� ����������D���������� ������� ���������� =����� ���� +������� !$ "!##/% !2(!'!2(.�

?� �����+5 ������ +�5 ��������� =���������������� ������������� �� "� O�%O ���� �� ��������� +��� � ��� �������� ��;����� ���� �� ? ���� +��������� ��� ./ "!#..% !2( '!3&�

?� ����� �15 ��0��� +=5 ���0�� )4� ������������� * ����� ������� � ��� ����� �����*� ������� ������ !! "!##$% 233'2/$�

?���� �� ��5 I���� ?�2��5 7 � ;��������� ��� ���� ���� ������������� � ������������� �� � ��� � �������� ���� ���� �� -&& "!##(% !'!3�

������5 ������0���1� 4���� ���������� �� �������� 8�� ��������� �������>������� !$$$$ �������� ���� = �� /$ "!#..% --##'-2$!�

���������5 = ������5 ����� )5 +������� �� ���������� ����* ��� ����*���>�������� �� �����>�������� ����� ����������D��������������������� ������������ � ���� �����������*� ��� � ��� ����������M ����� =����� ���� +�������� !$ "!##/% !!##'!-$.�

���������5 ����� )5 +��������� +�;������� �� �������� �� � ������������ ����� ������������� �,�������� �� ����������� ����* �����8��� �����>�������������� ���������� ���������� "��)4%� �� ? ���� +������� �� ��� !2!"!##&% 233'2.3�

������� �5 4�������� 15 ��*���5 ��� ������ �������������� �� ��������� +������������� 64 I�@=� 6��� ��� "!###%�

����� 75 I����;���� �+5 4���*�� � ��� �� ��� �� �������,��* ���������;������� ����� ���������� ����* �����>��������� ����� ���������� �������������� �����������*� ��� 9��� ���� +�� :+� #/ "!###% (!2!'(!2/�

����� 75 4���*�5 1���� ��5 ����� ��5 +��I5 ����� �)5 �����* ��� 7������ ���� �����������* ��� ��� ��� ��������,� ������� �������������� �� ����������� ������� � ������� ������ -! "-$$$% --3-'--/3�

����� 75 4���*�5 I����;���� �+� )���,��������� ���������� �� ���������� ����,� ��;������� �� �*��������������� ��*���� �������� ����� ����������� ����*�����>��������� ����� �����������D���������� ���� �����������*� ����� =������ ���� +������� !& "-$$$�% -2&.'-23/�

���

Page 321: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

������5 ���������=5 9�8����5 4�,��� 75 �����)5 1������� 5 6��������&( �� � �������� ��� �#(��������� �������� ������� 9����� 2.. "!##(%(3'(.�

�������5 4B������5 ���������5 +� ������ 5 +� ��0�� �5 6�����������5 ��������6�� ������� � ������ ��� ���������,� ��;��� 8���� ������ �������� ������� ����� ���*������� ��������� ����� ������� ������ !2 "!##-% (2'(3�

����� ?5 ������:� 78������������� �������� ������ �� ��������� �� ������� ��������� ��� ������������ ��� � ���������� ����*��� �� � � ������� ������� ������!/ "!##3% !$2&'!$3#�

���������5 9��� ��� 5 �� ��0�9�������5 ������ +5 �������4������5 ?�0������ 45 ����� ?5 ���������0�*� 5 ����� �����������5 ���45 ���������� ������>�������� ����� ����������D���������� ���� �����������* ������ ������������ ��� ��;��� ��� ,������ ������� ��� ������� ����*���� ? ���� +������� 2-"!##(% 3#2'/$!�

4��0� @@5 ����8����5 �����������4� ������ ���� �������� �����>�������������� ����������D���������� ���� �����������*� ���� = �� (- "-$$$%/3-'/3(�

4P���� :�� =���,��� �� ���������� �������� ������ � � �������* �� � � ��� ����������� ��� 7&� 9����� --( "!#($% /.$'/.3�

4����� �5 ������ =��� ������* ��� � � ������ ���G���� ' � ��������� ��������* ��� � ������������ ������������� ������>�� ����� ���� �����������*�7����� =��� ���� ( "!##(% !2#'!&-�

4������5 �B���)5 ?����,���� ?�15 1��������0���� ����� �� ������� ��������������� ��� ���*������ ������������� �� � � ���������� �� ������� ����� ���������� �* �8������������� ��� �������� ������� ������� ������ !. "!##(%-$.3'-$#$�

4������5 �B���)� +��������� �� ���� ����*���� 0����* ����� �� �����8����� �� ������� 4��� +������ 9�8� 2 "!###% /'.�

4������5 7�0Q�� �5 ,��� +5 ������ 5 4� � ��65 6���5 �5 ���*=5 1���������0���� 78������������� ��� �� � � �������� �� ����� ���� ����������� ������� ������ -! "-$$$% &!!'&-#�

4� �5 +�8��� �=5 ��������� 4 5 ����� +5 ������0�� )? ��� 1�� �� �?A = ������� ����,��� �� ������*� �������� ��� ������� ��������������� ���� = �� (2"-$$!% 32#3'3&$-�

4����5 5 ����� ��� )����������� ������* �� ��0��*���� ��������� �9� �*����� �� � � ���*������ � ��� ��������� +������ -3( "!##-% #/('#(!�

4�������5 ���R��5 S���B� ?5 =�������:5 ����� 75 �������� ?45 ��������5I����;���� +� 6����������� � ������* ��� �����,�� ����� ���� ��;������� �*����,��������� ����������� ����* "�+)% ����� ���� ��4)�7�1 8�� � ;��������� ����� ����������� ���������� �+�+ ���������� �� ���� �����������*��� ������ ������5 = �����5 :+ "-$$!%�

4��0 �?5 =�����0 5 I���� ?� � � �������* ��� � � �������������� �� ����������������� �� ����������� ������� ����������� �� � ���� ����������� ��������� �� ?���� +������� �� ��� !/$ "!##(% 2$2'2!/�

4��0 �?5 ��������5 = ��� ��� =�������� � � ��������� ��� �����,�� ����������� �� �������� ������� �� � � ������ �� �� ���� �� ���� ��!-� ������� ������� !. "!##(% !-3#'!2!2�

4��0 �?� �� -�) ������� ����*��� ��������� ��� ��� �� ��������� ������*!!-� ������ ����5 7���8�5 9? "!###%�

4��0 �?5 �� ?5 +� ����� )�5 =�����0 5 �����?5 ������ )�5 ���,�0 ��5 I����?� � )����� ����*��� �� ������� ������>�� ����� ���� �����������*� 9����������� !( "!###% /(/'/.-�

���

Page 322: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

4������5 ����� ���0*�5 �������0��5 ��65 +������� ��� � ������ ;����������D������������ � ���� ������������ 8�� � �����>��������� ����� ����������D���������� ������� ������ ��� ������������ ����� =����� ���� +�������!& "-$$$% !$&('!$3(�

4�����5 ?95 ��*5 ?65 �����*5 7I ��� =��0�5 ��5 �G������ �� ���� ���� � ;���������� ��� ���� ���� ������������� �� ? ���� +������� �� ��� .. "!#.#%#('!!!�

�����5 �NG���5 ���������� � :�� �� ���� ������������� ��������� 8��� ������������ �� �������* �������� �� ��;����� ���������� ���� ���� +�������-- "!##2% 22.'2&3�

�����5 6����� ������������� �������������� �� �������� �� ��;����� ����������* ������� ��;����� ����� ���� = �� // "!##&% &2#$'&2##�

������ � � ������ �� ����������� ���� ������ ������� ��;����� ����5 �>�����������;����� ���� ��� ���������� 7����� ���� +�� -! "!##/% &#&'&#3�

������ + 5 + �����8��� ?5 ����)15 ����� ?�A +����������� �+ ��� �+D�+������� ��;������� ����� ������4= ������ + ������� ��������� ��� �*�������� ���� �����������*� ���� = �� (- "-$$$% &-//'&-(&�

�������5 ������ ������ ������������ ��� ������������� �* 7�������*�� ��� ���5�������5 ��� ��� ���� ��������� ��� ����������� �������� ��� �8���������������� �������� ������� ���� ���� �� -(2 "!###% 2!2'2!3�

������ 9�5 +��� )�5 =������ ��5 1�� ���� ?5 �����8� 4 5 +����,��=�5�����������45 ������ 4�� ���������� �� �������� �8������������� ����������� ������ ��� ���� ������������� �������������� �� �*��0��������������������� �� � �!.$ ���,���� ��������� ������ ������� ������ !. "!##(%&$#'&!(�

��=�����0�45 +� ����� )�5 �����+5 I����5 ������)5 )�����)5 I���� ?�� )����� ����*��� ��� �������������� �� �������� �� ��>����� �* 4=��+D�+��� �������� ����� ��� �� � � ��8 ��������� ��,��� ���� = �� /# "!##(%(/('((/�

��1������ �)5 7��������)1� =�����������-3- ������ ���������� ���� ������������*� +������ !#! "!#(/% #-$'#-3�

�������,��* ?5 ���08���)� 7 � �����������* �� ������� ������� ��� �������������� �� �,������� �* �8������������� ���*���*���������� �������� ��������� �����>� ���� � ���������� *� ���� ? ���� �� &! "!#(&% !.!'!#$�

����� �����0* �15 =������� ?�5 ����8����5 1����0 ��5 ?� ��� 5 @����� �45�����������4� 7 � � ������������� �� ������� ����������������� ����������������� � �� ����������� ��4)�7E1D7E1 ������ ���� ����������������� = �� (- "-$$$% 33-'33.�

���������0�*� E�5 + �,� ��0���5 = ����� �,�� @5 )�����, �15 ����� ���0�, �� ����������* ���������� ������������ � ���� �����������* �� �������� ������*� ���� = �� // "!##&% ##'!$(�

���0 ��5 )�,*�5 =������� ?+� 7 � ����*��� �� ������,������ ��������� ������ �*�����>��������� ����� ���������� ���� �����������*� ���� �� ���� *� ���=����� !(( "!##!% /&&'/3!�

�����*�� 78������������� �������� ������ �� �������� �������� ���������������� �� ���������� ���� ���� �� -.$ "-$$$% !'!$�

������ �45 ���� ?+5 ���� � 5 +������ �?� +��*���*��� *������ �� ������ ���*����*������ ���� ��� �� ���� ��������� �� �������� ���������* ��������� ��������� ������ ���� ������������� ��� �� ��� �������*��� �*����������������� ��������� ������� ������ !( "!##/% #$('#!(�

������ ��5 �>���75 )��� �5 4��� ���� ?5 �����5 ������� �+5 ��*�� ?5 ����������� ��� �������,��* ������������*�����,���� ������������� ������ ����

���

Page 323: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

�����������* �� � ��,�� ;���������D��� ������������������� ������������ ����� ������������� ����� =����� ���� +������� !$ "!##/% ..#'.#/�

���� ��� �5 J������� �5 ?���� � J����������� ��� ����������� �� ��,���;������� �� �������� �* �������� 9��������� ��������� �� �������� 8�� �������������� ��������� �����*� ���� = �� (- "-$$$% &$&('&$3(�

9��������5 �����5 ���������� ?5 =��,�� =5 6������5 �G� 5 +������ ?54������5 ������ ���� �����������* ��� +7�������� ����� ��� ����8�� �������������� �� � � ������������� ����������� ������>� 9����� ����� -$"!##.% &/'3$�

9�� ��� @5 �����95 7���� ) ��� � ����6� ����,�� �������� �� �������� �����*���*������ ���� ��������� ����������� �������� ���� 8�� ����� ���0����� ���������� �������,��* ����� =�������� ��������� ���� ��-3$ ��� ��-3$� �������� ������ # "!#..% -33'-/-�

ET1������ �� ��� ����������� �8������������� �������� ������ �� ��������� ?���� = �� -3$ "!#(3% &$$('&$-!�

ET1������ H5 ���������5 ET1������ �� ��� ���������� �8��������������������� ������ �� ����� �� 8��� �� ������ ��������� =��� !- "!#((% !!22'!!&-�

E��I5 ������5 =���� 1�5 =�8����)5 = ��� �7� �������� ;����������� �� �������� �>�������� ��� ���� �������� � ��� ��*������� ��� 9�� ���� +�� :+� #/"!###% /3#!'/3#/�

E ������ +5 +� ��� =5 ���0���� ��0����� �������� �� ������� ������� ����� �������8���� � �8������������� ��0����� ������ ���� ������� ������ -! "-$$$%2($!'2($#�

����*�5 ������ ��������� �� ����* ����� ��� �������� 9����� &$3 "-$$$%.2('.&/�

�����)?=5 �NG���5 ������* �?� ����� �������������� �� �������� �* ����������� ��������������� =��� ���� 2 "!##2% 2-('22-�

�����)?=5 �� ���)5 ������ �15 ��������?�����5 ?�����*65 ������* �?�= ������*5 ���� �����������* ��� ������������ ���������� ,������� ����� ��� ��� � � ����� �������������� ��� ������� �� �������� ��������� ����� +����������* �� � � ���������� +�������� �����������45 =��� +�5 ���"!##/% !23'!3$�

�����)?=5 �� ���)5 ������ �15 ?�����*65 +����� =6� ������ ���� ��������������� �� � ���� ��� � � ����� �������������� ��� ������� �� �������� ���������� ������� 5 ������ �H5 ��� ��� ��� �� ������� ��������� ����*���� ���8����������D����� ����� ���5 )������ � "!##3% !/!'!(2�

�����5 6����5 ����� +5 �������5 ����0����05 ��� =5 9������=� � ���������������� ��� � � ����* �� +��� ����*��� ����,����� ���� 8��� ����������� �������� ������ -! "-$$$% 22#/'2&!$�

������ ?5 ������������ ���������� �� 0������ ����������� ���� -������������ ����� ���� ���� �� -.# "-$$!% #.'##�

����7���� 4� ��� � ���� ��� ���������8��� ��������� ������������ �� �������� �>�������� ����� ���� �����������*� ? �� = �� +�� !-! "!###%(#&#'(#3$�

������� 95 1��� �5 ������ �?� 1��� ��� �������,� ������� �������� 8�� ���������� ���� @����� !( �����8��� ����������� �������� �� ������� ��� ��*�� ���������� ��� ����������� �� ���������� ������� ������ # "!#..% &..'&#/�

�������� +)5 ����������� ���� ������������� ������� �� ��� � � ���������������� ������������� ��������� ������� ������ !/ "!##3% !(#!'!.!&�

�����6� )�������� �������� �� ���*���*������ ���� ��� �� ����������� ����������� � ���������� ���� ������� ��;����� �� ��������� ��������� +�5)����?5 ��� ���� +��������� ����� ��� 4��� "-$$!% /3'./�

���

Page 324: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

��������� +�5 6��0�����5 ��� �������� )�5 )����?� ������� ����*�������� ������� � �������������� �� ���������� ��������� 7����� =��� ���� ( "!##(%!/.'!(2�

��0��� )95 �����)?=5 =����* )�5 =������� ?+� ���������*������ ������� ��������������� �* ����� ��� ��;����� ��������� ����� ���� �����������* ����� ������� ������ -$ "!###% 233!'23/(�

�����:5 H��� ���65 +� ���5 ����� � � �����>��������� ����� ���������������������� � ���� �����������*� � ��8����� ���� ��� � � ���� ��� ��;���������*��� �� ������� ��� �������� ����������������� 9������ ����� ��� -! "!##2%2!#!'2!#/�

������ ?1� ��*��������� ����������8��� � ���������� ����� ������ �����*� �������� ' ���� �������� �������� ������� ���������� �� 7������*���� ��� 7���������� ������ �*����� ���� ���� �� !!& "!#.!% !2!'!2#�

��� �5 ,�� ��� ���� ��5 ���� �=?5 �B���� ������� ,���������* �� ������ ������������ ����*��� �* ���� ��� �8������������� �������� ������ 8�� ������������ �� ���������� ������� ������ !/ "!##3% !2!-'!2!/�

J�� ?5 ������� =?5 H ���<� )� ��,� ������� ��;������� �� �� ��� ���� ���������������� 8�� !.E ���������� ����� =����� ���� +������� !- "!##.%-$#'-!/�

J�� ?5 +����,����� �??�5 = ��� �7� � ��������� ��� ���� ���� ������������ ���� � ����*��� �� �������� �* �����>��������� ����� ����������D����������� ����= �� /. "!##/% !(.&'!(#!�

���������75 �������� 5 =���U95 ��� ���� �� ������������������5 � �����* ������������ 8�� �����,�� �������������� ����������� ����������� ��� ������������������� ����� ���������� ����������� ���� ���� �� !.3 "!##$% #&'!$-�

���������7� � ���������� ���8��� ��8 ���0������ ���,�� �������� ��� ���,��������� ������� ������� ������� ������ !2 "!##-% &-#'&2#�

���������75 @������ =5 4�8����� ??� +����� ����������� �* ������ �� *������������,�� � � ���������� �� �8������������� �������� ������ 8�� ������������� ��������� �� � � ����� ���������� ������� ������ !3 "!##&% !33-'!33.�

���������75 @������� 45 ����* =5 4�8����� ??� +��,�� �������� �� �������� �� ���*����*������ ����� � ������� �,��,��8� =��� ��� ���� &$ "!##&% 3('(3�

���������7� :�� �� � ������ �� �������� � � ���������* �� �������� �������� ���8������������� �������� ������� ������� ������ !# "!##.% (3.'(/$�

���������7� +��,�� �������� �� -�) �������� ������ ����� ��� ��� ��� ���� !!-"!###% -#('2$3�

���������75 �������0 75 �������5 4�� � +5 ����������5 4������ ?5 �������������=� ����*��� �� �������� �������� �* �8������������� �������� �������=��������� �� � � �������� �>������� ���� ������ �� ��������� ������������������� ��*� ���*�� � ����� ������� ������ -$ "!###% 2/$2'2/!$�

���������75 = �,������� +������������� �� �������� �� �8������������� ��������� ������� � ���������75 �� ������� ������� � 78������������� ��� ��������� ������ ��� �������������� ��� ���� +�������5 ������ ���������� 9�8 I��0"-$$$% #'-#�

���������75 = ������ +� )�������� �� �������� �� �8������������� ����� ����������75 �� ������� ������� � 78������������� ��� �������� ������ ����������������� ��� ���� +�������5 ������ ���������� 9�8 I��0 "-$$$%!$('!-/�

���������75 +���� ?��5 4�� � +5 ,�� )����������5 4������ ?� � ���������� ����8��� +*��� ���* ��� ��� ����� ���� "��� �� ����� ������ �����������% ������������� ������ ��� ������� ��������� �� ����� ��������� ! "-$$!% /##'($&�

���

Page 325: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

������� 4+� J������*��� ������� �� -�)�� �������������� �������� � 4��0 �?�" �% -�) ������� ����*��� ��������� ��� ��� �� ��������� ������* !!-������� ����5 7���8�5 9? "!###% ##'!$2�

������ ?75 :������ �5 ����� �5 �B���5 +� �B�����5 ���������5 1���0��7�8���� � �8������������� �������� ��� ����������� ��������� �������� ������ -! "-$$$% 2(/3'2(.$�

��� ���� �5 7�����5 �������� � ����� �� -����������� ���� �� �� ����������� ����������� ��������� ? ���� �� ���� *� ��� ��� / "!#.-% -!#'--(

��� ���� �� �� 6��0 7+5 �� ��������� ���������� ��������� � ���*5 ��� �������* ��� ������������� ���,��� ���������� ����5 ��������� "!#.2%�

��� ���� �5 ����� =� ���������� �� ��������� ��� ����������� ��������� � ����������,� ����������� �� �� �* ������� ����� ? ���� �� ���� *� ��� ��� #"!#.&% !$2'!!#�

��� ���� �� �� ��������5 ,�� ����������� �� �� ���������� �� ����������� � ���* ��� ��� ������*� ���,���5 ��������� "!##$%�

������������5 ��� ���� �� �������� ������� ����*��� �* ����������� ���������� ����������� �� ���������� ������� ������ / "!#.3% &!#'&--�

���������� ��� 1� ���� ?5 ������� ��� � ������ ������������ ��� ��;��������� �� ���� ������� �� ��������� ������ ���� +������� !! "!#.&% /$!�

���������� ?5 =����,����� ?5 ��������� ?=5 1������� ����� ��������� �� ����������� �������� ��;����� ����*��� ����� ���� �� �8������������� �������� ����������� ���� �� -$2 "!##-% !(2'!(#�

����������5 �G���;,��� �5 �������� @� � ������ ��� �� ��� � ������ ��������� ���������� ��� �������� ������� �� ������ �?5 ���������)� �� ��������������� ��� ������ �� �������6� �� ���*���5 ������ "!#((% !/3'!(!�

��� �)65 ����� H�5 +��������95 7 ���0 6����� ?� = ���� ����,��������� ���������� ��� ����*��� �* ���� �����������*� ���� +������� ��,��8� !( "!##.%-33'-(&�

+������ ��+� K�� 15 ����B� ?5 E����� 5 0�����5 �����8��� ?5 �G���;,��� �� ����������� )�*+���� ����������� ��� �� �������� �� ��������* �8�������������� ��� �������� ������� ������� ������ -! "-$$$% 2/&#'2/3/�

+��� �� ?�=5 ����� �)5 �����E5 ��;���� =5 ��,��� 15 ������ �5 ��� ���������)1� ����� +6++�-)�� ��������� ������� ������ !/ "!##3%!!2!'!!3!�

+��� �� ?�=5 �����@5 �������5 ��,��� 15 7������ 45 ������*���5 6��0�����5��� ��������)1� ����,�� ��� ���������� ������ ������ ����������� ��������8������ �� ��* ����������� �� ���������� ������� ������ !. "!##(%2-&'2-(�

+������ @5 �����*�5 ���������7� �������� �������� ��� ����������� :������ ����������M ������� ������ -! "-$$$% !$3&'!$($�

+� P�����5 ,�� ?���8�� 7������������� �����*� �����������*���*������ ����������� ������ ��� � � ���������� �� �������� �� � � ����� ���� ! �� !$$ 0)������ ���� �� !// "!#.(% 2/.'2(#�

+� ���� ��� 78������������� ��� ����*��� �� ������� ��������� = ���������������� ������ ��� �>������ ����������� ��������� ? ���� = �� -3$ "!#(3%32(3'32.3�

+� �������5 ��0����5 �������*�� ) ��� 4� ��� 6)A ����*��� �� �������� ��� ��*������ �* � ����������� �� �������� ��������� ��� ������� ���� ���������������*� ���� = �� (2 "-$$!% !($'!(/�

+� �������5 ?�����G�8�0� 5 4� ��� 6)� �������������*��� ������������� ��!.E ���� ������� ��������� ��� ��� ����������� ��� ������� ��;������� �* ������������* ��� �����>��������� ����� ����������D���������� ���� ������������*� ������� ������ !( "!##/% #&3'#32�

���

Page 326: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

+�� � + ��� = ��� �7� ������������ �� �*������ �������� �* ��0*������� � ���� ��������� ������� ��� ������� ��������������� ���� = �� ($ "!##.% 3!3$'3!3.�

+ �,� ��0��5 6����5 @���E5 ������ ���� ������������� ��;������� ���������� ���,���������� ���*���*������ ����� ���� = �� /. "!##/�% .3$'.3.�

+ �,� ��0��5 ?����� E95 ������G��0�,�5 +�������� 15 6����5 @���E5 ����������5 + �,� ��0��5 ���� �����5 ������ 4��0��� ������ ��� ��������� �* ���� �����������*� ����� ����� �������������� �� *���� �������� �����8� ����������� ����� ��� 9��� ���� +�� :+� #2 "!##/�% !&&$'!&&3�

+ �,� ��0��5 = ���� �,�� @5 ��65 +������� ��5 7 ������5 6����5������ ����� V�� ��,�T ������� ��;������� �* � ����������� �� ����������������*5 �������� ��������� ��� � ;���������D������������ � ���� ����������������� =����� ���� +������� !! "!##(% !$!3'!$-&�

+ �,� ��0��5 4������5 + �,� ��0��5 ��65 +������� ��� ��4) ;���������� ������������ � ���� �����������*� � ��8����� ���� ��� ��������� ������� ����� = �� (- "-$$$% -!2-'-!&!�

+ � +)�5 ������� � 5 =��� +�5 ���� )�5 4��� 5 ��4������* 16A ��� ���������D� ��� �������� ������� �* �������� ������� ������������ ���� ������������*� ���� = �� (2 "-$$!% !#'--�

+����� 5 ������?5 ��,���� �5 ���� ����5 @�����0���0 �,�5 4��� �5 +����,��@� 7�������� �� �������������� �� � � *���� ,������ �� �������� �* +��!�5 ��*������� ������ �� � � ($ 0)� ������ ������� �����*� ? ���� = �� -(3 "-$$$%2&$3&'2&$3#�

+�� �5 �B����� 5 6���������� �5 ��� ���� �� ���������� �� -�3'!! ���������� ��� �8������������� �������� ������ ������� ������ !2 "!##-% -!$'-!&�

+�� �5 ����� ?5 +� �������5 ���������7� � ��8 ���,�� �������� ��������� ������������ ��� �����>��������� ����� ����������D��������������� �� ���� � ����*���� �� �������� ����� �8������������� �������� ������� ��������� ! "-$$!%.23'.&$�

+0������ ?5 =������� ?5 ������5 ��*�� ?5 ���� 5 4��������� ?5 ������� �A ���������� �� ��,� ������� ��;������� ����� J�7�� +��+D�+ ��� ����8��� ��������������� �� � � ����� ���� &(� �+�+ ���������� ���� �����������* ��������� ������5 )����� "!###%�

+���0��5 H ���5 ����������� J���������,� ������� ��������� ����� �8������������� ��� �������� ������5 ������� ����� �������* ��� �������� ��� ���������������*� ��� =��� ��������� ! "-$$-% !#'-#�

+��������5 4������0��� ��15 ������� +5 = ������5 ���������5 ?�����*65��������?�����5 �����)?=� ������ ��;������� �� � ����� ����,���,�� �*���������� ����* ��4) ���� �����������*� �� ? ���� +������� �� ���!/#D!($ "!##(% !-('!&$�

+������� �A ���������� ����* ����*��� �� �����>��������� ����� ����������D����������� ���� �����������* �� ������������� ? ���� +������� 2- "!##(%!$!#'!$2/�

+������� �=5 �����* 5 +*0� ? 5 ��*����� 6 5 7���5 ?1?� �� ? ���� +��������� ��� /$ "!#.&% .3'#.�

+�� � �5 +�����5 ������5 ������0���1� ����*��� �� ������� ��������� �������* �����>��������� ����� ����������D���������� ���� �����������*� ���� = ��/2 "!##!% !&/2'!&//�

+���*0 75 �������:5 +��� ���*��0*� +� E��������� ������ ����������� ��� -�)�������� ������� 4��� +������ 9�8� # "-$$!% #'!-�

+����������65 )����������� 5 ��,���+5 4� ����5 ��������5 ?�����+����� ������� ��� �������� ����*���� ������� ������ !# "!##.% #$!'#$.�

+�����5 �K���� �5 � 1��������5 ���*�5 ������ = �������������� �� +7��-����� � ��8 ��� �� ��� �*������ � ��� ��*������ ����*��� �* ������ ����

���

Page 327: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

�����������*� ���������� �� � � &#� �+�+ ���������� �� ���� ������������* ��� ������ ������5 = ����� "-$$!%�

+���������� ���������0������������ �� ��*���*����� ��� ��� ��8��������� ��� �������� � ����*�� ��� �������� ����8 = �� .- "!#($% /&$�

+�������� 7�5 �������� �5 +����� @� ������������ �� +I�E E����� ���+I�E ��� ������� ��� ������� ���� ���� �� -2# "!##/% -2.'-&3�

+��������� � ��� ?����� E9A +��������� ������ ����������� ��� �� ��� ��������������������� �* �����>��������� ����� ����������D���������� ���� ������������*� ����� ��������� �� � � ����� �������� ��������� ! "-$$!% #33'#//�

+��� ��� ?�5 ����� +�5 +������� 45 6���� ?5 �����65 �B���� ��� ������������8������������� ���*���*������ ��� �������� ������ �� ����� �*����� ���*���������� :�� �� ����������� �� ��������� �� � � ����� ���������� ������� ������� . "!#.(% !/3'!(2�

+������5 ��5 �����5��5 ��� ������0���5 1� -53�)� *���>*������� ����� � ��8�����> ��� ����� ��������������������� ���� �����������*� �� ? ���� +��������� ��� !!! "!##!% .#'!$-�

+����� =65 �������� �+5 =������� ?+5 =������ ?�5 6 ����� =�5 )����?5 ������)?� ������������� �� �*�������� �������� ���� �8������������� ���� �*������� ���� ��������������� ������� ������ !/ "!##3% 2$.'2!/�

+,�������� ���������� ������������� 5 ����*��� ��� � �������������� �� ��� ��*���� �� ������� �� ���������� 7 � ������������ �;������ �� ������ ���������������� � �����* ����� ��� ��� ������� ��� ������ ������ ���� = �� +���� !3 "!#/!%2-3'2&!�

7�*����� )������������� �� 8���� ����� �� �� �������� ������ ��� � +�� 4��� �-.$"!#/&% 2.2'2#(�

7 ����������5 �� ����95 )����,�� =5 ������=5 ����������5 +������ @5 ��@�����)5 H�,*�� ��������� ��� ������� ��� � *���������� ������� �� ������� ������� ������ -$ "!###% -$!2'-$-/�

7���� 75 H���I��� <�5 ��,���5 �����)5 =�����5 ����*�� � �5 ���� 75 +���������� 7 � E��&� ��� E��3� +������� �� � � <������ ��� ���� ������ ������������ ������> ��� ������� �� E��!� ��� =��/�� ? ���� = �� -(2 "!##.%2-&-!'2-&-#�

:��� 5 ���� 45 =����*�5 ��������� 7�5 ?������+5 ���� � ?�5 4��0���)5 9����*��@5 +����,�����5 �� ��� 5 J���� �� ���� �5 4� I5 ���8���5 =���,��)5���������� 75 @�G�*���������5 I����5 ?� ������5 1����� +5 ��� ���� ?��� ������ ����,� ����*��� �� ��������������� ������������ �� ���������������������� 9����� &$2 "-$$$% /-2'/-(�

W��K�5 ������ �5 ������ ?+� )��������� ��� �������� ������� � ������ ������ �� ��� ��������� � ����� �� ������� �>������� ������� ������ !# "!##(%-$(!'-$((�

:�8��@5 ?��0���� 78������������� ���*���*������ ��� �������� ������ �� ��������� ������� 8�� � � ������� ��� ��������������� ����� �� ������������������ ����������� ��������� ������� �� � � ����������� ������� ���� ������������� � ������ � ������������ ��,���� ����� ���� �� -$# "!##2% 3('/-�

:����8������?���� +5 9��������5 = ������������ +5 H������5 6���6� ���������� �� ��� ��;������� �� �������� ����� � � ������������ �������� ��� ��;������������ ! "-$$!% //.'/.-�

@���� � ��5 ���0�����+5 )�����5 ��������0��5 = �����������5 @����0���0� �,� ?5 ��,���� �� ������� ����*��� �� � � = ���*��� ���������� ����������* ���*� ������� ������ -- "-$$!% !-$&'!--2�

@����0���0 �,� ?5 ���8�5 �*���5 @�� )���� ?5 @�� ��������� �������������� �� ���*����� ������ ����������� � ����� � ����� ��� ���� *����*��� ������ � ��� ��;������� �� �������� ;��������� �� ������� ���,�����* ���������

��

Page 328: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

�� ������ �X���*� ������� ���*���*������ ���� �� ? ���� �� !3- "!#.3%#'!#�

@������ �0�, �95 ��65 +������� ��� ���������� ������������ � ���� ������������� 8�� �� �����������* ��� ������ ��� ��� ������ �>��������� ���� = �� //"!##&% !-/'!22�

@����� �45 ?� ��� 5 ������ +�� )���*�� �>�������� �����>��������� ����� ����������� ������������ � ���� �����������*� ����� =����� ���� +������� #"!##3% !$&&'!$3$�

@���������5E� +*�� ���� ��� ����������� ������������� �� ������� ��� ��*���� ����= ��� +���� -2 "!#/#% -/32'-///�

,�� ������ )5 )��� �� +5 �������� )�5 ����������5 6���� ?)� ���� �������������� � �������������� �� �������� �>������� ���� ?��0�� 7 ���� �������������������� �������� �������� ��������� ! "-$$!% !$!$'!$-!�

@���E5 ���������� 5 ������ ����,�� ���������� ��� ,��* �� �������,��* ����4)�7E1 �� �����> �������� ���� �* ���� �,���������� ���� = �� //"!##&% 2-.!'2-.(�

@������� 45 ������95 ���������7� � ������ ������� �������������� 8�� ������������� ������������� ������� ������ !/ "!##3% -#3'-#(�

6������5 �� ��5 ���������� +� ��>�� ��� ��P������,�� 1����1��8� ��0���� ������� �� 6������5 ������� � �� ��>�� ��� ���0���� ������� �� 7�������� ����� +��������@�����5 ���������� "!#.#% --2'-/!�

6�� �����5 6������)5 I���� ?� � 4���� ����� ����*��� �� � � *���� ���������* ���������������� ������� �������������� ��� �����*� 9����� ������ ��� !#"-$$!% -&-'-&(�

6������� @=5 =���8��� +?5 =�������G�0�5 I�� ?<5 �����*��5 6��0�����5)����� �65 ������ �5 6��������45 ���� ��*�+��� � ������� 8�� ������������ ������� �� � � �������������������� ���������� ������� ������!/ "!##3% !$#$'!$#&�

6���� �5 E������� 7 � ����������* �� ��������� 8��� � �������������� �* ������*� ���� �������*���*������ ��� �������� ������� ? ���� = �� -&& "!#/.%&&$/'&&!-�

6����65 @��������� =5 �B���� ������� ������ � �������������� �� 8 ��� �������������� ���� ��������� �����,��� ��,��,�� �� ��0��T� ��� ��� ������� ������!& "!##2% .$3'.!/�

6����� 5 �� H������5 ?�,�� 5 ��� ���� �� ��� ������5 ����������� ���������� ��������� ��� ���������,� ����������� ��������� ? ���� �� ���� *� ��� ���� !& "!#.(% -#'&2�

6����� )5 1�K���:� � ��� �� ��� � � ;���������,� ����,��* �� ������� �� �������������� �� � � �������� �� ���������� ��� ������� ���� ���� �� !2. "!#.&%!&!'!&2�

6������������ ������� ������ �� �������� 64 I�@=�5 6��� ��� "-$$!%�6�����������5 �����65 6���� ?5 �B���� ��� ����������� �8������������� ��������� ������ 8�� ����������� �������� �� ����������� �� ���������� ? ���� ������ *� ��� ��� . "!#.2% 2-!'22$�

6 ����� ��5 4� 4� ��� ���������� �����>��������� ����� ���������� ���������� �� ������� ������������ � ���� ������������� ���� = �� /( "!##3% !#3$'!#3&�

6��������� �5 �������5 E��������=5 ����� �5 6����65 1�* +?5 4����� �5�B���� 7�8���� �� �� ����������� 78������������� �������� ������ �� +���� ����*��� ����,����� �������� ����� �,��������� �����8 ����������� ������������ ������� ������ -! "-$$$% -/!$'-/!/�

6���* 6= ��� ��4���� �� 7����������� � ���� ������������ 8�� �����,������������� ��, +�� ������ -/ "!#33% !!3$'!!3(�

���

Page 329: Proteomics in practice –a laboratory manual of proteome analysis

����������

6������� �=?5 + � =5 +��0���)� +��������� �� ������� �������� �* ������������������� �� ����������� �� �������� ����� ���� ���� �� -(3 "!###%-/3'-/(�

6����5 ������ ����*����� ���������� �� � � ���������������* ������� ����= �� /. "!##/% !'.�

6����5 9��������5 ������ ����� ���� ����� �� ����������� ������� ��>������� ���� = �� /. "!##/% 3-('322�

6����5 + �,� ��0��5 ���� ��,�75 ����� +5 +� 8������� 45 1����� 75 ������1�������� ��;������� �� �������� ���� ���*���*������ ���� �* �����������������* ���� �����������*� 9����� 2(# "!##/% &//'&/#�

I�� ?<5 ����* ��5 +����*=5 )����?� ����������� ������ �������� �� ����������������� �* �8������������� ��� �������� ������ ����� +I�E �*��� �������� ������ -! "-$$$% 2/3('2//3�

I�� ?<5 6��� �5 ���0�����75 ����* ��5 6�������0 ?�5 6 ����� =�5 )����?�� �������� ���,�� �������� �������� ��� ,������������ �� �������� ����������8�� �����>��������� ����� ����������D���������� ��� �����������* ��������������� �����������*� ������� ������ -! "-$$$% 2///'2/(-�

I���� ?� 5 +���� �� +5 ������� �5 ���0������� 7A ������ ���� ����� � �� �*���������,� ������� �� ������� ��������������� ���� ���� �� -!& "!##2%2#('&$.�

I���� ?� 5 �� ?�5 ��=�����0�45 +� ����� )A ��� �� �� ��������� ���������� ������� �� �������� �������� �� ����� ���� ��;������ �� � � ���������������� ���� = �� /( "!##3% !&-/'!&2/�

I���5 ��65 ���� 45 ���������� ��� ����� ������������� ����� ������� ���������� ������� !##-� ������� ������ !2 "!##-% !$$- '!$!2�

H��� 5 ��������5 E����5 ���� +5 6����E5 ������� �����5 ��������E56���� 7� )�������� �� =�����������?���� ������� �* �8������������� ��� ��������� ������ �� ������������� ������ 4����� 2&. "!##/% .&/'.&#�

H ���5 4��5 )�=���)5 = ��+5 + ��5 ����I5 1����5 ��������� ?5 ��957�*��� 5 ���0 � 5 4����� 4�5 �������� =5 H ��I� -�) ������������ �������������� ������ ��� � � �������������� �� ���� ���� ����� �;������ ���� ������� �������� ������� ���0���� ��� =��� ��������� "-$$-% �� ������

���


Recommended