Protocolo Para Verificacion de Metodo Mb

Laboratorio de Microbiología de los Alimentos(LDMA)

GUÍA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE LOS MÉTODOS DE ENSAYO

MICROBIOLÓGICOS(Verificación o Validación Secundaria)

Versión 1Revisión 01

febrero 2012

Vigencia: 15 febrero 2012

CÓDIGO VERSION Nº FECHA DE EMISION REVISION Nº FECHA DE REVISION

PVE-MA-02 1 2012/02/12 01 2012/02/06

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Tabla de Contenido

1. OBJETIVO..................................................................................................................................................3

2. ALCANCE...................................................................................................................................................3

3. POLÍTICAS Y RESPONSABILIDADES............................................................................................................3

4. ESTRATEGIAS Y LINEAMIENTOS.................................................................................................................4

5. DEFINICIONES............................................................................................................................................5

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................................................................7

7. DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD................................................................................................................8

8. MÉTODOS CUALITATIVOS.......................................................................................................................10

9. MÉTODOS CUANTITATIVOS.....................................................................................................................13

10. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN PARA LA EVALUACIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS.....20

11. ELABORACIÓN DEL PROTOCOLO.............................................................................................................20

12. EJECUCIÓN DEL PROTOCOLO..................................................................................................................21

13. ELABORACIÓN DEL INFORME DE VALIDACIÓN........................................................................................22

14. VIGENCIA.................................................................................................................................................23

ANEXO A ................................................................................................................................................................24

ANEXO B ................................................................................................................................................................25

ANEXO C ................................................................................................................................................................30

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GUÍA PARA LA EVALUACIÓN DEL DESEMPEÑO DE LOS Pág. 3 of 36MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS: Verificación (Validación Secundaria) Versión 01Código del documento: PVE-MA-02 Revisión 01

1. OBJETIVO

Establecer los lineamientos y criterios para la evaluación del desempeño de los métodos de ensayo microbiológicos normalizados (estándares o primarios)

Describir el proceso para la evaluación del desempeño de los métodos microbiológicos normalizados.

2. ALCANCE

Los criterios establecidos en esta guía deberán observarse durante la evaluación del desempeño (validación secundaria o verificación) de los métodos de ensayo microbiológicos utilizados para los análisis de alimentos y agua potable.

Este documento debe ser aplicado por el personal del Laboratorio Central de Diagnóstico Veterinario y Microbiología de Alimentos (LCDVMA), para la verificación de sus métodos de ensayos y por los coordinadores del SGC y Técnico para el proceso de evaluación de la competencia técnica del área de Microbiología de Alimentos, permitiendo establecer las no conformidades encontradas en base en los criterios establecidos en esta guía.

3. POLÍTICAS Y RESPONSABILIDADES

3.1. Políticas

3.1.1. La presente guía para verificación de los métodos de ensayos microbiológicos, establece los requerimientos mínimos que se deben considerar en el protocolo de validación correspondiente a cada tipo de muestra.

3.1.2. La aplicación de estos criterios es del tipo prospectiva.

3.1.3. La eficacia de la verificación (validación secundaria) de los métodos de ensayos microbiológicos, bajo los criterios de esta guía, está relacionada con la consistencia de las actividades del laboratorio en apego al cumplimiento de los requisitos definidos en el sistema de gestión de la calidad, conforme los establecido en la norma NTN 04 001-05, segunda revisión (ISO/IEC 17025:2005).

3.1.4. Antes de cada validación se deberá comprobar que los equipos utilizados en el método de ensayo cumplen con el calendario de mantenimiento y calibración.

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3.1.5. Cada medio de cultivo y reactivo utilizados en los ensayos, deberán ser preparados y su calidad debe ser verificada, conforme lo establecido en el método de ensayo.

3.1.6. Los microrganismos de prueba (cepas de referencia), deberán ser obtenidos de colecciones nacionales o internacionales certificadas o en su defecto, deberán ser obtenidos a partir de aislamientos en el laboratorio, siempre que estos microrganismos estén correctamente evaluados en sus identificación, pureza y viabilidad

3.2. Responsabilidades

Las diferentes responsabilidades del proceso de validación son asumidas por los siguientes comités, equipos o técnicos:

Coordinador: Jefe de Laboratorio (Consultor).

Comité de validación: Coordinador Técnico y Jefe de Área (MBA).

Equipo de validación: Jefe de Área y Analistas (2).

Responsable de validación: Jefe de Área.

Garantía de la calidad: Coordinador Técnico (Consultor).

Control de Calidad: Analista Designado.

ResponsableActividad

Coordinador Comité de validación

Equipo de validación

Responsable de validación

Garantía de Calidad

Control de Calidad

1. Elaborar el protocolo SI R

2. Revisar el protocolo R

3. Actualizar el protocolo R

4. Realizar operaciones y registrar datos

R

5. Verificar operaciones. R

6. Adjuntar certificados y gráficos.

RC RC

7. Muestreo y control Microbiológico

R

8. Preparar informe técnico. S R

9. Otorgar calificación y dictamen.

RC RC

10. Emitir certificados de validación.

RC RC RI

ABREVIATURAS: R = Responsable. RC = Responsabilidad Compartida. SI = Suministra Información. RI = Recibe Información.

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4. ESTRATEGIAS Y LINEAMIENTOS

4.1. Estrategia para la verificación de los métodos de ensayos microbiológicos

4.1.1. Para cada método de ensayo que se implemente en el laboratorio es necesario realizar la verificación (evaluación del desempeño) de tales métodos; para lo cual el laboratorio debe contar con un plan general o documento maestro de validación, donde se describa la estrategia y el proceso de verificación, para evaluar los parámetros de validación en las matrices de interés en el laboratorio.

4.1.2. Para cada método de ensayo a evaluar se deberá contar con un protocolo, en el que se deben definir los parámetros y métodos estadísticos utilizados para evaluar el desempeño del método de ensayo; así mismo se deben registrar los siguientes datos:

El método a evaluar, La estrategia particular de evaluación, Descripción de las actividades a realizadas, Descripción de los equipos y materiales Descripción de los medios y reactivos Las especificaciones y los criterios estadísticos de aceptación

4.1.3. Durante la ejecución del protocolo de evaluación se deberán documentar las actividades realizadas y los resultados obtenidos.

4.1.4. Verificar que todos los materiales, medios de cultivo y reactivos cumplen con los criterios de calidad conforme se tiene establecido en el sistema de aseguramiento de la calidad y conforme lo requiere la norma NTN 04 001-05, 2da revisión y los Criterios establecidos por la ONA para la acreditación. Antes de cada evaluación del desempeño deberá comprobarse que el equipo utilizado para cada ensayo, cumple con la vigencia y el calendario de mantenimiento y/o calibración.

4.1.5. Con base al protocolo de evaluación del desempeño se deberá verificar que se cuenta con todos los materiales, medios y reactivos, es conveniente contar con un cronograma de las actividades y los nombres de los analistas que participan en la evaluación del desempeño.

4.1.6. La preparación del inóculo debe ser realizada por un solo analista durante el desarrollo de la evaluación del desempeño del método.

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5. DEFINICIONES

Analito: componente medido por el método de análisis, puede ser un microrganismo o un grupo microbiano. Microrganismo de prueba

Blanco: Es el alimento usado como matriz, en el que se encuentra el analito de interés.

Coeficiente de Variación (CV): Es la relación entre la desviación estándar y la media, multiplicada por 100

CV = σX

×100

Evaluación del Desempeño: Es el proceso que realiza un laboratorio para demostrar que un método normalizado produce consistentemente resultados confiables en las condiciones particulares del laboratorio. Confirmación mediante la aportación de evidencias objetivas de que un método analítico validado internacionalmente cumple con su propósito en las condiciones particulares del laboratorio donde se realiza el análisis.

Exactitud relativa o recuperación: Es la aproximación entre un resultado del ensayo y el valor de referencia aceptado. Para el propósito de este protocolo, es la cantidad de microrganismos recuperado entre la cantidad de microrganismo inoculado o nivel de fortificación.

Fase estacionaria: Es el intervalo de tiempo en donde la curva de crecimiento microbiana se hace constante y antecede a la muerte microbiana. En esta etapa se puede conocer con cierta seguridad y durante un lapso corto de tiempo la concentración microbiana

Fortificación de la muestra: Inoculación de una cantidad conocida del o los microrganismos de prueba.

Incertidumbre de la medida: Parámetro asociado al resultado de una medición que caracteriza la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos al mesurando.

Intervalo de trabajo: Intervalo comprendido entre las concentraciones superior e inferior, en el cual el analito puede cuantificarse con un nivel satisfactorio de repetibilidad y recuperación.

Límite de detección: Es el número más pequeño de microrganismos en una muestra, que puede ser detectado bajo las condiciones del análisis. El límite microbiano de una prueba determina la presencia o ausencia de microrganismos; por ejemplo, ausencia de Salmonella spp, en 25 g de muestra.

Matriz: Es la muestra de alimento en la que potencialmente se encuentra el analito.

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Método normalizado: Proceso de medición robusto donde pequeñas variaciones en el procedimiento no deben producir de forma imprevista grandes variaciones en los resultados. Métodos internacionalmente aceptados y validados.

Nivel de fortificación o tamaño del inóculo: Es la cantidad conocida de microrganismos inoculados a una muestra.

Protocolo para la evaluación del desempeño: Documento que describe los pasos a seguir durante la evaluación del desempeño de un método analítico microbiológico, cuyo fundamento se encuentra descrito en el presente documento.

Repetibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analíticos individuales obtenidos por la aplicación de un mismo procedimiento analítico, a diferentes porciones de una misma matriz (muestra) en las mismas condiciones de análisis (analista, equipamiento, laboratorio) en intervalos cortos de tiempo.

Reproducibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analíticos individuales obtenidos por la aplicación de un mismo procedimiento analítico, a diferentes porciones de una misma matriz (muestra), realizadas bajo distintas condiciones de medición (personal, equipamiento, laboratorio) y en diferentes tiempos (o intervalos de tiempos más largos)

Resultado aberrante: Corresponde a cualquier valor extremo que ocurra durante la ejecución de la prueba. En menos de 1% de las pruebas esos resultados pueden ocurrir aleatoriamente en situaciones normales.

6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6.1. USP 36 – NF 21 <1223> Validation of Alternative Microbiological Methods

6.2. USP 36 – NF 21 <1225> Validation of Compendial Procedures

6.3. USP 36 – NF 21 <1227> Validation of Microbiological Recovery from Pharmaceutical Articles

6.4. Dulce Toccheto S. Curso teórico-práctico: Validación de Métodos Microbiológicos bajo un sistema de Aseguramiento de la Calidad. Santa Cruz de la Sierra, Bolivia. Proyecto TCC/Bolivia-México. 2007.

6.5. European Cooperation for Accreditation EA-04/10 – Accreditation for Microbiological Laboratories. 2002

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6.6. G. A. Leotta, I. Chinen. Validación de una técnica de PCR múltiple para la detección de Escherichia coli productor de toxina Shiga. Revista Argentina de Microbiología. Vol. 37, Nº 1. 2005

6.7. Guía d validación de Métodos Analíticos. Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos Biólogos de México, A. C. Edición 2002.

6.8. ISO 16140:2003 (E) – Microbiology of food and animal feeding stuffs – Protocol for the validation of alternative methods. First edition

6.9. ISO/TR 13843:2000 – Water Quality – Guidance on validation of microbiological methods. First edition

6.10. ISO 17994:2004 – Water Quality – Criteria for establishing equivalence between microbiological methods. First edition

6.11. The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A laboratory guide method validation and related topics. Eurachem Guide. 1988. Disponible en http://www.eurachem.org/guides/pdf/valid.pdf (febrero 2011)

6.12. Philip Feldsine, Carlos Abeyta, Wallace H. Andrews. AOAC International Methods Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Methods of Analysis. 2002. Disponible en http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-Guidelines-Appendix-X.pdf (febrero 2011)

7. DESCRIPCIÓN DE LA ACTIVIDAD

7.1. Selección y obtención de la matriz

Los criterios de selección de la matriz se deberán describir en el protocolo para la evaluación del desempeño de cada método, considerando los siguientes lineamientos:

Se deberán elegir las matrices (muestras) representativas que tenga el alcance del método a evaluar, una vez elegida, se deben hacer pruebas previas de ellas para conocer su microbiota. Se deberá contar con cantidad suficiente de muestra para hacer todos los análisis. Las matrices elegidas y su justificación deben mencionarse en el protocolo de validación.

Cuando el método analítico a ser verificado se destina al análisis de varios tipos de alimentos, la matriz se escoge con base al cuadro de categorías que aparece en la norma internacional ISO 16140:2003 (ver referencia bibliográfica en 4.8), y será aquella donde se

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http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-Guidelines-Appendix-X.pdf

http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-Guidelines-Appendix-X.pdf

http://www.eurachem.org/guides/pdf/valid.pdf


esperan las mayores dificultades para la recuperación del microrganismo de prueba con respecto de las matrices más analizadas en el laboratorio.

7.2. Preparación del inóculo

Determinación de la concentración de la cuenta bacteriana en la fase estacionaria (FE)

Este procedimiento es general y adecuado para la mayoría de los microrganismos de prueba; pueden aplicarse variaciones en este, siempre que se obtengan inóculos constantes.

a) Inocular una colonia tomada a partir de un cultivo puro del microrganismo de prueba en 9 mL de caldo BHI o cualquier otro caldo de enriquecimiento,

b) Incubar a 35 ºC ± 2 ºC, entre 22 y 24 horas (este tiempo puede ser diferente dependiendo de la experiencia en el laboratorio y del tipo de microrganismo del que se trate)

c) Transferir un mL del cultivo anterior a 90 mL de BHI

d) Incubar a 35 ºC ± 2 ºC, entre 22 y 24 horas

e) A partir del cultivo anterior hacer diluciones decimales

f) De cada una de ellas transferir, por duplicado, un mL a placas Petri y adicionar agar cuenta estándar

g) Incubar a 35 ºC ± 2 ºC, entre 18 y 24 horas

h) Realizar el conteo en cada dilución para conocer la concentración de microrganismos.

i) Registrar los resultados indicando la concentración de microrganismos en cada dilución. Estos resultados servirán de referencia para la estimación de la dilución adecuada a utilizar durante la fortificación de las muestras en la evaluación del desempeño del método de ensayo.

j) Antes de cada ensayo se deberá repetir la preparación del inóculo de forma idéntica que en la determinación de la concentración de la cuenta bacteriana en la fase estacionaria (5.3.1 a-h) y cada inóculo deberá ser verificado por vaciado en placa utilizando al menos dos cajas.

Nota 1: Con la prueba previa de fase estacionaria se fija el tiempo de incubación, el volumen necesario que lleve la concentración microbiana, para fortificar cada una de las alícuotas de acuerdo al protocolo de evaluación de desempeño del método en particular. Durante su manipulación se recomienda sumergir el recipiente que contiene la fase estacionaria (FE) en agua fría.

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Nota 2: Cuando la matriz (muestra) sea sólida, fortificar las alícuotas. Si la matriz es líquida, se puede fortificar la matriz completa o las alícuotas.

7.3. Preparación de las muestras

Registrar la muestra con la siguiente información:

Fecha y hora de muestreo Tipo de muestra Procedencia o lugar de muestreo Cantidad de muestra

Homogenizar perfectamente y separar la muestra que se utilizará para el análisis. Si la muestra es perecedera, el sobrante se debe guardar en refrigeración. Se recomienda iniciar el análisis inmediatamente.

7.4. Fortificación de la muestra

En condiciones asépticas dividir la muestra cuantitativamente, siguiendo el método de ensayo. Inocular la muestra con una concentración conocida del microrganismo de prueba.

8. MÉTODOS CUALITATIVOS

8.1. Criterios de Aceptación

Parámetro Criterios de Aceptación

Límite de detecciónDemostrar que el método es capaz de recuperar menos de 5 UFC por lo menos en el 80% de las repeticiones

RepetibilidadNo más del 20% de las repeticiones con resultados negativos al inocular menos de 5 UFC

Reproducibilidad

Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen resultaos negativos en no más del 20% cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno.

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IncertidumbreMencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a las mediciones

8.1.1. Límite de detección

Demostrar que el método es capaz de recuperar menos de 5 UFC por lo menos en el 80% de las repeticiones.

Microrganismo de prueba: Utilizar al menos aquellos microrganismos indicados como control positivos en el método de ensayo, el tamaño del inóculo deberá ser menor de 5 UFC.

Matriz seleccionada: Verificar por sextuplicado (6 veces) la ausencia del microrganismo de prueba.

Repeticiones: 30 repeticiones

Cálculos:

Lectura= No .de positivosNo .de repeticiones

×100

Ejemplo:

Se desea verificar el método para aislamiento de un microrganismo patógeno; para la determinación del límite de detección deberá prepararse un inóculo de 5 UFC del patógeno.

Al realizar la estimación de la curva microbiana se determina que en la dilución 10 -7, se obtienen 150 UFC/mL. Antes de la prueba deberá preparar un inóculo fresco y realizar diluciones decimales hasta 10-9, a partir de esa dilución se transfieren 2 mL a cada una de las 30 porciones de la muestra. En paralelo se verifica el inóculo, transfiriendo 1 mL de la suspensión a 6 cajas Petri.

Para la verificación del inóculo, se incubaron en condiciones adecuadas y se hicieron los cálculos para determinar la cantidad de microrganismos inoculados a la muestra. La prueba es válida si se inoculan menos de 5 UFC.

Para las muestras inoculadas se procedió como indica el método de ensayo. Se registraron los resultaos de ausencia/presencia.

Ausencia: 5

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Presencia: 25

Entonces:

Lectura=2530

×100⟹Lectura=83.33%

Conclusión:

Se cumple con el criterio de aceptación

8.1.2. Repetibilidad

Los resultados de método cualitativos se registran comúnmente como positivo o negativo o presencia/ausencia, por lo que la repetibilidad se calcula utilizando los datos obtenidos en la prueba del límite de detección. El criterio de aceptación es igual o menor al 20%

Ejemplo:

Usando los datos del ejemplo del límite de detección.

Supongamos que:

Ausencia: 5

Presencia: 25

Entonces:

Lectura= 530

×100⟹Lectura=16.66%

Conclusión:

Se cumple con el criterio de aceptación

8.1.3. Reproducibilidad

Inoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen resultados negativos menores o iguales al 20% cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno. Las repeticiones se realizaron en momentos diferentes:

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Ejemplo:

Resultados Analista A Analista B

No. de Repeticiones 10 10

Ausencia 1 2

Presencia 6 8

Lectura110

×100=10% 210

×100=20%

Criterio Lectura ≤ 20%

Concusión individual de repetibilidad

Cumple el criterio Cumple el criterio

Conclusión global de Reproducibilidad Cumple el criterio

8.1.4. Incertidumbre del método cualitativo

El concepto de incertidumbre no puede ser aplicado directamente a resultados cualitativos en pruebas microbiológicas por lo que solo se mencionan las siguientes:

Fuentes de Incertidumbre

Distribución de los microrganismos en la muestra; Efecto de la matriz Destrezas y habilidades del personal operativo Mediciones realizadas (masa de la muestra y volumen de alícuotas y diluciones) Homogenización Calidad de los medios Tiempo transcurrido hasta la inoculación Temperatura de incubación

9. MÉTODOS CUANTITATIVOS

9.1. Selección de Matrices

Muestras naturalmente contaminadas. Para evaluar la capacidad de un método para recuperar de forma consistente un microrganismo o grupo de microrganismos de interés, es importante contar con muestras naturalmente contaminadas, estas deberán de ser comprobadas por el método de prueba por duplicado. Estas muestras deberán ser utilizadas para la comparación de las muestras.

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Muestras no contaminadas. Se debe contar con matrices no contaminadas, es decir, que no cuenten con el microrganismo de interés (en algunos casos pueden producirse artificialmente, mediante esterilización).

Se deberá comprobar usando el método de ensayo por duplicado.

Los resultados de las matrices deberán registrarse e incluirse en el informe de verificación.

9.2. Criterios de Aceptación


Repetibilidad R < 30%

Reproducibilidad R <30%

Recuperación 90% ≤ Rec ≤ 110% log

Sesgo La diferencia absoluta entre lo recuperado y lo inoculado: d < 0.3 log

Incertidumbre a) Especificar el mesurandob) Identificar las fuentes de incertidumbre

9.2.1. Repetibilidad

La determinación de la repetibilidad (r) sirve para verificar el grado de concordancia entre los resultados obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por el mismo analista, en las mismas condiciones, en la misma muestra, en intervalos cortos de tiempo.

Analito: Usar una cepa del microrganismo de interés asociado a la prueba.

Número de repeticiones: 30 (a excepción de NMP: 10 repeticiones)

Nivel de fortificación: 1 nivel (valor medio)

A. Muestras no contaminadas

Fortificación de la muestra. Inocular una concentración conocida de microrganismo tal que al concluir el análisis se recuperen recuentos de aproximadamente el valor medio del intervalo de lectura.

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B. Muestras naturalmente contaminadas

Verificar por duplicado la concentración de los microrganismos

Ejemplo:

Cuando el método de ensayo indica que se deben contar las cajas que tengan entre 25 y 250 UFC, se utilizan 25 g de muestra y se coloca 1 mL de cada dilución por placa. El inóculo en la muestra debe ser tal que después del método de análisis se recuperen aproximadamente 80 UFC:

Límite Recuento Log Dif. Log Dif. Log/2 Log(LI) + D/2 UFCInferior 25 1.40

1.00 0.5 1.90 79Superior 250 2.40

Cuando el método de ensayo indica que se deben contar las cajas que tengan entre 15 y 150 UFC, se utilizan 25 g de muestra y se coloca 1 mL de cada dilución por placa. El inóculo en la muestra debe ser tal que después del método de análisis se recuperen aproximadamente 50 UFC:

Límite Recuento Log Dif. Log Dif. Log/2 Log(LI) + D/2 UFCInferior 15 1.18

1.00 0.5 1.68 47Superior 150 2.18

Dif. Log = Log(Lim. Sup.) –Log(Lim. Inf.) Log(LI) + D/2 = Log(Lim. Inf.) + Dif. Log/2

Si se considera que se realizará una sola dilución entonces la concentración del microrganismo en la dilución 10-1 deberá ser aproximadamente 800 UFC, pero considerando que el tamaño de la muestra es de 25 g, entonces se deberían inocular aproximadamente 2000 UFC.Nota 3: Todos los inóculos deben ser verificados utilizando la técnica de vaciado en placa, empleando para el cálculo 6 placas.

Desarrollo:Partiendo de 30 porciones inoculadas de la muestra o de muestras naturalmente contaminadas, el analista A, procede como lo indica el método de ensayo.Cálculos:Calcular el Log de las UFC contadas por placa en cada repetición.

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A B C D E1 Repetición Placa 1 Placa 2 Log(Placa 1) Log(Placa 2)2 Rep. 1 70 UFC 90 UFC 1.85 1.953 Rep. 2 71 UFC 91 UFC 1.85 1.964 Rep. 3 80 UFC 80 UFC 1.90 1.905 Rep. 4 76 UFC 82 UFC 1.88 1.916 Rep. 5 78 UFC 82 UFC 1.89 1.917 Rep. 6 77 UFC 88 UFC 1.89 1.948 Rep. 7 56 UFC 80 UFC 1.75 1.909 Rep. 8 87 UFC 80 UFC 1.94 1.90

10 Rep. 9 77 UFC 86 UFC 1.89 1.9311 Rep. 10 65 UFC 84 UFC 1.81 1.92

Excel Texto # "UFC" # "UFC" =LOG(B2) =LOG(C2)

Calcular las desviaciones estándar relativa (DER) y elevarlas al cuadrado.

DER= SX

D E F G H I1 Log(Placa 1) Log(Placa 2) Desv. Estd. MEDIA DER DER2

2 1.85 1.95 0.077 1.900 0.0406 0.0016513 1.85 1.96 0.076 1.905 0.0400 0.0016004 1.90 1.90 0.000 1.903 0.0000 0.0000005 1.88 1.91 0.023 1.897 0.0123 0.0001516 1.89 1.91 0.015 1.903 0.0081 0.0000657 1.89 1.94 0.041 1.915 0.0214 0.0004588 1.75 1.90 0.110 1.826 0.0600 0.0036009 1.94 1.90 0.026 1.921 0.0134 0.000180

10 1.89 1.93 0.034 1.910 0.0178 0.00031611 1.81 1.92 0.079 1.869 0.0421 0.001776

Excel=LOG(B2) =LOG(C2) =DESVEST(D2:E2) =PROMEDIO(D2:E2

)=(F2/G2) =H2^2

Calcular la media cuadrática de la DERA, usando la siguiente fórmula:

DER A=2√ DER1

2+DER22+…+DERn

2

nPara determinar la repetibilidad del método se multiplica la DERA por 2.8 que es el valor de la distribución normal Z con 95% de confianza.

Repetibilidad (r) = 2.8 x DERA de repetibilidad

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I J K

1 DER2 DERA r

2 0.001651

0.0313 0.0876

3 0.001600

4 0.000000

5 0.000151

6 0.000065

7 0.000458

8 0.003600

9 0.000180

10 0.000316

11 0.001776

Excel =H2^2 =RAIZ((SUMA(I2:I11)/CONTAR(I2:I11)))) =J2*2.8

9.2.2. Reproducibilidad

La determinación de la reproducibilidad (R) sirve para verificar el grado de concordancia entre los resultados obtenidos en diferentes repeticiones realizadas por diferentes analistas, en las mismas condiciones, en la misma muestra, en diferentes intervalos de tiempo.

Desarrollo:Partiendo de 30 porciones inoculadas de la muestra o de muestras naturalmente contaminadas, proceder como lo indica el método de ensayo.

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Ejemplo:

A B C D E F G H I J

1 Analista Repetición Placa 1 Placa 2 Log(Placa 1) Log(Placa 2) Desv. Estd. MEDIA DSR DSR2

2

A

Rep. 1 79 UFC 80 UFC 1.90 1.90 0.004 1.900 0.0020

0.000004

3 Rep. 2 60 UFC 67 UFC 1.78 1.83 0.034 1.8020.018

80.00035

4

4 Rep. 3 77 UFC 86 UFC 1.89 1.93 0.034 1.910 0.0178

0.000316

5 Rep. 4 77 UFC 70 UFC 1.89 1.85 0.029 1.8660.015

70.00024

6

6 Rep. 5 89 UFC 70 UFC 1.95 1.85 0.074 1.897 0.0389

0.001511

7 Rep. 6 69 UFC 89 UFC 1.84 1.95 0.078 1.894 0.0413

0.001703

8 Rep. 7 77 UFC 80 UFC 1.89 1.90 0.012 1.895 0.0062

0.000038

9 Rep. 8 80 UFC 80 UFC 1.90 1.90 0.000 1.903 0.0000

0.000000

10

Rep. 9 78 UFC 83 UFC 1.89 1.92 0.019 1.906 0.0100

0.000100

11

Rep. 10 75 UFC 77 UFC 1.88 1.89 0.008 1.881 0.0043

0.000018

12

Analista Repetición Placa 1 Placa 2 Log(Placa 1) Log(Placa 2) Desv. Estd. MEDIA DSR DSR2

13

B

Rep. 1 70 UFC 79 UFC 1.85 1.90 0.037 1.871 0.0198

0.000394

14

Rep. 2 89 UFC 80 UFC 1.95 1.90 0.033 1.926 0.0170

0.000289

15

Rep. 3 80 UFC 77 UFC 1.90 1.89 0.012 1.8950.006

20.00003

816

Rep. 4 70 UFC 77 UFC 1.85 1.89 0.029 1.866 0.0157

0.000246

17

Rep. 5 70 UFC 89 UFC 1.85 1.95 0.074 1.897 0.0389

0.001511

18

Rep. 6 89 UFC 69 UFC 1.95 1.84 0.078 1.8940.041

30.00170

319

Rep. 7 80 UFC 77 UFC 1.90 1.89 0.012 1.895 0.0062

0.000038

20

Rep. 8 80 UFC 80 UFC 1.90 1.90 0.000 1.9030.000

00.00000

021

Rep. 9 83 UFC 78 UFC 1.92 1.89 0.019 1.906 0.0100

0.000100

2 Rep. 10 79 UFC 84 UFC 1.90 1.92 0.019 1.911 0.009 0.00009

18 de 36


2 9 7

Calcular la media cuadrática de la DERAB, usando la siguiente fórmula:

DER AB=2√ DER1

2+DER22+…+ DERn

2

n

Para determinar la reproducibilidad (R) del método, se multiplica la DERAB por 2.8 que es el valor de la distribución normal Z con 95% de confianza.

Reproducibilidad (R) = 2.8 x DERAB de reproducibilidad

19 de 36


A B J K L1 Analista Repetición DSR2 DERAB R2

A

Rep. 1 0.000004

0.0209 0.0584

3 Rep. 2 0.0003544 Rep. 3 0.0003165 Rep. 4 0.0002466 Rep. 5 0.0015117 Rep. 6 0.0017038 Rep. 7 0.0000389 Rep. 8 0.000000

10 Rep. 9 0.00010011 Rep. 10 0.000018

12 Analista Repetición DSR2

13

B

Rep. 1 0.00039414 Rep. 2 0.00028915 Rep. 3 0.00003816 Rep. 4 0.00024617 Rep. 5 0.00151118 Rep. 6 0.00170319 Rep. 7 0.00003820 Rep. 8 0.00000021 Rep. 9 0.00010022 Rep. 10 0.000097

=RAIZ((SUMA(I2:I11,I13:I22)/CONTAR(I2:I11,I13:I22)))) =J2*2.8

9.2.3. Recuperación

Es la cantidad de UFC que el método de ensayo es capaz de recuperar cuando es inoculado un número conocido de microrganismos.

Con los datos obtenidos en el cálculo de la repetibilidad (5.6.2) en muestras fortificadas, calcular la cantidad de UFC, en cada repetición y calcular el logaritmo de cada recuento, promediar los logaritmos. Calcular el logaritmo del inóculo verificado.

Finalmente calcular el % de recuperación:

%Recuperación=Promedio de los logaritmosde los recuentosLogaritmmode lasUFC inoculadas

×100

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A B C D E F G H I J

1 Analista Repetición Placa 1 Placa 2 Prom. Recuento Log(PRC) Prom. Log(PRC) InóculoLog(Inóc.

)% Recup.

2

A

Rep. 1 79 UFC 80 UFC 80 UFC 1.90

1.89 80 UFC 1.90 99%

3 Rep. 2 60 UFC 67 UFC 64 UFC 1.83

4 Rep. 3 77 UFC 86 UFC 82 UFC 1.93

5 Rep. 4 77 UFC 70 UFC 74 UFC 1.85

6 Rep. 5 89 UFC 70 UFC 80 UFC 1.85

7 Rep. 6 69 UFC 89 UFC 79 UFC 1.95

8 Rep. 7 77 UFC 80 UFC 79 UFC 1.90

9 Rep. 8 80 UFC 80 UFC 80 UFC 1.90

10 Rep. 9 78 UFC 83 UFC 81 UFC 1.92

11 Rep. 10 75 UFC 77 UFC 76 UFC 1.89

=PROMEDIO(C2:D2) =LOG(E2) =PROMEDIO(F2:F11) =LOG(H2) =G2/I2

9.2.4. Sesgo

El sesgo es la diferencia relativa, en porcentaje, encontrada entre el valor conocido como verdadero (valor esperado) y el valor experimental (valor obtenido).

A partir de los cálculos de recuperación, calcular la diferencia entre la media de los logaritmos de los recuentos experimentales y el logaritmo del recuento del inóculo utilizado:

% Sesgo=Prom [ log ( PRC ) ]−log(Inoc)

log(Inoc)×100

Donde:Prom [Log (PRC)] = promedio de los logaritmos de los recuentos experimentalesLog (Inoc) = logaritmo del recuento del inóculo utilizado

% Sesgo=1.89−1.901.90

×100=−0.53%

9.2.5. Incertidumbre del método cuantitativo

a. Especificar el mesurando.b. Identificar las fuentes de incertidumbre

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c. Estimar la incertidumbre según el documento oficial del LCDVMA: PVE-MA-03 – Guía para la estimación de la incertidumbre de los métodos de ensayo microbiológicos, Revisión 01, 2013

10. CRITERIOS DE ACEPTACIÓN PARA LA EVALUACIÓN DE MÉTODOS DE ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS

Cuantitativos


Repetibilidad R < 30%

Reproducibilidad R <30%

Recuperación 90% ≤ Rec ≤ 110% log

Sesgo La diferencia absoluta entre lo recuperado y lo inoculado: d < 0.3 log

Incertidumbre c) Especificar el mesurandod) Identificar las fuentes de incertidumbre

Cualitativos


Límite de detecciónDemostrar que el método es capaz de recuperar menos de 5 UFC por lo menos en el 80% de las repeticiones

RepetibilidadNo más del 20% de las repeticiones con resultados negativos al inocular menos de 5 UFC

ReproducibilidadInoculando menos de 5 UFC, 2 analistas obtienen resultaos negativos en no más del 20% cuando realizan al menos 10 repeticiones cada uno.

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IncertidumbreMencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a las mediciones

11. ELABORACIÓN DEL PROTOCOLO

Elaborar un Protocolo der Validación, incluye lo siguiente:

Título Protocolo para la evaluación del desempeño del método “Nombre y código del método” que se pretende validar

1. Objetivo Considerar los parámetros de desempeño a evaluar y el analito (microrganismo) a determinar

2. Campo de aplicación (Alcance)

Indicar el tipo de producto(s) para los cuales aplica la validación (especificar las matrices de ensayo)

3. Método de ensayo Elaborar un diagrama de flujo del método en cuestión

4. Equipo Mencionar los equipos a utilizar y las condiciones que requieren (verificación y/o calibración, si aplica)

5. Materiales Indicar los materiales a utilizar

6. Medios de cultivo y reactivos

a) Indicar el nombre (código) de los Medios de Cultivo a utilizarb) Indicar el nombre y concentración de los reactivos a utilizarc) Indicar las cepas de referencia que se usarán y la forma de

preparar los inóculos

7. Muestras a) Indicar las características, formas de almacenamiento y cantidades de muestra estimadas para llevar a cabo la validación.

b) Detallar la preparación de los blancos de muestra o muestras inoculadas

8. Desarrollo experimental

Detallar las Instrucciones para cada uno de los parámetros de desempeño a ensayar

9. Resultados Elaborar los formatos donde se registrarán los resultados del trabajo experimental

10. Análisis estadístico Establecer para cada parámetro de desempeño la herramienta

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estadística a utilizar para su evaluación

11. Criterios de aceptación Establecer los criterios de aceptación que deben cumplirse con su respectiva referencia bibliográfica

Nota: El protocolo debe incluir firmas de quién elaboró, revisó y aprobó.

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12. EJECUCIÓN DEL PROTOCOLO

Deberán documentarse todos los resultados en los formatos descritos en sus protocolos, todos los registros deberán estar firmados por el personal que realiza la actividad y mostrar evidencias de supervisión.

Cuando se realice un cambio con respecto al protocolo establecido, este deberá estar documentado y autorizado.

13. ELABORACIÓN DEL INFORME DE VALIDACIÓN

Elaborar un informe de resultaos de la validación que incluya lo siguiente:

Título Informe de resultados de la evaluación del desempeño del método “Nombre y código del método” que se evaluó

1. Objetivo Considerar los parámetros de desempeño a evaluados y el analito (microrganismo) a determinado.

2. Campo de aplicación (Alcance)

Indicar el tipo de producto(s) para los cuales aplicó la validación (especificar las matrices de ensayo)

3. Equipo Listado de los equipos utilizados y sus estado de calibración y/o verificación y mantenimiento.

4. Materiales Listado de materiales utilizados

5. Medios de cultivo y reactivos

Listado de medios de cultivo y reactivos utilizados y sus estado de calidad

6. Muestras

a) Indicar las características, condiciones de almacenamiento, marca u origen, presentación, caducidad y cantidades de muestra utilizadas para llevar acabo la validación.

b) Detallar la preparación de los blancos de muestra o muestras inoculadas usadas

7. Método de ensayo Describir el método y presentar el diagrama de flujo del método validado (en Anexos)

8. Desarrollo Detallar cómo se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de los

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experimental parámetros de desempeño.

9. ResultadosPresentación de resultados en forma de tablas, señalando la fechas de inicio y término, analistas, laboratorio (sección), microrganismos de prueba, matriz, unidades, clave de bitácoras o registro primario.

10. Análisis de resultadosPresentar en forma de tabla los criterios de aceptación considerados y los resultados obtenidos y hacer las observaciones pertinentes.

11. ConclusiónEfectuar una conclusión final en donde se señale que el método se ajusta al uso previsto o propuesto. (Numeral 5.4.5.2 de la norma NTN 04 001-05, 2da Rev. (ISO/IEC 17025:2005)

12. Bibliografía Listado bibliográfico de la referencias utilizadas

13. Anexos

Los que apliquen:

Registros primarios Base de datos utilizadas Certificados de calificación/validación,

calibración/verificación de los equipos. Listado de medios de cultivo Listado de cepas de referencia Formatos de verificación, Gráficos de control

Nota: El informe de resultados debe incluir firmas de quién elaboró, revisó y aprobó.

14. VIGENCIA

Las directrices de esta “Guía para la evaluación del desempeño de los métodos de ensayo microbiológicos (Verificación o Validación Secundaria)”, se aplicará a todos los procesos de evaluación de la conformidad que se realicen en la Sección de Microbiología de Alimentos del Laboratorio, a partir de la fecha de publicación de este documento y se otorga un plazo de 120 días calendario, para tener implementado los criterios aquí establecidos.

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ANEXO A

Guía informativa para la fortificación de una matriz

La fortificación de muestras se hace por medio de la adición de diluciones conocidas del microrganismo a prueba, a partir de su fase estacionaria (FE), en la matriz en cuestión, como sigue:

Estimación de la dilución de trabajo

A partir de un cultivo de microrganismo de interés en BHI (o cualquier otro medio de enriquecimiento), hacer diluciones decimales hasta 10-9 en agua peptonada amortiguada al 0.1%; o en el diluyente que utilice el laboratorio.

Hacer recuentos por triplicado de las diluciones 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 en agar soya tripticaseína o agar cuenta estándar.

Realizar las lecturas y cálculos de los números de células en cada una de las diluciones para establecer la dilución que será usada en la fortificación de la matriz y registrar los resultados de los recuentos y los cálculos.

Preparación del inóculo

Preparar un nuevo cultivo de caldo BHI, preparar las diluciones necesarias con base en los resultados obtenidos en la estimación de la dilución de trabajo, verificar la concentración del inóculo por sextuplicado.

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ANEXO B

Guía informativa de formatos

Cuadro 1VALIDACIÓN PARCIAL DE:

FASE ESTACIONARIA

Analista: Fecha:

Nombre del microrganismo:

Caldo: Volumen del caldo: Temperatura y tiempo total de incubación:

Intervalo de tiempo de lectura: UFC/mL en FE =

Horas Vol. de inóculo en placa

Dilución Cuenta UFC Placa 1

Cuenta UFC Placa 2

Promedio de cuentas

UFC/mL

Cálculos:

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Cuadro 2VALIDACIÓN PARCIAL DE:

CÁLCULO D E INÓCULOS

Analista: Fecha:

Nombre del microrganismo:

Parámetro de desempeño:

Intervalo de tiempo de lectura: UFC/mL en FE =

Dilución de FE

Concentración UFC/mL Dilución

Nivel y concentración a la que se quiere llegar en

UFC/mL

Dilución seleccionada

Volumen necesario

Cálculos:

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Cuadro 3

ANÁLISIS DE LA MATRIZ EN ESTUDIOPrueba de ausencia del: “nombre del microrganismo”

Matriz: Método a prueba:

Analito: UFC/mL en FE: Fecha:

Analista:

Parámetro de desempeño:

Alícuota de 25 g Resultado del análisis Observaciones

1.

2.

3.

4.

5.

6.

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Cuadro 4

Matriz: Analistas:

Fecha: Método a prueba:

Parámetro de desempeño:Límite de detección

Analito:

UFC/mL en FE:

Nivel a confirmar:LD no declarado:_______ UF/25gLD declarado:__________

Niveles que se prueban:

No. de alícuotas: Cantidad de muestra por alícuota:

Nivel: ___________Dilución seleccionada de la FE:Concentración en UFC/mL que corresponde a la dilución seleccionada:Cálculos:

RESULTADOS:

Dilución de FE:_____________

Volumen ce FE:_____________

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Cuadro 5

Resultados del parámetro del Límite de Detección

Matriz: Método a prueba:

Analito: UFC/mL en FE:Analista:

No. de réplicas del nivel declarado: 30 Fecha:

Nº Nivel de fortificación (N1)

Concentración esperada en UFC/25 g

Resultados [registrar (+) o (−)]

Nº de (+)x 100/Nº total de alícuotas

123456789

101112131415161718192021222324252627282930

R = resultado, en esta tabla se registran 30 porque se hace la determinación por nivel para 3 medios de cultivo en el caso de Salmonella.

N1 = nivel declarado en el método de prueba.

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ANEXO C

Guía para la elaboración de las fórmulas en hojas de cálculo Excel

Porcentaje de recuperación A B C D E F G H I J

1 Analista Repetición Placa 1 Placa 2 Prom. Recuento Log(PRC) Prom[Log(PRC)] Inóculo Log(Inóc.) % Recup.

2 =promedio(C2:D2) =LOG(E2)

= PR

OM

EDIO

(F2:

F11)

80 UFC =LOG(H2) =G2/I2










Porcentaje de Sesgo A B C D E F G H I J

1 Analista Repetición Placa 1 Placa 2 Prom. Recuento Log(PRC) Prom[(Log(PRC)] Inóculo Log(Inóc.) % Sesgo.


= PR

OM

EDIO

(F2:

F11)

80 UFC =LOG(H2)










33 de 36


Reproducibilidad

A B C D E F G H I J K L

1 Analista Repetición Placa 1 Placa 2 Log(Placa 1) Log(Placa 2) Desv. Estd. MEDIA DSR DSR2 DERAB R

2 =LOG(C2) =LOG(D2) =DESVEST(E2:F2) =PROMEDIO(E2:F2) =G2/H2 =I2^2

= RA

IZ((S

UM

A(J2

:J11,

j14:

J23)

/CO

NTA

R(J2

:J11,

J14:

J23)

))

=K2*2.8








10 =LOG(C10) =LOG(D10) =DESVEST(E10:F10) =PROMEDIO(E10:F10)=G10/H10

=I10^2


=I11^2

12

13 Analista Repetición Placa 1 Placa 2 Log(Placa 1) Log(Placa 2) Desv. Estd. MEDIA DSR DSR2


=I4^2


=I5^2


=I16^2


=I17^2


=I18^2


=I19^2


=I20^2


=I21^2

22 =LOG(C22) =LOG(D22) =DESVEST(E22:F22) =PROMEDIO(E22:F22) =G22/H22

=I22^2

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=I23^2

35 de 36


Repetibilidad

A B C D E F G H I J K

1 Repetición Placa 1 Placa 2 Log(Placa 1) Log(Placa 2) Desv. Estd. MEDIA DSR DSR2 DERAB R

2 =LOG(B2) =LOG(C2) =DESVEST(D2:E2) =PROMEDIO(D2:E2) =F2/G2 =H2^2

= R

AHZ(

(SU

MA(

I2:I1

1)/C

ON

TAR(

I2:I1

1)

=J2*2.8

3 =LOG(B3) =LOG(C3) =DESVEST(D3:E3) =PROMEDHO(D3:E3) =F3/G3 =H3^2



6 =LOG(B6) =LOG(C6) =DESVEST(D6: E6) =PROMEDHO(D6: E6) =F6/G6 =H6^2




10 =LOG(B10) =LOG(C10) =DESVEST(D10: E10) =PROMEDHO(D10:E10) =F10/G10 =H10^2


---------------------- FIN DE ESTE DOCUMENTO ----------------------

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