EXTRACCIN DE DNA GENMICO DE D. melanogaster SOLUCIONES: Buffer A (lisis celular) Tris HCl (pH 7.5) 0.1M EDTA (pH8) 0.1M NaCl 0.1M SDS 0.5%

de sock (para 10mL) 1mL (1M) 2mL (0.5M) 0.058g 0.05g

KOAc LiCl

Buffer B (precipitacin protena) 5M 4mL 4.9g en10mL (5M) 6M 10mL 2.54g en 10mL (6M)

1. Se anestesian 30 moscas con CO2; se colocan en un tupo eppendorf (1.5mL) y se usan inmediatamente o se congelas a -70C. 2. Se agregan 200L de BufferA y se maceran con un embolo de plstico estril. Se agregan 200L ms y se sigue macerando por un par de minutos, hasta que solo queden las cutculas. 3. Incubar las muestras a 65C por 30 minutos 4. Agregar 800L de BufferB, mezclar por inversin varias veces. Incubar en hielo 10min-2hora (por 1hora y guardar a 4C) 5. Centrifugar a 15min/14,000rpm/TA 6. Transferir 1mL del sobrenadante en un tubo nuevo. Con cuidado que las partculas flotantes no se transfieran. Si es necesario centrifugar nuevamente para descartar partculas. Pasar el sobrenadante a un tubo nuevo. 7. Agregar 500-600L de isopropanol fro y mezclar por inversin varias veces. (precipitar DNA) 8. Centrifugar 15min/14,000rpm/TA 9. Descartar el sobrenadante y lavar la pastilla con etanol al 70%. Centrifugar 5min/14,000rpm y se desecha el sobrenadante utilizando una micropipeta. 10. Dejar secando al aire o en una estufa a 37C por unos minutos sin permitir que se seque completamente la pastilla de DNA. 11. Disolver la pastilla en H2OmQ, TE 1X. Usar 50L para un total de 30 moscas o proporcional. 12. Visualizar DAN en gel de agarosa al 0.8% utilizando 2L En caso de utilizar DNA genmico extrado para PCR diluir al menos 10veces

PREPARACIN DE BACTERIAS CALCIO COMPETENTES (Ca++) 1. Picar una colonia de bacterias DH5 y crecer en tubo con 3mml de medio LB, incubar toda la noche/37C/300rpm 2. Del precultivo crecido tomar 1mL e incubar en 100mL de medio LB 2h/37C/300rpm. (tomar 1mL del medio con bacterias o medio LB y utilizarlo como blanco) 3. Al trmino de las 2h, tomar 200L de la muestra de bacterias y determinar la absorbancia en espectrofotometro leyendo a 570nm. La absorbancia ptima deber ser 0.375nm 4. Poner 50mL del cultivo bacteriano en 2 tubos de centrifuga y centrifugar 10min/4C/5000rpm 5. Decantar el medio y aadir 10mL de CaCl2 0.1M previamente enfriado 6. Dar vortex hasta disgregar el pellet y posteriormente incubar 30min/hielo 7. Centrifugar a 10min/4C/5000rpm 8. Decantar el sobrenadante y resuspender las bacterias en 2mL de CaCl2 9. Guardar en hielo a 4C

TRANSFORMACIN DE BACTERIAS Ca++ COMPETENTES (BCa++) 1. Transferir 50L de BCa++ a un tubo eppendorf fro; 2. Agregar 1L del plsmido con una concentracin de 1ng/L (positivo); en otro tubo epp agregar 3L de la reaccin de ligacin; y uno ms para negativo; mezclar e incubar 30min/hielo 3. Dar choque trmico: 1min30seg/42C 4. Colocar nuevamente los tubos 5min/hielo 5. Agregar 200L de medio LB; 6. Incubar 30min/250rpm/37C 7. Centrifugar 20seg/14,000rpm; 8. Eliminar 150-200L del sobrenadante (para dejar de 50L y pastilla) 9. Resuspender pastilla y sembrar en placa de LB+Amp e incubar 12h/37C

TRANSFORMACIN DE BACTERIAS One Shot TOP10 Chemically Competent E. Coli Descongelar, en hielo, un vial de One Shot TOP10 para cada transformacin. Agregar de 1 a 5L de DNA (10pg 100ng) en un vial de One Shot y agitar (no resuspender con pipeta). Para el control pUC19, agregar 10pg (1L) de DNA en un vial de One Shot aparte y agitar. Incubar los viales en hielo por 30minutos. Dar choque trmico 42C/30seg sin agitacin. Poner nuevamente los viales en hielo por 2minutos. Agregar 250L de Medio S.O.C. pre-atemperado a cada vial, de manera asptica. Tapar bien los viales y agitar de forma horizontal 37C/1h/225rpm. Esparcir de 20-200L de cada transformacin en una placa de cultivo selectiva pre-atemperada e incubar toda la noche a 37C. Almacenar los remanentes de la mezcla de transformacin a 4C. Esto se puede cultivar al da siguiente. Seleccionar las colonias y analizarlas mediante aislamiento de plsmido, PCR o secuenciacin.

MINIPREPARACIN 1. Tomar una colonia, inocular en 3mL de LB + 3L de Amp. Dejar incubando toda la noche/37C 2. Tomar 1.5mL del cultivo, transferir a tubo epp; centrifugar 14,000rpm/2min 3. Descartar el sobrenadante y resuspender pastilla en 150L de solucin I (Glucosa 50mM, EDTA 10mM y Tris-HCl 25mM, pH 8); vortex, dejar 5min/hielo; 4. Agregar 150L solucin II y mezclar por inversin, agregar solucin III y mezclar por inversin, Incubar 10min/-20C 5. Centrifugar 5min/14,000rpm, transferir sobrenadante a un tubo epp 6. Agregar 1 volumen de Isopropanol al 100% (500L); mezclar por inversin e incubar 10min/-20C 7. Centrifugar 10min/14,000rpm; descartar sobrenadante; 8. Agregar 500L de etOH al 70%; 9. Centrifugar 5min/14,000rpm; quitar la mayor cantidad de sobrenadante y secar pastilla a 37C 10. Agregar 20L H2O mQ; 1L RNAsa 11. Correr 2 L en gel de agarosa al 0.8%

Soluciones Miniprep y Mediana Escala 200ml c/u I II III Tris-HCl (pH 8.0) 25mM 5mL de 1M NaoH 0.2N 4mL de 10N KOAc 5M 60mL o 29.4g (slido) EDTA (ph 8.0) 10mM 4mL de 500mM SDS 1.0% 2.0g (slido) Acdio actico 11.5mL Llevar a un volumen de 200mL con Resuspender y llevar a un volumen de Llevar a un volumen de 100mL agua mQ 200mL con agua mQ con agua mQ Esterilizar antes de usar

MINIMEDIANA 1. Inocular 10mL LB + 10L de bacterias + 10L Amp; incubar 2. Centrifugar 7min/5,000rpm/TA 3. Agregar 1mL solucin I 4. Agregar 1mL solucin II 5. Agregar 1mL solucin III 6. Centrifugar 7min/5,000rpm/TA 7. Retirar el sobrenadante y agregar 1 volumen de cloroformo; vortex 8. Centrifugar 7min/5,000rpm/TA 9. Extraer fase superior y aadir 2.5volumnes de etOH a 100% 10. Incubar 2h/-20C 11. Centrifugar 10min/5,000rpm/4C 12. Lavar con 3mL de etOH al 70% 13. Secar a 37C y resuspender en 100L de H2O + RNAsa

REACCIN DE LIGACIN en vector PCR-TOPO 2.1 H2O Solucin Salina Producto Amplificado Vector Volumen total 2L 0.5L 3L 0.5L 6L

La reaccin se deja 5min/Tambiente, despus se pasa a 18C Una vez terminada la reaccin se tomn 3L de esta y se realiza la transformacin en bacterias Ca++

PURIFICACIN DE DNA CON COLUMNAS WIZZARD POR CENTRIFUGACIN La muestra de DNA a purificar puede provenir de una reaccin de PCR, digestin enzimtica, reaccin con alguna enzima de modificacin o de un fragmento de DNA en agarosa. Preparacin de la muestra de DNA en solucin Agregar un volumen de solucin de unin a la muestra. Preparacin de la muestra de DNA en agarosa Pesar un tubo eppendorf antes y despus de agregar el fragmento de agarosa que contiene el DNA a purificar para calcular el peso de la agarosa. Agregar 1uL de solucin de unin por cada mg de agarosa. Incubar de 50-65C por 10 min o hasta que se haya disuelto la agarosa. Protocolo General 1. Colocar una minicolumna SV en u n tubo de colecta (2mL) para cada muestra de DNA. 2. Transferir la muestra de DNA dentro de la minicolumna, esperar 1 minuto. 3. Centrifugar a 10,000 rpm/1minuto, descartar el lquido del tubo de colecta y regresar la minicolumna al tubo de colecta. 4. Lavar la columna aadiendo 700uL de solucin de lavado de membrana previamente diluida con el etanol 95% (75mL para 50 preps). Centrifugar 1min a 10,000rpm, vaciar el tubo de colecta, regresar la minicolumna, agregar 500uL de solucin de lavado y centrifugar 5min a 10,000rpm. 5. Remover la minicolumna teniendo cuidado de no mojar el fondo, vaciar el tubo de colecta y re-centrifugar 1minuto. Dejar reposar en la mesad urante 5min para evaporar el etanol (se puede dejar en la incubadora a 37C). 6. Transferir cuidadosamente la minicolumna a un tubo de microcentrifuga nuevo de 1.5mL, aadir 50uL de agua libre de nucleasas directamente al centro de la minicolumna son tocar la membrana. Incubar 1min/TA y centrifugar 1min/10,000rpm. 7. Descartar la minicolumna y almacenar el tubo que contiene el DNA a 4 o -20C. el volumen final debe ser de 42-47uL, pero si se quiere concentrar el DNA se puede precipitar con etanol o eluir con u nvolumen menor que puede ser hasta de 15uL (menos no recomendado).

PURIFICACIN DE DNA A PARTIR DE AGAROSA USANDO COLUMNAS WIZARD Disolver el fragmento del gel 14. Pesar un tubo epp (1.5mL) 15. Despus de la electroforesis, cortar la banda de DNA del gel y colocarlo en un tubo para microcentrfuga (1.5mL). Pesar nuevamente el tubo epp con el fragmento del gel 16. Aadir 1L de Solucin de Unin a membrana por cada 1mg de gel. Dar vortex e incubar a 50-56C, hasta que el gel se disuelva. Unin del DNA Insertar una minicolumna SV en el tubo colector. Transferir el gel disuelto, incubar a 1min/TA Centrifugar 1min/14,000rpm; descartar el sobrenadante y reinsertar la minicolumna en el tubo colector Lavado Agregar 700L de la Solucin de Lavado de membrana (etanol adicionado). Centrifugar 1min/14,000rpm. Descartar el sobrenadante y reinsertar la minicolumna en el tubo colector Aregar 500L de la Solucin de Lavado de membrana (etanol adicionado). Centrifugar 5min/14,000rpm Vaciar el tubo colector y recentrifugar 1min (sin tapa de de rotor de centrifuga) (evaporacin de residuos de etanol) Elucin Transferir cuidadosamente la minicolumna a un tubo nuevo de 1.5mL Aadir 50L de Agua libre de Nucleasa a la minicolumna. Incubar 1min/TA. Centrifugar 1min/14,000rpm Descartar la minicolumna y almacenar el DNA a 4C -20C

PURIFICACIN DE DNA PLASMIDICO MEDIANTE QIAGEN PLASMID MIDI KIT - Realizar precultivo; picar una colonia e inocularla en 2-5mL de medio LB con antibitico. Incubar 300rpm/37C/8h - Diluir el precultivo 1/500 en medio selectivo LB. Inocular 25mL de medio selectivo con 25-50L del precultivo. Crecer en 300rpm/37C/12-16h - Centrifugar el cultivo bacteriano 5000rpm/4C/15min - Resuspender el pellet de bacterias en 4mL del Buffer P1 - Agregar 4mL Buffer P2, mezclar mediante inversin (4-6 veces) e incubar TA/5min - Agregar 4mL de Buffer P3 (enfriado), mezclar inmediatamente mediante inversin (4-6 veces) incubar en hielo/15min - Centrifugar a 11,000rpm/4C/30min. Retirar el sobrenadante - Centrifugar el sobrenadante nuevamente a 11,000rpm/4C/15min. Retirar sobrenadante - Equilibrar una columna aplicando 4mL de Buffer QBT, y dejar que la columna se vace (por gravedad). - Agregar el sobrenadante a la columna y dejar fluya por la columna (por gravedad) - Lavar la columna dos veces con 10mL de Buffer QC - Eluir DNA con 5mL de Buffer QF - Precipitar DNA agregando 3.5mL (0.7 volumenes) de isipropanol, mezclar y centrifugar 11,000rpm/4C/30min. Decantar cuidadosamente el sobrenadante. - Lavar el pellet de DNA con 2mL de etanol al 70% y centrifugar 11,000rpm/10min. Decantar cuidadosamente el sobrenadante sin remover el pellet. - Secar el pellet por 5-10min y disolver el DNA en H2O mQ aprox. 2mLP1 P2 P3 FWB2 QBT QC QF 6.06 g Tris base + 3.72g Na2EDTA.2H2O en 800mL 2DH2O; ajustar pH a 8.0 con HCl. Ajustar volumen a 1L; agregar 100mg RNasa A por litro 8.0g NaOH (pellets) en 950mL 2DH2O + 50mL 20% SDS 294.5g acetato de potasio en 500mL 2DH2O. ajustar pH a 5.5 con acido actico glacial. Ajustar volumen a 1L 98.2g acetato de potasio en 500mL 2DH2O, ajustar pH a 5 con acido actico glacial. Ajustar volumen a 1L 43.83g NaCl + 10.46g MOPS en 800mL 2DH2O, ajustar pH a 7 con NaOH. Agregar 150mL Isopropanol puro y 15mL 10% Triton X-100. Ajustar volumen a 1L 58.44g NaCl + 10.46g MOPS en 800mL 2DH2O, ajustar pH a 7 con NaOH. Agregar 150mL de Isopropanol puro, ajustar volumen a 1L 73.05g NaCl + 6.06g Tris base en 800mL 2DH2O, ajustar pH a 8.5 con HCl. Ajustar volumen a 1L

CONGELACIN DE CLULAS 1. Preparar medio de congelacin a partir del medio de cultivo con 10% SFB; ajustar a una concentracin final de 20% SFB, 10% DMSO 2. 10mL MEDIO + 1mL SFB + 1mL DMSO 3. Tripsinisar las clulas (incubar a 37C) 4. Centrifugar 5min/2,500rpm 5. Eliminar sobrenadante y resuspender pellet en medio de congelacin 6. Alicuotar en crioviales (1mL) 7. Congelar -70C (toda la noche) 8. Transferir a N2 ; para su almacenamiento

EXTRACCIN DE MONONUCLEARES 1. Extraer sangre 5mL de sangre + 5mL solucin salina (1:1) 2. En tubo de 15mL poner 3mL FICOL + 3mL de sangre diluida (con cuidado) 3. Centrifugar 30min/1,726rpm/TA 4. Aspirar mononucleares (fase opaca), transferir a tubo limpio 5. Agregar 10mL solucin salina; lavar 6. Centrifugar 10min/1,500rpm/TAC 7. Descartar sobrenadante, lavar si an hay clulas rojas 8. Resuspender en medio de cultivo (para sembar)

INDUCCIN DE APOPTOSIS MEDIANTE CIS-PLATINO Se siembran 1,000,000 de clulas a las cuales se aade 100g de CISPLATINO y se incuba 24h Fragmentacin de DNA 1. Sembrar 500,000 clulas en botella de 25cm2. Incubar 24h 2. Aplicar tratamiento por 72h 3. Retirar sobrenadante (conservar para centrifugar en caso de clulas despegadas; 10min/1,600rpm), lavar con medio 4. Tripsinizar el resto de la botella y aadir la misma cantidad de medio para neutralizar la tripsina y evitar dao de clulas; centrifugar 10min/1,600rpm 5. Resuspender el pellet en Buffer de lisis (40L) mediante golpecillos. Incubar 30min/50C 6. Aadir 1mL de proteinasa K e incubar 30min/30C 7. Correr gel de agarosa 12%. SB

INMUNODETECCIN MEDIANTE WESTERN BLOT Correr protenas mediante electroforesis SDS-PAGE al porcentaje requerido - Transferencia de las protenas a membrana de inmobiln o Acomodar el gel y la membrana en una cmara de transferencia hmeda vertical. Tratar la membrana previamente con metanol al 100% para aumentar su permeabilidad Tratar las esponjas y los papeles filtros con el buffer de transferencia 1X o Llenar cmara de electroforesis con Buffer de Transferecia totalmente y correrla a 2h/25V toda la noche/4C/10V o Tomar la membrana y enjuagarla con H2O mQ o Teir la membrana con Solucin Rojo de Poceau concentrado por 5min, para verificar la transferencia o Bloquear la membrana con solucin TBS-T 1X con leche descremada Nestle 5% (Carnation Instant Nonfat Dry) o BSA 2h/TA/150rpm o Incubar la membrana con el anticuerpo primario anti-conejo disuelto en TBS-T 1X en la dilucin apropiada; toda la noche a 4C con agitacin constante a 150rpm o Lavar la membrana 3 veces (10min c/lavado) con TBS-T 1X o Incubar la membrana con el anticuerpo secundario anti-conejo disuelto en TBS-T por 1h/TA/150rpm o Lavar la membrana 3veces (10min c/lavado) con TBS-T 1X o Poner la membrana en contacto con 500L (v/v) con los sustratos de quimioluminiscencia; solucin 1 y 2 de ECL 1min/1mL. Eliminar el exceso del reactivo tomando la membrana con unas pinzas y colocndola sobre una servilleta. o Exponer membrana con el film o Revelar film colocndolo 1min en la solucin de revelado; 1min en H2O y 1min en solucin fijadora

LINFOPROLIFERACIN Clulas de Timo de ratn 1. Limpiar el rea de trabajo con etanol, prender mechero, poner papel, acercar ratones y material de diseccin. 2. Sacrificar ratones y rociarlos con etanol. 3. Obtener timo y colocarlo en caja petri con medio RPMI sin SFB 4. Llevar la caja con los timos a la campana y macerarlos ; pasar a tubo cnico (15 50mL) 5. Centrifugar 10min/2,000rpm/8C; eliminar sobrenadante; agregar 5mL RPMI 6. Centrifugar 10min/2,000rpm/8C; eliminar sobrenadante; agregar 5mL RPMI con SFB, contar clulas 7. Ajustar clulas dependiendo a lo necesario 8. En las placas de 96pz se hacen diluciones del tratameinto 9. A los pz de tratameinto se les agrega 10L de las clulas de timo

PREPARACIN DE MTT Thiazolyl Blue Tetrazolium; sales de formasal 5mg / 1mL 1. Pesar 200mg de MTT en PBS 2. Aforar a 40ml 3. Filtrar

PREPARACIN DE BUFFER DE LISIS (PARA APOPTOSIS) Tris HCl 10mM (0.01M) 0.18g NaCl 100mM (0.1M) 2.95g EDTA 25mM (0.025M) 4.6g SDS 0.5% 2.5g Ribonucleasa 2g/100mL

PREPARACIN DE GEL DE POLIACRILAMIDA GEL SEPARADOR 10 % H2Od Acrilamida 40% Buffer 4X pH 8.8 PSA 10% 2.441 mL 1.249 mL 1.250 mL 50 L GEL CONCENTRADOR 15 % 1.818 mL 1.872 mL Buffer pH 6.8 50 L 10% - 15% 1.880 mL 370 L 750 L

PREPARACIN DE SOLUCIN DECOLORANTE 500mL Metanol (CH3OH) 250mL Ac. Actico (CH3COOH) Agua destilada (H2Od) 50mL 200mL

250mL 125mL 25mL 100mL

PREPARACIN DE BUFFER DE TRANSFERENCIA 10X (500mL) Tris-Base 15.15 g Glicina 72 g

PREPARACIN DE TBS 10X (500mL) Tris-Base (pH7.5) 12.11 g 200 mM Cloruro de Sodio 43.83 g 1.5 M

PREPARACIN TBS-T 1X 500 mL TBS 10X 50 mL H2Od 450 mL

50 mL 5 mL 45 mL

PREPARACIN DE SOLUCIN DE TRABAJO PARA TRANSFERENCIA (1L) H2Od 700 mL Metanol 200 mL

PREPARACIN DE MEM Usar todo el polvo inmediatamente despus de abrirlo. pH final = 7.3 1. Usar ~90% del volumen final a preparar de H2O a 15-20C. 2. Agitar el agua y agregar el polvo, seguir agitando hasta disolver NO CALENTAR. 3. Lavar el empaque con la solucin anterior y agregarlo a la misma. 4. Agregar 2.2g de bicarbonato de sodio [7.5% w/v] por cada litro de volumen final de medio preparado. Agitar hasta disolver. 5. Ajustar pH a 0.1 0.3 unidades por debajo del deseado (se incrementar al filtrar). Se recomienda usar 1N HCl o 1N NaOH. 6. Agregar agua adicional para completar el volumen final. 7. Esterilizar mediante filtracin. 8. Almacenar en contenedores esteriles.

Preparacin de Marcador Molecular + Pst I Para 300L de Marcador de Peso Molecular utilizar: H2O mQ 157.0L Buffer NEB 3 (10X) BSA NEB (100X) DNA fago NEB [500ng/L] Enzima PstI NEB(20U/L) 1. 2. 3. 4. 30.0L 3.0L 100L 10.0L 160L 30L -----------------[250ng/L] 200L 10L

Agregar los reactivos en un tubo epp Mezclar perfectamente con vortex y dar spin Incubar toda la noche a 37C Tomar una muestra de 8-10L de la digestin y visualizar en gel de agarosa 2%. Verificar el corte total de la muestra. 5. Si la digestin es total, agregar 50L de jugo azul 6X y mezclar. 6. Alicuotar en de 25-50L, etiquetar y almacenar a -20C En caso de ser parcial la digestin, agregar 5L ms de enzima e incubar de 2h a toda la noche a 37C y verificar el corte nuevamente.

FIJACIN DE DISCOS IMAGINALES Se utilizan larvas del tercer estadio, se disectan con la ayuda de pinzas y agujas de diseccin en una gota de PBS pH8 PBS1X NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g Disolver en 1L de agua Los discos imaginales se colocan durante 3min en PBS 1X y se fijan en una solucin de glutaraldehido al 0.75% preparado en PBS 1X. Posteriormente, se lavan varias veces en PBS 1X y se montan en glicerol al 40% para su posterior observacin.

INMUNODETECCIN EN DISCOS 1. Los discos previamente fijados en glutaraldehido fueron rehidratados con 200L de metanol de 30%; 50%; 70% y 100% (v/v) con PBS y se dejan 5min en cada solucin en rotacin a 50rpm. 2. Se eliminan los sobrenadantes y se permeabilizan durante 1h usando 200L de PBT (PBS+TritonX-100 0.1%) y se dejan en el brazo de rotacin a 50rpm. 3. Al terminar la incubacin se elimina el sobrenadante 4. La solucin de bloqueo (500L de PBT+BSA 10%) se aade a los discos y se incuban 1h/TA/50rpm 5. Se retira la solucin de bloqueo, y se agrega 60L del anticuerpo primario a los discos dejndolos a 4C durante toda la noche. 6. Se retir el anticuerpo primario y los discos se lavan rpidamente por inversin con 500L de PBT y 3 lavados de 30min con 500L de PBT en el brazo de rotacin a 50rpm 7. Se elimina el sobrenadante y se agregan 60L del anticuerpo secundario-------------------------------- y se incuba 3h/ TA/50rpm cubriendo los tubos con aluminio (el anticuerpo se encuantra acoplado a un fluorocromo) 8. Realizar lavados con 500L de PBT, uno rpido por inversin y 2 de 30 min cada uno en el brazo de rotacin a 50rpm, posteriormente se elimina el PBT y se da un lavado rpido con 500L PBS+TWEEN20 (0.05%) 9. Eliminar el PBS+TWEEN20 (0.05%) y agregar suavemente 500L de PBS/etanol (v/v) al 30%; 50%; 70% y 100% durante 2min en cada solucin agitando por inversin en el brazo rotatorio a 50rpm. 10. Agregar 60L de glicerol 40%

DECORIONIZACIN 1. Colocar los embriones en cloro al 4% por 3min (antes de poner los embriones en cloro, tener listos los tubos con la mezcla del paso 3) 2. Pasar los embriones atravs de un filtro/embudo para ser lavados con agua destilada y posteriormente se enjuagan con una solucin de Titrn X-100 al 0.03% / NaCl 0.4% 3. Enjuagar nuevamente con agua destilada los embriones decorionizados, se colocan en un tubo de 1.5mL que contiene una solucin de 500L de heptano, 100L formaldehido y 400L de Buffer PIPES 0.1M pH 6.9 para su fijacin durante 20min en el brazo de rotacin a 50rpm. (antes de comenzar los lavados poner las soluciones en los tubos) DESVITELINIZACIN 4. Se retiran las soluciones a los embriones cuidadosamente procurando no desechar los embriones en este proceso y agregar 500L de heptano y 500L de metanol absoluto y se coloca en le brazo de rotacin 5min/50rpm 5. Lavar los embriones aadiendo 500L de metanol absoluto y agitar en brazo de rotacin 10min/50rpm (repetirlo 3 veces) o hasta que los embriones se depositen fcilmente en el fondo del tubo. Sacar todo el metanol y aadir 200L de metanol. 6. Los embriones fijados por este procedimiento se almacenan a -20C mnimo una noche antes de ser utilizados, e incluso pueden utilizarse si tienen mximo 2 meses de almacenamiento.

INMUNODETECCIN EN EMBRIONES 1. Los embriones almacenados en metanol se rehidratan, reemplazando sucesivamente el metanol con 500L de soluciones de 30%; 70%; y 100% metanol/PBS (v/v). Agitar por inversin y dejar 5minutos en cada una de las soluciones a 50rpm. 2. Eliminar sobrenadante y permeabilizar durante 1h usando 500L de PBT (PBS + TritnX-100 0.1%), dejndolos a 50rpm. 3. Eliminar el sobrenadante y aadir 500L de PBT + BSA 10% preparada al momento; bloquear con esta solucin TA/1h/50rpm. 4. Retirar solucin de bloqueo y agregar 30L (o volumen suficiente para cubrir los embriones) del anticuerpo primario diluido en PBT + BSA 1% preparado al momento, agitar por pipeteo e incubar 4C/toda la noche. (clculos para anticuerpo primario) 5. Retirar anticuerpo primario y lavar embriones rpidamente por inversin con 500L de PBT y 3 lavados con 500L de PBT 30min/50rpm. 6. Eliminar sobrenadante y agregar 20L del anticuerpo secundario diluido en PBT + BSA 1% preparado al momento, mezclar mediante pipeteo e incubar TA/3h. **proteger tubos con aluminio si se usan anticuerpos acoplados a fluorocromos. 7. Realizar lavados con 500L de PBT, uno rpido por inversin y dos ms de 30min/50rpm. 8. Eliminar el PBT y dar lavado rpido con 500L PBS + Tween 20 (0.05%) 9. Eliminar PBS+Tween 20 (0.05%) y agregar sucesivamente 500L de PBS/etanol (v/v) al 30%; 50%; 70% y 100% por 2min/50rpm cada solucin. 10. Agregar 60L de PBS 60% glicerol / 40% PBS.