PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE V BOTANICE

1) Princip metody

Petr Koutecký, 2012

Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických

oborů PřF JU

Turn on lasers, turn on flow,

Turn on lasers, turn on flow.

…

When not at leisure, here’s what I treasure:

It gives me plesure quickly to measure

Cell as they go, cells as they go,

…

They scatter light, and absorb, and fluoresce;

All this can be quantified with sucess.

…

(H. Shapiro, 2003,“Largo al FACStotum“)

3 / 51

Průtoková cytometrie

► Metoda studující optické vlastnosti částic (cyto- = buňky) při ozáření určitým světlem» typicky laser (lasery)

» měření rozptylu světla a intenzity fluorescence

► Vzorky jsou ve formě suspenze, částice postupně protékají měřícím bodem

► Metoda vznikla primárně pro analýzu krve v medicíně» dodnes nejčastější použití

» nejvíce ovlivňuje směřování výzkumu a metodické inovace

» … a taky komerčně dostupné aparatury

4 / 51

Historie

► Mějme na paměti: historie FCM je krvavá

http://www.siumed.edu/~dking2/intro/bldcells.htm

5 / 51

Historie

► První přístup - statické metody (scanning cytometry etc.)

► Před: vizuální hodnocení preparátů pod mikroskopem

► Automatizace procesu» měření nějaké optické vlastnosti v malé plošce preparátu

» systematické posouvání („skenování“) preparátu

» složení informace dohromady

► 30. léta 20. stol.» T. Caspersson – microspectrophotometer

» stanovení obsahu nukleových kyselin a případně proteinů měřením absorbance UV světla při 260, resp. 280 nm(primární motivace – odlišný obsah NK v normálních a abnormálních, tj. rakovinných buňkách)

6 / 51

Historie

► 1950, Swift H.: The constancy of desoxyribose nucleic acid in plant nuclei, PNAS 36: 643–654» analýza obsahu DNA v jádrech rostlin (Zea, Tradescantia)

barvených Feulgenovou reakcí, měřena absorbance

» důkaz konstantního množství DNA, násobky u různých typů buněk (gamety, somatické buňky), endopolyploidie [tento název ale později], označování 1C, 2C, 4C,…

» porovnání obsahu DNA dvou druhů [poměr, ne abs. množsví]

► 60. léta – první komerční přístroje (Zeiss), pokusy o auto-matickou klasifikaci krevních buněk a histologických preparátů (diagnóza rakoviny)

► postupně různá řešení rastrování obrazu, nástup fluores-cenčních barviv, zavedení počítačů,…

7 / 51

Historie

► pokud jde o stanovení velikosti genomu, vycházejí z tohoto přístupu 2 v současnosti používané metody:

► Feulgen (micro)densitometry» preparát s jednou vrstvou buněk, barvení Feul-

genovou reakcí (Feulgen & Rossenbeck 1924)• naštěpení DNA silnou kyselinou, na naštěpenou

DNA se váže tzv. Schiffova báze (basic fuschsin), po navázání se mění z bezbarvé na růžovou

» stechiometrický vztah (intenzita ~ obsah DNA)

» měření absorbance (větš. λmax = 560 nm), v mnoha bodech

» porovnání absorbance mimo jádra („blank“) a v jádře

» součet absorbancí přes celé jádro, průměr přes celý preparát

» porovnání se standardem o známém obsahu DNA

jádra Allium cepa a Abies alba

(Greilhuber 2008)

8 / 51

Historie

► pokud jde o stanovení velikosti genomu, vycházejí z tohoto přístupu 2 v současnosti používané metody:

► Image cytometry» podobná logika jako mikrodensitomerie, stejný chemický

princip

» místo měření jednotlivých bodů je CCD kamerou vyfocen obraz celého preparátu

» výpočet založený na porovnání intenzity jednotlivých pixelů

» mnohem rychlejší a asi i přesnější než tradiční mikro-densitometrie

► Greilhuber 2008, Ann. Bot. 101: 791–804 [densitometrie]

► Vilhar et al. 2001, Ann. Bot. 87: 719–728 [image cytom.]

9 / 51

Historie► Druhý přístup = měření částic v roztoku při průchodu měřícím

bodem (flow cytometry, Coulter volume,…)

► teoretický popis základního principu: A. Moldavan 1934

► první funkční přístoj ve 40 letech (Gucker et al. 1947)» počítal bakterie ve vzorku vzduchu, který byl unášen rychlejším

proudem filtrovaného vzduchu, pomocí mikroskopie v temném poli měřen rozpyl světla [v dnešní terminologii SSC]

» vývoj probíhal za 2. svět. války, sponzorován armádou USA

► od přelomu 40. a 50. let podobné přístroje na počítání krvinek (bez odlišení jednotlivých typů)

► ve 40. letech vyvinutí fluorescenčně značených protilátek,A. H. Coons (např. Coons et al. 1942, J. Immunol.45: 159–170)

► hydrodynamic focusing: Crosland-Taylor 1953

10 / 51

Historie

► 50. léta – W. Coulter, počítání krevních buněk metodou Coulter volume – měření elektrických, ne optických vlastností» suspenze buněk ve fyziologickém

roztoku

» roztok vodivý (ionty), vodivost buňky skoro nulová

» suspenze protéká malým otvorem → zvýšení odporu ve chvíli, kdy je v něm buňka; závisí na objemu buňky

» dodnes používáno v diagnostice (počítání krevních buněk) i výzkumu (>100 publ. na WOS za poslední 3 roky)

11 / 51

Historie

► 1965 – Rapid Cell Spectrophotometer (RCS), L. Kamentsky, IBM» klasický mikroskop s UV lampou, buňky tekly do zorného pole

kanálkem z boku (bez sheath fluid)

» stanovoval obsah DNA měřením absorbance při 260 nm a později i fluorescenci na 1 nebo 2 vlnových délkách

» z absorbance při 410 nm počítána analogie rozptylu světla [FSC v dnešní terminologii]

» koncem 60. let přidána možnost třídit vybrané buňky (syringe pump sorter)

► 1965 – popsán princip a sestrojen droplet sorter (M. J. Fulwyer)

12 / 51

Historie

► 1969 – fluorimetrické měření obsahu DNA (tj. měření fluorescence)» modifikovaná Feulgenova reakce (Van Dilla et al. 1969)» ethidium bromid (Dittrich & Göhde 1969) –

cytometr ICP (Impulscytophotometer), od roku 1970 komerčně prodávaný společností Phywe AG, Göttingen → dnes Partec

► cca od 1970 – využití laserů jako zdrojů světla, nové fluorescenční látky,… (1973 – PI, 1977 – DAPI)

► od 80. let zejména v medicíně zásadní zavedení fluorescenčně značených monoklonálních protilátek

13 / 51

Historie

► další vývoj už „jenom“ vylepšování» motivace – důkladnější analýzy v medicíně (hl. imunologie,

onkologie)

» výkonnější elektronika, přesnější měření, vyšší rychlost,…

» zavedení počítačů

» nové fluorescenční látky – měření fluorescence několika vlnových délek naráz, excitovaných jedním zdrojem

» zvýšení citlivosti – analýzy organel, virů, dokonce jednotlivých molekul,..

» měření dalších parametrů buněk (enzymová aktivita, pH, charakteristiky membrány, pronikání léčiv do buněk, exprese genů,…)

» zmenšení na „bench-top“ rozměry, nižší cena

14 / 51

► první analýza genomu rostlin (densitometrie) Swift 1950

► první FCM analýza rostliných jader: Heller F. O. (1973): DNS-Bestimmung an Keimwurzeln von Vicia faba L. mit Hilfe der Impulscytophotometrie. – Ber. Deutsch. Bot. Ges. 86: 437–441

» protoplasty připravené enzymatickým odbouráním buněčných stěn

» lýze protoplastů, barvení jader EtBr

» měřeno na ICP od firmy Phywe (Partec)

► popsání přípravy suspenze jader sekáním žiletkou:Galbraith et al. (1983): Rapid flow cytometric analysis of the cell cycle in intact plant tissues. – Science 220: 1049–1051

► masivní využití až od poloviny 90. let

Historie – měření rostlin

15 / 51

Průtkový cytometr v kostce

16 / 51

Průtokový cytometr v kostce

vzorek

zdroj světla» laser» UV lampa /

UV dioda

fluidika» pumpa» sheath fluid

kyveta

odpad

optika + počítač

17 / 51

Fluidika

► sheath fluid = destilovaná voda (příp. s trochou detergentu a NaN3)

» nebo fyziologický roztok

► vzorek vytlačován tlakem vzduchu, vyšším než tlak sheath fluid)» alternativa – píst („injekce“)

► v komůrce se vzorek dostávádo proudu sheath fluid

http://flowbook.denovosoftware.com/

18 / 51

Fluidika

Laminární proudění► citlivost na bubliny, nečistoty,…► rychlost hraniční vrstvy = 0,

pak se zvyšuje úměrně (R - r)2

Hydrodynamic focusing► zvýšení rychlosti toku zúžováním

kyvety► velmi úzký (~μm) core stream,

prostorová separace částic

f = rychlost (např. ml/s)

D = průměr kyvety

» zvýšení fsamp vede k rozšíření core stream = menší přesnost

d

Shapiro 2003

pozn.: Partec má opačnou orientaci

D f

fd

sheath

sampcore

19 / 51

Fluidika

Měřící bod (interrogation point)► v kapiláře kyvety (flow cell, flow

chamber), obvykle syntetický amorfní křemen (quartz), obdélní-kový nebo čtvercový průřez, typicky 100-200 x 200-400 μm

► stream-in-air – ve vzduchu pod otvorem komůrky, šířka ~50-100 μm

► microscope based“ uspořádání – vzorek prochází pod objekti-vem mikroskopu kolmo na jeho osu

http://flowbook.denovosoftware.com/

http://flowbook.denovosoftware.com/

20 / 51

Zdroje světla

Laser(Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation)

► různé typy, podle požadované vlnové délky► nejčastěji 488 nm (modrý) argon ion laser, případně

doplněný o 635 nm (červený) dioidový laser» toto uspořádání je dáno použitými fluorescenčními barvami –

většina je vyvíjena tak, aby byly excitovány právě těmito vlnovými délkami

► cytometr Partec CyFlow v naší laboratořimá 532 nm (zelený) frequncy-doubled diode-pumped YAG solid state laser» optimální excitace propidium iodidu,

maximum 536 nm (+ UV oblast)

http://www.mcb.arizona.edu/ipc/spectra_page.htm

21 / 51

Zdroje světla

Laser► monochromatické polarizované světlo► výchozí šířka paprsku ~1 mm► zaostřováno do eliptické oblasti cca 100 × 5-20 μm (delší

rozměr kolmý na směr proudění částic)► důvod: intenzita světla v paprsku laseru je nestejná, zhruba

Gaussova křivka (transverse emission mode: TEM00)

» pro osvětlení core stream je třeba využít jen střed, kde je intenzita ± stejná, aby všechny částice dostaly stejné osvětlení

» jde hlavně o rozměr kolmo na tok částic, aby částice v různě daleko od středu core stream byly osvětleny stejně

• v podélném směru méně důležité, všechny částice jdou stejně

22 / 51

Zdroje světla

Rtuťová výbojka► Mercury arc lamp, používáme typ HBO 100 [výkon 100 W]► Emisní spektrum zahrnuje několik výrazných čar, hlavně v

UV oblasti► Pro použití v cytometrii a

mikroskopii vybíráme jednuvlnovou délku pomocí optických filtrů» náš cytometr

Partec PA II vy- užívá barvivo DAPI, max. excitace při λ = 358 nm

http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/lightsources/mercuryarc.html

http://www.mcb.arizona.edu/ipc/spectra_page.htm

23 / 51

Měřené parametry

► Forward scatter (FSC) – rozptyl světla pod malými úhly» původní vlnová délka

• interakce fotonu a elektronu → předání energie elektronu a zánik původního fotonu → okamžité předání (téměř) celé energie novému fotonu → (téměř) stejná vlnová délka, ale „libovolný“ směr a fáze

• rozptyl je obecně do všech směrů, zaznamenáváme vždy jen část prostoru

• obecně platí, že rozptyl je nejsilnější ve vlnových délkách, kde nedochází k absorbci fotonů – a naopak

24 / 51

Měřené parametry

► Forward scatter (FSC) – rozptyl světla pod malými úhly» původní vlnová délka

» malé úhly, cca < 10° od směru původního paprsku• z praktických důvodů se neměří blíž na cca 2°, původní (skoro)

nerozptýlené záření blokováno stínítkem

» informace o velikosti částice• vztah ale není lineární a asi ani monotónní (kromě objemu závisí i

na mnoha dalších vlastnostech částic – indexu lomu, absorbci,…)

► Side scatter (SSC) – rozptyl světla pod velkými úhly» větší úhly než FSC, obecně > cca 20°, typicky kolmo na

původní paprsek (90°)

» souvisí s velikostí částic a jejich vnitřní (např. granularita) a povrchovou strukturou

25 / 51

Měřené parametry

► Absorbance» zeslabení intenzity záření původní vlnové délky

» obvykle počítáno z opaku, tj. transmitance (podíl prošlého záření oproti původnímu)

» dnes v průtokové cytometrii používáno málo, spíš v minulosti (např. měření obsahu DNA pomocí absorbance při λ = 260 nm, měření hemoglobinu při λ = 420 nm)

► Fluorescence» nejdůležitější a nejčastěji používaný parametr

0II

-log T log- A

26 / 51

Měřené parametry

► Fluorescence» absorbce fotonu vhodné vlnové délky,

excitace elektronu do vyšší energe-tické hladiny

» ztráta části energie bez vyzářenífotonu (vibrační stavy apod.) – řádověběhem pikosekund (10-12 s)

» vyzáření fotonu, obvykle menší energie, tedy větší vlnové délky, než měl excitující foton – řádově během nanosekund (10-9 s)

» průchod částice světelným paprskemv cytometru řádově delší (mikrosekundy, 10-6 s)

http://en.wikipedia.org/

27 / 51

fluorescein

http://www.invitrogen.com/

Měřené parametry

► Fluorescence» rozdíl mezi excitačním a emisním maximem = Stokes shift

» emisní a excitační spektrum často zrcadlového tvaru

» potřebujeme, aby emisní spektrum (skoro) nezahrnovalo excitační vlnovou délku (kvůli měření rozptylu)

Stokes shift488 nm laser

28 / 51

Detekce světla

► Ortogonální uspořádání» prakticky všechny cytometry

využívající lasery

► Uspořádání jako fluorescenčnímikroskop» u nás cytometr Partec PA II

» epi-illumination

» světla od zdroje (HBO lampa)prochází stejnou čočkou, kterásbírá signál (objektiv mikroskopu),osvětlení podle Köhlerova principu

http://en.wikipedia.org/

29 / 51

Detekce světla

► objektiv s velkou numerickouaperturou (světelností)» snaha posbírat co nejvíce světla

» většinou „high-dry“ objektivy, schopné posbírat světlo z kuželeo vrcholovém úhlu max. 78°, tj. asi 11% světla vyzářeného doprostoru

» některé cytometry mají kyvetu a objektiv pevně spojený optickým gelem → analogie imerzníhoobjektivu (max. vrcholový úhelcca 134°, tj. cca 30% světla)

Shapiro 2003

30 / 51

Detekce světla

Optické filtry► absorbční

» barevné sklo nebo plast, absorbuje určité vlnové délky» levnější, účinnější, ale nevýhodou je vlastní fluorescence filtru

► interferenční» sklo s tenkými vrstvou (vrstvami) dielektrického materiálu» v závislosti na tloušťce a počtu vrstev a vstupním úhlu světla

dochází k interferenci – některé vlnové délky projdou, některé se odrážejí (resp. v přímém směru se vyruší interferencí)

» často v podobě zrcadla (dichroic mirror) pod úhlem 45° (část záření prochází, část se láme o 90°)

» obvykle menší transmitance a větší propustnost pro filtrované vlnové délky než absorbční filtry, ale bez vlastní fluorescence, přesnější selekce vlnových délek → v praxi někdy doplňována i tenká absorbční vrstva za vlastním filtrem

31 / 51

Detekce světla

Optické filtry

► dělení podle propouštěných vlnovýchdélek» short pass

» long pass

» band pass

» neutral density filter• nemění vlnové délky, pouze celkově

zeslabuje intenzitu

» beam splitters• odráží malou část záření, bez selekce

vlnových délek (v podstatě není filtr;běžná součást cytometrů)

Shapiro 2003

32 / 51

Fluorescenční barviva (odbočka)

Fluorescenční barviva pro stanovení DNA► Propidium jodid

» interkalační barvivo (nespecifické vůči jednotlivím bázím), váže se i k RNA

» v komplexu s dsDNA asi 30× vyššífluorescence než volná látka

» max. excitace v komplexu s DNAλ = 536 nm (zelená), emisní maximum λ = 617 nm (oranžová)

► další DNA barviva bez specifity k jednotlivým bázím» ethidium bromid

» acridine orange (jiná fluorescences dsDNA a ssDNA a RNA!) http://probes.invitrogen.com/

http://www.sigmaaldrich.com

33 / 51

Fluorescenční barviva

Fluorescenční barviva pro stanovení DNA

► DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)

» váže se na skupiny AT párů (nejméně3 nebo 4 za sebou [odhady se různí])v malém žlábku dsDNA

» v komplexu s DNA cca 20× vyššífluorescence než volná látka

» max. excitace (v komplexu s DNA)λ = 358 nm (UV), emisní maximumλ = 461 nm (modrá)

» váže se i s RNA, ale slabší fluores-cence (cca 20%) a λmax ~ 500 nm

» vazba málo ovlivněna strukturouchromatinu – nízká cv

http://www.sigmaaldrich.com

http://probes.invitrogen.com/

34 / 51

Fluorescenční barviva

► další barviva se specifitou k bazím

» AT-selektivní:

Hoechst dyes (Hoehst 33258, 33342, …)

DIPI

» GC-selektivní:

mithramycin A

chromomycin A3 (= CMA)

olivomycin

35 / 51

Detekce světla

Příklady uspořádání filtrů► Partec PA II (HBO 100 lampa, detekce fluorescence DAPI)

» podle webu FCM labora-toře BÚ v Průhonicích

» náš konkrétnípřístroj to mátrochu jinak

435 nm LP

700 nm SP

heat protection

dichroic mirror, LP

400 nm SP

clona

36 / 51

Detekce světla

Příklady uspořádání filtrů► Partec CyFlow SL (532 nm laser, detekce fluorescence PI

+ SSC a FCS + max. 2 další fluorescenční kanály)» podle manuálu

firmy Partec

» náš konkrétnípřístroj to mátrochu jinak

37 / 51

Detekce světla

Fotoelektrický jev

► působením světla (fotonů) o dostatečné energii dochází k uvolňování elektronů do vnějšího prostředí (u vodičů – vnější fotoel. jev) nebo z valenčního do vodivostního pásu (u polovodičů – vnitřní fotoel. jev)

► energie fotonů musí být vyšší než prahová hodnota (energie nutná pro uvolnění elektronů z vazby)

► při zapojení do elektrického obvodu vzniká el. proud, jeho intenzita závisí na intenzitě záření

► právě tohoto jevu se využívá při detekci světla v cytometrii

38 / 51

Detekce světla

Fotonásobiče (photomultiplier tube, PMT)► fotokatoda► série elektrod (dynody) o

vzrůstajícím napětí► anoda

► mnohonásobné zesílení proudu(počet elektronů)» v praxi v FCM až 106×» závisí na rozdílu napětí – ovlivňujeme parametrem gain» kvantový výtěžek (počet elektronů / počet fotonů) do 30%

(pro krátké vlnové délky, pak klesá)

► konverze proudu na napětí → měření → zpracování signálu

Fotodiody – plovodičové, alternativa PMT – vyšší kvantový výtěžek, ale nemají gain → malé výstupní proudy

Shapiro 2003

39 / 51

Detekce světla

Měřené charakteristiky

► pulse heigth» intenzita

► pulse area► pulse width

» obě popisují průběh v čase

» lze použít pro oddělení „slepených“ částic (stejná intenzita, jiný časový průběh)

time

volta

ge

threshold

heig

ht

width

40 / 51

Zobrazení výsledků

► histogram» pro jeden parametr

» osa X = parametr(např. fluorescence)

» osa Y = počet částic

» lineární × logaritmická škála• vzdálenosti píků• CV (na log škále teoreticky

stejné u všech píků)• počty částic (lineární – peak

area; log – peak height)

41 / 51

Zobrazení výsledků

► 2D diagramy» dotplot

» pseudocolour plot

» contour plot

» density plot

» …

► 3D diagramy

► uložení do počítače» .fcs (Flow Cytometry

Standard)

» verze 2.0 × 3.0

42 / 51

Trigerring

► vyhodnocuje se jen signál surčitou intenzitou» vyšší než určitá úroveň

(threshold)

» odfiltrování šumu

► obvykle jeden z měřených parametrů » označován leading trigger nebo discriminator

» částice s nižší intenzitou se nezaznamenávají

» v našich aplikacích fluorescence

» v imunologii často FSC / SSC• při detekci imunofluorescence jsou zajímavé i negativní buňky

43 / 51

Citlivost přístroje

► různé zdroje šumu» fluktuace ve zdroji světla

» fluidika

» autofluorescence

» elektronika

» …

► jednotky MESF» molecules of equivalent soluble fluorochrome

» kalibrační částice se známým počtem molekul → kalibrační přímka → detekce stejných částic bez barviva (např. FSC) → výpočet odpovídající intenzity fluorescence

» možná absolutní jednotka v histogramech (osa X) ?

Shapiro 2003

44 / 51

Přesnost měření

► koeficient variance (CV)» vyjadřuje variabilitu v hodnotách daného parametru

» směrodatná odchylka / průměr

» pro stejné částice teoreticky 0 (žádná variabilita), v praxi >0%; pro měření DNA pokud možno pod 3%

► FWHM (full width at half maximum heigth)» odhad s.d., vychází z tvaru Gaussovy křivky,

s.d. ~ FWHM / 2.36

► linearita» do jaké míry odpovídají naměřené intenzity

skutečným násobkům (např. G1 vs. G2 fáze;„slepená“ jádra či kalibrační částice)

» u našich přístojů do cca ± trojnásobku

45 / 51

Gating

► výběr jen části pozorování podle určitého kriteria» automaticky × ručně

» kombinace různých parametrů

» lze v několika stupních• data → výběr (např. FSC × SSC) → výběr z výběru (např.

fluorescence) → výpočet

► např. výběr určité buněčné populace pro další analýzu

46 / 51

(Spektrální) Kompenzace

► měříme více parametrůnajednou» např. fluorescence

různých látek, překryvspekter, viz příklad:

FITC (fluoresceinisothiocyanate) + R-phycoerythrin

» ve žluté oblasti (PE)má určitou fluorescenci i FITC → signál i v nepřítomnosti PE

• a symetricky naopak

» fluorescenci „nechtěné“ barvy je třeba „odečíst“• z tvaru křivky lze spočítat, kolik světla (% maxima) je na dané

vlnové délce → suma přes rozsah vln. délek → toto se odčítá• vzájemně pro každou barvu – sada n rovnic o n neznámých…

http://www.invitrogen.com/

47 / 51

Třídění (sorting)

► možnost vybrat ze suspenze částice určitých vlasností» na základě rozptylu, fluorescence,…

» definujeme určitý rozsah parametrů (gate) pro vybírané částice

► obecně tři kroky» měření

» rozhodnutí, zda nás daná částice zajímá - sorting decision (na základě daných parametrů)

» vlastní třídění

► třídit lze skoro cokoliv» buňky

» organely

» chromosomy

» …

48 / 51

Třídění (sorting)

Droplet sorting

► stream-in-air uspořádání► proud kapaliny ve vzduchu nestabilní → rozpad na řadu

kapek, ± chaoticky► při aplikaci vibrací určité frekvence vznikají kapky pravidelně

» piezoelektrický jev – mechanická deformace krystalu (určité typybez centra symetrie) → vznikelektrického náboje na plocháchkrystalu → při návratu zpět vznikelektrického proudu

» funguje i opačně – aplikace stří-davého proudu → vibrace o stejné frekvenci

49 / 51

Třídění (sorting)

Droplet sorting

► rozpad proudu na kapky v konstantnívzdálenosti (~ mm)

► konstantní rychlost (~ 10 m / s)

► konstantní vzdálenost mezi kapkami(řádově stovky μm)

► přesná synchronizace» čas od průchodu měřícím bodem

po oddělení kapky » čas mezi oddělením kapek

http://www.gene-quantification.de/single-cell-handling.html

f v

50 / 51

Třídění (sorting)

Droplet sorting

► nabití proudu těsně před oddělením kapky se zájmovou částicí

► po oddělení nese kapka určitý náboj

► rozdělení kapek podle náboje mezidvěma opačně nabitými destičkami(deflection plates)

► současné přístroje řádově 10 000 částic / s (teor. do 100 000 / s)» limit daný rychlostí elektroniky +

vynechání částic (i chtěných) jdoucích těsně za sebou» fyzikální limit pro tvorbu kapek cca 250 000 / s

http://www.gene-quantification.de/single-cell-handling.html

51 / 51

Třídění (sorting)

► droplet sorting» v současnosti nejčastější, nejrychlejší

» nevýhodou tvorba aerosolů (problém u rizikového materiálu, např. nakažlivé choroby v medicíně)

► fluidic switching» několik různých provedení

» principem vždy změna prouděnísheath fluid při třídění

» pomalejší než droplet sorting (stovky částic / s), ale obvykle uzavřené fluidické systémy

Sha

piro

200

3