Quantitative Real-time PCR
Andrea MinutiDepartment of Animal Science, Food and Nutrition - DIANA
Proteomics and Nutrigenomics Research Center - PRONUTRIGEN
quantitative Real-time PCR
Simultanea amplificazione e quantificazione del DNA target
AMPLIFICAZIONE: classica reazione PCR
QUANTIFICAZIONE: composti la cui fluorescenza emessa ad ogni ciclo di reazione è proporzionale alla quantità di amplificato
quantitative Real-time PCR
Per ogni campione si ottiene una curva di amplificazione e il relativo CT (Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità di
DNA iniziale
Gene expressionSample
RNA extraction
RNA quality assessment
Retro trascription using precise amount of RNA
cDNA dilution (1:4 cDNA:water)
PCR with a precise amount of cDNA
PCR performance and data checking
Normalization and data transformation
Statistical analysis and data interpretation
Mix little amount of cDNA from samples (dilution 1:2)
Build the standard curve(1:2 or 1:10 dilution, 6 or 7 points)
Primers design
Primers validation
Validation of Internal Control Gene
Total RNA composed of:- Ribosomal RNA (rRNA) = ca. 80%
18S and 28S for mammalian rRNA- Transfer RNA (tRNA) = ca. 15%- Messenger RNA (mRNA) = 1-3%
our target!
Experion™Stazione automatizzata per elettroforesi su gel
Quantificazione di acidi nucleici
Integrità RNA quality indicator
RQI (0-10)
>7 5-7 <5
Quantitative Real Time PCR
Fleige and Pfaffl, Molecular Aspects of Medicine, 2006
La qualità è importante
enzima che aggiunge sequenzeripetitive di DNA non codificante,TTAGGG nei telomeri:
NON presente nelle cellule somatichePresente in:cellule germinalicellule tumoralicellule staminali
Telomerase activity
Capuco et al., Experimental Biology and Medicine. 2009, 234:475-482.
Our friend MIQEMinimum Information for publication of Quantitative
real-time PCR Experiment
Bustin et al., Clinical Chemistry 55:4 (2009)