4,5-Diarylisoxazole Hsp90 Chaperone Inhibitors: Potential Therapeutic Agents for the Treatment of Cancer Chaperona Hsp90 (ayudar al plegamiento de otras proteínas recién formadas en la síntesis de proteínas), para funcionar se le debe unir el ATP. En cancer se ha visto que su la funcion de la Hsp90 esta alterada. Inhibidores de la Hsp90 se unen en el sitio donde naturalmente se une el ATP. El problema de estos inhibidores es que la solubilidad, biodisponibilidad limitada. Compuesto 6, inhibidor de la Hsp90, (rojo: pirazol) actividad antiproliferativa importante. Química El modo de unión de esta familia de compuestos es la fracción resorcinol, presente en el compuesto 6. Interacción del compuesto 6 y la Hsp90 El resorcinol se une profundamente en el bolsillo, donde el 4'-hidroxilo desplaza una de las cuatro moléculas de agua que median la unión del sustrato en la región unión de adenina. Ambos grupos hidroxilo fenólicos y los átomos N del anillo de pirazol, forman una red de uniones de hidrógeno con el carboxilato del residuo clave Asp93 y los grupos polares o las moléculas de agua circundantes Figura 6. Estructura obtenida por Rayos X del compuesto 6 ligado al sitio de unión de la Hsp 90 a humana. Las esferas rojas representan las moléculas de agua estructuralmente conservadas.
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4,5-Diarylisoxazole Hsp90 Chaperone Inhibitors: Potential Therapeutic Agents for the Treatment of Cancer
Chaperona Hsp90 (ayudar al plegamiento de otras proteínas recién formadas en la síntesis de proteínas), para funcionar se le debe unir el ATP.En cancer se ha visto que su la funcion de la Hsp90 esta alterada.Inhibidores de la Hsp90 se unen en el sitio donde naturalmente se une el ATP. El problema de estos inhibidores es que la solubilidad, biodisponibilidad limitada.Compuesto 6, inhibidor de la Hsp90, (rojo: pirazol) actividad antiproliferativa importante.
Química
El modo de unión de esta familia de compuestos es la fracción resorcinol, presente en el compuesto 6.
Interacción del compuesto 6 y la Hsp90
El resorcinol se une profundamente en el bolsillo, donde el 4'-hidroxilo desplaza una de las cuatro moléculas de agua que median la unión del sustrato en la región unión de adenina. Ambos grupos hidroxilo fenólicos y los átomos N del anillo de pirazol, forman una red de uniones de hidrógeno con el carboxilato del residuo clave Asp93 y los grupos polares o las moléculas de agua circundantes
Figura 6. Estructura obtenida por Rayos X del compuesto 6 ligado al sitio de unión de la Hsp 90 a humana. Las esferas rojas representan las moléculas de agua estructuralmente conservadas.
La estrategia para optimizar la actividad in vivo de las series fue enfocarse en el SAR en tres distintas aéreas de la molécula.
1. Incorporación de un grupo de solubilización en los substituyentes 4-arilpirazole (rojo). 2. La modificación del heterocilo pirazol central (azul). 3. La optimización del sustituyente 5 en el anillo de resorcinol (verde).
Análisis Farmacocinéticos
Dosis conjuntas en animales con tumores transplantados: Administración multiple y simultanea de varias drogas a un mismo animal, luego se analizan la sangre con espectrofotometria.
1. Incorporación de un grupo de solubilización en los substituyentes 4- arilpirazole (objetivo: aumentar solubilidad)
Síntesis: Las posiciones meta y para del grupo arilo adjunto a la posición 4 del pirazol, apuntaban ser solventes, por lo que deberían ser
sitios adecuados para la incorporación de un grupo solubilizante. Para la síntesis de inhibidores pirazólicos de Hsp90 (19 y 20), se incorporaron fracciones CH2-amina, como grupo solubilizante.
a. Acilación regio selectiva de Friedel- Craftb. hidroxilos fenólicos fueron protegidos con grupos bencílicosc. Reacción de un intermediario enolato sódico con dietil oxalato, que otorgó el ceto-enol éster (12). d. hidrato de hidrazina en ácido acético para formar el heterociclo pirazólico (13)e. yodación en la posición 4 del pirazol, con N-yodosuccinamidaf. Saponificación del etiléster g ,h. Rxn con etilamina para obtener la etilamida.I, j. Reacción de acoplamiento- cruzado Suzuki catalizada con paladio con ácidos p- ó m-formilfenilborónico.K, L. Aminación reductiva con varias aminas, seguida por hidrogenación para eliminar los grupos bencilo.
ResultadosTable 1. Datos del ensayo de Unión (FP) e inhibición del crecimiento celular
(SRB Assay) para diarilpirazol aminometila
a: Valores son reportados como el promedio de al menos dos determinaciones independientes.
Para substituyen tes en la posición para del grupo 4-aril, en algunos casos, tanto la potencia de la enzima y los valores GI50 celulares (19e y 19 f) fueron similares a los del compuesto (6).
Los compuestos con grupos aminometil en la posición meta (20a-i), ninguno de los ejemplos igualo la afinidad del compuesto 6 en el ensayo FP óen el ensayo de inhibición del crecimiento celular con células HCT116.
Así, aunque la estructura cristalina del compuesto 6 sugirió que había espacio para introducir grupos solubilizantes fuera del sustituyente 4-aril, pareció que la regioquímica y la naturaleza del grupo solubilizante tuvo un efecto en que tan bien esta sustitución era tolerada en estos análogos de pirazol.
2) La modificación del heterociclo pirazol central (objetivo aumentar potencia antiproliferativa)
Síntesis de compuesto 33, isoxazol (rojo) análogo al pirazolEl cambiar N por un 0 permitió mayor unión, mayor potencia antiproliferativa. Cuando se le ponen sustituyentes para al anillo de isoxazol aumenta su potencia.
3) Optimización del sustituyente en la porción 5` del anillo de resorcinol (mejorar la afinidad de unión)
Al sustituir en esta posición, es posible inducir un cambio de conformación en la proteína, al formar una hélice entre los residuos 104 y 111, con lo cual se genera una bolsa lipofílica en el sitio de unión del ATP, de la proteína Hsp90. Todos los análogos 5` se sintetizaron a partir de intermediarios clave.
La adición de un cloro o un etilo de la posición 5´del resorcinol, resulta en un aumento (20 veces mayor) de la afinidad de unión para ligandos análogos a 6. Esto porque el cloro o el etilo interactúan en el borde de un bolsillo lipofílico. Esta también es una región flexible que permite acomodar grupos grandes, por un cambio conformacional. La posición 5´ tolera una gran variabilidad estérica.
Grupos como fenetil y fenil mantienen una afinidad de unión similar a los análogos clorados así como los sustituidos con alquilos pequeños. Estos muestran una gran potencia en los ensayos de inhibición de crecimiento celular, de particular interés el análogo 5´-isopropilo 40f.
Para evaluar importancia de las porciones –OH en el resorcinol, se recurrió a la síntesis de diferentes análogos del compuesto 5´ etilo O-metilados. La O-metilación en C2´ causó una gran caída en la afinidad de unión, en tanto la O-metilación en C4´ fue tolerada.
Durante todo el proceso de optimización se obtuvieron estructuras por cristalografía de rayos X de los ligandos unidos a la Hsp90a, para confirmar que al elaborar 6 y 40f, no se alteró el modo de unión de los ligandos. La información estructural de 40f, señala un modo de unión equivalente, comparando a con 5,6 y 33. Se dan puentes de H así como la interacción con moléculas de agua. Al reemplazar el cloro en el anillo de resorcinol en 6 o 34d, por un grupo isopropilo en 40f, se añade una interacción adicional hidrofóbica, en el bolsillo lipofílico flexible y otras interacciones hidrofóbicas adicionales gracias a la porción morfolino presente en 40f.
Para establecer que los nuevos ligandos mantenían el carácter inhibitorio hacia la Hsp90, se hizo un análisis por por Western Blots (con 1 y 2 veces la concentración GI50) en células HCT116 in vitro. El efecto de los ligandos en marcadores celulares muestra que los pirazoles 6 y 19e, isoxazoles 33, 30d y 40f, condujeron a una depleción de las proteínas Raf-1 y Her2, así como una inducción de la Hsp72.
Al disminuir la expresión de la Hsp90, la proteínas sustrato son susceptibles a mayor degradación, con lo cual entonces Raf-1 y HER-2 disminuyen su concentración. Esto se traduce en un aumento en polipéptidos producto de dicha degradación, lo cual induce un aumento de la Hsp72, para facilitar su eliminación.
• Raf-1 Pertenece a la familia de quinasas Raf. La unión
con otros complejos proteicos, generan cambios conformacionales que aumentan actividad quinasa, lo cual estimula vías de señalización.
• HER2 La proteína HER2, también llamada receptor
HER2, se encuentra sobre la superficie de algunas células normales del cuerpo. En las células normales, la proteína HER2 ayuda a enviar señales de crecimiento desde el exterior de la célula hacia el interior de la misma. Estas señales le indican a la célula que crezca y se divida.
• Hsp72La proteína Hsp72 juega un rol central en el
mecanismo que permite que las células se liberen de polipéptidos mal plegados o incompletamente sintetizados inducidos por el estrés, que de otra manera interferirían con las funciones celulares normales. De este modo, Hsp72 juega un rol fundamental en la mantención de la homeostasis celular y en la protección celular de condiciones estresantes y aumenta la supervivencia celular.
Resultados
El análogo isopropilo 40f mostró claramente la razón más alta de concentración tumoral a GI50
celular (hasta 35 veces), con una vida media de 9.5 horas en el tumor, por lo cual se utilizó para estudios ulteriores. Este derivado isoxazol demostró efectos antiproliferativos potentes, una variedad de líneas de células cancerosas humanas. En todas se observó la depleción de proteínas cliente así como la inducción de la Hsp72. La tasa de crecimiento tumoral fue inhibida significativamente tras la administración de 40f y el peso de los tumores tratados tras el día 12, correspondió a un 49.8% de los valores control.
Conclusiones
El compuesto 40f muestra una potencia excelente contra la Hsp90 en un ensayo de unión FP (IC5o= 21nM) e inhibe la proliferación en una gran cantidad de líneas cancerosas celulares humanas , con un GI50 promedio de 9nM. Las células tratadas mostraron la señal característica de inhibición de la Hsp90, asociada a una elevación de la Hsp72 y una degradación de proteínas oncogénicas cliente. También mostró una excelente eficacia en un grupo de modelos de transplantes tumorales humanos subcutáneos y ortotópicos, que cubren la mayoría de tipos de cáncer y perfiles oncogénicos diversos. Actualmente hay en estudio en fase I, una formulación I.V. del compuesto 40f.
