Rapport final bourse Projet Aubier Primequal 2
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RAPPORT FINALPROGRAMME PRIMEQUAL 2
TITRE DU PROJET
Rôle des interactions particules diesel-fumée de cigarette dans la physiopathologie desremodelages bronchique et alvéolaire de la bronchopneumopathie chronique obstructive(BPCO)
RESPONSABLEProfesseur Michel Aubier
1. INTRODUCTION
La broncho-pneumopathie chronique obstructive (BPCO) est une pathologie pulmonaireinvalidante, caractérisée par un remodelage bronchique et alvéolaire. La fumée de cigarette
est le principal facteur de risque pour développer une BPCO. Des études épidemiologiquessuggèrent que la pollution atmosphérique pourrait aggraver l’évolution de cette maladie.
Cependant, les mécanismes à l’origine de cet effet ne sont pas connus actuellement.
L'objectif de ce projet de recherche est d'investiguer le rôle de la pollution particulaire dans laphysiopathologie de la BPCO, en regardant son effet propre et associé à la fumée de cigarette
sur le remodelage pulmonaire caractéristique de cette maladie. La place du stress oxydant entant que mécanisme responsable des effets de la pollution particulaire sera également évaluée.
Le remodelage alvéolaire a été évalué à travers l’analyse de la balance
protéases/antiprotéases!(métalloprotéases de la matrice, leurs inhibiteurs et a1-antitrypsine)
dans les cellules épithéliales et les macrophages alvéolaires et le remodelage bronchique àtravers l’étude de la prolifération du muscle lisse bronchique. Des études in vitro et in vivo ont
été réalisées.
2. ETUDES IN VITRO
Ce rapport comporte le résultat d'expériences réalisées sur la lignée A549, lignée
représentative des pneumocytes de type II humains, sur des macrophages murins et sur descellules musculaires lisses bronchiques humaines en culture primaire. Par ailleurs, l’effet de la
fumée de cigarette a été comparé à celui de particules diesel, car ces particules représentent
des composants majeurs de la pollution atmosphérique urbaine.
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2.a. Matériel et Méthodes
Les cellules ont été exposées pendant des durées variables, de 3 à 24 heures, à des
concentrations croissantes de condensat de fumée de cigarette (10 à 100 mg/ml), avec et sans
exposition concomitante à une concentration fixe de particules diesel (20 mg/cm2). Cette
concentration est représentative de la concentration de particules de la pollutionatmosphérique trouvée dans l’atmosphère des grands villes de pays développés.
• La viabilité cellulaire a été évaluée par l'activité lactate-déshydrogénase (LDH) du milieu
de culture.
• L’expression des HO (HO-1, isoforme inductible en réponse à différents stimuli
générateurs de stress oxydant, et HO-2, isoforme d'expression constitutive) a été appréciéeau niveau de l'ARNm par RT-PCR, et de la protéine par immunoempreinte.
• Le stress oxydant a été mesuré par la détection de résidus 4-hydroxy-2-nonenal (4-HNE),
marqueur spécifique de la peroxydation lipidique. Ceci a été effectué parimmunohistochimie.
• L'expression des différents acteurs de la balance protéases/anti-protéases a été évaluée parRT-PCR.
• La prolifération de cellules musculaires lisses a été quantifiée par l’incorporation de
thymidine tritiée.
2.b. Résultats
I. Cellules A549
Viabilité cellulaire. L’exposition des cellules à 100 mg/ml de condensat de fumée de cigarette
pendant 24 heures entraîne une augmentation de l'activité LDH, témoin d’un certain degré detoxicité cellulaire (Figure 1). Des concentrations plus faibles de condensat et des
concentrations de particules diesel de l’ordre de 20 µg/cm2 n’entraînent pas d’effetsignificatif sur l’activité LDH (Figure 1). L’essentiel des expériences sur le contrôle de la
balance protéases/antiprotéases a été effectué en utilisant les concentrations non-cytotoxiques
de condensat de fumée de cigarette et des particules diesel, c’est à dire 10 µg/l et 20 µg/cm2
respectivement.
Expression de métalloprotéases de la matrice (MMPs). Nous avons axé notre étude surl’expression de la MMP-1, car cette protéase a été récemment impliquée dans la
physiopathologie de l’emphysème post-tabagique (1,2). L’utilisation de la RT-PCR semi-
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quantitative nous a permis d’observer une induction dose-dépendante de l’expression de
l’ARNm de la MMP-1 par le condensat de la fumée de cigarette et les particules diesel
(Figure 2a). Cet effet a été confirmé par RT-PCR quantitative (Figure 2b). L’augmentationd’expression est détectée dès 6 heures d’incubation avec les particules et elle est également
observée après 24 heures. En contraste avec ces résultats, aucun effet des particules diesel nide la fumée de cigarette n’est observé ni sur la MMP-2, ni sur les inhibiteurs endogènes des
MMP, les TIMPs, ni sur la cytokine pro-fibrosante, TGF-b (Figure 3).
Afin d’évaluer les mécanismes impliqués dans l’induction de la MMP-1 par les particules
diesel nous avons incubé les cellules avec un antioxydant, la N-acétylcystéine (NAC). Lesrésultats de ces expériences montrent que la NAC prévient l’augmentation de l’expression de
la MMP-1 induite par les particules diesel, ce qui souligne le rôle des oxydants dans
l’induction de cette protéase (Figure 4). Ce résultat est conforté par l’apparition d’unmarquage positif pour le 4-HNE, un marqueur de stress oxydant, dans les cellules exprimant
la MMP-1 (Figure 4, cellules en rouge).
La NADPH oxydase est une source importante d’oxydants dans les cellules épithéliales, et il a
été récemment démontré que les particules diesel peuvent activer cette enzyme (3). Nous
avons incubé les cellules A549 avec un inhibiteur de la NADPH oxydase, le diphenyleneiodinium (DPI) afin d’évaluer le rôle de la NADPH oxydase dans l’induction de la MMP-1.
Ces expériences montrent que le DPI inhibe l’induction de la MMP-1 par le condensat defumée de cigarette et les particules diesel, ce qui suggère un rôle des oxydants synthétisés par
la NADPH oxydase dans cette induction (Figure 5). Plusieurs isoformes de la NADPH
oxydase, appelées NOX, ont été mises en évidence récemment (4) (5). Nos résultats montrentl’expression de la NOX4 dans les cellules A549, et son induction par la fumée de cigarette et
les particules diesel (Figure 5). Ceci suggère que cette protéine pourrait être impliquée dansl’induction de l’expression de la MMP-1.
Ayant montré que les oxydants endogènes jouent un rôle dans l’induction de la MMP-1 par
les particules diesel, nous nous sommes intéressés aux voies de signalisation impliquées dansce phénomène. Nous avons commencé par regarder le rôle des «!mitogen activated protein
kinases!» (MAPK), protéine impliquée dans !les réponses adaptatives cellulaires aux
agressions exogènes. Nous avons évalué le rôle de 2 voies de MAPK, la voie des«!extracellular regulated kinases «!(ERK) et celle de la MAPK de 38 kD de poids moléculaire,
appelée p38. L’utilisation d’inhibiteurs spécifiques de ces 2 voies montre une diminutionsignificative de l’effet des particules diesel avec l‘inhibiteur d’ERK, mais pas avec celui de
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p38 (Figure 6). Ceci suggère que la voie NOX4-ERK serait impliquée dans l’induction de
l’expression de la MMP-1 par les particules diesel.
Nous sommes en train d’effectuer des expériences de western blot afin de confirmer cesrésultats et d’examiner le(s) mécanisme(s) moléculaire(s) impliqué(s) dans l’activation de la
NOX4 oxydase par la fumée de cigarette et les particules diesel.
Expression de l’alpha-1 antitrypsine (AAT). Une démarche similaire à celle utilisée avec la
MMP-1 a été entreprise afin d’évaluer l’effet de la fumée de cigarette et des particules diesel
sur l’expression de l’a-1 antitrypsine (AAT), principale antiprotéase impliquée dans la
neutralisation de l’élastase du neutrophile et dont le déficit est un facteur de risque pourdévelopper une BPCO (6). Des expériences de RT-PCR semi-quantitative effectuées sur la
lignée A549 ont montré une diminution de l’expression de cette antiprotéase lors de
l’incubation avec les particules diesel, mais non avec la fumée de cigarette. Ces résultats ontété confirmés et approfondis par des expériences de RT-PCR quantitative, qui ont montré une
diminution profonde et soutenue de l’expression de l’ARNm de l’AAT après 6 et 24 heuresd’incubation avec les particules diesel (Figure 7). Cette diminution est supprimée par la NAC,
ce qui suggère un rôle des oxydants (Figure 8). Des études sont en cours pour mieux
caractériser ce phénomène.
Effet de l’HO-1. Nous avons commencé par évaluer l’expression de l’HO-1 dans les cellules
exposées à la fumée de cigarette et aux particules diesel. Il existe une induction de l’HO-1dépendante de la dose de fumée de cigarette, avec un effet maximal à 100 µg/ml, que ce soit
en termes d'ARNm ou de protéine (Figures 9 et 10). L’exposition des cellules aux particules
diesel, à la concentration de 20 µg/cm2 induit également l’expression de l’HO-1 (Figure 9). Ilexiste d'autre part un effet synergique entre la fumée de cigarette et les particules diesel.
L'expression de l'ARNm de l'HO-2, isoforme constitutive de l'hème oxygénase, n'est pasmodifiée par une exposition à différentes doses de fumée de cigarette (résultats non-montrés).
Après avoir montré l’induction de l’HO-1 par la fumée de cigarette et les particules diesel
nous avons évalué si la surexpression de cette protéine prévient l’induction de la MMP-1.Pourcela, nous avons incubé les cellules A549 avec un inducteur de la HO-1, la cobalt-
protoporphyrine-IX (CoPP) (7).
Cette molécule entraîne bien l'induction de l'expression de l'HO-1 dès 3 heures d'incubation,ainsi qu'une diminution de l'activité LDH du surnageant en réponse à la fumée de cigarette
(résultats non montrés), mais, de façon surprenante, elle induit aussi per se une augmentation
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importante de l'ARNm de la MMP-1 (Figure 10). Ceci pourrait être dû à sa structure
protoporphyrique car il a été décrit dans la littérature que l'uroporphyrine, qui possède une
structure analogue au CoPP, potentialise l'induction de la MMP-1 dans des fibroblastes depeau en réponse à une irradiation UV (8). Afin de nous affranchir des effets du CoPP sur la
MMP-1, nous avons utilisé un autre inducteur de l'HO-1, le curcumin, épice qui a étédémontrée comme induisant l'HO-1 dans des cellules endothéliales (9).
Nous avons d’abord effectué une étude d’effet dose et effet-temps du curcumin sur
l’expression de la protéine HO-1. Les résultats de ces expériences montrent une induction del’HO-1 dès 6 heures d’incubation avec le curcumin, avec un plateau jusqu’à 18 heures et une
diminution ultérieure. L’effet maximal est observé pour une concentration de 15µM (Figure
11). Nous avons donc utilisé 18 heures d’incubation à 15 µM pour traiter les cellules avantune incubation pendant 24 heures avec la fumée de cigarette plus ou moins les particules
diesel.
Les résultats de ces expériences montrent que le curcumin atténue l'augmentation de l'activité
LDH et de l’expression de la MMP-1 par la fumée de cigarette (Figures 12 et 13). Ceci
pourrait jouer en faveur d’un rôle protecteur de l’hème oxygénase face aux altérations de labalance protéases/antiprotéases entraînées par la combinaison fumée de cigarette/particules
diesel.
Le(s) mécanisme(s) impliqués dans ce phénomène ainsi que l’effet du curcumin sur
l’expression de l’a-1 antitrypsin sont en cours d’évaluation.
II. Macrophages murins
Effet de la co-exposition fumée de cigarette-particules diesel
Dans les cas des macrophages murins, nous avons représenté les résultats obtenus avec les
particules de noir de carbone, car elles ont parfois des effets propres.
L'exposition des cellules à la fumée de cigarette de même qu’aux particules diesel n’entraîne
pas d’augmentation significative de l'activité LDH du surnageant de culture (Figure 14). Les
particules de noir de carbone n'ont aucun effet. Cette absence d’effet cytotoxique de la fuméede cigarette et des particules de la pollution est visible aussi par évaluation de la viabilité
cellulaire après exposition aux différents composés (Figure 15). En effet, la fumée de
cigarette, de même que les particules diesel et de noir de carbone n'entraînent pas des
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modifications statistiquement significatives de la viabilité cellulaire par rapport aux cellules
contrôles après 3 et 24 heures d'exposition.
Ni condensât de fumée de cigarette, utilisé à la concentration de 10 µg/ml, ni les particulesdiesel (20 µg/cm2) n’induisent une expression de l’HO-1, en termes d'ARNm (Figure 16). Il
existe une induction statistiquement significative de l’HO-1 avec la combinaison de la fuméeet les particules diesel, ce qui traduit un effet synergique entre ces 2 composés.
L'exposition des cellules au condensât de fumée de cigarette n’entraîne pas d’augmentation
significative de la peroxydation lipidique, évaluée à travers la détection du 4-HNE partechnique d'immunohistochimie (les cellules positives apparaissent marquées en rouge). Les
particules diesel en revanche induisent une augmentation claire du marquage par l’anticorps
anti 4-HNE, et cet effet est potentialisé par la co-exposition à la fumée de cigarette (Figure17).
En ce qui concerne la balance protéases/antiprotéases, on n’observe pas d’effetstatistiquement significatif du condensât de fumée de cigarette et/ou des particules diesel sur
l’expression de l’ARNm de la MMP-9 (activité gélatinolytique, Figure 18). Il existe une
tendance à l’augmentation, mais elle n’atteint pas le seuil de significativité. En revanche, ilexiste une augmentation statistiquement significative de l’expression de la MMP-12 (activité
élastolytique) avec les particules diesel, qui est potentialisée par la co-exposition avec lecondensat de fumée de cigarette. (Figure 18). On n’observe pas de modification de
l’expression des TIMPs (Figure 19). Les premiers résultats d'évaluation d'activité
gélatinolytique du surnageant de culture par zymographie montre que la fumée de cigaretteentraîne une augmentation de l'activité gélatinolytique attribuable à la MMP-9 après 24
heures d'exposition (résultats non-montrés).
Effet de l’hème oxygénase
Nous avons d’abord vérifié, comme pour les cellules A549, l’inductibilité de l’HO-1 par le
curcumin sur les macrophages murins. Les résultats de ces expériences montrent uneinduction de l’expression protéique de l’HO-1 dès 6 heures d’incubation avec le curcumin,
avec un plateau jusqu’au 24 heures. L’effet maximal est observé pour une concentration de25µM (Figure 20). Nous avons donc utilisé 24 heures d’incubation à 25µM pour prétraiter les
cellules avant une incubation pendant 3 heures avec la fumée de cigarette plus ou moins les
particules diesel.
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Comme pour les cellules épithéliales, ce prétraitement a un effet protecteur vis-à-vis de la
cytotoxicité induite par les particules de la pollution atmosphérique en termes d'activité LDH
dans le surnageant de culture et de mortalité cellulaire, tout en sachant que l’augmentation dela LDH est moins importante dans les macrophages que dans les cellules épithéliales (Figure
21).
De façon paradoxale, l’expression de l’ARN messager de la MMP-12, évaluée par RT-PCR,
est augmentée de façon consécutive au prétraitement des macrophages par le curcumin
(Figure 22). À l’opposé, dans ces expériences on observe une augmentation de l’expressionde la MMP-12 par le condensât de fumée de cigarette, que n’est plus présent lors que les
cellules sont pré-traitées par le curcumin. Ces résultats correspondent à 2 et non 3 ou 4
expériences, comme pour les autres données et vont être vérifiés.
III. Cellules musculaires lisses
Des résultats similaires à ceux obtenus sur les cellules A549 ont été observés en ce quiconcerne la viabilité cellulaire et l’expression de l’HO-1 (résultats non-montrés).
L’incubation des cellules musculaires avec le condensat de fumée de cigarette diminue la
prolifération musculaire induite après stimulation par un mitogène (Platelet Derived GrowthFactor, PDGF) (Figure 23). Ce dernier effet n’est pas réversé par l’incubation avec un
antioxydant (la N-acetylcystéine, NAC) (Figure 24). L’incubation avec les particules diesel nemodifie pas significativement la prolifération musculaire. Cet effet anti proliféraif de la fumée
de cigarette est inattendu et il est contraire à notre hypothèse initiale. Des études sont en cours
pour mieux le caractériser.
3.ETUDES IN VIVO
Nous avons commencé par la mise au point du modèle de BPCO chez la souris exposée à lafumée de cigarette afin d’examiner l’interaction fumée-diesel et le rôle de l’HO.
Nous avons évalué 2 souches de souris!: Balb/C et C57/Bl6 car elles sont fréquemment
utilisées en physiopathologie pulmonaire. Des modèles de BPCO ont été décrits dans les 2souches, bien que majoritairement chez les souris C57/Bl6.
Les résultats de nos expériences montrent que les souris Balb/C ont une réponseinflammatoire moindre que celle de souris C57/Bl6, évaluée à travers la cellularité totale du
LBA et la balance MMPs/TIMPs pulmonaire. En effet, nous avons dû enfumer les souris
Balb/C 1 mois pour obtenir des modifications équivalentes à celles observées chez les souris
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C57/Bl6 au bout de 5 jours d’enfumage. La figure 25 montre la cellularité totale du LBA dans
les 2 souches de souris. La figure 26 montre le profil d’expression de l’ARNm de l’HO-1 et
des différentes protéases et antiprotéases au bout d’un mois d’exposition des souris Balb/C.Des résultats similaires ont été observés au bout d’une semaine chez les souris C57/Bl6
(résultats non montrés). Ces donnés montrent une induction de l’HO-1, témoignant d’uncertain degré de stress oxydant, et une induction des MMP-9, -12 et –14, ce qui permet en
quelque sorte de valider le modèle, car un profil similaire a été rapporté dans la littérature et
chez des patients emphysémateux.
Des études sont en cours pour évaluer l’effet de la modulation de l’expression de l’HO-1 sur
la balance protéases/antiprotéases
4. CONCLUSION
Les principaux résultats des études sur les cellules, en utilisant des concentrations non-toxiques du condensat de fumée de cigarette et des particules diesel, montrent!que!:
1. Les particules diesel potentialisent l’effet de la fumée de cigarette sur le stress oxydant
(évalué à travers la péroxydation lipidique et l’expression de l’HO-1) et sur ledéséquilibre protéases/antiprotéases.
2. L’effet sur la balance protéases/antiprotéases est différent selon le typecellulaire!examiné!: au niveau des cellules A549 les particules diesel augmentent
l’expression de l’ARNm de la MMP-1 et diminuent celui de l’a1 antitrypsine!mais au
niveau des macrophages ces particules augmentent l’expression de la MMP-12.
3. Le curcumin protège les cellules vis-à-vis de l’augmentation du relargage de LDH etdu déséquilibre MMPs/TIMPs des cellules A549. Par contre, il aurait un effet
inducteur propre sur la MMP-12 des macrophages.
Les résultats des expériences in vivo chez la souris montrent la mise au point progressive du
modèle d’enfumage.
Les études sur les cellules répondent globalement aux objectifs que nous nous sommes fixésen démarrant ce travail. Certains résultats étaient plus ou moins prévisibles (effets sur les
MMPs), alors que d’autres sont plutôt inattendus (diminution de l’expression de l’a-1
antitrypsine et de la prolifération du muscle lisse bronchique).
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Des études sont en cours pour mieux comprendre ces résultats. Quoi qu’il en soit, ces résultats
suggèrent que les particules de la pollution atmosphérique peuvent potentialiser les effets de
la fumée de cigarette sur l’appareil respiratoire et aggraver ainsi la BPCO post-tabagique. Ceteffet serait en rapport avec les propriétés oxydatives des particules.
5. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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