Review Karbohidrat Kelompok VI Far A

8/11/2019 Review Karbohidrat Kelompok VI Far A

http://slidepdf.com/reader/full/review-karbohidrat-kelompok-vi-far-a 1/23

TUGAS

KIMIA FARMASI KUANTITATIF

REVIEW:

ANALISIS KARBOHIDRAT

OLEH:

KELOMPOK VI FARMASI A

ANDI AMALIA AKO 70100111006

AYU TRY SARTIKA 70100111016

FEBRIYANTI HASDAN SALEH 70100111026

ILHAM ARIDANI 70100111037

MUH. LUTHFI AZAM 70100111046

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR

SAMATA-GOWA

2014



ANALISIS KARBOHIDRAT

Karbohidrat adalah salah satu bahan yang paling penting dalam makanan maupun

sebagai bahan mentah. Karbohidrat mungkin terjadi secara alami atau ditambahkan ke produk

makanan untuk menyediakan nutrisi serta untuk meningkatkan tekstur dan kualitas

keseluruhan dari produk pangan. Polisakarida alami dalam makanan merupakan bagian

intrinsik atau bawaan dari bahan baku. Misalnya, pati adalah zat karbohidrat terbanyak dalam

produk makanan, diikuti oleh pektin, hemiselulosa dan bahan dinding sel.

A. Anal isis Kandungan Total Gula

1. Penyiapan Sampel

Sebelum menganalisis untuk setiap kelas karbohidrat, apakah itu monosakarida

atau bahan selulosa tidak larut, sampel harus dipersiapkan agar menghilangkan zat

yang dapat mengganggu analisis. Untuk sampel yang sudah dasarnya larutan gula (jus,

madu) sangat sedikit persiapan sampel diperlukan. Untuk sampel lainnya, seperti

minyak biji, sereal atau makanan utuh, lemak, protein, pigmen, vitamin, mineral, dan

berbagai senyawa lainnya harus dihilangkan sebelum analisis.

2.

Uji Fenol-Asam Sulfat

a. Teori Reaksi

Pada asam kuat dan panas, karbohidrat menjalani serangkaian reaksi yang

mengarah pada pembentukan turunan furan seperti furanaldehyde dan

hydroxymethyl furaldehide. Reaksi awal, adalah reaksi dehidrasi diikuti dengan

pembentukan turunan furan yang terkondensasi atau senyawa fenolik untuk

menghasilkan warna gelap yang kompleks. Kompleks tersebut mengabsorpsi UV-

VI dan absorbansi setara dengan konsentrasi gula. Absorbansi maksimum pada490 nm untuk heksosa dan 480 nm untuk pentose dan asam uronat dengan

spektrofotometer UV-VI.



b.

Prosedur

Fenol, dalam larutan 5 atau 80% ditambahkan ke tabung reaksi yang berisi

larutan sampel yang jernih. Asam sulfat pekat ditambahkan dalam aliran cepat

langsung ke permukaan cairan dalam tabung reaksi. Campuran dilarutkan dan

dicampur dengan bantuan Vortex dan waktu yang cukup untuk memungkinkan

pengembangan warna. Solusi absorbansi dibaca pada 490 atau 480 nm

menggunakan spektrofotometer, tergantung pada jenis gulanya.

c. Kuantifikasi

Kurva kalibrasi dibuat dengan menggunakan gula yang diuji. Stok 1mg/ml larutan

gula standar digunakan untuk menyiapkan 5 atau 6 standar dengan range 10

hingga 100 µg/ml. Setiap standar diberi perlakuan sesuai prosedur yang diuraikan

di atas, dipindahkan ke kuvet, dan absorbansi yang dibaca pada 480 atau 490 nm.

Absorbansi kosong harus dikurangkan dari absorbansi standar manual, atau



kosong harus digunakan untuk spektrofotometer zero. Sebuah grafik absorbansi

vs konsentrasi dibuat dan jumlah analit diturunkan dari kurva kalibrasi.

d.

Penerapan

Metode fenol-sulfat banyak digunakan untuk menentukan konsentrasi total

karbohidrat dalam sampel. Hal ini dapat digunakan pada ekstrak bebas lipid dari

sereal, biji-bijian, dan tanaman. Selain itu, dapat digunakan untuk mengukur

monosakarida, oligosakarida, dan polisakarida. Metode ini memberikan hasil yang

paling akurat ketika diterapkan pada sampel yang mengandung hanya satu jenis

karbohidrat.

3.

Uji Anthron-Asam Sulfat

a. Teori Reaksi

Serupa dengan uji asam fenol-sulfat, metode antron didasarkan pada

kondensasi dari furaldehide derivatif, yang dihasilkan oleh karbohidrat dengan

adanya asam kuat, dengan reagen, yaitu anthron (9,10-dihidro-9-ozoanthracene),

untuk menghasilkan senyawa berwarna. Reaksi karbohidrat dalam lingkungan

asam kuat dengan hasil anthrone berwarna biru-hijau dan absorbansi dibaca pada

625 nm.

b. Prosedur

Campuran dingin dari 2% anthrone dalam asam sulfat pekat dicampur dengan

sebuah aliquot dari larutan sampel yang jernih mengandung gula yang diuji.

Setelah inkubasi dalam suhu yang dikendalikan dalam waktu tertentu untuk

memungkinkan pengembangan warna, larutan dituangkan ke dalam yang sesuai

kuvet spektrofotometri dan absorbansi diukur pada 625 nm.

c.

KuantifikasiSerupa dengan uji asam fenol-sulfat, reaksi anthrone adalah nonstoikemetrik dan

karena itu memerlukan pembangunan kurva standar untuk tujuan kuantitatif.

d. Penerapan

Metode anthrone-sulfat berlaku untuk larutan yang mengandung satu jenis

heksosa karena gula dengan struktur serupa menghasilkan angka yang berbeda

dan jumlah pembangunan warna. Gula lain, seperti pentosa dan asam heksuronat,

juga akan bereaksi untuk menghasilkan senyawa berwarna yang menyerap pada

panjang gelombang yang sama. Uji ini juga dapat digunakan untuk analisis

kuantitatif oligo-dan polisakarida yang hanya ada satu jenis dalam larutan.



4. Analisis Asam Uronat

Metode kolorimetri untuk menentukan asam uronic mirip dengan fenol-asam

sulfat dan uji anthrone didasarkan pada reaksi dari reagen dengan turunan karbohidrat

yang terbentuk dalam asam pekat.

a. Teori Reaksi – Metode m-Hydroxydiphenyl

Sementara semua karbohidrat bereaksi asam pekat membentuk senyawa berwarna,

asam uronic bereaksi dengan m -Hydroxydiphenyl dalam asam kuat lingkungan

untuk membentuk kompleks berwarna pink. Pengukuran absorbansi dibaca pada

520 nm meningkat secara linear dengan konsentrasi asam uronat dari 0 sampai

100 μg / ml.

b.

Prosedur Operasi

Sebuah solusi sampel dicampur dengan asam sulfat yang mengandung tetraborat

dalam tabung reaksi dan ditempatkan dalam bak air mendidih selama 5 menit.

Setelah pendinginan cepat dalam air es, m-Hydroxydiphenyl ditambahkan ke

masing-masing sampel uji tabung dan di-vortex untuk memastikan pencampuran

yang memadai. Absorbansi untuk setiap sampel dibaca setelah memungkinkan

warna untuk mengembang selama 20 menit. Sebuah sampel blanko (yang

mengandung pelarut sampel) harus disiapkan pada saat yang sama sebagai

sampel.

c. Kuantifikasi

Suatu larutan standar asam uronat yang sesuai (yaitu, asam galakturonat)

digunakan untuk menyiapkan beberapa pengenceran dan ini digunakan untuk

mempersiapkan kurva standar. Sebuah grafik konsentrasi vs absorbansi dibuat dan

pembacaan absorbansi sampel diplot sepanjang kurva untuk mendapatkan nilai

konsentrasi. Kurva standar biasanya berkisar dari 10 hingga 100 µg/ml.d.

Penerapan

Uji m-Hydroxydiphenyl dapat mentolerir adanya gula asam nonuronat hingga ~

200 μg / ml. Tetapi konsentrasi yang lebih tinggi dari gula netral mungkin

meningkatkan pembacaan absorbansi. Selain itu, adanya protein dalam sampel

dapat mengganggu absorbansi. Metode ini sesuai untuk kuantifikasi bahan pektik

dalam buah-buahan dan sayuran dan telah diadaptasi untuk digunakan dengan

micro-plate.



B. Anal isis Monosakarida

Metode yang paling sering digunakan untuk menentukan konsentrasi

monosakarida dalam sampel adalah kromatografi gas (GC) dan kromatografi cair kinerja

tinggi (HPLC). Tidak seperti metode enzimatik, yang cenderung lebih spesifik untuk satu

jenis monosakarida saja, teknik kromatografi memberikan informasi kualitatif dan

kuantitatif tentang satu atau beberapa monosakarida dalam sampel.

Persiapan sampel secara sederhana dengan sampel yang relatif murni, yaitu sampel

kering. Untuk analisis HPLC, sampel hanya perlu ditumbuk halus, dilarutkan, diencerkan

jika diperlukan, dan disaring sebelum diinjeksi ke dalam kolom. Dalam beberapa kasus,

terutama ketika menganalisis produk makanan yang kompleks, persiapan sampel menjadi

agak lebih kompleks dan satu atau lebih langkah selanjutnya mungkin diperlukan.

Senyawa larut lipid umumnya dihilangkan melalui ekstraksi dengan pelarut yang cocok,

seperti eter atau heksan. Protein dapat dihilangkan dari sampel secara enzimatik

menggunakan protease yang sesuai (papain). Keberadaan garam-garam anorganik negatif

dapat mempengaruhi kolom .

Ketika sampel awal adalah polisakarida dan analisis kuantitatif atau kualitatif

analisis monosakarida penyusunnya diperlukan, sampel harus di-Depolimarisasi. Hal ini

paling sering dilakukan.

1. Hidrolisis Asam

Pada asam kuat dan panas, ikatan glikosidik antara residu monosakarida

dalam polisakarida dipecah. Selama reaksi ini, satu molekul air yang dikonsumsi

untuk setiap keterkaitan glikosidik dipecah. Selama hidrolisis asam, dilepaskan

monosakarida yang rentan terhadap degradasi dengan adanya asam pekat panas.

Asam sulfat dan asam trifloroasetat (TFA) biasanya digunakan untuk

hidrolisis. Telah dilaporkan bahwa asam sulfat lebih unggul dari TFA untuk hidrolisissubstrat berserat seperti dedak gandum, jerami, apel, dan mikrokristalin selulosa.

Namun, asam sulfat bisa sulit untuk menghilangkan gangguan setelah analisis. TFA

mudah menguap dan dapat dengan mudah dihilangkan sebelum analisis HPLC.

Sesuai prosedur hidrolisis untuk gums polisakarida netral menggunakan TFA

membutuhkan pemanasan ~ 10 mg bahan polisakarida dalam 1 ml 1M TFA pada

121° C selama 1 jam. Setelah pendinginan sampai suhu kamar, TFA dapat

dipindahkan di bawah aliran nitrogen. Prosedur hidrolisis menggunakan asam sulfat

untuk serat makanan larut air dalam makanan telah diuraikan. Hal ini membutuhkan

pencampuran sampel dengan 1M asam sulfat dan pemanasan pada 100°C selama 2,5



jam. Prosedur lain direkomendasikan untuk polisakarida netral melibatkan

pencampuran 2 sampai 5 mg sampel kering ditimbang dengan 0,1-0,25 ml HCl 2M

dan pemanasan pada 100°C selama 2 sampai 5 jam.

Sampel yang mengandung residu gula asam seperti pektin dan jamur polisakarida

tertentu bisa sulit untuk menghidrolisis secara kuantitatif menggunakan metode

tradisional yang menggunakan TFA atau asam sulfat.

2. Kromatografi Gas Cair (KG)

Kromatografi gas cair adalah teknik dimana komponen dalam campuran

dipisahkan berdasarkan tingkat afinitasnya atau interaksi dengan cairan fase diam.

Dalam kasus KG, komponen sampel dilarutkan dalam fase gas dan bergerak melalui

lubang kolom yang sangat kecil, interior yang dilapisi dengan fase diam. Pemisahan

ini terjadi pada tekanan tinggi dan suhu tinggi. Komponen dalam campuran sampel

dengan afinitas tinggi untuk fase diam akan tinggal di kolom lama dan yang kurang

afinitasnya untuk fase diam akan mengelusi. Tingkat afinitas atau interaksi dengan

fase diam pada molekul telah diatur berdasarkan struktur, sifat, dan sifat kimia fase

diam yang digunakan.

Prasyarat sampel KG harus mudah menguap, mengingat bahwa monosakaridatidak mudah menguap, monosakarida harus diderivatisasi lebih dahulu untuk

dianalisis.



a. Derivatisasi

Monosakarida netral yang paling sering diderivatisasi menjadi alditol asetat lebih

dahulu sebelum dianalisis dengan KG. Unsur-unsur penting dari prosedurderivatisasi ini adalah reduksi gula netral menjadi alditol dan selanjutnya

diasetilasi. Asetat alditol yang dihasilkan kemudian dilarutkan dalam pelarut yang

cocok dan disuntikkan ke dalam kolom KG. Gula Asam diperlakukan berbeda

untuk menghasilkan trimetilsilil (TMS) derivatif. Proses derivatisasi ditunjukkan

pada reaksi di atas.

1) Gula Murni

Bahan awal harus sampel kering dari satu atau lebih monosakarida. Bahan

polisakarida pertama harus dihidrolisis dan asam dihilangkan sebelum analisis.

Asam trifloroasetat bekerja dengan baik untuk tujuan ini karena mudah

menguap dan dapat dengan mudah dihilangkan dengan penguapan putar.

Sampel kering yang mengandung sejumlah kecil monosakarida (~ 10mg)

ditimbang secara akurat dan inositol heksaasetat (standar internal) dicampur

dengan larutan natrium borohidrida dalam amonium hidroksida mengkonversi

monosakarida menjadi alditols. Asam asetat ditambahkan untuk mengasamkan

sampel dan menghancurkan kelebihan natrium borohidrida setelah reaksi.

Campuran dikeringkan (dengan rotary evaporator atau dialiri nitrogen) dan



metanol ditambahkan dan dihilangkan dengan aliran nitrogen beberapa kali.

Perlakuan dengan metanol menghilangkan ion borat sebagai metil borat yang

volatil. Bila bagian akhir dari metanol telah dihilangkan dan sampel kering,

yaitu campuran alditol diasetilasi dengan menambahkan anhidrida asetat dan

pemanasan pada 121°C selama beberapa jam. Beberapa tetes air ditambahkan

ke dalam vial untuk menghancurkan sisa reaksi anhidrida asetat dan seluruh

campuran dikeringkan. Alditol asetat yang dihasilkan dilarutkan dalam metilen

klorida dan dianalisis dengan KG.

2) Asam Gula

Seperti polisakarida netral, polisakarida yang mengandung asam uronat harus

dihidrolisis dan dikeringkan sebelum analisis.

Sampel yang mengandung sejumlah kecil karbohidrat (~ 10 mg) ditimbang

akurat, dilarutkan dalam natrium karbonat dan kemudian diperlakukan dengan

natrium borohidrida. Asam asetat ditambahkan untuk menghancurkan

kelebihan borohidrida dan ion borat dihilangkan dengan metanol seperti yang

dijelaskan untuk monosakarida netral. Campuran yang dihasilkan dari asam

aldonat dan aldosa (dari gula netral jika ada) dibuat menjadi turunan TMS

dengan memperlakukan residu kering dengan campuran yang mengandung

piridin, heksametildisilazane, dan asam trifloro asetat. Standar internal, seperti

dokosan, dapat digunakan untuk kuantifikasi.

b. Keuntungan/Kerugian

Keuntungan analisis karbohidrat dengan KG adalah teknik yang baik dan banyak

metode yang telah dioptimasi, membutuhkan ukuran sampel jumlah kecil dan

sangat sensitif. Kerugian dari teknik ini terutama dari langkah-langkah persiapan.

Jika salah pengurangan atau langkah-langkah asetilasi tidak dilanjutkan sampaiselesai, jumlah diderivatisasi gula akan di bawah perkiraan.

3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Mirip dengan KG, HPLC adalah teknik pemisahan di mana senyawa dalam campuran

dipisahkan pada fase diam. Dalam kasus ini, fase gerak (eluen) yang berisi sampel dan

fase diam keduanya cairan.

Kinerja tinggi anion kromatografi penukar (HPAEC), pilihan yang semakin populer

untuk pemisahan karbohidrat, ditandai dengan fase diam anionik dan fase gerak

dengan pH yang tinggi. Pada pH tinggi (10 sampai 14), karbohidrat gugus hidroksil



mengion dan pemisahannya didasarkan pada perbedaan afinitas untuk muatan

berlawanan fase diam dan fase gerak.

a.

High Performance Anion Exchange Chromatography (HPAEC)

Jenis kromatografi ini didasarkan pada kenyataan bahwa karbohidrat dalam

lingkungan basa kuat akan mengioni, sehingga membuatnya bisa dipisahan pada

kolom penukar ion. Kolom HPAEC digunakan untuk karbohidrat yang dilapisi

dengan anion penukar resin. Sebagai contoh, Dionex (Sunnyvale, CA) kolom PA1,

dioptimasi untuk pemisahan mono-, di-, oligo dan polisakarida BM rendah. Sistem

HPAEC biasanya menggunakan natrium hidroksida sebagai eluen untuk

memisahkan mono- dan disakarida, sementara eluen untuk molekul yang lebih

besar sering termasuk natrium asetat untuk meningkatkan kekuatan ioniknya.

Detektor untuk HPAEC adalah Pulse Amperometric Detector (PAD). Secara

umum, amperometry mengukur perubahan arus yang dihasilkan dari oksidasi atau

pengurangan senyawa pada elektroda.

b. Kuantifikasi

Menghitung jumlah setiap individu mono-, di-, oligo-atau polisakarida dari

kromatogram HPAEC cukup sederhana yang disediakan 4 sampai 5 pengenceran

standar yang sesuai dijalankan dengan satu set sampel. Perangkat lunak terkait

dengan sistem HPLC akan mengintegrasikan puncak, menyediakan area peak /

ketinggian, dan memberikan nilai konsentrasi yang disediakan standar dengan

konsentrasi diketahui telah dijalankan. Untuk heksosa memerlukan faktor

konversi 0,90 dan untuk pentosa 0,88.

c.

Keuntungan/Kerugian

Keuntungan dari HPAEC untuk analisis karbohidrat adalah bahwa sampel tidak

memerlukan derivatisasi dan cukup cepat. Kerugian dari HPLC berasal dengansistem deteksi yang sebagian besar sangat tidak sensitif. Detektor indeks bias

merupakan detektor yang dipilih karena lebih sensitif, misalnya UV atau detektor

fluoresensi tidak cocok untuk menganalisis karbohidrat karena karbohidrat tidak

mengandung gugus yang merespon sistem deteksi ini.

4. Analisis Enzimatik

Metode ini digunakan untuk menentukan kandungan gula yang

mempercayakan pada kemampuan enzim untuk mengkatalisis suatu reaksi spesifik

dan menggunakan metode yang sesuai untuk memonitoring perkembangan reaksi atau



konsentrasi dari produk reaksi. Metode enzimatik sangat spesifik, biasanya cepat dan

sensitif untuk konsentrasi gula yang rendah.

a.

Analisis Glukosa

1)

Teori Reaksi

Salah satu yang paling awal dan paling luas menggunakan enzim untuk

penentuan kuantitatif glukosa adalah glukosa oksidase. Enzim yang spesifik

yang dapat diperoleh dari Penicillium notatum dan Aspergillis niger ,

mengkatalisis oksidasi (kehilangan 2 atom hidrogen) dari beta-D-

glukopiranosa menjadi D-glukono-1,5-lakton, yang merupakan spesies yang

menghidrolisis menghasilkan asam D-glukonat. Reaksi dari glukosa dengan

glukosa oksidase juga menghasilkan H2O2 dengan perbandingan 1:1.

Metode awal untuk mendeteksi jumlah glukosa dalam sampel setelah diberi

perlakuan dengan glukosa oksidase bergantung pada asam glukonat yang

terbentuk saat titrasi secara volumetrik. Saat ini, metode kolorimetri

berdasarkan penggunaan glukosa oksidase lebih umum. Dalam reaksi ini

peroksidase digunakan dalam kombinasi dengan kromogen untuk

menghasilkan kompleks berwarna dengan adanya H2O2. Glukosa dioksidasi

untuk menghasilkan asam glukonat dan peroksida dengan adanya glukosa

oksidase dan peroksidase mengkatalisis oksidasi dari kromogen (contohnya o-

dianisida) dengan adanya H2O2, dengan demikian penghitungan kuantitatif

secara spektrofotometri ketika kurva standar yang tepat telah ditetapkan.



Heksokinase adalah enzim lain yang sering digunakan pada penentuan

kuantitatif glukosa. Glukosa bereaksi dengan heksokinase dengan adanya

adenosine trifosfat (ATP) membentuk glukosa-6-fosfat dan adensin difosfat

(ADP). Glukosa-6-fosfat bereaksi dengan glukosa-6-fosfat dehydrogenase

dengan adanya adenin nikotinamid dinukleotida (NAD) memproduksi 6-

fosfoglukonat dan NADH. Konsentrasi NADH dihitung secara

spektrofotometri pada 340 nm atau reaksi dimodifikasi dengan penentuan

secara kolorimetri.

2) Prosedur (Glukosa Oksidase)

Sampel dicampur dengan larutan buffer yang mengandung glukosa oksidase,

peroksidase, dan kromogen dan diinkubasi pada suhu yang terkontrol dalam

waktu tertentu sesuai dengan metode analisis yang dipilih. Setelah beberapa

waktu untuk pengembangan warna, absorbansi dibaca pada panjang gelombang

yang tepat. Sebagai contoh, ketika menggunakan o-dianisodin HCl sebagai

kromogen dalam buffer asetat 0,1 M pH 5,5, larutan sampel diinkubasi pada

suhu 30oC selama 5 menit dan absorbansinya pada 525 nm berlawanan dengan

reagen blanko.

3) Kuantifikasi

Sebuah kurva kalibari dibuat dengan memplot absorbansi vs konsentasi untuk

5 larutan glukosa berbeda. Kuantifikasi diperoleh menggunakan kurva

kalibrasi.

b.

Analisis Galaktosa dan Laktosa

D-galaktosa telah diuji secara enzimatik menggunakan galaktosa dehydrogenase

dan glukosa oksidase. Adanya oksigen, galaktosa dioksidasi menjadi D-galakto-

heksodialdo-1,5-piranosa oleh galaktosa oksidase. Reaksi ini menghasilkan

hidrogen peroksida yang dapat diukur secara kolorimetri dengan adanya pendonor

hidrogen. Secara terurut, D-galaktosa dioksidasi menjadi asam galaktonat oleh

NAD ketika ada beta-galaktosa dehydrogenase dan hasil pembentukan NADH

dapat dimoditor secara spektrofotometri. Laktosa dapat juga dideteksi sebagai

galaktosa setelah perlakuan dengan beta-galaktosidase, sebuah enzim yang



mengkatalisis hidrolisis laktosa menjadi D-glukosa dan D-galaktosa. Galaktosa

dan laktosa dapat ditentukan dalam sebuah sampel dengan mengkoreksi

kandungan laktosa dari sampel yang diperoleh setelah pencernaan β-Galac-

tosidase dengan mengurangi galaktosa bebas ditentukan dalam tidak adanya

enzim.

1)

Teori Reaksi

Galaktosa dioksidasi menjadi asam galaktonat oleh NAD dengan adanya

galaktosa dehydrogenase. NADH dihasilkan pada reaksi ini berada dalam

larutan pada konsentrasi sebanding dengan kandungan galaktosa.

2) Prosedur

Sampel yang mengandung galaktosa dicampur dengan buffer mengandung

NAD, absorbansi awal pada 340 nm dan diukur kembali setelah inkubasi

dengan galaktosa dehidrogenase. Laktosa yang mengandung sampel pertama-

tama harud diberi perlakuan dengan beta-galaktosidase untuk mengkonversilaktosa menjadi glukosa dan galaktosa dan diinkubasi dengan galaktosa

dehidrogenase. Galaktosa dan laktosa dapat ditentukan dalam satu pengujian

menggunakan kedua enzim ini.

3) Kuantifikasi

Jumlah NADH yang terbentuk stoikiometri dengan jumlah galaktosa dalam

sampel. Perbedaan absorpsi sampel dan blanko harus ditentukan dahulu

dengan mengurangkan nilai absorbansi awal (sebelum penambahan galaktosa

dehidrogenase) dari nilai absorbansi akhir (setelah penambahan galaktosa

dehidrogenase).

4) Penerapan

Uji ini berlaku untuk menentukan konsentrasi galaktosa dalam larutan yang

bebas dari lemak dan protein. Sampel yang akan dianalisis harus jelas dan

kurang dari 0,5 g / L total galaktosa dan laktosa. Sampel yang mengandung

protein dapat diberi perlakuan dengan asam perklorat atau Carrez reagen, yang

mengendapkan protein dan menyerap beberapa senyawa berwarna.





3) Kuantifikasi

Glukosa diukur dari nilai absorbansi yang diperoleh setelah menambahkan

heksokinase dan dehidrogenase glukosa-6-fosfat. Untuk mengukur fruktosa

dalam sampel yang sama, nilai absorbansi dibaca setelah menambahkan

fosfoglukosa isomerase yang dikoreksi untuk nilai absorbansi glukosa awal.

Jumlah NADH yang dihasilkan stoikiometri dengan jumlah glukosa dan

fruktosa.

4)

Penerapan

Metode ini sesuai untuk penentuan glukosa dan fruktosa dalam banyak varietas

yang berbeda dari bahan makanan termasuk selai, madu, dan es krim, selama

mereka telah diperlakukan untuk menghilangkan zat mengganggu seperti lipid

dan protein. Sampel harus jelas, relatif tidak berwarna, dan bebas dari bahan

endapan. Larutan yang keruh atau mengandung campuran materi penganggu

dapat disaring atau diperlakukan dengan reagen Carrez.

d. Analisis (13) (14)-ß-D-Glukan

1) Teori Reaksi

(13) (14)-ß-D-Glukan merupakan dinding sel polisakarida yang ditemukan

dalam jumlah yang banyak di sereal padi-padian seperti oats dan gandum,

sedangkan jumlah yang sedikit ditemukan pada terigu dan dandum hitam. ß-

glukan dari sereal gandum telah diteliti lebih dari beberapa dekade berdasarkan

manfaat kesehatan menurunkan kadar glukosa darah dan menurunkan kadar

kolesterol serum. Analisis dari ß-glukan dapat menggunakan hidrolisis

enzimatik dengan (1→3)(1→4)-β-D-glukan-4-glukanohidrolase untuk

membentuk oligosakarida dan kemudia dihdrolisis dengan β-glukosidase.

Pelepasan glukosa diuji dengan glukosa oksidase seperti tercantum pada subAnalisis Glukosa.

2) Prosedur

Sampel kering ditimbang secara akurat (biasanya tepung atau gilingan)

dicampur dengan buffer fosfat (pH 6,5), dididihkan dan diaduk. Campuran

diinkubasi dengan lichenase kemurnian tinggi pada suhu 50oC, campur dengan

buffer natrium asetat (pH 4,0) dan disentrifuge. Sejumlah supernatant diberi



perlakuan dengan glukosidase dan sisanya dengan buffer asetat sebagai blanko.

Setelah inkubasi pada suhu 40oC dengan glukosidase, sampel dicairkan dan

glukosa ditentukan secara enzimatik dengan metode glukosa oksidase-

peroksidase. Standar mengandung 50 dan 100 µg/ml glukosa, reagen blanko

(mengandung buffer asetat dan reagen glukosa oksidase-peroksidase) dan

tepung kontrol dengan nilai ß-glukan yang diketahui disiapkan.

3) Kuantifikasi

Nilai absorbansi dari standar glukosa yang digunakan untuk mengevaluasi

persen glukosa dalam sampel. Ketika menghitung glukosa persen, penting

untuk menyertakan faktor konversi 0,9 untuk memperhitungkan perbedaan

berat molekul glukosa bebas vs glukosa dalam polisakarida.

4) Penerapan

Uji ini cocok untuk digunakan dengan tepung kering dan fraksi penggilingan

biji-bijian sereal seperti gandum, oat, barley, gandum, dan sereal tanpa

pemanis memberikan semua hal di atas telah digiling dan melewati ayakan

mesh 0,5 mm. Uji ini juga dapat digunakan untuk sampel yang mengandung

gula sederhana dengan mengekstraksi sampel dengan 50% etanol untuk

menghilangkan gula (yang dapat meningkatkan nilai glukosa yang diukur)

terlebih dahulu deberi perlakuan lichenase. Untuk sampel yang berbeda,

langkah ujinya telah dimodifikasi dan dioptimasi.

e. Analisis Galaktomanan

Galaktomanan adalah polisakarida yang terdiri dari ß-14 terikat substituen

manosil diganti pada posisi C6 dengan α-galaktosa. Jumlah dari substituen yang

diganti tergantung pada sumber galaktomanan, contohnya galaktomanan dari guar

memiliki galaktosa:manosa (G:M) perbandingan 1:2 sementara perbandinganuntuk locust bean gum (carob gum) adalah 1:4. Metode enzimatik secara

kuantitatif untuk galaktoman dikembangkan berdasarkan pada perbandingan G:M

yang diketahui.

1)

Teori Reaksi

Konsentrasi galaktoman dalam sampel ditentukan dari jumlah galaktosa yang

dilepaskan oleh α-galaktosidase setelah pencernaan ß-mannanase. Galatosa

dihitung secara spektrofotometri setelah perlakuan dengan NAD dan galaktose

dehydrogenase.



2)

ProsedurSampel berupa tepung kering dari guar atau locust bean gum diekstraksi

dengan etanol 80% untuk menghilangkan gula sederhana dan oligosakarida

yang mungkin mengandung galaktosa. Galatomanan dilarutkan dengan

pemanasan tepung dalam bufferdiikuti dengan inkubasi pada suhu 40oC

dengan ß-mannanase. Campuran sampel disentrifugasi untuk memisahkan

materi tak terlarutnya dan sejumlah supernatant diinkubasi dengan α-

galaktosidase untuk melepaskan galaktosa dan sisa supernatant lainnya diberi

perlakuan dengan buffer asetat sebagai dan dijadikan blanko. Galaktosa secara

kuantitatif ditentukan dalam sampel setelah perlakuan dengan NAD dan

galaktose dehidrogenase.

3) Kuantifikasi

Nilai absorbansi blanko dikurangkan dari absorbansi sampel dan hasilnya

digunakan untuk penentuan galaktosa secara kuantitatif. Rata-rata persentase

galaktosa dalam guar dan locust bean gum adalah 38 dan 22%.

C. Anal isis Oligosakarida

Oligosakarida adalah karbohidrat yang terdiri dari dua dan sepuluh residu

monosakarida yang terikat glikosidik. Sakarida dengan DP lebih besar dari 10 yang sering

disebut sebagai oligosakaarida. Misalnya, inulin, rafinosa dan stachyose, tri-dan

tetrasakarida terdiri dari galaktosa, glukosa, dan fruktosa yang ditemukan dalam kacang-

kacangan. Oligosakarida umum lainnya dalam makanan adalah dekstrin atau hidrolisat

pati, maltodekstrin dan terutama digunakan untuk menambahkan massal untuk produk

makanan serta mereka viskositas-memodifikasi dan pembentuk film.

Analisis oligosakarida dilepaskan melalui hidrolisis asam parsial atau serangan

enzimatik adalah teknik yang sering digunakan untuk memberikan informasi berharga

tentang struktur molekul. Sebagai contoh, (1 → 4) yang terikat pada (1 → 3) unit glukosa

dalam campuran terikat pada (1 → 3) (1 → 4)-β-D-glukan dipecah oleh (1 → 3) (1 → 4)-

β-D-glukan-4-glukanohidrolase (lichenase). Oligosakarida dibebaskan dari pencernaan

lichenase dari β-glucan terutama 3-O-β-cellobiosyl dan 3-O-β-cellotriosyl-D-glukosa.



Analisis oligosakarida ini dengan demikian merupakan langkah penting dalam memahami

sepenuhnya polisakarida induk.

Metode untuk menganalisis oligosakarida mirip dengan metode untuk

menganalisis monosakarida. Sebagai contoh, ekstraksi oligosakarida dari produk makanan

dicapai seperti untuk monosakarida, dengan etanol 80% panas. Mereka dapat dihidrolisis

dengan asam atau enzim untuk konstituen mereka monosakarida dan hidrolisat dikenakan

analisis dengan kromatografi, kimia, atau metode enzimatik. Selain itu, teknik eksklusi

ukuran dapat digunakan untuk memisahkan campuran oligosakarida berdasarkan ukuran.

1. Komposisi Monosakarida

Komposisi monosakarida oligosakarida dapat ditentukan oleh hidrolisis (asam

atau enzimatik) diikuti dengan metode yang cocok untuk mengidentifikasi

monosakarida yang diursikan. Monosakarida Dirilis dapat diidentifikasi dengan

menggunakan teknik kromatografi (HPLC, GC).

2. Size Exclusion Chromatography (SEC)

Kromatografi ekslusi ukuran adalah teknik kromatografi dimana molekul

dalam sampel dipisahkan berdasarkan ukuran mereka. Molekul dalam aliran eluan

(biasanya buffer) diarahkan ke dalam kolom berisi dengan gel berpori. Molekul yang

lebih kecil dalam sampel akan ditahan oleh pori, sehingga membutuhkan lebih banyak

waktu melewati kolom dan elusinya lambat dibandingkan molekul yang lebih besar

yang pada terelusi pada kolom lebih dulu. Detektor indeks bias sering digunakan

sendiri atau dalam kombinasi dengan detektor hamburan cahaya dan/atau detektor

viskosmetrik.

Dekstrin, atau hidrolisat pati, dapat menjadi campuran yang agak rumit dari

oligosakarida dengan ukuran dan proporsi oligomer linier dan bercabang bervariasitergantung pada bahan awal (pati beras, pati jagung, dll) dan metode hidrolisis (enzim,

asam) bahkan ketika DE adalah sama. Dekstrin dari DE berkisar 4-25 dianalisis pada

sistem SEC dilengkapi dengan multi-sudut detektor cahaya-hamburan, memungkinkan

perolehan informasi sehubungan dengan distribusi berat molekul. Dalam kombinasi

dengan kinerja tinggi kromatografi pertukaran anion (HPAEC), yang memberikan

informasi tentang terjadinya relatif oligosakarida individu, SEC ditambah dengan

berat detektor sensitif molekul diperbolehkan dekstrin lebih lengkap

profil sampel dari nilai DE saja (yang hanya mencerminkan jumlah mengurangi



ujungnya). Salah satu kelemahan dari sistem SEC adalah waktu yang diperlukan untuk

menganalisis sering membutuhkan beberapa jam atau bahkan berhari-hari.

3.

High Performance Anion Exchage Chromatography (HPAEC)

Tidak seperti analisis monosakarida, di mana fase gerak biasanya natrium

hidroksida saja, fase gerak untuk oligosakarida mengandung sodium asetat juga untuk

meningkatkan kekuatan ionik dan untuk memastikan pendorongan oligosakarida dari

kolom. Kolom Dionex Carbopac PA1 telah digunakan untuk memisahkan dekstrin

hingga DP 3040 menggunakan kombinasi fase gerak dari 80% A dan 20% B pada

waktu nol dengan gradien linier sampai 90% B dan 10% A (di mana A = 100 mM

NaOH dan B = 100 mM NaOH mengandung 600 mM NaOAc). Dalam hal ini,

dekstrin berupa sampel kering diencerkan dengan air secukupnya dan disaring (filter

0,45 um) sebelum injeksi. HPAEC juga telah digunakan sebagai teknik preparatif

untuk memisahkan oligosaccharides dalam bir. Sekali lagi, menggunakan buffer

NaOH / NaOAc. Oligosakarida (terdiri dari glukosa, galaktosa, dan xylose) diurai oleh

aksi dari selulase pada biji xyloglukan dipisahkan pada kolom CarboPak PA100

(Dionex, Sunnyvale, CA) menggunakan gradien elusi dari natrium hidroksida dan

natrium buffer asetat. Oligosakarida seperti isomaltose, kojibiose, gentiobiose,

nigerose, dan maltosa dari berbagai varietas madu juga telah dipisahkan menggunakan

HPAEC-PAD.

Tidak terbatas pada pemisahan oligosakarida netral, asam oligogalakturonat

dari jus strawberry telah dipisahkan pada sistem HPAEC menggunakan

gradient natrium hidroksida dan kolom CarboPac PA-100.

Asam oligogalaturonat hasil dari depolimerasi pektin enzimatik dipisahkan pada

kolom Mono-Q anion exchange (Pharmacia, Upsala, Swedia) menggunakan pengelusigradien (Na2SO4 dalam buffer fosfat) dan terdeteksi pada detektor fotodioda array.

Kerugian utama menggunakan HPAEC-PAD untuk menganalisis oligosakarida

adalah tidak adanya standar yang memadai untuk berbagai jenis oligosakarida

(oligosakarida dari β-glucan, malto-oligosakarida lebih dari DP 7). Selain itu, detektor

pulsed amperometric tidak sesuai untuk semua jenis sampel dan, pada kenyataannya,

respon detektor menurun dengan kenaikan DP.



4. Analisis Enzimatik

Hidrolisis enzimatik oligosakarida ditambah dengan pemisahan kromatografi dan

identifikasi penguraian oligosakarida umumnya digunakan untuk mengukur

oligosakarida pada sistem makanan sederhana dan kompleks. Metode ini telah berhasil

diterapkan untuk analisis frukto-oliosakarida dan inulin. Inulin dan oligofruktosa

adalah fruktans, (2 → 1) terikat pada unit β-D-fructofuranosyl dengan atau tanpa

glukosa terminal, ditemukan secara alami dalam sawi putih, Jeruselem artichoke, dan

bawang. Kedua inulin dan oligofruktosa adalah campuran polydisperse dengan nilai

masing-masing DP berkisar antara 2 sampai 60 dan 2 sampai 10.

Kedua inulin dan oligofruktosa dalam produk pangan dapat diukur dengan

menundukkan ekstrak air panas untuk perlakuan enzimatik yang memungkinkan

penentuan fructan berdasarkan perbedaan (kadar gula sebelum dan sesudah

perlakuan). Fruktosa dan sukrosa bebas ditentukan dalam sampel asli, glukosa bebas

dan glukosa dari pati ditentukan setelah perlakuan amiloglukosidase, dan glukosa total

dan fruktosa total yang ditentukan setelah hidrolisis fruktozim. HPAEC-PAD cocok

untuk analisis hidrolisat enzim ini karena memungkinkan resolusi dasar dari semua

gula dan memfasilitasi kuantifikasi langsung.

Sebuah metode telah dikembangkan untuk ekstraksi, deteksi, dan kuantifikasi

inulin dalam produk daging. Inulin diekstrak dari produk daging di pelarut air panas,

diberi perlakuan dengan inulinase, dan menguraikan fruktosa diukur dengan HPLC

dengan deteksi RI. Jumlah inulin dan oligofruktosa ditentukan dengan mengurangi

jumlah fruktosa bebas (diperoleh dari blanko tanpa enzim) dari fruktosa total dalam

sampel setelah perlakuan enzim.

Fruktan dapat ditentukan sebagai glukosa dan fruktosa setelah hidrolisis enzim

menggunakan metode kimia/spektrofotometri. Metode ini menggunakan p-hidroksibenzoat asam hydrazide (PAHBAH) untuk mengukur fruktan sebagai gula

reduksi setelah perlskusn dengan fruktanase. Fructans diekstraksi dalam air panas dan

ekstrak diperlakukan dengan suksesi enzim untuk memecah sukrosa menjadi glukosa

dan fruktosa dan pati menjadi glukosa. Monosakarida yang dilepaskan direduksi

menjadi gula alkohol untuk menghindari gangguan dalam uji fruktan. Fruktanase

ditambahkan untuk melepaskan fruktosa dan glukosa dari fruktan dan sejumlah gula

reduksi berada dalam larutan kemudian ditentukan dengan metode asam p-

hidroksibenzoat hydrazide dimana warna yang dihasilkan oleh reaksi diukur pada 410

nm.



D. Anal isis Dietary F iber (Serat M akanan)

1. Defenisi Dietary Fiber

Serat makanan adalah bahan dinding sel tanaman yang tahan terhadap enzim

pencernaan. Definisi ini kemudian diperluas untuk mencakup semua polisakarida yang

tidak dapat dicerna seperti gelatin, mucilago, selulosa yang dimodifikasi,

oligosakarida, dan pektin. Definisi itu diperluas karena zat tambahan tersebut

berperilaku fisiologis dengan cara mirip dengan senyawa yang termasuk dalam

defenisi serat makanan tersebut, mereka dapat dimakan dan tidak dicerna dan diserap

dalam usus kecil. Definisi AACC, tentang serat makanan adalah sebagai berikut:

“Serat makanan adalah bagian yang dapat dimakan dari tanaman atau karbohidrat

analog yang resisten terhadap pencernaan dan penyerapan di usus kecil manusia

dengan fermentasi lengkap atau parsial pada usus besar. Serat makanan termasuk

polisakarida, oligosakarida, lignin, dan tanaman yang mengandung zat serat

makanan. Serat makanan memberikan efek fisiologis menguntungkan termasuk

laksasi, atau penurunan kolesterol darah atau penurunan glukosa darah.”

2. Analisis Dietary Fiber

a.

Metode Uppsala

Ada dua pendekatan yang berbeda secara fundamental untuk menganalisa serat

makanan. Metode Uppsala untuk mengukur gula netral, asam uronat (bahan

pektik), dan Klason lignin (serat makanan nonkarbohidrat termasuk lignin, tanin,

dan proteinatous) dan menjumlahkan komponen-komponen ini untuk

mendapatkan nilai serat makanan. Sampel pertama-tama direaksikan dengan

amilase dan amiloglukosinase untuk menghilangkan pati. Hidrolisat pati dan gula

BM rendah dipisahkan dari serat larut menggunakan etanol 80% meninggalkanresidu yang mengandung serat larut dan tidak larut. Gula netral ditentukan setelah

derivitisasi sebagai asetat alditol dengan GC, asam uronat yang diuji secara

kolorimetri, dan Klason lignin ditentukan secara gravimetri.

b.

Enzimatik/ Metode Gravimetri

Metode kedua adalah pengukuran berdasarkan perbedaan di mana residu serat

makanan diisolasi, dikeringkan, ditimbang, dan kemudian berat ini disesuaikan

untuk nondietary bahan serat (yaitu, protein dan abu). Metode enzimatik-

gravimetri mereaksikan sampel untuk suksesi enzim (α-amilase, miloglukosidase,

protease) untuk mengurangi material tercerna, langkah pengendapan etanol untuk

mengisolasi polisakarida non pati, dan terakhir penentuan abu dan protein. Jumlah



protein dan abu dikurangi dari berat residu kering untuk mendapatkan total nilai

serat makanan.



Date post:	02-Jun-2018
Category:	Documents
Upload:	ayyu-thrye-sartheeqaa
View:	220 times
Download:	0 times

Review Karbohidrat Kelompok VI Far A

Documents