“Efecto del complejo enzimático producido por Aspergillus oryzae sobre la producción
de alcohol etílico por Saccharomyces cerevisiae en condiciones de laboratorio”
"Effect of enzyme complex produced by Aspergillus oryzae on the production of ethyl
alcohol by Saccharomyces cerevisiae under laboratory conditions"
Liz Sánchez-Torres1 ,---------------------------------------------
Escuela de Microbiología y Parasitología, Universidad Nacional de Trujillo1.
ABSTRACT
In order to determine the effect of the concentration of the enzyme complex produced by
Aspergillus oryzae CECT 2094 and CECT 2095 on the production of ethyl alcohol by
Saccharomyces cerevisiae in laboratory conditions, four fermentation’s systems were
conditioned using bottle with 400 mL molasses broth, which was added enzymatic extract at
concentrations of 2, 4, and 6% (v / v) and a control without enzyme extract. The systems were
inoculated with Saccharomyces cerevisiae and incubated at 28 ° C for 2 days under anaerobic
conditions, then it was proceeded to measure the concentration of alcohol expressed in
percent in each of the fermentation systems. The highest percentage of alcohol was obtained
in the treatment with 4% extract enzyme, with an average of 4.47% alcohol as opposed to the
control which was obtained 3.73%, differ also in alcohol tolerance because biomass at the end
of fermentation was 1.36 x 108 cells / mL in the treatment with 4% while the control was 9.92
X107 Cel / mL. In both treatments a decrease of the Brix was observed to 6,6ºB. The
conclusion was that the enzyme complex produced by Aspergillus oryzae has an effect on
ethanol production by Saccharomyces cerevisiae under laboratory conditions.
Keywords: Aspergillus oryzae, Saccharomyces cerevisiae, percentage of alcohol, amylase,
protease, fermentation.
INTRODUCCIÓN
El mundo encara el agotamiento progresivo de sus recursos energéticos basados
mayoritariamente en combustibles no renovables. Al mismo tiempo, el consumo de energía
aumenta a ritmo cada vez más creciente. De otro lado, el consumo global de combustible
genera enormes cantidades de gases contaminantes que son liberados a la atmósfera. La única
forma de encarar esta problemática es mediante recursos energéticos renovables; una solución
renovable es el uso de energía solar en forma de biomasa, la cual está representada en los
materiales lignocelulósicos y los cultivos de plantas ricas en energía, a partir de los cuales se
producen biocombustibles líquidos (bioetanol, biodiesel)1,2.
El biocombustible más importante es el alcohol carburante (etanol, EtOH) el cual
permite un aumento del índice de octano y por lo tanto, la reducción del consumo y reducción
de la contaminación (10 a 15% menos de monóxido de carbono e hidrocarburos). Así mismo
el etanol podría sustituir al metil ter-butil éter (MTBE) para reducir las emisiones de CO 2.
Está acción es muy importante pues el MTBE, por ser un compuesto muy estable de baja
degradación y muy soluble en agua, ha resultado ser un contaminante de aguas
subterráneas2,3.
Una de las opciones para producir etanol es por fermentación a partir de materias primas
ricas en carbohidratos (azúcar, almidón, celulosa, etc.). Por tal razón, es común designar al
etanol obtenido por esta vía “bioetanol”. Entre estas materias primas se encuentran vegetales
como la caña de azúcar y la remolacha, los cereales (trigo, maíz, sorgo), los tubérculos
(papas, yuca) y en general, materias provenientes de ligno-celulosa o de residuos orgánicos.
El proceso de obtención es más eficiente en aquellos productos que tienen más azúcar; de esta
manera el proceso más eficiente se logra a partir de caña de azúcar y de maíz, siendo la mejor
materia prima para los principales productores a nivel mundial como Brasil y EE UU
respectivamente3.
El uso de los biocombustibles se implementa e incrementa en países como Alemania,
Francia, Italia, Australia, Estados Unidos, Brasil y Colombia entre otros, impulsados por la
disminución de las reservas de petróleo, el incremento en su precio y la preocupación por el
impacto de los combustibles sobre el medio ambiente. A nivel mundial se está dando mucha
importancia a la producción de bioetanol, presentando muchas opciones de producción, es así
como la opción española de producción industrial de bioetanol se ha concretado en la
utilización de cereales; en un proceso que sigue los siguientes pasos: transformación del
almidón del cereal en glucosa, obteniéndose un mosto azucarado que se fermenta por medio
de levaduras. El mosto alcohólico obtenido se somete a destilación, para enriquecer el
contenido alcohólico y posteriormente se deshidrata por medio de tamices moleculares2.
Saccharomyces cerevisiae, la especie de levadura usada con más frecuencia en los
procesos de fermentación, convierte las hexosas en EtOH en condiciones anaeróbicas,
generando 2 moles del compuesto generador de energía en los seres vivos, el adenosín
trifosfato (ATP), por cada mol de hexosa consumida, además de dos moles de EtOH. Este
microorganismo tiene también la capacidad de convertir las hexosas en CO2 aeróbicamente.
Algunas levaduras tienen la ventaja adicional de tolerar concentraciones relativamente altas
de EtOH (hasta 150g.L-1)1,3.
El proceso de fermentación y su eficiencia para producir etanol depende en alto grado
de la acción de levaduras, esto implica la mayor tolerancia a la inhibición por concentración
de alcohol, dependiendo del sustrato utilizado, en algunos casos es necesario emplear
complejos enzimáticos sobre el almidón no convertido, para que pueda ser usado como
fuente de carbono durante la fermentación, así mismo para mejorar la asimilación de
nitrógeno, lo que otorga una mejor estructura conformacional de la membrana celular de las
levaduras, por lo tanto es importante el empleo de enzimas hidrolíticas como las amilasas y
proteasas 4.
La técnica de fermentación en medio sólido (FMS) ha sido y sigue siendo utilizada por
numerosos investigadores para producir enzimas y otros metabolitos primarios y secundarios.
Por lo general los cultivos de microorganismos en medio sólido se realizan utilizando
sustratos agrícolas como salvado de trigo, bagazo de caña, harina de yuca, cáscara de cereales
y de remolacha etc; a estos sustratos se les agrega una solución de sales y una suspensión de
esporas de hongo como inoculante5,6.
El salvado de trigo es más rico en celulosa, hierro, fósforo, magnesio, calcio, y
vitaminas del complejo B, y ha sido utilizado en Bogotá como sustrato en la Obtención de
amilasas por Aspergillus sp. aislado de lentejas, demostrando que estas amilasas son activas
en el desdoblamiento de la molécula de almidón a pH 5.0 y temperatura de 37ºC 7.
Los hongos filamentosos producen una variedad de metabolitos secundarios originados
a partir de intermediarios del metabolismo primario, además son los microorganismos más
adaptados a cultivo en medio sólido y son la base de muchas fermentaciones y fuentes de
muchas enzimas comerciales (amilasas, proteasas, pectinasas, peroxidasas, etc.), ácidos
orgánicos, antibióticos y otros muchos principios activos usados en medicina y en industrias
alimentarias y textil 8,9.
El hongo a utilizar en este proyecto pertenece al Género-forma Aspergillus especie
Aspergillus oryzae. Al comenzar su desarrollo, las colonias son blanco-amarillentas, y luego
se convierten en amarillo verdosas o de color castaño; puede tener una o dos filas de
esterigmas con conidiosporos piriformes. Produce amilasas, proteasas, y ácido kójico.
Dentro de las investigaciones realizadas en este campo, se ha estudiado el efecto de la
concentración de CO2 y del O2 en la fase gaseosa sobre el crecimiento y el metabolismo de
Aspergillus oryzae para la producción de amilasas y proteasas en FMS, y se demostró que la
producción óptima de amilasa se obtiene durante la fase exponencial de crecimiento con bajas
concentraciones de CO2 (de 2 a 5%) al contrario de las proteasas que necesitan una
concentración elevada de CO2 (5%) durante la fase estacionaria 8.
Muchas Industrias biotecnológicas de bioprocesos han evaluado la adición de una serie
de enzimas que mejoran la producción de alcohol etílico empleando melaza como sustrato. La
melaza presenta aproximadamente entre 4 y 7% de componentes como maltosa, almidón y
celulosa que no pueden ser metabolizados por la levadura en condiciones normales de
proceso; por esta razón ha evaluado una mezcla de enzimas comerciales (0.05% p/v),
obteniendo muy buenos resultados, pero el elevado costo no es apropiado desde el punto de
vista económico10,11.
Hoyos y Carrera (2004) reportaron un incremento del grado alcohólico del 10% v/v con
la adición de de enzimas de 0.5% p/v obtenidas por fermentación en sustrato sólido con
Rhizopus niveus, valor muy satisfactorio; que sin embargo, no supera el rendimiento que se
obtiene con la adición de la enzimas comerciales 10.
Actualmente, en América Latina está aumentando el interés por la producción de etanol;
por ejemplo en noviembre del 2005 Colombia inicia la adición de un 10% de EtOH a la
gasolina; Argentina por su parte, planea para los próximos cinco años la transición hacia
mezclas de gasolina con un 5% de EtOH. En nuestro país, aún no se ha desarrollado mucho
la producción de etanol; la falta de una tecnología desarrollada que pueda suplir las
necesidades de la industria productora de alcohol hace necesario el estudio de nuevas
alternativas y metodología de producción que permitan aprovechar al máximo los recursos
industriales como la melaza (para producir etanol) y el salvado de trigo (para producir
enzimas) 1,12.
El presente trabajo tuvo como objetivo optimizar el rendimiento en la producción de
etanol por S. cerevisiae a partir de melaza utilizando una mezcla de enzimas denominado
complejo enzimático, producido por A. oryzae mediante fermentación en sustrato sólido, cuyo
efecto se verá reflejado en el aumento del porcentaje alcohólico.
MATERIAL Y MÉTODO
1. Material Biológico
Cepas de Aspergillus oryzae CECT 2094 y CECT 2095 Procedente de la
Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). Univ.de Valencia.
Cepas de Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus MIT-L51. Proporcionado por
el Laboratorio de Microbiología Industrial y Biotecnología del Departamento de
Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Univ.
Nac. de Trujillo.
Salvado de Triticum aestivum “Trigo”.Procedente del Mercado Central de
Trujillo.
Melaza de Saccharum officinarum “Caña de azúcar”. Procedente del Molino San
Francisco. Trujillo. La libertad.
2. Método
2.1. Fermentación en sustrato sólido con Aspergillus oryzae.
2.1.1. Propagación de Aspergillus oryzae.
Las cepas CECT 2094 y 2095 de A. oryzae, fue rehidratado con Caldo
Sabouraud estéril y sembrado en Agar Extracto de Malta y Papa Dextrosa (PDA)
respectivamente. Se dejó incubar durante cinco días a 28ºC tiempo suficiente para
el crecimiento del hongo y producción de esporas.
2.1.2. Preparación del inóculo.
La preparación del stock de esporas de Aspergillus oryzae, se realizó partiendo
de un cultivo en placa de Agar Papa Dextrosa (PDA) y Agar Extracto de Malta
para las cepas CECT 2095 y CECT 2094 respectivamente, se lavó la superficie
del cultivo con 10 mL de solución al 0,1 % de Tween 80 para facilitar el
desprendimiento de esporas. La solución del lavado se centrifugó a 2800g, durante
3 minutos, se decantó y se resuspendió las esporas en 10 mL de agua destilada
estéril, se repitió el proceso de centrifugación y decantación. Finalmente las
esporas se resuspendieron en 10ml de agua destilada estéril. Seguidamente se tomó
una alícuota de esta suspensión y se llevó a la cámara de Neubauer para el
recuento de esporas por mL haciendo las diluciones necesarias para obtener la
concentración de 2X107 esporas/mL en el medio de fermentación.
2.1.3. Preparación del sustrato sólido e inoculación de esporas13
En botellas de vidrio planas de 1000 mL se colocó 80 gr de salvado de trigo y
se llevó a autoclave a 121ºC durante 20 minutos, seguidamente se humedeció el
salvado con solución tampón a pH 5,0 (previamente autoclavada) en cantidad
suficiente para alcanzar una humedad relativa de 50%. Posteriormente se le
adicionó una suspensión de esporas por gramo de materia seca y con una bagueta
estéril se extendió el medio tratando de formar una superficie plana. Este sistema
se ubicó horizontalmente en la incubadora a 24ºC, para semejar las condiciones del
cultivo en bandeja. La fermentación se llevó a cabo durante cinco días.
2.1.4. Extracción de enzimas14.
Una vez cumplido el tiempo de incubación, el sustrato de fermentación se pasó
a un matraz estéril y se le agregó 200 mL de la solución tampón, se agitó
aproximadamente por una hora en un agitador magnético para extraer la enzima,
luego se separó la fracción soluble de la insoluble filtrando a través de un lienzo
(prensado). Se recolectó el sobrenadante (preparado enzimático) y se centrifugó a
2500 rpm por 10 minutos a 4 °C y finalmente se filtró a través de un filtro
bacteriológico estéril; y el filtrado se guardó en refrigeración a 4ºC hasta la
determinación de las unidades de enzima.
2.2. Prueba de Actividad de Alfa Amilasa15
Se prepararon 3 tubos de la siguiente manera: Tubo I (Blanco Reactivo), Tubo
II (Blanco Muestra) y Tubo III (Muestra). En los tubos II y III se agregó 10µL del
extracto enzimático, luego al tubo I y III se agregó 0.5mL de la solución de
almidón bufferado pH 5. Luego se incubó los tres tubos por un tiempo de 7.5
minutos. Finalizando dicho tiempo se le añadió 4.5mL de la solución reveladora a
los tres tubos y se completaron los volúmenes con 0.01mL y 0.5mL de agua
destilada en los tubos I y II respectivamente. Luego se midió la absorbancia a
574nm.
Para cálculo de resultado se usó la siguiente fórmula:
Donde:
Absorbancia (Blanco) – Absorbancia (Muestra)
Amilasa UA/dL ₌ ―––––––––––––––––––––––––––––––––––––––* 1000
Absorbancia (Blanco)
Absorbancia del Blanco= Abs. De Blanco reactivo + Abs. De Blanco muestra
Absorbancia de Muestra= Absorbancia de cada eluído enzimático.
2.3. Determinación de la actividad de las enzimas proteolíticas13.
Con el objeto de verificar si el complejo enzimático contiene proteasas se
empleó la siguiente metodología basado en la hidrólisis proteolítica de un sustrato
de caseína. Se trabajó con tres tubos (I, II, III), de los cuales dos de ellos (I, II)
contuvo 2mL de caseína al 1%, se agregó 2mL de buffer fosfato 0,1 M pH 8 a los
tres tubos ( I, II, III) , sólo a dos de ellos (I, III) se les colocó 2mL del preparado
enzimático; para igualar los volúmenes se añadió agua destilada a los tubos II y III,
se mezcló y se colocó en baño de agua a 37ºC durante 30 minutos. Finalizando el
tiempo de reacción, se tomó alícuotas de 0.5 mL de cada uno de los tubos y se
trasladó a otro sistema de tubos igualmente numerados (I, II, III) a los cuales se les
agregó 1 mL de solución de ninhidrina a cada uno de los tubos, se mezcló y llevó a
un baño de agua hirviendo (franca ebullición) durante 3 a 5 minutos, luego se retiró
y agregó 3,5 mL de agua destilada. Finalmente se mezcló por inversión y se leyó en
espectrofotómetro (640 nm).
La actividad enzimática se comparó con la curva estándar de caseína.
2.4. Preparación del inóculo de Saccharomyces cerevisiae 13.
A partir del cultivo conservado en agar sabouraud se activó la levadura
sembrando en placas conteniendo Agar Sabouraud Glucosa Enriquecido (ASGE), y
se incubó a 30ºC durante 36 horas. Luego se “cosecharon” las células de levaduras
utilizando de 2 a 3 ml de Solución Salina Fisiológica (SSF) por placa de cultivo.
Seguidamente se reunieron todas las suspensiones en un tubo estéril y se
homogenizó la suspensión, se realizó una observación en fresco utilizando azul de
metileno para determinar la viabilidad de las levaduras.
2.5. Determinación de la fase logarítmica de crecimiento de Saccharomyces
cerevisiae13.
Para determinar la curva de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae se tomó
un volumen de 300mL de melaza diluida, con una densidad de 1,05 Kg/dm3 y a pH
4.5. Se esterilizó a 121ºC por 15 minutos. Luego se inoculó la levadura (10% de
inóculo) y se incubó a temperatura ambiental (19±1ºC) durante 48 horas. Los
recuentos de células se llevaron a cabo cada hora.
2.6. Producción de etanol.
En 4 biorreactores debidamente acondicionados y esterilizados se colocaron
400 mL de caldo melaza (Anexo 8), se inocularon con 40 mL de suspensión de
levaduras en fase logarítmica y se les adicionó el complejo enzimático en
concentraciones de 2, 4 y 6% (v/v) a los tres biorreactores problemas, el biorreactor
control se trabajó sin adicionar complejo enzimático, el proceso de fermentación
duró 48 horas.
2.7. Determinación del porcentaje de etanol.
A las 48 horas se midió el porcentaje (%) de etanol utilizando el Ebulloscopio
de Malligan en cada uno de los cuatro biorreactores cuyos resultados se organizaron
y analizaron estadísticamente en base a la prueba de análisis de varianza (ANAVA).
RESULTADOS
Se observó que el porcentaje de Alcohol producido por Saccharomyces cerevisiae fue
mayor en los sistemas que se trabajaron con el extracto enzimático producido por Aspergillus
oryzae en comparación con el control donde no se añadió dicho extracto (fIg.1). Además se
observó que el extracto favoreció el crecimiento celular en un medio dónde puede ser inhibido
por el porcentaje de alcohol (fig.2 y 3). Dicho crecimiento celular puede observarse también
en la caída del Brix inicial del medio caldo melaza (fig.4).
También se observó que el mayor porcentaje de Alcohol se obtuvo en el tratamiento
con 4% de extracto enzimático obteniéndose una media de 4.47% de alcohol a diferencia del
control en el cual se obtuvo 3.73% como se puede observar en la figura 1. Así mismo se
puede observar que se obtuvo mayor población celular en el tratamiento con 6% de extracto
enzimático (Fig. 2.).
Según el ANAVA, existe diferencia estadísticamente significativa entre los
porcentajes de alcohol promedio de un nivel de Concentración Enzimático a otro para un
nivel de confianza del 95.0%. Según el Post. ANAVA (Tests de Rangos Múltiples), se
identificó que en el rango de 2 y 4 %; 2 y 6% al igual que 4 y 6% no hubo diferencia
significativa (p> 0.05) por lo tanto a dichas concentraciones se obtiene igual efecto; sin
embargo en los tres pares de medias restantes (comparación con la media control) se observó
que éstos muestran diferencia estadísticamente significativas a un nivel de confianza 95.0%
haciendo un total de dos poblaciones estadísticas (grupos homogéneos), considerando al
control como una de ellas ( Fig. 2).
a, b : p ≤ 0.05 Hay diferencia significativa
Fig. 1. Porcentaje de alcohol producido por Saccharomyces cerevisiae empleando diferentes
concentraciones del extracto enzimático de Aspergillus oryzae a los 48 hrs. de
fermentación.
Fig. 2. Población celular de Saccharomyces cerevisiae (Cel/mL) en presencia de diferentes
concentraciones de complejo enzimático de Aspergillus oryzae a los 48 hrs. de
fermentación.
0,00E+00
2,00E+07
4,00E+07
6,00E+07
8,00E+07
1,00E+08
1,20E+08
1,40E+08
1,60E+08
1,80E+08
Po
bla
ció
n
celu
lar
Sa
cch
rom
yces
cere
vis
iae
(cel/
mL
)
0% 2% 4% 6%
Concentración de extracto enzimático producido por Aspergillus oryzae
9.92E+07
1.27E+081.36E+08
1.61E+08
3,2
3,4
3,6
3,8
4
4,2
4,4
4,6
Porc
enta
je (
%)
de
alc
oh
ol
pro
du
cid
o p
or
sa
cch
aro
myc
es
cere
visi
ae
0% 2% 4% 6%
Concentración de extracto enzimático producido por Aspergillus oryzae
a
b
b b
3.73%
4.27%
4.47%
4.27%
Fig. 3. Fase exponencial de crecimiento de Saccharomyces cerevisiae (millón/mL) cultivado en
medio Caldo Melaza y evaluado durante las 25 hrs.
Fig. 4. Grados Brix inicial (14ºB) y finales de los medios de fermentación (caldo melaza) con
la correspondiente Población celular de Saccharomyces cerevisiae evaluado a las
48hrs.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
3 4 7 8 9 10 12 25
Tiempo (h)
Po
bla
ció
n C
elu
lar
de S
acch
aro
myces
cere
vis
iae
(m
illó
n/m
L) Y=0.0513X+18.096
0
2
4
6
8
10
12
14
Gra
dos
Bri
x (
ºB)
2,76E+07 9,92E+07 1,27E+08 1,36E+08 1,61E+08
Población celular de Saccharomyces cerevisiae (Cel/mL)
14
6.67 6.67 6.65 6.57
0% 2% 4% 6%
DISCUSIÓN
En lo que se refiere a la estandarización de la metodología de la fermentación
alcohólica, hay una etapa muy importante que es el momento de pasar la levadura de fase
aerobia a fase anaerobia. La levadura se debe pasar a la fase anaerobia cuando la curva de
crecimiento del cultivo está en la fase logarítmica de desarrollo (véase figura 3).Para
determinar este grado de desarrollo fue necesario realizar una curva de crecimiento, en la cual
se observó que el momento óptimo para hacerlo era a las 5 horas 23 minutos después de
iniciada la fase aerobia. Al realizar la fermentación de esta forma, se asegura que la levadura
está pasando en las mejores condiciones a la fase anaerobia10,25.
Saccharomyces cerevisiae es una levadura que posee alta actividad metabólica, por lo
que en la fase aerobia se caracteriza por la producción de biomasa y la fase anaerobia
generalmente por la producción de etanol. Es importante la fase aeróbica, ya que la levadura
presenta una fase de adaptación para que produzca enzimas necesaria tipo invertasa que le
permitan metabolizar el sustrato y así alcanzar la biomasa adecuada para la fermentación en
donde la mayor parte del carbono se emplea como energía y sólo el 2% se asimila como
material celular26 .
El complejo enzimático obtenido de A. oryzae contiene enzimas de diferentes tipos.
Para la presente investigación se decidió evaluar el contenido de amilasas y proteasas. El
resultado de la prueba de actividad para amilasas arrojó un concentración de 676.42 UA/dL
(Anexo 3), que indica que el complejo enzimático puede hidrolizar residuos de maltosa y de
almidón (amilosa amilopectina). Realizando la prueba de actividad de la amilasa se
demuestra que el complejo actúa sobre enlaces alfa 1,4 y alfa 1.6 logrando disponer para la
levadura nuevos componentes. Esto justifica también la disminución final de los azúcares
totales reductores y el aumento del porcentaje de alcohólico con respecto al blanco10. (Fig. 1 y
4).
David Johnston, tecnólogo alimentario en la Unidad de la Ciencia de Conversión de
Cultivos e Investigación de Ingeniería, está investigando nuevos procesos usando enzimas
proteasas de microbios y hongos para producir etanol más eficazmente. Él ha descubierto que
las enzimas hacen más nutrientes disponibles para la levadura, acelerando la fermentación de
los azucares. Además que las enzimas proteasas también pueden facilitar el proceso de quitar
el agua de los restos sólidos después de la extracción del etanol. Él en conjunto con otros
investigadores han reportado que las α-amilasas afectan la concentración final del etanol
dándoles como resultado un aumento de 10,5 hasta 11,6%(v/v) a una concentración de α-
amilasa de 42.8 U/g de maíz seleccionado para la molienda en seco a nivel de laboratorio11,27.
La prueba de la proteasa, fue incluida por la baja especificidad que presentan las
enzimas proteolíticas de la levadura. Las proteasas mejoran la asimilación del nitrógeno
presentes en la melaza como proteínas y aminoácidos, lo que representa una mejor estructura
conformacional de la membrana celular de la levadura y por tanto una mayor tolerancia a la
inhibición por concentración de alcohol. Como se observa en la figura 2, muestra un notable
aumento de la población celular por la adición del extracto enzimático. Al desarrollar la
metodología propuesta para evaluar la presencia de esta enzima, el resultado de la prueba
arrojó la presencia de proteasas en el medio que hidrolizan 2.7305mg de caseína a 37ºC por
30 minutos (Anexo 2) 10,20,26.
Como se sabe, solamente 20 aminoácidos componen el alfabeto a partir del cual se
forma la gran variedad de proteínas existentes, existen muchos métodos bioquímicos que nos
permiten identificar su presencia en una muestra, dentro éstos destacan la formación de
complejos cromóforos por interacción del aminoácido y un reactivo especifico, en esta
ocasión se trabajó con la Ninhidrina, agente que al entrar en contacto con aminoácidos libres
da lugar a un complejo visible de color azul-violáceo. Por ello podemos afirmar que el
extracto enzimático tiene proteasas por dar positiva la reacción de la ninhidrina con los
grupos aminos de los aminoácidos libres16.
La obtención de alcohol de melazas se diferencia de otras materias primas, como maíz,
papa, milo y otros, en que éstos son productos de plantas con alto contenido de carbohidratos
almacenados en la forma de almidón. Por lo tanto, estos materiales deben pasar por un
proceso de pretratamiento de cocción o tratamiento enzimático para hidrolizarlos y obtener
azúcares fermentables. En contraste, los carbohidratos presentes en las melazas ya se
encuentran disponibles y no requieren tratamiento, con fundamento en las propiedades que
tienen algunos microorganismos de metabolizar azúcares y producir como residuo, alcohol
etílico. Para el caso particular de hidrólisis de materiales lignocelulósicos de la caña de azúcar
o ruptura de las moléculas en medio acuoso, tiene como finalidad la transformación de
azúcares complejos (polisacáridos) en carbohidratos sencillos. Esto se logra con ácido
sulfúrico o clorhídrico a altas temperaturas y tiempos de operación cortos o largos; el ácido
actúa como catalizador y se obtiene una mezcla de glucosa y xilosa con algunos productos de
degradación como ácido acético, furfural y derivados de la ruptura de la lignina1,19.
Los principales cambios notados durante el almacenamiento de la melaza son: pérdida
de sacarosa, ganancia de azúcares reductores, incremento del porcentaje de compuestos
orgánicos no azúcares, pérdida de sólidos totales, y gran incremento de color. En la
descomposición de la melaza se producen varias reacciones siendo la más importante la de los
aminoácidos con estos azúcares reductores, en la cual se forman productos coloreados como
las melanoidinas (impurezas coloidales coloreadas con alto contenido de carbono) y los
residuos fermentables a los cuales se les ha encontrado un contenido de 68% de nitrógeno
combinado, en forma no asimilables por los microorganismos. Para reducir la probabilidad de
cambios químicos originados por las temperaturas, la melaza debe almacenarse a la menor
temperatura posible26.
La cantidad de melaza almacenada y la duración del período de almacenamiento, son
factores que se debió considerar ya que esa puede ser la causa de que la levadura no produjo
porcentajes de alcohol más altos al no tener la fuente de carbono y nitrógeno libres ya que se
formaron impurezas coloidales debido a un mal almacenamiento (temperatura ambiente).
Pues se sabe que el carbono sirve como fuente de energía y como material constitutivo de la
masa celular y el nitrógeno se encuentra en la célula formando parte esencial de las proteínas,
aminoácidos y ácidos nucleicos. Además según investigaciones realizadas, se ha reportado
que en un cultivo para levaduras en melaza la relación carbono/nitrógeno debe ser 1:1 para
que la productividad celular sea máxima26.
Una de las etapas en el proceso de fermentación es la preparación del “mosto”, el cual
consiste (en este caso particular) en una dilución de la melaza hasta 12-14º Brix por adición
de la cantidad adecuada de agua. Suele ser satisfactoria una concentración de azúcar del 10 al
18%, el valor más corriente es del 12%. Cuando se trabaja con concentraciones de azúcar muy
altas, del orden de 22%, se observa una deficiencia respiratoria en la levadura y un descenso
de la velocidad de fermentación; por el contrario, al trabajar con concentraciones muy bajas,
el proceso resulta antieconómico ya que requiere un mayor volumen para la fermentación. Por
esto se utiliza como sustrato la melaza, que tiene de 10 − 15% de azúcar. La melaza con la
que se trabajó tuvo 26.82% de sacarosa con un Brix de 80.5 la cual se diluyó hasta obtener
14ºB y 13.31% de azúcares. La evaluación de los grados brix (sólidos solubles), muestra una
disminución al final de la fermentación con respecto al blanco (fermentación alcohólica sin la
adición de enzima) como se observa en la figura 4, lo cual es indicativo de que hubo
conversión a etanol. La disminución del grado Brix puede estar dada por la asimilación de
maltosa, almidón amilasa hidrolizados por el complejo enzimático1,17,18,28.
Las condiciones de fermentación también pueden ser un factor importante en la
producción de etanol; así el pH óptimo para el metabolismo de la levadura es de pH 4.5; el
tipo de azúcares también es un factor importante, la levadura solo metaboliza directamente
azúcares simples (glucosa y fructosa). Para fermentar disacáridos como la sacarosa, presentes
en jugos y mieles de caña, por ejemplo, la levadura emplea la enzima invertasa para desdoblar
la sacarosa en sus azúcares simples glucosa y fructosa. Para procesar materiales que contienen
azúcares simples y disacáridos, como las mieles de la industria de la caña de azúcar, basta con
diluir hasta conseguir concentraciones apropiadas (se diluyo hasta los 14ºB) y luego agregar
cantidades de levadura suficientes (2.76X107 cel/mL). Sin embargo, el porcentaje de alcohol
que se puede obtener en la fermentación está limitado por la tolerancia de la levadura a las
concentraciones de alcohol, lo cual varía de una especie a otra. El alcohol tiene un efecto
negativo sobre las enzimas que la levadura emplea para desdoblar el azúcar, por lo que a
medida que se genera durante la fermentación, la capacidad de la levadura para producirlo se
ve reducida.
Se ha demostrado que las membranas citoplasmáticas y de varios organelos son el
blanco principal para la inhibición por etanol. El alcohol ocasiona alteraciones en la
organización y permeabilidad de las mismas al afectar su composición lipídica y el
funcionamiento de proteínas de membrana involucradas en el transporte de azúcares y
aminoácidos. Estos cambios en la permeabilidad, causan la fuga de cofactores, coenzimas y
nucleótidos. La pérdida de estas biomoléculas, esenciales para la actividad de enzimas
involucradas en la glicólisis y producción de alcohol, son suficientes para explicar el efecto
inhibitorio del mismo20,21,22,23.
No obstante, se ha reportado que es posible alcanzar hasta 21% de alcohol con
especies genéticamente adaptadas y bajo ciertas condiciones. Lo común en la industria del
alcohol es alcanzar porcentajes de entre 9 a 15%. Sin embargo a nivel de laboratorio,
Concepción y Col24 reportaron rangos de 4.88 - 9.84 % y 4.95 - 9.56% y en ninguno de los
casos se excedió el 10% respectivamente, haciendo corridas experimentales con nitrógeno
(sulfato de amonio) y sin nitrógeno concluyeron que la adición de la fuente de nitrógeno
exógena no tuvo influencia sobre el rendimiento de alcohol además que en 4 y 8% de alcohol
existe una meseta que demuestra la estabilidad en la actividad celular.
En el presente estudio el porcentaje de alcohol producido por Sacharomyces cerevisiae
empleando diferentes concentraciones del extracto enzimático de Aspergillus oryzae también
dio valores bajos entre 4,27 y 4,47% (Fig 1.) hecho que se puede explicar como lo hacen
Hoyos y Carrera que reportaron un incremento del grado alcohólico del 8% a 10% v/v con la
adición de de enzimas obtenidas por fermentación en sustrato sólido con Rhizopus niveus,
concluyendo que es un valor satisfactorio pero muy bajos probablemente por la cepa de
Saccharomyces usada, la cual no es una cepa mejorada y específica para obtención de
alcohol pero al añadir el complejo enzimático la cepa presentó tolerancia (cepas clasificadas
así cuando soportan de 9 a11% de alcohol)10,24.
La adición de sulfato de amonio como fuente de nitrógeno a las distintas
concentraciones de miel durante la fermentación, surte a las levaduras de una fuente externa
de nitrógeno en exceso. Por una parte el sulfato de amonio favorece la reacción fermentativa y
por otra incrementa el ªBrix inicial, aumentando las presiones osmóticas del medio que se
oponen a los procesos celulares. El aumento progresivo de los niveles de sólidos en el medio
incrementan las presiones osmóticas, lo que conlleva a un incremento en la concentración de
etanol intracelular, lo cual da como resultado un decremento de las enzimas intracelulares que
intervienen en la producción de etanol24.
Por las razones mencionadas anteriormente no se le añadió sulfato de amonio al medio
Caldo Melaza debido a que la fuente de nitrógeno exógeno no ejerce efecto en cuanto al
aumento de la producción de alcohol. Esto evidencia que la melaza utilizada contiene la
suficiente cantidad de nitrógeno alfa amino (6.3% proteínas) para el metabolismo celular a
estas concentraciones18,24.
CONCLUSIONES
1. El complejo enzimático producido por Aspergillus oryzae, a una concentración de
676.42 UA/dL (unidades aminolíticas) y proteasas con una actividad de hidrolizar
2.7305mg de caseína a 37ºC por 30 minutos; tiene efecto sobre la producción de
alcohol etílico por Saccharomyces cerevisiae aumentando la producción de etanol. en
condiciones de laboratorio.
2. Se obtuvo un incremento del porcentaje alcohólico de 3.73 % a 4.47% v/v con un
porcentaje de adición complejo enzimático de 4% valor estadísticamente significativo
pero bajo debido a que la cepa de Saccharomyces usada no es una cepa mejorada.
3. Al comparar estadísticamente el porcentaje de alcohol con los tratamientos de 2,4 y
6% de concentración del complejo enzimático, se observó que no hay diferencia
significativa entre estas concentraciones. Sin embargo si hay diferencia significativa
entre estas concentraciones y el control.
AGRADECIMIENTOS
A la Ms.C. Nélida Milly E. Otiniano García; por su asesoramiento, constante apoyo y
sus acertados consejos sin los cuales no hubiera sido posible la realización de la presente tesis.
Al Ms C. Julio Arrellano Barragán; por ayudarme a resolver algunas inquietudes que
se han estado presentando durante el desarrollo de la tesis.