Research Collection
Doctoral Thesis
Neue Aspekte der Biosynthese von Herqueinon undIsoherqueinon
Author(s): Hostettler, Bernhard
Publication Date: 1984
Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000336983
Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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ETH Library
Diss. ETH Nr. 7503
NEUE ASPEKTE DER BIOSYNTHESE VON
HERQUEINON UND ISOHERQUEINON
ABHANDLUNG
zur Erlangung des Titels eines
Doktors der Naturwissenschaften
der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE
ZÜRICH
vorgelegt von
BERNHARD HOSTETTLER
dipl. Chem. ETH
geboren am 26. Ma'rz 1950
von Wahlern/BE
Angenommen auf Antrag von
Prof. Dr. D. Arigoni, Referent
Prof. Dr. V. Prelog, Korreferent
Zürich 1984
Meinen Eltern und Marlene
in Dankbarkeit
gewidmet
Meinem Lehrer,
Herrn Prof. Dr. Dullio Arigoni,
unter dessen Leitung die vorliegende Arbeit durchgeführt
wurde, danke ich für das interessante Thema, für die vielen
hilfreichen Diskussionen und die Freiheit bei der Lösung der
gestellten Probleme.
- 1 -
INHALTSVERZEICHNIS
Theoretischer Teil
1. Ei nleitung
2. Historischer Ueberblick
3. Problemstellung
4. Die Isolierung der PiIzmetaboliten Atrovenetin,
Herqueinon und Isoherqueinon
4.1. Versuche mit Penicillium Atrovenetum ATCC-13352
4.2. Versuche mit Penicillium Herquei CMI-112950
4.3. Die Isolierung von Herqueinon und Isoher¬
queinon
4.4. Versuche zur Trennung von Herqueinon und
Isoherqueinon
4.5. Die Herstellung von Herqueinon- und Isoher-
queinonmonosilyläthern
4.6. Die Trennung der Monosilyläther von Herque¬
inon und Isoherqueinon
4.7. Die leichte Epimerisierbarkeit von Herqueinon
4.8. Die Entwicklung einer Methode zur Silylie-
rung von Herqueinon und Isoherqueinon in Ge¬
mischen, ohne Epimerisierung
4.9. Die Spaltung der Silyläther von Herqueinon
und Isoherqueinon
4.10. Bemerkungen zu den H-NMR-Spektren eines
Enantiomerengemischs von Isoherqueinon
5. Zur spezifischen Abstammung der geminalen Methyl¬
gruppen C-18 und C-19 im Fünfring von Herqueinon
und Isoherqueinon
5.1. Die Identifikation der Methylgruppen C-18
und C-19 im ]H- und 13C-NMR5.2. Die eindeutige Zuordnung der Signale der Me¬
thylgruppen C-18 und C-19 von Herqueinon und
1 13Isoherqueinon im H- und C-NMR
5.3. Die biogenetische Abstammung der geminalen
Methylgruppen C-18 und C-19 in Herqueinon
und Isoherqueinon
1
4
12
15
15
16
18
21
23
26
30
33
35
36
40
40
42
53
6. Untersuchung des stereochemischen Verlaufs der
Alkylierung mit der C5-Einheit und des darauffol¬
genden Ringschlusses bei der Biosynthese von Her¬
queinon und Isoherqueinon 67
7. Analyse der theoretisch möglichen regio- und ste¬
reospezifischen Vorgänge bei der Bildung des Fünf¬
ringes von Herqueinon und Isoherqueinon 79
7.1. Diskussion der direkten C-Alkylierung 81
7.2. Diskussion der O-Alkylierungen 88
7.3. O-Alkylierung versus C-Alkylierung 97
8. Bestimmung der direkten Vorläufer von Herqueinon
und Isoherqueinon 104
Anhang I Die Röntgenstrukturanalyse eines Racemats
von Isoherqueinontrimethylsilyläther (^9) 111
Anhang II Zur Epimerisierbarkeit von Herqueinon 117
Experimenteller Teil 125
Zusammenfassung 214
Summary 216
Literaturverzeichnis 218
- 1 -
THEORETISCHER TEIL
1. Einleitung
Herqueinon {Y) und Isoherqueinon (2_), zwei aus Penicillium
herquei (Bainier & Sartory) isolierte Metaboliten, besitzen
neben einem Phenalenonkern einen zusätzlichen, ungewöhnlich
verknüpften Fünfring.
Abbildung 1
1: R' = CH3,R2 = H
2:1^ = ^1, R2 = CH3
Experimente haben gezeigt, dass die beiden Metaboliten aus
einem Heptaketidteil und einer Isopentaneinheit aufgebaut
werden.
Abbildung 2
OR
o-...^
- 2 -
Für die Verknüpfung des Phenalenonkerns mit der Cc-Einheit
können zwei mechanistisch interessante Varianten formuliert
werden. Der Verlauf dieser hypothetischen Reaktionsvarianten
wird in Schema 1 verdeutlicht. Die eine beinhaltet eine Clai-
senumlagerung (Weg a) und die andere eine C-Alkylierung mit
einem S«.'-artigen Mechanismus (Weg b).
Schema 1
HERQUEINON ISOHERQUEINON
Die aus P. herquei stets zusammen isolierten Produkte Her¬
queinon (J[) und Isoherqueinon (2) werden je nach Wachstumsbe¬
dingungen des Pilzes in verschiedenen Verhältnissen gewonnen.
Diese Beobachtung suggeriert das Vorhandensein eines gemein¬
samen Vorläufers (wie z.B. k_ in Schema 1),
aus welchem die
beiden Endprodukte J_ und 2_ entstehen könnten.
- 3 -
Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem stereochemischen
Verlauf der Verknüpfung des Phenalenonkerns mit der Iso¬
pentaneinheit und versucht abzuklären, ob Herqueinon (V) und
Isoherqueinon (2^) über eine gemeinsame Vorstufe gebildet wer¬
den.
- 4 -
2. Historischer Ueberblick
1912 beschrieben Bainier und Sartory*•'' einen neuen Penicil¬
lin-Stamm, welchem sie den Namen P. herquei gaben. Sie be¬
richteten, dass dieser Pilz je nach Vorgabe des Nährmediums
ein gelbes oder ein blaugrün fluoreszierendes Pigment bilde¬
te. Heute weiss man, dass es sich beim gelben Produkt um
Atrovenetin (5^) ^2»3) un(j Deim blaugrünen um das Anhydrid 6^(4'5) handelte.
Abbildung 3
1951 versuchten Stodola, Raper und Fennell(6)
einen Zusam¬
menhang zwischen den beiden Pigmenten 5_ und 6^ zu finden. Da¬
bei isolierten sie aber ein neues, ziegelrotes Produkt, für
welches sie die Bruttoformel Cjj^qO,, ermittelten.
1955 erschienen gleichzeitig aus der Gruppe von Stodola(7)
und aus jener von Raistrick(8)
Arbeiten, die sich mit der
Charakterisierung von Herqueinon (_1_), wie der ziegelrote
Festkörper inzwischen von Stodola benannt wurde, befassten.
In Raistricks Arbeit wurde zusätzlich die Isolierung von Nor-
herqueinon (]_) ,dem Anthrachinon Physcion (<8) und von Meso-
erythrit (9) beschrieben.
- 5 -
Abbildung 4
7"
8 9
Intensive Arbeiten zur Untersuchung der Metaboliten von
P. herquei brachten in der Folge Deoxyherqueinon (J_0) ^',
Isoherqueinon (2) ('0)^ Isonorherqueinon (JM_) (°,10) und Her-
queichrysin {\2) * ' ' als weitere aus diesem Pilz isolier¬
te Substanzen hervor.
Abbildung 5
10 2 = R = CH3 12
TJ:R = H
1956 beschrieb G. Smith ^3) den morphologisch engen Zusam¬
menhang der beiden Pilze Penicillium herquei und Penicillium
atrovenetum. Kurz darauf isolierte Raistrick 111)aus
P. atrovenetum Atrovenetin (5) und vermutete eine nahe struk-
- 6 -
relle Verwandtschaft zwischen diesem und Norherqueinon (7_)
sowie Herqueinon (Y). Diese Verwandtschaft wurde noch im sel¬
ben Jahr von Barton und Mitarbeitern bestätigt ^2'. Sie zeig¬
ten, dass man aus Norherqueinon (]_) durch Reduktion mit Zink
direkt zu Atrovenetin (5^ gelangt. Eine erste, allerdings
noch falsche Konstitution _1_3 für Atrovenetin (5_) publizierten
Barton, deMayo, Morrison und Raistrick '^' im Jahr 1959.
Abbildung 6
OH
Diese falsche Struktur J_3 für Atrovenetin (5_) basierte auf
der gesicherten Konstitution des Phenols 13a, welches aus
Atrovenetin durch Abbau mit Salpetersäure erhalten worden war
(vgl. Abbildung 7).
Abbildung 7
- 7 -
1962 wurde die heute gültige Konstitution des Atrovenetins
(j>) von Paul, Sim und Morrison ^'^>'°> durch Röntgenstruktur-
analyse der Verbindung 14 hergeleitet (vgl. Abbildung 8).
Abbildung 8
FeCI4- OCH3
HOv.+^L ^OCH3
HO OCH3
Als nun die richtige Struktur von Atrovenetin (]5) vorlag,
schlug R.B. Woodward *'5) ais erster eine Gerüstumlagerung
vor, welche während des Säureabbaus von Atrovenetin (5) zum
Phenol 13a geschehen müsste, um die geänderte Konstitution in
13a zu erklären. Der Abbau hätte dann über ein Zwischenpro¬
dukt wie 13b zu verlaufen (siehe Abbildung 9)•
Abbildung 9
N020
HO>
02N-
NO,
*<s.
2 Q
b
13a
Mit Hilfe der von Barton und Mitarbeitern ^2'nachgewiesenen
Verwandtschaft zwischen Deoxynorherqueinon (=Atrovenetin (5_))und dessen Monomethyläther JJ) schloss dieselbe Arbeitsgruppe
1959 aus der Konstitution des Atrovenetins (5_) auch auf jene
des Herqueinons {Y) ^ '.
In den 70er-Jahren wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen
versucht, mit Hilfe spektroskopischer Daten die Konstitution
von Herqueinon (_1_) eindeutig zu erfassen vlOt17»1öj^
Die Struktur von Herqueinon (Y), einschliesslich der absolu¬
ten Konfiguration, wurde aber erst 1980 von Quick, Thomas und
Williams mit Hilfe einer Röntgenstrukturanalyse bestimmt
*'9>. Die absolute Konfiguration am C-16 von Herqueinon (_0war allerdings schon früher bekannt. 1971 berichteten Brooks
und Morrison in einer kurzen Mitteilung(20> und 1974 in ei¬
nem ausführlichen Artikel '21'über die Bestimmung der abso¬
luten Konfiguration von Atrovenetin (j>) und verwandter Ver¬
bindungen. Ausgehend von einem Gemisch aus Herqueinon (_1_) und
Isoherqueinon (2), gelangten sie mit einer aufwendigen
Reaktionssequenz und nach der Trennung zweier diastereomerer
Alkohole ^5 und J_6 zu den enantiomeren Acetaten YJ_ und 18,
welche sie mit Aethyllactat (J_9) bekannter absoluter Konfigu¬
ration verknüpften (vgl. Schema 2).
Bereits in ihrer Arbeit über die Herleitung der Konstitution
von Atrovenetin (5_) schlugen Barton et al. einen Weg für die
Biosynthese von Pilzphenalenonen vor^ '. Sie postulierten
für den Phenalenonkern einen Aufbau aus Acetateinheiten und
für den Dihydrofuranring Mevalonsäure (]56_) als Vorläufer.
Durch Einbauversuche mit radioaktiv markierten Vorläufern
konnte Thomas * 2'diese Hypothese 1961 verifizieren. (1-
l4C)-Acetat und [2-1 ''c]-Mevalolacton (55a) wurden von P. her¬
quei in Norherqueinon (7_) eingebaut; Mevalolacton aus¬
schliesslich in der Isopentaneinheit.
- 9 -
Schema 2
OCH,
3 Stufen
y 3 Stufen
HO j-~COOC2H5 ^
CH3
19
OCH3
H3CO\^^-OCH3
7Stufen
H3C CH3
17:R1 = CH3,R2 = H
18: R^H, r2=CH3
Die Art der Faltung des postulierten offenkettigen Heptake-
tids ,20 zur Bildung des Phenalenons 2k_ wurde 1979 von Simpson
<-23)abgeklärt (siehe Schema 3) •
Die Bildung von 2_4 ist im Prinzip aus den drei Konformeren 2_1_
bis £3 denkbar. Durch Einbau von [1,2- 'cJ-Acetat in Deoxy-
herqueinon (JK)) konnten die Faltungen 2\_ und 2_3 ausgeschlos¬
sen werden.
Die Fähigkeit von P. herquei ,Atrovenetin (5_), Deoxyher-
queinon (_1_0) , Herqueinon {Yi und Norherqueinon (J_) ineinander
überzuführen, wurde von Kriegler und Thomas '2^'untersucht.
Ihre Arbeit ergab, dass aus ( + )-(R)-Atrovenetin (5_) durch
Oxydation (+)-(R)-Norherqueinon (]_) gebildet wird. Dieses
kann aber nicht mehr zu Herqueinon (J_) methyliert werden.
(+)-(R)-Atrovenetin (5^) jedoch wird mit S-Adenosylmethionin
zu ( + )-(R)-Deoxyherqueinon (_1_0) methyliert, welches dann zu
Herqueinon (Y) oxydiert werden kann.
Frost, Haiton und Morrison ^2->J äusserten 1977 die Vermutung,
dass aus (-)-(S)-Atrovenetin ((-)-5) in einer ähnlichen Reak-
- 10 -
Schema 3
tionsfolge Isoherqueinon (2^) und Isonorherqueinon (J_U ent¬
stehen könnten. Diese Vermutung basierte auf der Isolierung
von teilweise racemischem Atrovenetin (5_) aus P. herquei.
Aufgrund des gleichzeitigen Auftretens von Herqueichrysin
(12) mit Verbindungen aus der Atrovenetin/Herqueinon-Reihe in
P. herquei postulierte Simpson 1979 ^23), dass \_, 5 und \2_
aus dem gemeinsamen Vorläufer ^ entstehen könnten (vgl.
Schema 4).
Eine ausführliche Zusammenfassung über die in der Natur vor¬
kommenden Phenalenone und verwandter Verbindungen findet man
bei Cooke und Edwards ^2o)_
- 11 -
Schema 4
SAM
Cyclisatlon
OCH3
HO^^k^OH
- 12 -
3. Problemstellung
Brooks und Morrison ^10)^ aber auch Cason, Koch und Correia
(17)vl'' berichteten, dass es ihnen nicht gelungen sei, Isoher¬
queinon (2_) durch fraktionierende Kristallisation oder mit¬
tels verschiedener Chromatographieverfahren von Herqueinon
(Y) abzutrennen.
Die Darstellung herkömmlicher Derivate wie Methyläther oder
Acetate führte ebenfalls zu Schwierigkeiten ''.4)j da aus
beiden Metaboliten jeweils eine ganze Reihe von Produkten
entstand.
Bevor überhaupt mit der Lösung von chemischen oder biochemi¬
schen Problemen begonnen werden konnte, galt es vorerst rei¬
nes Herqueinon (Y) und Isoherqueinon(2j oder geeignete Deri¬
vate der beiden zu isolieren.
Eine Antwort auf die Frage nach dem stereochemischen Verlauf
der Alkylierung des Phenalenons 2f± mit der Cc-Einheit 2J_ bei
der Biosynthese von Herqueinon (,Y) und Isoherqueinon (2_)
(vgl. Schema 5) kann unter folgenden Bedingungen gefunden
werden :
- die beiden geminalen Methylgruppen C-18 und C-19 der End¬
produkte müssen spektroskopisch unterschieden werden
- einen stereospezifischen Einbau der Isopentaneinheit 27
einmal vorausgesetzt, müssen die Methylgruppen C-18 und
C-19 wie im Schema 5 gezeigt auf dem Weg von der Cc-Ein¬
heit bis zu den Endprodukten 2_8, 2j) oder 3_0_ und 3J. ihre
Identität stets bewahren.
Der zweite Schritt bestand also in der Suche nach einem Vor¬
läufer, welcher den soeben aufgezählten Bedingungen ent¬
spricht.
Danach galt es, eine Aussage über den sterischen Verlauf der
Cyclisation des postulierten Vorläufers 4^ zu den Endprodukten
1 und 2 zu machen (vgl. Schema 6, Seite 14).
- 13 -
Schema 5
SOiR^CHg F»2
31 R^H, R2 = CH3
Es müsste somit ein mit verschiedenen Wasserstoffisotopen H«
und Hg stereospezifisch markierter Vorläufer 3_2 gefunden wer¬
den, so dass nach dessen Kondensation mit dem Phenalenonkern
26 allenfalls eine doppelt markierte, offenkettige Vorstufe
33 gebildet wird. Durch Protonierung mit dem dritten Isotop
tir aus der Nährlösung und anschliessende Cyclisation zu den
Endprodukten J_ und 2_ müssten daraus Herqueinon (.Y) und Iso¬
herqueinon (2) mit chiralen Methylgruppen C-15 entstehen.
Schliesslich mussten für die Verifizierung der Hypothese,
dass Herqueinon (J_) durch Oxydation von (+)-(R)-Deoxyher-
queinon (J_0) und Isoherqueinon (2_) durch Oxydation von
(-)-(S)-Deoxyherqueinon ((-)-(JJD)) entstehen, diese beiden
Vorläufer in geeignet markierter und reiner Form hergestellt
werden (vgl. Abbildung 10).
- 14 -
Schema 6
AA"he
32
H.
HA= T, HB=DX = OPP
*! HA-C= H
23!HA=T,HB=D,HC=Hoder: HA=D,Hß=T,HC=H
35 iR^CHDT, RZ=H
36 :R^=H, R2=CH0T
Abbildung 10
10 = R1 = CH-, R = H
37 : R^= H, R= CH,
- 15 -
4. Die Isolierung der Pilzmetaboliten Atrovenetin, Herqueinon
und Isoherqueinon
4.1. Versuche mit Penicillium atrovenetum ATCC-13352
Zu Beginn der vorliegenden Arbeit wollte man einen Abbau der
Cc-Einheit am stereochemisch einheitlichen Atrovenetin (5)
durchführen. Deshalb wurde zuerst mit der Züchtung von
P. atrovenetum begonnen.
Eine Penicillium-atrovenetum-Kultur, Stamm S. M. 683 (ATCC-
13352)* wurde genau nach den Vorschriften von Neill und Rai-
strick '3) auf Kartoffel-Dextrose-Agar vermehrt. Die reifen
Schrägagarkulturen wurden anschliessend zum Impfen von
Flüssigkulturen verwendet. Auch hier folgte man genau der
Vorschrift von Neill und Raistrick. Hatten sich bei der Auf¬
zucht von P. atrovenetum auf Schrägagar keine Schwierigkeiten
ergeben, so stiess man auf umso grössere bei den Grossansät¬
zen zur Produktion von Atrovenetin (5_) in Flüssigkulturen.
Anfänglich verlief das Wachstum dieser Kulturen wie bei Neill
und Raistrick '3) beschrieben. Aber bereits nach einer Inku¬
bationszeit von 7 Tagen kam es gegenüber Raistricks Versuchen
zu einem deutlich verlangsamten Wachstum der Oberflächenmyce-
lien. Auch 18 Tage nach dem Ueberimpfen hatte nur ein schwa¬
ches Pilzwachstum stattgefunden. Von den bei Raistrick be¬
schriebenen gelben Kristallisaten in der Nährlösung und auch
von der Gelbfärbung des Mycels war keine Spur zu sehen. Diese
ersten Kulturen wurden deshalb verworfen.
Nun versuchte man die Wachstumsbedingungen für die Flüssig¬
kulturen durch eine Reihenuntersuchung zu optimieren. Die Be¬
dingungen sowie die bei den verschieden behandelten Kulturen
gemachten Beobachtungen sind in Tabelle 1 im Experimentalteil
auf Seite 132 aufgeführt.
* "ATCC": American Type Culture Collection Nr. 13352
- 16 -
Die Kulturen Nr.2 und 6 wurden als einzige aufgearbeitet. De¬
tails zur Aufarbeitung sind im Experimentalteil der vorlie¬
genden Arbeit (Seite 130) festgehalten.
Auffallend war, dass praktisch bei allen Ansätzen eine grün¬
liche Verfärbung der ganzen Kulturen auftrat. Diese deutet
auf einen oxydativen Abbau des Atrovenetins (j>) zum entspre¬
chenden Anhydrid 6^ hin (4>5). Dieselbe Grünfärbung gekoppelt
mit schlechten Ausbeuten an Atrovenetin (5_) wurde auch von
Thomas festgestellt '27). Die weitere Verarbeitung des Rohex¬
trakts aus den Kulturen Nr.2 und 6 erfolgte deshalb in einer
"Drybox" unter striktem Ausschluss von Sauerstoff und Wasser.
Dabei konnten im Gesamten 11 mg reines Atrovenetin (5^) iso¬
liert werden, welches in trockener Form nun sehr stabil war.
Die geringe Ausbeute von nur 0,1% reinem Produkt bezüglich
der Trockenmasse des isolierten Mycels stand im krassen Ge¬
gensatz zu den von Neill und Raistrick *3) erzielten Ausbeu¬
ten von bis zu 5% bezogen auf das Trockenmycel.
Weil zudem ein Abbau unter Erhaltung der Stereochemie am
Fünfring bei Atrovenetin (5_) nicht bekannt, ein solcher für
(10 ?0 ?1)Herqueinon (J_) aber beschrieben worden war \|u>cui^l') wurde
die Produktion und Isolierung von Atrovenetin (5_) nicht mehr
weiter verfolgt.
4.2. Versuche mit Penicillium herquei CMI-112950*
Nach einer von T. J. Simpson (23) beschriebenen Methode wur¬
den Schrägagar-Kulturen von P. herquei CMI-112950, welche wie
bei P. atrovenetum auf Kartoffel-Dextrose-Agar gezüchtet wor¬
den waren, auf zwei Flüssigkulturen überimpft und nach vier
Tagen als Schüttelkulturen weiter inkubiert. Nach insgesamt
zwölftägigem Wachstum wurden sie als Impfmaterial für einen
* "CMI":Commonwealth Mycological Institute, Stamm 112950
- 17 -
Grossansatz von 25 Flüssigkulturen verwendet. Letztere wurden
direkt nach dem Animpfen geschüttelt. Nach neun Tagen wurden
die Mycelien geerntet. Das getrocknete und pulverisierte My-
cel wurde anschliessend mit Aether extrahiert. Aus den 42 g
Mycelpulver konnten 650 mg Rohextrakt gewonnen werden.
Das grüne Rohprodukt wurde wie bei Simpson beschrieben acety-
liert. Ein Dünnschichtchromatogramm zeigte das Vorhandensein
von mindestens 11 verschiedenen Produkten an. Ein Teil des
rohen Acetylierungsgemischs wurde auf Kieselgel säulenchroma-
tographiert. Dabei wurde der grösste Teil der aufgetragenen
Substanz auf dem Trägermaterial zurückgehalten, und es konn¬
ten keine nennenswerten Mengen identifizierbarer Produkte ge¬
wonnen werden. Den Rest des kristallinen Acetylierungsproduk-
tes versuchte man durch Umkristallisieren zu reinigen. Nach
Versuchen mit einer ganzen Reihe von Lösungsmitteln und -ge-
mischen konnten aus Essigester/Hexan kristalline, orange Pro¬
dukte gewonnen werden, die aber uneinheitlich waren.
In einem weiteren Versuch wurden neun Flüssigkulturen nach
der Methode von Simpson^23)
gezüchtet und inkubiert. Nach
der Isolierung von 13,5 g getrocknetem Mycel wurde dieses
nach einer Vorschrift von Neill und Raistrick '3'weiterver¬
arbeitet. Einer Extraktion des Mycels mit Hexan - um die
fettlöslichen Teile zu entfernen - folgten zwei Auszüge mit
Aether und einer mit Aceton. Ueber die dabei erzielten Aus¬
beuten gibt Tabelle 2 Auskunft. Alle Extrakte ergaben nur
grüne Produkte. Von den erwarteten und beschriebenen roten
Produkten fand sich keine Spur.
Die zweite Aetherfraktion wurde erneut nach einer Vorschrift
von Neill und Raistrick '3) acetyliert. Nach der Aufarbeitung
erhielt man ein braunes Produkt, welches zweimal dünn-
schichtchromatographiert wurde. Auch nach dieser Behandlung
erhielt man ein laut NMR-Analyse sehr uneinheitliches Pro¬
dukt.
- 18 -
Tabelle 2
Hexan-Extr. 1.Aetherextr. 2.Aetherextr. Acetonextrakt
88 mg 261 mg 41 mg 558 mg
Die Untersuchungen an P. Herquei CMI-112950 wurden auf dieser
Stufe abgebrochen.
4.3. Die Isolierung von Herqueinon und Isoherqueinon
Die Isolierung eines Herqueinon/Isoherqueinon-Gemischs aus
P. herquei IMI-89376* wurde von Galarraga, Neill und Rai¬
strick sehr präzise^°' beschrieben. Ihre Vorschrift wurde
für die Zwecke der vorliegenden Arbeit nur geringfügig abge¬
ändert .
Eine Kultur des oben erwähnten Pilzes wurde anstatt auf ge¬
wöhnlichem Malzagar auf einem selbst hergestellten Kartof-
fel-Dextrose-Agar vermehrt. Vorversuche hatten gezeigt, dass
der Pilz auf diesem Nährboden viel rascher und homogener ge¬
dieh.
Fünf Wochen alte Schrägagar-Kulturen, welche zu diesem Zeit¬
punkt sicher sporuliert hatten, wurden in Form einer Sporen¬
suspension auf ein Raulin-Thom-Flüssigmedium überimpft und
während 18 Tagen inkubiert. Nach dieser Zeit wurde das Mycel
geerntet, getrocknet und extrahiert.
Wurde die Extraktion unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt,
so erhielt man als Rohprodukt einen rostbraunen Festkörper.
* "IMI-89376": heute: "CMI": Commonwealth Mycological In¬
stitute, Stamm 89376 (vgl. Seite 55).
- 19 -
Aus diesem Hessen sich durch Umkristallisation aus Chloro¬
form und Hexan oder aus siedendem Aethanol in über 80J-iger
Ausbeute rote Nadeln gewinnen. Eine 1H-NMR-Analyse zeigte,
dass es sich dabei um Mischkristalle aus Herqueinon (Y) und
Isoherqueinon (2_) handelte.
Da man später Zugang zu racemischem Isoherqueinon (2_) hatte,
welches in achiralen Lösungsmitteln in 100 MHz-Spektren die¬
selben NMR-Signale aufweist wie natürliches (+)-Isoherqueinon
(2_) ,und weil Herqueinon (Y) und Isoherqueinon (2_) vom Pilz
nicht in gleichen Mengen produziert wurden», konnten die Si¬
gnale den beiden Metaboliten (Y) und (2_) auch in Gemischen
zugeordnet werden.
Erfolgte die Extraktion des Mycels unter Sauerstoff (Luft)
und Licht, so erhielt man einen tiefgrünen Festkörper, wel¬
cher durch Umkristallisation aus siedendem Aethanol ebenfalls
Herqueinon (Y) und Isoherqueinon (2_) als Mischkristalle in
einer Ausbeute von 40-50? lieferte.
Unter diesen Bedingungen wurde offensichtlich ein erheblicher
Teil der vom Pilz gebildeten Phenalenone zum Anhydrid 6^ (vgl.
Seite 4) oxydiert. Dass dies relativ rasch geschieht, wurde
schon 1959 von Barton * ' beobachtet und 1963 von Narasimha-
chari und Vining^'
erneut festgehalten.
Je nach Umkristallisierverfahren lag das Verhältnis von Her¬
queinon (Y) zu Isoherqueinon (2_) zwischen 30:70 und 65:35.
Bei sehr sorgfältigem Arbeiten und bei ausschliesslicher Ver¬
wendung von Chloroform und Hexan zum Umkristallisieren konnte
reproduzierbar ein Verhältnis von 56:44 zugunsten von Her¬
queinon (Y) erzielt werden. Beim Gebrauch von Aethanol als
Lösungsmittel während des Umkristallisierens wurde Isoher¬
queinon (2_) immer als Hauptkomponente isoliert. Dieser Befund
deckt sich gut mit der schon 1955 von Cason und Mitarbeitern
gemachten Beobachtung ('', dass sich das UV-Spektrum von
"Herqueinon" (1) in Aethanol mit der Zeit verändert. In der
* Vergleiche dazu Abschnit 4.10.
- 20 -
vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass das von Cason
beschriebene '•', am Ende stabile UV-Spektrum von "Herquei¬
non" in Aethanol mit demjenigen von künstlich erzeugtem, ra-
cemischem Isoherqueinon (2_) weitgehend übereinstimmt.
Ohne zu wissen, dass sie neben Herqueinon (_0 immer auch
(+)-Isoherqueinon (2_) mitisoliert hatten, konnten Cason et
al. das gefundene Phänomen nicht deuten. Ebenso wenig ver¬
standen sie, dass die spezifische optische Drehung von "Ca-
son-Herqueinon", welche in Chloroform +345° betrug, in 0,1 N
Natronlauge sofort auf +5,5° zusammenfiel, ohne sich dann
über Stunden hinweg weiter zu verändern.
Diese und auch weitere, von andern Autoren mitgeteilte Beob¬
achtungen bedürfen hier eines Kommentars.
Bereits 1955 beschrieben Galarraga, Neill und Raistrick *-°>
die Bildung von optisch inaktivem "Isoherqueinon", das durch
Behandeln einer Acetonlösung von "Herqueinon" (welches auch
hier (+)-Isoherqueinon {2) enthielt) mit wasserfreiem Kalium-
carbonat entstanden war.
Während 15 Jahren blieb die Wichtigkeit dieser Beobachtungen
unerkannt. Erst 1970 konnten Brooks und Morrison ^'°'zeigen,
dass es sich beim früher beschriebenen v 'optisch inaktiven
"Isoherqueinon" um ein nahezu 1:1-Gemisch von (+)- und
(-)-Isoherqueinon handelte.
Milde basische Behandlung von (+)-Herqueinon (Y) führt offen¬
bar zur Epimerisierung am tertiären Carbinolzentrum 11, wobei
sich enantio-Isoherqueinon ((-)-Isoherqueinon) bildet. Zusam¬
men mit dem schon vorhandenen, durch den Pilz erzeugten und
unter den herrschenden Bedingungen stabilen (+)-Isoherqueinon
kommt es künstlich zu einem Enantiomerengemisch, welches bei
der Umkristallisation in Form des Racemats von (2_) anfällt.
Diese erstaunlich rasch und unter sehr milden Bedingungen ab¬
laufende Epimerisierung von Herqueinon (_1_) wird im Anhang II
diskutiert.
- 21 -
4.4. Versuche zur Trennung von Herqueinon und Isoherqueinon
Obschon Brooks und Morrison ('°> wie auch Cason et al. ('<'
eine direkte Trennung der beiden aus dem Mycel von P. herquei
isolierten Isomeren _^ und 2_ als unmöglich beschrieben, wurde
in der vorliegenden Arbeit mit moderneren Methoden versucht,
eine solche Separation doch noch zu erzwingen.
Versuche mit normaler Chromatographie an Kieselgel scheiter¬
ten alle an der sehr starken Polarität der beiden Substrate _1_
und g_. Auch mit Hilfe der Flash-Chromatographie(2°)
und un¬
ter Verwendung so polarer Laufmittel wie zum Beispiel Metha¬
nol/Essigsäure 95:5 gelang es nicht, die einmal aufgetragenen
Substanzen wieder vom Trägermaterial herauszulösen. Dasselbe
Resultat ergab sich bei der Anwendung der Hochdruck-Chromato¬
graphie (HPLC-Verfahren). Etwas erfolgreicher gestaltete sich
die Benützung von sehr apolaren stationären Phasen (Rever-
sed-Phase-Methode) unter HPLC-Bedingungen.
Bei Verwendung von C^-silylierten Trägern, welche nach einem
von H. Härder ^29; entwickelten Verfahren behandelt worden
waren, konnten Herqueinon (Y) und Isoherqueinon (2_) in analy¬
tischen Mengen rein dargestellt werden. Als mobile Phase
diente dabei ein Laufraittelgemisch aus Methanol/Wasser/konz.
Phosphorsäure von 500:250:1 ^30)_pie phosphorsäure war not¬
wendig, um eine dauernde Protonierung der Substrate _1_ und 2_
während der ganzen Chromatographie zu gewährleisten. Gab man
der mobilen Phase keine Phosphorsäure zu, so führte dies zu
einem starken Ueberladen der Säulen auch schon beim Auftragen
kleinster Mengen von Substraten. Eine Trennung der beiden
Isomeren _]_ und 2_ wurde dadurch verunmöglicht (vgl.
Abbildung 11).
Die Trennkapazität des phosphorsäuregepufferten "Rever-
sed-Phase- Systems" war aber so gering, dass nur Substratmen¬
gen bis zu 10 fig aufgetragen werden konnten. Dabei waren die
Retentionszeiten sehr lang (teilweise über 30 Minuten) und
die Phosphorsäure war nach erfolgter Chromatographie prak¬
tisch nicht mehr zu entfernen.
- 22 -
Da ein Verfahren für präparative Zwecke gesucht war, wurde
auf eine weitere Ausarbeitung dieser Methode verzichtet.
Abbildung 11
Int. Int.
—r—
10
-r-
15
—T-
20
•-t
10 1 5
-J—
20
Chromatogramm ohne Zusatz von Chromatogramm bei Zusatz von
Phosphorsä'ure Phosphorsäure
Gaschromatographische Verfahren verlangten bereits bei analy¬
tischen Versuchen Temperaturen von 300 °C, so dass eine prä¬
parative Anwendung dieser Methode überhaupt nicht in Frage
kam.
Nachdem chromatographische Verfahren offensichtlich nicht zum
Ziel führten, blieb als weitere Möglichkeit zur Trennung der
Pilzmetaboliten 1 und 2 die Suche nach geeigneten Derivaten.
- 23 -
4.5. Die Herstellung von Herqueinon- und Isoherqueinonmonosi-
lyläthern
Wie schon früher erwähnt, schlugen Versuche zur Bildung kon¬
ventioneller einheitlicher Derivate wie Acetaten, Methyl-
äthern oder Halogeniden bereits bei andern Arbeitsgruppen
fehl (3,^i 10, 17)# In (jer vorliegenden Arbeit wurden deshalb
Versuche mit neueren Derivatisierungsmitteln unternommen.
Als eines der ersten Reagenzien prüfte man das heute schon
als Standard-Reagens geltende Trimethylsilylchlorid (TMSC1).
Nach einer Methode von Corey und Venkatesvarlu (3D wurde ein
Gemisch von Herqueinon (_U und Isoherqueinon (2_) in N,N-Dime-
thylformamid (DMF) gelöst, mit zwei Aequivalenten Imidazol
und einem Aequivalent TMSC1 versetzt. Der Verlauf der Reak¬
tion wurde mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie (DC) ver¬
folgt.
Nach dreissigminütigem Rühren bei Raumtemperatur konnten im
Reaktionsgemisch nur die Edukte nachgewiesen werden. Die Men¬
gen des "Katalysators" Imidazol und des Silylierreagens'
TMSC1 wurden in der Folge sukzessive auf 10 (Imidazol) und 5
(TMSC1) Aequivalente erhöht, aber auch dies führte nach län¬
gerem Rühren bei Raumtemperatur zu keiner Reaktion. Nun wurde
versucht, die Reaktion durch Erhöhen der Temperatur in Gang
zu bringen. In einem Mikroansatz von ca. 1 ml Reaktionsge¬
misch wurde das Gefäss mit einem Fön während 30 Sekunden von
aussen erwärmt. Dabei bildete sich über der Reaktionslösung,
welche dunkler wurde, augenblicklich ein feiner weisser Ne¬
bel. Die Kontrolle mit DC zeigte, dass sich nun drei neue,
apolare Produkte gebildet hatten, während die Edukte stark
zurückgegangen waren. Nach zehnminütigem Weiterrühren bei
Raumtemperatur waren keine Edukte mehr nachweisbar.
- 24 -
Spatere Untersuchungen zeigten, dass das kurze Aufheizen für
den Start der Reaktion zwar notwendig war, ein längeres Er¬
warmen der Reaktionsmischung aber zu verminderten Ausbeuten
an silylierten Produkten führte.
Nach der sauren Aufarbeitung der Reaktionslosung verschwanden
die beiden apolareren der drei gebildeten Produkte. Bei ge¬
nauerer Betrachtung des Dunnschichtchromatogramms des ver¬
bliebenen Produkts erwies sich dessen Fleck als Ueberlagerung
zweier Produkte mit sehr geringer Rj—Differenz. Durch Opti¬
mieren des Laufmittelsystems gelang es, von beiden Produkten
genügend Material in reiner Form zu isolieren, um eine umfas¬
sende Analytik durchfuhren zu können. Danach bestand kein
Zweifel: es handelte sich bei den gewonnenen Substanzen um
die am tertiären Carbinolzentrum C-11 monosilylierten Aether
38 und 3j) von Herqueinon (_1_) und Isoherqueinon (2_). Die Zu¬
ordnung der beiden Aether erfolgte aufgrund der Rontgen-
spektralanalyse des kristallinen Silylathers j[9 (siehe
Anhang I), welche diesen als Abkömmling der Isoreihe auswies.
Abbildung 12
Das Verschwinden der beiden apolaren Produkte bei der sauren
Aufarbeitung lasst sich recht einfach erklaren. Beim genaue¬
ren Betrachten des DC's der rohen Reaktionsmischung erkennt
man, dass es sich bei den beiden Flecken mit hohen R^-Werten
- 25 -
ebenfalls um Doppelflecken überlagerter Produkte handeln
muss. Jene verkörpern vermutlich die Di- und Trisilyläther
4£ - 4_5 der beiden Isomeren _1_ und 2_ (vgl. Schema 7) .
Da es sich bei den phenolischen Hydroxylgruppen an den Zen¬
tren C-6 und C-8 in den Edukten eigentlich um Teile vinyloger
Säurefunktionen handelt, entstehen bei der Silylierung von \_
und 2_ an diesen Zentren nicht gewöhnliche Silyläther-, son¬
dern vinyloge Silylestergruppen. Von letzteren ist bekannt,
dass sie speziell im Fall des Trimethylsilylrests sehr hydro¬
lyseempfindlich sind (31,32)_ ge^ ^er sauren Aufarbeitung
wurden diese offensichtlich rasch und vollständig gespalten,
so dass nur die einheitlichen Monosilyläther 3_§_ und 3_9 iso¬
liert wurden.
- 26 -
In der Meinung, dass das zu Beginn beobachtete Scheitern der
Reaktion allein auf das unterlassene kurze Aufheizen zurück¬
zuführen sei, wurden die Reagensmengen auf die Literaturanga¬
ben (31)von i(2 Moläquivalenten TMSC1 und 2,5 Aequivalenten
Imidazol reduziert. Das Erstaunen war recht gross, als auch
nach längerem Erwärmen der Reaktionslösung keine Produktebil¬
dung nachgewiesen werden konnte. Offenbar ist die Reaktion
stark konzentrationsabhängig. In späteren Versuchen konnte
gezeigt werden, dass bei Verwendung minimaler Lösungsmittel¬
mengen von weniger als 1 ml DMF/g Substrat auch der Einsatz
von 2 Aequivalenten TMSC1 und 4 Aequivalenten Imidazol zu gu¬
ten Resultaten führte. In der Praxis, vor allem bei Ansätzen
im Millimolbereich, erwies sich der Gebrauch von 1 Aequiva-
lent Substrat, 5 Aequivalenten TMSC1 und 10 Aequivalenten
Imidazol als optimal.
Die Rjn-Differenz von nur 0,01 zwischen den beiden diastereo-
meren Silyläthern 3_8 und 3_9 auf Kieselgeldünnschichtfolien
war zu gering, um für präparative Zwecke eine genügend gute
Trennung zu gewährleisten. Zusätzlich erschwerend waren das
schon auf DC-Platten beobachtete "Schleppen" und die leichte
Zersetzung der Trimethylsilylderivate. Dieses Verhalten wurde
bei der Uebertragung auf die Säulenchromatographie noch ver¬
stärkt .
4.6. Die Trennung der Monosilyläther von Herqueinon und Iso¬
herqueinon
Zur Lösung des im vorhergehenden Abschnitt aufgezeigten
Trennproblems boten sich zwei verschiedene Wege an. Der eine
führte über die Entwicklung neuer, stabilerer und grössere
Rf—Differenzen aufweisender Derivate. Der andere verfolgte
die Suche nach besseren Trennsystemen.
- 27 -
Zuerst wurde versucht, durch Aendern der Reste am Silizium¬
atom zu grösseren Rj—Differenzen zwischen den entsprechenden
Silyläthern von 2 und 2_ zu gelangen. In der Folge wurden ver¬
schiedene Silylierreagenzien ausprobiert (vgl. Tabelle 3).
Dabei wurde rasch klar, dass man sich auf diesem Weg in recht
engen Grenzen bewegte. Beim Aendern der Silylreste wurden die
entsprechenden Monosilyläther von Herqueinon (Y) und Isoher¬
queinon (2_), wie aus den R^-Werten in Tabelle 3 hervorgeht,
wieder polarer, was natürlich nicht erwünscht war. Aber auch
die Rf-Unterschiede der enstprechenden diastereomeren Silyl-
äther nahmen nur unwesentlich oder gar nicht zu. In dieser
Richtung war also wenig zu erwarten.
Tabelle 3
Silylrest Rf Her.Der. Rj. Iso.Der. Laufmittel
(CH3)3Si-(CH3)2(C6H5)Si-(CH3)(C6H5)2Si-(C6H5)3Si-
0,19 (3_8>
0,17 (46)
0,09 (48)
0,04 (50)
0,21 (39)
0,19 (47.)
0,12 (4_9)
0.07 (5J.)
Hex/EE=5:1*
* Hexan/Essigester = 5:1
Eine Variante dieses Wegs hätte nun darin bestanden, sich von
den Silyläthern zu lösen und ganz andere Derivate von J_ und 2_
herzustellen. Da die Silylätherderivate als Gemische rasch
und problemlos hergestellt werden konnten, drängte sich aber
die Suche nach einem verbesserten Trennsystem auf. Mit ande¬
ren Worten, es wurde versucht, auf dem zweiten Weg zu einer
Lösung des Trennproblems zu gelangen.
- 28 -
Hier kamen nun die Erfahrungen, welche man bei den Trennver¬
suchen an Herqueinon (Y) und Isoherqueinon (2_) gemacht hatte,
zum Tragen (vgl. Abschnitt 4.4.).
Dort war es - allerdings nur im analytischen Massstab - ge¬
lungen, das bei der "Reversed-Phase-HPLC'-Technik auftretende
"Verschleppen" durch Zugabe von Phosphorsäure in die mobile
Phase zu unterdrücken.
Eine direkte Anwendung dieses Verfahrens kam hier allerdings
nicht in Frage. Erstens sind stark apolare stationäre Phasen
heute noch sehr teuer, und zweitens hätte die Entfernung der
Phosphorsäure nach erfolgter Chromatographie zu Schwierigkei¬
ten geführt.
Der gleiche Effekt wie bei der Zugabe von Phosphorsäure in
die mobile Phase sollte aber auch durch Puffern der stationä¬
ren Phase zu erreichen sein. Falls es gelänge, mit einem Puf¬
fer auf Kieselgel während der Dauer der Chromatographie einen
konstanten Protonierungsgrad der Substrate zu erreichen,
müsste das früher beobachtete "Schleppen" verschwinden.
Nach einer Methode von R. Schwarzenbach ^33; wurde gewöhnli¬
ches Kieselgel für die Flash-Chromatographie in 0,1 N wässri-
gen Lösungen von kristallinen organischen Säuren aufge¬
schlämmt und nach einer Filtration gut getrocknet. Durch die¬
ses Verfahren wird die Oberfläche des Silicagels mit einem
kristallinen Belag der enstprechenden Säure überzogen.
Im vorliegenden Fall wurden Weinsäure, Oxalsäure und Zitro¬
nensäure als Puffermaterial getestet. Bei der Anwendung der
so präparierten Säulen zeigte sich, dass mit zitronensäurege¬
puffertem Silicagel die besten Trennresultate zu erreichen
waren.
Die Vorteile dieses Trennsystems sind augenfällig:
- anstelle von maximal 12$ bei der Chromatographie an unbe¬
handeltem Kieselgel, konnten bei Verwendung des gepuffer¬
ten Materials 95-97$ der aufgetragenen Substratmengen
wieder eluiert werden.
- 29 -
- die Rf—Werte der einzelnen Derivate änderten sich gegen¬
über dem unbehandelten Material nur unwesentlich und
wenn, dann waren sie durchwegs grösser.
- die Rf-Differenzen waren im gepufferten System etwas
grösser als beim unbehandelten Säulenmaterial.
Mit diesem neuen System war es nun möglich, alle in Tabelle 3
(siehe Seite 27) aufgeführten Diastereomerengemische zu tren¬
nen. Ein Optimum wurde beim Gemisch der Dimethylphenylsilyl-
äther 4_6_ und 4_7_ erreicht.
Nach einigen Versuchen ergab sich zur sauberen Trennung der
diversen Silyläthergemische ein Standardverfahren. Das bei
einer Silylierung erhaltene rohe Reaktionsgemisch, welches
noch überschüssiges Silylierreagens und eventuell wenig Eduk¬
te enthielt, wurde auf einer gepufferten Säule grob vorge¬
trennt. Dabei kam es zur vollständigen Befreiung der ge¬
wünschten Silyläther vom Rest des Rohgemischs. Diejenigen
Fraktionen, welche laut DC-Analyse nur Silyläther enthielten,
wurden anschliessend gaschromatographisch untersucht.
Bei einem Wasserstoffdruck von 1,2 bar und Säulentemperaturen
zwischen 250 und 275 °C waren mit den Silyläthern 3_8, ^9 und
46-49 auf Kapillar-GC Retentionszeiten von weniger als 10 Mi¬
nuten zu erreichen. Dabei waren die jeweils untersuchten
Silylätherpaare in allen Fällen basisgetrennt. Die Triphenyl-
silyläther 5_0_ und 5J_ waren allerdings mit den verfügbaren,
nach K. Grob ^34)hergestellten immobilisierten SE-54-Säulen
nicht mehr gut trennbar. Die Siedepunkte dieser Aether sind
offenbar zu hoch, um bei Säulentemperaturen von weniger als
300 °C noch zu einem "verschleppungsfreien" und basisge¬
trennten Chromatogramm zu führen. Temperaturen von über 300
°C hätten aber ein "Ausbluten" der wertvollen Kapillarsäulen
zur Folge. Aus diesem Grund wurden die Triphenylsilyläther 5_0
und 51 nicht mehr weiterverwendet.
- 30 -
Die gaschromatographisch untersuchten Fraktionen wurden nun
in vier Gruppen unterteilt:
- in die beiden sauberen, je nur ein Diastereomer enthal¬
tenden Fraktionen
- in die beiden Sorten von Mischfraktionen, welche je eines
der beiden Isomeren im Ueberschuss enthielten.
Fraktionen, die der gleichen Gruppe angehörten, wurden verei¬
nigt und vom Lösungsmittel befreit. Die beiden Sammelmisch-
fraktionen wurde separat nochmals auf einer kleineren Säule
chromatographiert. In der Regel erhielt man auf diese Weise
etwa zwei Drittel des eingesetzten Produktegemischs in Form
diastereomerenreiner Substanzen zurück.
4.7. Die leichte Epimerisierbarkeit von Herqueinon
Wie schon unter 4.3- erwähnt, ist Herqueinon (Y) bereits un¬
ter milden basischen Bedingungen am tertiären Carbinolzentrum
C-11 epimerisierbar. Da das zweite chirale Zentrum unverän¬
dert bleibt, fällt man dabei aus der Herqueinon- in die Iso-
herqueinonreihe, das heisst, es wird das unnatürliche
(-)-Isoherqueinon ((-)-2) gebildet.
Abbildung 13
OCH-, OCH3HO^k^OH
- 31 -
Da es sich beim für die Silylierung verwendeten Reaktionsver¬
mittler Imidazol bezüglich Herqueinon (JO um eine schwache
Base handelt - der pKa von Imidazol beträgt 6,953^35J
_ könnte es bei dieser Reaktion zu Schwierigkeiten kom¬
men. Schon zu Beginn der Silylierversuche beobachtete man ein
zunächst unerklärliches "Verschwinden" der einen Eduktkompo-
nente. Ausgehend von 100$ eines 60:40-Gemischs aus Herqueinon
(Y) und Isoherqueinon (2_), erhielt man zwar in ca. 95$-iger
Ausbeute ein Silyläthergemisch, welches laut DC aber einen
Ueberschuss an Isosilyläther enthielt. Dies war bereits ein
Hinweis darauf, dass ein Teil des eingesetzten Herqueinons
{Y) während der Silylierung epimerisiert haben könnte. Zum
Zeitpunkt dieser Beobachtung wurde deren volle Konsequenz al¬
lerdings noch nicht erkannt. Ersichtlich wurde das Problem
erst, als die Röntgenspektralanalyse von vermeintlich enan-
tiomerenreinem Isoherqueinontrimethylsilyläther (3_9) vorlag.
(Näheres über diese Röntgenanalyse siehe Anhang I).
Die röntgenographischen Daten zeigten eindeutig, dass es sich
bei der untersuchten Substanz um das Racemat (±)-(3_9) handel¬
te. In der Folge wurde das Epimerisierungsverhalten von Her¬
queinon (.Y) unter den Reaktionsbedingungen des Silylierens
genauer untersucht.
Abbildung 14
W-39
H3COHO^-L^OH
SE
- 32 -
Qualitativ liess sich das gleiche Resultat auch an den opti¬
schen Drehwerten des Edukt- und Produktgemischs ablesen. In
einem Versuch, bei welchem nahezu 100$ des eingesetzten Her-
queinons (Y) isomerisierten, hatte das Eduktgemisch in Chlo¬
roform einen Wert von "n = +278°, während das Gemisch nach
der basischen Behandlung einen solchen von «p = -17,5° auf¬
wies .
Ein weiterer Versuch zeigte ebenfalls die leichte Epimeri-
sierbarkeit von Herqueinon (Y) unter basischen Bedingungen
auf.
Eine Probe eines Herqueinon/Isoherqueinon-Gemischs wurde mit
1,3-Diphenyl-1,1,3,3-tetramethyldisilazan (DPTMDS) umgesetzt.
Bei dieser Reaktion entstand Ammoniak, welcher als Base eben¬
falls zu einer Epimerisierung führte. Nach der Chromato¬
graphie des Reaktionsgemischs wurde fast ausschliesslich der
Silyläther >)]_ als Gemisch beider Enantiomeren gefunden (vgl.
Tabelle 4). Der Herqueinonsilyläther ^6 fehlte fast völlig.
Zudem war das isolierte Hauptprodukt aufgrund des gemessenen
Drehwertes von 0° offenbar racemisch. Die Diskrepanz zwischen
eingesetztem 60:40-Gemisch und vorgefundenem Racemat lässt
sich bei genauerer Betrachtung der Aufarbeitung leicht erklä¬
ren. Das Reaktionsprodukt wurde zur Reinigung einmal umkri¬
stallisiert. Dabei kristallisierte vermutlich ein echtes Ra¬
cemat von Isoherqueinon (2_) rascher aus der Lösung aus als
die einzelnen Enantiomeren oder ein zufälliges Gemisch der
beiden. Diese Vermutung wurde unterstützt durch den Befund,
dass ein beim Einengen der Mutterlauge isoliertes Produkt,
welches allerdings gegenüber der 1. Fraktion in leicht ver¬
minderter Reinheit anfiel, eine negative optische Drehung
aufwies.
Damit war die Epimerisierung von Herqueinon (Y) unter den Be¬
dingungen der Silylierung mehrfach nachgewiesen. Dieses Re¬
sultat war für die weiteren Arbeiten entscheidend, und die
Suche nach einer Silyliermethode ohne Epimerisierung von Her¬
queinon (J_) wurde unumgänglich.
- 33 -
Tabelle 4
Fraktionen Nr. Ausbeute Produkte
1- 3
4-13 16,2 mg (i)-47 und andere Produkte
14-25 42,5 mg (i)-47
26-27 2,5 mg (±)_4_7 und 4_6
Chromatographische Ausbeute: 97,5$
Ein Versuch zur Erklärung der doch erstaunlichen Inversion
eines tertiären Carbinolzentrums wird im Anhang II gemacht.
4.8. Die Entwicklung einer Methode zur Silylierung von Her¬
queinon und Isoherqueinon in Gemischen, ohne Epimerisie¬
rung
Da die Methode von Corey und Venkatesvarlu (31)Zur quasi
neutralen Herstellung von Silyläthern offensichtlich noch zu
"basisch" war, wurde zuerst eine phasentransferkatalysierte
Silylierung nach Lissen und Weiffen ^3b) versucht. Die beiden
Autoren beschreiben den Verlauf ihrer Reaktion als neutral.
Die Reaktion scheiterte aber schon an der schlechten Löslich¬
keit der Edukte in den angegebenen organischen Phasen.
In einem weiteren Versuch wurde versucht, die Methode von
Corey zu "neutralisieren". Unter der Annahme, dass das als
"Katalysator" dienende Imidazol rasch silyliert wird, um dann
als eigentliches Silylierreagens zu wirken, müsste es eigent¬
lich möglich sein, durch vorgängige Herstellung dieser reak¬
tiven Spezies die basische Wirkung von Imidazol zu umgehen.
In der Praxis wurde deshalb die Reihenfolge der Zugabe der
- 34 -
Reagenzien gegenüber früheren Versuchen geändert. Zu einer
Lösung des Eduktgemischs in DMF gab man nicht wie bis anhin
Imidazol, sondern zuerst das Silylierreagens zu. Erst dann
gab man portionenweise im Stickstoffgegenstrom Imidazol zur
Reaktionslösung. Damit sollte gewährleistet werden, dass das
Imidazol vom Silyliermittel verbraucht wurde, bevor es zur
gefürchteten Epimerisierung kommen konnte.
Tatsächlich funktionierte dieser simple Trick!
In einem Versuch mit Dimethylphenylsilylchlorid (DMPSC1) als
Derivatisierungsmittel erhielt man nach Chromatographie des
rohen Reaktionsgemischs enantiomerenreine Silyläther ^6_ und
47 (vgl. Tabelle 5). Ausser der Reihenfolge der Zugabe der
Reagenzien war nichts an der alten Vorschrift geändert wor¬
den. Das Verhältnis der Ausbeuten des Herqueinon- zum Isoher-
queinonsilyläther (4_6 zu 4J) in Kombination mit den gefunde¬
nen Drehwerten dieser Produkte bestätigte, dass unter den
neuen Bedingungen am Zentrum C-11 von Herqueinon (J_) keine
Epimerisierung stattgefunden hatte. Bei einer allfälligen
Epimerisierung hätte das Produkteverhältnis gegenüber demje¬
nigen der Edukte ändern und der Isosilyläther 4_7 einen viel
schwächer positiven Drehwert aufweisen müssen.
Tabelle 5
Frakt.Nr. Ausbeute Produkte »D25
1
2-10
11-16
17-27
28-34
Total
6 rag
9 mg
42 rag
13 mg
70 mg
höher silylierte Prod.
Isosilyläther 47a^Mischfraktionen 47 und 46
Herqueinonsilyläther 46a^
92$ bezüglich Rohgemisch
+516°
+663°
a) GC-Analyse: Diastereomerenreinheit > 98$
- 35 -
4.9- Die Spaltung der Silyläther von Herqueinon und Isoher¬
queinon
Mit einer von Gerlach ^3) verfeinerten Methode nach Corey
(3D wurde versucht, die diversen Silyläther von Herqueinon
{Y) und Isoherqueinon (2_) wieder zu spalten.
Zu einer Standardlösung von wasserfreiem Tetrabutylammonium-
fluorid (TBAF) in absolutem Tetrahydrofuran (THF) gab man un¬
ter Schutzgas eine Lösung des entsprechenden Silyläthers in
THF. Dabei wurde die orangerote Reaktionslösung rasch grün.
Nach saurem Aufarbeiten isolierte man ein rotes, kristallines
Rohprodukt in quantitativer Ausbeute.
Fluoridionen in aprotischem Milieu sind ziemlich stark ba¬
sisch. Deshalb müsste auch bei dieser Reaktion wieder mit ei¬
ner Epimerisierung des entstehenden Herqueinons (.Y) gerechnet
werden. Leider bestätigten sich diese Befürchtungen. Die
H-NMR-Analyse eines aus einem 60:40-Gemisch von Herqueinon-
und Isoherqueinonsilyläthern ^8 und 3_9 entstandenen Spaltpro¬
dukts zeigte fast nur noch Signale für Isoherqueinon (2_).*
Dies bedeutet aber, dass der grösste Teil des erwarteten Her¬
queinons (J_) zu (-)-Isoherqueinon epimerisiert hatte.
Mit dieser Spaltreaktion war es also nur möglich, ausgehend
von einem reinen Isosilyläther zu enantiomerenreinem Isoher¬
queinon (2) zu gelangen. Der Zugang zu reinem Herqueinon (_1_)
blieb somit weiterhin verwehrt.
In einem weiteren Experiment wurde versucht, einen Her-
queinonsilyläther mit wässriger Flussäure sauer zu spalten.
Dies führte aber zur Zerstörung des ganzen Herqueinongerüsts,
und es konnten keine definierten Produkte isoliert werden.
Da man nicht unbedingt auf die Herstellung von reinem Her¬
queinon angewiesen war, wurde nicht mehr weiter in dieser
Richtung gesucht.
* siehe auch Abschnitt 4.10.
- 36 -
4.10. Bemerkungen zu den H-NMR-Spektren eines Enantiomeren-
gemischs von Isoherqueinon
Die meisten H-NMR-Analysen bei den früher erwähnten Epimeri-
sierungsversuchen wurden mit 90 oder 100 MHz-Geraten durchge¬
führt. Schon bei diesen Feldstarken fiel die etwas ungewöhn¬
liche Breite eines Teils der Signale von nicht enantiomeren-
reinem Isoherqueinon (2_) auf. Bei der Aufnahme eines 300
MHz-Spektrums von Isoherqueinon (2_) ,welches durch basische
Isomerisierung aus einem 58:42-Gemisch von Herqueinon (Y) und
( + )-Isoherquemon (2_) hervorgegangen war, stellte man plötz¬
lich eine Verdoppelung von einigen "Isoherquemon"-Signalen
fest. Dabei gab es bei jeder verdoppelten Signalgruppe ein
starkes und ein schwächeres Signal im Verhältnis von 2:1. Auf
diesen Befund hin wurde ebenfalls ein 300 MHz-Spektrum eines
Isoherqueinons aufgenommen, welches durch Spaltung eines
enantiomerenreinen (+)-Isoherqueinonsilylathers k]_ entstanden
war. In diesem Fall war bei keinem einzigen Signal die früher
beobachtete Verdoppelung von Signalen festzustellen. Die Lage
der Signale des enantiomerenreinen Produkts stimmte innerhalb
der Messgenauigkeit mit derjenigen der stärkeren Signale im
Spektrum des Enantiomerengemischs von Isoherqueinon uberein.
Die beiden Spektren sind zum Vergleich in Abbildung 15 und 16
dargestellt.
Die Konzentrationsabhangigkeit wurde durch 20-fache Verdün¬
nung (oneu= 0,34 mg/ml) der ursprünglichen Probe ueberpruft.
Die Verdoppelung der Signale, ihr Intensitatsverhaltnis und
auch die chemische Verschiebung blieben aber erhalten. Bei
der Aufnahme einer ähnlich verdünnten Probe in Pyridin-dc
konnte die Verdoppelung nicht mehr beobachtet werden. Durch
das Verdünnen konnte ein Erzeugen doppelter Signale infolge
gleichzeitiger Aufnahme eines Festkörper- und eines Losungs¬
spektrums* ausgeschlossen werden. Eine mögliche Erklärung für
* Durch teilweises Auskristallisieren von Substanz und an¬
schliessendes "Schwimmen" auf der Losung innerhalb des
Messbereichs kann es zu solchen Effekten kommen *-'?>
- 37 -
Abbildung 15
\
15 14
I,
/^/\l
~T
13
Enantiomeren-Genisch
\ \
/
TMS
Abbildung 16
S
-r 1 '—r15 14 13
(-)-Isoherqueinon rein
TMS
i
4
das beobachtete Verhalten ergibt sich aus der folgenden Be¬
trachtungsweise :
Durch die Epimerisierung von Herqueinon (J_) entsteht (-)-Iso-
herqueinon. Dieses bildet mit dem schon vorhandenen (+)-Iso-
herqueinon entweder ein echtes Racemat (RR-SS-Spezies), bis
- 38 -
der Vorrat an (+)-Isoherqueinon aufgebraucht ist, oder stati¬
stisch verteilte 1:1-Komplexe von RR- und SS-Assoziaten. Da
im Eduktegemisch mehr Herqueinon als (+)-Isoherqueinon vor¬
liegt, kommt es bei einer vollständigen Epimerisierung von
Herqueinon in allen Fallen zu einem Ueberschuss an RR-Moleku-
len. Zwischen den zwei oben beschriebenen Extremfallen kann
experimentell im Prinzip unterschieden werden: die statisti¬
sche Verteilung aller möglichen Kombinationen oder eine be¬
vorzugte Bildung des Racemats (RR-SS) neben der Bildung über¬
schüssiger RR-Gebilde, muss zu verschiedenen Verhaltnissen
der Signalintensitaten fuhren. Mit einem Eduktgemisch von
58:42 sind im statistischen Fall 34$ RR-RR-, 18$ SS-SS- und
48$ RR-SS-Spezies zu erwarten. Die zwei dadurch erzeugten Si¬
gnale müssten in einem Intensitatsverhaltnis von 52:48 vor¬
liegen. Im Falle einer bevorzugten Bildung des Racemates RR-
SS hatte man 42$ RR-SS-Assoziate neben einem 16%-igen RR-
Ueberschuss. Auch hier mussten zwei verschiedene Signale ent¬
stehen, diesmal aber in einem Verhältnis von 84:16. Im vor¬
liegenden Experiment wurde eine 66:33 (2:1)-Verteilung beob¬
achtet, was keinem der beiden Extremfalle entspricht. Da laut
NMR-Analyse des Reaktionsgemischs nicht alles Herqueinon epi-
merisiert hatte und bei der anschliessenden Reinigung durch
Sublimation eine Form angereichert worden sein konnte,
schliesst der experimentelle Befund keine der beiden be¬
schriebenen Möglichkeiten aus. Die beobachtete Verdoppelung
von Signalen kann jedenfalls nur durch Assoziatbildung er¬
klart werden, wie auch immer diese Assoziate aussehen mögen.
Die Komplexe müssen über eine bemerkenswerte Stabilität ver¬
fugen und in Losung laut NMR-Spektrum eine Lebensdauer von
mehr als 1/10 sec aufweisen.
Im '3c-NMR war eine entsprechende Verdoppelung von Signalen
nicht zu beobachten. Vermutlich ist aber die Auflosung bei
der benützten Feldstarke von 75.47 MHz zu gering, um eine
möglicherweise vorhandene, aber doch recht schwache Aniso-
chronie noch erkennbar zu machen.
Ein Präzedenzfall für das Auftreten einer Anisochronie auf¬
grund einer asymmetrischen Induktion durch Enantiomerengemi-
- 39 -
sehe wird in der Herstellung von Chininderivaten beschrieben
(80)_
Ein weiterer Fall, bei welchem dieses Phänomen beobachtet
wurde, wird von Harger in einer Arbeit über optisch aktive
Phosphinaraide beschrieben (ö1'.
- 40 -
5. Zur spezifischen Abstammung der geminalen Methylgruppen
C-18 und C-19 im Fünfring von Herqueinon und Isoherqueinon
5.1. Die Identifikation der Methylgruppen C-18 und C-19 im
1H- und 13C-NMR
Eine der ersten Bedingungen, die erfüllt sein muss, um eine
Antwort auf die Frage des stereochemischen Verlaufs der bio¬
logischen Alkylierung des Phenalenons ^6_ mit der Isopentan¬
einheit 2]_ (vgl. Schema 6 Seite 14) zu erhalten, ist die
spektroskopische Unterscheidung der beiden geminalen Methyl¬
gruppen C-18 und C-19 am Fünfring der Endprodukte Herqueinon
(Y) und Isoherqueinon (2_).
Abbildung 17
Die Tabelle 6 zeigt, dass diese geforderte Differenzierungs¬
möglichkeit durch die erstaunlich grossen Unterschiede in den
chemischen Verschiebungen der fraglichen Signale sowohl beim
H- als auch beim 3c_nmr der beiden Produkte gegeben ist.
- 41 -
Tabelle 6
Verbindung 1H-NMR (300 MHz) [ppm] 13C-NMR (75MHz) Py-d6 [ppm]
Herq. 1
Isoherq. 2
1,05 und 1,57
0,85 und 1,47
15,98 und 23,82
16, 14 und 16,71
Zu den in Tabelle 6 angegebenen Werten ist zu erwähnen, dass
die chemischen Verschiebungen aus Spektren von Gemischen von
J_ und 2_ entnommen wurden. Da durch die Epimerisierung von
Herqueinon {Y) in Anwesenheit von Isoherqueinon (2) ein Enan-
tiomerengemisch von (+)- und (-)-Isoherqueinon entsteht, wa¬
ren die Signale von Isoherqueinon bekannt und konnten zwei¬
felsfrei zugeordnet werden. Bei den übrigbleibenden Signalen
des Gemischs müsste es sich somit um jene des Herqueinons
handeln. Erst kürzlich wurden von einer japanischen Gruppe
(37) 1H_ und 13c_fjMR_Daten von Herqueinon (Y) publiziert. Die
3c-Werte von Herqueinon in Tabelle 6 stammen aus dieser ja¬
panischen Arbeit (37)*
Die doch recht grossen Differenzen in den chemischen Ver¬
schiebungen der beiden Methylgruppen lassen sich nur durch
eine besondere räumliche Anordnung dieser Gruppen erklären.
Die eine der beiden Methylgruppen gelangt offenbar in den
magnetischen Bereich einer Carbonylgruppe oder des
Phenalenonkerns, wird durch deren magnetische Anisotropie
( ' stärker abgeschirmt als die andere und weist somit eine
Resonanzfrequenz bei höherem Feld auf.
Eine Zuordnung der Signale allein aufgrund dieses Effekts ist
aber gerade am Fünfring sehr gewagt (44'.
* Dabei muss erwähnt werden, dass die Autoren leider keine
Angaben dazu machen, wie sie das verwendete Herqueinon
gereinigt haben.
- 42 -
5.2. Die eindeutige Zuordnung der Signale der Methylgruppen
C-18 und C-19 von Herqueinon und Isoherqueinon im H-
und 13C-NMR
In der Literatur waren zu Beginn der vorliegenden Arbeit nur
13c-NMR-Analysen von Deoxyherqueinondiacetat (^2) (38)jHer_
queichrysin (^2), Herqueichrysinmono- (5_3) und Herquei-
chrysintriacetat (^4) (23' bekannt. Auch bezüglich 'H-NMR wa¬
ren keine gesicherten Daten von Herqueinon (Y) und Isoher¬
queinon (2) verfügbar. Simpson veröffentlichte 1979 eine aus¬
führliche 13c-NMR-Analyse von Deoxyherqueinondiacetat (52)
und Herqueichrysintriacetat (5JO . Durch Einbau von doppelt¬
markiertem [1,2- 3c]-Acetat in P. Herquei gelangte er zu mar¬
kiertem Material, bei welchem '^C-^H- und '^C- 3c-Kopplungenbestimmt werden konnten. Aufgrund diverser NMR-Experimente
gelangt Simpson auch zu einer Zuordnung der Signale der gemi¬
nalen Methylgruppen im Fünfring der Deoxyherqueinon- und Her-
queichrysinderivate. Zusätzlich sagt er, dass in beiden Fäl¬
len die zur singulären Methylgruppe C-15 antiständige gemina-
le Methylgruppe mit dem quaternären Zentrum C-17 (vgl.
Abbildung 18) koppelt. Dies würde bedeuten, dass diese Me¬
thylgruppe ursprünglich aus dem C-3' von Mevalolacton (55)
abstammt (siehe Schema 8). Da diese Zuordnungen aber nicht an
Herqueinon erfolgten und Simpson nicht genau sagt, wie er ei¬
gentlich zu seinen Zuordnungen der Signale im Fall der gemi¬
nalen Methylgruppen gelangte, wurde in der vorliegenden Ar¬
beit eine unabhängige Zuordnung der Signale der entsprechen¬
den Methylgruppen an Herqueinon und Isoherqueinon angestrebt.
Die Zuordnung der Signale der Methylgruppen C-18 und C-19 in
den NMR-Spektren von Herqueinon (J_) und Isoherqueinon (2)
konnte grundsätzlich auf zwei Arten erfolgen. Die erste Me¬
thode beinhaltet einen chemischen Abbau von 2 bzw. 2, während
die zweite ausschliesslich auf der Auswertung spektroskopi¬
scher Daten beruht.
- 43 -
Abbildung 18
Seit den Arbeiten von Barton (^' und Thomas (22^ ist bekannt,
dass Mevalolacton (J[5_) als Vorläufer für den Aufbau des Fünf¬
rings von Herqueinon und Isoherqueinon dient. Durch einen
Einbau von 13c-markiertem Mevalolacton (55c) käme man, einen
stereospezifischen Einbau von Mevalolacton vorausgesetzt, zu
Herqueinon und Isoherqueinon, welche an einer der beiden ge¬
minalen Methylgruppen C-18 oder C-19 selektiv markiert wären.
Schema 8
- 44 -
Durch einen stereospezifisch kontrollierten Abbau der mar¬
kierten Endprodukte _1_ und 2_ zu einem Bruchstück, in welchem
die NMR-Signale eindeutig zugeordnet sind, wäre man in der
Lage, eine eindeutige Zuordnung auch bei Herqueinon (J_) und
Isoherqueinon (2) zu erzielen.
Ein Abbau von Herqueinon {Y) und Isoherqueinon (2_) wurde von
Brooks und Morrison (10,20,21) ^m Zusammenhang mit der Be¬
stimmung der absoluten Konfiguration am Zentrum C-16 von Her¬
queinon beschrieben (vgl. Schema 9, Seite 45).
Die dabei als Abbauprodukte entstehenden 2,2-Dimethyl-3-hy-
droxybuttersäuren 61a und 61b sind von Fräter (39)stereospe¬
zifisch markiert hergestellt worden (vgl. Schema 10, Seite
46).
Fräter war es dadurch möglich, die Signale der geminalen
Methylgruppen C-5 und C-6 dieser Säuren sowohl im 1H- als
auch im '3c-NMR eindeutig zuzuordnen.
Weil während des Abbaus von Herqueinon und Isoherqueinon auf
dem Weg zu den Hydroxybuttersäuren 61a und 61b an der Lage
der geminalen Methylgruppen nichts verändert wird, kann man
mit Hilfe der Resultate von Fräter die Signale der Methyl¬
gruppen C-18 und C-19 auch in Herqueinon und Isoherqueinon
zuordnen.
Angesichts einer Gesamtausbeute von nur ca. 0,2$ bei der von
Morrison beschriebenen Abbausequenz verzichtete man auf eine
solche Lösung des vorliegenden Problems.
Aus diesem Grund wurde nun die rein spektroskopische Methode
angewandt. Die Ausnützung des Nuclear-Overhauser-Effekts
(NOE) erlaubt eine Aussage über die räumliche Lage zweier
Zentren in einem Molekül * '' '. Dieses Verfahren ist heute
so verfeinert, dass es meist rascher und ebenso sicher zum
Ziel führt wie die herkömmliche Bestimmung mit chemischen Ab¬
baureaktionen .
- 45 -
Schema 9
i: H2/Pd/C; ii: CH2N2; iii: LiAlHjj; iv: 6N HCl in Dioxan;
v: Zn/AcOH; vi: 3,5-Dinitrobenzoesäurechlorid/Benzol/Pyridin;
vii: NaJOi)/Ru02/CCl^/60°C/7 Tage; viii: KOH/H20/EtOH.
Gesamtausbeute J[ 61a : 0,21$
2 6JJ) : 0, 15$
Eine direkte Untersuchung an Herqueinon (Y) und Isoherqueinon
(2_) war wegen der schon erwähnten schlechten Trennbarkeit
dieser Metaboliten nicht durchführbar. Eine Zuordnung der
NMR-Signale im Gemisch von J_ und 2_ schien ebenfalls unmög¬
lich. Da aber während der Derivatisierung von J[ und 2_ an den
interessierenden Zentren C-18 und C-19 nichts verändert wird,
- 46 -
Schema 10
HO O
,COEt0<
CH3CH3
68
HO O
X^COEt^H ''CH3
69
HO O
A>H SJ_n__X^CCH3CH3
61
CH3»-n3
HO O"
OEt
CH,
X.COEt _~ Xß«'CD, f'-ci
CH,3 CH,U
\70
HO O
71 CH, "3
HO o
COH
CH,3
74
HO O
COH
CD3on3
72
HO O
COH13
CH,
CH-,^
73 CH3
konnte auf die gut trennbaren Herqueinon- und Isoher-
queinonsilyläther 3_8 und 3_9 zurückgegriffen werden.
Abbildung 19
OCH3HO^^ik^OH
O
0-Si(CH3)338:R1=CH3,R2 = H
39:R'=H,R2 =CH,
Von beiden Verbindungen wurden zunächst 'H-NMR- und
3c-NMR-Standardspektren aufgenommen. Die entsprechenden
1H-NMR-Werte sind in Tabelle 7 aufgeführt. Bei beiden Silyl¬
äthern sind die chemischen Verschiebungen der geminalen
- 47 -
Methylgruppen C-18 und C-19 genügend verschieden, um eine gu¬
te Unterscheidbarkeit sowohl im 1H- als auch im ^3c_nmr zu
gewährleisten.
Tabelle 7
Methylgruppe Herqueinonäther 3_8 Isosilyläth. 39
H3C(18) u H3C(19)H3C(15)H3C(1)
1,006 u 1,432
1,583 (d) J = 7,0 Hz
2,503 (d) J = 1,2 Hz
0,823 u 1,360
1,388 (d) J = 6,7 Hz
2,477 (d) J = 1,2 Hz
Konnten die Signale der Methylgruppen C-1 und C-15 im 'H-NMR
aufgrund ihrer Multiplizitäten von den geminalen Methylgrup¬
pen C-18 und C-19 leicht unterschieden werden, so war dies im
3c-NMR wegen der ähnlichen Lage der Signale a priori nicht
möglich.
Mit Hilfe der selektiven 1H-Entkopplung im 13c-NMR ^°^konn¬
ten die im H-NMR zugeordneten Signale mit denjenigen der
13c-NMR-Spektren korreliert werden (vgl. Tabelle 8).
Dank dieser Methode waren die Signale der Methylgruppen C-1
und C-15 im 1H- und 13c-NMR von 3_8 und 3_9 eindeutig zugeord¬
net, während die geminalen Methylgruppen C-18 und C-19 noch
nicht identifizierbar waren.
Um zu einer eindeutigen Zuordnung der Signale der geminalen
Methylgruppen C-18 und C-19 zu gelangen, wurde die Methode
der Konfigurationsanalyse mittels Messung des Nuclearen Over-
hauser-Effekts (NOE) angewandt C*1»1*2^
- 48 -
Tabelle 8
Verbindung 1H-NMR korreliert mit 13c Zuordnung
31 1,006
1,432
1,583
2,503
23,924
16,166
18,626
24,224
H3C(18) od. H3C(19)H3C(18) od. H3C(19)H3C(15)H3C(1)
21 0,823
1,360
1,388
2,477
15,502
16,222
13,002
24,075
H3C(18) od. H3C(19)H3CO8) od. H3C(19)H3C(15)H3C(1)
In diesem Experiment wurden zuerst wieder die Silyläther 3_8und 3_£ benützt. Bei beiden Verbindungen wurde jeweils auf die
Resonanzfrequenz der geminalen Methylgruppen eingestrahlt und
das Intensitätsverhältnis des Signals des Protons am C-16 be¬
obachtet (vgl. Tabelle 9)-
Das Vorgehen bei der Zuordnung der Signale sei hier am Bei¬
spiel der Struktur von Isohherqueinon (2_) illustriert (vgl.
Abbildung 20).
Da die Desilylierung des Herqueinonäthers ^8_ zur Epimerisie¬
rung führte, wurde nur Isoherqueinon (2) mit dem gleichen
Verfahren untersucht. Kürzlich ist aber ein analoges Experi¬
ment an Herqueinon (J_) publiziert worden (37)_ D^e dort auf¬
geführten Literaturwerte bestätigen die in der vorliegenden
Arbeit gefundenen Resultate.
Während die NOE-Differenzen am Signal von H-C(16) bei den
Silyläthern nicht sehr gross sind, führen sie bei 2 und J_ zu
klaren Resultaten.
Deswegen wurden die Signale der geminalen Methylgruppen der
Silyläther 3_8 und 3_9_ mit denjenigen von Herqueinon 2 und Iso-
- 49 -
Tabelle 9
Verbindung Einstrahlung bei
5 = ppm
beobachteter
NOE am H-C(16)
Zuordnung
38 1 ,006
1,432
10$
5$
H3C(19)H3c(i8)
39 0,823
1,360
5$
11$
H3C(19)
H3C(19)
|IM 0,854
1,464
0$
18$
H3C(19)H3C(18)
1* 1 ,00
1,40
20$
6$
H3C(19)H3C(18)
* Werte aus der oben zitierten japanischen Arbeit (37)
Abbildung 20
OOH (o$~^
NOE klein
herqueinon 2_ in einem weiteren Experiment korreliert.
Ein mit 13c markiertes Gemisch aus Herqueinon (Jj und Isoher¬
queinon (2) wurde basisch epimerisiert (vgl. Abschnitt 4.3.
und Literatur 8).
- 50 -
Das entstandene Enantiomerengemisch aus (+)- und (-)-Isoher-
queinon wurde umkristallisiert und dabei das entsprechende
Racemat gewonnen. Der Nachweis für das Vorhandensein eines
Racemats wurde durch Bestimmen der optischen Drehung erbracht
(»D25= 0°).
Wie später gezeigt wurde (vgl. Abschnitt 5.3.), enthielten
beide Diastereomere des Eduktgemischs 92$ der Gesamtanreiche¬
rung mit '3c jeweils in der einen und die restlichen 8$ in
der andern der geminalen Methylgruppen.
Durch die Epimerisierung von (+)-Herqueinon zu (-)-Isoher-
queinon werden die markierten Methylgruppen nicht tangiert,
das heisst, ihre Lage wird sozusagen ins (-)-Isoherqueinon
"hinübergerettet". Da nun im Spektrum des racemischen Isoher-
queinons zwei gleich stark angereicherte Methylsignale gefun¬
den wurden, bedeutet dies, dass sich die Markierungen, her¬
rührend von ursprünglichem (+)-Isoherqueinon und aus Herquei¬
non neugebildetem (-)-Isoherqueinon, in diastereotoper Lage
befinden (siehe Schema 11). Die beiden markierten Zentren
sind zueinander diastereotop, weil sich das eine in der gemi¬
nalen Methylgruppe syn zur singulären Methylgruppe C-15 und
das andere in der "anti-Methylgruppe" befindet.
Durch Nachsilylieren des künstlich erzeugten, markierten Ra¬
cemats von 2_ konnte gezeigt werden, dass auch im racemischen
Silyläther (-)-39 zwei markierte Methylgruppen auftraten, wo¬
mit bewiesen war, dass bei beiden Silyläthern 3_8 und 3_9 die
starke Markierung in der gleichen Methylgruppe sitzt. Durch
die NOE-Experimente an raceraischem Isoherqueinon waren die
Signale der beiden geminalen Methylgruppen eindeutig zugeord¬
net worden. Da man durch das Epimerisierungsexperiment nun
wusste, dass in 3c_raari^ertem Herqueinon die zur singulären
Methylgruppe C-15 syn stehende geminale Methylgruppe C-18 die
starke Markierung trägt, konnten die Signale der beiden gemi¬
nalen Methylgruppen auch in Herqueinon eindeutig zugeordnet
werden. Das gleiche gilt für den entsprechenden Silyläther
iß.-
Damit sind alle Methylgruppensignale der Verbindungen J_> £>
38 und 3_9 im 1H- und 13c-NMR eindeutig identifiziert. Durch
- 51 -
Schema 11
(+)-Herqueinon
CH30.anti
(+)-Isoherqueinon
(-)-Isoherqueinon
Markierungen befinden sich
in diastereotoper Beziehung
die vorliegende Zuordnung wurde auch die von Simpson(23)
Deoxyherqueinondiacetat (5J2) getroffene Wahl für die Signale
der entsprechenden geminalen Methylgruppen bestätigt (vgl.
Seite 42).
Die Methylgruppen C-18 und C-19 von Herqueinon {Y) und Iso¬
herqueinon (2_) weisen in beiden Fällen im 'H-NMR eine Diffe¬
renz in ihren chemischen Verschiebungen von AS = 0,6 ppm auf.
Das gleiche Resultat lässt sich auch an den entsprechenden
Silyläthern 3J3 und 3_9 feststellen.
Die Röntgenstrukturanalyse von (i)-Isoherqueinontrimethylsi-
lyläther (3_9) (siehe Anhang I) zeigt ,dass der Fünfring von
39 stark deformiert ist. Dadurch gerät die zum Methinproton
H-C(16) syn-ständige Methylgruppe C-19 in den magnetischen
Bereich des konjugierten Ringsystemes; das heisst, sie steht
praktisch parallel zu den ^-Orbitalen des delokalisierten
Phenalenonteils. Sie erfährt dadurch eine verstärkte Abschir¬
mung, die zur beobachteten Resonanz bei hohem Feld
(•5C(iq) = 0,823 ppm) führt.
- 52 -
Dagegen liegt die Methylgruppe C-18 quasi in der Knotenebene
desselben TT-Systems und tritt deshalb bei normaler Frequenz
in Resonanz (*c(18) = ^>360 ppm).
Abbildung 21
Eine Röntgenstrukturanalyse von Quick, Thomas und Williams
(19)ergibt für Herqueinon (J^) ein ähnliches Bild. Auch dort
ist die zum Methinproton H-C(16) syn-stehende Methylgruppe
stark ins Innere des Ringsystems gedreht, was zum selben Ef¬
fekt wie oben führt.
- 53 -
5.3- Die biogenetische Abstammung der geminalen Methylgruppen
C-18 und C-19 in Herqueinon und Isoherqueinon
Mit der spektroskopischen Unterscheidung der geminalen
Methylgruppen C-18 und C-19 von Herqueinon (_0 und Isoher¬
queinon (2) verfügte man über eine Methode, welche es erlaub¬
te, die biologische Bildung des Fünfrings von J_ und 2_ zu ver¬
folgen .
Aus den Untersuchungen von Barton ( ' und Thomas (22)geht
hervor, dass Mevalolacton (^5) als Vorläufer für die Isopen¬
taneinheit von Herqueinon und Isoherqueinon dient.
Arbeiten von Bloch (")( Lynen\^°> und Cornforth (^') haben
gezeigt, dass die aktiven Cc-Vorläufer für Organismen, welche
Terpene synthetisieren, Isopentenylpyrophosphat (IPP) (75)
und Dimethylallylpyrophosphat (DMAPP) (7_6_) sind.
Abbildung 22
OPP i OPP
75 76
Die Abstammung der Methylgruppen C-4 und C-5 in DMAPP (76)
aus Mevalolacton (5j>) ist ebenfalls bekannt (siehe
Schema 12).
- 54 -
1956 zeigten Tavormina et al. (53,54)^ <}ass auf dera ^eg •von
Mevalolacton (5^5_) zu den biologisch aktiven Prenylierungsein-
heiten das C-1 von Mevalolacton (^5) verloren geht.
Etwas später konnte die Arbeitsgruppe von Bloch (55)zeigen,
dass aus 5-Pyrophosphomevalonat (7_7) und ATP mit einem He¬
fe-Enzym irreversibel IPP (7_5) , C02, ADP und Phosphat gebil¬
det werden.
Schema 12
-. OH
ko"^o55
PPOCOOM*
PPOCOO'M*
77
PPO 0"M+ PPO PPO
75 76
Beim Einbau von [2-1 C]-Mevalolacton (55a) in Soyasapogenol A
(J_8)(i48) und in Mycelianamid (7_9)
(49) (siehe Abbildung 23)
konnte indirekt abgeleitet werden, dass die (E)-Methylgruppe
C-4 von DMAPP (7.6) aus dem C-2 von Mevalolacton (55_) stammt
(vgl. Schema 12).
Diese Resultate von Arigoni(4°) und Birch (^9) wurden später
von Stone(->0)
und Ogura\5\) auf direkte Art und Weise be¬
stätigt .
- 55 -
Abbildung 23
CH,OH78
P
•°Och=C>
79
4OH
Beim Einbau von [2- 3c]-Mevalolacton (55c) in P. herquei
sollte somit eine der geminalen Methylgruppen C-18 oder C-19
in Herqueinon {Y) und Isoherqueinon (2_) selektiv markiert
werden, falls die Prenylierungsreaktion stereospezifisch ver¬
läuft.
Ein Einbau von [2-14C]-Mevalolacton (55a) in P. herquei LSHTM
P-219* war von Thomas (22) schon 1961 beschrieben worden. Al¬
lerdings isolierte er nicht Herqueinon (Y) ,sondern markier¬
tes Nor- und Isonorherqueinon (J_ und _1_1.). Die dort angegebene
spezifische Einbaurate von 0,16$ wäre zu gering, um auf diese
Weise das Problem der Signalzuordnung lösen zu können. Man
wäre auf eine ca. sechsmal grössere Einbaurate angewiesen, da
dann die ^-Anreicherung in den entsprechenden Zentren gera¬
de dem Doppelten des natürlichen '3c-Vorkommens entsprechen
würde.
In der vorliegenden Arbeit wurde P. herquei IMI-89376** ver¬
wendet. Die Einbaurate in diesem System wurde zuerst durch
Verfüttern von [2- C]-Mevalolacton (55a) bestimmt. Gleich-
* "LSHTM": The London School of Hygienic and Tropical Medi-
cine Stamm P-219
** "IMI": Imperial Mycological Institute, heute CMI: Common¬
wealth Mycological Institute, London (vgl. Seite 18).
- 56 -
zeitig wurde durch Verabreichen von vier verschieden zusam¬
mengesetzten Nährmischungen und durch Variieren des Fütte¬
rungsmodus' versucht, eine Optimierung der Einbaurate zu er¬
reichen (vgl. Tabelle 10).
Tabelle 10
Kultur Nr. Zusammensetzung der Futtermischung Fütterungs¬
modus/Port .
1 1 ml Wasser + 55a (2,5x107 ipm UC*) 1
2 5 ml Wasser + 5_5a (2,5x107 ipm 14C»)
0,5 mmol inaktives Mevalolacton (55)
1
3 5 ml Wasser + 55a (2,5x107 ipm 1l|C*)
5,0 mmol inaktives Mevalolacton (55)
1
4 10 ml Wasser + 5_5_a(2,5x107 ipm 1l*C*) 10 x 1ml
* Aktivität des biologisch verwertbaren (3R)-Enantiomers
Nach dem früher beschriebenen Standardverfahren wurden
Schrägagarkulturen von P. Herquei auf Raulin-Thom-Lösung
überimpft und diese nach vier Tagen gemäss den in Tabelle 10
beschriebenen Varianten mit radioaktivem Material gefüttert.
Nach einer Inkubationsperiode von insgesamt 18 Tagen wurden
die vier Kulturen einzeln aufgearbeitet und analysiert.
Von den isolierten Rohprodukten der vier verschiedenen Ansät¬
ze wurde jeweils eine Probe bis zum konstanten Schmelzpunkt
von 212-214 °C umkristallisiert. Die so gereinigten Produkte
wurden anschliessend bezüglich ihrer '4C-Aktivitäten gemes¬
sen .
- 57 -
Die Werte in Tabelle 11 kombiniert mit den Fütterungsvarian¬
ten aus Tabelle 10 zeigen, dass das System offenbar stark
konzentrationsabhängig ist und auf den Zeitpunkt der Verab¬
reichung des Vorläufers ebenfalls reagiert. Durch Verfüttern
von wenig, aber hochaktivem Mevalolacton (55a), wird zwar
praktisch alles aktive Material eingebaut (81$), die spezifi¬
sche Einbaurate bleibt aber gering. Beim Verfüttern der glei¬
chen Gesamtaktivität zusammen mit inaktivem Verdünnungsmate¬
rial nimmt zwar die totale Einbaurate drastisch ab, die spe¬
zifische hingegen stark zu.
Eine optimale spezifische Einbaurate wurde bei der Variante 2
erreicht. Diese wurde für die folgenden Einbauversuche als
Standard gewählt.
Tabelle 11
Kultur Nr. Rohausbeute
mg
Aktivität 1l*C
ipm/umol
Einbaurate in $
spez. total *
1 152,7 4.953X101* 0,4 81,3
2 194,3 6,324x103 12,7 13,3
3 178,8 6,020x102 12,0 1,2
4 186,5 1,491x102 3,0 0,3
berechnet bezüglich verwertbarem (3R)-Enantiomer von 55a
Zwei Flüssigkulturen von P. Herquei wurden am vierten Tag
nach der Animpfung mit je 1,8 ml einer 0,5 M Lösung von
[ 2- 3c]-Mevalolacton (55c) in sterilem Wasser gefüttert und
während weiteren 21 Tagen inkubiert. Nach dem Aufarbeiten der
getrockneten Mycelien gewann man aus beiden Kulturen insge-
- 58 -
samt 456 mg Rohprodukt mit einem Schmelzpunkt von 210 °C.
Wegen des offenbar recht hohen Reinheitsgrades wurde ein Teil
dieses Rohproduktegemischs ohne weitere Behandlung direkt
nach der nicht epimerisierenden Methode (vgl. Abschnitt 4.8.)
silyliert.
Nach chromatographischer Trennung und Reinigung des Silyl-
äthergemischs wurden die beiden Endprodukte 38a und 3_9a^
NMR-spektroskopisch untersucht. Die Interpretation der
'3c-NMR-Spektren ergibt, dass tatsächlich ein weitgehend
stereospezifischer Einbau von 55c bei Herqueinon (J_) und Iso¬
herqueinon (2_) stattgefunden hat.
Die genauen Einbauraten wurden auf zwei unabhängigen Wegen
bestimmt.
Die NOE-Verstärkungsfaktoren der einzelnen C-Atome eines
Moleküls im 13c-NMR können Werte zwischen 1 und 2,98^2'
aufweisen. Zudem gibt es beträchtliche Differenzen zwischen
den Spin-Gitter-Relaxationszeiten der verschiedenen Zentren,
welche gerade bei gepulsten Aufnahmeverfahren (FT-NMR-Spek-
troskopie) zu grösseren Intensitätsabweichungen der einzelnen
Signale führen ^4°). Hauptsächlich aus diesen Gründen können
mit normalen '3c-NMR-Messungen die Intensitäten verschiedener
Signale nicht direkt zur Bestimmung von 3c_Anreicherungen
beigezogen werden.
Mit Hilfe der INVERSE-GATED-Technik (56,57) können die obge-
nannten Störfaktoren weitgehend eliminiert werden, so dass es
möglich wird, auch im ^3c_nmr durch Intensitätsvergleich ver¬
schiedener Signale quantitative Analysen durchzuführen. Die
bei Anwendung dieser Methode (1) erhaltenen Resultate sind in
Tabelle 12 festgehalten.
Sowohl in Herqueinon (J[) als auch in Isoherqueinon (2_) war
die C-18-Methylgruppe zu mehr als 10$ mit ^C angereichert
worden. Dies erlaubte, die Anreicherung an diesem Zentrum
auch anhand des ^-NMR zu überprüfen, da die entsprechende
Methylgruppe im 1H-NMR genügend grosse 13c-Satelliten er¬
zeugt. Die Summe der Integrale dieser Satellitensignale, ver-
- 59 -
Tabelle 12
Verbindung Zentrum Anreicherung in \
1
gemäss Methode
2
Herq.silyläther
38a
C-15
C-18
C-19
0
16,2
1,3
0
15,9
Isosilyläther
39a
C-15
C-18
C-19
0
13,6
2,6 1
UJ
o
IM
glichen mit der Signalgrösse einer nicht markierten Methyl¬
gruppe, ergibt direkt die Einbaurate. Die entsprechenden Wer¬
te für die Silyläther 38a und 39a sind ebenfalls in Tabelle
12 aufgeführt. Ein Vergleich der für C-18 jeweils erhaltenen
Werte zeigt, dass beide Verfahren zu gut übereinstimmenden
Resultaten führten.
Die Werte in Tabelle 12 zeigen, dass sowohl beim Herqueinon-
(38a) als auch beim Isoherqueinonsilyläther (39a) hauptsäch¬
lich die Si-Methylgruppe C-18 mit 13c angereichert wurde.
Diese Tatsache deutet stark auf das Vorhandensein eines ge¬
meinsamen Vorläufers wie früher postuliert hin (vgl.
Schema 1, Seite 2).
In beiden Fällen wird jedoch auch eine geringe Anreicherung
in der Re-Methylgruppe C-19 festgestellt. Prozentual ergeben
sich - bezogen auf die gesamte Einbaurate - die in der Tabel¬
le 13 festgehaltenen Werte.
Im Falle des Isoherqueinonsilyläthers 39a Hesse sich die
kleine Anreicherung in C-19 durch ein "Verschleppen" der Mar¬
kierung erklären.
- 60 -
Tabelle 13
Verbindung relative Anreicherung in $ von 3c
in C-18 in C-19
Herq.silyläther 38a 92,6 7,4
Isosilyläther 39a 83,9 16, 1
Demnach wäre zwar der Einbau bei Herqueinon (Y) und Isoher¬
queinon (2_) stereospezifisch erfolgt, beim Silylieren durch
eine geringe Epimerisierung von Herqueinon zu (-)-Isoher-
queinon (2) die Markierung aber scheinbar verschmiert worden.
Da in achiralem Milieu der Silyläther 39a von seinem Enantio¬
mer im NMR nicht unterscheidbar ist* und die Si-Methylgruppe
C-18 von (-)-39a in ihrer chemischen Verschiebung der Re-Me-
thylgruppe C-19 von (+)-39a entspricht, könnte im '3c-NMR des
leicht mit seinem Enantiomer verunreinigten (+)-Silyläthers
39a eine unspezifische Markierung der geminalen Methylgruppen
vorgetäuscht werden.
Tatsächlich lässt sich diese Möglichkeit nicht ganz aus-
schliessen. Da aber unter nicht epimerisierenden Bedingungen
gearbeitet wurde (vgl. Abschnitt 4.8.), kann die Verunreini¬
gung mit dem (-)-Isomer nicht aHein die Begründung für einen
Anteil von 16,1$ der Gesamtanreicherung in 39a am C-19 sein.
Im ursprünglichen Gemisch von markiertem Herqueinon (57.) und
Isoherqueinon (5j)) beträgt sie denn auch nur ca. 8$.
Mit dieser "Verschleppungstheorie" gar nicht erklären lässt
sich hingegen die beobachtete Anreicherung am C-19 des Her-
queinonsilyläthers 38a. Da keine Epimerisierung von Isoher¬
queinon (2) zu (-)-Herqueinon stattfindet, kann keine Markie-
* Es sei denn, man hätte einen Anteil an (-)-Produkt von
mindestens 5$, so dass dieser im NMR sichtbar würde (vgl.
Abschnitt 4. 10. ) .
- 61 -
rung aus der Iso- in die Herqueinonreihe "verschleppt" wer¬
den.
In beiden Fällen lassen sich die Anreicherungen in den
Re-Methylgruppen C-19 nur durch einen nicht zu 100$ stereo¬
spezifisch verlaufenden Einbau von [2- 3)_Mevalolacton (55c)
in P. Herquei erklären.
Dieses Phänomen ist nicht unbekannt. So wurden beim Einbau
von [2- C]-Mevalonsäure (5j>) in Agroclavin (8_p und in Ely-
moclavin (8_2_) (58,59)am Zentrum C-17 ca. 93$ und am Zentrum
C-7 ca. 7$ der gesamten eingebauten Aktivität lokalisiert
(siehe Tabelle 14).
Ein ähnliches Resultat wurde beim Einbau von [2-1^C]-Mevalon-säure (56>) in Pleurotin (8_3) gefunden
(6o^(vgl. Tabelle 14).
Auch in diesem Fall war die Verteilung der Aktivität mit
14,5$ in C-12 und mit 2,0$ in C-13 im gleichen Verhältnis von
etwa 90:10.
Eine etwas geringere "Verschmierung" wurde auch am Beispiel
des Betulinsäuremethylesters (8_4) in der Reihe der Lupane
festgestellt (61). Dort wurde gezeigt, dass die C-29-Methy-
lengruppe 4$ der Gesamtmarkierung der Zentren C-29 und C-30
trug. Ebenso enthielt die axiale Methylgruppe 3$ der Gesam¬
taktivität beider geminalen Methylgruppen am C-4 dieses Ge¬
rüsts (vgl. Tabelle 14).
Eine ähnliche Unspezifität wurde beim Einbau von [2- Cj-Me-
valolacton (55a) in Ursolsäure (8_5_) gefunden (62).
Die Methylgruppe C-29 in 85. (vgl. Tabelle 14) enthielt 3,5$
der Gesarataktivität, welche in den Zentren C-29 und C-30
nachgewiesen wurde.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit sind es vor allem
zwei neuere Publikationen, welche von besonderem Interesse
sind.
1982 berichteten Gorst-Allman und Mitarbeiter (°2', dass beim
Einbau von [2- 3c] -Mevalolacton in Roquefortin (9_5) in den
Methylgruppen des 1,1-Dimethylallyl-Rests eine Verschmierung
der Markierung im Verhältnis von 2:1 auftritt.
- 62 -
Die Autoren äussern sich nicht über die Zuordnung der Methyl¬
gruppensignale in den NMR-Spektren, so dass unbekannt bleibt,
welche Methylgruppe aus welchem C-Atom des verfütterten Meva-
lolactons stammt. Einen ähnlichen Fall beschreiben Harrison
und Quinn (°3) in einer Arbeit über Echinulin (9_6) • Sie fan¬
den beim Verfüttern von [3'- Ho]-Mevalolacton an Aspergillus
amstelodami, dass im daraus isolierten Echinulin (£6_) 89$ der
Markierung in der Si-Methylgruppe des 1,1-Dimethylallyl-Rests
lokalisiert sind (vgl. Tabelle 14).
- 63 -
Tabelle 14
Vorläufer ProduktVerteilung der
Markierungen
CH,-OH
Ölo-~=o
*."c H'" 81
* •
93 :7
dito* •
87: 13
dito COOCH,
* •
96:4
97.3
*30
dito
COOH
* •
96 4
,
OH
^O^O• :,3C H 95 0H'N^.N
• o
66: 34
dito
• O
89 : 11
- 64 -
All die in Tabelle 14 aufgeführten Beispiele zeigen, dass auf
dem Weg von Mevalolacton (j[5) zu den am Ende isolierten ver¬
schiedenen Terpenen ein geringer Verlust der Identität der
beiden Methylgruppen der biologisch aktiven Cc-Einheit DMAPP
(7£) auftritt.
Dabei scheint es auch so zu sein, dass dieser Identitätsver¬
lust bei den Triterpenen kleiner ist als bei den Sesquiter-
penen. Demnach wäre die "Verschmierung" bei Hemiterpenen mit
ca. 10$ am grössten.
Ueber die Mechanismen, die zur beobachteten Verschmierung in
all den oben beschriebenen Isopentaneinheiten führen, weiss
man bis heute sehr wenig. Die einfachste Variante wäre eine
Unspezifität während der Isomerisierung von IPP (75.) zu DMAPP
(76) (vgl. Schema 12, Seite 54). Dass dies nicht der Fall
ist, wurde von Ogura und Mitarbeitern gezeigt (°D'. im Zusam¬
menhang mit der Abklärung der Substratspezifität von gerei¬
nigter IPP-Isomerase aus Schweineleber konnten sie nachwei¬
sen, dass die reversible Isomerisierung von IPP (7j5) zu DMAPP
(76) vollständig stereospezifisch verläuft. Sie setzten eine
grössere Menge IPP (£5.) mit mehrfach gereinigtem Enzym in
deuteriertem Wasser um. Nach Behandlung des Reaktionsgemischs
mit alkalischer Phosphatase isolierten sie deuterierten Dime-
thylallylalkohol (9_4) •Die Auswertung des Massenspektrums von
94 ergab eine relative Verteilung von 13$ dQ- ,28$ d.|- , 31$
dg- und 28$ d^-Spezies. Der Vergleich der 'H-NMR-Spektren von
undeuteriertem 3,3-Dimethylallylalkohol mit dem enzymatisch
deuterierten Produkt 9_4 zeigte, dass alles Deuterium aus¬
schliesslich in die E-Methylgruppe von 9_4 eingebaut worden
war.
- 65 -
Schema 13
IPP-lsomerase
I COPP in D„0
XJOPP alkal ische
Phosphatase q C "^
| OH
X^
75 76 94
In späteren Versuchen (siehe Kapitel 6) konnte gezeigt wer¬
den, dass beim Einbau von (3R,5S)-[53H,2H]-Mevalolacton (55e)
in P. Herquei auch eine teilweise Isomerisierung an jenem
Zentrum stattfand, welches aus dem C-5 von Mevalolacton (56)
stammt. Dabei war die Verschmierung der Isotopen an diesem
Zentrum von der gleichen Grössenordnung wie sie auch bei den
beiden Methylgruppen festgestellt worden war. Daraus ergibt
sich die interessante Möglichkeit, dass die beiden "Ver-
schmierungen" der Markierungen gegenseitig abhängig sind. Ei¬
ne solche Abhängigkeit wäre durch den folgenden Mechanismus
leicht zu erklären: Aus Mevalolacton entsteht als reaktive
Prenylierungsspezies DMAPP. Mit einer Allylumlagerung des
Pyrophosphatrests an DMAPP zum entsprechenden tertiären Pro¬
dukt 120 besteht die Möglichkeit, durch Drehung eines Teils
der umgelagerten Moleküle um 180° entlang der C-2/C-3-Ein-
fachbindung in 120 zu einer Verschmierung an beiden Zentren
C-1 und C-2 gleichzeitig zu gelangen (vgl. Schema 14). Er¬
folgt die Rückumlagerung der Pyrophosphatgruppe wie im ersten
Schritt nach einem syn-Prozess, so hätte man den Ort der Mar¬
kierung sowohl am Zentrum 1 als auch am Zentrum 3 vertauscht.
Mit ein und demselben Mechanismus wären somit die Anreiche¬
rung von 8$ in den Methylgruppen C-19 von 13c-markiertem Her¬
queinon (_1_) und Isoherqueinon (2_) wie auch die verminderten
optischen Reinheiten beim Einbau von (5S)-Mevalolacton (55e)
- 66 -
Schema 14
syn
OPP
D
OPP
ID
D OPP
Tr^
in _^ und 2_ zu erklären. Die im vorgeschlagenen Mechanismus
benötigte Syn-Umlagerung einer Pyrophosphatgruppe in biologi¬
schen Systemen wurde schon nachgewiesen. Beispiele dazu fin¬
den sich in Tabelle 21 auf Seite 95.
- 67 -
6. Untersuchung des stereochemischen Verlaufs der Alkylierung
mit der Cg-Einheit und des darauffolgenden Ringschlusses
bei der Biosynthese von Herqueinon und Isoherqueinon
Um eine Antwort auf die Frage nach dem stereochemischen Ver¬
lauf der Cyclisation des postulierten offenkettigen Vorläu¬
fers Jl zu den Endprodukten Herqueinon (]_) und Isoherqueinon
(2) zu erhalten, ist es nötig, die sich in der E- und Z-Lage
befindenden endständigen Wasserstoffatome H^ und Hg der Vi-
nylgruppe in 4^ verschieden zu markieren (vgl. Schema 15).
Da aber eine offenkettige Verbindung wie .4 aus P. Herquei bis
heute nie isoliert werden konnte, bleibt ein direkter Zugang
zur Lösung dieses Problems weiterhin verschlossen.
Indirekt ist diese Auskunft dennoch erhältlich.
HO
Schema 15
och3
HO^xk^OHT iT
Q»/VV°LkJc?
CHaHbHc
1 : CH H.H„ "oben"— a b c
2: CH H.H„ "unten"- a b c
Beim Einbau eines am C-5 mit unterschiedlichen Wasserstoff¬
isotopen Hft und Hg stereospezifisch markierten Mevalolactons
(55e) in P. Herquei muss ein Zwischenprodukt wie 4^ entstehen,
dessen E- und Z-Wasserstoffatome an der Doppelbindung der
Cc-Seitenkette verschieden markiert sind (vgl. Schema 16).
- 68 -
Da diese Doppelbindung im Cyclisationsschritt protoniert wird
und sich daraus die Methylgruppe C-15 in den Endprodukten 2
und 2_ bildet, muss diese bei geeigneter Markierung von 55e
chiral werden. Dies setzt allerdings eine stereospezifische
Protonierung der Doppelbindung voraus.
Aus' dem Chiralitätssinn der so gebildeten Methylgruppe C-15
in J_ oder 2_ kann man auf die Lage der beiden Wasserstoffatome
HA und Hg an der Doppelbindung des hypothetischen offenketti-
gen Vorläufers j4 zurückschliessen.
Schema 16
(15S)-Herqueinon (15R)-Herqueinon
Weil das Wasserstoffatora Hc in der Reaktionssequenz zuletzt
enzymatisch eingeführt wird, ist es von Vorteil, im syntheti¬
schen Vorläufer 55e bereits die beiden Isotopen Deuterium und
- 69 -
Tritium einzuführen. Der Einbau dieses Vorläufers kann danach
in gewöhnlichem Wasser erfolgen.
Die Synthese von in 5-Stellung mit Tritium und Deuterium
stereospezifisch markiertem Mevalolacton 55e ist schon seit
einiger Zeit bekannt (63-66)_ j-n unserer Gruppe wurde von H.
Hasler (67)nach einer Mevaldinsäuresynthese von A.I. Scott
et al. (68) (3R,5S)-[5-3H,2H]-Mevalolacton 55e synthetisiert
(vgl. Schema 17).
Schema 17
D20 + NaCN DCOO- Na* -*- DCOOCH3
OHOH"
H+
CHXOOEt
LiN(SiMe3)2
O^^D CHaOfQD CH3
1)O"
2).CH3OH/H*
NADP+H-N3BH4
Hefe
—NADP-3H
TOo (3R,5S)-[5-3H,2H]-Meva-lolacton
Ein Rest dieses von Hasler produzierten, doppelt indizierten
Mevalolactons (5_5_e) wurde in der vorliegenden Arbeit für den
Einbau in P. Herquei verwendet.
- 70 -
Eine nach dem früher beschriebenen Standardverfahren (siehe
Abschnitt 4.3.) gezüchtete, vier Tage alte Flüssigkultur von
P. Herquei wurde mit einer Probe von (3R,5S)-[5-^H,2H]-Meva¬lolacton (55e), welche eine Gesamtaktivität von 0,863 mCi
enthielt und mit 25 mg inaktivem Mevalolacton vermischt war,
gefüttert.
Nach einer Gesamtinkubationszeit von 18 Tagen im Dunkeln bei
24 °C wurde das Mycel geerntet. Nach der üblichen Aufarbei¬
tung erhielt man 179,3 mg rohes Herqueinon/Isoher-
queinon-Gemisch mit einer Gesamtaktivität von 8,97 x 10' ipm.
Dies entspricht einer spezifischen Einbaurate von 9,2$.
Eine Probe dieses rohen Gemischs wurde silyliert. In Unkennt¬
nis der erst später gefundenen leichten Epimerisierbarkeit
von Herqueinon (_1_) zu (-)-Isoherqueinon {2) wurde allerdings
vorerst das "normale" Silylierverfahren angewandt.
Nach chromatoghraphischer Trennung des Herqueinonsilyläthers
38c und des Enantiomerengemischs des Isosilyläthers (-)-39c*
wurden die beiden Produkte einem Kuhn-Roth-Abbau unterworfen.
Es ist bekannt (73)(dass bei der ursprünglichen Methode des
Kuhn-Roth-Abbaus (°9) e±n recht starker Protonenaustausch an
der Methylgruppe der gebildeten Essigsäure stattfindet.
Cornforth et al. beschrieben eine modifizierte Variante (70)(
die von Martinoni *''' im Hinblick auf die Erfassung chiraler
Methylgruppen nochmals verbessert wurde.
Zur Bestimmung der Ausbeute von Essigsäure beim Abbau von
Herqueinon (J[) und Isoherqueinon (2_) wurde in der vorliegen¬
den Arbeit ein Gemisch der beiden umgesetzt. In einer nach
Wiesenberger('2' modifizierten Kuhn-Roth-Apparatur wurde das
Gemisch von J_ und 2_ mit einer Oxydationslösung aus Chromtri-
oxid, destilliertem Wasser und konzentrierter Schwefelsäure
abgebaut. Das Kaliumsalz dieser Essigsäure wurde zum entspre¬
chenden p-Phenyl-phenacyl-derivat 8_9 umgesetzt und dieses
durch Chromatographie und Umkristallisation gereinigt.
* Das Vorliegen eines Enantiomerengemischs von 3.9 wurde
erst später festgestellt.
- 71 -
Am reinen Derivat wurde anschliessend durch Massenspektrome-
trie der m/e = M+1+-Wert bestimmt. Dieser Wert wurde im näch¬
sten Versuch als Eichung verwendet.
Der soeben beschriebene Versuch wurde nun mit einer vollstän¬
dig deuterierten Oxydationslösung wiederholt und im entspre¬
chenden Phenacylacetat 89a die Austauschrate der Wasserstoff¬
atome der Methylgruppen bestimmt. Die Ergebnisse dieses Ver¬
suchs sind in Tabelle 15 festgehalten.
Mit einem Deuteriumeinbau von 36,5$ war die Austauschrate
viel zu gross, als dass man eine vernünftige Konfigurations¬
bestimmung hätte durchführen können.
Das Vorgehen für die Oxydation wurde nun sukzessive in Rich¬
tung milderer Bedingungen geändert. Dabei müsste man aller¬
dings eine Abnahme der Ausbeute an Essigsäure in Kauf nehmen.
Ein Optimum wurde schliesslich mit einer Methode erreicht,
bei welcher man das Edukt zusammen mit der sauren Oxydations¬
lösung in einer verschlossenen Ampulle während ca. 30 Stunden
bei Raumtemperatur schüttelte. Die Ausbeute an isolierter Es¬
sigsäure war dabei zwar von anfänglich 92$ bezüglich 2 Aequi¬
valenten abbaubarer Methylgruppen* auf 72$ gesunken; gleich¬
zeitig hatte sich aber die Wasserstoffaustauschrate von 35,5
auf 3,5$ verringert (vgl. Tabelle 16, Seite 73).
Das optimierte Verfahren für die Kuhn-Roth-Oxydation wurde
nun direkt an einem Gemisch der nicht markierten Silyläther
38 und 3_9_ angewandt. Dabei erhielt man eine etwas geringere
Ausbeute an Kaliumacetat als im ersten Versuch; die Aus¬
tauschrate blieb aber ebenfalls sehr klein (vgl. Tabelle 15).
Das optimierte Verfahren (Nr.2) wurde deshalb für den Abbau
der tritierten Silyläther 38c und (±)_3qc verwendet.
* Die Methylgruppe C-1, welche am aromatischen Kern sitzt,
wird durch den Abbau wahrscheinlich nicht erfasst.
- 72 -
Tabelle 15
Verbindung Verfahren Ausbeute d0KOAc
d1 d2 d3
Gemisch 1+2_ 1 92$ 63,5$ 19,9$ 9,9$ 6,7$
Gemisch 1+2_ 2 72$ 96,5$ 1,5$ 1,0$ 1,0$
Gemisch 38/39 2 68$ 95,5$ 2,5$ 1,0$ 1,0$
In beiden Fällen wurde die gebildete Essigsäure mit verdünn¬
ter Kalilauge titriert und die daraus resultierenden Kaliura-
acetate £0_ und 9_]_ wurden mit [1-14C]-Natriumacetat so ver¬
schnitten, dass in beiden ein 3h/14C-Verhältnis von ca. 5:1
entstand (vgl. Tabelle 16).
Je eine Probe der doppelt markierten Acetate wurde nach Ver¬
dünnen mit unmarkiertem Kaliumacetat nach einer Standardme¬
thode (74)zu £ien entsprechenden p-Phenyl-phenacyl-acetaten
92 und 9_3 umgesetzt. Diese wurden durch Chromatographie sowie
durch Umkristallisation gereinigt und ihre Aktivität wurde
erneut bestimmt. Die jeweilige scheinbare Zunahme der Triti¬
umaktivität (vgl. Tabelle 16) ist durch den Verlust von
C-Carbonat zu erklären, welches im beigemischten
[ 1- C]-Natriumacetat enthalten war.
Die sonst gute Uebereinstimmung der 3h/'4C-Verhältnisse zwi¬
schen den Kaliumacetaten und ihren Phenacylderivaten 9_2 und
93 bestätigen die hohe chemische Reinheit der gewonnenen Es¬
sigsäuren .
- 73 -
Tabelle 16
Verbindung 3h ipm/umol '^C ipm/umol 3H/11»C Zunahme ^H
KOAc aus
Herq. (9_0) S.OlOxIO11
KOAc aus
Isoh. (£1) 7,432x10lt
90 mit
1l*C-NaOAc 4,814x104 1,180x101 4,080
9,8$
Phenacylde-
riv. aus £0 6,574x102 1,466x102 4,480
91 mit
1l,C-NaOAc 8,338x104 1,666x101' 5,005
4,5$
Pheancylde-
riv. aus £1 1,036x103 1,980x102 5,230
* chromatographierte und umkristallisierte Derivate
Das Vorgehen zur Konfigurationsbestimmung von Essigsäure
(75,76) iSt jjj, Schema 18 zusammengefasst. Details dazu werden
im Experimentalteil aufgeführt.
Je eine Probe der mit 1l,c-Acetat verschnittenen chiralen Ka-
liumacetate wurde nach ausführlich beschriebenen Methoden
(77,78) £n Acetyl-Coenzym A übergeführt und in Gegenwart von
Malat-Synthetase und Glyoxylat zu Aepfelsäure umgesetzt. Die
isolierten Aepfelsäuren wurden mit inaktivem Material ver¬
dünnt und anschliessend einer Equilibrierung durch Fumarase
unterworfen.
- 74 -
Die verbliebenen Aepfelsäuren wurden zurückisoliert und chro¬
matographisch gereinigt.
Schema 18
H
D-j-TCOOH
COOH
h HO-j-H Fumarase-
tJoCOOH
HRe=T
<d HO--"
H-
COOH
H
T
Fumarase
"h^T
Wkt
COOH
COOH
HO+HD-4-H
COOH
COOH
HOOC
H
HOOC
COOH
Wird im weiteren Ver¬
lauf der Reaktion nicht
mehr erfasst, da das
Tritium ausgewaschenwi rd.
COOH
HO-f-H(D)H-4-D(H)
COOH
COOH
HO4-HCT)H-J-T(H)COOH
Die Aktivitäten, die bei der Konfigurationsbestimmung gemes¬
sen wurden, sind in Tabelle 17 festgehalten.
Der relative prozentuale Tritiumgehalt, welcher nach der Be¬
handlung mit Fumarase in den zurückgewonnenen Aepfelsäuren
verbleibt, ist als "F-Wert" definiert (89)_
Dieser betrug für Herqueinon: 33,5
für Isoherqueinon: 37,5
- 75 -
Tabelle 17
Verbindung 3h ipm/mmol 1^C ipm/mmol 3H/1*C relativer
T-Gehalt
Acetat aus £0_
Malat I aus £0
Malat II (£0)
4,8l4x107
4,796x1051,788x105
1,180x107
1,224x105
1,216x105
4,08
3,92
1,47
1 ,040
1,00 *»
0,375
Acetat aus £1
Malat I aus £1
Malat II (£1)
5,850x107
1,230x1064,120x105
1,169x107
2,565x105
2,566x105
5,005
4,798
1,606
1,043
1,00 **
0,335
Malat I vor, Malat II nach Fumarasebehandlung** Normierter Basiswert
Aus den F-Werten lässt sich die optische Reinheit der iso¬
lierten Essigsäuren nach der Formel 1 berechnen.
Dies ergibt für die Essigsäure aus Herqueinon: 55$
aus Isoherqueinon: 42$
Formel 1
F-50
EU = x 100
30
Es ist bekannt (88)f dass bei chiraler Essigsäure mit 100$
Enantiomerenreinheit für die (R)-Konfiguration ein maximaler
F-Wert von 80 und für die (S)-Form ein solcher von 20 erwar¬
tet werden darf. Im vorliegenden Fall mussten somit beide Es¬
sigsäuren der (S)-Reihe zugeordnet werden. Wegen der Resulta¬
te, die man beim früher durchgeführten 13c-Einbauexperiment
erhalten hatte (siehe Kapitel 5), müsste das Vorfinden der
S-Konfiguration in beiden Reihen doch befremden. Der ^3c_yer-
- 76 -
such hatte deutlich auf einen gemeinsamen offenkettigen Vor¬
läufer (vgl. Schema 19) hingewiesen. Für diesen gibt es nur
zwei plausible Konformationen der Seitenkette, die zu einer
Cyclisation zum Fünfring führen können. Ausgehend von der ei¬
nen wird Herqueinon (1) und aus der andern Isoherqueinon (2)
gebildet.
Schema 19
Beim Einbau von (3R.5S)-[5-3h,2h]-Mevalolacton (55e) muss so¬
mit ein doppelt indizierter Vorläufer 4^ entstehen, der beim
Cyclisieren der beiden möglichen Konformeren zu Herqueinon
und Isoherqueinon mit entgegengesetzter Konfiguration der Me¬
thylgruppen C-15 führt (vgl. Schema 19)
Auch die relativ tiefe optische Reinheit von 42$ war ein Hin¬
weis darauf, dass an der abgeleiteten Konfiguration im Falle
des Isoherqueinons zu zweifeln war.
Nachdem die Röntgenstrukturanalyse von Isoherqueinontri-
methylsilyläther (3£) (siehe Anhang I) die leichte Epimeri-
sierbarkeit von Herqueinon (1) zu enantio-Isoherqueinon (-)-2^
- 77 -
aufgedeckt hatte (vgl. Abschnitt 4.7.), löste sich auch das
vorliegende Problem. Durch die Epimerisierung eines grossen
Teils des tritierten Herqueinons bei der Silylierung war mehr
(-)-Isoherqueinon entstanden als natürliches (+)-Isoher-
queinon je vorhanden gewesen war. Dass dies gut möglich war,
bewies eine nachträglich durchgeführte NMR-Analyse des aus
dem Pilz isolierten tritierten Rohgemischs, welche ein Ver¬
hältnis von 72:28 zugunsten von Herqueinon ergab.
Durch die Epimerisierung war die Konfiguration der C-15-Me-
thylgruppe des Herqueinons in die Isoreihe "verschleppt" wor¬
den. Wegen des Ueberschusses an "fremdem" (-)-Isoherqueinon
wurde in der Isoreihe sogar die falsche Konfiguration vorge¬
täuscht .
Nachdem eine Methode zur nicht epimerisierenden Silylierung
von Herqueinon/Isoherqueinon-Gemischen entwickelt worden war
(siehe Abschnitt 4.8.), konnten die oben geäusserten Vermu¬
tungen auch nachgewiesen werden.
Eine Probe des tritierten Rohgemischs von Herqueinon und Iso¬
herqueinon wurde unter nicht epimerisiernden Bedingungen si¬
lyliert. Das entsprechende Silyläthergemisch wurde chromato¬
graphisch getrennt und der Silyläther 39d bezüglich Reinheit
analysiert. Die Gaschromatographie ergab eine Diastereomeren-
reinheit von * 97%, und die optische Drehung wurde zu +510°
ermittelt. Eine frühere Messung an ^3c_markiertem Isoherquei-
nonsilyläther 39a mit einer optischen Reinheit von 84$ hatte
einen Drehwert von +436 °ergeben. Bei einer Enantiomeren¬
reinheit von 100$ müsste man somit einen Drehwert von +520°
erhalten. Daraus lässt sich für den tritierten Silyläther 39d
eine hohe Enantiomerenreinheit ableiten.
Der reine Isosilyläther 39d wurde nach der oben beschriebenen
Standardmethode durch Kuhn-Roth-Oxydation zu Essigsäure abge¬
baut und diese, nach Verschneiden mit ^C-Acetat, einer Ace-
tatanalyse unterzogen. Die dabei erhaltenen Resultate sind in
Tabelle 18 aufgeführt.
Im vorliegenden Fall Hess sich ein F-Wert von 68,0 berech¬
nen. Dieser Wert ergibt eine Enantiomerenreinheit für die Es¬
sigsäure von 60$ und eindeutig R-Konfiguration an der Methyl-
- 78 -
Tabelle 18
Verbindung 3h ipm/mmol'
C ipm/mmol 3H/1ltC rel 3h
Isoäther 3J)d 1,593x108Acetat aus 39d 4,920x107mit 1ltC-NaOAc 4,918x107 1 ,223x107 4,024 1,06
Malat I * 1,729x106 4,554x105 3,797 1,00 **
Malat II * 1,171x106 4,548x105 2,574 0,68
* verdünnte Substanzen
** normierter Basiswert
Malat I: vor Fumarasebehandlung
Malat II: nach Fumarasebehandlung
gruppe C-15 des entsprechenden Isoherqueinons. Der berechnete
maximal mögliche Enantiomerenüberschuss unter Einbezug der
Reinheit des Ausgangsmaterials, des Austausches beim
Kuhn-Roth-Abbau und der postulierten Verschmierung durch Al-
lylumlagerung von DMAPP ergab einen Wert von 66$. Damit lag
der experimentell ermittelte Wert nicht sehr weit darunter.
Mit den Resultaten aus dem letzten Experiment war erwiesen,
dass die Methylgruppe C-15 in Isoherqueinon effektiv die ent¬
gegengesetzte Konfiguration zu jener der entsprechenden Me¬
thylgruppe in Herqueinon aufweist.
- 79 -
7. Analyse der theoretisch möglichen regio- und stereospezi¬
fischen Vorgänge bei der Bildung des Fünfringes von Her¬
queinon und Isoherqueinon
Bei der Alkylierung des Polyketidkerns 26^ mit der noch feh¬
lenden Isopentaneinheit gibt es neben der direkten C-Alkylie¬
rung am Zentrum C-11 auch zwei Möglichkeiten zur O-Alkylie-
rung an den Hydroxygruppen der Zentren 10 und 12. Um zu den
gewünschten Endprodukten 1 und 2_ zu gelangen, muss bei direk¬
ter C-Alkylierung die Reaktion am Alkylierungsreagens DMAPP
(76) nach SN'-Modus verlaufen, während bei den beiden O-Alky-
lierungen eine "normale" Substitution am C-1 von DMAPP (76)
gefolgt von einer formalen Claisenumlagerung zum Ziele führt.
Neben den genannten regiospezifischen Varianten gibt es ver¬
schiedene stereospezifische Möglichkeiten, welche es zu un¬
terscheiden gilt. Für die Alkylierung und den darauffolgenden
Ringschluss sind insgesamt immer noch 64 mögliche Reaktions¬
wege denkbar. Diese Zahl lässt sich aber beträchtlich redu¬
zieren, wenn man den Reaktionsverlauf durch Verfüttern geeig¬
net markierter Vorläufer untersucht.
Durch den Einbau von ^c-markiertem Mevalolacton (55c) und
von (5S)-[5-3H,2H]-Mevalolacton (55e) in P. Herquei wurde be¬
wiesen, dass die Alkylierung und der Ringschluss bei der Bil¬
dung von Herqueinon (1) und Isoherqueinon (2_) stereospezi¬
fisch verlaufen. Kombiniert man in einem Gedankenexperiment
die beiden unabhängigen Einbauversuche, so erhält man ein hy¬
pothetisches Alkylierungsreagens 105 (siehe Schema 20, wel¬
ches alle notwendigen Markierungen enthält, um die regio- und
stereospezifischen Vorgänge während der 5-Ringannellierung
verfolgen zu können.*
* Obschon den folgenden Betrachtungen immer zwei unabhängi¬
ge Einbauexperimente zugrunde liegen, wird der Einfach¬
heit halber der dreifach markierte, hypothetische Vorläu¬
fer verwendet.
- 80 -
Schema 20
HO CH.
ÖO'
55c
HO CH3
HO CHr
I OPP
105
55e
- 81 -
7.1. Diskussion der direkten C-Alkylierung
Bei einer direkten C-Alkylierung des Phenalenonkerns 26 mit
DMAPP (7J0 führen alle Reaktionswege, welche eine Substitu¬
tion nach SN-Modus beinhalten, zu strukturell falschen Pro¬
dukten (siehe Schema 21) und können deshalb a priori verwor¬
fen werden.
Schema 21
Bezüglich der regiospezifisch erlaubten SN'-Alkylierung haben
wir nun verschiedene stereospezifische Varianten zu überprü¬
fen. Um die Angriffsrichtungen sowohl am Phenalenonkern als
auch an dessen Reaktionspartner DMAPP eindeutig festlegen zu
können, bestimmen wir nach der Re,Si-Noraenklatur (91)an bei¬
den Molekeln die entsprechenden Seiten (vgl. Schema 22).* Bei
Um von allfällig vorhandenen Isotopenmarkierungen unab¬
hängig zu sein, werden Isotopen nicht in die Gewichtung
der Substituenten einbezogen.
- 82 -
einem zur Diskussion stehenden Reaktionsweg kann dann zum
Beispiel von einem Re-Angriff am Ringgerüst und einem Angriff
auf die Si-Seite von DMAPP gesprochen werden. Im vorliegenden
Fall sind folgende Kombinationen denkbar:
Re.Re
Re.Si
Si.Si (lk)
Si.Re (ul)
Dabei soll die erste Kolonne jeweils die Angriffsrichtung an
der Polyketidkomponente und die zweite Kolonne die Angriffs¬
richtung am Isopentanrest beinhalten.
Schema 22
Si
^
$>—OHOH
HO i
^IRe
^
Si
^r
iRe
Si
I I OPP
Da das Zentrum C-11 des Phenalenonkerns 2b^ auf dem Weg zu den
Endprodukten planarisiert wird, spielt die Angriffsrichtung
hier keine Rolle, so dass nur zwischen einem Re- oder Si-An-
griff an DMAPP (£6) unterschieden werden muss. Bei diesem
Schritt wird - wegen der Markierung der E-Methylgruppe in
DMAPP - die Stereochemie des Zentrums C-17 in den postulier¬
ten Zwischenprodukten h_ oder 4_^ und in den Endprodukten Her¬
queinon (1) und Isoherqueinon (2_) bestimmt (siehe Schema 23) .
Experimentell wurde nachgewiesen, dass beim Einbau von 2-'3c-
markiertem Mevalolacton in P. herquei, sowohl in Herqueinon
(1) als auch in Isoherqueinon (2), die Markierung immer in
- 83 -
Schema 23
die Si-Methylgruppe am Zentrum C-17 zu liegen kommt (siehe
5.3- und 5.4.). Damit kann ein Angriff auf die Si-Seite der
Doppelbindung von DMAPP (7j6) ausgeschlossen werden.
Während die Lage der markierten Methylgruppe am Zentrum C-17
durch den Re- oder Si-Angriff an DMAPP gesteuert wird, ist
die Anordnung der verschieden markierten Wasserstoffatome am
Zentrum C-15* vom syn- oder anti-Verlauf der SN'-Reaktion ab¬
hängig (vgl. Schema 24, Seite 84).
* Beim Einbau von am C-5 mit T und D doppelt markiertem Me¬
valolacton in P. Herquei
- 84 -
Schema 24
C«ANTl( OPP
Offene Zwischenstufen (wie zum Beispiel >\_ im Schema 23) waren
im vorliegenden Fall nicht isolierbar. Die Lage des Deute¬
riums und des Tritiums an der Vinyldoppelbindung von 4^ und
damit der stereochemische Verlauf der Sn'_Reaktion konnten
deshalb nur auf indirektem Wege bestimmt werden. Wird für die
Cyclisation von l£ ein trans-anti-Mechanismus angenommen, so
kann aus der Konfiguration der C-15-Methylgruppe in den End¬
produkten 1 und 2_ auf die Positionen von D und T im hypothe¬
tischen Vorläufer 4^ zurückgeschlossen werden (vgl. Schema 25,
Seite 85). Ein trans-anti-Verlauf einer ähnlichen biologi¬
schen Reaktion ist von Cane (116)am Beispiel der Bildung von
Cyclonerolidol (117) aus Nerolidylpyrophosphat nachgewiesen
wurde (siehe Schema 26, Seite 86). Hat man auf diese Weise
die Lage der beiden Wasserstoffisotopen im nicht isolierbaren
- 85 -
Vorläufer 4^ festgelegt, so kann auch zwischen syn- oder anti¬
Verlauf der S«'-Reaktion unterschieden werden.
Schema 25
(15 S)-Herqueinon (15 R)-Herqueinon
IHO.
CH
'3
HO-
-X
L.N.
HO.
CH3
HC=N
(15E)-4 (15Z)-4
- 86 -
Im Falle des Herqueinons (Y) fand man an der Methylgruppe S-
Konfiguration (siehe Kapitel 6). Für das Entstehen von Iso¬
herqueinon (2) ist ein identischer Reaktionsverlauf bis vor
die Cyclisation verlangt. Durch den nukleophilen Angriff auf
die Si-Seite (statt wie bei Herqueinon auf die Re-Seite) der
Doppelbindung des gemeinsamen Vorläufers 4^, erhält man die in
Isoherqueinon (2_) beobachtete R-Konfiguration der C-15-Me-
thylgruppe (siehe Schema 27, Seite 87).
Schema 26
- 87 -
In Tabelle 19 sind die Ergebnisse der Analyse des Reaktions¬
verlaufs bei direkter C-Alkylierung gefolgt von trans-anti-
Cyclisation zur Bildung von Herqueinon (1) und Isoherqueinon
{2) zusammengefasst.
Schema 27
(15R)-Isoherqueinon
Tabelle 19
Produkt Angriff
an DMAPP
V Angriff auf
DB in 107b
Herqueinon Re anti Re
Isoherqueinon Re anti Si
- 88 -
7.2. Diskussion der O-Alkylierungen
Beginnt die Fünfringannellierung am Phenalenonkern (^6) mit
einer O-Alkylierung, so muss diese nach einem Sjj-Modus am C-1
der Isopentaneinheit 7.6 verlaufen (vgl. Schema 28). Durch 0-
Alkylierung nach SN' gelangt man zu den Zwischenprodukten
111a und 112a, die nicht mehr zu Herqueinon (1) oder Isoher¬
queinon (2) weiterreagieren können.
Schema 28
I Claise
Diese Vorläufer können nicht mehr zu Herqueinon und Iso-
Herqueinon und Isoherqueinon weiterreagieren herqueinon
Ist das Alkylierungsreagens DMAPP (16) am C-1 doppelt mar¬
kiert, so muss dieses Zentrum bei der direkten Substitution
invertiert werden (93-95)_ Durch Verfüttern von (3R,5S)-[5-3h,h]- Mevalolacton (5_5e) an P. Herquei hätten in diesem
Fall die (15R)-Produkte 111 oder 112 zu entstehen (siehe
Schema 28). Diese 0-alkylierten Zwischenprodukte müssten
- 89 -
dann, zumindest formal, einer Claisenumlagerung (96-99,103)
unterworfen werden, damit Herqueinon (1) und Isoherqueinon
(2_) anschliessend gebildet werden können.
Auch bei der O-Alkylierung gilt es nun verschiedene Reak¬
tionswege zu unterscheiden. Bei beiden O-Alkylierungsproduk-
ten 111 und 112 lassen sich für die Claisenumlagerung zwei
verschiedene 6-Ringübergangszustände in Sesselform und je
zwei in Wannenform postulieren. Diese sind am Beispiel von
111 in Schema 29, Seite 90 dargestellt, gelten aber sinnge¬
mäss auch für 112. Geht man von der Seite des jeweiligen An¬
griffs auf das Zentrum C-17 der Doppelbindung der Dimethyl-
allylätherfunktion* aus, so kann in beiden Fällen zwischen
einer "Re- und Si-Wanne" sowie einem "Re- oder Si-Sessel"
differenziert werden (100), Es ist einfach zu zeigen, dass
sich die beiden möglichen O-Alkylierungsprodukte 111 und 112
bezüglich der Stereochemie am Zentrum C-15 während einer
Claisenumlagerung äquivalent verhalten. Das heisst, dass z.B.
eine "Re-Wanne" in beiden Ausgangsprodukten zum selben Zwi¬
schenprodukt 4^ mit identischer Stereochemie führen muss.
Da bei Verwendung eines an der E-Methylgruppe markierten Vor¬
läufers TJi nur ein Umlagerungsprodukt mit (17S)-Konfiguration
zu den richtigen Endprodukten führen kann (vgl. 7.1.), müssen
die beiden "Si-Uebergangszustände" (Wanne und Sessel) nicht
weiter in Betracht gezogen werden, weil sie in jedem Fall zu
(17R)-Verbindungen führen. Die Lage der Wasserstoffisotopen T
und D am Zentrum C-15 wird durch die Wahl des Uebergangszu-
standes bei der Claisenumlagerung (Wanne oder Sessel) ge¬
steuert (siehe Schema 29).
Wie aus dem Schema 28 hervorgeht, führen beide möglichen 0-
Alkylierungsprodukte 111 und 112 zum selben Claisenumlage-
rungs-Produkt 4^. Gerade nach erfolgter Umlagerung unterschei¬
den sich die beiden Produkte allerdings in ihrer Konforma¬
tion. Wird die Umlagerung ausgehend von 111 durchgeführt, so
ist nur eine Drehung um die C(16)/C(17)-Achse nötig, um zu
* Auch hier erfolgt die Anwendung der CIP-Regeln unabhängig
von ev. vorhandenen Isotopenmarkierungen.
- 90 -
Schema 29
5l
HO.
o=<
HO- <y
.OH
.OH
"nS. ^
OH
Si
HO. ^OH
o=<
HO—«^
f^—HhO:
^S <&
17 R
Si
Re
HO OH *S^_
/ \^^% <r\HO—sT
>*.\ 0
17S
- 91 -
Konformationen zu gelangen, welche sowohl zu Deoxyherqueinon
(10) als auch zu Deoxyisoherqueinon (3_7) cyclisiert werden
können (vgl. Schema 30)•
Startet man mit 112, so gelangt man im Umlagerungsprodukt jl
zu einer Konformation, bei welcher zusätzlich zur oben be¬
schriebenen Rotation auch um die C(11)/C(17)-Bindung um 180°
gedreht werden muss, um die Cyclisationsprodukte 10 und 3_7 zu
erhalten.
Aus dem Schema 30 gehen zwei neue Erkenntnisse hervor:
a) Legt man die Lage des Phenalenonkerns wie im Schema darge¬
stellt fest, so erkennt man, dass im Falle von 111 ein
"Sessel unten" und eine "Wanne oben" zum richtigen Umlage¬
rungsprodukt führen. Beim O-Alkylierungsprodukt 112 hinge¬
gen gelangt man mit einem "Sessel oben" und einer "Wanne
unten" zum Ziel.
b) Wird 111 umgelagert, so kann aus dem Claisenprodukt 4_ for¬
mal in einer konzertierten Reaktion am C-11 deprotoniert
und aromatisiert, an der Doppelbindung C(15)/C(16) proto¬
niert und zum Fünfring cyclisiert werden. Ohne Aenderung
der Konformation nach der Umlagerung gelangt man so zu
Deoxyherqueinon (10), während eine 180°-Drehung um die
C(16)/C(17)-Bindung genügt, um auch Deoxyisoherqueinon
(37) zu erzeugen. Bei der Umlagerung von 112 entsteht eine
Konformation, in welcher zuerst zum Aromaten tautomeri-
siert werden muss, bevor die Cyclisation nach einer zu¬
sätzlichen 180°-Drehung um die C(11)/C(17)-Bindung einge¬
leitet werden kann.
Gegen die Bildung von 112 als Vorläufer von Herqueinon (1)
und Isoherqueinon (2_) spricht aber nicht nur der komplizier¬
tere Mechanismus als bei 111, sondern auch die Existenz von
Herqueichrysin (12). Betrachtet man nämlich das Umlagerungs¬
produkt von 112, so ist dessen Konformation geradezu ideal,
um - wie bei 111 zu Deoxyherqueinon (J_0) - direkt zu Her¬
queichrysin 12 zu gelangen (vgl. Schema 31)• Frost, Haiton
- 92 -
Schema 30
RO.
o=<
HO-
,OH
.OH
V ^
111 V«
o=<
HO
OH
OH
112
RO.
o=<
,OH H-£
HO-^ *
111
üv
RO.
o=<
HO-
.OH
112
H-^_
x:
s-4TJLj*
H'H
- 93 -
und Morrison (12,133,134) beschreiben die Isolierung von Her¬
queichrysin (J_2) zusammen mit Atrovenetin (5_), Herqueinon
{Y) , Deoxyherqueinon (10) sowie weiteren Phenalenonen aus
Schüttelkulturen von P. Herquei. Wenn also Herqueichrysin
(12) sogar zusammen mit Deoxyherqueinon (10) entsteht, ist
nicht einzusehen, warum in unserem Fall, wo nur Herqueinon
(1) und Isoherqueinon (2_) gebildet werden, ein O-Alkylie-
rungsprodukt 112 entstehen sollte, welches idealerweise di¬
rekt zu Herqueichrysin (12) cyclisieren könnte.
^TH
Schema 31
112
^OH X)H •
4" 12
Ih ~^& -=<rT4'
OH
12
Leider ist die Konfiguration am Zentrum C-16 von Herqueichry¬
sin (j_2) nicht bekannt. Obige Analyse verleitet aber dazu,
für Herqueichrysin (J_2) die (17S)-Konfiguration vorauszusa¬
gen.
- 94 -
Aus den soeben diskutierten Möglichkeiten lässt sich wie bei
der Analyse der C-Alkylierung eine Korrelationstabelle für
die verschiedenen Reaktionswege aufstellen, welche zu den
richtigen Endprodukten führen (vgl. Tabelle 20).
Tabelle
20
Produkt
Sessel
Wanne
Drehung
um
C(11)-C(17)-Bindung
beanspruchte
Sei¬
Drehung
der
DB
nötig:
ja/nein
te
der
DB
in
4in
4um
Herqeuinon
unten
oben
nei
nRe
Isoherqueinon
unten
oben
nei
nSi
180°
Obige
Tabelle
gilt,
falls
als
O-Alkylierungsprodukt
der
Vorläufer
111
gewählt
wurde.
Im
Falle
des
Vorläufers
112
gilt
die
folgende
Tabelle.
CO
CJ1
Produkt
Sessel
Wanne
Drehung
um
C(11)-C(17)-Bindung
beanspruchte
Sei
Drehung
der
DB
nötig:
ja/nein
te
der
DB
in
4in
4'
um
Herqueinon
oben
unten
ja
Re
90°
Isoherqueinon
oben
unten
ja
Si
90°
- 96 -
Die in der vorliegenden Analyse gefundenen Resultate zeigen,
dass im Falle einer O-Alkylierung, diese bevorzugt an der Hy-
droxygruppe des Zentrums C-12 stattfinden muss. Die darauf¬
folgende Claisenumlagerung kann über eine "Re-Wanne oben"
oder einen "Re-Sessel unten" direkt zu Deoxyherqueinon (10)
führen. Für die Bildung von Deoxyisoherqueinon (3_J_) ist in
jedem Fall eine Drehung der Doppelbindung des offenkettigen
Claisenprodukts jt um die C(16)/C(17)-Bindung nötig. Zwischen
den beiden Uebergangszuständen Wanne und Sessel kann nicht
differenziert werden. Von in vitro durchgeführten, nicht en-
zymatisch gesteuerten Claisenumlagerungen ist allerdings be¬
kannt, dass die Sesselkonformation in der Regel energetisch
günstiger ist als die Wannenform (100-102)t
- 97 -
7.3. O-Alkylierung versus C-Alkylierung
Experimentell ist im vorliegenden Fall zwischen der 0- und
der C-Alkylierung nicht zu unterscheiden. Das Alkylierungs¬
reagens DMAPP (76) erfährt bei der O-Alkylierung am Zentrum
C-1 anlässlich der Substitution nach SN-Modus eine Inversion.
Die daran anschliessende Claisenumlagerung verläuft als
[3,3]-sigmatrope Umlagerung suprafacial. Während des gesamten
Reaktionsverlaufs bis zum offenkettigen Vorläufer >± hat man
somit eine Inversion, welche zum selben Resultat führt wie
die S«,'-C-Alkylierung bei einem Verlauf nach dem anti-Modus
(vgl. 7.1.). Damit weisen die Doppelbindungen der auf ver¬
schiedenen Wegen entstandenen Produkte 4^ in beiden Fällen
dieselbe Stereochemie auf und sind auch bei Verwendung mar¬
kierter Vorläufer nicht unterscheidbar.
Für eine O-Alkylierung mit anschliessender Claisenumlagerung
sprechen folgende Befunde:
Grundon(104) nat gezeigt, dass aus Ravenin (113) Ravenolin
(115) gebildet wird. Dabei muss zuerst das Claisenumlage-
rungsprodukt 113b entstehen (siehe Schema 32), welches mit
einer anomalen Claisenumlagerung(100-102)
zum Endprodukt 115
weiterreagiert. Die Hypothese der Bildung des Claisenprodukts
113b wird unterstützt durch das ebenfalls bekannte Cyclisa-
tionsprodukt Ifflaiamin 114 (vgl. Schema 32). Leider gelang
es Grundon nicht, das Zwischenprodukt 113b zu isolieren.
Barbier und Mitarbeiter (130)naDen bewiesen, dass Phomamid
(128) ein Vorläufer von Sirodesmin PL (127) ist. Auch hier
muss für die Bildung des Endprodukts eine Claisenumlagerung
am Vorläufer 128 stattfinden (siehe Schema 33).
Bei Arbeiten mit Zellkulturen von Streptocarpus dunnii haben
Inoue et al. (125) ein offenkettiges Claisenprodukt 125 als
Zwischenstufe auf dem Weg zu verschiedenen Dunnionderivaten
isoliert (siehe Schema 34, Seite 99). Ausgehend vom markier¬
ten Dimethylallyläther 121a von Lawson 121 isolierten sie
nebst dem Claisenprodukt 125, <*-Dunnion (122) ,Dunnion (123)
und 8-Hydroxydunnion 124.
- 98 -
Schema 32
Ol
IS CH3
Schema 33
L-TyroslnL-Serin
DMAPP
OAc OAc
127
- 99 -
Schema 34
• Markierung »D XXÄm o
Die Umwandlung von Chorisminsäure (116a zu Prephensäure (116)
beinhaltet formal ebenfalls eine Claisenumlagerung (106,107)
(siehe Schema 35).
Schema 35
COOH
O^ COOH
OH
HOOC CH2-C-COOH
0ÖH
116a 116
- 100 -
Chorisminsäure (116) selbst ist thermisch so instabil, dass
sie schon bei niedrigen Temperaturen zu Prephensäure umgewan¬
delt wird. Die Halbwertszeit für Chorisminsäure beträgt 7 Ta¬
ge bei 4 °C in Lösung und 19 Tage bei 22 °C als Festkörper.
Gerade deshalb ist die Frage nach dem wirklichen Mechanismus
bei dieser Umwandlung heute erneut Gegenstand intensiver Un¬
tersuchungen (139)#
Gegen ein O-Alkylierung mit Claisenumlagerung sprechen die
hohen Temperaturen, welche in vitro benötigt werden, um an
Phenalenonderivaten Claisenumlagerungen durchzuführen. Frost
und Morrison (133) veröffentlichten 1972 eine Synthese von
gelbem Atrovenetintrimethyläther 130.* Unter leicht basischen
Bedingungen lagerte der Allyläther 131 bei 200 °C in 4 Stun¬
den zu 78% um (siehe Schema 36, Weg A). Bei einer später be¬
schriebenen Synthese von Desmethylherqueichrysin (132) aus
dem gleichen Edukt (vgl. Schema 36, Weg B), wurden immer noch
Temperaturen von 153 °C benötigt d34)#
Schema 36
* Es gibt auch einen strukturisomeren orangen Trimethyl-
äther von Atrovenetin.
- 101 -
Zudem ist eigentlich nicht recht einzusehen, wie ein Enzym
eine solche Reaktion katalysieren könnte. Es fällt ebenfalls
schwer zu verstehen, warum ein Mikroorganismus zuerst eine
O-Alkylierung durchführen sollte, um dann mit einer Claisen¬
umlagerung, welche eine hohe Aktivierungsenergie benötigt, zu
einer Zwischenstufe zu gelangen, welche durch C-Alkylierung
nach Sjj'-Modus direkt erhalten werden kann.
Bezüglich der direkten C-Alkylierung gibt es mehrere biologi¬
sche Präzedenzfälle. H. Hasler(") hat 1978 die damals un¬
tersuchten Beispiele von SN'-Reaktionen in einer Tabelle zu-
sammengefasst. Die wenigen, unseres Wissens seither noch un¬
tersuchten biologischen Beispiele sind in Tabelle 21 festge¬
halten .
In Haslers Tabelle ^°'' sind mit der Bildung von Linalool aus
Geranyl-PP('15) un(j der isomerisierung von Farnesyl-PP zu
Nerolidyl-PP('^' zwei biologische Beispiele von SN'-Reak¬
tionen aufgeführt, welche nach einem syn-Mechanismus verlau¬
fen. Dabei handelt es sich allerdings um Allylumlagerungen,
in deren Verlauf eine C-0-Bindung gespalten und am andern En¬
de des Allylsystems mit der Abgangsgruppe neu gebildet wird.
In allen anti-Fällen, mit Ausnahme der Cyclisation von Salu-
taridinol I zu Thebain (109), wird eine C-C-Bindung unter
gleichzeitigem Ringschluss neu geknüpft. Bei Salutaridinol I
findet zwar eine O-C-Verknüpfung statt, aber es wird gleich¬
zeitig auch ein Ring geschlossen und Pyrophosphat dient wie
in allen andern anti-Beispielen wirklich als Abgangsgruppe.
Im Falle der Isomerisierung von Farnesylpyrophosphat zu Nero-
lidyl-PP hat Cane d2D durch Einbau von [1-18o]-Farnesyl-PPin Gibberella fujikuroi gezeigt, dass der Reaktionsverlauf am
besten mit einem Ionenpaarmechanismus (siehe Schema 37) kom¬
patibel ist. Mit einem solchen Mechanismus wird die beobach¬
tete 1/3-Verteilung der 1°0-Markierung im isolierten Cyclone-
rolidol (117) (vgl. Schema 26, Seite 86) am ehesten erklärt.
- 102 -
Tabelle 21
Sandarocopimaradien
(-)-ent-Kauren
Pimarenyl-Kation
PPO D
-?c\.
Virescenol 8
t|VOPP
qd^>D
- 103 -
Schema 37
O* -° P.* O* o
RY «Pxo-p-o RV^*K .0 R->0V-0-p-o
Bisher wurde kein Fall bekannt, wo eine direkte C-Alkylierung
nach SN'-Modus zur Bildung eines reinen Prenylierungsproduk-
tes nachgewiesen wurde. Trotzdem passt der in der vorliegen¬
den Arbeit verlangte anti-Verlauf bei einer allfälligen di¬
rekten C-Alkylierung gut ins Konzept, welches sich aus den
Resultaten der bisher untersuchten Sjg '-Reaktionen in biologi¬
schen Systemen ableiten lässt.
- 104 -
8. Bestimmung der direkten Vorläufer von Herqueinon und Iso¬
herqueinon
Kriegler und Thomas (2^zeigten durch Einbauexperimente mit
^C-markiertem Atrovenetin (5), dass dieses nach Methylierung
mit S-Adenosylmethionin in P. herquei zu Herqueinon (1) oxy¬
diert wird. Leider machten die Autoren keine Angaben zur Dia¬
stereomeren- und Enantiomerenreinheit des Ausgangsmaterials
und der Endprodukte. Es muss deshalb vermutet werden, dass
sie zwar ( + )-(R)-Atrovenetin (5_) (durch Einbau von'C-iar-
kiertem Acetat in P. atrovenetum gewonnen) in recht reiner
Form verfütterten, dann aber ein Geraisch aus Herqueinon (1)und Isoherqueinon (2_) isolierten. Es war deshalb nicht klar,
ob in diesem Gemisch beide oder nur eines der Diastereomeren
in markierter Form vorlag. Frost, Haiton und Morrison (25)
vermuteten später aufgrund der Isolierung von (-)-Atrovenetin
((-)-5_) aus P. Herquei-Stämmen, dass dieses Enantiomer als
Vorläufer von Isoherqueinon (2_) dienen könnte. Da man zu je¬
nem Zeitpunkt aber nicht in der Lage war, weder reines mar¬
kiertes (-)-Atrovenetin herzustellen, noch die entstehenden
Herqueinon/Isoherqueinon-Gemische zu trennen, konnte ihre Hy¬
pothese nicht überprüft werden.
Durch die Trennung der Silyläther von Herqueinon und Isoher¬
queinon war es in der vorliegenden Arbeit möglich geworden,
die beiden Reihen zu trennen. Zudem war aus Arbeiten von Bar¬
ton et al. (2^bekannt, dass Herqueinon/Isoherqueinon-Gerai-
sche mit Zink in Essigsäure zu (+)- und (-)-Deoxyherqueinon
(10) (im Gemisch) reduziert werden können. Dieses Verfahren
wurde von uns angewandt, um aus enantiomerenreinen, 14C-mar-
kierten Herqueinon- und Isoherqueinonsilyläthern direkt zu
den (R)- und (S)-Formen von markiertem Deoxyherqueinon (10)
zu gelangen. Anlässlich der Optimierung der Reaktion an un¬
markierten Silyläthergemischen stellte man fest, dass die Re¬
ste am Siliziumatom keine grosse Rolle spielen.
- 105 -
Diphenyl-methyl-sllyläthergemische der beiden Metaboliten 1
und £ wurden ebenso glatt reduktiv gespalten wie die empfind¬
licheren Trimethylsilyl-Derivate.
Da beim Einbau markierter Verbindungen in P. herquei die Ver¬
dünnung durch endogenes Material gross ist (vgl. Tabelle 11,
Seite 57), war für die Durchführung des geplanten Versuchs
ein Eduktegeraisch von hoher spezifischer Aktivität verlangt.
Dieses wurde durch Verabreichen einer wässrigen Lösung von
[2-14C]-Natriumacetat - welches zu ca. 90? markiert war - an
P. Herquei erhalten. Man isolierte ein Herqueinon/Isoherquei-
non-Gemisch mit einer spezifischen Aktivität in der Höhe von
10° ipm/mmol, was einer spezifischen Einbaurate von 0,86%
entspricht.
Ein Teil des radioaktiven Rohgemischs wurde mit Dimethyl-phe-
nyl-silylchlorid (DMPSC1) und Imidazol in DMF nach der nicht
epimerisierenden Methode (vgl. Abschnitt 4.8.) veräthert. Die
diastereomeren Silyläther wurden säulenchromatographisch ge¬
trennt. Die getrennten Produkte wiesen laut Kapillar-GC eine
Diastereomerenreinheit von je 98 - \% auf. Ein Hinweis auf
die hohe Enantiomerenreinheit waren die Drehungen von «p =
+663° für den Herqueinon- und +516° für den Isosilyläther.
Die beiden Derivate wurden nun in parallel laufenden Ansätzen
nach Barton ^2'mit Zink in Eisessig reduziert. Nach Chroma¬
tographie an gepuffertem Kieselgel erhielt man die gewünsch¬
ten (+)- und (-)-Deoxyherqueinone (10a und 10b) als gelbe,
kristalline Produkte. Dabei fand man für das (+)-Produkt ei¬
nen Drehwert von ttn = +121° und für das (-)-Deoxyherqueinon
einen solchen von -119°. Die Drehung von (+)-Deoxyherqueinon
war fast doppelt so hoch wie jene (+64°), welche von Galarra-
ga, Neill und Raistrick (°'ursprünglich publiziert worden
war. Die fast diametral entgegengesetzten Werte des (R)- und
(S)-Produktes sind übrigens erneut ein Beweis für das Nicht-
epimerisieren während der Silylierung.
Die beiden markierten Produkte 10a und 10b wurden nun in pa¬
rallel laufenden Versuchen nach bekanntem Standardverfahren
in P. herquei eingebaut. Nach 24 Tagen wurden die Mycelien
geerntet und aufgearbeitet. Die isolierten Rohextrakte wurden
- 106 -
mit Dimethyl-phenyl-silylchlorid (DMPSC1) unter nicht epime-
risierenden Bedingungen veräthert und in die entsprechenden
Herqueinon- und Isoherqueinonderivate aufgetrennt. Die Resul¬
tate dieses Versuchs sind in Tabelle 22 zusammengefasst.
Auch wenn beim Einbau von (+)-Deoxyherqueinon (10a) im iso¬
lierten Isoderivat eine geringe Radioaktivität festgestellt
wurde, lässt sich doch sagen, dass das (+)-Edukt praktisch
ausschliesslich in Herqueinon (1) eingebaut worden war. Die
im Isosilylderivat gefundene Aktivität entspricht nämlich
ziemlich genau der Summe der prozentualen Verunreinigungen
durch das falsche Diastereomer im ursprünglich eingesetzten
Silyläther und im Endprodukt. Dasselbe lässt sich sich mit
"umgekehrten Vorzeichen" auch für die Resultate bei der (-)-
Reihe sagen. Die totalen Einbauraten in den Rohextrakten wa¬
ren mit 69 und 64% erstaunlich hoch und auch die spezifischen
Einbauraten berechnet an den entsprechenden Silyläthern waren
mit 4 und 6% gut.
Da sich während des Stehenlassens der beiden Kulturfiltrate
je ein roter Festkörper in den wässrigen Lösungen gebildet
hatte, extrahierte man die Lösungen mit Chloroform. Nach dem
Einengen der getrockneten organischen Phasen erhielt man in
beiden Fällen rote, nadeiförmige Kristallisate. Die 'H-NMR-
Analyse zeigte, dass es sich um Gemische von Herqueinon und
Isoherqueinon handelte. Die beiden Gemische wurden wie oben
beschrieben silyliert, die entstandenen Silyläthergemische
chromatographisch getrennt und die Produkte bezüglich Ra¬
dioaktivität gemessen. Die Resultate aus diesen Versuchen
sind in Tabelle 23 festgehalten.
Berechnet man hier die spezifischen Einbauraten, so erhält
man plötzlich 52% für das (+)-Isomere und gar 55% für das
(-)-Produkt!. Dafür sind in diesen aus den Nährlösungen ex¬
trahierten Metaboliten die totalen Einbauraten etwas geringer
als bei den Produkten, welche aus den Mycelien gewonnen wur¬
den. Eine mögliche Erklärung für dieses Verhalten ist, dass
der verabreichte Vorläufer zuerst im Innern des Mycels zu den
Endprodukten oxydiert wird. Dies führt zur hohen totalen Ein¬
baurate in den "Mycelprodukten". Da es aber zu einer starken
Tabel1e
22
Werte
der
Produkte
aus
dem
Mycelextrakt
Edukt
verfutterte
Menge
Einbaurate
im
Rohgemisch
total
spezifisch
spezifische
Einb
Herq.silylather
aurate
in
Isosily1ather
(+
)-Deoxyherq
.2,40xl06
ipm
total
1,17x10
lpm/mmol
69%
2,7%
4,05%
0,065%
(-)-Deoxyherq
.2,
52xl
06ipm
total
8,16x10
ipm/mmol
64%
3,4%
0,12%
6,30
%
Tabelle
23
Werte
der
Produkte
aus
der
Nährlösung
i
o ^j
Edukt
verfutterte
Menge
Einbaurate
im
Rohgemisch
total
spezifisch
spezifische
Einbaurate
in
Herq.silylather
Isosilyläther
(+)-Deoxyherq
2,40x10
ipm
total
Q
1,17x10
lpm/mmol
18,8%
31,2%
52,3%
2,45%
(-)-Deoxyherq.
2,52x106
ipm
total
8,16x10
ipm/mmol
21,7%
29,0%
2,7%
55,60%
- 108 -
Verdünnung mit endogenem Material kommt, findet man relativ
niedrige spezifische Einbauraten. Später werden Herqueinon
und Isoherqueinon auch ausserhalb des Mycels produziert. Weil
aber bereits ein grosser Teil des Vorläufers verbraucht wor¬
den ist, führt dies zur beobachteten niedrigeren totalen Ein¬
baurate als in den im Mycel gebildeten Produkten. Da aber in
der Nährlösung keine Verdünnung durch endogenes Material
stattfindet, weisen die hier produzierten Substanzen eine
grosse spezifische Einbaurate auf. Es könnte auch sein, dass
mit der Zeit, vielleicht durch Ueberproduktion, ein Teil der
Zellen platzt, so dass unversehrte Oxydase ins Nährmedium ge¬
langt, welche dort noch nicht umgesetzten Vorläufer zu den
Endprodukten oxydiert. Eine spontane Oxydation darf ausge¬
schlossen werden, da die verabreichten Vorläufer sowohl an
Luft als auch in Lösung stabil sind.
Die oben beschriebenen Versuche zeigen, dass (+)- und (-)-
Deoxyherqueinon (-10) die direkten Vorläufer von Herqueinon
(1) beziehungsweise Isoherqueinon (2) sind. Da aber Atrovene¬
tin (5) auch zu Herqueinon umgewandelt wird (2^), muss daraus
geschlosssen werden, dass der Pilz P. herquei im Gegensatz zu
P. atrovenetum fähig ist, (-)-Atrovenetin ((-)-5_) herzustel¬
len. Dass die Differenzierung zwischen (+)- und (-)-Formen in
P. herquei erst auf der Stufe von Deoxyherqueinon geschieht,
wurde durch einen Versuch von Kriegler und Thomas (24)augge¬
schlossen, da sie zeigten, dass Desmethylherqueinon nicht
mehr zu Herqueinon methyliert werden kann.
In diesem Zusammenhang stellt sich die interessante Frage',
warum in P. atrovenetum offenbar nur das (+)-(R)-Isoraer von
Atrovenetin (5_) gebildet wird, während in P. herquei auch die
(-)-Verbindung entsteht. Eine Hypothese zur Erklärung dieses
Phänomens ist, dass in P. herquei eine nicht enzymatische,
spontane Cyclisation des offenkettigen Vorläufers 4. zu ( + )-
und (-)-Atrovenetin führen könnte (vgl. Schema 25, Seite 85).
- 109 -
Ein von Kirby und Evans '136) untersuchtes chemisches Analo-
gon hierfür ist die Cyclisation von 2-(1,1-Dimethylallyl)-
3,5-Dimethyl-4-Bromphenol (131) (siehe Schema 38). Diese Cyc¬
lisation wird allerdings nur bei einem pH unter 2,5 oder über
8,5-13 drastisch beschleunigt.
Bei pH 10 wurde für die Cyclisation bei 39°C eine Halbwerts¬
zeit von 82 Sekunden gemessen. Bei Raumtemperatur und einem
pH zwischen 3 und 7 verläuft die Reaktion nur sehr langsam
mit einer geschätzten Halbwertszeit von über 10 Tagen.
Schema 38
OH f? 0-OfH +
131 Br Br Br
Aehnliche Cyclisationen an nicht aktivierten Doppelbindungen
wurden auch mit Stickstoffanaloga nachgewiesen (137). im vor¬
liegenden Fall verläuft die Bildung von Herqueinon und Iso¬
herqueinon während der ganzen Produktionsphase des Pilzes im¬
mer in saurem Milieu mit einem pH zwischen 3 und 6. Dies wür¬
de dann eher wieder auf eine enzymkatalysierte Cyclisation
hindeuten. Bei Syntheseversuchen von Atrovenetin- und Her-
queichrysingerüsten beobachteten Morrison et al. d33) aller¬
dings eine spontane Cyclisation bei der Claisenumlagerung
entsprechender 3>3-Dimethylallyläther zu den C-alkylierten
Produkten in saurem Milieu. Die offenkettigen Claisenprodukte
konnten nur gefasst werden, wenn die Umlagerung in Gegenwart
einer Base durchgführt wurde. Durch Behandeln des offenen
&
- 110 -
Vorläufers in verdünnter Salzsäure erhielten sie rasch die
cyclisierten Produkte. In diesem Zusammenhang ist auch eine
Beobachtung von Inoue und Mitarbeitern ('38) interessant,
welche bei Arbeiten mit zellfreien Kulturen von Streptocarpus
dunnii Dunnion (123) mit ganz unterschiedlicher optischer
Reinheit vorfanden (vgl. Schema 34, Seite 99).
Mit den bisher durchgeführten Versuchen lässt sich die Bil¬
dung von (+)- und (-)-Atrovenetin in P. herquei durch sponta¬
ne,, nicht enzymkatalysierte Cyclisation des offenkettigen
Vorläufers 4^ nicht ausschliessen. Die nicht statistische 1:1-
Verteilung von Herqueinon und Isoherqueinon lässt sich in
diesem Fall durch Interaktion des enzymatisch gebildeten Vor¬
läufers 4^ mit der Enzymoberfläche begründen ("Herqueinon-Kon-
formation" bevorzugt gegenüber der Konformation, die zu Iso¬
herqueinon führen würde).
- 111 -
ANHANG I
Die Röntgenstrukturanalyse eines Racemats von Isoherqueinon-
trimethylsilyläther (39)
Zu Beginn der vorliegenden Arbeit waren nur eine Röntgen-
strukturaufklärung von einem Atrovenetinderivat (>5,io) unc)
eine zweite über Herqueinon (1) bekannt "", Quick, Thomas
und Williams (1^) bestimmten mit Hilfe der Schweratommethode
(Chloroform im Kristallgitter) neben der relativen auch die
absolute Konfiguration von ( + )-Herqueinon iY) • Brooks und
Morrison (10' äusserten 1972 in ihrer Arbeit über die Struk¬
turaufklärung von Herqueinon (1) und Norherqueinon {]_) die
Vermutung, dass Isoherqueinon (2) am Hydroxyl tragenden asym¬
metrischen Zentrum die gleiche Konfiguration wie Herqueinon
(Y) besitze, während die Konfiguration des zweiten asymmetri¬
schen Zentrums in Isoherqueinon (2) entgegengesetzt der ent¬
sprechenden in Herqueinon (1) sein müsse. Zusammen mit ihrer
Röntgenanalyse von Herqueinon (1) leiteten Thomas et al. (1"'
daraus auch die Struktur und die relative sowie die absolute
Konfiguration von Isoherqueinon (2) ab.
Da es bis 1980 niemandem gelungen war, ein herqueinonfreies
Präparat von Isoherqueinon (2_) herzustellen, blieb ein
schlüssiger Beweis für die relative und absolute Konfigura¬
tion von Isoherqueinon (2_) immer noch offen.
Deshalb wollten wir mit Hilfe der Silylierung von Herquei-
non/Isoherqueinon-Gemischen und anschliessender Trennung der
entsprechenden Trimethylsilyläther die Struktur von Isoher¬
queinon (2^) durch Röntgenanalyse des kristallinen Isosilyl-
äthers (3£) ableiten. Zu diesem Zeitpunkt der Arbeit war noch
nicht bekannt, dass bei der Silylierung unter basischen Be¬
dingungen eine Epimerisierung von Herqueinon {Y) zu enan-
tio-Isoherqueinon ((-)-2) auftritt (vgl. Kapitel 4.7) • Deswe¬
gen wurde nach der "normalen" Methode silyliert. Das chroma¬
tographisch gereinigte Gemisch aus (+)- und (-)-Isosilyläther
(39) wurde aus Aether umkristallisiert. Dabei bildeten sich
- 112 -
in einer ersten Fraktion tiefrote, stäbchenförmige Kristalle
mit einem Schmelzpunkt von 179-180 °C. Diese wurden für die
geplante Röntgenstrukturanalyse aufbewahrt. In einer zweiten
Fraktion erhielt man vermeintlich etwas weniger reine Kri¬
stalle vom Smp. 167-170 °C (IR, 1H-NMR identisch mit 1. Frak¬
tion) . Von einer Probe dieser zweiten Fraktion wurde die op¬
tische Drehung zu d25= +f,10° (° = 0,034, Chloroform) be¬
stimmt. In der Meinung, dass dann die Kristalle aus Fraktion
1 aufgrund ihrer grösseren Reinheit wohl noch höher drehen
müssten, wurden diese direkt für die Röntgenanalyse einge¬
setzt. Die kristallographischen Daten sind weiter unten fest¬
gehalten. Als dann die Analyse eindeutig auf ein Raceraat hin¬
wies, wurde auch die Drehung der für die Röntgenanalyse ein¬
gesetzten Kristalle bestimmt, wobei diese tatsächlich 0°
be¬
trug.
Zusammen mit der neu erworbenen Kenntnis, dass unter den ge¬
wählten Silylierbedingungen eine Epimerisierung von Herquei¬
non stattfindet, konnten obige Resultate nicht mehr erstau¬
nen. Aus dem wegen der Teilepimerisierung von Herqueinon {Y)
isolierten Iso- und enantio-Isoherqueinonsilyläthergemisch,
war beim Umkristallisieren offenbar zuerst ein echtes Racemat
ausgefallen. Als dann der Vorrat an künstlich erzeugtem
(-)-Isosilyläther ((-)-3j)) verbraucht war, blieb der Ueber-
schuss an "natürlichem" (+)-39 zurück, welcher in der zweiten
Fraktion enantiomerenrein aus der Mutterlauge auskristalli¬
sierte.
Die experimentellen Arbeiten sowie die Auswertung der Rönt¬
genanalyse wurden an unserer Abteilung von Herrn Dr. Schwei¬
zer in der Gruppe von Herrn Professor Dunitz durchgeführt.
Ihnen sei an dieser Stelle für die vorzügliche Zusammenarbeit
nochmals bestens gedankt.
- 113 -
Die Messungen wurden auf einem
4-Kreis-Diffraktoraeter durchgeführt.
CAD-4 Enraf-Nonius
Verwendete Methoden
MULTAN 80 (126)
Strukturaufklärung mittels
"Direct Methods":
Verfeinerung der Nicht-H-Zentren
mit anisotropen und der H-Atome
mit isotropen thermischen Parametern: SHELX 76 d2')
Verfeinerung mit modifizierten
experimentellen Gewichten *: X-RAY 72
(12°)
H lokalisiert aus 4F (Differenzen
FourierSynthese)
Kristallstrukturdaten
Bruttoformel:
Dichte dx (g/cm^);
Raumgruppe:
Z:
Zelldimensionen:
CpoHpoOfrSi
1,314
P1
2
a = 8,,645(2) 8
b = 9,,541(3)
c = 14,,156(3)
cr= 84,81(2)°
ö= 87,63(2)
V= 75,14(2)
Igem (e = 25°,MoK„, .1= 0,71069 8)
I * 3er (I):
R:
R : *
3939
2396
0,04
0,044
«~2(F) x exp (A x sin2(6)/12); A = 4 d29)
H22/1 -0,185(5)H22/2 -0,163(6)H22/3 -0,070(5)
H21/1 -0,110(4) 0,145(3) -0,465(2)H21/2 0,022(5) 0,190(4) -0,506(3)H21/3 -0,108(5) 0,309(4) -0,455(3)
H16 0,040(3) 0,472(3) -0,223(2)
H 3 0,310(3) -0,145(3) 0,058(2)
H04 0,648(4) -0,401(4) -0,101(2)
H06 0,646(4) 0,052(3) -0,423(2)
Sil
0,0382(1) 0,15118(9) -0,33296(6)ooooooo
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roro
ro
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rororo
CJCJCO
116
Bindungswinkel in Grad (Fortsetzung)
C12
C 8
CIO
C13
C19
C13
C13
C 6
C12
Cll
C 7
C 9
C14
C17
C12
C 2
C 5
Sil
0 2 109,5(2)0 5 120,1(2)C14 121,7(2)C 5 119,1(2)C16 111,1(2)0 1 125,1(2)C 3 119,6(2)C 4 119,5(2)C23 110,5(2)
C 5
C 9
C 9
Cll
C15
C12
C 3
Cll
C22
C 6
C 8
CIO
C17
C16
C13
C 4
C17
Sil
0 4
0 6
0 7
C16
0 1
C 2
0 3
Sil
0 2
120
121
123
99
107
124
120
136
108
,2(2),2(2),6(2),3(2),3(2),3(2),9(2),4(2),9(2)
Werte in Klammern: Standardabweichungen
o
Die Bindungslängen in A sind in der Figur unten eingetragen
1,501(4)
- 117 -
Stereobild von (*)-Isoherqueinon-trimethylsilyläther
Stereobild der Einheitszelle des racemischen Silylathers 39
- 118 -
ANHANG II
Zur Epimerisierbarkeit von Herqueinon
Wie in den Kapiteln 4.3 und 4.7 festgehalten wurde epimeri-
siert Herqueinon bereits unter sehr schwach basischen Bedin¬
gungen am tertiären Carbinolzentrum C-11. Das diastereomere
Isoherqueinon dagegen bleibt unter den gleichen Bedingungen
völlig stabil. Dies konnte durch basisches Behandeln eines
enantiomerenreinen Gemischs aus (+)-Herqueinon und (+)-Iso-
herqueinon nachgewiesen werden. Kochte man ein solches
56:44-Gemisch (Herqueinon im Ueberschuss) mit Kaliumcarbonat
in Aceton während einer halben Stunde unter Rückfluss, so
isolierte man ein Racemat von Isoherqueinon. Das Racemat fiel
allerdings erst nach einer Reinigung des Rohprodukts durch
Umkristallisieren an. Nach weiterem Einengen der Mutterlauge
erhielt man ein Produkt, welches im 60MHz-1H-NMR, IR und UV
mit der racemischen Erstfraktion übereinstimmte, aber im Ge¬
gensatz zu dieser einen negativen optischen Drehwert aufwies.
Dies bedeutet, dass es sich bei der zweiten Fraktion um ein
Gemisch von Isomeren mit einem Ueberschuss an (-)-Isoherquei-
non handelte. Dass man keine Spur von Herqueinon fand,
heisst, dass Isoherqueinon offenbar nicht zu Herqueinon zu-
rückisoraerisieren kann.
Bezüglich Stereochemie unterscheiden sich die beiden Metabo¬
liten nur durch die Lage der Methylgruppe am C-16. In Her¬
queinon steht diese syn zur epimerisierenden Hydroxygruppe,
während sie in Isoherqueinon entsprechend die anti-Lage ein¬
nimmt. Die Destabilisierung eines 1,3-syn-Methylcyclopenta-
nols gegenüber dem anti-Produkt wurde von Haber und Fuchs
(131)zu o,2 kcal/mol berechnet. Diese geringe Energiebarrie¬
re für sich allein betrachtet, führt nur zu einem ca. 8%-igen
Ueberschuss von enantio-Isoherqueinon gegenüber Herqueinon.
Auch wenn man den Wert von Fuchs und Haber nicht einfach auf
das vorliegende Problem übertragen darf, fehlen doch noch et¬
wa 2,5 kcal/mol, um das praktisch vollständig auf die enan-
- 119 -
tio-Isoherqueinon-Seite verschobene Gleichgewicht zu erklä¬
ren. Durch die Verknüpfung des Fünfrings an das quasi plana-
re, starre Phenalenongerüst müssen sehr viel stärkere Wech¬
selwirkungen auftreten, als dass dies im freien Fünfring der
Fall ist. Dies geht auch aus der Röntgenstrukturanalyse des
Isoherqueinonsilyläthers J9_ hervor. Dort sieht man, dass auch
wenn die Hydroxygruppe am C-11 anti-ständig zur Methylgruppe
C-15 steht, der 5-Ring immer noch stark von der OH-Gruppe
weggedreht ist.
Erstaunlich aber ist auch der Mechanismus, welcher der oben
beschriebenen Epimerisierung zugrunde liegen muss. Ueber mög¬
liche Reaktionswege haben sich in der Vergangenheit verschie¬
dene Autoren geäussert. 1970 schlugen Cason, Koch und Correia
(1'' einen Mechanismus vor, welcher die Ausbildung eines ter¬
tiären Carbanions beinhaltet (vgl. Schema 39) . 1972 k'riti-
sierten Brooks und Morrison CO) den Cason'schen Vorschlag
und betrachteten ihn als wenig plausibel.
Schema 39
- 120 -
Tatsachen, die gegen den Carbanion-Vorschlag sprechen, lie¬
ferte auch die vorliegende Arbeit. Das von Cason postulierte
Carbanion ist isoelektronisch mit einem tertiären Amin. Von
tertiären Aminen ist bekannt, dass sie im allgemeinen schon
bei Raumtemperatur rasch durchschwingen C32)_ Dasselbe darf
deshalb auch vom postulierten Carbanion angenommen werden.
Dieses Verhalten konnte aber durch die basische Epimerisie¬
rung eines nahezu 1:1-Gemischs von' ^c-markiertem Herqueinon
und Isoherquinon ausgeschlossen werden. Die zwei je an der
Methylgruppe C-18 gleich stark angereicherten Phenalenone er¬
gaben bei basischer Behandlung ein Racemat von Isoherqueinon,
in welchem die beiden diastereotopen Methylgruppen C-18 und
C-19 zu gleichen Teilen markiert waren. Bei raschem Invertie¬
ren eines als Zwischenstufe auftretenden Carbanions müsste
man eine andere Verteilung der Markierung erwarten. Das Sig¬
nal des ursprünglichen, während der basischen Behandlung sta¬
bilen (+)-Isoherqueinons müsste durch das "Flippen" der Mar¬
kierung durch das Epimerisieren von (+)-Herqueinon verstärkt
werden. Bei statistischer Verteilung der beiden Carbanionkon-
figurationen müsste man eine 75:25-Verteilung beobachten. Das
tatsächliche Auftreten einer 50:50-Verteilung spricht deshalb
gegen ein Carbanion als freie Zwischenstufe.
Brooks und Morrison CO postulierten einen alternativen Me¬
chanismus (vgl. Schema 40), welcher über einen 4-Ringäther
als Zwischenprodukt verläuft. Die beiden unterstützen ihren
Vorschlag durch die Existenz von Trimethylherqueinon B (129),
dessen Struktur analog demjenigen ihres postulierten Zwi¬
schenprodukts ist.
Die von Cason et al. C7)hergeleitete Struktur für Tri¬
methylherqueinon B (129) (siehe Abbildung 24) basiert aller¬
dings nur auf NMR- und MS-Interpretationen und wurde nie end¬
gültig bewiesen. Sie lässt denn auch einige Zweifel an ihrer
Richtigkeit offen.
- 121 -
Abbildung 24
OCH3
CH3OnAs^OCH3
XjQo
129
Schema 40
enant io-1 soherquei non
Die Bildung eines Vierrings in einem ersten Zwischenprodukt,
die Spaltung zu einer offenkettigen zweiten und das erneute
Schliessen eines Vierrings in einer dritten Zwischenstufe er¬
scheinen wegen des erheblichen Spannungsaufbaus unwahrschein¬
lich und erklären die ausserordentlich rasch und unter sehr
milden Bedingungen verlaufende Epimerisierung kaum.
Beide zitierten Varianten haben gemeinsam, dass sie von einer
Deprotonierung der tertiären Hydroxygruppe unter gleichzeiti¬
ger Bildung einer Carbonylfunktion am C-11 ausgehen. Dadurch
- 122 -
muss zwangsläufig eine der drei Ringbindungungen zum Zentrum
C-11 gebrochen werden. Dies bedeutet aber in jedem Fall eine
Spaltung des Herqueinongerüsts. Es sei hier deshalb noch eine
Möglichkeit vorgeschlagen, welche besagtes Gerüst intakt
lässt.
Bei den beiden Hydroxygruppen am C-6 und am C-8 handelt es
sich um Teile vinyloger Carbonsäurefunktionen, deren pK-Werte
zwischen 2,7 und 3,4 liegen. Bei basischer Behandlung von
Herqueinon sind dies zweifelsohne die ersten Stellen, an wel¬
chen eine Deprotonierung stattfindet. Die dazwischen liegende
Methoxyfunktion am C-7 erfährt durch die beiden benachbarten
negativen Ladungen verstärkte Donoreigenschaften, so dass es
zu einer trisvinylogen Elimination der Hydroxygruppe am C-11
kommen könnte (vgl. Schema 41). Das dabei entstehende Oxoni-
uraion wäre durch die beiden negativen Ladungen der benachbar¬
ten deprotonierten Hydroxygruppen recht gut stabilisiert. Oh¬
ne das Herqueinongerüst zu spalten, hätten wir das Zentrum
C-11 planarisiert, so dass durch Addition des Hydroxylanions
in anti-Stellung zur Methylgruppe C-15 die Epimerisierung be¬
endet wäre.
Eine weitere Möglichkeit eines Reaktionsmechanismus, bei wel¬
chem allerdings auch eine der drei Gerüstbindungen zum C-11
gebrochen wird, ist im Schema 42, Seite 123 dargestellt. Da¬
bei wird in einem ersten Schritt mit einem Hydroxyl-Anion am
Zentrum C-12 von Herqueinon angegriffen. Das dadurch gebilde¬
te Halbacetal deprotoniert unter gleichzeitiger Umlagerung
der C-12/C-11-Bindung. Dabei entsteht aus dem 6-Ring des Phe¬
nalenonkerns, welcher mit dem 5-Ring verknüpft ist, ein 9-
Ringlacton. Dieser grosse Ring ist nun befähigt in seiner
Konformation durchzuschwingen und so das Zentrum C-11 zu in¬
vertieren. Die vorher verlagerte Bindung schliesst erneut zum
5- und 6-Ring und unter Wasserabspaltung am Zentrum C-12 ge¬
langen wir zum gewünschten (-)-Isoherqueinon.
Durch Auffinden und Ausführen geeigneter Experimente wurde
versucht, einen der oben beschriebenen Mechanismen zu unter¬
mauern .
- 123 -
Schema 41
Unter der Annahme dass auch die entsprechenden Silyläther von
Herqueinon wie oben beschrieben isomerisieren, wurde, ausge¬
hend von einem reinen Silyläther, eine basische Behandlung
unter striktem Auschluss von Wasser durchgeführt. Eine Probe
von laut GC-Analyse zu mindestens 98$ diastereomerenremem
Herqueinontrimethylsilylather (3_8) wurde in absolutem Aceton
mit trockenem Kaliumcarbonat versetzt und unter Ruckfluss ge¬
kocht. Man entnahm der Reaktionslosung alle 30 Minuten eine
kleine Probe und untersuchte diese dunnschichtchromatogra-
phisch. Dabei wurde festgestellt, dass neben unverändertem
Herquemonsilylather auch ein polareres Produkt enstand, wel¬
ches mit zunehmender Reaktionsdauer immer starker auftrat.
Die Vermutung lag nahe, dass es sich dabei um desilyliertes
Produkt, also Herqueinon handelte. Dieser Nachweis ist aller¬
dings nicht leicht zu erbringen, da desilyierte Produkte gas¬
chromatographisch nicht erfassbar sind. Nach 6 Stunden Reak¬
tionszeit wurde trotzdem eine GC-Analyse durchgeführt. Dabei
hatte sich die Isosilylatherkomponente scheinbar von 2 auf
- 124 -
Schema 42
ca. 1% verstärkt. Beim Nachsilylieren dieser Probe zeigte
sich allerdings, dass das neue Gemisch im Gaschromatogramm
eine 87: 13-Verteilung zugunsten des Isoderivates aufwies. Die
basische Wiederbehandlung dieses Produkts führte dann zu ei¬
nem vollständigen Verschwinden der Herqueinonkomponente. Beim
Nachsilylieren des Gemischs erhielt man fast reinen enantio--
Isoherqueinonsilyläther (cp = 490°). Dies bedeutet, dass im
Reaktionsgemisch nach 6 Stunden nur mehr wenig Herqueinonsi-
lyläther vorhanden war, während der Isosilyläther praktisch
unverändert blieb. Beim Aufarbeiten des Gemischs war dann
- 125 -
enantio-Isoherqueinon entstanden, welches beim Silylieren zum
entsprechenden enantio-Isosilylather umgewandelt wurde. Die
oben beobachtete Zunahme wurde wahrscheinlich nur durch ein
rascheres Verschwinden von Herquemonsilylather vorgetauscht,
da dieser schneller zu spalten scheint als der entsprechende
Isosilyläther.
Beim fortgesetzten Kochen des ursprünglichen Edukts fand man
schliesslich keine Silyläther mehr. Ein Nachsilylieren dieses
Produktegemischs führte aber wieder zu Isosilyläther mit ei¬
ner optischen Drehung von nahezu 0°. Dies bedeutet, dass un¬
ter den drastischeren Reaktionsbedingungen schliesselich auch
der Isosilyläther gespalten wird. Die erhoffte Epimerisierung
unter Elimination der Silylätherfunktion und direkter Addi¬
tion des Silanolanions von der anderen Seite des Zentrums C-
11 war somit nicht eingetreten. Dies kann nun verschiedene
Ursachen haben: Eine erste wäre, dass der vorgeschlagene Weg
nicht zutrifft. Eine weitere wäre die ungenügende Nukleophi-
lie des ausgestossenen Silanolrests.
Um allenfalls doch noch einen direkten Wiedereintritt eines
möglicherweise gebildeten Nukleophils nachweisen zu können,
wurde in einem weiteren Versuch ein Silylathergemisch von
Herqueinon und Isoherqueinon statt mit Kaliumcarbonat in Ace¬
ton mit Natriummethanolat in Methanol behandelt. Dabei er¬
hoffte man sich die Bildung eines enantio-Isoherquemon-me-
thyläthers. Leider erwies sich das Phenalenongerust unter den
gewählten Bedingungen als nicht stabil und wurde zersetzt. Es
wurden deshalb keine weiteren Untersuchungen in dieser Rich¬
tung gemacht.
- 126 -
EXPERIMENTELLER TEIL
Allgemeine Bemerkungen
Smp : Die Schmelzpunkte wurden in zugeschmolzenen
und evakuierten Glaskapillaren mit einer Appara-
ratur nach Tottoli (Büchi 510) gemessen und
sind nicht korrigiert.
25[o]
n: Die optischen Drehungen wurden in einem Quarz¬
rohr von 1 dm Länge mit einem Polarimeter Per-
kin-Elmer 237 bei 25 C gemessen.
UV : Die Ultraviolett-Spektren wurden mit einem Per-
kin-Elmer spectrophotometer PE 402 im jeweils
angegebenen Lösungsmittel aufgenommen. Die Lage
der Absorptionsmaxima ist in nm angegeben; die
molaren Extinktionskoeffizienten werden direkt
folgend in Klammern in logarithmischer Form
aufgeführt.
Die Infrarot-Spektren wurden auf einem Perkin-
Elmer Spektrometer PE 257 aufgenommen. Wo nichts
anderes vermerkt ist, wurde Chloroform als Lö¬
sungsmittel verwendet. Die Werte sind in Wellen¬
zahlen [cm ] angegeben und die Intensitäten
der Banden werden mit (vs)= sehr stark, (s)=
stark, (m)= mittel und (w)= schwach bezeichnet.
Die Protonenresonanz-Spektren wurden auf den
Modellen Perkin-Elmer R 24B (60 MHz), Varian
EM-390 (90 MHz), Varian HA-100 (100 MHz) und
Bruker WM-300 (300 MHz) aufgenommen. Die Lage
der NMR-Signale ist in «-Einheiten (ppm), bezo¬
gen auf internes Tetramethylsi1 an ( s= 0 ppm)
angegeben.
IR
H-NMR
- 127 -
Im Falle von WM-300-Spektren wurde extern auf
ein H-Locksignal eingemessen und die s-Skala
auf einen Tetramethylsi1an-Wert von 6=0 ppm
normiert. Als Lösungsmittel diente - wo nichts
anderes vermerkt wird - Deuteriochloroform.
Für die Multiplizitäten der Signale werden fol¬
gende Abkürzungen verwendet: s= Singlett, d =
Dublett, t= Triplett, q = Quartett, m = Multiplett
und b = breit. Die Kopplungskonstanten J sind
in Hertz angegeben.
C-NMR : Die Kohlenstoff-13-Kernresonanz-Spektren wurden
auf einem Varian XL-100 (25 MHz) oder einem
Bruker WM-300 (75 MHz) Gerät aufgenommen. Es
wurden verschiedene neuere Messverfahren wie
zum Beispiel "Inversed Gated 2" angewandt. Falls
nichts anderes festgehalten wird, wurden die
Substanzen in Deuteriochloroform gemessen. Ange¬
geben wird die Lage der Signale in ppm (bezogen
auf das Signal von Tetramethyl si 1 an bei 8 = 0
ppm). Dahinter in Klammern stehen die Multipli-
zitäten, welche sich im tei1entkoppelten Spek¬
trum ergeben.
Die Massenspektren wurden auf einem Hit achi -
Perki n- Eimer Spektrometer RMU-6A mi t ei ner loni -
sierung senergie von 70 eV aufgenommen. Es si nd
die m/e -Werte der stärksten Si gnale j eder G ruppe
angegeben. In Klammern sind di e rel at i ven I nten-
sitäten in Prozenten bezügll i ch des Basi s peaks
(=100%) angegeben. Mit M wi rd das Signal1 des
Grundmo leküls bezeichnet.
H/ C : Die Radioaktivitätsmessungen erfolgten auf einem
Nuclear Chicago Seinti11ation Mark I Apparat1 37
mit internem Cs-Standard.
- 128 -
Die Messungen wurden mit Probenmengen von £0.2
mg, gelöst in 15 ml einer Standard-Scinti11ator-
lösung in Toluol, durchgeführt. Wegen der star¬
ken Farblöschung und teilweiser Fluoreszenz
der Proben, wurde meistens mit einem internen
1 4C-Standard verglichen. Die Messungen sind
bezüglich Uebersprechen, Löschung und Nullwert
korrigiert. Die Angaben erfolgen in ipm/mg (Im¬
pulse/Minute/Milligramm) oder ipm/umol (Impulse/
Mi nute/Mikromol). Der maximale Fehler beträgt
für einfach markierte Proben ±2% und für doppelt
markierte Proben +5%.
Die DUnnschichtchromatogramme wurden auf Kiesel¬
gel Fertigplatten MERCK 60 F„5. oder DC-Alufo-
lien Kieselgel MERCK 60 F.g. durchgeführt. Die
Flecken wurden - falls nicht farbig - unter
UV-Licht, mit Jod oder durch Besprühen mit kon¬
zentrierter Schwefelsäure und anschliessendem
Erhitzen sichtbar gemacht.
Die Säulenchromatografien wurden ausschliesslich
nach der neueren Methode *, der sogenannten
Flash-Chromatografie, durchgeführt. Dabei be¬
nützte man Kieselgel MERCK 60 (0.04-0.063 mm).
Angegeben sind jeweils Säulendurchmesser, Druck,
Elutionsmittel und Fraktionengrösse. Die Höhe
der verwendeten Kieselgelfüllung betrug - wo
nichts anderes vermerkt - durchwegs 25 cm. Ge¬
puffertes Kieselgel wurde wie folgt hergestellt:
Käufliches Kieselgel wurde mit fünfprozentiger
wässriger Natronlauge gewaschen und auf einer
Glasfi1ternutsche so trocken wie möglich abge-
ill, M. Kahn, A. Mitra; J. Org. Chem. 43, 2923 (1978)
- 129 -
saugt. Dann wurde mit Wasser neutral gewaschen.
Das gut trockengesaugte Kieselgel wurde an¬
schliessend in 0.1 molarer wässriger Zitronen¬
säure aufgeschlämmt und während 60 Sekunden
in ein Ultraschallbad eingetaucht. Nun wurde
erneut abfiltriert und danach am Hochvakuum
(ca. 10" torr) bei 80°C getrocknet.
GC : Die Gaschromatogramme wurden auf einem für
Kapillarsäulen umgebauten Modell Fractovap 2400
von Carlo Erba ausgeführt. Es wurden Kapillar¬
säulen SE-54, beschichtet und immobilisiert
nach Grob*, verwendet. Die Dimensionen werden
jeweils angegeben. Als Trägergas diente Wasser¬
stoff. Druck und Split sowie Injektor-, Detek¬
tor und Säulentemperatur werden angegeben. Die
Retentionszeiten tR, ,der Produkte n sind in Mi¬
nuten und Sekunden angegeben.
Lsm : Die Lösungsmittel waren grundsätzlich destil¬
liert. In den meisten Fällen wurden puriss. Qua¬
litäten der FLUKA AG verwendet.
Chem : Die Chemikalien wurden - falls nicht spezifi¬
ziert - in purum oder puriss. Qualitäten von
FLUKA AG bezogen.
*
K. Grob, G. Grob und K. Grob, Jr.,
J. Chromatog. 211, 243 (1981)
- 130 -
Isolierung von Atrovenetin aus P. Atrovenetum G. Smith, SM 683
Penicillium
atrovenetum
HCH3
Eine lyophilisierte Probe von P. Atrovenetum G. Smith, SM 638,
ATCC-13352* wurde mit 1 ml sterilem Wasser aufgelost und einen
Tag lang bei 24 C ruhen gelassen. Die so gebildete Suspension
wurde auf vier Malzagarrrohrchen verteilt und im Dunkeln bei
26°C inkubiert. Bereits nach vier Tagen hatte sich ein blau-
qruner Pilzrasen gebildet. Die Kulturen wurden wahrend fünf
Wochen zur Reife gebracht und dienten dann als Stammkiilturen
für alle weiteren Versuche.
12 reife Schragagarkulturen wurden mit sterilem Wasser ver¬
setzt, an der Oberflache gut mit einer Imnfose aufgekratzt und
die Sporensuspensionen auf Agarboden in vier 500ml-Erlenmeyer-
kolben als Impfmaterial verwendet. Diese "Grosskulturen" wuch¬
sen recht gut und wurden ihrerseits nach vier Wochen als Impf¬
material für Flussigkulturen gebraucht. Für die Flussigkultu¬
ren wurde ein Czapek-Dox-Medium nach folgendem Rezept herge¬
stellt:
Herstellung von Czapek-Dox-Losung
- 1000 ml Wasser
- 50,0 g Glucose
- 2,0 g NaN03- 1,0 g KH2P04- 0,5 g KCl
- 0,5 g MgS04-7H20- 0,01 g FeS04-7H?0
* ATCC: American Type Cul-
ture Collection Nr.13352
- 131 -
Die vier Agarkulturen wurden mit je 100 ml sterilem Wasser
versetzt und an der Oberfläche aufgekratzt. Von den so her¬
gestellten Sporensuspensionen wurden je 10 ml als Impflösung
benützt, um 40 Erl enmeyerkol ben, welche mit je 100 ml der
sterilen Czapek-Lösung gefüllt waren, zu anzuimpfen. Diese
Fl üssigkulturen wurden bei 24 °C unter Lichtausschiuss inku¬
biert. In den ersten Tagen verlief das Wachstum zufriedenstel¬
lend. Nach 7 Tagen trat allerdings ein Stillstand ein und
die Myceloberfläche blieb weiss, obschon sie laut Raistrick zu
diesem Zeitpunkt bereits blau-grün hätte gefärbt sein müssen.
Auch nach 24 Tagen war das Aussehen bei allen Kulturen anders
(3)als bei Raistrick beschrieben
.Trotzdem wurden 15 der Kul¬
turen geerntet. Das Mycel wurde abfiltriert, mit Wasser gewa¬
schen und in einer kleinen Weinpresse so trocken wie möglich
gepresst. Der "Mycelkuchen" wurde anschliessend in einem gros¬
sen Rundkolben bei 40-50 °C und unter Vakuum (20mm Hg) getrock¬
net, bis kein Kondenswasser mehr festgestellt werden konnte.
Danach wurde noch während 12 Stunden am Hochvakuum (10 mmHg)
weitergetrocknet. Der sehr spröde, harte Rückstand wurde in
einer Kugelmühle pulverisiert. Pro Kultur erhielt man durch¬
schnittlich 1,6 g Mycelpulver. Das Trockenpulver der 15 Kul¬
turen wurde in einer Soxhlet-Apparatur kontinuierlich mit Pen-
tan extrahiert, um die fettlöslichen Anteile zu entfernen.
Danach wurde mit Aether während 4 Tagen weiter extrahiert. Der
Pentanextrakt wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und ergab
ein braunes Oel,
welches verworfen wurde. Bei der Aetherex-
traktion wurde alle 12 Stunden die Aetherlösung gewechselt.(3)
Anders als bei Raistrick kam es nie zur Bildung eines
Festkörpers in den jeweiligen Extraktionslösungen. Beim Ein¬
dampfen der tiefgrünen Lösungen erhielt man insgesamt 211 mg
ockerbraunes Pulver. Nach den Aetherfraktionen wurden noch 4
Aceton-Fraktionen ä je 12 Stunden Laufdauer angesetzt. Aus
diesen konnten total 1,436 g dunkelbraunes, teils festes,
teils öliges Produkt gewonnen werden. Direkte Chromatographien
aller erhaltenen Fraktionen auf Kieselgel führte in keinem der
Fälle zum Erfolg. Auch die Acetylierung mit Acetanhydrid und
- 132 -
Pyridin führten zu keinen identifizierbaren Produkten. Da
bei Raistrick das Produkt ziemlich rein aus den Extraktions¬
lösungen ausgefallen war und dann durch einfache Umkristalli¬
sation gereinigt werden konnte, wurde mit den vorliegenden
Gemischen nicht weiter gearbeitet. Statt dessen wurden neue
Flüssigkulturen angesetzt und in einer Reihenuntersuchung ver¬
schiedene Parameter während des Wachstums verändert. Die ver¬
schiedenen Bedingungen und die Resultate sind in Tabelle 1
(siehe unten) angegeben. Von den 6 angesetzten Kulturen wurden
nur die Nummern 2 und 6 als einigermassen aussichtsreiche Kan¬
didaten aufgearbeitet. Die geernteten Mycelien wurden verei¬
nigt und wie oben beschrieben weiterverarbeitet. Man erhielt
aus den Aetherfraktionen insgesamt 27 mg ockergelbes Pulver.
19 mg davon wurden bei 190-198 °C am Hochvakuum (10 mm Hg)
sublimiert. Man erhielt 15,8 mg gelb-oranges Produkt vom Smp.
280-282 °C (Zersetzung). Dieses wurde in der Drybox einmal aus
Aceton umkristallisiert. Die Ausbeute an gelben Kristallen
betrug dabei 11 mg. Dieses Produkt wurde für Analysezwecke
eingesetzt und wies die untenstehenden Daten auf.
Atroveneti n
C19H18°6Aussehen
Smp
UV/VIS
]H-NMR
(80 MHz)
DMSO-d,
MG: 342
senfgelbes kristallines Pulver
280-282 °C (Zersetzung)
(EtOH, c = 0,034)
222 ( 4, 61 );235(Schulter,4,37);250 (rel .Min. 4,28);258(4,31 ); 283 (3,99);313(Min.);370(4,12);430(4,22)
1,26 (s,3H) und 1,50 (s,3H) HgC(18) und H3C(19)1,43 (d,J=7 Hz, 3H) H3C(15); 2,75 (s,3H) H3C0-C(7)4,65 (q, J=7 Hz, 1H) H-C(16); 6,80 (bs, 1H) H-C(3)
8-14,5 (4H) H0-CU), H0-C(7), H0-C(8), H0-C(10).
Das Signal der Methylgruppe H,C(1) liegt unter
dem Signal von DMS0 versteckt.
C,H-An : berechnet: C: 66,66 H: 5,30
gefunden : C: 66,72 H: 5,38
- 133 -
Schuttel-Kultur+
CSL
6
Erbsengrosse, weisseKugeln.
Am
Rand
leicht
braun
verfärbt.Wie
am
3.
Tag.
Mycelkugelchen sehenaus
wie
"Morgensterne". Nährlösungdun¬
kelgelb.Sonstwie
am
5.
Tag.
Leichte
grau
gefärbt. Mycelkugelnund
Nährlösungdunkel
und
grungrauver¬
färbt.
OrangeAb¬
lagerungen.
Nährlösungfast
schwarz.Am
Rand
graueund
gelbe
Zonenam
Rand.
Am
14.
Tag
geern¬
tet
und
aufge¬
arbeitet.
Stand-Kultur belüftet+
CSL
5
wie
Kultur4
aber
blaugrune Oberflachemit
gelberTonung.
Wenig
weiterent¬wickelt.Blau¬
färbungetwas
verstärkt Nährlösungdun¬
kelgelb.Ober-
flacheleichtge¬
faltet,ziem¬
lich
grün. Nährlösungdün¬
ke
lorangebis
braun.Ober-
flachestark
gefaltet. Stark
ausge¬trocknet.Tiefe
Falten. Ab
12.
Tag
ohne
Belüftung.
Stand-Kultur normal+
CSL
4
sehr
homogenerweisser
Pelz
mit
gelblichemRand. Fast
gleichwie
am
3.
Tag.
GlatteOber-
flache. Wie
am
5.
Tag.
Oberflacheet¬
was
dichter.Keine
Faltung.Mycel
weiss.Wie
am
7.
Tag.
Oberflachenoch
immer
glatt.Leichtgrau¬
licherTon.
Wie
am
10.
Tag.
Oberflachenoch
immer
glatt.Keine
Verände¬rung
gegenüber10.
Tag.
Schuttel-Kultur normal
3
griessformige weisseKulturmit
dunkelbraunem Rand. Wie
am
3.
Tag.
Losungdunkler.
Unverändertwie
am
3.
Tag.
Ei¬
nige
grünlicheZonen. Mycel
graugrün.Am
Rand
dunkel¬gelbeund
grüne
Ablagerungenam
Rand. GraugrüneVer¬
färbungder
Oberflache.Ab
12.
Tag
ohne
Schuttein.
Stand-Kultur belüftet
2
wie
Kultur2
mit
zusatzlicher Blaufärbungder
Oberflache. Nährlösung braunlich-gelb. Oberflacheblau¬
grun. Nährlösungbraun
Oberflachesehr
stark
gefaltet.Blaugrunver¬
färbt. Stark
gefalteteOberflache. Blaugrun
mit
gelbenZonen.
Sehr
starkge¬
falteteOber¬
flache.Nähr¬
lösungorange.
Vom
12.
Tag
an
ohne
Belüftung.
Stand-Kultur normal
1
Oberflachemit
Locherndurch¬
setzt.Rand
leichtgelb.
Nährlösungzi¬
tronengelb,
mit
homogener,ge¬
falteterOber-
flache. Nährlösungdun¬
kelgelb.Ober¬
flachewenigge¬
faltet.Bläu¬
lich
verfärbt. Nährlösungist
braun.Ober-
flacheleicht
gefaltet.Wird
langsamgrün.
Nährlösungnoch
dunkler.Ober¬
flache.Grau.
Ganz
grau.
TagCO tn C- o
r-\
CMr-i
rH
CM
- 134 -
Züchtung von Penicillium Herquei Bainier & Sartory S.M.138
und Isolierung von rohem Herqueinon/Isoherqueinon-Gemiseh U+2)
Eine Schrägagarkultur von Penicillium Herquei Bainier & Sar¬
tory S.M. 138 (IMI-89376*) wurde auf PDA-Nährmedium (ATCC-
Medium 336**) vermehrt.
PDA-Nährmedi um
- 300 g Kartoffeln
15 g Agar-Agar
20 g Glucose
- 1000 ml desti11iertes Wasser
Die feingewürfelten Kartoffeln wurden in 500 ml destilliertem
Wasser weich gekocht. Der entstandene Brei wurde durch ein
Tuch aus Leinen filtriert. Das Filtrat wurde mit destilliertem
Wasser auf 1000 ml aufgefüllt, erhitzt und unter Rühren mit
dem Agar-Pulver versetzt. Zum Schluss gab man die Glucose zu.
Die heisse, klebrige Masse wurde in Portionen von je 8 ml auf
ca. 125 Reagenzgläser (130 x 14 mm) verteilt. Die Röhrchen
wurden mit vorgefertigten Wattepfropfen verschlossen und im
Autoklaven während 25 Minuten bei 120°C und -1 bis +1 bar
steri1i siert.
* IMI:Imperial Mycological Institute, heute CMI:Commonwealth...Kew,England** ATCC: American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA
- 135 -
Die Stammkultur wurde nun mit 10 ml sterilem Wasser versetzt
und an der Oberflache mit einer Impfose aufgekratzt. Die so
entstandene Sporensuspension wurde zu je 5 Tropfen mit einer
Pipette auf 20 sterile PDA-Rohrchen verteilt Die mit Watte
verschlossenen, fl achllegenden Rohrchen wurden bei 24 C im
Dunkeln wahrend 5 bis 6 Wochen zum Reifen gebracht. Diese
nun Sporen tragenden Kulturen wurden entweder sofort als
Impfmaterial für Flussigkulturen verwendet oder bei -30 Cge-
1agert.
Die präparative Züchtung erfolgte in steriler Raulm-Thom-
Losung in sogenannten Standkulturen.
Raulin-Thom-Losung
75,00 g Glucose (Dextropur, MIGR0S)
4,00 g L-( + )-Wemsaure (FLUKA puriss.)
4,00 g Di-ammomumtartrat (FLUKA purum)
0,60 g Di-ammomumhydrogenphosphat (MERCK p.a.)
0,25 g Ammoniumsulfat (MERCK p.a.)
0,60 g Kailumcarbonat
1,20 g Magnesiumsulfat-7 H„0
0,07 g Eisen-(II)-sulfat-7 H200,07 g Zinksulfat-7 HjO
- 1500 ml bidesti11lertes Wasser
Diese Nährlösung wurde zu je 150 ml auf 500 -ml-Erlenmeyerkol-
ben verteilt. Die gefüllten Kolben wurden mit Watte und Alu¬
folie verschlossen, im Autoklaven wahrend 25 Minuten bei 120
bis 125 C und alternierend -1 bis +1 bar Dampfdruck sterili¬
siert und dann uberimpft.
20 Rohrchen mit reifen Kulturen wurden mit je 10 ml steriler
Raulin-Thom-Losung gefüllt, an der Oberflache vorsichtig auf¬
gekratzt und die entstandenen Sporensuspensionen in einem
Erlenmeyerkolben vereinigt. Von diesem Inoculum gab man nun
je 10 m1 zu 20 der mit steriler Nährlösung gefüllten Kolben.
* Originallosung [3] 0,40 g Magnesiumcarbonat.
- 136 -
Danach liess man die so geimpften Kulturen während 21 Tagen
im Dunkeln bei 24 C wachsen. Am Ende der Inkubationszeit wurde
das braunrote, die ganze Oberfläche bedeckende Mycel von der
tiefgelben Nährlösung abfiltriert. Nach gründlichem Waschen
mit Wasser wurden die vereinigten Filterrückstände auf einer
kleinen Weinpresse so trocken wie möglich gepresst und dann
in einem grossen Rundkolben bei 45 bis 50 C und 10 torr
getrocknet. Pro Liter Nährlösung konnten im Durchschnitt 13 g
Trockenmaterie geerntet werden. Das getrocknete Mycel wurde
in einer Kugelmühle pulverisiert und das braunrote Pulver
in 2 1 Chloroform suspendiert. Dieses Gemisch wurde über Nacht
bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre stehen gelassen.
Dabei hatte sich bereits etwas rotes Rohprodukt abgeschieden.
Die gefilterte Chloroformlösung wurde auf ca. 50 ml eingeengt
und im Kühlschrank (ca. 3 C) ein paar Stunden abgekühlt. Der
erneut ausgefallene rote Festkörper wurde zum erstabgeschiede¬
nen Produkt gegeben. Dieses Rohprodukt wurde mit 10 ml Hexan
gewaschen und getrocknet. Die verbleibende Mutterlauge wurde
nochmals auf ca. 10 ml eingedampft und abgekühlt. Dabei bilde¬
te sich eine dritte Fraktion roter Festkörper. Alle Fraktionen
hatten einen Schmelzpunkt zwischen 214 und 219 °C und wurden
deshalb vereinigt. Aus 1500 ml Kulturlösung gewann man so
1,059 g rohes Herqueinon/Isoherqueinon-Gemiseh (1+2),
dessen
Reinheit für die meisten Zwecke der Weiterverarbeitung genügte.
Für analytische Zwecke konnte durch mehrmaliges Umkristalli¬
sieren aus Chloroform ein reines Präparat, allerdings unter
grossen Verlusten, gewonnen werden.
Herquei non/Isoherqueinon-Gemi seh (1+2)
C20H20°7 MG: 372'38
Aussehen: kupferrote, bis 5 mm lange, haarfeine Nadeln
Smp : 222-224 °C (Zersetzung)
- 137 -
IR : (CHC1-, Gemisch Herqueinon/Isoherqueinon)
3680,3550,3300-31 00(w);3005,2980,2940(m);2875,2840,
2740(w);1630,1625(vs); 1610,1560,1552,1548,1515,1470
1450,1435(m);1392(s);1380(m);l365,1350(s); 1325,1310
1295 J 180 J 140 J 130(m);1095'(w); 1050,1025,1015 (m);
995 (w) -,955,910,880,870,845,825 (m);610(w).
UV/VIS : (CHC1,, Gemisch Herqueinon/Isoherqueinon)
260(4,15);322(4,43);350(Schulter;3,79);448(3,54)
Herqueinon in Gegenwart von Isoherqueinon
1,05 (s,3H) H3C(19); 1,57 (s,3H) HgCt 18); 1,70 (d,
J=7,0 Hz,3H) H3C(15); 2,45 (d,J=l,0 Hz,3 H) H3C(1);3,85 (s,3H) H3C0-C(7); 4,70 (q,J=7,0Hz,1H) H-C(16);
5,37 (s.lH) HO-C(ll); 5,99 (q,J=l,0 Hz, 1H) H-C(3);
13,12 (s,lH) und 14,77 (s,lH) H0-C(6) und H0-C(8).
Zuteilung einiger Signale mit Hilfe der Integrale.
Isoherqueinon in Gegenwart von Herqueinon
0,85 (s,3H) H3C(19); 1,41 (d,J=7,0 Hz, 3H) H3C(15);1,47 (s,3H) H3C(18); 2,43 (d, J=l,0 Hz, 3H) H3C(1);3,85 (s,3H) H3C0-C(7); 5,10(q,J=7,0 Hz.lH) H-C(16);
5,30 (s.lH) HO-C(11); 6,01 (q,J=l,0 Hz, 1H) H-C(3);
13,21 (s.lH) und 14,76 (s,lH) H0-C(6) und H0-C(8).
Zuteilung nach Abzug der Herqueinonsignale.
MS : Gemisch Herqueinon und Isoherqueinon
372( M+ = H>0%), 356(27), 341(47), 329(33), 311(12), 302
(12),286(13),274(47),259(25),246(32),203(13),174(7)
163(5),157(6),149(10),114(7),97(45),69(30),55(19) ,
41(26),29(6),18(3),15(2).
C,H-An'
: berechnet: C: 64,51 H: 5,31
r. r. -.„ ,, ,-„,-• (im Gemisch)gefunden: C: 64,39 H: 5,35
D£ : Rf= 0,20 Hexan:Essigester = 2 :1 (leichte Zersetzung)
'H-NMR
(300 MHz)
- 138
Isolierung von rohem Norherqueinon/Norisoherqueinon-Gemiseh 7+11
CH3O-^CH
Norherqueinon 7
CH3CH3
3
'3 ö-
CH3
Non soherquei non 11
Das bei der Extraktion von Herqueinon und Isoherqueinon mit
Chloroform verbleibende Mycel wurde in einer Soxhlet-Apparatur
mit Aether kontinuierlich weiterextrahiert. Schon nach wenigen
Stunden setzte sich an den Wänden des Auffanggefasses ein
oranger Festkörper ab. Jeden Abend wurde der Destillationskol¬
ben durch ein neues Gefass mit frischem Aether ersetzt. Es
wurde solange extrahiert, bis die Extraktionslosung farblos
war. Eine solche Extraktion dauerte mehrere Tage.
Die "Tagesfraktionen" wurden jeweils am Rotationsverdampfer-2
eingeengt und anschliessend am Hochvakuum bei 10 torr ge¬
trocknet. Beim Trocknen wurde das orange Gemisch zusehends
dunkler und schliesslich braun.
Für analytische Zwecke wurde eine Probe wie folgt gereinigt:
1 g rohes Extraktionsgemiseh wurde in 250 ml absolutem Aethyl-
alkohol wahrend 10 Minuten aufgekocht. Die heisse Losung wurde
filtriert und der unlösliche Ruckstand (65 mg) in 65 ml Eis¬
essig heiss gelost. Die heisse Essigsaurelosung wurde nochmals
filtriert. Die geringe Menge Ruckstand wurde verworfen. Die
nun klare, dunkelrote Losung wurde auf ca. 25 ml eingeengt.
Diese übersättigte Losung wurde zuerst auf Raumtemperatur ab¬
gekühlt und dann im Kühlschrank bei 5 C zur Kristallisation
gebracht. Daraus konnten 24 mg (2,4% bezüglich Rohextrakt)
- 139 -
Norherqueinon/Norisoherqueinon vom Smp. 266-267 C gewonnen
werden.
Einengen der Aethanolmutterläuge ergab eine 2. und nochmaliges
Einengen eine 3. Fraktion. Die 2. Fraktion ergab 103 mg roten
Festkörper vom Smp. 265-266 C und die 3. Fraktion lieferte
219 mg rotes Produkt vom Smp. 246-248 C. Durch Eindampfen der
verbliebenen Mutterlauge bis fast zur Trockene konnten noch¬
mals 130 mg rotes Kristallisat vom Smp. 276-278 C gewonnen
werden. Dieses letzte Produkt wurde dann genauer untersucht.
Norherqueinon/Norisoherqueinon-Gemiseh
MG: 358,35C19H18°7
Aussehen dunkelrote, feine, bis 1 mm lange Nadeln; verfärben
sich nach längerem Stehenlassen am Tageslicht dun¬
kelbraun.
Smp : 276-278 C
IR : (KBr, Gemisch Norherqueinon/Norisoherqueinon )
3420,3260,2980,2935(m);2890,2710,1755,1715(w);1640
1630(vs );1600(s);1555(m);1525(s);1480,1475(m);1435
(s);1405(m);1385,1365,1350,1330,1295(s);1270,1240,
1210,1175,1140(m);1115(s);l100,1045,1020,1005,995
(m);960,940(w);915,895,870(m);855(s);815(m);790,785
750,715,695,675(w);610,575(m);555,540(w)
UV/VIS : (Aceton, Gemisch Norherqueinon/Norisoherqueinon)
336(3,84);350(3,72);432(3,64)
H-NMR : (DMS0-dc, 80%-Komponente in Gegenwart von 20%-Kompo-b
(300 MHz) nente)
0,774 (s,3H) und 1,316 (s, 3H) HgC«18) und H3C(19);1,360 (d,J = 6,6 Hz,3H) H3C(15); 2,462 (d,J = l,1 Hz,3H)
H3C(1); 4,948 (q,J = 6,6 Hz, 1H) H-CU6); 6,303 (q, J =
1,1 Hz,lH) H-C(3); 7,401 (s,lH) H0-C(11); 8,900 (bs
1H) H0-C(7); 13,064 und 15,275 (s, 1 H) H0-C(6) und
H0-C(8).
- 140 -
H-NMR : (DMSO-dg, 20%-Komponente in Gegenwart von 80%-Kompo-
(300 MHz) nente)
0,971 (s,3H) und 1,370 (s, 3H) H3C(18) und H3C(19);1,540 (d,J=6,7 Hz,3H) H3C(15); 2,484 (d,J=l,0Hz,3H)
H3C(1); 4,805 (q,J=6,7 Hz, 1H) H-C(16); 6,303 (q,J=
1,0 Hz.lH) H-C(3); 7,393 (s,lH) HO-C(11); 8,908 (bs
1H) H0-C(7); 13,062 (s,lH) und 15,271 (s , 1H) H0-Ö6)
und H0-C(8).
MS : Gemisch Norherqueinon und Norisoherqueinon
358(M* = U),356(1,7),344(1,7),342(40,21,327(100), 326
(5,1),313(9,8),309(9,4),299(11,2),283(6,3),271(3,1)
257 (3,4), 253(1, 7 ),243( 1,5), 237 (2,2), 223(1, 5), 21 3(1,5)
197 (1,7), 181 (2, 3), 171 (6, 2),'168(1,9), 163(6,9), 156(18/»
152 (5, 2), 149 (3,0), 139 (4,4), 133 (1,8), 128(4,0), 121 (2,7)
115(5,3),107(1,5),102(2,0),91(2,5),84(3,7), 76(2,7)
69(2,1),63(3,1),55(2,9),51(2,5),43(8,9),41(6,0), 39
(4,5), 28(6,3), 18(1,7).
C,H-An : berechnet: C: 63,68 H: 5,06
, .r c-> r-i ii / nn
(im Gemisch)gefunden: C: 63,57 H: 4,90
DC : R,= 0,01 Hexan-.Essigester = 2:1 (rasche Grünfärbung)
- 141 -
Versuchte Acetylierung eines Herqueinon/Isoherqueinon-Gemischs
OCH;
1 Herq.: R = CH,
R = H
2 Isoh.: R = H, R = CH
Acetylierungsprodukte
372 mq (1,0 mmol) Herqueinon/Isoherqueinon-Gemiseh (1+2) wurden
unter Stickstoffatmosphäre in 5 ml Methylenchlorid suspendiert
und anschliessend mit 600 mg (4,9 mmol) 4-N,N-Dimethylamino-
pyridin versetzt. Bei Zugabe der Base ging das Edukt rasch in
Lösung. Unter Rühren verdünnte man die dunkelrote Lösung mit
weiteren 5 ml Methylenchlorid und injizierte dann 500 1 (5,3
mmol) Acetanhydrid. Dieses Gemisch wurde anschliessend während
20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dann gab man 10 ml Me¬
thanol zu und engte am Rotationsverdampfer bis zur Trockene
ein. Der Rückstand wurde mit 15 ml Aether und 35 ml Tetrahydro-
furan gelöst und zuerst mit 50 ml 2 N Salzsäure und anschlies¬
send mit 50 ml gesättigter Natriumbicarbonatlösung ausgeschüt¬
telt. Nach zweimaligem Waschen mit Wasser wurde die organische
Phase über Magnesiumsulphat getrocknet und eingedampft. Dabei
bildete sich ein teilweise kristalliner,rotbrauner Rückstand.
Die Ausbeute betrug, bezogen auf ein mögliches Triacetat,61 %.
Dieses Rohprodukt wurde aus Essigester/Hexan umkristallisiert.
Dabei bildeten sich sehr feine orange Kristalle vom Smp. 130-
132 °C mit leichtem Sintern ab 110 °C.
Das 60 MHz H-NMR-Spektrum dieses umkristallisierten Produkts
zeigte ein nicht interpretierbares, sehr uneinheitliches Bild.
- 142 -
Eine weitere Reinigung wurde durch Flash-Chromatografie ver¬
sucht: Durchmesser Säule: 1 cm; pN_ : 0,35 bar; Laufmittel:
Hexan:Essigester=2:1; Fraktionengrösse: 1-2: 15ml, 3-12: 5ml,
13-18: 15ml.
Die Fraktionen 5-10 zeigten ein dünnschichtchromatografiseh
einheitliches Produkt mit Rr= 0,20 , Hexan:Essigester = 2:1.
1f
Das 60 MHz H-NMR-Spektrum zeigte aber auch hier wieder ein
Gemisch mehrerer Substanzen (Minimum 4) an. Aus diesem Grund
wurden die Untersuchungen hier abgebrochen.
- 143 -
Silylierung von Herqueinon/Isoherqueinon (1+2) unter teilweiser
Epimerisierung von Herqueinon (l)
OCH OCH,
w : R und S-Konfigu-
ration
SKCH3)3
Herqueinon/Isoherqueinon Herqueinon-, I soherqueinon-
und enantio-Isoherqueinon-
trimethylsilyläther
Herq.: R^ CH3>R2= H
Isoh.: R = H,R = CH
In einem 25ml-2-Halskolben, ausgestattet mit 2-Halsaufsatz
und RUckflusskühler, wurden unter Stickstoffatmosphäre 207 mg
(0,556 mmol) Herqueinon/Isoherqueinon-Gemiseh <1+2J vorgelegt.
Durch einen Sievenstopfen spritzte man 2 ml N,N-Dimethylform-
amid zu, was zu einer tieforangen Lösung führte. Im Stickstoff¬
gegenstrom gab man 379 mg (5,56 mmol; 10 Aeq.) Imidazol zu.
Das Gemisch wurde während 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Durch die Serumkappe spritzte man anschliessend 352 n 1 (2,78
mmol; 5 Aeq.) Trimethylsilylchl orid (TMSC1) hinzu. Bei der
Zugabe von TMSC1 bildete sich über der Reaktionsmischung augen¬
blicklich ein feiner weisser Nebel. Mit zunehmender Reaktions¬
dauer wurde die Reaktionslösung dunkler. Nach zweistündigem
Rühren bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch auf 50 g
Eis und 10 ml 5-prozentiger Schwefelsäure gegossen. Die saure,
wässrige Phase wurde zweimal mit je 100 ml Aether extrahiert.
Die nun farblose Wasserphase wurde verworfen. Die vereinigten
Aetherphasen wurden dreimal mit je 75 ml Wasser und einmal mit
50 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Dann wurde
die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet und am
- 144 -
Rotationsverdampfer (Wasserstrahlvakuum, 50 C Badtemperatur)
eingeengt. Als Rohprodukt wurde ein tiefroter, teils zähflüs¬
siger, teils schaumiger Rückstand gewonnen. Dieser wurde am
Hochvakuum (5-10 torr) bei 50 C 12 Stunden lang getrocknet.
Rohausbeute: 242 mg (98%)
Dieses Rohgemisch wurde säulenehromatografiert: Säulen-0: 2,0
cm; Druck: 0,25 bar; Laufmittel: Hexan/Essigester = 5:1; Frak-
ti onengrösse: 10ml.
u- raktionen Nr. Ausbeute Produkte
0-14 --
15-17 63 mg Isoherquei nonsi lyl äther (3?)
18-21 115 mg Mischfraktionen (38) und (3?)
22-32 44 mg Herqueinonsi lyläther (38)
15-32 222 mg 90% bezüglich Rohgemisch
Herqueinontrimethylsilyläther (38)
C23H28°7Si MG: 444'55
Aussehen
Smp
IR
UV/VIS
]H-NMR
(300 MHz]
tiefrote, harzige, nach einiger Zeit glasige Masse
nicht kristallin
(CHC13)3690(w);3005,2960,2940(m);2880,1670,1655(w);1630(vs)
1605( s ) ;1565,1555,1525,1510,1470,1435(m)-,1395,1380,
1365,1355(s); 1330,1290,1255,1180,1145(m) ;1130(s);
1120,1100,1090,1045,1035(m); 1020(w); 1000,965,955,
945,915,880(m);870,845(s).
(Chloroform, 261(4,11);322(4,48);350(3,86);450(3,54)
-0,099 (s,9H) (CH )3S10-C(11); 1,006 (s,3H) H3C(19)l,432(s,3H) H3C(18); 1,583 (d,J=7,0 Hz,3H) H3C(15);2,503 (d,J=l,2Hz,3H) H3C(1); 3,949 (s,3H) H3C0-C(7)4,627 (q,J=7,0Hz,lH) H-C(16); 6,290 (q,J=l,2 Hz.lH)
- 145 -
: H-C(3); 13,275 (s,lH) und 15,381 (s,lH) H0-C(6) und
H0-C(8).
13C-NMR : o,711 (q, (CH3>3SiO-); 16,167 (q, C-18); 18,623 (q,
(75MHz) C-15); 23,924 (q, C-19); 24,224 (q, C-1); 44,472
(s, C-17); 60,586 (q, HjCO-); 80,385 (s, C-11);
95,810(d, C-16); 103,777 (s); 104,556 (s); 109,858
(s); 124,235 (d, C-3); 132,143 (s); 138,672 (s);
149,874 (s); 162,454 (s); 163,772 (s); 175,753 (s);
187,165 (s); 195,911 (s).
Mj> : 444(M+=56%),429(6),411(3),401(16),397(1),386(3),383
(3),373(15),361(9),355(8),346(23), 339(9), 331(18),
327(8),321(2),311(8),302(3),297(6), 288(4), 285(4),
273(10),269(6),265(1),259(4),255(2),251(2), 245(3),
241(3),237(1),232(3),229(2),225(2), 217(2), 213(2),
202(4),193(2),185(2),181(1),174(3), 171(4), 169(2),
165(3),155(2),152(3),147(6),141(4), 139(3), 131(2),
128(4),115(5),102(2),97(14),89(3),83(4), 75(30) ,73
(100),69(14),59(5),55(18),47(6),45(15),43(11),41(20)
39(5),29(6),18(4).
C,H-An : berechnet: C: 62,14 H: 6,35
gefunden: C: 62,05 H: 6,20
DC. : R,= 0,18 Hexan:Essigester = 5:1
GC : SE-54 4 %. 21m-0, 35mm; Inj./Det.Temp.=275°C; Säulen-
temp.=240°C; tR= 7'55"
[c.]^5 : +651° (CHC13, c= 0,095)
Isoherqueinontrimethyl silyläther (39)~*
C23H28°7Si MG: 444,56
Aussehen : rubinrote, klare Kristalle in Quaderform
Smp : 179-181°C
TJR : (CHClj)3680(w);3000,2975,2940(m);2840(w);1660(m);1635(vs);
- 146 -
1630(vs);1605(s);1565,l560,1530,1525,1510(m); 1470,
1 460,1450(s); 1435,1 420(m); 1 390( s ); 1 380(m)-, 1 360( vs );
1330,1295,1265(m);1255,1245(s); 1175,1140(m); 1130,
1090,1055(m);1035(s); 1015,1000,960,910,880(m); 870
845(s);665,605(w).
UV/VIS : (Chloroform, 261(4,07);323(4,51);347(3,88);448(3,57)
VnMR : -0,091 (s,9H) ( CH3> 3Si 0-C (11 ); 0,823 (s,3H) H3C(19)(300 MHz) 1,360 (s,3H) H3C(18); 1,388 (d,J-6,7 Hz,3H) H3C(15)
2,477(d,J=l,2 Hz,3H) H3C(1); 3,950 (s,3H) H3C0-C(7)4,890 (q,J=6,7Hz,lH) H-C(16); 6,293 (q,J=l,2 Hz,lH)
H-C(3); 13,332(s, 1H) und 15,344(s, 1H) H0-C(6) und
H0-C(8).
13C-NMR : 0,620 (q, (CH^SiO-); 13,003 (q, C-15); 15,502 (q,
(75MHz) C-19); 16,222 (q, C-18); 24,075 (q, C-1); 47,752
(s, C-17); 60,478 (q, H3C0-); 80,201 (s, C-11);
89,973 (d, C-16); 104,076 (s); 104,168 (s); 109,863
(s); 124,276 (d, C-3); 132,082 (s); 138,660 (s);
149,590 (s); 162,371 (s); 163,712 (s); 175,048 (s),
187,170 (s); 196,542 (s).
MS : 444(M+=2M>,429(11),411(4),401(33), 386(6), 383(4),
373(29), 361(11),359(7),355(10),345(30 ) ,339(14) ,327
(10),317(6),311U0),302(3),297(7),288(4),283(4),273
(6),269(6),259(3),251(1),241(2),232(2),202(2),193(2)
171(2),149(2),141(2),128(2),115(2),97(10),83(2),73
(52),69(7),55(5),45(6),41(7),28(3),18(1).
C,H-An : berechnet: C: 62,14 H: 6,29
gefunden: C: 62,17 H: 6,21
DC : Rf= 0,21 Hexan:Essigester = 5:1
G£ : SE-54 4 %< 21m-0,35mm; Inj./Det.Temp.=275°C; Säulen-
temp.= 240°C; t = 7'15"
[a]p5 : +467° (CHC13, c= 0,0850)
- 147 -
Versuchte Herstellung der Herqueinon/Isoherqueinon-tert.-butyl-
dimethylsilyläther (140)und (141)
Herq. : Rj = CHg, R2= H Herq. : Rj= CH3> R^ H
Isoh. : R = H, R = CH Isoh. : R = H, R = CH
100 mg (0,27 mmol) Herqueinon/Isoherqueinon-Gemiseh (1+2) wurden
in einem 25ml-2-Halskolben, versehen mit Rückflusskühler, Mag-
netrührer und Schrei beraufsatz*, in 2 ml N,N-Dimethylformamid
(DMF) gelöst. Die Apparatur wurde zuvor mit Stickstoff gespült
Im Stickstoffgegenstrom gab man 40 mg (0,59 mmol; 2,2 Aeq.)
Imidazol zu. Nach einer Rührzeit von 5 Minuten spritzte man
durch eine Serumkappe eine Lösung von 45 mg (0,296 mmol; 1,1
Aeq.) tert.-Butyl-dimethylsilylchlorid (TBDMSCl) in 1 ml DMF
zu. Nach zehnminütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde der
Reaktionsverlauf mit DC kontrolliert: Da kein Edukt verbraucht
worden war, wurde nun während 10 Minuten auf 40 C erwärmt.
Auch durch diese Behandlung hatte sich kein Produkt gebildet.
Nach Abkühlen auf Raumtemperatur gab man nochmals 143 mg (2,10
mmol; 8 Aeq.) Imidazol und 162 mg (1,1 mmol; 4 Aeq.) TBDMSCl
in ca. 1,5 ml DMF gelöst zu. Nach einstündigem Rühren bei
Raumtemperatur zeigte eine DC-Kontrolle erneut kein Produkt
an. Nun wurde das Reaktionsgemisch kontinuierlich um 10 C er¬
wärmt, 10 Minuten bei erhöhter Temperatur belassen, dann wie¬
der 10°C höher erhitzt, 10 Minuten bei dieser Temperatur ge-
*Schreiberaufsatz: 2-Halsaufsatz mit Gas- und Flüssigkeitseinlass
- 148 -
rührt etc. Dieses Prozedere wurde bis zum Erreichen der Siede¬
temperatur (ca. 150 C) wiederholt. Nach jedem Temperatursprung
um 10 °C wurde eine DC-Kontrolle durchgeführt. Nachdem auch
nach zweistündigem Kochen unter Rückfluss laut DC kein Produkt
gebildet worden war, wurde der Versuch abgebrochen.
- 149 -
Herstellung der Diphenylmethylsilyläther (48) und (49) aus einem
Herqueinon/Isoherqueinon-Gemiseh (1+2)
OCH OCH
Herq.: R^ CHg, R2= H
Isoh.: R = H, R = CH„1
'2 3
Herq. R = CH R2=HIsoh.: R = H, R = CH
beide: R = Si(CH„) (C H )„o o b o d
37,2 mg (100 vimol ) Herquei non/Isoherquei non-Gemi seh (1+2) wurden
in 1 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst. Der roten Lösung
fügte man 170 m 1 (0,8 mmol; 8 Aeq.) Diphenylmethylsilylchlorid
zu. Nach kurzem Rühren spritzte man eine Lösung von 136 mg
(2,0 mmol; 20 Aeq.) Imidazol in 0,8 ml DMF zu obigem Gemisch.
Die Reaktionslösung wurde mit dem Fön während 20 Sekunden
erwärmt und noch eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt.
Nach dieser Zeit wurde nach dem üblichen Verfahren (siehe
Seite 142) aufgearbeitet.
Das kristalline Rohprodukt wurde auf mit Zitronensäure gepuf¬
fertem Kieselgel chromatografiert: Säulen-0: 1,0 cm; Druck:
0,35 bar; Laufmittel: Hexan:Essigester = 10:1; Fraktionengrösse:
10 ml.
Fraktionen Nr. Ausbeute Produkte
1-16 1,0 mg apolare Produkte
16-18 --- ---
19-29 9,0 mg Isoherqueinonsi lyl äther (4?)
- 150 -
Fraktionen Nr. Ausbeute Produkte
30-41 27,0 mg Mi schfraktionen
42-52 19,0 mg Herqueinonsi lyl äther (48)
1-52 56,0 mg 98 %
Herqueinon-diphenylmethylsilyläther (48)
C33H32°7Si MG: 568>705
Aussehen : gelboranger, mikrokristalliner Festkörper
Smp
IR
H-NMR
(90 MHz)
C,H-An
£C
GC
i ,25
108-110 C
3690 (m)-,2980,2940(w);1640(m, Schulter) ;1628(vs);l 600
1560,1530,1470,1450,1430,1390,1380,1360(m);1350(s);
1325(m);1290,1255,1180(w);1130(s);1100(w);107 5,1045
1000,965,950,910,880(w);860,845(m).
0,50 (s,3H) H3C(0)2Si-; 0,99 (s,3H) H 3C(19) ; 1,590
(d,J=7,0 Hz,3H) H3C(15); 1,60 (s,3H) H3C(18); 2,370
(d,J=l Hz, 3H) H3C(1); 3,88 (s,3H) H3C0-C(7); 4,630
(q,J=7,0 Hz.lH) H-C(16); 6,17 (q,J=l Hz,1H) H-C(3);
7,27 (m,10H) (HgCg)2(Me)Si-; 13,08 (s,lH) und 15,25
(s,lH) H0-C(6) und H0-C(8).
berechnet: C: 69,69 H: 5,67
gefunden C: 69,59 H: 5,59
5:1R = 0,09 Hexan:Essigester
SE-54 3S,; 15m-0,35mm;Druck: 1,2 bar; Det/Inj.temp.
275 °C; Säulentemp.: 265 °C; tR= 9'00"
+566°
(c=0,058 in Chloroform)
I soherqueinon-diphenylmethylsi lyl äther (49)
C33H320?Si MG: 568,705
- 151 -
n : ziegelrotes Pulver
: 88-90 °C
: 3680,3080(w);3000,2940(m);1630(vs);1620(s);1600(m);
1565,1560,1530,1510,1470,1450,1430(m);1390,1360(s);
1330,1295,1245,1175,1140(m);1135(s);1125,1080,1055,
1040(m);1020(w);1000,960,915,885,865,855,700(m).
: 0,50 (s,3 H) H3C(0>2Si-; 0,80 (s,3 H) H3C(19); 1,38
) (d,J = 7 Hz,3 H) H3C(15); 1,50 (s, 3 H) H3C(18); 2,30
(d,J=l Hz,3 H) H3C(1); 3,89 (s,3 H) H3CO-C(7); 5,03
(q,J=7 Hz,l H) H-C(16); 6,13 (q,J=l Hz,l H) H-C(3);
7,26 (m,10 H)(H5C6)2(Me)Si-; 13,15 (s,lH) und 15,22
(s,lH) H0-C(6) und H0-C(8).
: berechnet: C: 69,69 H: 5,67
gefunden : C: 69,73 H: 5,74
: R : 0,12 Hexan:Essigester = 5:1
: SE-54 3%.; 15m-0,35mm; Druck: 1,2 bar; Det./Inj .temp:
275 V, Säulentemp.: 265 °C; tR= 8'30"
: +375°
(c= 0,0537 in Chloroform)
- 152 -
Silylierung eines Herqueinon/Isoherqueinon-Gemischs U+2) mit
1,3-Diphenyl-1,1,3,3-tetramethyldisi1azan und Bestimmung der
dabei erzeugten Epimerisierungsrate von Herqueinon ( 1 )
OCH OCH
Herq.: R = CHg, R2= H
Isoh.: R = H, R = CH
CH3> R2= H, R3= Si(CH3)3
Unter Stickstoffatmosphäre löste man 220 pl (0,75 mmol; 5 Aeq.)
1,1-Diphenyl-l,1,3,3-tetramethyl-disilazan (DPTMDS) in 1 ml
absolutem N, N-Dimethylformamid (DMF). Diesem Gemisch tropfte
man eine Lösung von 56 mg (0,15 mmol) Herqueinon/Isoherqueinon
(l+2)in 1 ml DMF zu. Das Reaktionsgemisch wurde 10 Minuten bei
Raumtemperatur gerührt und dann während 30 Sekunden mit dem
Fön geheizt. Eine DC-Kontrolle zeigte, dass sich noch fast
keine Produkte gebildet hatten. Das Gemisch wurde eine weitere
Stunde lang gerührt und dann nochmals mit dem Fön während
30 Sekunden geheizt. Eine DC-Kontrolle ergab nun, dass neben
viel Produkt fast kein Edukt mehr vorhanden war. Das Reak-
tionsgefäss wurde jetzt solange mit Stickstoff ausgeblasen,
bis am Ausgang kein Ammoniak mehr nachgewiesen werden konnte.
Danach wurde das Reaktionsgemisch auf 30 g Eis gegossen, mit
100 ml Aether und 20 ml Wasser versetzt und mit verdünnter
Schwefelsäure (5%) auf p H = 1 angesäuert. Nach dem Abtrennen
der wässrigen Phase wurde diese nochmals mit 50 ml Aether ex-
- 153 -
trahiert. Die beiden Aetherphasen wurden zusammengegeben und
dreimal mit je 80 ml Wasser sowie einmal mit 75 ml gesättigter
Kochsalzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über
Magnesiumsulfat getrocknet, der Aether am Rotationsverdampfer
abdestilliert und das Rohprodukt am Hochvakuum (10 torr) von
tiefer siedenden Nebenprodukten befreit.
Der zähe, dunkelrote Rückstand wurde auf mit Zitronensäure
gepuffertem Kieselgel f1ash-chromatografiert: Säulen-0:1,O cm;
Druck: 0,25-0,30 bar; Laufmittel: Hexan:Essigester = 5 :1 ; Frak-
tionengrösse (-dauer): 1-10: 1'; 11-26: 30" bei einer Tropfen¬
zahl von 90/Minute.
Fraktionen Nr. Ausbeute Produkte
1-3 --- ---
4-13 16,2 mg Isoherq.silyläther + apolare Prod.
14-25 42,5 mg Isoherquei nonsi lyl äther (3?)
26-27 2,5 mg Isoherq.- und Herq.silyläther
1-27 61,2 mg Total: 81 %
Isoherqueinon-/enantio-Isoherqueinondimethylphenylsilyläther
C28H30°7Si MG: 506'63
Aussehen : orangerotes Pulver, rubinrote Nadeln nach Umkris¬
tallisation aus Chloroform/Hexan
Smp : 143-145 °C
I_R : 3680, 3650, 3630, 3040( w) ; 3000,2975, 2940(m); 2900, 2840,
1730(w);1660(m); 1630(vs); 1620(s); 1600,1570,1565,
1550,1525(m);1505(w); 1470,1460,1445,1430(m); 1390,
1355(s);1325(w);1295,1260(m);1175(w);1140,1130,1080
(m);1050(w); 1035(m); 1015,995,960,910,880(w); 860,
840(m);640,610(w).
- 154 -
(Chloroform; 261(4,10);313(4,50);324(4,55);450(3,56)
0,244 (s,3H) und 0,274 (s,3H) (CH3)2(Phe )Si
) ( s,3H) H3C(19); 1,372 (d,J = 6,6Hz,3H) H3C(15)(s,3H) H3C(18); 2,306 (d,J = l,l Hz,3H) HgCd)
0,772
1,404
3,914
(s,3H) H3C0-C(7); 4,932 (q,J=6,6 Hz.lH) H-C(16);
6,146 (q,J=1,l Hz,lH) H-C(3); 7,114-7,260 (2m,5H)
(H 5C6 )(Me)2 Si-; 13,136 (s,lH) und 15,202 (s,lH)
H0-C(6) und H0-C(8).
berechnet: C: 66,38 H: 5,97
gefunden: C: 66,27 H: 6,00
R,= 0,18 Hexan:Essigester = 5:1
SE-54 4%.; 21m-0,35mm; Det./Inj.-temp.: 275°C; Säu-
lentemp.: 260°C; tR= 10'15"
0° (c= 0,050 in Chloroform)
- 155 -
Basisch induzierte Isomerisierung eines Herqueinon/Isoherque-
inon-Gemischs (1+2)
HOs
OCH,
„OH
ks^"^v^LOH
\£H3CH;
1+2
3 O-ACH3
R2
Herq. V CH3, R2.= H
Isoh. V "' V CH3
OCH
(-)-Isoh. R = CH,
R = H, ll-(R)
(+)-Isoh. R1= H, R2= CH3, ll-(S)
150 mg (0,4 mmol) Herqueinon/Isoherqueinon-Gemiseh im Verhält¬
nis von 58 42 (1+2) wurden in 5 ml trockenem Aceton gelost.
Nach Zugabe von 170 mg (1,2 mmol; 3 Aeq.) Kaiiumcarbonat wurde
das Gemisch auf dem Oelbad (ca. 60 C Badtemperatur) erhitzt
und wahrend einer Stunde unter Rückfluss gekocht. Dabei änder¬
te sich die ursprünglich tiefrote Farbe über orange nach gelb.
Nach etwa 15 Minuten Reaktionsdauer bildete sich ein gelber
Niederschlag. Am Ende der Reaktionszeit wurde das Gemisch
auf Raumtemperatur abgekühlt und das Losungsmittel am Rota¬
tionsverdampfer entfernt. Der Ruckstand wurde mit verdünnter
Schwefelsaure (5%) angesäuert und anschliessend mit Methylen-
chlorid und Wasser ausgeschüttelt. Dabei färbte sich ein Teil
des gelben Ruckstands orange und loste sich in Methylenchlo-
nd, wahrend ein Rest gelb blieb und oben auf der Wasserphase
schwamm. Die organische Phase wurde über Filterwatte filtriert
und so von einer geringen Menge braunen Ruckstands, welcher
verworfen wurde, befreit Nach dem Trocknen der orangen Methy-
1enchloridphase über Magnesiumsulfat wurde das Losungsmittel
- 156 -
abdestilliert. Der ziegelrote, kristalline
was einer Ausbeute von 60 % entspricht.
18 mg von diesem Rohprodukt wurden bei 190
-3(6-10 torr) sublimiert und ergaben 11 mg
Isoherqueinon/enantio-Isoherqueinon (±)-2
C20H20°7 : MG: 372>38
Aussehen : ziegelrotes Pulver
Smp : 235-236 °C
Jj* : 3670,3550(w);3480-3100,2985,2940(m);2840(w);1630(vs)
1605(s);l565,1550,1530,1515,1500,1470,1450,1435(m);
1400,1390,1360,1350(s);1325,1295, 1200, 1175, 1140,
1130,1045,1025,1015(m);990(w);950,910, 870, 845(m),
660(w).
^-NMR : 0,853 (s,3H) HgCf19); 1,415 (d,J=6,6 Hz,3H) H3C(15)(300 MHz) 1,465 (s,3H) H C(18); 2,451 (d,J=l,l Hz,3H) HgCM);
3,868 (s,3H) H3CO-C(7); 5,100 (q,J=6,6Hz,1H)H-C(16)
5,200 (bs.lH) HO-C(ll); 6,045 (q,J = l,1 Hz,1H) H-C(3)
13,233 (s,lH) und 14,872 (s,lH) H0-C(6) und H0-C(8)
Dazu: 0,845 (s,3H) H3C(18); 1,470 (s,3H) H 3C(19);2,460 (d,J = 1,l Hz,3H) H 3C (1 ) ; 3,865 (s,3H) HjCO-C(7); 6,021 (q,J=l,l Hz,lH) H-C(3); 13,279(s,lH)
und 14,881 (s.lH) H0-C(6) und H0-C(8).
[a]" : -17,4°
(c= 0,056 in Chloroform)
Rückstand wog 91 mg,
-195 C am Hochvakuum
(6H) Sublimat.
- 157 -
Epimerisierung eines Herqueinon/Isoherqueinon-Gemischs (1+2) mit
Imidazol; Bestimmung der Epimerisierungsrate
OCH
Herq.: R = CH,
R = H
Isoh.: R = H, R = CH
OCH
IST
H
Herq.: R = CH,, R = R = H4
1 3' 2 3
Isoh.: R = R3= H, R2= CH3
20 mg (53 ymol) Herqueinon/Isoherqueinon (1+2) wurden in 1 ml
N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst. Nach fünfminütigern Rühren
unter Stickstoffatmosphäre fügte man 150 mg (2,2 mmol;40 Aeq.)
Imidazol zu. Nachdem das Gemisch eine Stunde lang bei Raumtem¬
peratur gerührt worden war, heizte man mit dem Fön während 15
Sekunden auf, rührte 2 Minuten bei Raumtemperatur weiter und
heizte dann nochmals während 30 Sekunden mit dem Fön. Das
Reaktionsgemisch wurde danach auf 10 g Eis gegossen, mit 25
ml Wasser verdünnt und mit fünfprozentiger Salzsäure angesäu¬
ert. Das saure Gemisch (pH=l) wurde mit 120 ml Aether ausge¬
schüttelt. Nach dem Trennen der beiden Phasen wurde die wäss-
rige Phase nochmals mit 150 ml Aether extrahiert. Die verei¬
nigten Aetherphasen wurden dreimal mit Wasser und einmal mit
gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat
getrocknet und eingedampft. Dabei konnten 19,5 mg (97%) rotes
Rohprodukt gewonnen werden.
Eine NMR-Untersuchung vor der Epimerisierung hatte gezeigt,
dass das Eduktgemisch in einem Verhältnis von Herqueinon:Iso¬
herqueinon = 56:44 vorlag. Die Untersuchung nach der Reaktion
- 158 -
ergab, dass nun ein Verhältnis von 84:16 zugunsten von Isoher¬
queinon und/oder enantio-Isoherqueinon vorlag. Die Epimeri-
sierungsrate betrug somit 72 %.
Die Umsetzung einer Probe des gleichen Eduktgemischs mit dem
Spaltreagens für Silyläther, Tetrabutylammoniumf1uorid (TBAF),
ergab, im aprotischen Lösungsmittel Methylenchlorid durchge¬
führt, ein vergleichbares Resultat.
- 159 -
38 H (-)-? H
45 mg (0,1 mmol) Herqueinon-trimethylsilyläther (38) wurden
in 5 ml trockenem Aceton gelöst. Anschliessend fügte man dieser
Lösung 48 mg (0,34 mmol) Kai iumcarbonat zu und kochte das
Gemisch während einer Stunde unter Rückfluss. Dann wurde die
Reaktionslösung auf Raumtemperatur abgekühlt, am Rotationsver¬
dampfer zur Trockene eingeengt und nach dem Ansäuern mit ver¬
dünnter Schwefelsäure (5%) in 100 ml Aether aufgenommen. Das
saure Gemisch wurde dreimal mit je 30 ml Wasser ausgeschüttelt
und zum Schluss einmal mit 30 ml gesättigter Kochsalzlösung
gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat
getrocknet und eingeengt. Die Ausbeute an Rohprodukt ergab
44 mg (98%) roten Festkörper. Eine GC-Analyse zeigte, dass
bezüglich dem eingesetzten Herqueinonsi lyl äther (38) nur 7%
enantio-Isoherqueinonsilyläther gebildet worden waren. Das
Rohgemisch wurde deshalb noch einmal unter den oben beschrie¬
benen Bedingungen weiterbehandelt. Diesmal kochte man aber
während 18 Stunden unter Rückfluss. Nach dieser Zeit wurde
wie oben aufgearbeitet. Eine DC-Kontrolle zeigte, dass sich
der grösste Teil des eingesetzten Edukts (38) unter diesen
Bedingungen zersetzt hatte. Eine GC-Analyse des noch silylier-
ten Rests zeigte immer noch einen Isomerisierungsgrad von
- 160 -
/om
mitei DeTreu. «acn arei
kuum erhielt man 33 mg (93%) der gt _...,.
Herquei non/enantio-Isoherqueinon-trimethylsi lyl äther(38+(-)-39)
C„,H,o0,Si MG: 444,561CJ CO I
Aussehen
Smp
GC
oranges Pulver
130-135 C
SE-54 4 % ; 25m-0,25mm; Inj./Det.temp.: 275 C;Säu-
lentemp.: 266 °C; tR1= 8' 2 5", tR2= 9'00"
Die Daten von J_R, H-NMR und D_£ stimmten mit denjenigen des
auf Seite 142 beschriebenen Silyläthergemischs 38*39überein.
[o]25
D1,5 (c= 0,0872 in Chloroform)
- 161 -
Silylierung von Herqueinon/Isoherqueinon(l+2)unter nicht epi¬
meri sierenden Bedingungen
OCH OCH
Herq. : R^ CHg, R2= H
Isoh.: R = H, R = CH
xsir£r4
Isoh.: R = H, R = CH
beide: R3= CH3, R4= C^
55,8 mg (0,15 mmol) Herqueinon/Isoherqueinon M+2) wurden in
1 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und unter Stickstoff¬
atmosphäre mit 176 rt (1,05 mmol; 7 Aeq.) Dimethylphenylsilyl-
Chlorid (DMPSC1) versetzt. Nach fünfminütigem Rühren bei Raum¬
temperatur gab man tropfenweise eine Lösung von 145 mg (2,1
mmol; 14 Aeq.) Imidazol in 1 ml DMF zu. Nach 10 Minuten heizte
man das Gemisch mit dem Fön während 15 Sekunden auf. Dabei
bildete sich über der Reaktionslösung ein feiner weisser Nebel.
Nach weiteren 10 Minuten Reaktionsdauer zeigte eine DC-Kon¬
trolle, dass praktisch alles Edukt umgesetzt worden war. Neben
den gesuchten Produkten hatte sich auch ein bisschen höher
silyliertes Produkt gebildet.
Zur Aufarbeitung wurde das Reaktionsgemisch auf 10 g Eis und
10 ml verdünnte Schwefelsäure (5%) gegossen. Das Reaktions-
gefäss wurde mit 10 ml Wasser,gefolgt von 10 ml Aether.nachge¬
spült. Spüllösungen und Reaktionsgemisch wurden zusammengege¬
ben und 3 Minuten ruhen gelassen. Dann fügte man dem sauren
Gemisch 100 ml Aether zu und schüttelte aus. Die abgetrennte
Wasserphase wurde nochmals mit 100 ml Aether extrahiert. Nach
- 162 -
dem Zusammengiessen der beiden Aetherphasen wurden diese mit
je 75 ml Wasser dreimal und mit 75 ml gesättigter Kochsalzlö¬
sung einmal gewaschen. Die so behandelte Aetherphase wurde
über Magnesiumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer
vom Lösungsmittel befreit. Nach dreistündigem Trocknen am
.3Hochvakuum (8-10 torr) erhielt man eine tiefrote, hochviskose
Flüssigkeit in einer Ausbeute von 201 mg.
Dieses Rohgemisch wurde auf zitronensäuregepuffertem Kieselgel
chromatograf iert: Säulen-0: 1,0 cm-, Druck: 0,3 bar;Laufmi ttel :
Hexan/Essigester = 5:1; Fraktionengrösse (Dauer): 30" ab er¬
ster gefärbter Fraktion.
Fraktionen Nr. Ausbeute Produkte
1 -- --
2-10 6,0 mg apolares Produkt
11-16 9,0 mg Isoherqueinonsi lyl äther (47)
17-27 42,0 mg Mi schfraktionen
28-34 13,0 mg Herqueinonsi lyläther (46)
2-34 70,0 mg Total 92 % bez. Edukt
a) Herqueinon-dimethylphenylsi lyl äther (46)
MG: 506,633
rote, feine Nadeln (nach längerem Stehenlassen)
152-154 °C
3680,3450,3075,3040(w);3000,2960,2935(tn);1670, 1660
(w);1630(vs);1600,1565,1555,1525, 1515, 1507, 1470,
1450,1430(m);1395(s);1380(m);1360,1352(s); 1330(m),
1290(w);1255,1180,1140(m);1130(s);1120, 1095, 1080,
1035(m);1000(w);960(m);950,910(w);880,860,855, 845,
660(m);605(w).
C28H30°7Si
Aussehen :
Smp :
IR :
- 163 -
H-NMR
(300 MHz)
0,262 (s,3H) und 0,269 (s,3H) (H3C>2(Phe)SiIs,3H) H3C(19); 1,476 (s,3H) H C(18)
0,957
1,631 (d,J=
6,8 Hz, 3H) H3C(15); 2,349 (d,J=l,l Hz, 3H) HjCjl);3,909 (s,3H) H3C0-C(7); 4,599 (q,J=6,8Hz,1H)H-C(16)
6,134 (q,J=l,l Hz,1H) H-C(3); 7,129 (m,4H) und
7,232 (m.lH) (H gC6 )(Me>2 Si-; 13,043 (s.lH) und
15,233 (s.lH) H0-C(6) und H0-C(8).
C,H-An berechnet:
gefunden :
C: 66,38
C: 66,29
H: 5,97
H: 5,99
DC.
GC
,25JD
R,: 0,17 Hexan:Essigester = 5:1
; 21m-0,35mm; Inj./Det.temp.:275 C; Säu-
260°C; tD= 8'25"
SE-54,
lentemp
+663° (c= 0,0717 in Chloroform)
b) Isoherqueinon-dimethylphenylsilyläther (47)
C28H30°7Si MG: 506'633
Aussehen : rote Quader
Smp
IR
]H-NMR
(300 MHz)
145-147 C
3670,3530,3090, 3070,3040(w); 2995,2970,2940(m);2870,
2840,2730(w);1960,1885(w);1660(m);l630(vs);1600(s);
1565,1535,1525,1510(m); 1470,1460,1450(s ) ; 1430(m);
1390(s);1355(vs); 1380,1295,1255,1240,1175(m);1130(s)
1080,1050,1030(m);1015,995(w);960(m);910,880(w);860
840(m);810,660,640,605(w).
0,244 (s,3H) und 0,274 (s,3H) (HjC)£(Phe ) Si
(s,3H)
(s,3H)
H3C(19); 1,372 (d,J = 6,6 Hz,3H)H3C(15 )
H3C(18); 2,306 (d,J=l,l Hz,3H) H3C(1)
0,772
1,404
3,914
(s, 3H) H3C0-C(7); 4,932 (q,J=6,6 Hz, 3 H) H-C(16)
6,146 (q,J=l,l Hz.lH) H-C(3) 7,140 (m,4H)
13,136(s, 1 H)
15,202 (s.lH) H0-C(6) und H0-C(8).
7,235 (m, 1 H) (HgC6)(Me>2Si
und
und
- 164 -
C,H-An : berechnet: C: 66,38 H: 5,97
gefunden : C: 66,31 H: 6,02
DC : Rf: 0,19 Hexan:Essigester = 5:1
GC : SE-54 4%„ ; 21m-0,35mm; Inj./Det.temp.: 275°; Säulen-
temp.: 260°C; tR= 7*55"
[a]^5 : +516° (c= 0,0504 in Chloroform)
- 165 -
Desilylierung von Herqueinon-trimethyl si lyl äther (38)
methylsilyläther
a) Darstellung von trockenem Tetrabutylammoniumf1uorid (TBAF)
1,76 g (5,4 mmol) TBAF-3 H_0 wurden in Benzol gelöst und wäh¬
rend 12 Stunden am Wasserabscheider gekocht. Dann wurde das
Benzol am Rotationsverdampfer (Hausvakuum) abdesti11iert. Der
flüssige, zweiphasige, gelbliche Rückstand wurde durch mehr-
-3stündiges Trocknen am Hochvakuum (5-10 torr) eine einphasige
zähflüssige Masse. Die Ausbeute an diesem Produkt betrug 775mg
= 55 %.
b) Spaltung des Silyläthers (38)
70 mg (0,158 mmol) Silyläther (3_8) wurden in 1 ml trockenem,
entgastem Tetrahydrofuran (THF) gelöst. In einem mit Stick¬
stoff gespülten 2-Halskölbchen wurden unter Stickstoffatmo-
sphäre 1 ml trockens THF und 170u 1 einer 0,987 molaren (0,168
mmol) TBAF/THF-Lösung vorgelegt. Unter Rühren spritzte man
die vorher hergestellte Eduktlösung zu. Dabei wurde die tief¬
rote Silyläther-Eduktlösung rasch entfärbt. Nach einminüti¬
gem Rühren bei Raumtemperatur wurde der Reaktionsverlauf mit
Hilfe eines DC's untersucht. Bereits nach dieser kurzen Reak¬
tionsdauer konnte kein Edukt mehr festgestellt werden. Zum
Aufarbeiten tropfte man direkt ins Reaktionsgefäss 1 ml wäss-
- 166 -
riger Salzsäure (5 %). Das Gemisch wurde mit 5 ml Wasser ver¬
mischt und eine Minute lang gut gerührt. Das saure Gemisch
wurde in einen Scheidetrichter transferiert, mit 50 ml Wasser
und 150 ml Methylenchlorid versetzt und ausgeschüttelt. Zur
Phasentrennung liess man das Schüttelgemisch 15 Minuten ruhen.
Nach Abtrennen der wässrigen Phase wurde diese nochmals mit
100 ml Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methylen¬
chloridphasen wurden dreimal mit je 50 ml Wasser gewaschen
und dann über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel
wurde am Rotationsverdampfer (WasserstrahlVakuum) abdestil¬
liert, wobei 64 mg orangeroter Festkörper verblieben. 19 mg
dieses Rohprodukts wurden in Chloroform heiss gelöst und in
der Hitze mit Hexan versetzt. Dabei kam es zu einem gelben,
flockigen Niederschlag. Dieser wurde abfiltriert und nicht
weiter untersucht. Beim Stehenlassen der Mutterlauge bildeten
sich 10,5 mg feiner, ziegelroter Nadeln vom Smp. 219-220 C.
2,5 mg dieser Nadeln wurden bei 175-190 C und 3-10 torr sub-
limiert. Dabei gewann man 1,0 mg rotes Produkt vom Smp. 221-
222°C.
Um eine vollständige Epimerisierung zu gewährleisten, wurde
basisch nachepimeri siert. 3 mg (8 iimol ) des Rohprodukts wurden
in 1 ml Aceton gelöst, mit einer Spatelspitze Kaiiumcarbonat
versetzt und während einer Stunde unter Rückfluss gekocht.
Dann wurde am Rotationsverdampfer zur Trockene eingeengt, mit
verdünnter Schwefelsäure angesäuert und anschliessend mit
Methylenchlorid (od. Chloroform) extrahiert. Die organische
Phase wurde dreimal mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsul¬
fat getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt. Nach
Trocknen am Hochvakuum erhielt man 2,2 mg (73 %) rotes Pulver.
enantio-I soherqueinon
C20H20°7 : MG: 372'38
Aussehen : ziegelrotes Pulver (nach Sublimation)
Smp : 221-222 °C
- 167 -
: 3680,3550,3030,2990(w); 2935(m); 2840(w); 1630(vs);
1605(s);1560,l550,1515,1505,1470,1445,1430,(m);1390
1360,1350(s);1325,1295,1175,1140(m),1130(s);1045(w)
1030,1025(m);990(w);950,910,870,845(m);610(w).
: (Chloroform, 255(4,07);260(4,08);320(1,08);347(3,86)
350(3,80);443(3,54).
: 0,867 (s,3H) H3C(18); 1,414 (d,J=6,7 Hz,3H) H3C(15)) 1,455 (s,3H) H3C(19); 2,459 (d,J=0,9 Hz,3H) HgCd);
3,889 (s, 3 H) H3C0-C(7); 4,456 (bs, 1 H) HO-C(ll);
5,072 (q,J = 6,7 Hz.lH) H-CM6); 6,119 (q,J =0,9 Hz.lH)
H-C(3); 13,267 (s,lH) und 14,970 (s.lH) H0-C(6) und
H0-C(8).
: 372(M+,100%),356(18),341(25),329(26),311(8),302(10)
286(10),274(41),259(14),246(23),231(10),203(6), 185
(3),174(3),157(2),142(2),129(2),115(3),97(15),91(4)
83(5),69(13),55(11),41(13),29(4),18(7).
: Rf= 0,11 Hexan:Essigester = 2:1
: -185° (c=0,00835, in Chloroform)
- 168 -
Desilylierung von Isoherqueinon-trimethylsilyläther (39)
OCH3 OCH
(+)-3? CH3 <*•>-? CH3
Isoherqueinon-tri- Isoherqueinon (Ge-
methylsilyläther misch beider Iso-
(Gemisch beider meren)
Enantiomeren)
In einem mit trockenem Stickstoff gespülten Kolben wurden 42mg
(0,132 mmol, 1,2 Aeq.) Tetrabutylammoniumf1uorid•3 HO (TBAF)
in 3,5 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst. Mit einer Spritze in¬
jizierte man unter Rühren bei Raumtemperatur eine Lösung von
49 mg (0,11 mmol, 1,1 Aeq.) Isoherqueinon-trimethylsilyläther
(3j[)in 1,5 ml absolutem THF. Dabei verfärbte sich die ursprüng¬
lich blassgelbe THF/TBAF-Lösung rasch grün. Nach 10 Minuten
Reaktionsdauer bei Raumtemperatur wurde eine DC-Kontrolle ge¬
macht: Hexan:Essigester = 3:1; Startfleck gelb, Rf= 0,06 violett,
R,= 0,11 blassgelb, Rf= 0,36 orange wie Referenz, kein Edukt-
gemisch mehr vorhanden.
Nach diesem Befund wurde das Reaktionsgemisch aufgearbeitet.
Die Reaktionslösung wurde mit 10 ml Aether verdünnt und auf
ca. 50 g Eis gegossen. Mit verdünnter Schwefelsäure (5%) wurde
auf pH= 1 angesäuert. Das Ganze wurde mit Aether auf 150 ml
Gesamtvolumen aufgefüllt und ausgeschüttelt. Nach Abtrennen
der sauren Wasserphase wurde diese nochmals mit 50 ml Aether
extrahiert. Die beiden Aetherphasen wurden vereinigt und mit
je 50 ml Wasser viermal gewaschen. Zum Schluss wurde mit 50ml
- 169 -
gesättigter Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Die oganische Phase
wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und am
Rotationsverdampfer eingeengt. Man erhielt 50 mg eines teils
kristallinen, teils gummiartigen, orangeroten Produkts.
Dieses Rohprodukt wurde an Kieselgel f1ash-chromatografiert:
Säulen-0: 1,0 cm; Druck: 0,25 bar; Laufmittel: Hexan:Essiges-
ter=2:l; Fraktionengrösse: 5-10 ml.
Die Fraktionen 8-17 (DC: R,= 0,11 Hexan:Essigester=2:1) wurden
vereinigt und eingedampft. Nach Trocknen des Rückstandes am
Hochvakuum (10 torr) erhielt man 5 mg (12%) tieforange, feine
Nadeln. In späteren Versuchen wurde das Rohprodukt auf gepuf¬
fertem Kieselgel chromatografiert, wobei die Ausbeute nach
Chromatografie auf 75 % gesteigert werden konnte.
Isoherqueinon (*2) Gemisch beider Enantiomeren
C H 0, : MG: 372,3820 20 7
Aussehen : feine, ziegelrote Nadeln
Smp : 236-238 °C
J_R : 3680,3540,3400-3100,3000(w);2930(m);2855(w);1630(vs)
1615(s);1600,1560,1550,1515,1508, 1470, 1450, 1430,
1420,1396(m);1390,1360(s);1350,1325,1295,1240,1225,
1200,1175,1140,1130(m),1100(w),1045, 1025, 1015(m),
990(w);950,910,868,842(m).
UV/VIS : (Chloroform; 260(4,04);332(4,49);350(3,78);448(3,53)
]H-NMR : 0,854 (s,3H) H3C(19); 1,414 (d,J=7,0 Hz,3H) H3C(15)(300 MHz) 1,464 (s,3H) H3C(18); 2,432 (d,J=l,0 Hz,3H) HjCd),
3,856 (s,3H)H3C0-C(7); 5,095 (q,J=7,0 Hz,1H)H-C(16)
5,193 (bs,1H) HO-C(ll); 6,023 (q,J = l,0Hz,1H ) H-C(3)
13,201 (s.lH) und 14,774 (s.lH) H0-C(6) und H0-C(8)
1 3C-NMR : (CDC1-, Gemisch beider Isomeren)
(75 MHz) 13,11 (q, C-15); 16,23 (q,q C-18 und C-19); 24,34
(q, C-1); 46,79 (s, C-17); 60,62 (q, H3C0-); 78,81
- 170 -
(s, C-11); 90,46 (d,
109,84 (s); 123,38 (
150,93 (s); 162,76 (
197,06 (s).
: (Pyridin-d_, Gemisch
) 13,020 (q, C-15); 16
C-19); 24,021 (q, C-
0CH3); 79,687 (s, C-
(s); 104,022 (s); 11
132,368 (s); 139,587
164,123 (s); 178,332
: 372(M+ = HH)%),356(21)
311(11),302(12),297(
(5),259(22),246(36),
185(5),174(6),163(4)
137(5),118(3),115(6)
77(6),69(27),65(4),5
C-16); 103,44 (s); 103,58 (s);
d, C-3); 131,70 (s); 139,20 (s)
s,s); 177,23 (s); 186,62 (s);
beider Isomeren)
,144 und 16,710 (q,q C-18 und
1); 46,789 (s, C-17); 60,356 (q
11); 90,811 (d, C-16); 103,405
0,260 (s); um 125 (verdeckt,C-3)
(s); 150,648 (s); 162,956 (s);
(s); 187,415 (s); 198,804 (s).
,341(38),329(33),323(7),314(8),
5),286(13),283(s),274(55),269
231(16),228(13),213(4),203(12),
,157(5),149(4),147(4),141(3),
,101(4),97(45),91(6),89(6),83(4)
5(16),51(3),41(25),28(14).
: R,= 0,11 Hexan:Essigester=2:l
- 171 -
1 3Einbau von (3-R,S)-[2- C ]-Mevalolacton (55c)in Penicillium Her-
1 3quei; Isolierung von C-markiertem Herqueinon/Isoherqueinon(ia+2a)
OCH
CH3 OH R,= CH„,R = H1 3 2
R = H,R = CH„2
'2 3
Herq.
Isoherq.
1a + 2a
Mevalolacton1 3
[18- C]-Herqueinon/Isoherquei non
13r 13,0,5g (3,8mmol) (3-R,S)-[2- C ]-Mevalolacton (90 Atom-% '"C)
von MERCK SHARP & DOHME CANADA LIMITED, Montreal, Canada wur¬
den mit 3,6 ml sterilem Wasser gelöst.
Flüssigkulturen von P. Herquei wurden nach der auf Seite be¬
schriebenen Standardmethode präpariert. Nach vier Tagen Wachs¬
tum unter Normalbedingungen wurden zwei Kulturen mit je 1,8ml
der Mevalolactonlösung gefüttert. Die Kulturen wurden danach
bei 24 C im Dunkeln während 25 Tagen inkubiert. Anschliessend
wurden die Mycelien geerntet und normal aufgearbeitet. Nach
dem Trocknen wurden die Mycelien der beiden Kulturen vermischt
und gewogen: 3,35 g Trockenmaterial. Nach gutem Zerreiben in
einem Mörser wurde das Mycelpulver in 80 ml Chloroform aufge¬
schlämmt. Die Suspension wurde unter Stickstoffatmosphäre bei
Raumtemperatur während 12 Stunden gut gerührt. Die Chloroform¬
lösung wurde dann vom unlöslichen Mycelrest abfiltriert, am
Rotationsverdampfer auf ca. 25 ml eingeengt und im Kühlschrank
bei 0-3 C während 4 Stunden stehen gelassen. Das ausgefallene,
kristalline, rote Produkt wurde abfiltriert. Ausbeute: 155mg.
Diese erste Fraktion hatte einen Smp. von 208-210 C.
Durch weiteres Einengen der Mutterlauge konnten nochmals 243mg
- 172 -
Festkörper vom Smp. 208-210 C gewonnen werden. Die verbliebe¬
ne Mutterlauge wurde auf die Hälfte eingedampft und lieferte
nochmals 277 mg dunkelbraunes Produkt. Durch Umkristallisie¬
ren aus Chloroform und Hexan konnten daraus 58 rag roter Nadeln
vom Smp. 212-213 C gewonnen werden. Insgesamt konnten 456 mg
verwertbares Rohgemisch gewonnen werden.
[ 18-13C]-Herqueinon/[ 18-1 3C ]-Isoherqueinon (la+2a)
C20H20°7
Aussehen
Smp
]H-NMR
13C-NMR
_I_R
,Mj>
DC
MG: 372,38
kupferrote, 5 mm lange, haarfeine Nadeln
212-213 °C (Zersetzung)
identisch mit Spektrum eines normalen Herqueinon/1 3
Isoherqueinon-Gemischs ( ). C-Satelliten bei Me¬
thylsignalen bei 1,47 und 1,57 ppm mit Kopplungskon¬
stanten von je 128 Hz.
(Pyridin-dc,nur Isoherqueinon/enantio-Isoherqueinon
nach basischer Epimerisierung des oben beschriebe¬
nen Rohgemischs)
13.020 (q) C(15); 16,144 (q) C(19); 16,710 (q) C(18)
24.021 (q) C(l); 46,789 (s) C (17); 60,356 (qMOCHj);79,687 (s) C(ll?); 90,811 (d) C(16); 103,405 (s);
104,022 (s); 110,260 (s); 123,800 (d) C(3); 132,368
(s); 139,587 (s); 150.648 (s); 162,956 (s); 164,123
(s); 178,032 (s); 187,415 (s); 198,804 (s).
(CHC13,
wie normales Herqueinon/Isoherqueinon (1+2))
Wie Herqueinon/Isoherqueinon (1+2), m/e = 373 (25,4%)
Rf= 0,20 in Hexan:Essigester = 2:1
- 173 -
Silylierung eines [18- C]-markierten Herqueinon/Isoherqueinon-
Gemischs (ia+2a)und Trennung der entsprechenden diastereomeren
Si lylather (38a)und (39a)
[18- C]-Herqueinon/ [18- C]-Herqueinon/
Isoherqueinon Isoherqueinon-trimethyl-
Herq. R^ CH3,R2= H silyläther Isoh. R1= H,R2= CH3
In einem 25ml-2-Halskolbchen wurden unter Stickstoffatmosphare
93 mg (0,25 mmol) markiertes Herqueinon/Isoherqueinon-Gemiseh
(la+2a)in 2 ml N ,N-Dimethyl f ormami d (DMF) gelost. Durch eine
Serumkappe gab man anschliessend 175 yl (1,375 mmol; 5,5 Aeq.)
Trimethylsilylchlorid (TMSC1) zu. Nach zweiminutigern Ruhren
bei Raumtemperatur gab man im Stickstoffgegenstrom 187mg (2,75
mmol, 11 Aeq.) Imidazol zu. Dieses Gemisch wurde bei Raumtem¬
peratur gerührt. Nach 30 Minuten wurde der Reaktionsverlauf
mittels DC kontrolliert. Da sich nur wenig Produkt gebildet
hatte, gab man nochmals 175 fl (1,375 mmol, 5,5 Aeq.) TMSC1
zu und heizte mit einem Fon im Abstand von 2 Minuten wahrend
jeweils 20 Sekunden zweimal auf. Nach 30 Minuten Ruhren bei
Raumtemperatur wurde der Reaktionsverlauf erneut mit einem
DC kontrolliert. Nun war praktisch alles Edukt (Rf- 0,1 Hexan
Essigester=5 1) verschwunden und zwei neue Produkte (Rf_ 0,18
und Rf= 0,20) hatten sich gebildet.
Man gab nun ca. 5 g Eis zur Reaktionsmischung, rührte wahrend
5 Minuten gut und transferierte die entstandene Suspension in
- 174 -
einen Scheidetrichter. Dort gab man 50 ml Wasser und 150 ml
Aether hinzu und schüttelte aus. Nach dem Trennen der beiden
Phasen wurde die Wasserphase mit 80 ml frischem Aether extra¬
hiert. Die beiden Aetherphasen wurden vereinigt, mit je 50 ml
Wasser dreimal gewaschen, am Schluss mit 50 ml gesättigter
Kochsalzlösung ausgezogen und über Magnesiumsulfat getrocknet.
Nach Entfernen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer und
Trocknen am Hochvakuum (10 torr, 30-40 C) erhielt man 100mg
(91%) rotes, harzartiges Rohproduktegemisch. 20 mg dieses Roh¬
gemischs wurden auf oxalsäuregepuffertem Kieselgel chromato-
grafiert: Säulen-0: 1,0 cm; Druck: 0,20 bar; Laufmittel:
Hexan:Essigester=5:1; Fraktionengrösse: 2-3 ml.
Fraktionen Nr. Ausbeute Produkte
0-3 --- ---
4-7 3 mg Isoherqueinonsilyl äther(39a)
8-18 14 mg Mi schfrakti onen
19-25 2 mg Herqueinonsilyläther (38a)
4-25 19 mg 95% bezüglich Rohgemisch
1 318- C]-Herqueinon-trimethylsilyläther (38a)
C23H28°7Si MG: 444>561
Aussehen : dunkelrote, glasige Masse
IR : wie unmarkiertes Material 38
UV/VIS : dito
]H-NMR : -0,105 (s,9H) (CHj) Si-; 1,002 (s,3H) H3C(19);1,428(300 MHz) (s,3H) H3C(18); 1,579 (d,J=6,8 Hz,3H) H3C(15);2,499
(d,J=1,3 Hz, 3 H) H3C(1); 3,944 (s, 3 H) H3C0-C(7);4,624 (q,J=6,8 Hz.lH) H-C(16); 6,294 (q,J=l,3 Hz,
1H) H-C(3); 13,277 (s,lH) und 15,377 (s,lH) H0-C(6)
und H0-C(8). Das Signal bei 1,428 ppm hat in je 64
- 175 -
13C-NMR
(75 MHz)
Hertz Entfernung nach tieferem und höherem Feld je1 3
einen C-Satelliten mit Gesamtintegral von 12 %.
0,769 (q, (CH3)3S1-); 16J2Z=igi=C-l§i; 18,668 (q,
C-15); 23,985 (q, C-19); 24,254 (q, C-1); 44,533
(s, C-17); 60,648 (q, HjCO-); 80,427 (s); 95,813
(s); 103,841 (s); 104,613 (s); 109,919 (s); 12*1,312
(d, C-3); 132,208 (s); 138,707 (s); 149,881 (s);
162,520 (s); 163,839 (s); 175,731 (s); 187,233 (s);
195,950 (s). === : stark, :schwach angereichert
DC
GC
f»I25
Rf= 0,18 Hexan:Essigester = 5:1
SE-54 4 %., 21m-0,35mm; Inj./Det.-Temp.: 275°C;Säu-
lentemp.: 241°C; tR= 7'25"
+ 520°(c= 0,112, CHC13)
1 3[18- C]-Isoherqueinon-trimethylsilyläther(39a)
C23H28°7Si MG: 444>561
Aussehen dunkelrote Quader
179-180 °C
wie unmarkiertes Material (39)
dito
-0,096 (s,9H) (CH3)3Si-; 0,817 (s,3H)H3C(19); 1,356
(300 MHz) (s,3H) HgCt18); 1,385 (d,J=6,7 Hz,3H)HjC(15); 2,474
(d,J=l Hz,3H) H3C(1); 3,949 (s,3H) H3C0-C(7); 4,892
(q,J=6,7 Hz,lH) H-C(16); 6,289 (q,J=l Hz.lH) H-C(3)
13,330 (s,lH) und 15,344 (s,lH) H0-C(6) und H0-C(8)
Das Signal bei 1,356 ppm hat in 60 Hz Entfernung1 3
zu höherem und tieferem Feld je einen C-Satelli-
Smp
JI
UV/VIS
^-NMR
13C-NMR
ten mit Gesamtintegral von 12 %.
0,736 (q, (CH3)3Si-); 13,123 (q, C-15); 15,612 (q,
(75 MHz) C-19); 1 § * g 41=_(jqL,_
_Q = 1 81; 24,216 (q, C-1); 47,849
(s, C-17); 60,679 (q, H3C0-);80 ,225 (s);90,015 (s);
- 176 -
104,145 (s); 104,261 (s); 109,953 (s); 124,386 (d,
C-3); 132,141 (s); 138,752 (s); 149,688 (s);162,438
(s); 163,764 (s); 175,180 (s); 187,277 (s); 196,620
(s). === : stark, : schwach angereichert
D_C : Rf= 0,20 Hexan:Essigester = 5:1
GC : SE-54 4%.; 21m-0,35mm; Inj./Det.-temp.: 275°C; Säu-
lentemp.: 241°C; tR= 7'00"
[o]p5 : +470° (c= 0,0167, CHClj)
- 177 -
Kuhn-Roth-Abbau von Herqueinon/Isoherqueinon (1+2) sowie Dar¬
stellung des p-Phenyl-phenacyl-derivats des gebildeten Acetats
OCH °^-CH3I
O\
CH.,
KOAc
Herqueinon/Isoher- Kaliumacetat
queinon-Gemisch
Herq: Rx= CH3,R2= H; Soh: R^ H,R2= CHg
89
p-Phenyl-phenacyl-
acetat
a) Herstellung der Oxidationslösung
4 g Chromtrioxid
- 10 ml bidestilliertes Wasser
2,5 ml konzentrierte Schwefelsäure
b) Oxidativer Abbau
8 mg (21,5 Mmol) Herqueinon/Isoherqueinon-Gemiseh(1+2)wurden
im Reaktionskolben eines Kuhn-Roth-Apparats*
vorgelegt, mit
dem oben beschriebenen Oxidationsreagens (gesamte Menge) ver¬
setzt und erhitzt. Das Gemisch wurde bei 150-160°C während
60 Minuten unter Rückfluss gekocht. Nach dem Abkühlen auf
Raumtemperatur wurde zwischen Reaktionsgefäss und Kühler eine
Destillationsbrücke eingesetzt und die gebildete Essigsäure
durch Wasserdampfdestillation aus der Oxidationsmischung ent¬
fernt. Diese Destillation wurde bei Erreichen von 70 ml Des¬
tillat abgebrochen. Dieses wurde mit 0,01 M wässriger Kalium¬
hydroxidlösung gegen Phenolphthalein titriert. Es wurden 6,16
ml (61,6 iimol) Lauge verbraucht. Dies entspricht bei einer
maximal möglichen Menge von 64,52 wmol Essigsäure (3 abbau-
* Apparatur modifiziert nach E. Wiesenberger; Mikrochim. Acta 35, 51 (1948)
- 178 -
bare Methylgruppen) einer Ausbeute von 95 %.
c) Darstellung des p-Phenyl-phenacylacetats (89)
Die durch Kuhn-Roth-Abbau erhaltene Kaiiumacetatlösung wurde
eingeengt, dreimal in je 5 ml Acetonitril gelöst und am Rota¬
tionsverdampfer wieder zur Trockene gebracht. Die daraus re¬
sultierende Wasserfreiheit konnte anhand der fehlenden Violett¬
färbung nachgewiesen werden. Der weisse Rückstand wurde in
7 ml Acetonitril aufgeschlämmt, mit einer Spatelspitze 18-
Crown-6-äther sowie 18,5 mg (67,2 iimol; 1,1 Aeq.) p-Phenyl-
phenacylbromid versetzt und bei 85 C Badtemperatur während
3 Stunden unter Rückfluss gekocht. Nach Abkühlen auf Raumtem¬
peratur wurde das Gemisch am Rotationsverdampfer zur Trockene
eingeengt. Der feste Rückstand wurde in Methylenchlorid auf¬
genommen und von Unlöslichem abfiltriert. Der Fi 1terrückstand
wurde mit Methylenchlorid gut gewaschen. Die Waschlösungen
und das Filtrat wurden zusammengegeben und auf ca. 1,5 ml
eingeengt. Dieses Konzentrat wurde auf Kieselgel flash-chro-
matografiert: Säulen-0: 1,0 cm; Druck: 0,25 bar; Laufmittel:
Methylenchlorid; Fraktionengrösse: 4 ml.
Die Fraktionen 33-47 enthielten 14 mg (90%) des gewünschten
Produkts.
p-Phenyl-phenyl acetat (89)
C16Hu03 : MG: 254,288
Aussehen : farblose Nadeln
Smp : 110-111 °C
MS^ : m/e= 254 (M+) als Standard
m/e= 255 (M+l+)
100% gesetzt
20,4%
- 179 -
Kuhn-Roth-Abbau von Herqueinon/Isoherqueinon-trimethylsilyl-
äther (38+39)unter minimem Protonenaustausch an der Methyl gruppe
der dabei gebildeten Essigsäure
OCH
R_= Si(CH,)3'3
Herq: R=CH3>R2= H
Isoh: R=H,R2= CH3
Herqueinon/Isoherque-
inontrimethylsilyl-
äther-Gemisch
CH3COOH
CHxDyCOOH
x = 1-3
y = 1-3
CH3
o*c'R-CH,-0
= p-Phenyl-
benzoyl
89
Essigsäure-d.,d2,d- und entsprech¬
endes p-Phenyl-phenacylacetat-d.-d,
a) Herstellung der Oxidationslösung
- 2,1 g Chromtrioxid
- 5 ml deuteriertes Wasser (99,8 Atom-% 2H)- 1,25 ml deuterierte Schwefelsäure (min.99,5 Atom-% H)
b) Oxidativer Abbau
14,5 mg (32,8 ymol ) Herqueinon/Isoherqueinon-trimethylsilyl-
äther-Gemi seh (38+39)wurden i n einer mit Stickstoff ausgeblasenen
25ml-Ampulle vorgelegt. Nach Abkühlen der Ampulle auf -78 C
wurde im Stickstoffgegenstrom die unter a) beschriebene, vor¬
gekühlte Oxidationslösung zugegeben und die Ampulle sofort ab¬
geschmolzen. Die geschlossene Ampulle wurde zur Sicherheit
in Teflonband eingewickelt und auf einer Warburg-Schüttelma¬
schine (horizontale Schüttelbewegung) bei Raumtemperatur wäh¬
rend 38 Stunden geschüttelt. Nach dieser Zeit wurde die Am¬
pulle vorsichtig geöffnet (geringer Ueberdruck). Die dunkel¬
braune, klare Reaktionsmischung wurde mit 10 ml destilliertem
- 180 -
Wasser in einen 1-1-Rundkolben gespült und mit flüssigem Stick¬
stoff lyophilisiert. Nach vierstündigem Lyophi1isieren wurde
das Auffanggefäss gewechselt, die halbverfestigte Reaktions¬
mischung mit 10 ml destilliertem Wasser verdünnt und nochmals
während 2 Stunden lyophilisiert. Die beiden Lyophilisate wur¬
den aufgetaut, zusammengegeben und während 30 Minuten unter
Rückfluss gekocht, um ev. gelöste Kohlensäure auszutreiben.
Die wässrige Lösung wurde nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur
mit 2 Tropfen einer alkoholischen Phenolphthaleinlösung (5%)
versetzt und mit 0,01 N Kalilauge titriert. Es wurden 67 pmol
Base verbraucht, was einer Ausbeute von 68% bezüglich 3 maxi¬
mal möglicher Aequivalente Essigsäure entspricht. Der Umschlag
des Indikators erfolgte scharf. Man tropfte dem Reaktionsge¬
misch noch 0,1 ml Lauge im Ueberschuss zu und destillierte
das Wasser am Rotationsverdampfer ab.
c) Herstellung des entsprechenden p-Phenyl-phenacylacetats (89a)
Das nach obigem Verfahren erhaltene Kaliumacetat ( ) wurde
zweimal mit je 10 ml Acetonitril gelöst und durch azeotropes
Abdesti11ieren vom noch vorhandenen Wasser befreit. Danach
gab man eine Spatelspitze 18-Crown-6-Aether, 20 mg (73pmol;
1,1 Aeq.) p-Phenyl-phenacylbromid und 10 ml Acetonitril zu.
Dieses Gemisch wurde bei einer Badtemperatur von 90 C während
3 Stunden unter Rückfluss gekocht. Nach dem Abkühlen auf Raum¬
temperatur wurde das Gemisch am Rotationsverdampfer eingeengt.
Der Rückstand wurde in Methylenchlorid aufgenommen, von Unlös¬
lichem abfiltriert und f1ash-chromatografiert: Säulen-0:1,0 cm;
Druck: 0,25 bar; Laufmittel: Methylenchlorid; Fraktionengrösse:
3-4 ml. Ausbeute: 14,5 mg (85%)
p-Phenyl-phenacylacetat-d (89a) d = 96,5%; d.= 1,5%; d? ,= 1*
C,CH, n : MG: 254,288
Aussehen : farblose Nadeln (einmal aus CH-CK umkristallisiert)
Smp : 110-111 °C
* Mit Lyophilisaten meint man hier die bei der Lyophilisaten aufgefan¬
genen wässrigen Essigsäuredestillate
- 181 -
3 2Einbau von (3R,5S)-[5- H, H]-Mevalolacton (55e)in P. Herquei
HO CH3
OCH
Herq.: R
Isoh.: R = H, R = CHDT
Eine nach dem auf Seite 133 beschriebenen Standardverfahren ge¬
züchtete Flüssigkultur von P. Herquei in 150 ml Raulin-Thom-
lösung wurde zunächst 4 Tage normal wachsen gelassen. Nach
dieser Zeit hatte sich an der Flüssigkeitsoberfläche bereits
ein ziemlich kompakter, aber noch weisser Myceldeckel gebil¬
det.
3 2Eine Probe von (3R,5S)-[5- H, H]-Mevalolacton (55e) mit einer Ge¬
samtaktivität von 0,863 mCi, verdünnt mit 25 mg inaktivem Me¬
valolacton, wurde in 1 ml sterilem Wasser gelöst. Diese Lösung
wurde durch ein Sterilfilter mit einer Spritze direkt unter
die Myceloberf1äche der 4 Tage alten Kultur gespritzt. Die
so behandelte Pilzkolonie wurde zusammen mit einer inaktiven
Kontrollkultur weitere 14 Tage im Dunkeln bei 24 C inkubiert.
Das Wachstum erfolgte bei beiden Kulturen normal. Nach einer
Gesamtinkubationszeit von 18 Tagen wurde die mit aktivem Mate¬
rial gefutterte Kultur filtriert. Das zurückbleibende feste
Mycel wurde zwischen Filterpapier so trocken wie möglich ge-
presst, in einen 250ml-Rundkolben transferiert und bei 45 C
.3am Hochvakuum (10 torr) während 100 Stunden getrocknet. Das
trockene, spröde Mycel wurde unter Stickstoffatmosphäre in
100 ml Chloroform suspendiert und während 12 Stunden stehen
- 182 -
gelassen. Das Gemisch wurde von Unlöslichem abfiltriert und
die tiefrote Chloroformlösung am Rotationsverdampfer auf etwa
10 ml Restvolumen eingeengt. Dabei kam es zur Bildung einer
ersten Fraktion roten Festkörpers. Die Mutterlauge wurde mit
wenig Hexan versetzt und auf ca. 2,5 ml eingedampft. Die ge¬
ringe Menge schwarzen Festkörpers, welche dabei ausfiel, wurde
abfiltriert und verworfen. Die nun klare Lösung liess man
im Kühlschrank (ca. 3°C) während 6 Stunden ruhen. Dabei bil¬
dete sich eine zweite Fraktion Produkt in Form roter Nadeln.
Durch sukzessives Einengen der jeweils verbleibenden Mutter¬
laugen konnten insgesamt 6 Fraktionen mit gewünschtem Produkt
gewonnen werden.
Frakti onen-Nr. Smp.°C Tritiumgehalt ipm/mg Ausbeute mg
1 210-212 5.25-105 3,2
2 214-217 5,58.105 37,1
3 216-218 6,44-105 38,0
4 210-212 5.14-105 36,0
5 208-212 2,76-105 43,0
6 216-218 5.68-105 22,0
1-6 8.97-107 total 179,3
Totale Einbaurate : 10,4 %
5Spezifische Aktivität : 5,00-10 ipm/mg
- 183 -
3 2 1Silylierung von [15- H, H, H ]-Herquei non/Isoherquei non l_b+2g und
Trennung des entsprechenden Silyläthergemischs 38b+39b
OCH OCH
Herq.: R = CH
Isoh.: R = H,
Herq.: R
Isoh.: R = H, R = CH
R3 = Si(CH3)3
37,2 mg (0,1 mmol) aktives Herqueinon/Isoherqueinon lb+2b mit
einer Gesamtaktivität von 1,97-10 ipm wurden in 1 ml N,N-Di-
methylformamid (DMF) gelöst und unter Stickstoffatmosphäre
mit 68 mg (1,0 mmol; 10 Aeq.) Imidazol versetzt. Nach 15 Minu¬
ten gab man 65 yl (0,5 mmol; 5 Aeq.) Trimethylsilylchlorid
(TMSC1) in 0,2 ml DMF gelöst zu. Die Reaktionsmischung wurde
20 Sekunden mit dem Fön geheizt und anschliessend während
90 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Ein Kontrolle des Re¬
aktionsverlaufs mittels DC zeigte, dass kein Edukt mehr vor¬
handen war. Das Gemisch wurde nun auf 10 g Eis gegossen, mit
2 ml verdünnter Schwefelsäure (5%) angesäuert und mit 100
ml Aether extrahiert. Die Wasserphase wurde nochmals mit 50ml
Aether ausgeschüttelt. Die beiden Aetherphasen wurden verei¬
nigt und dreimal mit je 30 ml Wasser und einmal mit 30 ml
gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Nach dem Trocknen über
Magnesiumsulfat wurde das Lösungsmittel abdestilliert. Der
Rückstand wurde am Hochvakuum während drei Stunden bei 50 C ge¬
trocknet, wonach man 44 mg (98%) Rohprodukt in Form eines
roten Schaums erhielt. Dieser Schaum wurde in 1 ml Hexan und
- 184 -
wenigen Tropfen Essigester gelöst und auf mit Oxalsäure gepuf¬
fertem Kieselgel chromatografiert: Säulen-0: 1,0 cm; Druck:
0,2 bar; Laufmittel: Hexan:Essigester = 5:1; Fraktionengrösse
(-dauer): 1-2: 4,30", 3-24: 30", 25-40: 4'30".
Fraktionengrösse Ausbeute Produkte
0-3 --- ---
4-9 9 mg Iso/enantio-Isoherq.silyläth.
10-23 17 mg Mi schfraktionen
24-30 3 mg Herqueinonsilyläther
31-37 5 mg polarer Rest
4-37 34 mg 77 %
[15- H, H, H I-Isoherqueinon/enantio-Isoherqueinonsilyläther39b
C,.,Hoo0,Si MG: 444,561CO CO I
Aussehen : orangerotes Pulver
Smp : 177-179 °C
^H : 5,293-105 ipm/mg
[a]p5 : + 75° (c= 0,0534, in Chloroform)
[15-3H,2H,1H]-Herqueinonsilyläther (38b)
MG: 444,561
rote, glasartige Masse
55,766-10 ipm/mg
+650° (c= 0,0952, in Chloroform)
C23H2807Si
Aussehen
[c]25
- 185 -
3 2 1Kuhn-Roth-Abbau von [15- H, H, H ]-Isoherqueinon/enantio-Iso-
herqueinonsilyläther (39b)
OCH
,CH3CH » /"CH3
O AH OH3 O ACHDT
CHDT (i)39 H
CHDTCOOH
R = Si(CH3)3 R = Si(CH3)3
a) Herstellung der Oxidationslösung
- 2,10 g Chromtrioxid
- 5,00 ml destilliertes Wasser
- 1,25 ml konzentrierte Schwefelsäure
b) oxidativer Abbau
9 mg (20,2 ymol) [ 1 5-3H, 2H,1H ]-Silyläther (39b) wurden in einer
25ml-Ampulle vorgelegt und bei einer Temperatur von -75 C mit
der oben beschriebenen, vorgekühlten Oxidationslösung versetzt.
Danach wurde die Ampulle sofort zugeschmolzen und auf einer
Warburg-Schüttelmaschine über Nacht geschüttelt. Die Ampulle
wurde dann vorsichtig geöffnet (geringer Ueberdruck) und ihr In¬
halt nach Verdünnen mit 10 ml Wasser lyophilisiert. Das Lyo¬
philisat wurde während einer halben Stunde unter Rückfluss
gekocht und dann mit 0,01 N Kalilauge gegen Phenolphthalein
titriert. Der Baseverbrauch bis zum scharfen Farbumschlag be¬
trug 5,8 ml. Dies entspricht 95 % bezüglich 3 Aequivalenten
Essigsäure.3 4
Die Bestimmung der H-Aktivität ergab 5,01-10 ipm/ymol
- 186 -
i a
c) Verschneiden mit [1- C]-Natriumacetat
3 2 15,8 ymol [2- H, H, H]-Kal iumacetat (90a), gelöst in 1 ml Wasser,
1 4wurden mit 41 yl einer Lösung von [1- C] -Natriumacetat in
14 6Wasser, mit einer C-Ativität von 1,776-10 ipm/ml;vermiseht.
Eine Radioaktivitätsbestimmung einer Probe dieses Gemischs
ergab folgendes Resultat:
3H: 2,792-105 ipm/ml , ,.
14-, „., ln4 . . . H/ C = 4,08
C: 6,846-10 ipm/ml
d) Darstellung des entsprechenden p-Phenyl-phenacylacetats (92)
0,45 ml (2,61 ymol) einer 1 - ml-Standardlösung des unter c)
hergestellten Gemischs wurden mit 20,6 mg (0,21 mmol) inakti¬
vem Kaliumacetat (MERCK p.a.) versetzt.
Diese Mischung wurde nach dem auf Seite 177 beschriebenen Stan¬
dardverfahren mit p-Phenyl-phenacylbromid und 18-Crown-6-äther
in Acetonitril umgesetzt. Das chromatografierte Rohprodukt
wurde einmal aus Methylenchlorid umkristallisiert. Das Produkt
in Form weisser Nadeln hatte einen Smp. von 111-112 C.
Die Radioaktivitätsmessung ergab folgendes Resultat:
3H: 2,585-103 ipm/mg
14C: 5.766-102 ipm/mgH/ C = 4'483
- 187 -
Kuhn-Roth-Abbau von [15-3H,2H,]H]-Herqueinonsilyläther (38b)
OCH3
HO^k^OH
38b
R = Si(CH.3 3
CHDTCOOH
a) Herstellung der Oxidationslösung
- 2,10 g Chromtrioxid
- 5,00 ml destilliertes Wasser
- 1,25 ml konzentrierte Schwefelsäure
b) oxidativer Abbau
2,7 mg (6 ymol) [ 1 5-3H,2H, ^J-Si lyl äther (38b) wurden in genau
analoger Weise abgebaut, wie dies mit dem auf Seite 185 festge¬
haltenen Isoprodukt (39b) geschehen war.
Die Titration der gebildeten Essigsäure mit 0,01 N Kalilauge
ergab einen Baseverbrauch von 1,62 ml. Dies entspricht einer
Ausbeute von 90 % bezüglich 3 Aequivalenten Essigsäure.4
Die Aktivität des Abbauprodukts wurde zu 7,432-10 ipm/ ymol
bestimmt.
c) Verschneiden mit [1- C ]-Natriumacetat
6,5,umol [2-3H,2H,1H]-Kaliumacetat (91a) in 0,94 ml destillier-
1 4tem Wasser wurden mit 60 yl einer Lösung von [1- C ]-Natrium-
acetat in Wasser mit einer Aktivität von 1,776-10 ipm/ml ver-
mi seht.
Die Bestimmung der Radioaktivität des Gemischs ergab folgende
- 188 -
Werte: 3H: 5.42-105 ipm/ml ,,.
l4rn no i«5 . , , H/ C: 5,005
C: 1,08-10 ipm/ml
d) Darstellung des entsprechenden p-Phenyl-phenacylacetats (93)
0,35 ml (2,4 ymol) einer 1ml-Standardlösung des unter c) her¬
gestellten Kaliumacetatgemischs wurden mit 20,2 mg (0,21 mmol)
inaktivem Kaliumacetat (MERCK p.a.) verdünnt und nach der
Standardmethode von Seite ins entsprechende p-Phenyl-phena-
cylacetat umgewandelt. Das Rohprodukt wurde an Kieselgel mit
Methylenchlorid chromatografiert. Das chromatografierte Mate¬
rial wurde einmal aus Methylenchlorid umkristallisiert und
hatte einen Smp. von 111-112 °C.
Die Bestimmung der Radioaktivität ergab folgendes Resultat:
3H: 4,073-103 ipm/mg ?,.
14r-7 7S7 in2 iM;,„
H/'^C = 5,230C: 7,787-10 lpm/mg
- 189 -
3 2 1Bestimmung des F-Werts der aus [15- H, H, H ]-Iso/enantio-Iso¬
herquei non-trimethyl si lyl äther 39b stammenden Essigsäure
COOH
ICHDT
-»~ Malat I [Fumarat] -»- Malat II
a) Herstellung der Malatsynthetase-Reaktionslösung
(für 3 ymol Kaliumacetat)
2-1,5 ml Puffer 200 mM CO.
8 mM MgCl2 pH= 8,2
2 mM EDTA
30 yl Dithiothreitol (DTT)
120 yl ATP
90 yl CoA-SH
60 yl Na-Glyoxylat
100 mM
100 mM
10 mM
100 mM
(15,4 mg/ml)
(60 mg/ ml)
(10 mg/ ml)
(11,4 mg/ml)
1,5 ml Malatsynthetase :
15 yl Acetatkinase :
30 yl Phosphotransacetylase:
( 4 U/ml )
(550 U/ml)
(450 U/ml )
3,3 ml Gesamtvolumen
b) Umsetzung von chiralem Kaiiumacetat (90a) mit Malatsynthetase
Die unter a) beschriebene Enzymlösung wurde in einem 25ml-Kol-
ben vorgelegt. Dann gab man 0,55 ml (3 ymol) einer durch Kuhn-
Roth-Abbau* von Iso/enantio-Isoherqueinonsilyläther 39b erhal¬
tenen Kaiiumacetatlösung 90a zu. Das gut verschlossene Gefäss
wurde bei 25 C (Thermostat) während 120 Minuten geschüttelt.
Nach dieser Zeit wurde das Reaktionsgemisch mit 20 mg (0,15
mmol) inaktiver L-Aepfelsäure (MERCK p.a.) verdünnt. Mit einem
Tropfen konzentrierter Perchlorsäure wurde die Lösung auf
pH= 1-2 angesäuert und während 5 Minuten denaturiert. Das
* modifiziert, ausgeführt in verschlossener Ampulle
- 190 -
Gemisch wurde anschliessend über Watte filtriert und so vom
beim Denaturieren entstandenen weissen Niederschlag befreit.
Der Fi 1terrückstand wurde mit 10 ml destilliertem Wasser gewa¬
schen. Filtrat und Waschwasser wurden vereinigt, mit 1,0 N
Natronlauge auf pH= 5 eingestellt und dann auf ca. 5 ml ein¬
geengt. Nun wurde auf pH= 7-8 basifiziert und die Lösung auf
3 ml Endvolumen eingedampft.
c) Reinigung der Aepfelsäure
In einer Säule von 1,5 cm Durchmesser wurde 15 cm hoch Dowex-
1x8 (100-200 mesh) lonentauscher in der Formiatform eingefüllt
Die unter b) beschriebene, wässrige Malatlösung wurde auf
die Säule aufgetragen, mit 150 ml Wasser gewaschen und suk¬
zessive mit je 70 ml 0,25 N, 0,50 N, 0,80 N und 1,0 N wässri¬
ger Ameisensäure eluiert. Ab Zugabe der 1,0 N Ameisensäure
wurden 7 Fraktionen ä je 30 ml gesammelt. Alle Fraktionen
wurden eingedampft und die Rückstände in je 1 ml Aceton ge¬
löst. Von jeder Lösung wurde eine Probe von je ca. 3 yl auf
eine Cel1ulose-DC-Platte (MERCK) aufgetragen und mit einem
Laufmittelgemisch von Aether:Ameisensäure:Wasser = 75:15:10
chromatografiert. Nach gründlichem Trocknen der Platte wurde
diese mit einer Glucose/Ani1in-Lösung besprüht und bei 140 C
während 10 Minuten entwickelt. Alles Malat befand sich laut
DC in den Fraktionen 2-6. Diese wurden vereinigt und einge¬
dampft. Es konnten 24 mg kristallines Pulver gewonnen werden.
Das Rohprodukt wurde in 1,5 ml Wasser aufgenommen (leichte
Trübung), über Watte filtriert, eingedampft und gewogen. Man
erhielt 20 mg Aepfelsäure. Davon wurde eine 1ml-Standardlösung
hergestellt. Dreimal 0,1 ml dieser Lösung wurden zur Bestim¬
mung der Radioaktivität verwendet. Der Durchschnitt der 3
Messungen ergab folgendes Resultat:
3H: 7,310-104 ipm/ml ,,.
14ri 9CC m4 i,.,
H/ '^C = 3,920C : 1 ,865-10 lpm/ml
Die restlichen 0,7 ml der AepfelSäurelösung (14mg, ^0,1 mmol)
- 191 -
wurden mit 0,2 ml 1 N Natronlauge auf pH= 6,5-7,0 eingestellt.
d) Equilibrierung der Malatlösung I mit Fumarase
In einem 10ml-Rundkolben wurden 1,0ml Kaliumphosphat-Puffer
(100 mM, pH= 7,4) und 0,7 ml der unter c) beschriebenen, neu¬
tralisierten Aepfelsäurelösung vorgelegt. In dieses Gemisch
gab man anschliessend 10 yl Fumarase (5mg/ml, 30 U). Das gut
verschlossene Gefäss wurde während 3 Stunden tüchtig bei 25 C
(Thermostat) geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde danach
durch zweimaliges Erhitzen während je ca. lj Minuten auf 90 C
denaturiert.
e) Reinigung des equi1ibrierten Malats II
Eine Ionentauschersäule von 1 cm Durchmesser wurde auf einer
Höhe von 12 cm mit Dowex-lx8 (100-200 mesh),in der Formiatform
vorliegend, gefüllt. Das unter d) erhaltene Gemisch wurde
auf diese Säule aufgezogen, mit 100 ml Wasser gewaschen und
anschliessend mit 1 N Ameisensäure eluiert. Dabei wurden 4
Fraktionen ä je 25 ml gesammelt. Die Lösungen wurden einge¬
dampft, die Rückstände mit je 1 ml Aceton gelöst und je eine
3y1-Probe davon auf eine Cellulose-DC-Platte aufgetragen. Die
Chromatografie und das Entwickeln erfolgten genau wie unter c)
beschrieben. Die Fraktionen 2 und 3 enthielten die gesamte
Menge der verbliebenen Aepfelsäure in einer Ausbeute von ca.
8 mg. Davon wurde eine 1 -ml-Standardl ösung in Wasser herge¬
stellt. Daraus wurden drei Proben ä je 100 yl zur Radioaktivi¬
tätsbestimmung entnommen. Der Mittelwert der drei Messungen
ergab folgendes Resultat:
3H: 3,402-104 ipm/ml , ,.
14r9 -591 Ifl4 inn,/m1
H/ c = ]'465C: 2,321-10 lpm/ml
Aus dem letztgenannten Verhältnis errechnet sich der F-Wert zu
F = 37,4 %
- 192 -
3 2 1Bestimmung des F-Werts von Essigsäure aus [15- H, H, H]-Her
queinon-trimethylsilyläther (38b)
COOH
| »~ Malat I »- [Fumarat] — Malat II
CHDT
a) Herstellung der Malatsynthetase-Reaktionslösung
Es wurde die gleiche Lösung wie beim Umsetzen des chiraien
Acetats von Iso-/enantio-Isoherqueinonsilyläther (39b) (siehe
Seite 185) verwendet.
b) Umsetzung von chiralem Kaliumacetat (91a) mit Malatsynthetase
3,3 ml der auf Seite 185 unter a) beschriebenen Reaktionslösung
wurden in einem 25ml-Rundkölbchen vorgelegt. Dazu gab man
0,5 ml (3,4 ymol) Kaiiumacetatlösung, welche durch Kuhn-Roth-
Abbau aus Herqueinonsilyläther 38b erhalten worden war (ver¬
gleiche Seite 183). Die Behandlung des Gemischs erfolgte analog
derjenigen, welche beim aus der Isoreihe stammenden Acetat (90a)
angewendet worden war (siehe Seite 189).
c) Reinigung des Malats
Auch die Reinigung über Ionenaustauscher erfolgte genau gleich
wie beim entsprechenden Produkt aus der Isoreihe. Nach der
Reinigung wurde aus der gewonnenen Aepfelsäure eine Iml-Stan-
dardlösung hergestellt. Dieser wurden 3 Proben zu je 100yl zur
Bestimmung der Radioaktivität entnommen. Der Durchschnitt
der 3 Messungen ergab folgende Werte:
3H: 1,887105 ipm/ml .
14r-< 0x9 m4 inm/ml
H/'^C = 4,789C: 3,932-10 lpm/ml
0,7 ml der verbliebenen Standardlösung (14 mg, ^0,1 mmol) wur¬
den mit 0,2 ml 1 N Natronlauge auf pH = 6,5-7,0 gebracht.
- 193 -
d) Equilibrierung der Malatlösung I mit Fumarase
Die 0,7 ml der unter c) beschriebenen Standardlösung wurden
mit 1 ml Kaliumphosphatpuffer (100 mM, pH= 7,4) und lOyl Fuma-
raselösung (5 mg/ml, 40 U) gemischt und während 3 Stunden bei
25 C im verschlossenen Reaktionsgefäss equi1ibriert. Nach
dem Denaturieren durch zweimaliges kurzes Erhitzen der Reak¬
tionsmischung auf 90 C wurde das verbliebene Malat II gerei¬
nigt.
e) Reinigung des mit Fumarase equilibrierten Malats II
Die Malatlösung II wurde auf einer Dowex-lx8-Säu1e von 1 cm
Durchmesser wie auf Seite beschrieben chromatografiert.
Man erhielt 9,8 mg gereinigte Aepfelsäure. Diese wurde in
0,4 ml destilliertem Wasser gelöst und zur Radioaktivitätsbe¬
stimmung verwendet. Es wurden 3 Proben ä je 100 yl gemessen.
Die Mittelwerte der 3 Messungen ergaben folgende Resultate:
3H: 7,101 -104 ipm/ml
14C: 4,421-104 ipm/mlH/ C = L60«
Daraus lässt sich ein F-Wert von F = 33,4 % errechnen.
- 194 -
3 2 1Silylierung eines [15- H, H, H ]-Herqueinon/Isoherqueinon-Ge¬
mi schs (1+2) unter nicht epimerisierenden Bedingungen und Iso¬
lierung von enantiomerenreinem Isoherqueinonsilyläther (39b)
OCH3 OCH3
"3 Ö-^-H
39b CHDT
Rr "'^V01^1Herq.: R = CHDT, R£= H
Isoh.: R = H, R2= CHDT
3 2 118,6 mg (50 ymol) [15- H, H, H]-Herqueinon/Isoherqueinon (lb+2b)
wurden in 1 ml absolutem N,N-Dimethylformamid (DMF) gelöst.
Unter Stickstoffatmosphäre gab man dieser Lösung 50 yl (375
ymol; 7,5 Aeq.) Trimethylsilylch1orid (TMSC1) zu. Nach fünfmi¬
nütigem Rühren spritzte man dieser Mischung eine Lösung von
51 mg (750 ymol; 15 Aeq.) Imidazol in 0,5 ml DMF zu. Beim
Erwärmen mit dem Fön während 15 Sekunden bildete sich über dem
Reaktionsgemisch ein feiner weisser Nebel. Nach einer Reakti¬
onsdauer von 15 Minuten gab man nochmals 50 yl (375ymol; 7,5
Aeq.) TMSC1 ins Reaktionsgemisch und rührte während 45 Minu¬
ten bei Raumtemperatur weiter. Danach wurde mit dem Fön noch¬
mals während 20 Sekunden aufgeheizt. Zur Aufarbeitung wurden
in einem Scheidetrichter 30 ml Eiswasser, 3 ml verdünnte Schwe¬
felsäure (5%) und das Reaktionsgemisch vorgelegt. Dazu gab
man 75 ml Aether und schüttelte aus. Die saure wässrige Phase
wurde nochmals mit 50 ml Aether extrahiert und, nun farblos
geworden, verworfen. Die vereinigten Aetherphasen wurden drei¬
mal mit je 25 ml Wasser und einmal mit 25 ml gesättigter Koch¬
salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und
- 195 -
durch Eindampfen vom Lösungsmittel befreit. Man erhielt 19,2
mg (86%) Rohprodukt.
Eine GC-Analyse ergab ein Verhältnis von 59:41 zugunsten des
entsprechenden Herqueinonsilyläthers.
Das Rohgemisch wurde nun auf mit Zitronensäure gepuffertem
Kieselgel chromatografiert: Säulen-0: 1,0 cm; Kieselgel höhe:
30 cm; Druck: 0,15 bar; Laufmittel: Hexan:Essigester = 5:1;
Fraktionengrösse: 7 ml.
Fraktionen Nr. Ausbe jte Produkte
1-4 1,8 mg apolare, unbekannte Produkte
5-6 4,0 mg Isoherquei nonsi lyl äther 3_9b
7-9 4,2 mg Mischfraktionen,mehr Iso-Prod.
10-11 6,4 mg Mischfraktionen.mehr Herq.-Prod.
12-16 2,8 mg Herqueinonsilyläther 38b
1-16 19,2 mg Total: 100 %
[15-3H,2H,1H]-Isoherqueinonsilyl äther 39b
C23H28°7S1 MG: 444'561
Aussehen
Smp
3H
[«]25
oranges Pulver
nicht bestimmt
4,282-105 ipm/mg; 1.904-108 ipm/mmol
+470°
(c= 0,112 in Chloroform)
; 15-3H,2H,1H]-Herqueinonsi lyl äther 38b
C23H28°7Si MG: 444'561
Aussehen
M25
dunkelrote, glasige Masse
C O
4,483-10 ipm/mg; 1,993-10 ipm/mmol
+520°
(c= 0,080 in Chloroform)
- 196 -
F-Wertbestimmung der Essigsäure, welche durch Kuhn-Roth-Abbau
aus Isoherqueinontrimethylsilyläther 39b erhalten wurde
COOH
| p- Malat I - [Fumarat] - Malat II
CHDT
Die Bestimmung des F-Werts der Essigsäure aus enantiomerenrei-
3 2 1nem [15- H, H, H]-1soherqueinonsilyläther (39b) erfolgte in allen
Punkten analog dem auf Seite 185 beschriebenen Verfahren. Es
werden hier nur noch die gefundenen Resultate aufgeführt.
Mittelwert der Radioaktivitätsbestimmung des Malats I nach
der Malatsynthetase-Behandlung:
3H: 1,290-105 ipm/ml , ,.
14r-7 xQ7 in4 inm/ml
H/'\ = 3,797C: 3,397•IU ipm/mI
Nach der Fumarase-Equi1ibrierung ergab sich für di everbl iebene
Aepfelsäure folgendes Resultat aus dem Mittelwert dreier
Messungen:
3H: 7,217-104 ipm/ml ,,.
14C: 2,804-104 ipm/mlH/ C " 2'574
Daraus ergibt sich ein F-Wert von F = 67,8 %
- 197 -
Bestimmung des F-Werts von echt racemischem Acetat (90b)
COOH
rac. -*- Malat I - [Fumarat] Malat II
CHDT
Eine von F. Marti* an unserem Institut hergestellte racemisehe
Essigsäureprobe (90b)wurde wie folgt umgesetzt:3 2 1
Zu 1 ml wässriger (±)-[2- H, H, H ]-Kaiiumacetatlösung (44 ymol
H: 5,234-10 ipm/ymol) wurden 34 yl einer wässrigen [1- C]-
14 3Natriumacetatlösung ( C: 1,776-10 ipm/yl) gegeben. 100 yl des
Gemischs wurden zur Radioaktivitätsbestimmung verwendet. Dabei
ergaben sich folgende Aktivitäten:
3H: 2,282-105 ipm/ml ,.
l4rc CC1 ,n4 • , .
H/ C = 4,103C: 5,561-10 ipm/ml
Weitere 100 yl (4,4 ymol) dieser Standardlösung wurden nach
der auf Seite 185 beschriebenen Methode enzymatisch umgesetzt.
Nach der Behandlung mit Malatsynthetase erhielt man aus drei
Messungen des Malats I folgende Mittelwerte:
3H: 1.681-104 ipm/ml - ,.
l4ra A^n ,n3 / i
H7 C = 3,815C: 4,410-10 ipm/ml
Nach der Equilibrierung des verbliebenen Malats mit Fumarase
ergaben sich bei der zurückgewonnen Aepfelsäure aus 3 Messun¬
gen folgende Mittelwerte der Aktivitäten:
3H: 7,884-103 ipm/ml . ,.
14r, nc, ln3 • / i
H/ C = 1,990C: 3,961-10 ipm/ml
Daraus errechnet sich ein F-Wert von F = 52,165
* F. Marti, Diss. ETH Nr. 7236, (1983)
- 198 -
Einbau von [2- C]-Natriumacetat in Penicillium Herquei
1? + ?5 f»2
Herq.: R^ CH3,R2= H
Isoh.: R = H, R = CH12 3
4 Schrägagarröhrchen mit sporentragenden Penicillium Herquei-
Kulturen wurden mit je 5 ml steriler Raulin-Thom-Lösung (siehe
Seite 134) gefüllt. Daraufhin wurden die Myceloberf1ächen in
den Röhrchen mit einer Impföse aufgekratzt und die entstande¬
nen Sporensuspensionen in einem sterilen Gefäss vereinigt.
Von dieser Sammelsuspension gab man je 10 ml zu zwei 500 ml-
Erlenmeyerkolben, welche mit je 150 ml steriler Raulin-Thom-
lösung gefüllt waren. Direkt nach dem Ueberimpfen verfütterte
14 14man an zwei der Kulturen je 1 ml [2- C]-Natriumacetat ( C:
250 yCi/ml). Dem einen der beiden Kolben gab man am 2. Tag
nach der Ueberimpfung nochmals 1,7 ml derselben Standardlösung1 4
[2- C]-Natriumacetat zu.
Die Kulturen wurden bei 24 C im Dunkeln während 15 Tagen in¬
kubiert. Nach dieser Zeit wurden sie nach der auf Seite 135
beschriebenen Standardmethode aufgearbeitet.
Die mit schwächer aktivem Material gefütterte Kultur (_]_) ergab
2,116 g Trockenmycel, während die mit mehr aktivem Acetat
gefütterte Kultur (2_) 2,133 g lieferte. Die beiden Mycelmassen
wurden in je 200 ml Chloroform unter Stickstoffatmosphäre
suspendiert. Nach 12 Stunden wurden die beiden Gemische fil¬
triert und die Chloroformextrakte auf je einen Drittel des
Volumens eingeengt. Aus der Kultur (J_) gewann man dabei 476 mg
und aus der Kultur {2) 460 mg Rohprodukt.
- 199 -
Zusätzlich konnten aus den Nährlösungen der beiden Kulturen
(_U und (2_) durch Ausschütteln mit je zweimal 150 ml Chloro¬
form 13 mg (]_) und 24 mg (2) Rohprodukt gewonnen werden.
Ausbeute an Rohextrakten total:
Kultur (]_): 489 mg
Kultur (2): 484 mg
Durch Umkristallisation dieser Rohextrakte aus Methylenchlorid
und Hexan konnten in beiden Fällen kristalline Produkte in
ausreichend sauberen Fraktionen gewonnen werden, um damit
weitere Reaktionen durchführen zu können:
Kultur (Yl: 105 mg C: 6,278-104 ipm/mg
Kultur (2): 114 mg C: 3.821-105 ipm/mg
Für die weitere Verarbeitung wurde nur noch Material der höher
aktiven Kultur (2) verwendet.
- 200 -
Silylierung von [ 1 ,3,5,7 ,9,11,13,16 ,18,19-14C]-Herqueinon/Iso-herqueinon 1c+2cmit Dimethylphenylsilylchlorid
OCH OCH
Herq
Isoh.: Rj= H, R2= CHg
Herq.: R = CH,
R = H 46a13 2
Isoh.: R = H, R2= CH3 47a
114 mg (0,306 mmol) aktives Herqueinon/Isoherqueinon-Gemiseh
lc+2cwurden mit 385 yl (2,3 mmol; 7,5 Aeq.) Dimethylphenyl-
silylchlorid (DMPSC1) und 315 mg (4,6 mmol; 15 Aeq.) Imidazol
in 4 ml N,N-Dimethylformamid (DMF) nach der Standardmethode
von Seite 161 umgesetzt. Dabei kam es zu keiner Epimerisierung
am Zentrum 11.
Man erhielt 546 mg rohes Gemisch, welches noch überschüssiges
DMPSC1 und andere Silylverbindungen enthielt.
Dieses Rohprodukt wurde auf mit Zitronensäure gepuffertem
Kieselgel chromatografiert: Säulen-0: 2,0 cm; Druck: 0,25 bar;
Laufmittel: Hexan :Essigester = 5:1; Fraktionengrösse: 10 ml.
Die Fraktionen 34-48 enthielten die beiden gewünschten isome¬
ren Silyläther, allerdings nicht aufgetrennt. Die Fraktionen
wurden deshalb zusammengegeben und zur Trockene eingedampft.
Man erhielt 147 mg (0,290 mmol, 95 %) Gemisch der beiden ge¬
wünschten Silyläther.
Dieses Gemisch wurde ein zweites Mal unter den gleichen Bedin¬
gungen wie oben, allerdings auf einer Säule mit nur 1 cm 0,
chromatografi ert.
Man erhielt 23 mg reinen Isoherqueinonsilyläther 47a und
16 mg reinen Herqueinonsilyläther 46a neben 101 mg Mischprodukt.
- 201 -
[1,3,5,7,9,11,13,16,18,19-]4C]-Isoherqueinon-dimethylphenylsi•
lyläther (47a)
C28H3007Si MG: 506,633
Aussehen
iE
1H-NMR
DC
G£
[«]25
14,
rotes Pulver
wie inaktives Produkt
dito
R,= 0,177 Hexan:Essigester = 6:1
SE-54, 4%.; 21m -0,35mm; Inj./Det.-temp.: 275 °C;
Säulentemp.: 262 °C; tR= 7'35"
+520°
(c= 0,0506 in Chloroform)
53,01-10 ipm/mg
14[1,3,5,7,9,11,13,16,18,19- C]-Herqueinon-dimethylphenylsilyl
äther (46a)
C28H30°7S1 MG: 506'633
Aussehen : rote, nach längerem Stehen kristalline Substanz
wie inaktives Material
di to
R,= 0,155 Hexan:Essigester = 6:1
Gleiche Bedingungen wie Iso-Produkt: tR= 8'00"
iE
'h--NMR
D£
GC
[a25
D
14r
+665 (c= 0,0687 in Chloroform)
51,70-10 i pm/mg
- 202 -
Reduktion eines Herqueinon/Isoherqueinon-Gemischs (1+2 ) mit
Zink in Eisessig
OCH3
HO^^^fs^OH
Herq.: R = CH,R = H
1 3' 2
Isoh.: R = H, R = CH
(±)-10
(+)-Verb.: R = CH,R = H
(-)-Verb.: R = H, R = CH
40 mg (108 ymol) Herqueinon/Isoherqueinon (1+2) wurden in 5 ml
Eisessig gelöst. Unter gutem Rühren gab man 80 mg (1,24 mmol;
11,6 Aeq.) gewaschenen Zinkstaub* zu. Das Gemisch wurde bei
Raumtemperatur während 30 Minuten heftig gerührt. Dabei färbte
sich die rote Suspension bald über braun nach zitronengelb mit
stark blauer Fluoreszenz unter UV-Licht. Das Reaktionsgemisch
wurde filtriert, der Rückstand auf dem Filter mit 8 ml Wasser
gewaschen und dieses zusammen mit dem Filtrat in 10 ml Wasser
gegeben. Dabei bildete sich ein hellgelber, flockiger Nieder¬
schlag. Dieser wurde auf einer Glasfilternutsche vom Wasser
abgetrennt und mit 10 ml IN Salzsäure gewaschen. Der nun senf¬
gelbe Filterrückstand wurde am Hochvakuum getrocknet. Man
erhielt 32 mg (83%) Rohprodukt. Davon wurden 25 mg einmal aus
Aceton umkristallisiert, wobei 15 mg (60%) kristallines Pro¬
dukt anfielen. * siehe nächste Seite unten
(t)-Desoxyherqueinon (Gemisch beider Enantiomeren)(*10)
C20H20°6 : MG: 356'379
Smp 237-239 C
- 203 -
Jj* : (KBr-Pille)
3420, 2980, 2935,2900 (m)-,2875,2840,1 680 (w); 1610(vs);
1560,1490,145 5,1440,1395(m);1380(s);1360(m);1290(vs)
1230,1220,1200(m);l170,1145(s);1100(m);1060(s);1050
1030,995,975,950,915,880,865,850,820,810,800,750(m)
690,650(w);620(m);585,555,540(w).
UV/VIS : (Chloroform; 254(4,25); 263(4,27); 272(4,25); 394
(4,26); 410(4,25).
]H-NMR : 1,326 (s,3H) H3C(19); 1,482 (d,J=6,6 Hz,3H) H3C(15)(300 MHz) 1,565 (s,3H) H3C(18); 2,816 (d,J=0,6 Hz,3H) HjCd);
CHC13 4,091 (s,3H) H C0-C(7); 4,654 (q,J=6,6 Hz.lH) H-
C(16); 5,295 (s.lH) HO-C(?); 6,822 (q,J=0,6 Hz.lH)
H-C(3); ferner: 3,0-7,5 (2H) fehlende HO-C(?).
VnMR : 1,247 (s,3H) H3C(19); 1,432 (d,J = 6,5 Hz,3H) HjC(15);(300 MHz) 1,491 (s,3H) HgC(18); 2,751 (d,J=0,8 Hz,3H) HjCO);DMSO-d, 3,806 (s,3H) H,C0-C(7); 4,663 (q,J=6,5 Hz,lH) H-
b 3
C(16); 6,790 (q,J=0,8 Hz,1H) H-C(3); ferner: 3,0-
5,2 (3 H) H0-C(6), H0-C(8) und HO-C(IO).
MS : 356(M+= 49%),341 (_H)0) ,327(12),323(17),313(9),297(5)
284(4),178(6),163(10),152(3),141(4),139(3), 128(3),
121(4),115(3),43(4),28(11),18(1).
C,H-An : berechnet: C: 67,40 H: 5,65
gefunden: C: 67,29 H: 5,73
DC : Rf= 0,25 Hexan:Essigester = 5:1
[c.]25 : 0°
(c= 0,485 in Essigsäure)
*Käuflicher Zinkstaub wurde mit Salzsaure, Wasser, Methanol, Aceton und
absolutem Aether gewaschen und dann gut getrocknet.
- 204 -
Reduktive Spaltung von Herqueinon/Isoherqueinon-dimethylphenyl •
silyläther46/7 mit Zink in Essigsäure
OCH, OCH,
HON ,OH
Q> ^^^\f°3 4
[ /-v^SiRjR
^v.^SLX ,CH3
CH3 »-,_46+47
/^CH3-TR1R2
Herq. 5 V 3' 2,= H
Isoh. : R1 = H, R2= CH,beide : R = CH„, R„ = c, H
(I)-IO
Herq.: R.^ CH3>Isoh.: R = H, R = CH
6 5
42 mg (83 ymol) eines Silyläthergemischs 46+47 wurden in 5 ml
Eisessig gelöst und unter Stickstoffatmosphäre mit 80 mg Zink¬
staub versetzt. Das heterogene Gemisch wurde während einer
Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Dabei färbte sich die ur¬
sprünglich tiefrote Lösung allmählich zitronengelb. Nun wurde
die Mischung filtriert, der Rückstand auf der Nutsche mit
1 ml Essigsäure gewaschen und das Filtrat, zusammen mit der
Waschlösung, zu 10 ml Wasser gegeben. Dabei kam es zu einer
amorphen gelben Fällung. Unter Stickstoffatmosphäre liess man
dieses Gemisch drei Stunden ruhen. Danach wurde wieder fil¬
triert, wobei ein geringer Teil des gelben Produkts die G-4-
Glasfi1ternutsche passierte. Der Filterrückstand wurde mit
5 ml verdünnter Salzsäure (5%) gewaschen, mit Wasser neutral¬
gespült und getrocknet. Man erhielt 14 mg gelbes Pulver vom
Smp. 233-236°C. Die filtrierte Reaktionslösung wurde mit Chlo¬
roform ausgeschüttelt, die organische Phase über Magnesiumsul-
fat getrocknet und eingeengt. Dies führte nochmals zu 15 mg
gelborangen Festkörpers. Die Ausbeute an Rohprodukt betrug
somit insgesamt 29 mg (98%).
- 205 -
Dieses Rohprodukt wurde auf zitronensäuregepuffertem Kieselgel
chromatografiert: Säulen-0: 1,0 cm; Druck: 0,3-0,5 bar; Lauf¬
mittel: Hexan:Essigester = 5:1; Fraktionengrösse: 5 ml.
Fraktionen-Nr. Ausbeute Produkte
1-8 --- ...
9-12 1,5 mg apolare Produkte
13-24 --- ---
25-36 21,0 mg (t)-Desoxyherqueinon (10)
Das gewonnene Produkt (10) hatte einen Smp. von 237-238 C.
Die spektralen Daten H-NMR, IR, UV, und MS stimmten mit den¬
jenigen des auf Seite 202 beschriebenen Reduktionsproduktes
10 aus Herqueinon/Isoherqueinon \+2_ überein.
- 206 -
Reduktion der [1,3,5,7,9,11,13,16,18,19- \ ]-Silyläther (38b)und
(39b)mit Zink in Eisessig
Herq. : R = CH,R = H Herq. : R = CH
,R = H (+)-10b
R = S i (CH )Isoh. : R = H, R = CH 3
^3;3 Isoh. : R = H, R2= CHg (-)-10b
Das Verfahren wird hier nur am Herqueinon-Abkömmling (38b) be¬
schrieben, erfolgte aber am Isoprodukt (39b_) genau analog.
16 mg (32 ymol) Herqueinon-dimethylphenylsilyläther (38b) wur¬
den in 3 ml Eisessig gelöst und mit 35 mg Zinkstaub versetzt.
Das vorerst orange Gemisch wurde unter Stickstoffatmosphäre
bei Raumtemperatur gerührt. Langsam wurde die Reaktionslösung
heller. Nach 2 Stunden war sie zitronengelb und änderte die
Farbe nicht mehr. Das Gemisch wurde noch während einer zusätz¬
lichen Stunde weitergerührt. Danach wurde das Produkt durch
Filtrieren vom überschüssigen, unlöslichen Zink befreit. Das
Filtrat wurde direkt am Rotationsverdampfer eingeengt. Nach
dem Trocknen des orange-gelben Rückstands am Hochvakuum (3-10
torr) bei 50 °C erhielt man 16,3 mg Rohprodukt.
Dieses wurde auf einer zitronensäuregepufferten Kieselgel Säule
chromatografiert: Säulen-0: 1,0 cm; Druck: 0,2 bar;Laufmittel:
Hexan:Essigester = 5:1; Fraktionengrösse: 7-10 ml.
Alle zitronengelben Fraktionen wurden vereinigt und einge¬
dampft. Man erhielt 10,5 mg (93 %) gereinigtes Produkt, wel¬
ches in IR, H-NMR und UV mit dem inaktiven Produkt (H)) über¬
einstimmte (siehe Seite 202 ).
- 207 -
.
(+)-[1,3,5,7,9,11,13,16,18,19-14C]-Desoxyherqueinon (10b)
C20H20°6
Aussehen
Smp
DC.
ri25
[»In
14,
MG: 356,379
gelbes Pulver
240-241 C
Rf= 0,25 (Hexan:Essigester = 5:1)
+121 (c= 0,486 in Essigsäure)
3,261-10 ipm/mg
(-)-[ 1,3,5,7,9,11,13,16,18,19-14C]-Desoxyherqueinon (10b
C20H20°6 : MG: 356'356
Ausbeute : 13,5 mg (87 %)
Aussehen : gelbes Pulver
Smp : 239-240 °C
D_C : Rf= 0,25 (Hexan:Essigester = 5:1)
[c.]25 : -119°
(c= 0,0128 in Essigsäure)
14r2,29-10 ipm/mg
- 208 -
Einbau von (+)- und (-)-[1,3,5,7,9,11,13,16,18,19-14C]-Desoxy-
herqueinon in Penicillium Herquei; Nachweis der Radioaktivität
in den entsprechenden Silyläthern (38c) und (39c)
OCH3
Herqueinon: R = CH,R = H
Isoherq. Rl= H> V CH3
V Si(CH3>3
V CH3, R2= H
R = H, R = CH,12 3
In einem Paral1elversuch wurden die zwei radioaktiven chiraien
Vorläufer (+)- und (-)-Desoxyherqueinon in P. Herquei einge¬
baut. 3 Tage alte Flüssigkulturen, die nach der auf Seite 133
beschriebenen Standardmethode gezüchtet worden waren, wurden
wie folgt gefüttert:
Kultur Nr. Aktives Material Aceton Tween 80 Wasser
1 (- )-Desoxyherqueinon 11mg 0,5 ml 0,1 ml 1,5 ml
2 (+)-Desoxyherqueinon 7 ,3 mg 0,5 ml 0,1 ml 1,5 ml
3 --- 0,5 ml 0,1 ml 1,5 ml
4,5 --- --- --- ---
Die Kulturen 4 und 5 wurden nicht gefüttert. Alle 5 Kulturen
wurden bei 24 C im Dunkeln inkubiert. Gegenüber den beiden
unbehandelten Kulturen zeigten die 3 gefütterten Organismen
bald eine Veränderung im Wachstum. Wahrscheinlich durch Ab¬
nahme der Oberflächenspannung (Tween 80 ?) kam es am 5. Inku-
- 209 -
bationstag zum Versinken der Myceloberf1ächen in den Nährme¬
dien. Am 7. Tag nach dem Ueberimpfen der Flüssigkulturen kam
es bei den erwähnten Kulturen zu einem neuen Wachstum des
Mycels an der Flüssigkeitsoberfläche. Am 11. Tag verlangsamte
sich das Wachstum bei den 3 Kulturen wieder deutlich. Dagegen
entwickelten sich die Kontrollkulturen 4 und 5 völlig normal.
Nach einer Gesamtinkubationszeit von 25 Tagen wurden die 2
mit aktivem Material gefütterten Kulturen nach dem früher be¬
schriebenen Standardverfahren (siehe Seite 134) aufgearbeitet.
Arbeitsgang (-)-Kultur (+)-Kultur
Isolierung Rohmycel 305 mg 318 mg
Trituration des Mycels mit Hexan,Ein¬
dampfen der Hexanlösung. Rückgewin¬
nung von Fütterungsmaterial
1,2 mg 0,8 mg
Extraktion der Nährlösung mit Chloro¬
form, Eindampfen, Gewinnung von Roh¬
produkt
48 mg 46 mg
Extraktion mit Chloroform des Mycels,
1. Fraktion Rohprodukt96 mg 88 mg
Je eine Probe der Rohprodukte aus der (+)- und der (-)-Reihe
wurden mit Diphenylmethylsilylchlorid (DPMSC1) und Imidazol
in N,N-Dimethylformamid (DMF) ohne weitere Reinigung veräthert.
Eingesetztes Rohprodukt DPMSC1 Imi dazol DMF Ausbeute
33 mg (0,087 mmol) (+)-Prod. 152 mg 120 mg' 2,0 ml 41,5 mg
48 mg (0,013 mmol) (-)-Prod. 222 mg 178 mg 2,5 ni 63,5 mg
Die beiden Rohgemische aus der ( + )- und aus der (-)-Reihe
wurden auf mit Zitronensäure gepuffertem Kieselgel chromato¬
graf iert .
- 210 -
Bei beiden Chromatografien wurden dieselben Bedingungen ange¬
wandt: Säulen-0: 1,0 cm; Druck: 0,25 bar; Laufmittel: Hexan:
Essigester = 5:1; Fraktionengrösse: 5ml.
Die in beiden Reihen isolierten Silyläther wurden zuerst gas-
chromatografiseh und dann auch bezüglich Anreicherung der
14C-Aktivität untersucht. Dabei fand man folgende Resultate:
Produkt GC-Reinheit Radioaktivität
(+)-Herq.silyläther 97,4 % 7,786-103ipm/mg
(-)-Herq.silyläther 95,3 % 4,418-103ipm/mg
(+)-Isoherq.silyläther 98,2 % 1,502-102i pm/mg
(-)-Isoherq.silyläther 98,7 % 8,970-104ipm/mg
Bemerkung: Die Aktivitäten beim Isoherqueinonsilyläther in
der (+)-Reihe und beim Herqueinonsilyläther in
der (-)-Reihe entsprechen ziemlich genau den gas-
chromatografiseh festgestellten Verunreinigungen
durch das andere Isomer.
- 211 -
Die auf den folgenden Seiten aufgeführten Arbeiten beschrei¬
ben zwei misslungene Experimente. Da der Aufwand zur Durch¬
führung recht gross war, und weil gerade auch das Nichtgelin-
gen recht informativ sein kann, werden diese Versuche hier
trotz Versagens kurz beschrieben.
- 212 -
Ozonolyse eines Herqueinon/Isoherqueinon-Gemischs (1+2)
??
nicht identifizier¬
bare Produkte
186 mg (0,5 mmol) Herqueinon/Isoherqueinon-Gemiseh (1+2) wurden
in einer Steilbrustvorlage in 50 ml Chloroform gelöst, mit
Stickstoff gespült und auf -75 C abgekühlt. Bei einer Durch¬
laufmenge von 15 1 Sauerstoff pro Stunde und einer Ozonproduk¬
tion von 40 mmol pro Stunde wurde während 20 Minuten ozoni¬
siert. Dabei kam es zu einem teilweisen Ausfrieren der Reak¬
tionslösung. Nachdem eine DC-Kontrolle ergeben hatte, dass
noch Edukt vorhanden war, gab man 25 ml Methylenchlorid zu.
Unter sonst gleichen Bedingungen wie oben wurde erneut während
15 Minuten ozonisiert. Dabei wurde die ursprünglich tiefrote
Lösung violett, gegen Ende lila und nach Abbruch der Reaktion
grün. Das Reaktionsgemisch wurde nach Ausblasen des Reaktions-
gefässes mit Stickstoff mit einem Ueberschuss von Dimethylsul-
fid reduziert. Dabei wurde die grüne Lösung zuerst gelb und
dann rot. Eine DC-Kontrolle des Endgemischs zeigte nur sehr
polare, uneinheitliche Flecken ("Strassen") erzeugende Pro¬
dukte. Die Umsetzung einer Probe des Rohprodukts mit 2,4-Di-
nitrophenylhydrazin in saurer äthanolischer Lösung ergab keine
isolierbaren Hydrazone. Deshalb wurden die Untersuchungen
auf dieser Stufe abgebrochen.
Herqueinon/Isoher¬
quei non-Gemi seh
- 213 -
Versuch einer sauren Methanolyse an einem Herqueinon/Isoher-
queinon-Gemisch (1+2)
OCH
r>
Herq. : R^ CHg, Rg= H
Isoh. : R = H, R = CH,
41 mg (0,11 mmol) Herqueinon/Isoherqueinon-Gemiseh <i+2_)wurden
in einem 10ml-Rundkölbchen unter Rühren bei 0 C mit 6 ml einer
mit Chlorwasserstoff gesättigten Methanollösung versetzt.
Nach 15 Minuten wurde zur Verfolgung der Reaktion eine DC-
kontrolle durchgeführt. Diese ergab, dass sich noch kein Edukt
umgesetzt hatte. Das Gemisch wurde nun auf Raumtemperatur er¬
wärmt und über Nacht gerührt. Eine DC-Kontrolle ergab das
gleiche Resultat wie die erste. Das Reaktionsgefäss wurde
nun mit einem Rückflusskühler versehen und auf dem Oelbad auf
50°C erwärmt. Dabei ging das bis anhin als Suspension vorlie¬
gende Edukt rasch in Lösung. Nach 20 Minuten wurde die tief¬
rote Lösung mittels DC untersucht. Noch immer hatten sich
keine Produkte gebildet. Das Gemisch wurde am Rotationsver¬
dampfer eingeengt, in 100 ml Chloroform gelöst und gegen 50ml
Wasser ausgeschüttelt. Die Chloroformphase wurde über Mag-
nesiumsulphat getrocknet. Nach Abdesti11ieren des Lösungs¬
mittels erhielt man das Edukt in einer Ausbeute von 85 % un¬
verändert zurück.
- 214 -
Den folgenden Mitarbeitern danke ich für ihre Beiträge zum
Gelingen der vorliegenden Arbeit:
- Herrn Dr. W. Angst
für seine hilfreichen Ratschläge und Diskussionen zu Syn¬
theseproblemen während der Arbeit
- Herrn Dr. B. Martinoni
für die Hilfe bei den enzymatisehen Arbeiten
- Herrn Dr. K. May
für die Radioaktivitätsmessungen (Leitung: Prof. P. Jordan)
- Herrn Dr. J. Schreiber
für die Hilfe bei der Anwendung der Hochdruckchromatografie
- Herrn W. Manser und Herrn D. Manser
für die Durchführung der Mikroanalysen
- Frau L. Golgowski
für die Aufnahme der Massenspektren
(Leitung: Prof. J. Seibl)
- Fräulein B. Brandenberg, Herrn K. Hiltbrunner, Herrn F.
Bangerter, Herrn F. Fehr und Herrn M. Langenauer
für die Aufnahmen der NMR-Spektren (Leitg: Prof. J.F.M. Oth)
- Herrn R. Dohner und Herrn H.U. Hediger
für die Aufnahme von IR-Spektren (Leitung: Prof. W. Simon)
- Herrn Dr. B. Schweizer
für die Röntgenspektralanalyse (Leitung: Prof. J. Dunitz)
- Allen Mitarbeitern der obgenannten Sparten-Chefs sowie dem
Verwaltungspersonal des Organisch Chemischen Instituts ETH.
- 215 -
ZUSAMMENFASSUNG
Im Rahmen von Untersuchungen über den stereochemischen Ver¬
lauf bei SN'-Reaktionen in biologischen Systemen wurden am
Beispiel der Biosynthese von Herqueinon (]_) und Isoherqueinon
(2^) - zwei Metaboliten aus Penicillium Herquei - folgende Re¬
sultate erzielt:
- Die in Penicillium Herquei immer als Diastereomerengemisehe
anfallenden Metaboliten 2 und 1 wurden in der vorliegenden
Arbeit erstmals vollständig getrennt und zwar in Form ihrer
Monosilylätherderivate.
- Die Röntgenstrukturanalyse von racemischem Isoherqueinon-
trimethyl si lyl äther (3_9) gab Aufschluss über die bis anhin
nicht gesicherte relative Konfiguration der beiden asymme¬
trischen Zentren C-11 und C-16 von Isoherqueinon (2).
1 4- Durch Verfüttern von [2- C]-Natriumacetat an P. Herquei
erhielt man radioaktiv markiertes Herqueinon und Isoherque¬
inon, deren Silyläther getrennt und reduktiv zu (+)- bzw.
(-)-Desoxyherqueinon 1 Ob gespalten werden konnten. Durch
Einbau dieser Produkte in P. Herquei wurde gezeigt, dass
( + )-Desoxyherqueinon der direkte Vorläufer von Herqueinon
und (-)-Desoxyherqueinon jener von Isoherqueinon ist.
1 3- Der Einbau von [2- C]-Mevalolacton 55c in P. Herquei führ¬
te zu stereospezifisch markierten Endprodukten J_ und 2_. Mit
Hilfe von NMR-Experimenten gelang der Nachweis, dass sich
1 3die C-Anreicherungen zu über 90% jeweils in der Si-Methyl¬
gruppe am C-17 von Herqueinon und Isoherqueinon befinden.
- Das Verfüttern von (3R,5S) -[ 5-3H, 2H]-Meval ol acton 5_5_e an P.
Herquei lieferte die Metaboliten J^ und 2_ mit je einer chi¬
raien Methylgruppe am Zentrum C-16. Kuhn-Roth-Abbau und an¬
schliessende Acetatanalysen ergaben für Herqueinon die S-
und für Isoherqueinon die R-Konfiguration am jeweiligen Zen¬
trum C-15. Zusammen mit dem Ergebnis der C-Markierungs-
versuche konnten aus diesem Resultat Rückschlüsse auf den
- 216 -
stereospezifischen Verlauf der Alkylierung des Polyketid-
kerns 2_6 mit der noch fehlenden Isopentaneinheit gezogen
werden. Die wahrscheinlichste unter den verbleibenden Vari¬
anten impliziert das intermediäre Auftreten der Zwischen¬
stufe 4 (vgl. Schema unten), welche nach einem anti-Mecha¬
nismus zu den Endprodukten cyclisieren kann. Die Entstehung
dieser Zwischenstufe ist das Ergebnis einer formalen, anti-
verlaufenden S„'-Substitution am AIkylierungsmittel 76b.
Diese Substitution kann mechanistisch sowohl durch eine di¬
rekte C-Alkylierung als auch durch O-Alkylierung gefolgt
von einer Claisenumlagerung gedeutet werden.
- Die erhaltenen Resultate erlauben zudem das Aufstellen ei¬
ner plausiblen mechanistischen Hypothese zur Deutung des
partiellen Identitätsverlusts, welcher in der vorliegenden
Arbeit - wie auch in vielen früheren Fällen - für das C-2
von Mevalolacton bei der biologischen Umwandlung des letz¬
teren in aliphatische und cyclische Terpene nachgewiesen
worden ist.
OCH3 OCH:
- 217 -
SUMMARY
Within the field of investigations about the stereochemical
courseof SN'-reactions in biological Systems some aspects of
the biosynthesis of herqueinone (_1_) and isoherqueinone (2)
- two metabolites from Penicillium herquei - were studied and
the following results were obtained:
- The two di astereomeric metabolites 1_ and 2^ which co-occured
as an so far inseparable mixture in P. herquei have been
separated for the first time after conversion into their
monosilylethers.
- The X-ray analysis of racemic isoherqueinone trimethylsilyl-
ether (Jj)) gave information about the so far unproved rela¬
tive configuration of the two centers C-11 and C-16 of iso-
herqueinone (2_).1 4
- Feeding of [2- C]-sodium acetate to P. herquei gave label-
led herqueinone and isoherqueinone, the silylethers of
which could be separated and cleaved by reduction with zinc
in acetic acid to yield (+)- and (-)-deoxyherqueinone (10b).
The incorporation of these products in P. herquei showed
that ( + )-deoxyherqueinone acts as a direct precursor of
herqueinone whereas (-)-deoxyherqueinone is the precursor
of isoherqueinone.
1 3- Feeding experiments with [2 C]-mevalonol actone, 55c, led
1 3to stereospecif ical ly labelled products 1_ and 2^, the C-
nmr spectra of which showed that the Si-methyl group at
C-17 of both metabolites was enriched to an extent of over
90%.
3 2- Incorporation of (3R,5S)-[5- H, H]-mevalonolactone, 55e, in
P. herquei gave ]_ and 2_, each having a chiral methyl group
at C-16. Kuhn-Roth degradation followed by acetate analysis
demonstrated that the critical methyl group has the S-con-
figuration in herqueinone and the R-configuration in iso¬
herqueinone. From these results, together with the outcome
- 218 -
1 3of the C-labelling experiments, it is possible to draw
conclusions about the stereospecific course of the alkyla-
of the polyketide nucleus with the dimethlallylpyrophos-
phate 76b. Several of the theoretically possible mechanisms
can then be eliminated. The most probable among the remai-
ning possibi1ities implies the participation of the inter-
mediate 4_ (see scheine), which can cyclise by an anti mecha-
nism to the endproducts ]_ and 2_. The formation of this
intermediate is the result of a formal anti S„'-Substitu¬
tion of the alkylating reagent 76b. This Substitution may
be mechanistical1y explained by a direct C-alkylation or by
an O-alkylation followed by a Claisen rearrangement.
The results obtained in the present work have led to the
developement of a mechanistical ly plausible hypothesis to
explain the partial identity loss for C-2 of mevalonolac-
tone on its way to aliphatic and cyclic terpenes.
Scheme
OPP
D
T
CH30
HO_XrNwOH
- 219 -
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- 228 -
LEBENSLAUF
Am 26. März 1950 wurde ich als ältestes von drei Kindern
des Hans und der Hedwig Hostettler-Beyeler in Bern geboren.
Nach dem Besuch von vier Jahern Primarschule in Zollikofen/
BE trat ich im Jahr 1961 ins städtische Progymnasium in Bern
ein. Nach vier Jahren wechselte ich ans städtische Realgym¬
nasium über, dessen Lehrgang ich im Jahr 1969 mit der Matura
Typus C abschloss.
Nach einigen Monaten Praktikum in der Chemischen Industrie
und nach Absolvieren von 72 Wochen Militärdienst immatriku¬
lierte ich mich im Herbst 1971 an der Abteilung für Chemie
der ETH in Zürich. Im Herbst 1976 schloss ich mein Studium
mit dem entsprechenden Diplom ab.
Seit Januar 1977 arbeitete ich in der Forschungsgruppe von
Prof. Dr. D. Arigoni an der vorliegenden Dissertation. Die
Arbeit wurde durch weiteren Militärdienst und eine schwere
Krankheit während insgesamt zwei Jahren unterbrochen. Von
1979 bis 1983 war ich zudem als Assistent des Organisch Che¬
mischen Praktikums tätig.
Zürich, im Februar 1984 Bernhard Hostettler
