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Research Collection
Doctoral Thesis
Untersuchungen zur quantitativen Mikroskopie vonDrogenpulvern
Author(s): Behringer, Claudius Andreas
Publication Date: 1963
Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-000095040
Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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ETH Library
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Prom. Nr. 3343
Untersuchungenzur quantitativen Mikroskopie
von Drogenpulvern
Von der
EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN
HOCHSCHULE IN ZÜRICH
zur Erlangung
der Würde eines Doktors der Naturwissenschaften
genehmigte
PROMOTIONSARBEIT
vorgelegt von
Claudius Andreas Behringer
dipl. Pharmazeut E. T. H.
deutscher Staatsangehöriger
Referent: Herr Prof. Dr. H. Flück
Korreferent: Herr Prof. Dr. P. Speiser
Juris-Verlag Zürich
1963
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meiner lieben Frau
und
meiner lieben Familie
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INHALTSVERZEICHNIS
I. EINLEITUNG 9
1. Wahl des Themas 9
2. Aufgaben der quantitativen Drogenanalyse 9
3. Methoden der quantitativen Drogenanalyse 10
3.1 Chemische Analyse 10
3.2 Analyse durch mechanisches Auftrennen mit Pinzette und Lupe 11
3.3 Analyse mit Hilfe von Luftsichtern 11
3.4 Analyse durch Sedimentation oder Flotation 11
3. 5 Analyse durch Schätzung 12
3.6 Analyse durch Zählen oder Messen einzelner Teile 12
4. Quantitative Analyse von Drogenpulvern mit dem
Mikroskop durch Zählen oder Messen von Pulverteilen 16
4.1 Vorbereitung der Drogenpulver zur Messung 16
4.1.1 Färbung 16
4.1.2 Suspendierung 16
4.1.3 Verwendung von Zählkammern 17
4.1.4 Lycopodiummethode nach Wallis 18
4.1.5 Lycopodiumverreibung nach Haller 20
4.2 Zählmethode 21
4. 3 Flächenmessmethoden 22
4.3.1 Projektionsmethoden 22
4.3.1.1 Planimeter 22
4.3.1.2 Wägemethode 23
4.3.1.3 Messung mit Millimeterpapier 24
4.3.1.4 Zeiss-Teilchengrössen-Analysator nach Endter TGZ 3 24
4.3.2 Methoden, bei denen die Messung mit Hilfe von Zusatz¬
geräten im Mikroskop selbst erfolgt 25
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4.3.2.1 Messung "mittlerer Durchmesser" 25
4.3.2.2 Lochlehren nach Fairs 26
4.3.2.3 Integrationstisch 26
4.3.2.4 Automatische Methoden 28
4.3.2.5 Punktzählverfahren 30
4.4 Analysenfehler 34
4.4.1 Zufallsbedingte Fehler 34
4.4.2 Systematische Fehler 34
4.4.2.1 Fehler bei der Stichprobenentnahme 35
4.4.2.2 Veränderungen der Messelemente durch und
während der Messung 36
4.4.2.3 Beobachtungsfehler 37
II.EIGENE UNTERSUCHUNGEN 38
5. Arbeitsplan 38
6. Eigene Untersuchungen 38
6.1 Auswahl der Analysenmethoden 38
6.1.1 Vergleich der Lycopodiummethode mit der Zähl¬
kammermethode 39
6.1.2 Spezielle Untersuchungen für die Zählkammermethode 48
6.1.2.1 Prüfung der Homogenität der Suspensionen 48
6.1.2.2 Prüfung auf Zufälligkeit der Partikelver¬
teilung in einer Zählkammer 54
6.1.3 Spezielle Untersuchungen für die Lycopodiummethode 58
6.1.3.1 Bestimmung der Lycopodiumzahl 58
6.1.3.2 Korrelation zwischen Messelementen und
Anzahl Lycopodiumsporen 60
6.1.4 Auswahl des Flächenmessverfahrens für die Flächen-
messmethode 62
6.1.4.1 Planimeter 62
6.1.4.2 Wägemethode 62
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6.1.4.3 Zeiss-Teilchengrössen-Analysator 63
6.1.4.4 Integrationstisch 64
6.1.4.5 Punktzählverfahren 64
6.1.4.6 Ergebnisse 64
6.1.5 Untersuchung über den Einfluss der Flächenform auf
die Ergebnisse des Punktzählverfahrens 67
6.2 Bestimmungen mit der Zählmethode 71
6.2.1 HerbaSabinae 71
6.2.2 Fructus Anisi 72
6.2.3 Amylum Cannae 73
6.3 Bestimmungen mit der Flächenmessmethode 76
6.3. 1 Fructus Anisi 76
6.3.2 Semen Sinapis 80
6.3.2.1 Messung mit dem Planimeter 82
6.3.2.2 Messung nach dem Punktzählverfahren 87
6.3.2.3 Vergleich der Messungen mit dem Planimeter
und nach dem Punktzählverfahren 88
7. Besprechung der Ergebnisse 89
7.1 Untersuchungen zur Auswahl der Analysenmethode 89
7.2 Bestimmungen mit der Zählmethode 90
7.3 Bestimmungen mit der Flächenmessmethode 90
in. ZUSAMMENFASSUNGEN 92
8.1 Zusammenfassung 92
8.2 ResumS 92
8.3 Summary 93
IV. LITERATURVERZEICHNIS 94
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VORWORT
Die vorliegende Arbeit wurde in der pharmakognostischen Abteilung des pharma¬
zeutischen Institutes der Eidgenössischen Technischen Hochschule unter der Leitung
von Herrn Prof. Dr. H.Flück ausgeführt.
Meinem geschätzten und lieben Lehrer, Herrn Professor Dr. H . Flück, möchte
ich an dieser Stelle meinen herzlichen Dank aussprechen: Er regte mich zu dieser
interessanten Arbeit an und stand mir stets mit seinem wertvollen Rat zur Seite.
Meiner lieben Frau danke ich für ihre Hilfe bei den Korrekturarbeiten und für
ihr stetes und verständnisvolles Interesse.
Ausserdem danke ich für ihre Unterstützung in Spezialfragen: Herrn Prof. Dr.
Le Roy und Herrn Prof. Dr. Linder,beide an der ETH Zürich, Herrn H
. Bremer,
Heidenheim/Brz., Fräulein Dr. P.Scott, Zürich, und meinen Kollegen im pharma¬
zeutischen Institut der ETH.
Die nachstehenden Firmen haben mir freundlicherweise Versuchs- oder Dokumen¬
tationsmaterial zur Verfügung gestellt, wofür ich hier danken möchte:
Firma G. Coradi A. G., Zürich, Firma Degussa, Deutsche Gold- und Silber-
Scheideanstatt vormals Roessler, Konstanz, Firma Dixa, St. Gallen, Firma Rank
Cintel Ltd., London (vertreten durch Firma Silectra - G. Glatz & Co. Zürich),
Firma Siegfried A. G., Zofingen, Firma Carl Zeiss, Oberkochen.
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I. EINLEITUNG
1. Wahl des Themas
Seit den Arbeiten von Hall er (1) über Flos Chamomillae, Folium Thymi,
Herba Absinthii, Herba Majoranae, Herba Sabinae und Rhizoma Valerianae, sind
unseres Wissens auf dem Gebiet der quantitativen Mikroskopie von Drogenpulvern
keine grösseren Arbeiten mehr vorgenommen worden. Und dennoch ist die Methode
nicht als veraltet zu betrachten, spielt sie doch in anderen Disziplinen, wie z. B.
in der Petrographie, eine sehr bedeutende Rolle. Sie ist ferner unbedingt notwendig
für die quantitative Analyse von Drogenpulvermischungen der Konkurrenz, für foren¬
sische Zwecke, zur Prüfung auf Preiswürdigkeit usw.; ausserdem wird sie in den
Pharmakognosiekursen am Pharmakognostischen Institut der Eidgenössischen
Technischen Hochschule von Studenten recht erfolgreich angewandt.
Die quantitative Mikroskopie ist vielleicht gegenüber anderen analytischen Ver¬
fahren, wie etwa der Papierchromatographie, in der Pharmakognosie etwas in den
Hintergrund getreten, weil über sie keine exakten, zahlenmässigen Angaben hin¬
sichtlich ihrer Genauigkeit und Anwendbarkeit vorlagen. Es handelt sich hier um
ein statistisches Problem, und Mathematik liegt den meisten Pharmazeuten - den
Autor eingeschlossen - nicht besonders. In den letzten Jahren sind jedoch einige
Bücher über Statistik speziell für Nicht-Mathematiker (2, 3, 4) erschienen, die auch
ihm die Statistik verständlich machen.
Auf Grund eigener Arbeiten mit Anis, stellten wir das Bedürfnis für eine kri¬
tische Betrachtung der quantitativen mikroskopischen Messverfahren fest und ent¬
schlossen uns zur vorliegenden Arbeit.
2. Aufgaben der quantitativen Drogenanalyse
Die quantitative Drogenanalyse erfolgt aus zweierlei Gründen: Man möchte
die Zusammensetzung einer fremden Drogenmischung ermitteln oder man will fest¬
stellen, ob eine Droge mit Boden- oder fremden Pflanzenbestandteilen unabsicht¬
lich oder absichtlich verunreinigt worden ist, d. h. ob sie den Vorschriften der
Pharmakopoee entspricht.
Bei Ganzdrogen ist diese Feststellung verhältnismässig einfach, wenn es sich
jedoch um feingeschnittene oder gepulverte Drogen handelt, wird die Analyse sehr
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schwierig; grosse Apotheken zogen es früher deshalb häufig vor, die Drogen als
Ganzdroge einzukaufen und selbst zu pulverisieren, eine Praxis, die auch heute noch
von den Drogengrosshändlern befolgt wird. Die Gefahr, verfälschtes Drogenpulver
einzukaufen, hat in unseren Tagen eher abgenommen, sofern man sich bei vertrau¬
enswürdigen Drogengrossisten bedient, besteht aber nach wie vor noch Für die Ana¬
lyse von Drogenpulvergemischen jedoch hat die quantitative Drogenanalyse ihre gan¬
ze Bedeutung behalten: Es handelt sich hierbei um die Kontrolle der Deklarationen
von Heilmitteln, Gewürzmischungen, Teeportionenbeuteln und anderen, ähnlichen
Produkten und um die Frage nach der Preiswürdigkeit.
3. Methoden der quantitativen Drogenanalyse
3.1 Chemische Analyse
Die chemische Analyse von Drogen wird sehr häufig angewendet; sie ist für
sehr viele Drogen auch in den Pharmakopoeen vorgeschrieben. Die mikroskopische
Betrachtung des Analysenpulvers kann dadurch jedoch nicht ersetzt werden und die
chemische Analyse ist nicht in allen Fällen anwendbar. In Pulvergemischen können
nur Komponenten einzeln bestimmt werden, deren Inhaltsstoffe chemisch hinreichend
voneinander verschieden sind, z. B. sind Folium Thymi und Herba Serpylli chemisch
sehr schwer zu unterscheiden, da beide ätherisches Oel mit phenolischen Körpern
enthalten.
Die chemische Analyse ist ferner nicht anwendbar, wenn der zu bestimmende
Pulveranteil kaum einen spezifischen, leicht bestimmbaren Stoff enthält, wie z. B.
bei der Analyse des Kakaoschalenanteiles in Schokolade (5,6, 7).
Es kommen auch Fälschungen vor, bei denen Gemischen aus Droge und Füllstoff
oder bereits extrahierter Droge genau die Menge an billigem synthetischem Wirk¬
stoff zugesetzt wird, um bei einer eventuellen chemischen Analyse den deklarierten
Wirkstoffgehalt zu erzielen. Die reine chemische Analyse genügt hier nicht, um die
Fälschung aufzudecken.
Bei der Analyse mit dem Mikroskop durch Zählen oder Messen ist die Chemie
jedoch oft beteiligt, indem bei der Herstellung der Präparate Substanzen chemisch
so verändert werden, dass sie bei der Messung nicht mehr stören oder Messelemen¬
te besser sichtbar werden lassen: Gewebe werden entfärbt oder gefärbt, Stärke wird
hydrolysiert, Eiweiss gelöst oder sogar die ganze Droge, ausser den Faserbestand-
teilen,aufgelöst (Bestimmung der Rohfaser) (8).
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3. 2 Analyse durch mechanisches Auftrennen mit Pinzette und Lupe
Teegemische werden normalerweise zur Analyse unter der Lupe mit der Pin¬
zette mechanisch in ihre Bestandteile aufgetrennt (9); bei groben Pulvern müsste
dazu das Mikroskop zu Hilfe genommen werden und es wäre sehr viel Arbeit erfor¬
derlich.
3. 3 Analyse mit Hilfe von Luftsichtern
Luftsichter werden schon seit langer Zeit vor allem in der Zement- und kera¬
mischen Industrie verwendet. Die Apparate arbeiten nach dem Stokes 'sehen Ge¬
setz; praktisch wird das Analysenpulver in ein langes Rohr gebracht und von unten
Luft hindurchgeblasen. Ab einer bestimmten Feinheit übertrifft die Geschwindigkeit
der aufsteigenden Luft die Fallgeschwindigkeit der Partikel und die Teilchen werden
aus dem Rohr getragen. Die Luftgeschwindigkeit wird, mit geringen Geschwindig¬
keiten beginnend, stufenweise erhöht, und das Pulver so nach Korngrössen-Klassen
aufgetrennt (10). Nach Roller (11) entstehen dabei sehr homogene Fraktionen.
Soweit uns bekannt, wurde die Luftsichtung zur quantitativen Analyse von Dro¬
genpulvern bisher noch nicht verwendet. Interessant erscheint die Möglichkeit, ein
Pulver nach Grössenklassen aufzutrennen und dann jede Grössenklasse für sich nach
verschiedenen Methoden oder, bei mikroskopischer Analyse, mit verschiedenen Ver-
grösserungen zu untersuchen. In gleicher Weise könnten von einem gegebenen Pul¬
ver, Teilchen, die die quantitative mikroskopische Untersuchung stören würden,
abgetrennt werden.
3.4 Analyse durch Sedimentation oder Flotation
Bei Flotation und Sedimentation gilt ebenfalls das Stokes 'sehe Gesetz. Wäh¬
rend bei der Schlämmanalyse, wie bei der Luftsichtung, das Medium bewegt wird,
wobei die Luft durch verschiedene Flüssigkeiten ersetzt wird, ist bei der Sedimen¬
tation bzw. Flotation das Medium stationär und die Partikel bewegen sich, je nach
ihrer Dichte, verschieden schnell nach unten oder oben (10,12,13,14,15).
Whymper (6) beschreibt verschiedene Flotationsmethoden, um Kakaoscha¬
len von der Kakaomasse zu trennen. Von diesem Fall abgesehen, haben wir in der
Literatur keine Verwendung dieser Methode in der Pharmakognosie feststellen
können.
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Wie auch die Luftsichtung, Messen sich Sedimentation und Flotation zur Anrei¬
cherung der Messelemente oder zur Trennung nach Partikelgrösse verwenden.
3. 5 Analyse durch Schätzung
Das Schätzungsverfahren wird vorzugsweise in der Metallindustrie verwendet,
wo es auf schnelle Analysen ankommt, ohne dass sehr hohe Genauigkeit verlangt
wird (16,17): Es werden Proben mit verschiedenen Mischungsverhältnissen und dar¬
aus, unter Standardbedingungen, mikroskopische Präparate hergestellt, von denen
Mikrophotographien oder Dauerpräparate aufgehoben werden. Vom Analysenpulver
wird ebenfalls und unter denselben Standardbedingungen ein mikroskopisches Prä¬
parat angefertigt, das mit den Standardbildern verglichen und nach visuellen Krite¬
rien einem Intervall zugeordnet wird.
Wenn die Methode auch nur geschätzte Werte liefert, so dürfte sie für Zwecke
der Pharmakopoee doch in speziellen Fällen nützlich sein: Bei den Gehaltsanalysen
der Pharmakopoee soll im allgemeinen ja in erster Linie nur festgestellt werden,
ob der Gehalt eines mikroskopisch differenzierbaren Präparates über oder unter
einem bestimmten Grenzwert liegt; je nachdem wird das Pulver angenommen oder
verworfen.
3.6 Analyse durch Zählen oder Messen einzelner Teile
Die meisten Drogen stellen Aggregate verschiedener Gewebe dar und nur eini¬
ge dieser Gewebe sind für die betreffende Droge charakteristisch; bei der Analyse
von Gemischen mehrerer Drogenpulver kann daher der grössere Teil an Gewebe¬
substanz nicht einer bestimmten Droge zugeordnet werden.
Schon zu Beginn der quantitativen mikroskopischen Analyse in der Pharma¬
kognosie wurde bei der Analyse von Drogenpulvern deshalb versucht, statt der ge¬
samten Drogenmasse, nur bestimmte, charakteristische Gewebe derselben zu zäh¬
len oder zu messen und zur Gesamtmasse in Beziehung zu setzen. Man zählte Spalt¬
öffnungen, Haare, Pollenkörner, Stärkekörner, Steinzellen oder mass die Fläche
bestimmter Gewebestückchen, wie z. B. der Epidermis, aus (18). Es wird dabei
aber ein einigermassen konstantes Verhältnis dieser charakteristischen Teile, die
man nach Meyer (19) "Messelement" nennt, zur Drogenmasse, die sie repräsen¬
tieren, vorausgesetzt; leider ist diese Voraussetzung meist nicht erfüllt, und zwar
von Natur aus, weil Rasse, Standort, ontogenetische Entwicklung und Jahrgang das
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Verhältnis des Messelementes zur Gesamtdroge zum Teil stark beeinflussen (z. B.
Grösse der Oberfläche, Behaarung). Es können also nur Durchschnittswerte fest¬
gestellt werden. Timmermann (20) berichtet z. B. über sehr grosse Schwankun-
2gen in der von ihr bestimmten Anzahl Spaltöffnungen pro mm bei verschiedenen
Datura-Arten, sodass eine Unterscheidung mit dem Spaltöffnungsindex nicht möglich
war.
Häufig wird argumentiert, dass dies Verfahren wesentlich ungenauer ist, als
andere analytische Methoden. Das ist zweifellos der Fall, doch haben genauere Ana¬
lysen bei den grossen Schwankungen, die in der Zusammensetzung des pflanzlichen
Ausgangsmaterials auftreten, gar keinen Sinn und es wird dabei auch sehr viel Zeit
verloren (21). Da die mikroskopische Analyse das Material unmittelbar misst, sind
ganz grobe Fehler dagegen nahezu ausgeschlossen.
Die geschichtliche Entwicklung der Methode wird von Hoch (18) erschöpfend
beschrieben. Die Methode der Flächenmessung betreffend, möchten wir ergänzen,
dass die ersten quantitativen Bestimmungen auf Grund von Flächenmessungen von
Geologen bzw. Petrographen versucht wurden: Del esse (22) stellte 1847 die Regel
auf, dass "auf einer ebenen Schliffläche eines gleichmässig zusammengesetzten
Gesteines sich die Summe der in der Schnittebene liegenden Flächenanteile der ein¬
zelnen Mineralkomponenten, so wie die Summe ihrer Volumina in dem gemengten
Gesteine verhält". Die sich daraus ergebende neue Methode der Gesteinsanalyse
konnte sich nur sehr mühsam einführen, weil eine einwandfreie mathematische Be¬
gründung fehlte.
1898 ersetzte Rosiwal (23) die in der Praxis umständliche Flächenmessung
durch eine Streckenmessung: Ueber den Gesteinsschliff wird ein System paralleler
Linien gezogen. Die Summen der Strecken innerhalb der zu messenden Flächen sind
den Flächen proportional. Die Methode wurde von Shand, Wentworth und Hurl-
but weiterentwickelt und wird heute noch in den sog. Integrationstischen z. B. von
der Firma Zeiss angewandt.
1933 vollzieht Glagole v (24, 25, 26) den letzten Schritt in der Vereinfachung
der Flächenmessung, die Streckenmessung wird durch Punktezählungen ersetzt:
Ein Punktegitter wird auf den Schliff gelegt und die Punkte innerhalb der verschiede¬
nen Teilflächen gezählt; die Punktsummen sind den Teilflächen proportional.
In der Pharmakognosie verwendet Hart 1919 (27) erstmals die Flächenmess-
methode, um den Anteil von Pfefferkornschalen in gemahlenem Pfeffer zu bestim¬
men.
1933 werden von Wallis und Saber (28) Flächenmessungen an verschiede¬
nen Blattepidermen vorgenommen. In den folgenden Jahren erscheinen einige Ar-
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beiten von Saber (29,30,31,32), der die aufgeworfenen Probleme weiter verfolgt.
1946 entwickelt Haller (1) für die Pharmakopoee quantitative Bestimmungsverfah¬
ren für Flos Chamomillae, Folium Menthae, Folium Thymi, Herba Absinthü, Herba
Majoranae und Rhizoma Valerianae, die auf der Flächenmessung bestimmter Organe
beruhen.
Die quantitative Pharmakognosie interessiert sich, neben den Zählverfahren,
für die Analyse mittels Flächenmessung, weil eine grössere Anzahl Drogen keine
für das Zählverfahren geeignete Messelemente besitzt. Als Messelement dient nun
die Fläche gewisser Organe, die zur Gesamtmasse der Droge in einem bestimmten
Verhältnis stehen sollen. Die Flächenmessung erschwert die Bestimmung technisch,
doch hat sie den Vorteil, dass die Messelemente, die bei ihr verwendet werden
(Blattepidermis, gewisse im Innern der Droge lokalisierte Zellagen), nicht so stark
von den Umwelteinflüssen abhängig sind, wie die Messelemente, die sich zum Zäh¬
len eignen (Haare, Spaltöffnungen u. ä.). Allerdings müssen auch hier die Fehler¬
möglichkeiten nicht ausser Acht gelassen werden, die entstehen können, wenn Ober¬
flächen mit Volumen in Beziehung gesetzt werden: Da die Oberfläche einer Kugel
mit ihrem Volumen nicht in linearem Verhältnis steht, spielt z.B. bei Früchten und
Samen die Korngrösse bei der Verwendung von Flächen als Messelemente in der
quantitativen Mikroskopie eine Rolle. Aenderungen in der Form (Kugel - Ellipsoid)
haben ebenfalls Einfluss auf das Verhältnis.
Es können nur Organe als Messelement Verwendung finden, die eine wohlde¬
finierte Zellschicht ausbilden (an der Zellform, natürlichen Färbung oder Färbung
mittels besonderer Reagenzien erkennbar). Häufig werden Zellschichten ausgemes¬
sen, die nur eine Zelle dick sind, z. B. Blattepidermis oder Steinzellschicht der
Samenschale von Semen Sinapis. Hier treffen wir auf einen wesentlichen Unterschied
der Flächenmessmethode in der Pharmakognosie gegenüber der in der Petrographie:
Bei Gesteinsmessungen wird die Fläche in sich homogener Teile bestimmt, die sich
durch verschiedene physikalische oder chemische Eigenschaften (Färbung, Bre¬
chungsindex, chemische Farbreaktionen) voneinander unterscheiden. Die Unter¬
scheidung ist bei den heutigen Mitteln der Mikroskopie praktisch von der Korngrösse
unabhängig. Bei biologischem Material dagegen sind die Teilflächen aus Zellen zu¬
sammengesetzt und haben eine spezielle Struktur. Die Flächenmessung ist hier nur
eine verkürzte Methode für das Auszählen der Einzelzellen. Wenn die Zellen des
Messelementes nicht von Natur aus gefärbt sind oder spezielle Stoffe enthalten, die
eine Farbreaktion ermöglichen, was eher selten ist und bei der Analyse auf Ver¬
fälschungen auch nur mit Vorbehalt ausgenutzt werden darf, hängt die Messung da¬
von ab, dass die Teilflächen an ihrer speziellen Struktur als solche identifiziert
werden können. Technisch wird die Analyse damit weiter erschwert: Ist das Dro-
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genpulver zu fein, so sind die Zellen weitgehend zerstört und nicht mehr zu identifi¬
zieren. Bei grobem Pulver hingegen ist häufig das Messelement noch zu wenig von
den umgebenden Geweben abgetrennt und die Begrenzungen der Flächenstücke sind
optisch schwer festzulegen. Es kommt hinzu, dass in der Statistik die Ergebnisse
umso genauer sind, je repräsentativer eine Stichprobe ist, d.h. je gleichmässiger
das Messelement im untersuchten Präparat verteilt ist, was bei feinen Pulvern na¬
türlich eher gegeben ist. Die ideale Pulverkörnung wäre diejenige, in der die Zellen
des Messelementes einzeln, aber intakt, und somit wohl identifizierbar enthalten
wären. Da die als Messelement verwendeten Zellen durchschnittlich gleiche Dimen¬
sionen haben, wäre eine Flächenmessung bei einem derartigen Pulver sinnlos, das
Zählverfahren wäre rationeller.
Praktisch findet man in einem Drogenpulver das Messelement nebeneinander
in der Form des Zellverbandes, der Einzelzelle und der Zelltrümmer (die nicht
mehr erfasst werden können). Je nach Droge, Zerkleinerungsverfahren und Einstel¬
lung der Pulvermühle (= Feinheit des Pulvers) wechseln die Anteile dieser Kompo¬
nenten. Wenn die Pulverisierung nicht bis in die Details normiert wird, entstehen
dadurch neben den üblichen, zufallsbedingten statistischen Streuungen, weitere,
systematische Fehler, die beträchtliche Ausmasse annehmen können.
Von Chamot-Mason (33) wird empfohlen, die Zählung oder Flächenmes¬
sung mehrerer Messelemente miteinander zu kombinieren: Alle quantitativ erfass¬
baren Elemente eines Pulvers sollen gemessen und ins Verhältnis gesetzt werden.
Die Statistik zeigt Wege (34), um die Messfehler durch Berücksichtigung mehrerer
Messzahlen weiter herabzusetzen.
Die quantitative Analyse von Drogenpulvern mit dem Mikroskop umfasst zwei
Arbeitsgebiete:
1. Die Suche eines geeigneten Messelementes für eine bestimmte Droge und die Be¬
stimmung seiner Kennzahl, das ist, die Häufigkeit seines Vorkommens in einem
Gramm Droge.
2. Die Analyse von Drogenpulvergemischen mittels der gefundenen Kennzahl.
In der vorliegenden Arbeit befassen wir uns hauptsächlich mit der Bestim¬
mung der Kennzahl.
Im Prinzip vollzieht sich die Messung folgendermassen: Ein mikroskopisches
Präparat des reinen Drogenpulvers wird unter das Mikroskop gebracht und die
Messelemente oder die Messflächen werden gezählt oder deren Fläche ausgemes¬
sen. Das Problem ist dabei, jeweils auch zu bestimmen, wieviel Drogenpulver be¬
trachtet wurde und hierin unterscheiden sich die Methoden der verschiedenen Auto¬
ren: Während eine Gruppe die Messung in Zählkammern, ähnlich der Hämocytome-
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ter, vorzieht, hat eine andere Gruppe ein Verfahren entwickelt, bei dem sie dem
Drogenpulver eine bestimmte Menge Lycopodiumsporen, sozusagen als quantitatives
Leitelement, beimischt und an Hand ihrer jeweiligen Anzahl im Gesichtsfeld auf die
gemessene Drogenpulvermenge schliesst.
4. Quantitative Analyse von Drogenpulvern mit dem Mikroskop
durch Zählen oder Messen von Pulverteilen
4.1 Vorbereitung der Drogenpulver zur Messung
4.1.1 Färbung
Auch wenn im Mikroskop die Messelemente gut erkannt werden können, emp¬
fiehlt Chamot Mason (35) doch ein Anfärben, um zweifelhafte Diagnosen auszu¬
schalten. Silverman und Dünn (36) beschreiben eine von ihnen erprobte Metho¬
de mit Bismarck-Braun. Mellors und Silver (37) behandeln das Analysenpul¬
ver mit Fluorochromen und vermessen die Präparate im Fluoreszenzmikroskop. In
speziellen Fällen kann auch die Verwendung von polarisiertem Licht die Identifika¬
tion erleichtern, z. B. bei Stärkekörnern oder Fasern.
Häufig besitzen die Messelemente jedoch keine speziellen Inhaltstoffe, die an¬
gefärbt werden könnten, und man muss sich darauf beschränken, den Kontrast
durch Variierung des Brechungsindexes des Einbettungsmittels, durch Dunkelfeld¬
beleuchtung oder durch Phasenkontrast möglichst gross zu gestalten. In jedem Fall
erfordert die mikroskopisch quantitative Untersuchung von Drogenpulvern eine ge¬
naue Kenntnis der Zell- und Gewebeformen des Pulvers jeder einzelnen Droge.
4.1.2 Su spendier ung
Bei der mikroskopischen Analyse von Drogenpulvern werden nur sehr kleine
Substanzmengen gemessen, die sich in der Grössenordnung von Milligrammen be¬
wegen. Das genaue Abwägen derart geringer Substanzmengen stellt apparative Prob¬
leme; sehr früh wurde das Analysenpulver deshalb in Form einer Suspension ver¬
dünnt, was das Abwägen der hundertfachen oder tausendfachen Menge für eine Ana¬
lyse gestattete. Ausserdem wird zur Herstellung einer Suspension eine wesentlich
grössere und damit repräsentativere Stichprobe des Analysenpulvers verwendet;
zweifellos wäre dies ein Vorteil, wenn durch die Suspendierung nicht auch die Feh¬
lermöglichkeiten zunehmen würden. Wasser oder Chloralhydratlösung besitzt nicht
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die gleiche Dichte wie das Drogenpulver: Die Suspensionen sedimentieren oder rah¬
men sehr schnell auf. Verschiedene Autoren (38, 39, 40, 41) versuchen, diesen Nach¬
teil durch Erhöhung der Viskosität des Suspensionsmediums zu beheben: Sie empfeh¬
len Rizinusöl, Olivenöl, Paraffinöl, Glycerin, Zuckersirup, Gelatinelösung, Tra-
ganth- oder Gummischleim.
Andere Autoren (42,43, 44,45) ziehen es vor, das Analysenpulver trocken mit
Substanzen zu verreiben, die in Chloralhydratlösung löslich sind. Für jedes Präpa¬
rat wird dann eine entsprechende Menge Verreibung genau abgewogen, auf den Ob¬
jektträger oder in die Zählkammer gebracht und durch Zusatz einiger Tropfen Chlo¬
ralhydratlösung das Verreibungsmedium aufgelöst. Als Verreibungsmedium wird
z. B. Zucker, Laktose oder Dextrin empfohlen.
4.1.3 Verwendung von Zählkammern
Sowohl Suspensionen als auch Trockenverreibungen können in Zählkammern
ausgemessen werden. 1911 verwendet Linde (43) für seine Untersuchungen einen
Objektträger, in den ein Quadrat von der Grösse des Deckglases und darin 100
Kleinquadrate eingeätzt sind; er nimmt zur Lösung seiner Trockenverreibung so¬
viel Chloralhydratlösung, dass sie bei aufgelegtem Deckglase nicht unter diesem
hervortritt. Diese Anordnung stellt eine Vorstufe zur Zählkammer dar. Hart¬
wich und Wichmann (44) stellen durch Aufkitten von Glasstreifen auf einen Ob¬
jektträger eine Zählkammer mit 1,5 cm Seitenlänge her. 1915 verwendet Kühn
(46) eine Zeiss-Thoma Kammer. Noch 1920 findet Wallis (39) Messverfahren,
die mit Zählkammern und Spezialkreuztischen arbeiten, nicht allgemein genug an¬
wendbar und zu zeitraubend, doch heute sind Zählkammern in der Form des Hämo-
cytometer so stark verbreitet, dass Messverfahren, die auf ihrer Anwendung be¬
ruhen, allgemein angewendet werden können.
Die üblichen Hämocytometer sind Zählkammern mit 0,1 mm Kammertiefe
2und sie besitzen ein Zählfeld von 3 auf 3 mm Seitenlänge = 9 mm Fläche. Die Kam¬
mertiefe von 0,1 mm ist im allgemeinen genügend, da die Analysenpulver meist
fein gemahlen werden. Für spezielle Zwecke kann die Zählkammer nach Petroff-
Hausser mit einer Kammertiefe von 0,02 mm gewählt werden (47). Brown,
Beatty und Kirby (48) beschreiben verschiedene andere Zählkammerausfüh¬
rungen.
Vom statistischen Standpunkt aus stellt die Messung in einer Zählkammer eine
Vereinfachung dar, weil stets gleichgrosse Präparate, d. h. Stichproben, untersucht
werden und bei der mathematischen Auswertung die Stichprobenergebnisse dann
nicht mit der Stichprobenmasse gewichtet werden müssen.
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4.1.4 Lycopodiu mmethode nach Wallis
Wie schon oben ausgeführt, fand Wallis Messverfahren für den allgemeinen
Gebrauch zu kompliziert, zu deren Durchführung Zählkammern oder Spezialkreuz-
tische notwendig sind. Er suchte deshalb nach einer einfacheren Methode, um die
Menge des im Mikroskopgesichtsfeld sichtbaren Analysenpulvers festzustellen; denn
der Abstand des Deckglases vom Objektträger ist variabel und abhängig von der
Grösse des grössten darunter befindlichen Teilchens. Wallis (38,49) knüpfte an
ein Verfahren der Bakteriologen zur Bestimmung der Bakterienzahl in einem Impf¬
stoff an: Die Bakteriologen fügen dem Impfstoff eine bestimmte Menge Vollblut zu,
dessen Erythrocytenzahl bekannt ist, und zählen in ihren Präparaten nun sowohl die
Anzahl Bakterien als auch die Anzahl Erythrocyten pro Gesichtsfeld. An Hand der
Erythrocytenzahl des Vollblutes, des Mischungsverhältnisses und des gefundenen
Verhältnisses Erythrocyten/Bakterien lässt sich die Bakterienzahl errechnen. Statt
Erythrocyten verwendet Wallis Lycopodiumsporen als quantitatives Leitelement,
weil ihre Grösse der des pharmakognostischen Materials entspricht, ihre Zahl pro
mg sehr konstant ist, sie charakteristisch geformt und daher leicht zu erkennen
sind und weil sie chemisch-physikalisch ausserordentlich resistent sind.
Die von Wallis und seinen Schülern entwickelte Methodik sei kurz beschrie¬
ben: Das Analysenpulver und eine bestimmte Menge Lycopodium werden in einem
geeigneten Medium (Traganthschleim, Glycerin,Oel) (38,39) suspendiert. Von die¬
ser Suspension wird 1 Tropfen auf einen Objektträger gebracht, mit einem Deckglas
bedeckt, nach einem bestimmten Schema (39) 20 verschiedene Orte der Deckglas¬
fläche eingestellt und die Messelemente und Lycopodiumsporen im Gesichtsfeld
ausgezählt. Nach öfterer Wiederholung wird die Kennzahl der Droge berechnet:
Kennzahl =
Messelemente_
M • L • 1000 • b
g Droge Sp • a
M = Gezählte Messelemente
Sp = Gezählte Lycopodiumsporen
L = Lycopodiumzahl (94000 Lycopodiumsporen/mg (39))
a = Gewicht Droge in g in der gesamten Suspension
b = Gewicht Lycopodium in g in der gesamten Suspension
Ist einmal die Kennzahl einer Droge bekannt, lässt sich leicht auch ihr Mischungs¬
verhältnis mit anderen Drogen in einem Pulver berechnen:
..... cj, _
Messelemente pro g Mischung • 100
Kennzahl
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Bei der quantitativen Bestimmung einer Verunreinigung in einem Drogenpulver
muss die Lycopodiumzahl nicht unbedingt bekannt sein. Man stellt zwei Präparate her:
1. Eine 50-proz. Mischung der Droge mit der betreffenden Verunreinigung und mit
einem bestimmten Prozentsatz Lycopodium.
2. Eine Mischung des Analysenpulvers mit dem gleichen Prozentsatz Lycopodium.
Beide Mischungen werden dann in gleicher Weise ausgemessen und der Anteil Verun¬
reinigung im Analysenpulver mittels Dreisatz errechnet (39).
Ist die Lycopodiumzahl bekannt, so müssen Messelemente und Lycopodiumspo-
ren nicht unbedingt in demselben Gesichtsfeld gezählt werden (39); es besteht damit
die Möglichkeit, Messelement und Sporen mit verschiedenen Mikroskopvergrösse-
rungen zu zählen.
In den folgenden Jahren verfeinern Wallis und seine Schüler die Methode
und wenden sie bei verschiedenen Drogen an. Die Methode findet so grossen Anklang,
dass sich Wallis 1921 veranlasst sieht, zu einer Konzentration der Bemühungen
zu raten (50): Es sollen vorerst nur einfache Objekte gemessen werden, wie z. B.
Stärkekörner, Pollenkörner und die Ergebnisse verschiedener Beobachter sollen
miteinander verglichen werden, um eine zuverlässig arbeitende Methode zu erhal¬
ten; erst dann soll zu schwierigeren Messungen übergegangen werden, wie z. B.
Zählung von Steinzellen oder Flächenmessung. 1922 versucht Wallis, Weizen¬
stärke von Gerstenstärke durch die Anzahl Stärkekörner bestimmter Grösse zu un¬
terscheiden (51), er kommt jedoch zum Schluss, dass dies nur möglich ist, wenn
vom Mehl ausgegangen und die Stärke nach standardisiertem Verfahren hergestellt
wird. Ebenfalls 1922 schlagen J . F. Li verseege und Una Liverseege (52)
für die Stärkebestimmung den sog. "Lycopodiumäquivalent" vor, der die Anzahl
Stärkekörner darstellt, die in dem Substanzgewicht enthalten sind, das dem Gewicht
von 100 Lycopodiumsporen entspricht. 1933 beschreibt Mason eine Methode zur
mikroskopischen Analyse von Schokolade (53), und er definiert einen "Mikrowert",
der die Anzahl Partikel (in 100 000) von 25 u 0 bedeutet, die vorhanden wären, wenn
alle grösseren Partikel auf diese Grösse zerkleinert würden.
In den Jahren 1933 - 1936 dehnen Wallis und Saber (28) die Methode der
quantitativen Mikroskopie weiter aus, indem sie die Flächenmessung von charak¬
teristischen Gewebestücken einführen. Von den zahlreichen Arbeiten Saber s (29,
30,31,32) erscheint uns diejenige für unsere Arbeit besonders wichtig, in der er
über den Einfluss des Mahlvorganges auf die Epidermisfläche berichtet (41).
1943 - 1945 arbeitet Fairbairn (54,55,56) an der quantitativen Bestim¬
mung von Cardamomen durch Zählung der Sclerenchymzellen der Testa.
Wallis und Santra bestimmen 1948 und 1949 die Masszahlen für Flos
Caryophylli (57); Fructus Pimentae (58), Olivenkerne (59) und Pfeffer (60); sie
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stellen dabei fest, dass eine Zählung der Sclereiden einer Flächenmessung vorzu¬
ziehen ist.
Flück, Garcia und Tor res (61) ermitteln 1955 die Masszahlen für Rhizo¬
ma Rhei chinensis, Rhizoma Rhei rhapontici (Messelement = Kristalldrusen), Cor-
tex Cinnamomi chinensis und Cortex Cinnamomi ceylanici (Messelement = Fasern).
4.1.5 Lycopodiumverreibung nach Haller
Wie schon Wallis (39) bemerkte, hat die von ihm eingeführte Suspendierung
der Mischung aus Analysenpulver und Lycopodium, mit der er eine vollkommene
Homogenität zu erreichen hoffte, gewisse Nachteile: Die Suspendierungs-Flüssig-
keit hat meist eine andere Dichte als die Analysensubstanz, so dass die Suspension
sehr wenig stabil ist; die Partikel der Analysensubstanz setzen sich sehr schnell
ab oder rahmen auf. Es kann sogar der Fall eintreten, dass die Dichte der Suspen¬
sionsflüssigkeit zwischen den Dichten der Lycopodiumsporen und des Analysenpul¬
vers liegt und dass dadurch die beiden Mischungsbestandteile in eine Oberflächen¬
schicht und einen Niederschlag aufgetrennt werden. Es kommt hinzu, dass die ein¬
zelnen Partikel eines Analysenpulvers, je nach Grösse, Form und spezifischem
Gewicht, verschieden schnell sedimentieren oder aufrahmen. Im Ganzen gesehen
enthält die Suspendierungsmethode sehr grosse Fehlermöglichkeiten. Wallis
verwendete als Suspendier-Flüssigkeit deshalb Glycerin oder Oel (39) oder ver¬
dickte die wässrige Chloralhydratlosung mit Traganthschleim (38). Die Suspensio¬
nen können dann aber, wenn sie längere Zeit gestanden haben, infolge der hohen
Viskosität nur noch sehr schwer zu homogenen Präparaten aufgeschüttelt werden.
Um die angeführten Schwierigkeiten zu umgehen, hat Haller (1) für seine
Arbeiten die Suspensionsmethode verlassen und dafür die alte Verreibungsmethode
(42, 43, 44, 45) wieder aufgegriffen: Er verreibt das Analysenpulver jedoch nicht mit
einer in Chloralhydratlosung löslichen Substanz, sondern direkt mit einem bestimm¬
ten Prozentsatz Lycopodium. An Hand der Anzahl Lycopodiumsporen kann er in je¬
der beliebigen Verdünnung die vorhandene Menge Analysensubstanz feststellen.
Wie auch Wallis verwendet Haller für seine Messungen lediglich gewöhnliche
Objektträger und Deckgläschen.
Die Verreibung von Analysensubstanz und Lycopodium muss, wie Hall er
betont, sehr sorgfältig vorgenommen werden; es muss mindestens V2 Stunde lang
unter häufigem Abschaben der Wandungen der Prozellanreibschale verrieben wer¬
den, ohne dass allzugrosser Druck ausgeübt wird, so dass die Lycopodiumsporen
unbeschädigt bleiben. Diese Verreibung ist unbeschränkt haltbar.
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Zur Messung wird eine Nadelspitze Verreibung auf einem Objektträger in eini¬
gen Tropfen Chloralhydratlösung verteilt, mit einem Deckglas bedeckt und über der
Flamme, bis zum Auftreten von Gasblasen erhitzt. Wenn eine Verholzungsreaktion
durchgeführt werden muss, wird das Deckglas wieder abgehoben, die notwendigen
Reagenzien zugegeben, gut gemischt und schliesslich wieder mit dem Deckglas be¬
deckt.
Die Berechnung der Kennzahl und des prozentualen Anteiles einer bestimmten
Droge in einer Drogenmischung erfolgt nach derselben Formel wie bei der auf Seite
18 angegebenen Methode.
Haller hat die Wallis 'sehen Fehlerquellen durch die Herstellung trockener
Verreibungen zu vermeiden versucht. Allerdings scheinen uns in der Herstellung des
mikroskopischen Präparates aus der Verreibung, d.h. beim Erhitzen in der Chloral¬
hydratlösung oder beim Absaugen der überschüssigen Flüssigkeit nach dem Anfär¬
ben, wieder erhebliche Fehlermöglichkeiten zu liegen: Beim Erhitzen mit Chloral¬
hydratlösung fliehen immer einzelne Pulverpartikel gegen den Rand des Deckglases.
Nun wäre es denkbar, dass die Lycopodiumsporen zufolge ihrer Lipophilie mehr
oder weniger gegen den Rand fliehen als es die Drogenpartikel tun; es ist allerdings
zu bemerken, dass Chloralhydratlösung sowohl hydrophile als auch lipophile Parti¬
kel zu benetzen vermag. Die Möglichkeit bleibt offen, dass durch das Erwärmen
das Mischungsverhältnis von Lycopodiumsporen zu Analysenpulverpartikeln in ein¬
zelnen Orten des Präparates gestört wird.
4. 2 Zählmethode
Im Gegensatz zu den anderen Disziplinen, in denen das Zählen von Partikeln
neben der Flächenmessung seltener angewandt wird, ist die Zählmethode in der
Pharmakognosie das wichtigste Messverfahren, weil sich die zellulär organisierten
Drogenpartikel ganz besonders dazu eignen (in der Petrographie haben wir es ja mit
nicht zellulär organisierten Teilchen zu tun).
Zur Messung wird einfach die Anzahl im Gesichtsfeld oder der Zählkammer
sichtbare Messelemente gezählt. Als Messelemente werden häufig Haare, Spalt¬
öffnungen oder Steinzellen gewählt.
Bei jeder Zählung müssen gewisse Konventionen aufgestellt und beachtet wer¬
den, um Doppelzählungen zu vermeiden: Bei Zählungen in einer Zählkammer können
die Partikel, die auf der Begrenzungslinie liegen, entweder alle nur als halbe Parti¬
kel gerechnet werden, oder man zählt die Teilchen als Ganze, erfasst aber nur die
Hälfte der Begrenzungslinie, d. h. den oberen und linken Rand bzw. den unteren und
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rechten Rand. Wird mit einem gewöhnlichen Objektträger gearbeitet, so kann für
die am Rande des Gesichtsfeldes liegenden und nur teilweise sichtbaren Partikel
entsprechend verfahren werden.
Bei mehrzelligen Haaren wird nur eine charakteristische Zelle derselben, die
Basalzelle oder die Haarspitze gezählt; bei Fasern zählt man alle Faserspitzen und
teilt das Ergebnis durch 2, um die Anzahl Fasern zu erhalten (61).
Da es sehr unangenehm ist, während der Messung häufig vom Mikroskop auf¬
schauen und eine Zahl notieren zu müssen, hält man das jeweilige Zählergebnis am
besten mit einem Diktiergerät oder einem kleinen Drucktastenzählwerk, wie sie im
Handel erhältlich sind, fest.
4.3 Flächenmessmethoden
Zur Flächenbestimmung von Partikeln sind sehr zahlreiche Verfahren entwik-
kelt worden; einen vergleichenden Ueberblick auf die bis 1927 in der Petrographie
gebräuchlichen Methoden geben Alling und Valentine (62). Auch Eränkö
(63) vermittelt einen gewissen Ueberblick, er erfasst jedoch nicht alle Arbeiten auf
diesem Gebiet. Die für mikroskopische Messungen geeigneten Verfahren können in
zwei Gruppen gegliedert werden:
1. Methoden, in denen das mikroskopische Bild mittels eines Spiegels auf eine Zei¬
chenebene projiziert wird; die Messflächen werden dort auf Papier abgezeichnet
oder, eleganter, photographisch festgehalten. Die Ausmessung erfolgt dann mit
dem Planimeter, durch Wägen des Papiers oder mit dem Zeiss-Teilchengrössen-
Analysator.
2. Methoden, in denen die Flächen im Mikroskop selbst, mittels eines besonderen
Kreuztisches und Messokulares bestimmt werden. Hierher gehören das Netzmi-
krometerokular (64), das Schraubenmikrometerokular nach Pohlenz und
Kracht (65), die Lochlehren (graticules) nach Fairs, der Integrationstisch
nach Zeiss, die automatischen Methoden, der "Point-Counter" und das Zeiss'
sehe Integrationsokular nach Hennig.
Nachstehend sind die interessanteren Methoden kurz beschrieben:
4.3.1 Projektionsmethoden
4.3.1.1 Planimeter
Eine eingehende Beschreibung der verschiedenen Planimeterarten und eine
kurze Einführung in die Theorie findet sich bei C o r adi (66).
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- 23 -
«r
c
Abb1 Planimeter nach Loradi
Die Abbildung 1 zeigt das zur Verfugung stehende Gerat; es ist ein Kompensa-
tions-Planimeter nach Coradi Zur Messung einer Flache wird der Pol mit dem
Gewicht a befestigt. Dann wird die Einstellung der Messrolle b notiert und von einer
beliebigen, markierten Stelle des Flächenrandes ausgehend, die Flache mit dem
Fahrstift c umfahren Am Ausgangspunkt angelangt, wird die Messrolle ein zweites
Mal abgelesen Die Differenz beider Ablesungen, mit einem bestimmten Faktor mul¬
tipliziert, ergibt den Flacheninhalt Bei entsprechender Verlängerung bzw Verkür¬
zung des Fahrstabes d lasst sich der Faktor verändern, bis er 1 betragt und die
Multiplikation damit entfallt
Ambrosius (67) berichtet über seine gunstigen Erfahrungen mit dem Plani¬
meter bei der mikroskopischen Flachenmessung an biologischem Material.
4.3.1.2 Wägemethode
Die Wägemethode ist eines der ersten Flächenmessverfahren, das angewandt
wurde: 1847 bestimmte Del esse (22) damit bereits die Komponenten verschiede¬
ner Gesteine: Er übertrug von Gesteinsschliffen die Flachen der einzelnen Bestand¬
teile auf Papier, von diesem auf Stanniol, das er dann mit der Schere ausschnitt;
die einzelnen Stanniolstuckchen wurden gewogen und ihr Gewicht stellte ein Mass für
ihre Oberflache dar. Spatere Autoren (68,69) verlassen wieder das Stanniol zugun¬
sten von durchsichtigem Papier und in neuerer Zeit ziehen Pidgeon und Dodd
(70) das Ausschneiden und Wagen von photographischen Abbildungen der Teilchen
dem Planimetrieren vor, weil die Arbeit schneller vonstatten geht.
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Die beschriebene Methode ist einfach und sie erfordert nicht die Anschaffung
spezieller Instrumente. Allerdings ist darauf zu achten, dass das Material, auf dem
die Flächen aufgezeichnet werden, möglichst gleichmässig dick ist, bzw. überall
das gleiche Gewicht pro Flächeneinheit aufweist.
4. 3.1. 3 Messung mit Millimeterpapier
Statt die Flächen auf Papier aufzuzeichnen, auszuschneiden und zu wägen,
wurde schon versucht, die Flächen auf Millimeterpapier abzuzeichnen und dann die
Quadratzentimeter bzw. Quadratmillimeter, die sie einnehmen, auszuzählen. Wal¬
lis und Saber (28) haben diese, auch in der Geographie übliche Methode, bei
pharmakognostischem Material erprobt; sie fanden, dass sie wohl genauer als das
Abwägen oder Planimetrieren, jedoch auch unverhältnismässig zeitraubender ist.
Die genannten Autoren wählten für ihre Arbeiten schliesslich die Wägemethode.
4.3.1.4 Zeiss-Teilchengrössen-Analysator nach Endter TGZ 3
Da die vollautomatische Flächenmessung von Teilchen nur möglich ist, wenn
im Bild alle Teilchen getrennt liegen und sie nicht mit anderen Partikeln vermischt
sind, die nicht gemessen werden sollen, haben Endter und Gebauer, auf den
Lochlehren (graticules) von Fairs basierend, ein halbautomatisches Gerät entwickelt
(Abb. 2) (71): Mittels einer Irisblende wird auf einer Glasscheibe ein in 48 Grössen
variierbarer Lichtfleck erzeugt. Auf die Glasscheibe wird eine transparente Abbil¬
dung der Messflächen (Photo oder Zeichnung auf transparentem Papier) gelegt und
der Lichtfleck für die Messung jeder Fläche solange verändert, bis er mit ihr flä¬
chengleich ist. Durch einen Hebeldruck wird die Einstellung der Irisblende in der
entsprechenden Grössenklasse registriert und die Fläche auf dem Bild markiert.
Zum Schluss der Messung werden die Frequenzen in den einzelnen Grössenklassen
abgelesen. Der Apparat gibt nicht mehr die Grösse einzelner Flächenstückchen an,
sondern das Ergebnis ist ein Histogramm, das die quantitative Verteilung der Flä-
chengrössen auf mehrere Klassen zeigt; die gemessene Gesamtfläche kann daraus
trotzdem ohne weiteres berechnet werden.
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- 25 -
Abb. 2 Zeiss-Teilchengrössen-Analysator nach Endter
4.3.2 Methoden, bei denen die Messung mit Hilfe von Zusatz¬
geräten im Mikroskop selbst erfolgt
4.3. 2.1 Messung "mittlerer Durchmesser"
Das einfachste Zusatzgerät zum Mikroskop, mit dem Flächen gemessen wer¬
den können, ist das Okularmikrometer. Zu Beginn wurden im allgemeinen zwei, in
rechtem Winkel zueinander stehende, Durchmesser gemessen. Später erwies sich
der Arbeitsaufwand als zu gross und es wurde nur noch ein sog. "mittlerer Durch¬
messer" bestimmt, der nach den verschiedenen Autoren unterschiedlich definiert
ist. Wal ton (72) beschreibt verschiedene derartige Durchmesser:
Hey wo od bestimmt den Durchmesser des Kreises, der mit dem Partikel
flächengleich ist = d. Mit D wird der Durchmesser des Kreises bezeichnet, der
den gleichen Umfang wie das Teilchen hat.
Martin's Durchmesser (= M) (73) ist der horizontale Durchmesser eines
Teilchens an der Linie gemessen, die das Teilchen in zwei flächengleiche Hälften
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teilt. Mit einem Faktor multipliziert erhält man aus dem Durchmesser die Fläche.
Je nach Flächengestalt werden verschiedene Faktoren festgelegt.
Ferets Durchmesser (74) (= F) ist der senkrechte Abstand zwischen paralle¬
len Tangenten an den gegenüberliegenden Seiten der Fläche. 1921 hat bereits Green
(75)einen ähnlich definierten Durchmesser, nämlich den waagrechten Abstand zwi¬
schen parallelen Tangenten, benutzt.
M und F wird bei statistisch verteilten Partikeln bestimmt. Green (76) weist
darauf hin, dass ein Vergleich mehrerer Substanzen mit Hilfe einer der "mittleren
Durchmesser" nur durchgeführt werden kann, wenn ihre Grössenfrequenzhistogram-
me sehr ähnlich sind. Bei pharmakognostischen Objekten ist eben diese Forderung meist
nicht erfüllt.
4.3.2.2 Lochlehren nach. Fair s
Um die bei Martin's Durchmesser notwendigen verschiedenen Faktoren zu eli¬
minieren, verwenden Fairs (77) und May (78) Lochlehren, mit deren Hilfe die
Partikel in Grössenklassen eingeteilt werden. Man kann die Lochlehren als prakti¬
sche Weiterentwicklung von Heywood's Durchmesser betrachten, der praktisch ja
sehr schwer zu bestimmen ist; die Durchmesser der Lochlehren nach Fairs sind
von 1 bis 128 inV2 - Progression abgestuft. Sie können auch aufgezeichnet und bei
dem Projektionsverfahren verwendet werden. Pidgeon und Dodd (70) und Hey¬
wood (79) stellen eine allgemeine Tendenz fest, die Messflächen mit den Lochleh¬
ren nach Fairs überzubewerten; der Fehler kann mit vermehrter Erfahrung aller¬
dings fast ganz vermieden werden.
4. 3. 2.3 Integrationstisch
Das Gerät (Abb. 3), das 1928 von der Firma Leitz herausgebracht wurde,
geht auf die Arbeiten von Rosiwal (23), Shand (80), Wentworth (81) und
Hunt (82) zurück. Die Flächenmessung wird auf eine Streckenmessung zurückge¬
führt, wie es Rosiwal 1898 vorgeschlagen hat (vgl. Seite 13); das von Rosiwal be¬
nutzte System paralleler Linien wird beim Integrationstisch durch eine Reihe paral¬
leler Verschiebungen des mikroskopischen Präparates ersetzt. Das Gerät besitzt
mehrere Mess-Spindeln, die eine Summierung der Streckenabschnitte in mehreren,
verschiedenartigen Messflächen in einem Arbeitsgang gestatten: Während mit dem
Auge die Bewegung der Messfläche unter dem Okularfadenkreuz verfolgt wird,
wird eben diese Bewegung durch Drehen der entsprechenden Mess-Spindeln hervor¬
gerufen und quantitativ erfasst.
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Abb. 3 Integrationstisch der Firma Ernst Leitz GmbH, Wetzlar
Auf einer Verbesserung von Dollar (83) fussend, beschreibt Hurlbut (84)
ein Gerät, bei dem die Bewegung durch einen Motor bewerkstelligt und die Zuord¬
nung der durchfahrenen Strecke auf die einzelnen Mess-Spindeln durch Druck auf
entsprechende Knöpfe gesteuert wird. Ein ähnliches Gerät wird von der Firma
Fuess, Berlin, unter der Bezeichnung "Sigma" hergestellt.
Der Integrationstisch hat eine ausserordentliche Verbreitung gefunden; er
wird heute sogar zur Analyse von Lebensmitteln benutzt, wie Lerche und Si-
nell (85) und Kotter und Prändl (86) berichten. Liese und Meyer-Uh-
lenried (87) ziehen den Integrationstisch der Wägemethode oder dem Planimetne-
ren vor, weil sie der Ansicht sind, dass er einfacher, schneller und genauer arbei¬
tet; Howard und Cohen (88) ziehen aus ähnlichen Gründen den Integrationstisch
von Hurlbut dem Punktzählgerat vor.
Offen bleibt die Frage, welchen Abstand die einzelnen Messlimen voneinander
haben sollen und welche Strecke durchfahren werden muss, um eine gewünschte
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- 28 -
Genauigkeit zu erzielen. Johannsen und Stephenson (89) empfehlen, eine ins¬
gesamt 100 bis 200 mal grössere Strecke zu durchfahren, wie der mittlere Durch¬
messer der Körner, und den Linienabstand nicht enger als einen Korndurchmesser
zu wählen; bei ungleichmässiger Verteilung der Körner im Präparat soll entspre¬
chend mehr gemessen werden. Bei dieser Anordnung, in der jedes Korn nur je ein¬
mal durchfahren wird, wird die Aehnlichkeit der Messung mit der Bestimmung von
Ferets-Durchmesser (vgl. Seite 26) offenbar. Wie Hennig (21) jedoch ausführt,
sind diese Messanweisungen mathematisch nicht fundiert.
Schuchardt (90) beschreibt 1956 ein Integrationsokular, das auf dem genau
gleichen Arbeitsprinzip beruht, wie der Integrationstisch.
4. 3. 2. 4 Automatische Methoden
Mit der Entwicklung der Elektronik sind in den letzten Jahren automatische
Zähl- und Messgeräte erfunden worden, die eine ungeheure Steigerung der Messge¬
schwindigkeit gebracht haben; bei einem Gerät wird eine Zählgeschwindigkeit von
1 Million Partikel in der Sekunde, bei einem Messfehler von weniger als 1 %, ange¬
geben. Leider ist der Anwendungsbereich vollautomatischer Apparate in der Phar¬
makognosie beschränkt, weil die spezifische Fähigkeit des Auges, nur an Hand der
Strukturdifferenzen zwischen verschiedenen Geweben zu unterscheiden, bisher nicht
nachgeahmt werden konnte. Es können somit nur homogene Pulver ausgemessen
werden, deren Partikel das Messelement selbst darstellen, wie z. B. Stärkekörner,
Lycopodiumsporen, Baumwollfasern, oder heterogene Pulver, bei denen sich das
Messelement optisch von den übrigen Geweben hinreichend unterscheidet, wie z. B.
stark gefärbte Epidermis oder Frucht- und Samenschalen (Semen Sinapis); es
wäre auch denkbar, das Messelement durch chemische Behandlung optisch hervorzu¬
heben (Färbung, Adsorption von Fluorochromen); doch dürfte dies nur in Ausnahme¬
fällen möglich sein.
Wir unterscheiden zwei vollautomatische Flächenmessmethoden:
a) die photometrische Methode, bei der die Schwächung des durch das Gesichts¬
feld hindurchtretenden Lichtes durch die Messflächen auf photometrische Weise be¬
stimmt wird; ein derartiges Gerät wird von der American Instrument Co, Silver
Springs Md., verkauft (91).
b) das Abtasten des Gesichsfeldes mit einem feinen Lichtstrahl. 1952 umreisst
W a 11 o n (92) das Messprinzip, die dabei auftauchenden Probleme und verschiedene
Lösungsmöglichkeiten: Das Präparat wird mit einem kleinen Lichtfleck, ähnlich
dem Fernsehen, abgetastet. Beim Durchfahren eines Partikelchens wird der Licht-
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fleck verdunkelt, was mittels Photozelle quantitativ registriert wird. Die Schwierig¬
keit ist, dass, wenn der Lichtfleck grösser als die Partikel ist, mehr als ein Parti¬
kel gleichzeitig als Einheit gezählt werden kann, während wenn er kleiner ist, er
mehrmals das gleiche Partikel durchfahren und dieses also mehrfach gezählt werden
kann. Die Lösung lässt sich auf verschiedene Weise erzielen: In der "double-scan-
method" wird das Präparat zweimal abgetastet, mit einem kleinen und mit einem
grösseren Lichtfleck; die Differenz beider Messungen lässt Schlüsse auf die Grösse
des Fehlers infolge mehrmaliger Zählung desselben Teilchens zu.
In der "intercept-length-method" werden die Längen der durchfahrenen Strek-
ken registriert; die Methode stellt eine Parallele zum Integrationstisch dar.
Bei der "guard-spot-method" durchfahren zwei Lichtflecke gleichzeitig das
Präparat und zwar mit einer Zeile Abstand; der eine Fleck kontrolliert den anderen,
d. h. ein Partikel wird nur gezählt, wenn der Messfleck gleichzeitig eine Fläche durch¬
fährt und der Kontrollfleck nicht; die Apparatur spricht also nur an, wenn der Mess¬
fleck die Fläche zum ersten Mal durchfährt.
Eine letzte Möglichkeit bietet die "sequential-signal-method", bei der eine
spezielle elektronische Schaltung notwendig ist: Wird ein Partikel mehrmals vom
abtastenden Lichtfleck durchfahren, so erfolgt dies in regelmässigen Abständen ent¬
lang der aufeinanderfolgenden Durchfahrungslinien. Diese Signale werden von der
elektronischen Vorrichtung gruppiert und als Einheit gezählt.
Im gleichen Jahr beschreiben Roberts und Young (93) ein Gerät, das nach
der "guard-spot-method" arbeitet.
1953 gelingt es Mitchie (94), Lichtpunkte von 0,1 bis 0, 25 u Durchmesser
herzustellen, indem er den Lichtpunkt einer Braun'schen Röhre (Durchmesser 25 u)
mittels eines Mikroskopokulars und -Objektivs verkleinert auf der Präparateebene
abbildet. Die Lichtimpulse werden mit Photozelle aufgenommen und durch einen
Elektronenvervielfacher verstärkt. Werden die Stromimpulse auf einen Fernsehappa¬
rat gegeben, dessen Elektronenstrahl synchron mit demjenigen der Braun'schen
Röhre läuft, so erscheint auf dem Bildschirm eine vergrösserte Abbildung des Prä¬
parates, die sich durch hohes Auflösungsvermögen, in weiten Grenzen regelbaren
Kontrast und grosse Bildhelligkeit - ohne dass dazu eine starke Beleuchtung des
Präparates notwendig wäre - auszeichnet. Die Firma Rank-Cintel Ltd., London,
baut und verkauft ein nach diesem Prinzip konstruiertes Gerät ("Flying Spot Particle
Resolver"), bei dem es auch möglich ist, durch selektive Registrierung nur bestimm¬
ter Impulslängen die Partikel nach Grössenklassen gesondert zu zählen (Abb. 4).
Mellors undSilver (37) gelingt es, bestimmte Zellen in heterogenem,
biologischem Material vollautomatisch zu zählen: Die sie interessierenden Zellen
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Abb. 4 "Flying Spot Particle Resolver" der Firma Rank-Cintel Ltd., London
reichern aus einer Lösung Fluorochrome an; statt eines gewöhnlichen Lichtfleckes
tastet ein UV. -Fleck das Präparat ab und bringt die fluorochromierten Zellen zum
Aufleuchten, was auf übliche Weise durch eine Photozelle registriert wird.
Montgomery, Bonner und Hundley (94) beschreiben ein ähnliches Ge¬
rät. Weitere Literaturangaben finden sich bei Chamot, Mason (95) und bei
Walton (92).
4.3. 2. 5 Punktzählverfahren
Das Punktzählverfahren stellt eine weitere Vereinfachung der Flächenmes¬
sung dar: Wie 1898 von Rosiwal (23) die Flächenmessung auf eine Messung von
Linien zurückgeführt wurde, die ihre technische Form im Integrationstisch gefun¬
den hat, so wurde sie 1933 weiter von Glagolev (24,25,26) auf das Zählen von
Punkten vereinfacht; das zweidimensionale System der Fläche wird zum eindimen¬
sionalen des Liniengitters und dieses zum nulldimensionalen des Punktenetzes.
Das von Glagolev beschriebene Gerät ähnelt in seiner technischen Ausfüh-
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rung einem Integrationstisch. Vom Institut für Kristallographie und Petrographie der
Eidgenössischen Technischen Hochschule wurde uns der in Abbildung 5 dargestellte
Apparat zur Verfugung gestellt; er arbeitet nach dem Gl agol e v 'sehen Verfahren.
Abb. 5 "Point-Counter"
Die Messung geschieht folgendermassen: Das mikroskopische Präparat wird zwi¬
schen den Klammern a und b eingespannt; mit den beiden Knöpfen c und d kann das
Präparat in beiden Richtungen bewegt werden. Raster sorgen dafür, dass die Be¬
wegung in Sprüngen von je '/3 mm erfolgt. Das Fadenkreuz im Mikroskopokular
stellt den Messpunkt dar. Das Präparat wird nun von Rasterstellung zu Rasterstel¬
lung weiterbewegt und jedesmal festgestellt, innerhalb welchen Gemengeteiles sich
der Messpunkt befindet. Auf diese Weise wird das Präparat von einem Punktenetz
mit '/3 mm Punkteabstand in beiden Richtungen überzogen. Die Treffersumme für
jeden Gemengeanteil ist dem jeweiligen Flächenanteil proportional.
Ein Jahr nach Glagolev veröffentlichte ein japanischer Geograph, I. Matui
(96), eine statistische Methode, die es gestattet, schnell die Art der Oberflächen¬
bedeckung einer bestimmten Geländefläche an Hand von Karten quantitativ festzu¬
stellen: lieber die Landkarte wird ein Liniengitter, in der Art von kariertem Papier,
gelegt und die Bodenbedeckung unter den Linienschnittpunkten festgestellt. Die
Schnittpunkte über gleicher Bedeckung werden zusammengezählt und das Verhältnis
der Teilsumme zur Gesamt-Schnittpunktzahl stellt den Anteil der betreffenden Be¬
deckungsart an der Gesamtoberfläche dar.
In der Petrographie wurde die Arbeit auf dem Gebiet des Punktzählverfah¬
rens in den folgenden Jahren nicht vernachlässigt und es erschienen Beiträge von
Chayes (97,98,99,100), Chayes und Fairbairn (101) und Ro se nf e 1 d (102).
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Die Punktzählmethode nach Glagolev hat heute in der Petrographie eine ansehn¬
liche Verbreitung gefunden; allerdings haften ihr noch gewisse Mängel an:
Zur Einstellung jedes Messpunktes ist eine Verschiebung des Präparates not¬
wendig und es geht dabei Zeit verloren.
Der Abstand der Messpunkte ist durch die Raster festgelegt (beim vorliegenden
Gerät auf 1/3 mm) und kann nicht, der Struktur des Messpräparates entsprechend,
verändert werden; die absolute Grösse der Messfläche und die eingestellte Mikro-
skopvergrösserung finden ebenfalls keine Berücksichtigung.
1958 ging Hennig (21), in Zusammenarbeit mit der Firma Zeiss, deshalb
zur gruppenweisen Anordnung der Messpunkte über: In das Mikroskopokular wird
eine Messplatte eingefügt, auf der 25 gleichmässig auf der Gesichtsfeldfläche ver¬
teilte Messpunkte markiert sind (Abb. 6). Damit konnten beide angeführten Mängel
behoben werden, denn in wenigen Sekunden kann jetzt die Lage von 25 Messpunkten
erfasst werden und dadurch, dass die Messplatte Teil des optischen Systemes ist,
bleibt die Anzahl von 25 Messpunkten im Gesichtsfeld bei jeder Vergrösserung er¬
halten; beim Wechseln des Objektivs wird der relative, in das mikroskopische Bild
projizierte Abstand der Messpunkte verändert, was eine automatische Anpassung
des Messpunkte-Abstandes an die spezielle Struktur des Präparates bedeutet.
Abb. 6 Messplattenach Hennig (Firma Zeiss)
Wie Hennig in der oben erwähnten Arbeit weiter ausführt, hat die Punktzähl¬
methode gegenüber den übrigen anderen Methoden ausserdem noch den Vorteil, dass
die Streuung vorausberechnet und der Verlauf der Messung damit stets kontrolliert
werden kann. Die Häufigkeiten der Trefferzahlen pro Gesichtsfeld müssen nämlich
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- 33 -
eine Binomialverteilung ergeben. Für diese gelten folgende Formeln:
Mittelwert: x = n . p
Streuung: s = Vn. p. q
Relative Standardabweichung: s .
= 100
wobei: n = gesamte Anzahl Messpunkte
p = prozentualer Anteil der Messfläche an der
Gesamtfläche
q = 1 - p bzw. 100 - p
Mit Hilfe der letzten Formel lässt sich sehr einfach berechnen, wieviel Ge¬
sichtsfelder ausgemessen werden müssen, damit eine bestimmte Streuung nicht
überschritten wird: Durch Umformung erhalten wir:
1002 (100 - p)n =
s ,2.
p
relK
und wir müssen nur noch die Werte für p und s . einsetzen.
Es ist aus den Formeln auch deutlich zu entnehmen, wie wichtig es ist, Prä¬
parate mit möglichst hoher Konzentration an Messflächen herzustellen. Folgende
Tabelle zeigt, wie bei konstanter Anzahl Messpunkte die relative Standardabweichung
abnimmt, wenn der Anteil der Messflächen an der Gesamtfläche vergrössert wird:
Anteil der Messfläche Anzahl relative Standard¬
an der Gesamtfläche Messpunkte abweichung
% n srel= %
1 100 99,55 100 43,5
10 100 30
20 100 20
50 100 10
10 1000 9,5
Kelch und Gerigk (103) haben das neue Okular auf dem Gebiet der Lebens¬
mitteluntersuchung erprobt; pharmakognostische Arbeiten mit dem einfachen Punkt¬
zählverfahren oder dem Messokular sind uns nicht bekannt.
In der Pharmakognosie kann der Anteil an Messfläche - von den Verfahren der
Vortrennung abgesehen - nur durch die Herstellung "dickerer" Präparate gesteigert
werden; leider sind diesem Vorgehen meist schon bei geringen Konzentrationen Gren¬
zen gesetzt, weil die Messflächen von anderen Geweben teilweise überdeckt werden
100 - p
p. n
Page 35
- 34 -
und nicht mehr mit Sicherheit vollständig erfasst werden können (104). In diesem
Falle bleibt nur die Vermehrung der Messpunkte; der grosse Vorteil des Punktzähl¬
verfahrens ist dabei gerade eben der, dass diese Vermehrung nicht zu einem prohi-
bitiven Arbeitsaufwand führt. Aus der Formel ist zu entnehmen, dass eine Vermeh¬
rung der Messpunkte um das Vierfache die Streuung um die Hälfte reduziert, z. B.
hatten wir bei einem Messflächen-Anteil von 10 % und 100 Messpunkten mit einer
relativen Standardabweichung von 30 % zu rechnen, werden die Messpunkte auf 1000
erhöht, so sinkt die relative Standardabweichung auf 9, 5 %.
4.4 Analysenfehler
Jede Messung, wenn sie auch mit noch so grosser Sorgfalt durchgeführt wird,
ist mit einem Fehler behaftet, d. h. bei Wiederholung desselben Versuches unter ge¬
nau gleichen Bedingungen wird im allgemeinen ein vom ersten abweichendes Ergeb¬
nis erzielt. Voraussetzung für eine Verbesserung der Analysenverfahren ist eine
Analyse dieses Fehlers, eine Aufgliederung in seine verschiedenen Komponenten,
deren Ursachen dann erkannt und, wenn möglich, schliesslich eliminiert werden
können. Wir teilen die Fehler zunächst in zwei Hauptgruppen ein: Zufallsbedingte
Fehler und systematische Fehler.
4.4.1 Zufallsbedingte Fehler
Diese Gruppe umfasst die Fehler, die - wie es der Name sagt - rein durch
den Zufall entstehen; sie haben ihren Ursprung in der Unvollkommenheit der Instru¬
mente und der menschlichen Sinne (105) und können das Messergebnis sowohl zu
gross, wie auch zu klein ausfallen lassen. Liegen die Messergebnisse einer Ver¬
suchsreihe vor, so kann der zufallsbedingte Fehler nach den statistischen Metho¬
den berechnet und die Stelle, an der er entsteht, bei einem mehrstufigen Experiment
auch lokalisiert werden. Er kann, ausser durch Aenderung der Messmethode, ledig¬
lich durch Vermehrung der Versuchszahl verringert werden, wobei das Mass der
Verringerung an Hand der statistischen Formeln vorausgesagt werden kann.
4.4.2 Systematische Fehler
Systematische Fehler haben ihren Ursprung in der ungenügenden Berücksichti¬
gung von Nebenumständen beim Versuch (105); sie beeinflussen das Ergebnis stets
Page 36
- 35 -
nur in einer Richtung, entweder dass es zu gross oder dass es zu klein ausfällt. Die
systematischen Fehler können nicht berechnet werden; sie erscheinen als restlicher
Fehleranteil, wenn die zufallsbedingten Fehler vom Gesamtfehler in Abzug gebracht
werden, und sie werden auch nur auf diese Weise erkannt. Sie können hingegen voll¬
ständig behoben werden, wenn ihre Ursache festgestellt und mit geeigneten Mitteln
beseitigt werden kann.
Bei der quantitativen pharmakognostischen Analyse bestehen verschiedene sy¬
stematische Fehlermöglichkeiten, auf die hier kurz hingewiesen werden soll:
4.4. 2.1 Fehler bei der Stichprobenentnahme
Im Laufe der Analyse werden zur Herstellung des mikroskopischen Präparates -
bei dem ja nur minimale Substanzmengen Verwendung finden - meist mehrmals Stich¬
proben aus einer gegebenen Substanzmenge entnommen. Es ist dabei von ausschlag¬
gebender Bedeutung, dass die Entnahme mit der notwendigen Sorgfalt geschieht, vor
allem wenn in mehreren Stufen entnommen wird, denn die letzte Stichprobe soll ja
immer noch repräsentativ sein, d. h. an die Stelle der gesamten Substanzmenge tre¬
ten können; eine noch so genaue Messmethode kann Fehler bei der Stichprobenent¬
nahme nicht wieder gut machen (106).
Um eine repräsentative Stichprobe einer Substanzmasse entnehmen zu können,
muss sie homogen sein, d. h. an allen Stellen die gleiche Zusammensetzung aufwei¬
sen (zufallsbedingte Schwankungen ausgenommen). Vor jedes Stichprobenentnahme
muss immer gemischt werden, denn eine einmal hergestellte homogene Mischung
kann sich mit der Zeit wieder auftrennen, Suspensionen durch Sedimentation, Ver-
reibungen infolge Erschütterungen.
Zur Verhinderung oder zumindest Verlangsamung der Sedimentation von Sus¬
pensionen kann man die Dichte der Suspendierflüssigkeit derjenigen der Teilchen
anpassen. In der Pharmakognosie und wenn wir heterogene Drogenpulver untersu¬
chen wollen, stossen wir damit aber auf Schwierigkeiten: Als Suspendierflüssig¬
keit wird nämlich im allgemeinen eine Chloralhydratlösung verwendet, die auch zur
Aufhellung des mikroskopischen Präparates dient; ihre chemische Zusammenset¬
zung und damit ihre Dichte kann nur in gewissen Grenzen verändert werden, wenn
sie auch ihre zweite Aufgabe erfüllen soll. Bei heterogenen Pulvern weisen die ver¬
schiedenen Teilchenarten meist verschiedene Dichten auf, die Dichte der Suspen¬
dierflüssigkeit muss dann so gewählt werden, dass sie knapp oberhalb oder unter¬
halb des Dichtebereiches aller Teilchen liegt; die Suspension rahmt dann langsam
auf oder sedimentiert langsam. Stellen wir hingegen die Dichte der Suspendierflüs-
Page 37
- 36 -
sigkeit auf einen mittleren Wert innerhalb des Dichtebereiches der Teilchen ein, so
bewirken wir eine Auftrennung des heterogenen Pulvers, indem die leichteren Teil¬
chen nach oben und die schwereren nach unten wandern; der resultierende Fehler
ist wahrscheinlich grösser als derjenige, der durch Sedimentation oder Aufrahmen
der gesamten Teilchenmasse entsteht.
Für pharmakognostische Zwecke scheint die Stabilisierung der Suspensionen
durch Erhöhung ihrer Viskosität eher geeignet zu sein. Der Nachteil ist aber hier,
dass bei einer Viskosität der Suspension, die eine hinreichende Stabilität gewähr¬
leistet, sie nur noch sehr schwer gemischt bzw. aufgeschüttelt werden kann. In
letzter Zeit sind jedoch Stoffe entwickelt worden, die einer Suspension eine sehr
grosse Thixotropie verleihen: Sie erfüllen die Suspension als Gele mit einem Ske¬
lett, das die suspendierten Partikel in ihrer Lage fixiert; wird diese Struktur durch
auftretende Scherkräfte, etwa durch Schütteln, gestört, so gehen sie in den Sol-Zu-
stand über, die Viskosität der Suspension sinkt stark und einer guten Durchmischung
steht nichts mehr im Wege (107).
Die Herstellung von Verreibungen aus Analysenpulver und Lycopodium ge¬
schieht am besten nach der im Homöopathischen Arzneibuch beschriebenen Methode.
Bei der Herstellung der mikroskopischen Präparate können weitere sy¬
stematische Fehler entstehen: Die Art, wie eine Zählkammer gefüllt wird, kann
die Verteilung der Partikel beeinflussen; am besten arbeitet man nach den in der
Blutkörperchen-Zähltechnik entwickelten Methoden (108). Wenn mit gewöhnlichen
Objektträgern und Deckgläsern gearbeitet wird, kann sich das Erhitzen des Pulvers
in der Chloralhydratlösung, das zur Aufhellung vorgenommen wird und wobei oft
Dampfbläschen entstehen, störend auf die Verteilung auswirken; vor allem die
Grenzflächen (Deckglasränder) sollten bei Messungen gemieden werden (vgl. Seite
21).
Wird ein Präparat an mehreren Stellen ausgemessen, so sind die Messteilen
nach dem Prinzip der gesteuerten Zufälligkeit auszuwählen, d. h. die Koordinaten
der Messtelle müssen einer Zufallszahlentabelle entnommen werden (diese Tabel¬
len enthalten Zahlenreihen, bei denen die Zahlen rein zufällig aufeinander folgen
und deren Zufälligkeit statistisch überprüft wurde).
4. 4.2. 2 Veränderungen der Messelemente durch und während der Messung
Bei allen Messungen, für die die Analysensubstanz vorher pulverisiert wer¬
den muss, tritt ein systematischer Fehler auf, der von der Mühle herrührt (41,109).
Wie wir selbst feststellen konnten, sind diese Fehler überraschend gross. Alle Mahl¬
vorgänge sind deshalb zu normieren (vgl. Seite 15).
Page 38
- 37 -
Während bei der zählenden Analyse die Dimensionen der Messelemente keine
Rolle spielen, stellen sie bei der messenden Analyse gerade die Messzahl dar; eine
Aenderung dieser Dimensionen während der Messung führt damit zu einem Messfeh¬
ler. Saber (41,110,111) hat die Verhältnisse für die Epidermisfläche von Folium
Sennae untersucht: Er fand Veränderungen der Epidermisfläche bis zu 16 %, wenn
er die trockenen Flächenstückchen während längerer Zeit in Wasser einlagerte oder
mit Chloralhydratlösung erhitzte. Abhilfe kann hier nicht geschaffen werden, die
Fehler müssen aber beim Vergleich verschiedener Messergebnisse berücksichtigt
werden.
4.4. 2. 3 Beobachtungsfehler
Auch die Beobachtungsfehler müssen zu den systematischen Fehlern gerechnet
werden. Die wichtigsten seien kurz beschrieben:
Die mangelhafte Erkennung des Messelementes: Bis zu einem gewissen Grade
verringert sich der Fehler, wenn der Beobachter an Erfahrung gewonnen hat. Eine
weitere Verbesserungsmöglichkeit bietet die Heranziehung moderner mikroskopi¬
scher Methoden, wie UV-Mikroskopie, Phasenkontrast, Dunkelfeldbeleuchtung,
polarisiertes Licht und Beleuchtung mit Natrium- oder Zink-Dampf-Licht, um das
Auflösungsvermögen zu erhöhen (112).
Weiterhin sehr wichtig ist die optimale Auswahl der Korngrösse des Pulvers
und einer dazu passenden Mikroskopvergrösserung. Das Pulver sollte so fein ver¬
mählen sein, dass das Messelement aus dem Verband mit anderen Geweben mög¬
lichst gut herausgelöst ist und in seiner ganzen Ausdehnung beobachtet werden kann:
Ueberdeckungen des Messelementes durch andere Gewebe können zu Messfehlern
führen. Andererseits entsteht durch immer feinere Vermahlung ein immer grösse¬
rer Verlust an Messelement, also ebenfalls ein Messfehler. Die Korngrösse des
Pulvers muss so gewählt werden, dass beide Fehler möglichst klein werden (vgl.
Seite 15).
Schliesslich muss die Beobachtungstechnik, in Bezug auf Messelemente, die
nur teilweise im Mikroskopgesichtsfeld oder dem Zählkammerfeld erscheinen,
normiert werden. Als Beispiel sei die Konvention genannt, wonach in einer Zähl¬
kammer nur die auf dem linken oder oberen Rand liegenden Messelemente als Ein¬
heit gezählt werden, die auf den beiden anderen Rändern hingegen nicht. Nach eini¬
gen Messungen gleichen sich die Fehler aus. Ein anderes Beispiel ist das Zählen
von Haaren, bei dem, um Doppelzählungen zu vermeiden, nur die Haarspitzen oder
die Basalzellen gezählt werden.
Page 39
- 38 -
II. BIGENE UNTERSUCHUNGEN
5. Arbeitsplan
Unsere eigenen Untersuchungen unternahmen wir nach dem folgenden Arbeits¬
plan:
Wir untersuchten zunächst, mit Hilfe statistischer Methoden, die verschiede¬
nen mikroskopischen Messverfahren zur quantitativen Analyse von Drogenpulvern.
Die Messverfahren konnten dann nach rationalen Gesichtspunkten miteinander ver¬
glichen werden und es war die für unsere Zwecke am besten geeignete Methode aus¬
zuwählen. Zur Ergänzung mussten noch einige spezielle Prüfungen vorgenommen
werden.
An Hand von praktischen Bestimmungen mit den gewählten Methoden suchten
wir die im ersten Teil unserer Arbeit gewonnenen Ergebnisse zu bestätigen. In ei¬
ner ersten Gruppe von Messungen befassten wir uns mit der Zählmethode, in einer
zweiten Gruppe mit der Flächenmessmethode. Weitere zahlenmässige Messergeb¬
nisse, die wir im Verlaufe unserer Untersuchungen im ersten Teil unserer Arbeit
gewonnen haben, sind ebenfalls hier aufgeführt.
6. Eigene Untersuchungen
6.1 Auswahl der Analysenmethoden
Das Drogenpulver kann im Prinzip auf zwei Arten zur Analyse vorbereitet und
gemessen werden: In einer Zählkammer, wobei eine Suspension des Analysenpul¬
vers mit genau bekannter Konzentration zur Füllung der Kammer dient, und mit ei¬
nem gewöhnlichen Objektträger mit Deckglas; hierzu muss das Analysenpulver mit
einem Leitelement (Lycopodiumsporen) in bestimmtem, genau bekanntem Verhältnis
versetzt werden. Beide Verfahren wurden von verschiedenen Autoren bereits ange¬
wandt, doch erfolgte die Wahl des einen oder anderen Verfahrens mehr nach persön¬
lichen Neigungen als nach rationalen Gesichtspunkten. Wir treffen die Entscheidung
zwischen beiden Methoden im Folgenden auf Grund einer statistischen Methode, al¬
so auf streng rationale Art.
Für die Zählkammermethode wurde weiterhin in zwei Fällen untersucht, ob
die Methode mit systematischen Fehlern behaftet ist: Die Prüfung der Homogenität
Page 40
- 39 -
der Suspensionen und die Prüfung auf Zufälligkeit der Partikelverteilung in der Zähl¬
kammer. Beide Kriterien sind Voraussetzungen, um eine repräsentative Stichprobe
zu erhalten (die Frage der Homogenität der Suspensionen hat ja Haller (1) veran¬
lasst, wieder zu den Verreibungen zurückzukehren).
Für die Lycopodiummethode unternahmen wir die Bestimmung der Lycopodium-
zahl, einerseits um einen Wert mit Vertrauensgrenzen zu erhalten, andererseits um
die Werte anderer Autoren mit denen unserer Methode zu vergleichen. Die Korrela¬
tion zwischen den Messelementen und den Lycopodiumsporen zeigt uns, wie stark
Messelement und Leitelement miteinander verbunden sind und ob die Anzahl Lycopo¬
diumsporen im Gesichtsfeld bzw. Präparat als Mass für die vorhandene Substanz¬
menge dienen kann.
Schliesslich haben wir nach derselben rationalen, statistischen Methode die
günstigste Flächenmessmethode aus den zahlreichen möglichen Verfahren ausge¬
wählt. Wir stiessen dabei auf die Tatsache, dass die Flächenform einen gewissen
Einfluss auf die Streuung beim Punktzählverfahren ausübt, ein Effekt, den wir in
der Literatur nicht erwähnt fanden und den wir deshalb in unsere Untersuchungen
einbezogen.
6.1.1 Vergleich der Lycopodiummethode mit der Zählkammer¬
methode
Als Analysensubstanz verwendeten wir für den Vergleich Herba Sabinae. Das
Messelement bilden die charakteristisch geformten Spaltöffnungen, die mit der
Phloroglucin-Salzsäure-Verholzungsreaktion gefärbt werden können und so leicht
zu erkennen sind.
Für beide Methoden wurde je eine Präparatereihe angefertigt und ausgemes¬
sen:
Zählkammer methode (a): Genau gewogene 0, 3097 g Herba Sabinae wurden in
einem Becherglas mit wenig Chloralhydrat-Glycerinlösung (Chloralhydrat 100,0,
Glycerin 100,0) versetzt und gekocht, darauf, zur Färbung der Spaltöffnungen, mit
Phloroglucinlösung und Salzsäure 15 % behandelt; die Färbung wird beschleunigt,
wenn man kurz erhitzt, bis sich Alkoholdämpfe bilden. Die Mischung wurde nun
quantitativ in einen Messzylinder gebracht, 1, 5 ml Verdickungslösung (Aerosil ***
Degussa 10,0, Glycerin 90,0, Chloralhydrat 100,0) zugefügt und mit Chloralhy-
dart-Glycerinlösung auf 10,0 ml aufgefüllt. Der Messzylinderinhalt wurde heiss
solange geschüttelt, bis er homogen erschien, und dann erkalten gelassen. In kal¬
tem Zustand und bei ruhigem Stehen nimmt die Viskosität so stark zu, dass auch
nach monatelangem Stehen kein Absetzen sichtbar wird.
Page 41
- 40 -
Der jeweils gut umgeschüttelten Suspension wurde in der Reihenfolge der Ent¬
nahmestellen: Unten, in der Mitte und oben, Material für je zwei Zählkammerfüllun¬
gen mit einer Spezialpipette (113) entnommen und die Spaltöffnungen gezählt. Die Er¬
gebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Lycopodiummethode (b): In Vorversuchen war als Optimum eine Beimischung
von ca. 1 % Lycopodium ermittelt worden; genau gewogene 0, 4991 g Herba Sabinae
wurden deshalb 1 Stunde lang mit 0,0069 g Lycopodium sorgfältig verrieben. Für je¬
des Präparat wurde eine Nadelspitze voll Substanz der Verreibung entnommen, auf
einen Objektträger gebracht, sorgfältig in 2 bis 3 Tropfen Chloralhydratlösung dis-
pergiert, mit einem Deckglas bedeckt und über der Mikroflamme erhitzt.
Bei jedem Präparat wurden 10 Gesichtsfelder unter dem Mikroskop eingestellt,
deren Koordinaten einer Zufallszahlentabelle entnommen wurden, und jeweils die
Stomata und die Lycopodiumsporen gezählt. Die Messwerte sind in Tabelle 2 zusam¬
mengestellt.
Da, wie wir weiter unten zeigen werden, zwischen der Anzahl der Stomata und
der Lycopodiumsporen eines Gesichtsfeldes die Korrelation nur 0,07 beträgt, sind
wir für diese Berechnungen von der jeweiligen Summe für ein Präparat ausgegangen.
Den Gedanken, dass die Anzahl Stomata mit der Anzahl Lycopodiumsporen ge¬
wichtet werden müsste, um den substanzreicheren Präparaten mehr Einfluss auf
das Gesamtergebnis zu verleihen, haben wir im Verlaufe der Untersuchung wieder
fallen gelassen, denn die geringe Korrelation im Gesichtsfeld und die nicht sehr
starke Korrelationim Präparat zeigen, dass die Anzahl Lycopodiumsporenauf diesen
beiden Ebenen nur beschränkt als Mass für die vorliegende Substanzmenge gelten kann.
In beiden Fällen wurde die Varianz nach der Formel:
Zx2- <Zx)22 n
s =
n - 1
und daraus die Varianz des
berechnet.
Wir erhielten: s_"a = 1,72 Stomata
2s-
b= 0,001655 Stomata/Lycopodium.
arithmetischen Mittels, nach
Page 42
41 -
a) Messergebnisse in der Zählkammer
Tabelle 1 Vergleich der Lycopodiummethode mit der Zählkammermethode
Zählkammer Stomata
X X2
1 13,5 182,252 9,5 90,253 15,5 240,254 7,5 56,255 12,5 156,256 21,0 441,007 13,5 182,258 18,5 342,259 8,0 64,00
10 10,0 100,0011 14,0 196,0012 30,0 900,0013 15,0 225,0014 18,0 324,0015 13,0 169,0016 18,5 342,2517 8,5 72,2518 17,0 289,0019 7,5 56,2520 4,5 20,25
275,5 4448,75
x = 13,775
Zx2-£^Varianz =
n - 1
4448,75 - 275,5/20
Varianz des Mittelwertes
Relative Varianz des Mittelwertes
19o-x, -i
34,4_ _ 1,72
20
2 1,72 10 000
x rel90,6
189,9
Page 43
- 42 -
b) Messergebnisse bei der Lycopodiummethode
Tabelle 2 Vergleich der Lycopodiummethode mit der Zählkammermethode
Anzahl Anzahl Anzahl Anzahl
Präparate Lycopodiumsporen Stomata Lycopodiumsporen Stomata
X y
1 8
19
2
16
2
3,54,55
5
3,54
0
0
7,53
0
2
3,51 0 66,0 23,5
2 3
3
2
9,50
2
1
0
2
8,52
0
1
0
0
0
0
0,54 1 26,5 13,0
3 7
1
3
8
2
1,53
12,55
0
0
1
1,52
0,53
4
0
3 0 46,0 12,04 25
9
3
14
9
7
15
9,59
0
5,510
0
1
0,50
5,53,5
3 0,5 103,5 26,55 11,5
2
10
0
3
3,5
Page 44
- 43 -
Tabelle 2 (Fortsetzung)
PräparateAnzahl Anzahl Anzahl Anzahl
Lycopodiumsporen Stomata Lycopodiumsporen Stomata
X y
5 2
2
4
12
8
8,5
2,53
9,51,52
0
17,5 5 77,5 30,0
6 6,53
9
5,52
5
3
2
4
1,50,52
0
1,52
4,50
1,52 2 42,0 15,5
7 7
1
4,56
4
7
1
3
4
1
6
3
2,51
2
0
0
3
3,5 2 41,0 20,5
8 0
0
2,51
3
2
2
3
3
2,52
1
0
0
1
0
0
2,53 0 19,5 9,0
9 3
5
6
5
3,56
5
5
4
0
1
0
3
1,51
0
0
4,58 1 50,5 12,0
Page 45
- 44 -
Tabelle 2 (Fortsetzung)
PräparateAnzahl Anzahl Anzahl Anzahl
Lycopodiumsporen Stomata Lycopodiumsporen Stomata
X y
10 1
5
2,54
3,55
2
2
3,5
0
0
0
3,51
5
3,50
1
0 0 28,5 14,0
11 3
2
5,52
3
2
2,52
1
0
4
1,51
10
1
2
3
0
2 3 25,0 25,512 9
11
11,59
2
8
3
9,55
4
2
0
0
10,50,52
1
3
3,5 6 71,5 29,0
13 5,55
0,53
0,59
2,51,51
1
1
0
0
0
0
0
0
1
0,5 0 29,0 3,014 3
2
2
1
3
0
1,5
0
2
0
0
0
0
0
Page 46
- 45 -
Tabelle 2 (Fortsetzung)
PräparateAnzahl Anzahl Anzahl
-
—i
Anzahl
Lycopodiumsporen Stomata Lycopodiumsporen Stomata
X y
14 1,55
5,50,5
3 0,5 22,0 8,5
15 4
10
6,56,54
7
4
1
5
1
0
3
0,51
1
1,54,54
0 2 48,0 18,5
16 4
5
5
1
8,55
7
1
8
0
0
1
0
0
0
2
3
5,51 0 45,5 11,5
17 8
3
6
7
8
4
5
3
5
0
0
3
1
0,52
2
5
0
2 0 51,0 13,5
18 5
5
4,56
9
7
2
3
4
8
6
2
1
0
3,52,51
2
8 0,5 53,5 26,5
19 3
5
5
3,50
5,5
Page 47
- 46 -
Tabelle 2 (Fortsetzung)
PräparateAnzahl
Lycopodiumsporen
Anzahl
Stomata
Anzahl
Lycopodiumsporen
Anzahl
Stomata
X y
19
20
5,51
3
4
4
1
5
11
1
7
3
1
7
9
6
6,56
0
0
0
1,50
0
1
2
0
1
2
2
8
1
2
1
1
36,5
57,5
11,5
20
Total 940,5 343,5 940,5 343,5
x = 47,025 y = 17,175
Beide Werte können nicht miteinander verglichen werden, wir müssen sie zuerst
relativieren, nach:
s .100
2s2
.10000
und wir erhalten: s_ .: 90,6
x rel a'
2
sx rel b'
Grundsätzlich kann mit jeder Messmethode jede beliebige Genauigkeit erzielt
werden, es müssen nur eine entsprechend grosse Anzahl Messungen vorgenommen
werden; die Genauigkeit nimmt mit~Vn zu, d. h. für eine Verdoppelung der Genauig¬
keit, bzw. Halbierung der Streuung, ist die vierfache Anzahl Versuche notwendig.
Zur Beurteilung der verschiedenen Messmethoden müssen deshalb nun wirtschaft¬
liche Gesichtspunkte eingeführt werden, also die Versuchkosten oder die aufgewen-
Page 48
- 47 -
dete Zeit. Wir haben ein Optimum erreicht, wenn wir für die Beschränkung der Va¬
rianz auf einen bestimmten Wert ein Minimum an Zeit aufwenden müssen.
Als Mass für die Genauigkeit dient der Reziprokwert der Varianz, der auch
"Information" (In) genannt wird:
1
Information = —
s_2x
und unser gesuchtes Kriterium ist die Information pro Zeiteinheit:
1
In/t =—-.
s_2. t
Bei unseren Messungen haben wir folgenden Zeitbedarf festgestellt, wobei wir die
Zeiten für die Herstellung der Suspension bzw. der Verreibung als gleich betrach¬
ten und deshalb ausser acht lassen wollen:
Zählkammermethode: Füllen und Durchmustern einer Kammer 15 min. 20 Zähl¬
kammern: 20-15 min = 300 min insgesamt.
Lycopodiummethode: Herstellung eines Präparates: 5 min
Aufsuchen der Koordinaten von 10 Gesichts¬
feldern in der Zufallszahlentafel, einstel¬
len, durchmustern 25 min
30 min
für 20 Präparate: 20 • 30 =600 min insgesamt.
Wir setzen die Werte in obige Gleichungen ein und erhalten:
für die Zählkammermethode:
1-5
In/t = = 3,68 • 10°
a90,6-300 ===========
für die Lycopodiummethode:
1-5
In/t. = = 1,526 • 10°
D109,3•600 ============
Bei der Lycopodiummethode ist das Ergebnis auch von der Anzahl Gesichtsfelder,
die pro Präparat analysiert wurden, abhängig. Haller (1) hat bei seinen Messun¬
gen an Herba Sabinae mit der Lycopodiummethode 25 Gesichtsfelder pro Präparat
ausgemessen; wir haben dieselben Berechnungen unter Zugrundelegung unseres
Zeitbedarfes auch mit seinen Messwerten angestellt und fanden:
Page 49
- 48 -
Waller = 2,29-10-°
Wir stellen abschliessend fest, dass die Zählkammermethode deutlich wirt¬
schaftlicher ist als die Lycopodiummethode.
6.1.2 Spezielle Untersuchungen für die Zählkammer m ethode
6.1. 2.1 Prüfung der Homogenität der Suspensionen
Die Frage, ob die Analysensubstanz gleichmässig in der Suspendierflüssigkeit
verteilt ist, ist für die Verwendung von Suspensionen in der quantitativen Mikrosko¬
pie von entscheidender Bedeutung. Auch wenn eine Suspension als homogen erscheint,
kann nach Youden (114) doch nie damit gerechnet werden. Youden empfiehlt,
die Stichproben nach dem Umschütteln an verschiedenen Stellen der Suspension zu
entnehmen.
Wir versuchten die Homogenität unserer Suspensionen an der auf Seite 39 be¬
schriebenen Suspension (0, 3097 g Herba Sabinae auf 10 ml) nachzuweisen. Die Sus¬
pension war mit 75 mg Aerosil ® Degussa, einem kolloiden Kieselsäurepräparat,
verdickt worden.
Wie bei Ziffer 6.1.1 wurde der jeweils gut umgeschüttelten Suspension in der
Reihenfolge der Entnahmestellen: Unten, in der Mitte und oben, Material für je
zwei Zählkammerfüllungen mit einer Spezialpipette entnommen und die Spaltöffnun¬
gen gezählt. Die Resultate sind in Tabelle 3 zusammengestellt.
Wir versuchten zunächst, die erhaltene Verteilung mit der Normalverteüung
und mit der Poisson'schen Verteilung zu vergleichen, um festzustellen, ob sie da¬
von stärker abweicht, als durch blossen Zufall erklärt werden kann.
Es zeigte sich jedoch bald, dass unsere Verteilung weder normal ist, noch
der Poisson'schen Formel folgt und somit nicht mit diesen verglichen werden kann.
Dieses Verhalten erklärt sich durch die Tatsache, dass die Spaltöffnungen nicht
alle unabhängig voneinander auftreten: Neben einzelnen Stomata fanden wir immer
wieder unversehrte Epidermisstücke, auf denen allein bis zu 15 Stomata zu zählen
waren. Diesen Stücken ist es zuzuschreiben, wenn wir für einzelne Zählkammern
Spaltöffnungszahlen fanden, die über die zu erwartenden Zahlen weit hinausgingen.
Die Stücke können durch verstärktes Mahlen nicht eliminiert werden, da dabei auch
Spaltöffnungen zerstört und somit nicht mehr erfasst würden.
Wir gruppierten deshalb die Ergebnisse der 60 Zählkammern nach den drei
Entnahmeorten: Unten, in der Mitte und oben, und versuchten festzustellen, ob die
Page 50
- 49 -
Unterschiede relevant sind. Sind sie es nicht, so kann angenommen werden, dass
die Suspension homogen ist.
Bei der nun folgenden Beschreibung der statistischen Arbeiten folgen wir eng
der Darstellung von Da vi es (3).
Wir zerlegen die Streuung in:
2Fehler der Stichprobe : Ü<
2Fehler der Analyse : ö"q
2Die Summe beider Fehlerkomponenten ergibt die Gesamtstreuung <S
,wenn auf ei¬
ne Analyse und eine Stichprobe basiert wird:
^2 «-2 .2d
=tfx+ or0
2tf
obei n Analysen aus einer Stichprobe ist der Analysenfehler —— und
rf2
«-2 -.2°
0
bei k Stichproben und n Analysen aus jeder Stichprobe:
2 °V(<*1 +-F"> d
2*
2
er2 = =-J-
+—2-
k k nk
wobei n k die Gesamtzahl Analysen bedeutet.
2Zur exakten Bestimmung von tf wären cd viele Analysen notwendig; man be¬
gnügt sich deshalb mit Schätzungen, die mit "s" bezeichnet werden.
Angenommen, wir haben
k Stichproben
n Analysen in jeder Stichprobe
N = kn Gesamtzahl Analysen
und folgende Bezeichnungen:
(x.,, x.0,... x. ) Analysen der i-ten Stichprobe\l \ü in
x. Mittelwert der i-ten Stichprobe ,
dann ist die
Varianz innerhalb der Stichproben:
oder die Schätzung des Analysenfehlers für eine Stichprobe:
n9
F (x,, - x/
j=l H l
(n-1)
und bei k Stichproben:
Page 51
- 50 -
-x2
i=* H(x.4 - x.)
k (n - 1)
Der Zähler wird Summenquadrat innerhalb der Stichproben (SQ ) genannt, im Nen¬
ner stehen die Freiheitsgrade (FG ) und der ganze Bruch ist das Durchschnittsqua¬
drat (DQQ).Varianz zwischen den Stichproben:
Die Varianz zwischen den Stichproben erhält man folgendermassen:
k
(k-l)ist eine Schätzung für <$« + —-—
oder:
n iL (x. - x)i=l
1
(k-l)
wobei wieder die Bezeichnungen gelten:
-<2 ^2
ntfl+ö0
SQX
FG,
= DQ,
Gesamt-Varianz:
Auch die Gesamtvarianz lässt sich auf diese Weise ermitteln:
k n
£ Z(x..-x)2SQ
=
i=l j=l1]
FG nk-i
Zusammenfassend ergibt sich folgendes Bild:
Herkunft der
Variation
Summenquadrat Freiheits¬
grad
Durchschnitts¬
quadrat
Geschätzte
Grösse
Zwischen
Stichproben
k2
n E (x. - xf = SQ,
i=ll l
k - 1
SQ,—L
= DQ1
k-ll
^2 ^2dQ +nö'1
Innerhalb
Stichproben
k n 9
5 5'v'M k(n - 1)SQQ
_°_=DQk(n-l)
° «o2
Total s £<v»* nk - 1
Page 52
- 51 -
In der Praxis berechnet man lediglich das SQ^ und SQzwischen den gtlch_
proben'durch Subtraktion erhält man dann das SQ.^^ der 8üchproben.
Für die Ausrechnung nimmt man die bequemeren Ausdrücke:
SQ,
zwischen Stichproben
SQ,
total
Z^ Hijii=l n
k
zi=l
n
Z x..2
/ k n \!
51 Zxii\i=l j=l 1]/
nk
/k n \2
nk
In unserem Falle betrachten wir die drei Entnahmeorte als Stichproben und
die Resultate jeder Zählkammer als Analyse. Es sind dann zuberechnen (vergl. Tab. 3):
k n
Z Zx2i=l j=l
lJ
k
zi=l
(kl•
k n \J
Z Z x..
i=l j=l 1]/
nk
12 492
2832 202,52 276,52
20
762'
60
20 20
= 9 878
9 677
SQ,total
SQZwischen Entnahmeorten
12492 - 9677 = 2815
9 878 - 9 677 = 201
SQ.nnerhalb Entnahmeorte
2 614
Zusammengefasst erhalten wir:
SQ FG DQ
zwischen Entnahmeorten 201 2 100,5
innerhalb Entnahmeorte 2614 57 45,9
Total 2815 59
Page 53
- 52 -
Tabelle 3 Prüfung der Homogenität von Suspensionen
Messergebnisse einer Zählkammer bei Substanzentnahmenan verschiedenen Stellen der Suspension
Zähl¬ Anzahl Spaltöffnungen Zähl¬ Anzahl Spaltöffnungenkammer kammer
Entnahmestellen Entnahmestellenunten mitte oben unten mitte oben
No Xlj x2j X3j No Xlj x2j x3j
1 13,5 36 8,52 9,5 37 12,03 15,5 38 10,54 7,5 39 8,05 12,5 40 11,56 21,0 41 4,07 13,5 42 29,58 18,5 43 3,09 8,0 44 18,0
10 10,0 45 7,011 14,0 46 11,012 30,0 47 8,013 15,0 48 10,514 18,0 49 20,515 13,0 50 5,016 18,5 51 3,017 8,5 52 7,018 17,0 53 12,519 7,5 54 6,520 4,5 55 15,521 10,0 56 17,022 25,5 57 10,523 4,5 58 9,024 7,5 59 7,525 24,5 60 19,526
2722,5
5,0 Total 283,0 202,5 276,528
2928,5
15,5 Total aller Entnahmestellen: 762,030
3126,5
5,5 Mittel 14,15 10,1 13,832
33
34
35
5,58,09,5
Mittel aller Werte: 12, 7
13,0
Page 54
- 53 -
2Wir haben zu Beginn die Fehlerkomponente aus den Entnahmeorten mit tf.
bezeichnet. Wir stellen nun die Nullhypothese auf, dass zwischen den verschiedenen
2Entnahmeorten keine Streuung besteht: CT, =0. Dann wird das DQ. (Schätzung von
2 2 o
dq
+ n tf«) auch eine Schätzung von d Qz, wie das DQ,und wir können an Hand
des F-Testes prüfen, ob beide DQ sich signifikant unterscheiden.
Man errechnet das Verhältnis beider DQ:
DQi FG,
F - Verhältnis =
l
DQ0 FG0
und sucht in einer F - Tabelle die Werte für die Vertrauensgrenzen 0,05 und 0,01
auf. Sind die Tabellenwerte niedriger als das errechnete Verhältnis, so ist die Null¬
hypothese zu verwerfen.
In unserem Falle finden wir:
100,5 FG. = 2
F - Verhältnis = = 2,19*
45,9 FG0 = 57
und in der Tabelle: 0,05: 3,14
0,01: 5,01
Die Nullhypothese, dass keine Variation zwischen den Entnahmeorten besteht, wird
nicht entkräftet.
Auch wenn unsere Verteilung nicht normal ist, ist das Ergebnis des F-Testes
aufschlussreich, denn für unsere Verteilung müssten die Vertrauensgrenzen sogar
eher weiter gefasst werden. Ausserdem wäre die starke Abweichung des Mittels der
Werte der mittleren Entnahmestelle gegenüber dem der Entnahmeorte unten und
oben anders als durch den Zufall schwer erklärbar; auf keinen Fall kann dieses
Phänomen durch Sedimentation oder Aufrahmen bedingt sein, da sonst die Werte
unten oder oben abweichen müssten.
6.1. 2. 2 Prüfung auf Zufälligkeit der Partikelverteilung in einer Zählkammer
Die von uns verwendeten Blutzählkammern werden gefüllt, indem 1 Tropfen
der Drogensuspension auf den Glassteg in der Mitte der Kammer gebracht und mit
einem Deckglas bedeckt wird. Durch das Gewicht des Deckglases und das Fixieren
des Glases mit Klammern wird der Suspensionstropfen in die Breite gedrückt. Wir
stellten uns die Frage, ob dadurch eine ungleichmässige Verteilung der Partikel in
der Zählkammer entstehen könnte, insofern als die Suspensionsflüssigkeit bevor¬
zugt nach den Rändern des Tropfens gedrängt werden könnte, was natürlich das Mi¬
schungsverhältnis im Messgebiet verändern würde.
Wir wählten als Messobjekt Cannastärke (C an na edulis Edw).
0,4418 g Cannastärke wurden in 50 ml Glycerin (IT.)- Wasser (IT.)- Gemisch
Page 55
- 54 -
suspendiert, 2 Stunden lang in der Schüttelmaschine bei einer Frequenz von 2 Hz
dispergiert und 1 Tropfen dieser Suspension in eine Zählkammer nach Türk gebracht.2
Die Gesamtfläche der Zählkammer, 3x3 mm = 9 mm,wurde der Breite nach in
3 Streifen von je 1 mm Breite und diese der Länge nach in je 12 Abschnitte von 1 mm
Breite und 0,25 mm Höhe eingeteilt. Auf diese Weise erhielten wir 36 gleichgrosse
Teilflächen. Die Anzahl Stärkekörner innerhalb jeder Teilfläche wurde ermittelt.
Tabelle 4 zeigt die Ergebnisse; die Anordnung der Teilflächen in der Tabelle gibt
die tatsächliche Anordnung in der Zählkammer wieder.
Tabelle 4 Anzahl Stärkekörner in den Teilflächen einer Zählkammer, die mit
einer Suspension von Cannastärke beschickt wurde
Teil- Anzahl Teil- Anzahl Teil¬ Anzahl
fläche Stärkekörner fläche Stärkekörner fläche Stärkekörner
1 20 13 22 25 16
2 18 14 10 26 12
3 14 15 20 27 16
4 14 16 17 28 11
5 26 17 18 29 17
6 16 18 33 30 13
7 18 19 11 31 12
8 20 20 18 32 18
9 12 21 17 33 10
10 14 22 16 34 13
11 19 23 15 35 9
12 21 24 14 36 18
Insgesamt 588 Stärkekörner
Zur Analyse teilen wir die Teilflächen nach ihren Frequenzen an Stärkekör¬
nern in 6 Grössenklassen auf.
Wenn die Suspensionsteilchen rein zufällig in der Zählkammer verteilt sind,
muss die Anzahl Teilflächen in den Grössenklassen "normal" sein, d.h. der Gauss1
sehen Glockenkurve folgen. Wenn man die erhaltenen Zahlen betrachtet, scheint dies
der Fall zu sein.
Rechnerisch geht man so vor, dass man die erhaltene Verteilung, Klasse um
Klasse mit einer Normalverteilung mit gleichem Mittelwert und gleicher Varianz
vergleicht und prüft, ob die Abweichungen nur durch den Zufall bedingt sind oder
nicht.
Das Verfahren ist in Tabelle 5 ausführlich dargestellt. In den einzelnen Spal¬
ten stehen folgende Werte oder es wurden folgende Operationen vorgenommen:
Spalte I Klassengrenzen und Klassenmitten (x) in Anzahl Stärkekörnern.
Spalte n Anzahl Zählkammerteilflächen (f'), die in die betreffende Klasse
fallen.
Page 56
Tabelle 5 Prüfung auf Zufälligkeit einer Verteilung von Stärkekörnern in einer Zählkammer
Messwerte Berechnung von Mittelwert
und Streuungx2- Verfahren
Klassen¬
mitte grenzen
Frequen¬zen
Flächen Flächen¬
differenzen
Theoretische
Häufigkeiten
Beobachtete
Häufigkeiten
X f» d d-r d2-f» (x-x) ¥-«' f f» (f-f) (MO2 (f-f)2f
I II m iv=ii-in v=m2- n VI vn vm IX X=K-36 xi=n XH xm XIV
7,5 8,584 2,176 0,48524
9 3 -3 -9 27 0,06365 2,29' 3'
10,5 5,584 1,416 0,42160 •8,69 l 10 -1,31 1,7161 0,1975
12 7 -2 -14 28 0,17764 6,40 7
13,5 2,584 0,6555 0,24396
15
16,5
9 -1 -9 9
0,416 0,1054 0,04196
0, 28592 10,29 9 1,29 1,6641 0,1617
18
19,5
10 0 - - -
3,416 0,866 0,30678
0, 26482 9,53 10 -0,47 0,2209 0,0232
21 5 1 +5 5 0,14128 5,09 5
22,5 6,416 1,626 0,44806 • '6,65 - 7 -0,35 0,1225 0,0184
24 2 2 +4 8 0,04345 1,56. 2
25,5 9,416 2,387 0,49151
36.-32 +9
-23.77 0, 97676 35,16 36 0,4008
=x2
Hilfsmittel: Xjj= 18,0
Gruppenbreite: w =3
b =
^d-f'=:
I2! _ . 0 63936
'
Mittelwert: x = x„ + w b
= 18,0 + 3(-0,639)
x = 16,084
Varianz: s -l-f^-"2)s2 = 9 2| - 9-0,408
36'
s" = 15,57
s = 3,945
Page 57
Leer - Vide - Empty
Page 58
- 57 -
Spalte III Wir nehmen, damit die Zahlen einfacher werden, einen Hilfsmittel¬
wert von 18,0 an; die Zahlen bedeuten den Abstand der Klassenmit¬
ten vom Hilfsmittel in Klassenbreiten als Einheit (d).
Spalten HI-V dienen zur Berechnung des Mittelwertes und der Streuung nach den
auf der Tabelle verzeichneten Formeln.
Spalten VI-X enthalten die Berechnung der theoretischen Häufigkeiten für eine
Normalverteilung mit dem gleichen Mittelwert und der gleichen Va¬
rianz wie unsere Prüfverteilung.
Spalte VI Abweichung der Klassengrenzen vom beobachteten Mittelwert
(16,084).
Spalte VB Wir dividieren die Abweichungen durch die beobachtete Streuung
und erhalten damit Werte, die der "Einheitsform" der Normalver¬
teilung entsprechen (Fläche unter der Kurve = 1).
Spalte VIII An Hand einer Tabelle werden die den verschiedenen Abweichungen
vom Mittelwert entsprechenden Flächen unter der Normalverteilungs¬
kurve festgestellt. Die Fläche unter der Normalverteilungskurve,
von ihrem Ursprung bis zu einer bestimmten Abweichung, entspricht
der Häufigkeit der Fälle, mit deren Eintreten innerhalb dieses Be¬
reiches bei Normalverteilung gerechnet werden muss.
Spalte IX Wir bilden die Differenzen der Flächen, um den Flächenanteil jeder
Klasse zu erhalten.
Spalte X Die Flächenanteile (im Mass der Einheitsverteilung) werden mit 36
multipliziert und damit in eine Verteilung mit der Gesamtfläche =
Häufigkeitssumme 36 umgewandelt = gesuchte theoretische Häufig¬
keiten (f).
Spalte XI enthält die beobachteten Häufigkeiten (f'). Die Häufigkeiten sollen
nicht kleiner als 5 sein; sowohl in Spalte X (f) alf auch in Spalte XI
(f') wurden die Endgruppen deshalb zusammengezogen.
Spalten xn-XIV Für jedes Wertepaar bilden wir den Ausdruck:
(f-f)2f
Die Summe ist unser Kriterium,mit dem wir die Signifikanz der
Unterschiede zwischen Normalverteilung und Prüfverteilung fest¬
stellen:9
o
Wir erhalten ein X von 0,4008. Mit 3 Freiheitsgraden liegt die-
Page 59
- 58 -
ser Wert in der X -Tafel zwischen den Wahrscheinlichkeitspunkten2
0, 90 und 0, 95, d. h. die Wahrscheinlichkeit, dass ein X bei 3 Frei¬
heitsgraden den Wert von 0, 4 übertrifft, ist etwa 6 %. Die Unter¬
schiede sind demnach nicht signifikant und wir können annehmen,
dass beim Füllen der Zählkammer keine Entmischung stattfindet.
6.1.3 Spezielle Untersuchungen für die Lycopodiummethode
6.1. 3.1 Bestimmung der Lycopodiumzahl
Die Lycopodiumzahl L, das ist die Anzahl Lycopodiumsporen in einem Milli¬
gramm Lycopodium, ist für quantitative Bestimmungen nach der Lycopodiummetho-
de von grundlegender Bedeutung, sofern nicht nach Wallis (39) mit Vergleichs¬
präparaten gearbeitet wird, denn durch sie wird die Anzahl Lycopodiumsporen im
Gesichtsfeld mit dem Verhältnis Lyeopodium-Substanz im Präparat in Beziehung ge¬
setzt und eine Messung der Substanzmenge im Präparat als Funktion der Anzahl
Lycopodiumsporen erst möglich.
Wir haben die Bestimmung der Lycopodiumzahl wiederholt, obwohl sie schon
von Wallis (115,116), Liverseege (52) und Haller (1) vorgenommen worden
war, weil diese Bestimmung im Sinne der Forderung von Wallis (50), dass meh¬
rere Analytiker dieselbe Bestimmung vornehmen sollten, um Vergleichswerte zu
gewinnen, etwa die Bedeutung einer Test-Bestimmung erlangt hat. Wir wollten er¬
fahren, ob wir unseren mit der Zählkammer gewonnenen Wert an die der anderen
Autoren anschliessen können. Zudem haben wir in der Literatur keine Angaben über
die Streuung der Bestimmungen finden können und wir wollten diese Lücke schlies-
sen.
Zur Bestimmung wurden 36, 3 mg Lycopodium in 10 ml Chloralhydrat (100, 0)-
Glycerin(90,0)-Mischung suspendiert, die zur Verdickung 10,0 Aerosil ^Degussa3
enthielt. In 1 mm waren demnach 0,00363 mg Lycopodium enthalten. Der Suspen¬
sion wurde nach jedesmaligem guten Umschütteln 20-mal je 1 Tropfen entnommen,
der in eine Zählkammer nach Türk gebracht wurde; die Sporen in der gesamten
Kammer wurden ausgezählt.
In Tabelle 6 sind die Messwerte der 20 Zählkammerfüllungen festgehalten.
Als Mittelwert dieser 20 Bestimmungen erhielten wir 313 Sporen/Zählkammer.2
Das Zählkammerfeld ist 9 mm gross und die Zählkammer 0,1 mm tief, so dass
3bei jeder Füllung 0, 9 mm zur Messung gelangten.
Page 60
- 59 -
Tabelle 6 Bestimmung der Lycopodiumzahl
Zählkammer Lycopodiumsporen
No X X2
1 281 78 961
2 320 102 400
3 330 108 900
4 294 86 436
5 287 82 369
6 293 85 849
7 308 94864
8 290 84100
9 324 104 976
10 270 72 900
11 305 93 025
12 305 93 025
13 331 109 561
14 383 146 689
15 301 90 601
16 288 82 944
17 293 85 849
18 353 124 609
19 338 114 244
20 366 133 956
Summen: 6 260 1976 258
Mittelwert: x = 313 Sporen
Zx2 - (Zx)2/n 1976 258 - i^°_Varianz = =
n - 1 19
= 888, 32
29,8Streuung: s = V888.3229,8
Streuung des Mittelwertes: s_ =tj=>^—
= 6,66V20
Relative Streuung des Mittelwertes
6, 66 • 100
x relS1S
_ 2,13 %
313 SWir erhalten damit: —— = 347,8 Sporen/mm Suspension
0, 9
.347,8
und: '—
0,0036395810 Sporen/mg Lycopodium.
Page 61
- 60 -
Die Streuung des Mittelwertes wurde mit s- ,= 2,13 % errechnet und die
Vertrauensgrenzen liegen damit, mit einer Wahrscheinlichkeit von 95 %, bei
- 4 250 Sporen/mg. Als Lycopodiumzahl erhalten wir schliesslich:
LQ 95= 95 810 - 4 250 Sporen/mg
Die Lycopodiumzahlen von Wallis (94000 resp. 95000) und von Haller (97323 resp.
93 737) liegen sehr gut innerhalb des Vertrauensbereiches unserer Zahl; lediglich
der Wert von Liverseege (83 300) ist tiefer.
6.1. 3. 2 Korrelation zwischen Messelementen und Anzahl Lycopodiumsporen
Wie für Einzelwerte ein Mittelwert berechnet wird, um ihre Gesamtheit in
einer einzigen Zahl auszudrücken, werden Wertepaare, die in einer Ebene ver¬
streut liegen, durch eine Mittelwertslinie repräsentiert, die Regressionslinie. Die
Entfernung der Einzelwerte vom Mittelwert, ihre mehr oder weniger grosse Streu¬
ung, kommt in der Varianz zum Ausdruck. Bei den Wertepaaren wird analog der
Abstand zur Regressionslinie als Masstab benutzt, man berechnet den Bravais-
Pearson'sehen Korrelationskoeffizienten r:
Z(x- x) (y - y)r =if
VEfr - x)2 Z(y - y)2
wobei x und y je ein Wertepaar bilden.
r bewegt sich zwischen -1 und +1. Bei r = 0 besteht überhaupt keine Relation
zwischen beiden Wertereihen, r = 1 bedeutet eine absolute Abhängigkeit, d.h. die die
Wertepaare darstellenden Punkte befinden sich auf der Regressionslinie. Beim
positiven Vorzeichen nehmen beide Werte im gleichen Sinne zu, ist das Vorzeichen
negativ, so nimmt der eine Wert zu, wenn der andere Wert abnimmt.
In der Korrelation kommt die mehr oder weniger grosse Abhängigkeit zweier
Komponenten zum Ausdruck, in unserem Falle können wir daraus ersehen, ob die
Anzahl Messelemente stark mit der Anzahl Lycopodiumsporen variiert, ob also
die Sporenzahl z. B. schon auf der Ebene des einzelnen Gesichtsfeldes als Mass für
die vorhandene Substanzmenge dienen kann, oder ob dies erst auf der Ebene des
Präparates oder gar der des ganzen Versuches möglich ist. Diese Feststellung ist
notwendig, um zu entscheiden, ob die Anzahl Messelemente im Gesichtsfeld oder
Präparat mit der Anzahl Lycopodiumsporen gewichtet werden soll oder nicht, wie
wir schon auf Seite 40 ausführten.
Page 62
- 61 -
Zur Untersuchung verwenden wir die Ergebnisse der für den Vergleich der
Lycopodiummethode mit der Zählkammermethode ausgemessenen Präparateserie,
die in Tabelle 2 auf Seite 42 - 46 verzeichnet sind.
Wir bezeichnen die gefundene Anzahl Lycopodiumsporen mit x und die der
Spaltöffnungen mit y.
Durch Umformung lassen sich die Glieder obiger Formel für r wie folgt ver¬
einfachen:
ZxZyn
n
(Ey)2J
n
n = Anzahl Wertepaare
Wir berechnen zuerst r für die Wertepaare jedes Gesichtsfeldes:
EL(x - x)(y - y) = Zxy
2I(x - x)2 v 2= 2_x
Z(y - y)2 v2
Zy
Z(x - x)(y - y) 110,95
ZI(x - x)2 2688, 55
^(y - y)2 938,29
110,95und r = — = 0,0698
V2688,55-938,2£ ======
Der Korrelationskoeffizient ist so nahe bei Null, dass praktisch Lycopodien-
und Stomata-Anzahl im Gesichtsfeld als unabhängig voneinander betrachtet werden
müssen.
Wir haben daraufhin die Werte der Gesichtsfelder für jedes Präparat für sich
summiert und mit einem Wertepaar pro Präparat die Berechnung wiederholt.Wir
erhalten:
r = 0,688
Der Korrelationskoeffizient ist positiv, d. h. bei Zunahme der Anzahl Lyco¬
podiumsporen im Präparat werden auch mehr Stomata beobachtet; seine Höhe zeigt,
dass eine signifikante Korrelation zwischen Lycopodien und Stomata besteht. Die
Signifikanz ersieht man, wenn man die Signifikanzhöhe für 5 % und 1 % für (n - 2)
= 18 Freiheitsgrade aus einer speziellen Tabelle entnimmt: 5 %: 0,444 und 1 %:
0, 561, die unter unserem Wert liegen.
Wir stellen fest, dass auf Gesichtsfeldebene Messelemente und Lycopodium¬
sporen ganz unabhängig voneinander streuen, auf Präparateebene besteht dagegen
Page 63
- 62 -
eine gewisse Korrelation. Sie ist jedoch - unserer Ansicht nach - nicht stark genug,
um eine Verwendung der Anzahl Lycopodiumsporen zur Gewichtung der Ergebnisse
zu rechtfertigen.
6.1.4 Auswahl des Flächenmessverfahrens für die Flächenmess-
methode
Unter Ziffer 4.3 haben wir verschiedene Flächenmessmethoden beschrieben,
die für mikroskopische Zwecke geeignet sind. Alle erfordern einen unterschiedlichen
Zeitaufwand und arbeiten mit verschiedenen Streuungen. Zur Auswahl der am besten
geeigneten Methode war deshalb die Bestimmung der Streuung und des notwendigen
Zeitbedarfes bei jeder Methode unentbehrlich. An Hand dieser beidenWerte könnenwir
wiederum nach der auf Seite 47 beschriebenen Methode unseren Entscheid treffen,
d. h. das Verfahren auswählen, das die meiste "Information" pro Zeiteinheit liefert.
Die Formel lautet hier wie auf Seite 47, nur dass wir statt mit der Streuung des
Mittelwertes, s-,mit der Streuung der Einzelwerte, s
,rechnen:
In/t
i-2
1 x
sZrel • t t. s2- 10000
wobei: x = das arithmetische Mittel der Einzelwerte
t = die Zeit für eine Messung2
s = die Varianz der Einzelwerte ist.
Als Testfläche (Abb. 7) diente uns bei allen Verfahren das gleiche, auf 24, 5 cm
vergrosserte Stück aus der Steinzellschicht der Samenschale von Semen Sinapis. Wir
haben dieses natürliche Objekt irgendwelchen geometrischen Figuren vorgezogen, um
den Gegebenheiten im Versuch möglichst nahe zu kommen und systematische Fehler
infolge einer regelmässigen Form auszuschliessen.
Die Testfläche wurde bei allen Verfahren 31-mal gemessen, um den Anforde¬
rungen der Statistik auf eine hinreichend grosse Stichprobe Genüge zu leisten.
Die Untersuchung erstreckte sich auf folgende Flächenmessverfahren:
6.1.4.1 Planimeter
Die Messung wurde mit dem Kompensations-Polarplanimeter nach Coradi
(vgl. Abb. 1), wie auf Seite 22/23 beschrieben, durchgeführt.
6.1.4.2 Wägemethode
Die Messfläche wurde 31-mal auf durchsichtigem Zeichenpapier aufgetragen,
2
Page 64
- 63 -
Abb. 7 Testfläche (24,5 cni )
mit einem sehr feinen Scherchen genau ausgeschnitten und auf der Analysenwaage
gewogen. Da Gewichtsschwankungen infolge verschieden grosser Absorption von
Luftfeuchtigkeit nicht ausgeschlossen sind, wurde als Bezugsgrösse aus demselben
Papier eine Eichfläche genau bekannter Grösse ausgeschnitten, mit den Messflächen
zusammen aufbewahrt und im Zeitpunkt der Wägung der Messflächen damit das spe¬
zifische Gewicht pro Flächeneinheit bestimmt.
6.1.4. 3 Zeiss Teüchengrössen-Analysator nach E n d t e r
Zur Messung stellte uns die Firma Degussa in Konstanz freundlicherweise ihr
Gerät zur Verfügung. Die Testfläche wurde 31-mal in verkleinertem Masstab (der
Apparat misst nur Flächen innerhalb eines bestimmten Grössenbereiches) in zufäl¬
ligen Stellungen auf Film kopiert und mit dem Teilchengrössen-Analysator gemes¬
sen. Die Angabe des Zeitbedarfes bereitete uns hier einige Schwierigkeiten, denn
während die für die eigentliche Messung notwendige Zeit lediglich festzustellen ist,
ist der Zeitbedarf für die Vorbereitungsarbeiten, d. h. die Herstellung der Negative,
sehr verschieden und auch abhängig von der Anzahl Flächen, die auf ein Negativ ge¬
bracht werden können. Da der Apparat nur Teilchen bis zu einer bestimmten Grös¬
se misst, müssen sie unter Umständen nachträglich optisch verkleinert werden:
Von einer ersten Aufnahme muss eine Verkleinerung für die Ausmessung angefertigt
werden.
Im Falle einer Messung von Semen Sinapis sind die Flächenunterschiede der
Messelemente grösser als der Messbereich der Apparatur und die Messflächen in¬
nerhalb des Präparates derart verstreut, dass nur wenige jeweils auf eine Aufnah-
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- 64 -
me kämen, was umständliche photographische Vorarbeiten bedingen würde. Wir
schätzen den gesamten Zeitaufwand in diesem Fall auf etwa 5 min pro Fläche.
In Tabelle 7 ist als erster Wert der Zeitbedarf für die Messung allein und als
zweiter Wert der gesamte Zeitbedarf angegeben.
6.1. 4.4 Integrationstisch
Wie auch bei der folgenden Messmethode, war es hier vorteilhafter, das Ver¬
fahren auf dem Papier zu simulieren: Vom Mittelpunkt der Testfläche aus wurde ei¬
ne Linienschar (10 Linien) mit gleichem Winkelabstand in der Art einer Rosette ge¬
zogen und von 0 bis 9 numeriert. Auf durchsichtigem Millimeterpapier wurde ein
Liniengitter mit 1 cm Linienabstand gezeichnet. Aus einer Zufallszahlentabelle wur¬
de nun eine Zahl entnommen und mit ihr eine Linie aus der Linienschar auf der
Messfläche bezeichnet. Wir legten das Liniengitter parallel zu dieser Linie auf die
Testfläche und massen die Linienabschnitte des Gitters, die innerhalb der Testflä¬
che verliefen. An Hand der Zufallszahlen wurden 31 derartige Stellungen ausgemes¬
sen. Dieses etwas umständliche Verfahren war notwendig, um weder die Längs-
noch die Schmalseite der Testfläche frequenzmässig zu bevorzugen.
6.1.4.5 Punktzählverfahren
Zur Simulierung verfertigten wir Punktenetze auf durchsichtigem Millimeter¬
papier, die wieder 31-mal in zufälliger Weise über die Testfläche gelegt wurden.
Wir zählten jedesmal die innerhalb der Messfläche liegenden Punkte. Da wir erfah¬
ren wollten, wie sich Streuung und Zeitbedarf bei einer Aenderung des Punkteab-
standes verhalten, führten wir die Messung mit Netzen von 2 cm, 1 cm und 0, 5 cm
Punktabstand durch. Je nach ihrem Abstand voneinander repräsentieren die Punkte
eine bestimmte Fläche = spezifische Fläche. Die gemessene Fläche ergibt sich aus
dem Produkt von Trefferzahl und spezifischer Fläche.
6.1.4.6 Ergebnisse
In Tabelle 7 sind die Untersuchungsergebnisse mit den verschiedenen Mess¬
methoden zusammengestellt. Man ersieht daraus sofort, dass die Planimeterme-
thode als Methode betrachtet am leistungsfähigsten ist: Sie liefert am meisten In¬
formation in der Zeiteinheit.
Es ist jedoch nicht zu vergessen, dass diese Ergebnisse nur die Messfehler
2bedeuten (= s«), d. h. nur etwas über die Messgeräte bzw. Messverfahren aussagen.
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- 65 -
Tabelle 7 Ergebnisse zur Auswahl des Flächenmessverfahrens
Methode Streuung Information Zeitbedarf Information
in der Zeit¬
einheit
srelVs
,' relmin/Fläche
% In t In/t
Planimeter 0,33 9,18 1,94 4,73
Wägemethode 0,67 2,24 4,03 0,556
Teilchengrössen-Analysator
2,5 0,160,0835,0*)
1,9280,032
Liniengitter a = 1 cm 2,86 0,122 2,26 U,054
Punktenetz a = 2 cm 14,55 0, 0047 0,26 0,018
Punktenetz a = 1 cm 3,395 0,0868 0,32 0,271
Punktenetz a = 0,5 cm 1,467 0,464 1,35 0,344
*) vgl. Seite 63: Erster Wert : Zeitbedarf für die MessungZweiter Wert: Gesamter Zeitbedarf
Wir haben ja stets die gleiche Fläche ausgemessen! Wie wir auf Seite 49 sahen, ist
die Gesamtstreuung jedoch die Summe aus dem Messfehler und aus dem Stichproben¬
fehler (=tf j):«-2 ^2 .2<r =
C1+ tf0
Letzterer entsteht durch die zufällige Auswahl der Stichprobe aus der Gesamtheit
und wurde oben nicht berücksichtigt. Bei pharmakognostischen Analysen erfolgt
diese Auswahl sogar in mehreren Stufen bis zur Menge des einen Tropfens Suspen¬
sion, der zur Füllung einer Zählkammer notwendig ist.
Bei unseren ersten Messungen an Fructus Anisi stellten wir Gesamtfehler in
der Grössenordnung von bis zu 45 % fest. Da wir beim Planimeter - wie wir eben
gefunden haben - mit einem Messfehler von 0, 33 % rechnen müssen, ist der Stich¬
probenfehler praktisch mit dem Gesamtfehler identisch. Der Gesamtfehler kann
also nur verringert werden, indem der Stichprobenfehler herabgesetzt wird. Dies
kann durch Vermehrung der Anzahl Stichproben geschehen; die Genauigkeit nimmt
dabei mit der Quadratwurzel aus der Anzahl Stichproben zu.
Page 67
- 66 -
Henni g (21) weist nun aber darauf hin, dass der Gesamtfehler auch ohne
grösseren Zeitaufwand reduziert werden kann, wenn statt einer sehr genauen Mess¬
methode, wie dem Planimeter, eine Methode gewählt wird, die gröber, aber wesent¬
lich schneller arbeitet, wie das Punktzählverfahren, und so in der gleichen Zeit ein
Vielfaches an Stichproben erfasst. Mit unseren Zahlen lässt sich dies beispielsweise
folgendermassen veranschaulichen:
Messung mit dem Planimeter:
Gesamtfehler: 45%
Messfehler (Planimeter): 0,33%
Zeitbedarf: 1, 94 min/Fläche
Stichprobenfehler demnach:
2
sl=-- 2025 - 0,11 = 2024, 8£
sl'= 44,99%
Messung mit dem Punktnetz a = 1 cm:
Messfehler: 3, 4 %
Zeitbedarf: 0, 32 min/Fläche1 94
es werden in der gleichen Zeit (,l"in= 6,05-mal mehr
Stichproben ausgemessen; der Stichprobenfehler ist
damit: ,4,4'", = 18, 29 %V6,05
und der Gesamtfehler: s = 11,56 + 334,5 = 346,06
s = 18,6 %
Theoretisch am günstigsten wäre ein Verfahren, bei dem s.. und sQ- bei entspre¬
chendem Zeitgewinn - einander möglichst angeglichen würden.
Was den Punkteabstand des Netzes betrifft, so sehen wir am obigen Beispiel,
dass der Abstand von 1 cm noch zu klein war, denn der Messfehler ist noch viel
kleiner als der Stichprobenfehler. Mit dem weiteren Netz, Punkteabstand a = 2cm,
erhalten wir jedoch nach unserer obigen Rechnung wieder einen Gesamtfehler von
22 %, weil der Zeitgewinn, trotz des weiteren Gitters, bei der Messung nicht mehr
wesentlich vergrössert werden konnte. Der optimale Abstand ist in unserem Falle
2zwischen 1 und 2 cm zu suchen, bei einer Grösse der Testfläche von 24, 5 cm .
Page 68
- 67 -
6.1.5 Untersuchung über den Einfluss der Flächenform auf die
Ergebnisse des Punktzählverfahrens
Auf Seite 33 führten wir aus, dass die Streuung beim Punktzählverfahren an
Hand bestimmter Formeln zum voraus berechnet werden kann. Die Standardabwei¬
chung,
s =ioo\/I°°Zp
rel V P-n'
wird hierbei lediglich vom prozentualen Anteil der Messflächen an der Gesichtsfeld¬
fläche (p) und von der gesamten Anzahl Messpunkte (n) bestimmt. Die Gestalt der
Messfläche, d.h. ob sie in einem Stück mit langer oder kurzer Begrenzungslinie oder
in zahlreichen Teilstücken vorliegt, ist ohne Einfluss auf die Formel. Da bei der
Messung jedoch ein physiologischer Faktor infolge Mitwirkung des Auges auftritt,
stellten wir uns die Frage, ob die Gestalt der Messfläche praktisch tatsächlich ohne
Einfluss auf die Messgenauigkeit ist. Folgender Modellversuch wurde durchgeführt:2
Es wurden 3 Testflächen angefertigt, die in einem Quadrat von 100 cm Fläche,2
50 cm Messfläche enthielten, bei der Testfläche I in Form eines einzigen Kreises,o
bei der Testfläche II in Form von 10 Kreisen zu je 5 cm und bei Testfläche in von
220 Kreisen zu je 2, 5 cm (vgl. Abb. 8). Jede Testfläche wurde mit drei verschiede¬
nen, auf transparentem Papier gezeichneten Punktegittern mit den Punktabständen
a = 2 cm, a = 1 cm und a = 0,5 cm, 31-mal in zufälliger Weise bedeckt und die Tref¬
ferpunkte (Punkte innerhalb der Messflächen) gezählt. Für jede Messreihe wurde die
relative Standardabweichung berechnet. Tabelle 8 zeigt die erhaltenen Werte:
Testfläche I Testfläche H Testfläche IH
Abb. 8 Testkreise
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- 68 -
Tabelle 8 Relative Standardabweichungen bei der Messung dreier Testflächen
mit drei verschiedenen Messgittern
Relative Standardabweichung
Testfläche
a = 2 cm
Gitter
a = 1 cm a = 0, 5 cm
I 6,7% 2,4% 1,0%
n 12,1% 5,3% 1,4%
m 18,8% 7,6% 1,7%
Wir sehen, dass die Messgenauigkeit mit Zunahme der Unterteilung der Flä¬
che bzw. mit Vergrösserung des Flächenumfanges bei gleichbleibender Fläche ab¬
nimmt, was nach obiger Formel nicht zu erwarten war.
Wir können diese Verringerung der Messgenauigkeit nicht exakt erklären. Sie
erscheint jedoch plausibel, wenn man bedenkt, dass mit Verlängerung des Umfanges
sich bei den Messungen immer häufiger Punkte auf der Begrenzungslinie der Fläche
befinden, dass also bei einem immer grösseren Prozentsatz der Punkte der Beobach¬
ter entscheiden muss, ob der Punkt sich innerhalb oder ausserhalb der Fläche befin¬
det. Daraus muss natürlich eine grössere Streuung der Messergebnisse folgen.
Wenn man das Problem mathematisch betrachtet, muss man davon ausgehen,
dass jeder Punkt einen gewissen Flächenanteil repräsentiert. Die Flächenteile der
randständigen, inneren und äusseren Punkte ragen mehr oder weniger aus der Mess¬
fläche heraus oder in sie hinein. Bei der Zählung der innen liegenden Punkte wird
dann die Messfläche überbewertet und dadurch, dass die aussen liegenden nicht ge¬
zählt werden, unterbewertet; die hohe Punktezahl, die im Laufe einer Messung be¬
rücksichtigt wird, ermöglicht schliesslich den statistischen Ausgleich dieser Fehler.
Die Streuung der Messergebnisse rührt aber von diesen randständigen Punkten her,
denn die Fläche der weiter innen liegenden Punkte wird ja stets richtig bewertet.
Bei der Vergrösserung des Umfanges verschiebt sich das Zahlenverhältnis zwischen
"Rand"- und "Innen"-Punkten zugunsten der "Randpunkte": Der Messfehler nimmt
zu.
Wir versuchten nun weiter, diese Aenderung der Streuung vom Verhältnis zwi¬
schen der Grösse eines Testkreises und dem Punkteabstand des verwendeten Gitters
abzuleiten: Wir bildeten dazu das Verhältnis aus der Fläche eines einzelnen Testkrei¬
ses (TF) und der "Spezifischen Fläche" (GF) (vgl. Seite 64): TF/GF. Wir erhalten
die in Tabelle 9 aufgeführten Werte:
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- 69 -
Tabelle 9 Verhältnisse der Testkreisflächen zu den "spezifischen Flächen" bei der
Messung dreier Testflächen mit drei verschiedenen Messgittern
Verhältnis der Testkreisfläche zur spezifischenFläche
Testflächea = 2 cm
Gitter
a = 1 cm a = 0, 5 cm
I 8% 2% 0,5%
n 80% 20% 5 %
m 160% 40% 10 %
Da wir bei Testfläche II und III jedesmal 10 bzw. 20 Kreise ausmessen, bedeutet
die erhaltene relative Standardabweichung den Fehler für eine Messung mit 10 bzw.
20 Testen. Um die Werte für einen einzelnen Kreis zu erhalten, muss nach folgenden
Formeln umgerechnet werden:
s - tflO =
s10
s -tf20 =
s2Q
und wir erhalten nachstehende Werte:
Tabelle 10 Berichtigte relative Standardabweichungen bei der Messung dreier
Testflächen mit drei verschiedenen Messgittern
Relative Standardabweichung für einen Testkreis
TestflächeG
a = 2 cm
j 11 e r
a = 1 cm a = 0, 5 cm
I 6,7% 2,4% 1,0%
n 38,2% 16,8% 4,3%
m 83,9% 34,0% 7,7%
Page 71
- 70 -
Wir tragen die Werte der Tabellen 9 und 10 gegeneinander auf doppelt logarith-
mischem Papier auf (graphische Darstellung 1) und erhalten, wenn wir die Werte¬
paare miteinander verbinden, eine Gerade; zwischen der relativen Standardabwei¬
chung und dem Verhältnis der Messflächen zur spezifischen Fläche des Gitters be¬
steht daher die Beziehung:
TFlog sfel
= k • log —
Graphische Darstellung 1
Relative Standardabweichung als Funktion des Verhältnisses der Messflächen zur
spezifischen Fläche des Gitters
Page 72
- 71 -
"
6. 2 Bestimmungen mit der Zählmethode
Unsere Arbeiten zur Auswahl einer Analysenmethode haben uns, neben den
diesbezüglichen Ergebnissen, auch Zahlen geliefert, die wir weiter auswerten konn¬
ten, um quantitative Masszahlen einiger Drogen zu erhalten.
6.2.1 Herba Sabinae
Für den Vergleich der Lycopodiummethode mit der Zählkammermethode
(6.1.1, Seite 39) wurde Herba Sabinae und als Messelement dessen gut sichtbare
und färbbare Spaltöffnungen verwendet (Abb. 9). Wir berechnen aus den nach beiden
Verfahren erhaltenen Werten nun die Spaltöffnungszahl für Herba Sabinae.
Z ählkam mer met hode
Wir zählten im Mittel 12, 7 Stomata pro Zählkammer; 10 ml Suspension enthiel-
3ten 0, 3097 g Herba Sabinae und 1 Zählkammer fasst 0, 9 mm
.
Spaltöffnungszahl: 12Q<?
[ ^ = 455 700
*
4
^7
*
Abb. 9 Spaltöffnungen von Herba Sabinae
Page 73
- 72 -
s_ . ist für die 60 untersuchten Zählkammern: 6, 47 % und die Vertrauensgrenzen:
x - tQ 025• 29 500 = x - 2, 00 • 29 500 = x - 59 000
Wir erhalten endlich als Spaltöffnungszahl mit 95 %-iger Sicherheit:
455700 - 59000 Stomata/g Herba Sabinae
Lycopodiummethode
Wir fanden 343, 5 Spaltöffnungen auf 940, 5 Lycopodiumsporen. Da 1 mg Lyco¬
podium 95 810 Sporen enthält und wir 0, 4991 g Herba Sabinae mit 0,0069 g Lycopo¬
dium vermischt hatten, erhalten wir nach Seite 18:
Spaltöffnungszahl: ^'fü^wi9 = 4838°°
s-rel
ist hier 10,45 % und die Spaltöffnungszahl mit 95 % Sicherheit:
483 800 - 105 700 Stomata/g Herba Sabinae
Unsere beiden Werte bestätigen sehr schön die von Hall er (1) gefundene
Spaltöffnungszahl von 447 000/g.
6.2.2 Fructus Anisi
Parallel mit unseren Flächenmessungen der Querzellschicht von Fructus Ani¬
si, über die wir weiter unten berichten werden, zählten wir auch die charakteristi¬
schen Haare der Epidermis. Wenn diese Zahl als Messelement auch weniger zuver¬
lässig sein dürfte als die Querzellfläche, weil die Behaarung stark vom Klima ab¬
hängt, so wird sie doch wegen der Einfachheit der Bestimmung von Interesse sein.
Wir stellten nach der Lycopodiummethode (vgl. Seite 18) aus Anis alicante
und Lycopodium eine Verreibung und daraus 38 Präparate her; wir durchmusterten
bei jedem 10 Gesichtsfelder. Die ermittelten Werte sind in Tabelle 11 aufgeführt.
Die Haare sind durch das Mahlen häufig zerbrochen; um Doppelzählungen zu ver-
meiden,wurden nur die Haarspitzen in Betracht gezogen.
Bei der Berechnung der Anzahl Haare pro Lycopodiumspore und der Streuung
dieser Kennziffer wurden versuchshalber die unterschiedlichen Substanzmengen je
Präparat berücksichtigt und das Verhältnis Haare/Lycopodiumspore jedes Präpa¬
rates mit der Anzahl Lycopodiumsporen (f ) im Präparat gewichtet. Die Formeln
zur Berechnung des Mittelwertes und der Streuung lauten dann:
Page 74
- 73 -
Mittelwert:
Varianz:
Ix- {x
fx
2_
Z(x-x)2-fx~
Zfx-1
Ex2 fx _2
Efx-1x
Wir erhielten ein Verhältnis Haare/Lycopodiumsporen von 0, 216 Haare/Spore mit
einer relativen Standardabweichung s_ .= 3, 9 %. Die Verreibung enthielt 1,0213 g
Anis alicante und 0,0529 g Lycopodium.
Die Haarzahl ist somit:
0,216-95810-52,9= 1072000
1,0213
und bei s_ .= 3, 9 % mit 95 %-iger Sicherheit:
1072000 - 84 500 Haare/g Anis alic.
Zum Vergleich seien die Zahlen genannt, die man ohne das Gewichten erhält:
Verhältnis Haare/Lycopodiumsporen: 0, 2175
Relative Standardabweichung: 4, 7 %
und als Ergebnis:
1080 000 - 102 500 Haare/g Anis alic.
Die kleinere Standardabweichung bei den nach Gewichten errechneten Resultaten
zeigt, dass extreme Werte eher bei den Präparaten mit wenig Substanz vorkommen;
sie haben, ihrer geringeren Bedeutung entsprechend, nun weniger Einfluss auf das
Endergebnis.
6.2.3 Amylum Cannae
Bei der statistischen Prüfung der Partikelverteilung in einer Zählkammer
(6.1. 2. 2, Seite 54) war Cannastärke ausgezählt worden. Wir können somit die An¬
zahl Stärkekörner pro g Cannastärke errechnen: 0, 4418 g Cannastärke waren in
50 ml suspendiert und diese Suspension in der Türk'schen Zählkammer untersucht
2worden. Auf 9 mm Kammerfläche zählten wir 588 Stärkekörner, die bei einer
Page 75
- 74 -
Tabelle 11 Ergebnisse der Auszählung von 38 Präparaten von Anis alicante nach der
Lycopodiummethode. 10 Gesichtsfelder pro Präparat.
Anzahl Anzahl Haare
Präparat Lycopod.sporen
Haare pro Sporen
No. fx X X2 x2-fx
1 114 25 0,2192 0,048048 5, 4775862 119 17 0,1429 0,020420 2,4299803 226,5 34,5 0,1523 0,023195 5, 2536684 94,5 20 0,2117 0,044817 4, 2352075 85,5 12 0,1404 0,019712 1, 6853766 135 21 0,1556 0,024211 3, 2684857 107,5 25 0,2326 0,054103 5, 8160738 96 14 0,1458 0,021258 2, 0407689 65,5 14 0,2139 0,045753 2, 996822
10 143,5 25,5 0,1777 0,031577 4, 53130011 69,5 17 0, 2448 0,059927 4,16492712 103 18,5 0,1797 0,032292 3, 32607613 112,5 27,5 0, 2444 0,059731 6, 71973814 98 24,5 0, 2500 0,062500 6,12500015 190,5 43 0,2258 0,050986 9,71283316 107 29 0,2711 0,073495 7, 86396517 77,5 17 0,2193 0,048092 3,72713018 153,5 32 0,2084 0,043430 6, 66650519 53,5 12 0,2242 0,050266 2, 68923120 137,5 34 0,2473 0,061157 8, 40908821 65,5 23 0,3511 0,123271 8,07425122 138 26,5 0,1920 0,036864 5,08723223 145,5 34,5 0,2371 0,056216 8,17942824 106,5 27 0,2534 0,064211 6,83847225 108,5 21,5 0,1982 0,039283 4, 26220626 144,5 42 0, 2907 0,084506 12,21111727 130 48,5 0,3731 0,139204 18, 09652028 132 25,5 0,1932 0,037326 4, 92703229 68,5 14 0, 2044 0,041779 2,86186230 90 22 0, 2443 0,059682 5, 37138031 91,5 16,5 0,1804 0,032544 2,97777632 86 11,5 0,1338 0,017902 1, 53957233 58 13,5 0, 2328 0,054196 3,14336834 111,5 30,5 0,2735 0,074802 8, 34042335 77,5 13 0,1678 0,028157 2,18216836 73,5 15,5 0, 2109 0,044479 3, 26920737 154,5 31,5 0, 2039 0,041575 6, 42333838 59,5 13 0,2186 0,047786 2, 843267
4130,5 892,0 8, 2663 1,898753 203, 76842
Mittelwert:892
4130,50,216
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- 75 -
Ausrechnungen zur Tabelle 11:
Streuung: s2 =203'76842
- 0,0466564129,5
= 0,049344-0,046656 = 0,002688
s = 0,05185
Standardfehler: s- = -£=, = 0,00842x
¥38
s • 100
Relative Standardabweichung: s_,
=—= = 3,9
Ohne Berücksichtigung der Gewichte
Mittelwert: x = 8'2f-3 = 0,2175UO
_______
Streuung: s2 =^L-
- x2 = U||I51 . 0,04732n - 1 37
s2 = 0,00400
s = 0,0632
Standardfehler: s- =t==;
= 0,01026
s • 100
Relative Standardabweichung: s_,
= —~ = 4,7 %x rei y
3Kammertiefe von 0,1 mm demnach in 0, 9 mm Suspension enthalten waren. Wir
berechnen die Kornzahl/g zu:
588-50 000_ 73930000
0,9-0,4418
Die Varianz war: s = 3, 945 und die Varianz des Mittelwertes berechnet sich so¬
mit zu:
sx= ^jr = °-6576
Die relative Standardabweichung ist dann: s- .= 4,09 % und wir erhalten mit
einer Sicherheit von 95 % eine Kornzahl von:
73 930 000 - 6 141000 Stärkekörner/g Cannastärke
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- 76 -
Wallis (88) gibt für Weizenstärke 1827 360000 und für Kartoffelstärke
78 000 000 Stärkekörner pro Gramm an. Unser Wert für die bekanntlich sehr grossen
Körner der Cannastärke findet damit eine Bestätigung.
6.3 Bestimmungen mit der Flächenmessmethode
Für die technische Durchführung aller Flächenmessungen haben wir eine mi¬
kroskopische Anordnung mit Projektion gewählt, weil sie anpassungsfähiger ist (die
Flächen können z. B. planimetriert oder mit Gittern mit verschiedenen Punktabstän¬
den gemessen werden); ausserdem ist die Betrachtung des projizierten Bildes für
die Augen weniger anstrengend, als die Arbeit am Okular.
Die Apparatur wurde laboratoriumsmässig aus Teilen verschiedener Herkunft
zusammengestellt (vgl. Abb. 10): Die Leuchte für eine Philips Projektionslampe
12 V, 100 W, Typ 6031 E wurde selbst hergestellt (1). Das Licht wird durch die Lin¬
se (2) von einer Leitz Mikroskopleuchte auf den Mikroskopspiegel geworfen. Das
Mikroskop (3) ist ein älteres Modell der Firma Leitz, dem ein Kreuztisch (4) ange¬
fügt wurde. Zur Projektion verwendeten wir einen Schrägtubus (5) der Firma Wild
mit Projektionsspiegel (6). Das Okular ist ein Projektionsokular 7, 5 x von Busch (7).
Das Bild wird scaliesslich auf einer Tischfläche (8) aufgefangen, wo die entsprechen¬
den Messungen vorgenommen werden können oder das Messelement abgezeichnet
bzw. photographisch festgehalten werden kann.
Zur Flächenmessung wird die ganze Apparatur geeicht, indem ein Objektmi¬
krometer auf die Tischfläche projiziert und hier die lineare Vergrösserung festge¬
stellt wird, woraus sich leicht die Flächenvergrösserung ableiten lässt. Die Flächen-2 -8
angaben erfolgen in Quadratmikrometer (u ) = 10 Quadratzentimeter.
Bestimmungen nach der Flächenmessmethode haben wir bei zwei Drogen vor¬
genommen: Fructus Anisi und Semen Sinapis. Zu Beginn unserer Arbeit haben wir
einige Messungen an Fructus Anisi durchgeführt, später haben wir nur noch Semen
Sinapis verwendet, weil das Messelement, die Pigmentschicht, dank seiner Färbung
viel besser zu erkennen ist, als die Querzellschicht, die bei Fructus Anisi neben
den Haaren das einzige Messelement darstellt.
6.3.1 Fructus Anisi
Fructus Anisi ist die getrocknete Frucht von Pimpinella Anisum L.
(Umbelliferae). Als Messelement dienen, wie bei allen Umbelliferen, die sog.
Querzellen, grosse Endokarpzellen, die sich nachträglich durch parallele Wände
Page 78
- 77 -
Abb. 10 Projektionsmikroskop
unterteilt haben, ein charakteristisches Aussehen besitzen (Abb. 11) und in der
Frucht eine zusammenhängende Schicht ausbilden. Gemessen wird die Oberfläche
der Bruchstücke der Querzellschicht. Fructus Anisi ist, und hiermit unterscheidet
es sich von den anderen gebräuchlichen Umbelliferenfrüchten, noch mit Epidermis-
haaren (Abb. 12) besetzt, die ebenfalls als Messelement Verwendung finden können
(vgl. Seite 72).
Zur Messung verwendeten wir Anispulver der Sorte Fructus Anisi alicante.
1,0213 g Anispulver wurden mit 0,0529 g Lycopodium eine Stunde lang in einer glat¬
ten Porzellanreibschale verrieben. Zur Herstellung der mikroskopischen Präparate
wurde 1 Nadelspitze voll dieser Mischung auf einen Objektträger gebracht, einige
Tropfen Chloralhydratlösung dazugegeben, gut gemischt, mit einem Deckglas be¬
deckt und zur Aufhellung über einer kleinen Flamme erhitzt. Wir stellten auf diese
Weise 38 Präparate her und bei jedem massen wir 20 Gesichtsfelder aus, die wir
nach den Angaben einer Zufallszahlentabelle einstellten. Bei jedem Gesichtsfeld
wurden die darin sichtbaren Lycopodiumsporen und Haarspitzen gezählt und die
Querzellflächen auf Papier gezeichnet. Die Flächen wurden später mit dem Plani-
meter bestimmt.
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78
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Abb. 11 Querzellen bei Fructus Anisi
fr > ^3»*-Abb. 12 Epidermishaar von Fructus Anisi
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- 79 -
Die Ergebnisse sind für jedes Präparat in Tabelle 12 verzeichnet. Wir erhalten
6 2eine Querzellfläche von 2962 • 10 u pro Gramm Fructus Anisi alicante bei einer rela¬
tiven Standardabweichung von s .= 14,17 % (nach der Gewichtsmethode auf Seite 85
berechnet). Das Messergebnis lautet mit den Vertrauensgrenzen (0, 95):
2 962 • 106 - 823 • 106 u2 Querzellfläche / g Fructus Anisi alicante
Die überraschend grosse Streuung, auch verglichen mit derjenigen der Zählung
der Anishaare (s .= 3, 9 %), führte uns zunächst zur Annahme, dass die schwere
Erkennbarkeit der Querzellflächen dafür verantwortlich war. Wir suchten deshalb ei¬
ne Droge mit gut erkennbarem Messelement und wählten für unsere weiteren Versu¬
che Semen Sinapis. Später stellten wir allerdings fest, dass die Streuung auch hier,
trotz sehr guter Erkennbarkeit, relativ gross ist.
Tabelle 12 Ergebnisse der Ausmessung von 38 Präparaten von Anis alicante nach
der Lycopodiummethode. 20 Gesichtsfelder pro Präparat.
Präparat
Anzahl
Lycopod. -
sporen
Fläche
Querzell¬schicht
Präparat
Anzahl
Lycopod. -
sporen
Fläche
Querzell¬schicht
No. P2 No. u2
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
114
119
226,594,585,5
135
107,596
65,5143,569,5
103
112,598
190,5107
77,5153,553,5
31800
167000
66 800
59 800
181900
5100
104 300
25 500
11400
112100
26 400
289 700
9 200
24100
128 400
42100
44 300
85 900
0
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
137,565,5138
145,5106,5108,5144,5130
132
68,590
91,586
5t
111,577,573,5
154,559,5
83 900
12 500
19100
151200
51700
57 300
70 900
73 500
53 000
8 200
82600
89 300
60 700
10 700
75400
47 600
31700
63 800
5 200
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- 80 -
6.3.2 Semen Sinapis
Semen Sinapis sind die Samen von Brassica nigra (L.) Koch. Sie sind
kugelförmig und mehr oder weniger dunkelbraun gefärbt. Im Querschnitt (o9) er¬
kennt man die Pigmentschicht, die dank ihrer intensiven Färbung als Messelement
hervorragend geeignet ist. Abbildung 13 zeigt dieselbe Schicht in Flächenansicht,
wie sie bei Pulveranalysen meist erscheint.
Der Embryo enthält eine beträchtliche Oelmenge, die beim Vermählen hinder¬
lich ist, weil dadurch die Mühlensiebe sehr schnell verkleben. Das Ausgangsmate¬
rial wurde aus diesem Grunde zuerst im Soxhlet-Apparat mit Petroläther vollstän¬
dig entfettet; um diese Operation zu erleichtern, wurde von grob gepulvertem bzw.
gequetschtem Samen ausgegangen, ähnlich dem handelsüblichen "Senfmehl". Die
Extraktion der aufgeschlossenen Samen verlief ohne Schwierigkeit, der Fettgehalt
betrug 30 %.
Wir untersuchten drei Pulverfeinheiten, die wir mit dem Lochdurchmesser
des jeweiligen Mühlensiebes kennzeichnen, 0, 8, 0, 5 und 0, 25 mm. Die Mahlung
mit Sieb 0,5 wurde wiederholt, um die "Reproduzierbarkeit" zu überprüfen. Wir
verwendeten eine Schlagkreuzmühle von "T. Peppink & Zn., Amsterdam". In Abb.
14 sind zu erkennen: (1) die Einfüllöffnung, (2) das Schlagkreuz, das direkt auf der
Motorachse aufgesetzt ist und ca. 10 000 Umdrehungen pro Minute vollführt; die
Abb. 13 Flächenansicht der Pigmentschicht von Semen Sinapis
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Abb. 14 Schlagkreuzmühle der Firma T. Peppink & Zn., Amsterdam
Schlagkreuzkanten sind stumpf. Das Mahlgut verweilt su lang im Bereich des Schlag¬
kreuzes und wird dabei immer weiter zerschlagen, bis es so fein ist, dass es durch
die Löcher des Mühlensiebes (3) aus dem Mahlraum herausfallen kann.
Die Pulver wurden wie üblich (vgl. Seite 39) mit wenig Chloralhydratlösung
aufgehellt und mit weiterer Chloralhydratlösung und Aerosil zu 10 ml suspendiert.
Tabelle 13 zeigt die Werte der verschiedenen Suspensionen.
Tabelle 13 Zusammenstellung der ausgemessenen Suspensionen
Suspension No. I II III IV
Vermahlungsgrad (0 des
Muhlensiebes in mm) 0,8 0,5 I 0,5 11 0,25
suspendierte Substanz¬
menge in g0,4963 0,5103 0,4990 0,5155
Suspensionsmenge ml 10,0 10,0 10,1 10,0
Die Messungen erfolgten im auf Seite 76 beschriebenen Projektionsmikroskop
(vgl. Abb. 10).
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- 82 -
6.3. 2.1 Messung mit dem Planimeter
Die oben angeführten Suspensionen wurden in einer Zählkammer nach Türk mit
20,1 mm Kammertiefe mehrmals ausgemessen. Die Zählkammerfläche betrug 9 mm
,
3so dass bei jeder Kammer 0, 9 mm Suspension erfasst wurden. Die Pigmentflächen¬
stücke wurden auf dem Projektionstisch abgezeichnet und einzeln mit dem Planime¬
ter ausgemessen. Damit bot sich die Gelegenheit, für die verschiedenen Pulver ein
Diagramm der Verteilung der Messelementgrössen aufzunehmen und dann die opti¬
male Pulverfeinheit zu bestimmen. Wir ordneten dazu die Einzelwerte der Pigment¬
schichtflächen in Grössenklassen, deren Klassengrenzen so festgelegt wurden, dass
von einer linearen Reihe von Halbmessern ausgehend, die entsprechenden Kreisflä¬
chen berechnet wurden:
Tabelle 14 Auf Grund der Durchmesser berechnete Klassengrenzen
Radius Fläche Klasse
M H2 No.
bis 25 (i960)* 2000 1
50 (7850)* 7 900 2
75 17 700 3
100 (31415)* 31400 4
125 49 200 5
150 70 700 6
175 96 200 7
200 125 500 8
225 159 000 9
250 196 000 10
275 237 000 11
über 300 282000 12
13
*genauer Wert
In Tabelle 15 sind die Ergebnisse der vier Messreihen nach Grössenklassen
summarisch zusammengestellt, ferner sind die Gesamtergebnisse, wie auch die
dazugehörigen relativen Standardabweichungen enthalten. Die graphische Darstel¬
lung 2 zeigt die Verteilung der Gesamtfläche (reduziert auf 1 mg Semen Sinapis)
auf die einzelnen Klassen bei den vier untersuchten Pulvern. In Tabelle 16 führen
wir die Einzelwerte auf, die wir bei der Messreihe I gefunden haben, um ein Bei¬
spiel für das angefallene Zahlenmaterial zu geben.
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- 83 -
Tabelle 15 Ergebnisse der Messreihen I - IV nach Grössenklassen
summarisch zusammengestellt
Grössenklassen
2
Anzahl Pigmentschichtteile und (unterstrichen) Gesamt¬
fläche in ]i%
I
(0, 8 mm)
Messr
II
(0, 5 mm)
eihe
in
(0, 5 mm)IV
(0, 25 mm)
1: bis 2000 50
58 000
162
181 500
74
78 200
443
373 800
2: 2000 - 7900 51
210 100
189
823 400
62
255 700
274
1148 300
3: 7900 - 17700 29
352 400
92
1075 850
32
358100
106
1220 500
4: 17700 - 31400 25
559 100
80
1894050
29
695400
66
1433 800
5: 31400 - 49200 21
829 400
70
2801800
26
1039 500
20
705 300
6: 49200 - 70700 22
1264 300
43
2412 200
20
1168 200
3
164400
7: 70700 - 96200 17
1384400
41
3315400
28
2317000
8: 96200 - 125500 12
1282 800
14
1458 700
15
1634000
9: 125500 - 159000 7
1036 300
3
401100
8
1078 400
10: 159000 - 196000 7
1216 900
2
327100
11: 196000 - 237000 2
430 400
12: 237000 - 282000 1
246 600
13: über 282000 1
284000
Fläche der Pigment¬schicht pro mgSemen Sinapis
10 240 000
srel x:11,47%
7 819 000
s,_:
rel x
6,75%
10 065400
s,_:
rel x
8,4%
5 394000
s . _:rel x
5, 52 %
Mittlere Fläche (ji2) 37 700 21200 31200 5630
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- 84 -
Flächensumme
„2
2-10
1-10°
6.
2-10"
1-10"
2-10
l-10u
6.
2-106-!
l-10u
Messreihe I
Pulver 0,8
Messreihe in
Pulver 0,5 II
Messreihe H
Pulver 0,5 1
Messreihe IV
Pulver 0,25
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Klassen
Graphische Darstellung 2
Verteilung der gemessenen Pigmentschichtflächen von Semen Sinapis auf 13 Grössen-
klassen bei den 4 untersuchten Pulvern (Gesamtfläche reduziert auf 1 mg Semen Sinapis)
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- 85 -
Tabelle 16 Flächengrösse der einzelnen Messflächen nach Grössenklassen geordnet
Messreihe I
Grössenklassen
<2000 2000 7900 17700 31400 49200 70700 96 200 125500 159000 196000 237000 282000
7900 -17700 -31400 -49200 -70700 -96200 125 500 -159000 -196000 -237 000 -282000 bis
1500 5300 11000 19700 35100 35400 85900 97 400 136000 179000 202 100 246600 284000
1700 6600 13100 20800 42800 66400 89800 97 400 153700 164900 228 300
1400 7600 15200 27300 42800 59300 35400 106 500 134100 160 300
400 3000 12200 18300 48800 70000 82800 98 600 144700 173 400
1500 5400 15800 23000 35000 61800 92500 121500 157 700 169 600
1000 4800 8200 20000 49000 57100 93700 118 000 151700 185 200
800 4800 13300 19100 34700 59700 78900 97 600 158 400 184 500
1500 3400 10600 19600 33700 62900 70900 97100
700 2500 13000 25600 45500 60700 77000 114600
1200 2400 8600 29300 36300 58500 81500 119 700
1000 7800 12100 18000 38100 68700 85900 115600
1200 2600 13200 23700 41400 58000 80700 98000
1200 4900 13600 25400 42700 70500 72000
700 2800 8000 28200 46400 51600 89800
1100 7200 17300 27900 34300 24600 96000
800 4200 13400 18900 41400 59200 77200
1700 5400 8600 25100 41200 55800 94400
1400 2700 14800 25600 24600 52400
1300 2100 16500 19200 39500 65000
1800 2800 8600 24300 34000 64200
1300 2300 15900 19600 42100 51600
1500 4600 11100 18100 50900
1100 4900 10700 19500
1900 7100 8800 19600
1400 6200 10300 23300
1500 4800 15700
1200 2600 13500
1500 2300 8400
1000 2400 10900
1200 3000'
900 2200
900 4900
1200 2300
400 4300
500 6800
1700 2800
200 7700
1900 4100
1300 6700
600 2300
1200 3500
600 3100
1300 4500
1700 4800
1800 3300
600 3700
1200 3800
200 2100
1700 2300
600 3800
2600
58000 ! 10100 352400 559100 829400 L264300 1384400 1282 800 1036 300 1216 900 430 400 246 600 284000
====== ===== sssa~ ===== ====== ======= ======= ======== ========= ========= ======== ========= =========
N=50 N=51 N=29 N=25 N=21 N=22 N=17 N=12 N=7 N=7 N=2 N=l N=l
Einwaage-Versuch: 0, 4963 g Gemessen Insgesamt: 0,8933 mg Semen Slnapis
bezogen auf 1,0 mg S.S.:
64900123500013945001626000 928000 |1417000|1550000I1437000|1160000| 1360000 1 482000 1 276000 1318000
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- 86 -
Wenn wir die in Tabelle 15 aufgeführten relativen Standardabweichungen betrach¬
ten, stellen wir fest, dass sie mit zunehmender Pulverfeinheit abnehmen; es folgt
daraus, dass die Grösse der einzelnen Teilflächen durch das Vermählen nicht nur
kleiner, sondern auch gleichmässiger wird. Für die Messung erweist sich ein feine¬
res Pulver damit als günstiger.
Bei der Betrachtung der Messelement-Gesamflächen überraschen die grossen
Differenzen zwischen den Pulvern verschiedener Feinheit. Wenn man die relative
Standardabweichung von maximal 10 % heranzieht, sieht man, dass die Differenzen
nicht zufallsbedingt sind: Die Proben entstammen nicht mehr derselben Grundgesamt¬
heit. Auffallend ist auch - abgesehen von Pulver in - die systematische Abnahme der
Flächensummen mit der Korngrösse der Pulver. Die graphische Darstellung 2 lässt
die Ursache erkennen und erklärt auch die Differenz zwischen Pulver 0, 5 I und 0, 5 II:
Während bei Pulver 0, 8 noch Teile mit über 282 000 u gefunden wurden, war bei
Pulver 0,511 die maximale Teilchengrösse 196000 u, bei Pulver 0,51 159000 po
und bei Pulver 0,25 70 700 u . Dieser Abnahme bei den grossen Teilflächen steht
eine nur sehr viel geringere Zunahme bei den kleinen Teilflächen gegenüber: Ein
beträchtlicher Teil der Messelementfläche muss daher beim Mahlen so stark zerklei¬
nert worden sein, dass er bei der Analyse nicht mehr identifiziert und damit erfasst
werden kann. Je feiner das Pulver vermählen wird, desto grösser ist dieser Anteil,
bei Pulver 0, 25 etwa die Hälfte der Gesamtfläche gegenüber Pulver 0, b.
Die Differenz zwischen den Pulvern 0, 5 I und 0, 5 II muss - nach der graphi¬
schen Darstellung zu urteilen - durch unterschiedliches Mahlen entstanden sein:
Bei Pulver 0, 5 II weisen die Klassen 7, 8, 9 und 10 wesentlich höhere Flächensum¬
men auf, als bei Pulver 0, 5 I. Beim Mahlen wurde der gleiche Siebeinsatz verwen¬
det und der Motor hatte die gleiche Tourenzahl; die Einfüllgeschwindigkeit war je¬
doch nicht genormt worden. Nachträglich wurde festgestellt, dass wir bei Pulver
0,5 1 das Mahlgut in grösseren Portionen in die Mühle gegeben hatten; die stärkere
Vermahlung erklärt sich damit, dass bei Zugabe grösserer Portionen die schon ge¬
mahlenen ersten Pulveranteile eine gewisse Zeit beanspruchen, um durch die Sieb¬
löcher zu treten. Während dieser Zeit verharrt der restliche, grössere Teil des
Mahlgutes im Bereich des Schlagkreuzes - auch wenn er bereits fein genug wäre,
um durch das Mahlsieb aus der Mühle zu fallen - und wird weiter zerkleinert, bis
das Mahlsieb zur Aufnahme neuen Pulvers frei geworden ist. Der Mahlvorgang
sollte demnach bis ins kleinste Detail normiert werden.
Page 88
- 87 -
6.3. 2. 2 Messung nach dem Punktzählverfahren
Die Messung von Semen Sinapis mit dem Planimeter erfordert einen ausseror¬
dentlich hohen Zeitaufwand und wir versuchten die Messung durch Anwendung des
Punktzählverfahrens - wie auf Seite 66 erwähnt - rationeller zu gestalten.
Wir entschlossen uns, ein Messokular I von Zeiss (nach Hennig) zur Mes¬
sung zu verwenden; es enthält 25 auf der Gesichtsfeldfläche verteilte Messpunkte.
Da wir jedoch das Bild der Zählkammer auf eine Tischfläche projizieren, stellten
wir uns eine genau passende Vergrösserung des Messokulars her. Die Vergrösse-
rung wurde auf den Projektionstisch gelegt und das Gesichtsfeld darauf abgebildet.
Im Laufe der Messung erwiesen sich die Striche des Zeiss'sehen Okulares leider
als zu dünn, um bei unserem Material gut erkennbar zu sein; wir verfertigten uns
eine neue Kopie, bei der die Striche an den Messstellen durch dicke Punkte ersetzt
sind (Abbildung 15).
Abb. 15 Abgeändertes Messokular I von Zeiss
Als Analysensubstanz wurde die Suspension 0, 5 I verwendet (vgl. Seite 81);
sie enthält, wie erinnerlich, 0, 5103 g Semen Sinapis auf 10 ml Suspension. Die
Suspension wurde in eine Zählkammer mit 0,1 mm Kammertiefe gefüllt, 24 neben¬
einanderliegende Gesichtsfelder eingestellt und die Trefferpunkte gezählt. Insge¬
samt wurden so 20 Zählkammern ausgemessen, d. h. 480 Gesichtsfelder oder 12 000
Punkte. Die Resultate der Messreihe sind in Tabelle 17 aufgeführt.
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- 88 -
Tabelle 17 Ergebnisse der Ausmessung der Suspension 0, 5 I
nach dem Punktzählverfahren
Zählkammer Trefferpunkte Zählkammer Trefferpunkte
1 11 11 162 20 12 253 23 13 28
4 22 14 30
5 39 15 7
6 20 16 22
7 22 17 17
8 33 18 359 33 19 17
10 26 20 28
Gesamtzahl Trefferpunkte: 474
Mittelwert: x = 23,7
Relative Standardabweichung: s_,
=
x rel7, 64 %
Bei der eingestellten Vergrösserung repräsentierte ein Messpunkt eine Fläche2
von 28 580 u.Wir haben insgesamt 474 Treffer festgestellt, also eine Fläche von
474 • 28 580 = 13 650 000 u2
Bei den Messungen wurde ein Volumen von:
20 • 24 • 25 • 0,028 580 • 0,1 = 34,3 mm3
erfasst, das
51°10300034'3
= 1. ?5 mg Semen Sinapis
enthielt. 1 mg Semen Sinapis hat demnach:
13 650 000
1,75
Die Streuung betrug:
7 800 000 p Pigmentschicht.
sxrel = 7>64%
Die Uebereinstimmung mit dem Ergebnis der Messreihe II in Tabelle 15 von
o
7 819000 u Pigmentschicht pro mg Semen Sinapis ist ausserordentlich gut.
6.3.2. 3 Vergleich der Messungen mit dem Planimeter und nach dem Punktzähl¬
verfahren
Interessant ist der Vergleich der Flächenmessung mit dem Planimeter und
mit dem Punktzählverfahren nach der auf Seite 47 beschriebenen Methode:
Page 90
Der Zeitbedarf betrug beim Planimetrieren 3600 Minuten, beim Punktzählver¬
fahren nur 170 Minuten. Unser Kriterium "Information in der Zeiteinheit" berechnet
sich dann zu:
Planimetrieren:
In/t :
1
=
1
= 5, 48 • 10"6sx rel
-t 45,6 • 3600
Punktzählmethode :
1 1
In/t :• = 100, 9 • 10-6s
2•
t
s5c rell 58,3 • 170
Die Werte für die Information pro Zeiteinheit bei beiden Verfahren zeigen ein¬
deutig die starke Ueberlegenheit des PunktzählVerfahrens.
7. Besprechung der Ergebnisse
7.1 Untersuchungen zur Auswahl der Analysenmethode
Mit der Einführung des wirtschaftlichen Kriteriums zur Auswahl der am besten
geeigneten Analysenmethode war es möglich, aus den verschiedenen Messmethoden,
die von früheren Autoren bereits verwendet worden sind, die Beste auszuwählen.
Wir fanden, dass für die quantitative Analyse von Drogenpulvern die Zählkammer¬
methode der Lycopodiummethode vorzuziehen ist. Es ist zu beachten, dass die Ly-
copodiummethode nicht schlechter ist, sondern nur weniger rationell, also mit grös¬
serem Zeitaufwand arbeitet.
Nach dem gleichen Prinzip wurde die Auswahl bei den zahlreichen Flächenmess-
verfahren getroffen: Für die Messung von Einzelflächen hat sieh das Planimeterver-
fahren als bestes erwiesen. Wenn die genaue Grösse der Einzelfläche jedoch nicht
interessiert und sie nur innerhalb einer grossen Anzahl weiterer Flächen im Rahmen
einer Stichprobe Bedeutung hat, so ist das Punktzählverfahren das vorteilhafteste,
weil es viel mehr Messmaterial zu erfassen gestattet.
Einige mit den Messverfahren zusammenhängende Spezialf ragen wurden unter¬
sucht und abgeklärt:
Die für das Zählkammerverfahren sehr wichtige Homogenität der Suspensionen
konnte für die Suspension im Messzylinder, wie auch in der Zählkammer bestätigt
werden.
Page 91
- 90 -
Bei der Lycopodiummethode zeigte es sich, dass die Anzahlen Lycopodiumspo-
ren und Messelemente, auf der Stufe der Gesichtsfelder, praktisch nicht korrelieren,
also unabhängig voneinander streuen, was die geringere Wirtschaftlichkeit der Lyco¬
podiummethode teilweise erklärt.
In einem Modellversuch konnten wir zeigen, dass die Varianz beim Punktzähl¬
verfahren auch von der Flächenform abhängig ist, im Sinne einer Vergrösserung
der Varianz bei einer Verlängerung des Flächenumfanges.
7. 2 Bestimmungen mit der Zählmethode
Die Bestimmung der Masszahlen bei Herba Sabinae, Fructus Anisi (Haare)
und Amylum Cannae, bei denen die Messelemente gezählt werden, hat gezeigt, dass
bei dieser Methode mit normalem Arbeitsaufwand Ergebnisse mit befriedigender
Varianz erzielt werden können. Messtechnisch treten keine besonderen Schwierig¬
keiten auf.
7.3 Bestimmungen mit der Flächenmessmethode
Wir sahen uns hier zwei Problemen gegenüber:
Beim Vergleich der Varianzen, die bei der Zählung der Anishaare und der
Messung der Anisquerzellfläche auftreten, fällt die viel grössere Varianz bei der
Flächenmessung auf - beide Bestimmungen wurden an der gleichen Anzahl Präpa¬
rate durchgeführt. Unsere Annahme, dass die grosse Varianz eine Folge der
schwierigen Erkennbarkeit der Begrenzungen der Querzellflächen sei, erwies sich
als unzutreffend, denn bei der Messung der Pigment- bzw. Steinzellschicht von
Semen Sinapis, die ausserordentlich präzis zu erkennen ist, traten Varianzen der¬
selben Grössenordnung auf. Bei der Flächenmessmethode muss demnach allgemein
mit grösseren Varianzen gerechnet werden, als bei der Zählmethode. Zur Erzie¬
lung einer annehmbaren Varianz ist ein prohibitiver Arbeitsaufwand nötig.
Es wäre nun denkbar, das Pulver feiner zu vermählen, um damit eine gleich-
massigere Verteilung der Messflächen im Präparat und schliesslich eine kleinere
Varianz zu erzielen, doch ist diese Lösung aus Gründen, die das zweite Problem
bilden und die wir dort behandeln werden, nicht möglich.
Die Varianz kann auch durch Vermehrung der Stichproben und Messungen
herabgesetzt werden und dieses Prinzip brachte in Form des PunktzählVerfahrens
schliesslich die Lösung: Wir stellten bei unseren Messungen an Semen Sinapis
fest, dass das Punktzählverfahren zur Erzielung der gleichen Varianz, rund 18-
Page 92
- 91 -
mal weniger Zeit erfordert als das Planimetrieren der Flächen.
Das zweite Problem stellte sich, als wir verschiedene Feinheitsgrade des
gleichen Analysenpulvers herstellten und ausmassen. Im Gegensatz zu ungeglieder¬
ter Substanz hängt bei pharmakognostischem Material, wie wir schon betont haben,
die Identifizierung und damit auch die Messung von der Erhaltung der charakteristi¬
schen Struktur des Messelementes ab. Unsere Messungen zeigten, dass bei feinerem
Pulver die Menge an unterscheidbarem Messelement in unerwartet starkem Masse
abnimmt, so dass die Messung überhaupt fraglich erscheint; es entsteht ein syste¬
matischer Fehler. Zudem übt noch die Grössenverteilung der Messelementflächen
einen bedeutenden Einfluss aus, wie wir bei zwei Semen Sinapis-Pulvern feststellen
mussten, die mit der gleichen Mühleneinstellung gemahlen worden waren, bei denen
jedoch das Mahlgut verschieden schnell in die Mühle gegeben worden war. Um bei
der Flächenmessmethode reproduzierbare Resultate zu erhalten, muss von Pulvern
mit gleicher Feinheit und auch mit sehr ähnlicher Grössenverteilung der Mess¬
flächen ausgegangen werden. Wie wir zu Beginn unserer Arbeit ausführten, dient
die quantitative mikroskopische Analyse von Drogenpulvern zur Messung frem¬
der Drogenpulver, die also auf unbekannte Weise vermählen wurden und so auch
sehr verschiedene Verteilungen der Messflächengrössen aufweisen können. Ob ein
derartiges Pulver durch weiteres Vermählen mit einer Analysenmühle so verändert
werden kann, dass es eine standardisierte Korngrösse und Grössenverteilung der
Messflächen annimmt, erscheint uns zweifelhaft; zumindest müsste das Pulver re¬
lativ grob sein, um durch eine zweite genormte Mahlung einigermassen standardi¬
siert werden zu können. In diesem Falle ist dann aber auch eine allgemeine Ver¬
wendung der Flächenmessmethode in der Pharmakognosie problematisch, denn es
kann kein Faktor angegeben werden, mit dem die gemessenen Werte in tatsächliche
Werte umgerechnet werden können.
Page 93
- 92 -
III. ZUSAMMENFASSUNGEN
8.1 Zusammenfassung
1. Die verschiedenen Methoden zu einer Analyse von Drogen und im besonderen von
Drogenpulvern werden besprochen. Die Verwendung von Zählkammern und die
Lycopodiummethode von Wallis werden eingehender behandelt.
2. Nach objektiven Kriterien wird die für die quantitative mikroskopische Analyse
von Drogenpulvern am besten geeignete Methode bestimmt.
3. Die Homogenität der verwendeten Drogenpulversuspensionen und ihre gleichmäs-
sige Verteilung in der Zählkammer wurde statistisch überprüft.
4. Die in der Mikroskopie anwendbaren Flächenmessverfahren werden aufgeführt
und nach objektiven Gesichtspunkten miteinander verglichen; das jeweils
vorteilhafteste Verfahren wird gewählt.
5. Der Einfluss der Form der Messflächen auf die Messgenauigkeit bei der Flächen¬
messung wird in einem Modellversuch überprüft und eine derartige Beziehung
festgestellt.
6. In praktischen Messungen werden die Masszahlen zur quantitativen mikroskopi¬
schen Analyse für Herba Sabinae, Fructus Anisi, Amylum Cannae und Semen
Sinapis ermittelt.
7. Es zeigt sich, dass bei Verwendung von flächenförmigen Messelementen eine Re¬
produzierbarkeit der Messwerte und ein Vergleich verschiedener Messungen nur
möglich ist, wenn die Drogenpulver hinsichtlich Korngrösse und Grössenvertei-
lung der Messelemente sehr ähnlich sind.
8.2 Resume
1. Nous discutons les diffärentes m6thodes d'analyse de plantes mgdicinales et tout
spficialement des poudres de ces drogues. Nous traitons plus en detail l'emploi
de l'hömacytomötre et la mßthode aux lycopodes de Wallis.
2. Nous dßterminons objectivement la meilleure mäthode pour l'analyse quantitative
des poudres de plantes mgdicinales ä l'aide du microscope.
3. Nous contrölons ä l'aide de la statistique l'homog6neit6 des suspensions de poudres
que nous avons utilisßes et leur rßpartition uniforme dans l'Mmacytometre.
4. Nous decrivons les mßthodes de dßtermination des surfaces en microscopie et
nous les comparons de fagon objective; nous choisissons la mßthode la plus
avantageuse.
Page 94
- 93 -
5. Nous etudions l'influence de la forme de la surface sur l'exactitude de sa dötermi-
nation au moyen d'une expfirience modele concluante.
6. Des determinations pratiques mönent aux facteurs sp6cifiques pour l'analyse quan¬
titative au microscope des drogues suivantes: Herba Sabinae, Fructus Anisi,
Amylum Cannae et Semen Sinapis.
7. Les experiences faites avec des elöments de mesure de surface montrent que les
rGsultats ne peuvent 6tre reproduits et compares que si les poudres sont tres
semblables en ce qui concerne la grosseur des el^ments de mesure et leur repar-
tition de grandeur.
8. 3 Summary
1. The various methods of drug analysis and especially the analysis of powdered drugs
are discussed here. The use of counting Chambers and Wallis's Lycopodium Method
are dealt with exhaustively.
2. The most suitable method for the quantitative microscopic analysis of powdered
drugs has been chosen according to objective criteria.
3. The homogenity of the drug powder suspensions used, and their even distribution
in the counting Chambers was tested statistically.
4. The methods generally used in microscopic area measurements have been described
and compared objectively and then the best method selected.
5. The influence of the form of "m.a. " (1) on the accuracy of the area measurement
has been tested in a model experiment and such a relationship was found to exist.
6. In practical measuring tests the measurement factors in quantitative microscopic
analysis have been found for the following: Herba Sabinae, Fructus Anisi, Amy¬
lum Cannae and Semen Sinapis.
7. It has been found that in the use of "m.a. " (1) a reproduction of the measurement,
and a comparison between various measurements is only then possible when drug
powders are similar to each other in their size of "m.a. " (1) and their "m.a."
size distribution.
(1) "m.a." = measurable area i.e. the area of a suitable cell-layer, which represents
the whole drug powder mass.
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Lebenslauf
Am 25. Februar 1928 wurde ich in Heidenheim/Brz als Sohn des Fabrikdirektors
Adolph C. Behringer und seiner Ehefrau Ruth Behringer-Seinet geboren.
1935 - 1937 Primarschule in Heidenheim/Brz
1937 - 1939 Ecole Primaire de Neuchätel (Schweiz)
1939 - 1949 Oberschule in Heidenheim/Brz
1949 Maturität
1949 - 1951 Laborant bei Firma Osram GmbH
1951 - 1952 Physikstudium an der Universität Tübingen
1952 - 1954 Pharmazeutisches Praktikum in der Apotheke U. Irion, Oberkochen
1954 Pharmazeutische Vorprüfung in Stuttgart
1954 - 1955 Pharmaziestudium an der Universität Tübingen
1955 - 1957 Pharmaziestudium an der Eidgenössischen Technischen Hochschule
in Zürich
1957 Pharmazeutisches Diplom der Eidgenössischen Technischen Hoch¬
schule in Zürich
seit 1957 Doktorand bei Herrn Prof. Dr. H. Flück an der pharmakognosti-schen Abteilung des pharmazeutischen Institutes der EidgenössischenTechnischen Hochschule in Zürich
gleichzeitig Studium der Wirtschaftswissenschaften an der Universität
Zürich
und Mitarbeiter des Schweizerischen Apothekervereins in Zürich
1961 Verehelichung mit Fräulein A. Tüscher aus Leysin/VD
1962 Leiter der wissenschaftlichen Abteilung einer pharmazeutischenImportfirma in Zürich.
![Untitled-1 []SANiTÄTShÄUSER KLUGE DAK- Erhebungsbogen Dekubitus 09.2009 Norton-Skala zur Erkennung des Dekubitusrisikos Mobilität geht Ohne Hilfe geht mit Hilfe Rollstuhl- bedürftig](https://static.documents.pub/doc/80x56/5e484c581d97316bc7595e1a/untitled-1-sanittshuser-kluge-dak-erhebungsbogen-dekubitus-092009-norton-skala.jpg)
![W ] Z · R u th erfor d Fu n eral H om es & C rem ator ies ere is a D i eren ce R u th erfor d -C or bin Fu n eral H om e 515 N . H igh S t. 614 -8 85 -4 00 6 F u ne ral P re-P lan](https://static.documents.pub/doc/80x56/6044caeefb2ceb437c251dd1/w-z-r-u-th-erfor-d-fu-n-eral-h-om-es-c-rem-ator-ies-ere-is-a-d-i-eren-ce.jpg)
![W ] Z · 12/01/2020 · 515 N . H igh S t. 614 -8 85 -4 00 6 F u ne ral P re-P lan n in g A vailable w w w .rut h erfor d fu n eralhom e.com in fo @ rut h erfor d fu n eralhom e.com](https://static.documents.pub/doc/80x56/6095a58b764965573e134c28/w-z-12012020-515-n-h-igh-s-t-614-8-85-4-00-6-f-u-ne-ral-p-re-p-lan-n.jpg)
