Seminario 6

2006 – Human Mediator enhances basal transcription by facilitating recruitment of TFIIB

during PIC assembly

(Baek, Kang, Roeder)

Mediador mejora la transcripción basal por la facilitación del reclutamiento de TFIIB en el

ensamblaje del PIC

Transcripción

• ARN polimerasa II

• Factores de Transcripción Generales (GTFs): TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF y TFIIH

Necesarios y suficientes para transcripción basal de templados de DNA con TATA y para la formación del PIC

Ensamblaje del PIC

Estructura del complejo TBP-TATA

Modelo de Holoenzima Ensamble secuencial

Formación del PIC: Dos modelos

Mediador

Es un coregulador general de la transcripción

Compuesto por distintas subunidades y dominios

HEAD

MIDDLE

TAIL

CDK

Conservado en todos los eucariotas

Forma complejos con RNA pol II

Mediador• Aumenta nivel de transcripción basal (cooperatividad

con TFIID en ensamblaje y estabilización del PIC y en la reiniciación de transcripción en levaduras)

• Estimula actividad kinasa de TFIIH en el CTD de Pol II necesario para la transcripción basal y la formación del PIC dependiente de activador

Interacciones con la pol II y los GTFs facilitan la formación y función del PIC

Mediador interaccionando con la maquinaria basal de la transcripción

La cola de CTD no fosforilada está asociada al mediador y a componentes de la maquinaria de iniciación

La fosforilación parcial de la cola de CTD hace que tanto el mediador como los GTFs se separen

Mediador

• No esencial para transcripción basal in vitro con RNA pol II y GTFs purificados

• Necesario para transcripción basal en extractos nucleares y para transcripción activada

¿es coactivador, contrarresta la presencia de algún inhibidor o las condiciones in vivo son más restricivas?

•Compensa la presencia de GTFs en niveles limitantes, o de inhibidores

• Estudio de la interacción Med – TFIIB

Hipótesis: • Mediador recluta y estabiliza PIC• facilita fosforilación de CTD

Preguntas:

Paper

¿El ensamblaje del PIC en extractos nucleares es igual que con TFs purificados?

¿TFIIB tiene un efecto de reclutamiento similar al del Mediador?

Materiales

• Extracto nuclear HeLa inmunodepletado de GTFs y Mediador (tratamiento con anticuerpos, crosslinking, agregado de anti-anticuerpos y precipitación)

• GTFs y Mediador con tags de His o epítopes, expresados en bacterias y purificados

• Templados de ADN biotinilado con o sin TATA + bolitas de Streptavidina-Sefarosa

Materiales

• SDS PAGE de dos preparaciones de Mediador Purificado

FL

AG

-tags

epítop

es

Métodos

Templados inmovilizados

↓

Preincubación con extracto nuclear y GTFs

↓

LavadoIncubación con Mg2+, NTPs↓

Electroforesis Phosphorimager

↓nivel de transcripción

Western Blot (Immunoblot)↓

Unión de GTFs o Mediador

corte EcoRI

Resultados

• Templados + NE(IID/ Med) + TBP (TATA Binding Protein) + Med (variable)

UNIÓN TATA DEPENDIENTE

UNIÓN MED DEPENDIENTE

Unión no específica TFIIH y TFIIFMediador papel importante en

reclutamiento de, al menos, TFIIB TFIIE y Pol II

Resultados

Aumento >9x (TATA+ vs TATA-)

Aumento >5x (TATA+Med+ vs TATA+Med-)

=

Aumento 49x con TATA y Med

Correlación entre reclutamiento Med-dependiente de GTFs y Pol II y nivel de la transcripción basal

Resultados

• Comparación temporal (preincubación por tiempos variables, templado con TATA + NE(Med) + Med)

Nivel de transcripción a distintos tiempos Reclutamiento de Med y

GTFs a distintos tiempos

An

ticuerp

os

CORRELACIÓN TEMPORALEl reclutamiento del PIC depende de Mediador y determina el nivel basal de transcripción

Resultados

• Templados iG5HML con sitios para activador Gal4 + NE(Med) + Med + Gal4

Gal4 aumenta reclutamiento de Med y GTFs; si no hay Med, el reclutamiento de GTFs es mucho menor

Esto se correlaciona con los niveles de transcripciónEsto se correlaciona con los niveles de transcripción

Anticuerpos

Med parece ser esencial para el aumento de la transcripción en presencia de un activador (los niveles de reclutamiento no parecen diferir por Gal4)

Resultados

• Templados con TATA + NE(Med) + TFIIB en exceso

Un exceso de TFIIB (25x TFIIB endógeno) compensa la falta de Med con respecto a un extracto nuclear no depletado, en cuanto a niveles de transcripción basal

Un exceso de Med no compensa la falta de TFIIB

Control recíproco Control especificidad

Un exceso de TFIIF no compensa la

falta de Med

Med el aumento de transcripción se daría por aumento de reclutamiento

de TFIIB

Resultados

• Templados con TATA + NE(IIB) + TFIIB

La transcripción disminuye y sólo vuelve a niveles basales si se suplementa con TFIIB

purificado

¿Se debe a disminución del

reclutamiento del PIC cuando se elimina

TFIIB?

Control de la depleción sólo se eliminó TFIIB y muy pequeñas cantidades de Med u otros GTFs

Resultados

• Templados con TATA + NE(IIB) + TFIIB

Disminuye reclutamiento de Pol II y de TFIIE en ausencia de TFIIB

TFIIB no es requerido para el reclutamiento de Med, pero sí

de Pol II y TFIIE

Resultados

• Templados con TATA + NE(IIB) + TFIIB

El mismo fenómeno se aprecia a nivel transcripcional; aunque se haya reclutado Med, sin TFIIB hay muy poca transcripción porque no se

recluta eficientemente parte del PIC

Resultados

El nivel de transcripción se ve limitado por el tiempo de reclutamiento del Med cuando es agregado en la incubación

Resultados

• Templados con TATA + Med + TFIID/TBP

El reclutamiento de Med también depende de TFIID, pero no de TBP sola importancia de TAFs

Conclusiones

• Mediator aumenta la transcripción basal por reclutamiento de TFIIB, TFIIE y Pol II (como mínimo), como se infiere por la correlación temporal de transcripción Mediator-dependiente y reclutamiento Mediator-dependiente

• El reclutamiento de Mediator es un paso limitante en la formación del PIC y parece depender de la interacción con TFIID (habiendo ésta reconocido a la TATA previamente)

Conclusiones

• Mediator aumenta la síntesis indirectamente al reclutar a TFIIB, que a su vez recluta a Pol II.

• Es necesario para transcripción basal en extractos nucleares pero no con factores purificados; sin embargo aún no se encontraron cofactores negativos que pudieran explicarlo. Puede deberse a una limitación en los GTFs en los extractos naturales, lo cual concuerda con que TFIIB en exceso puede compensar su ausencia en cuanto a niveles de transcripción basal y reclutamiento de Pol II. También un exceso de TFIIH puede producir este efecto (Nair et al., 2005).

Conclusiones

• Este reclutamiento Med-independiente permite descartar el modelo de holoenzima en que Med cataliza la formación del complejo de Pol y los GTFs que deben unirse juntos a TFIID

• También implica que aunque los GTFs son irreemplazables por exceso de Mediator, éste podría compensar niveles limitantes de los mismos in vivo, actuando de forma cooperativa. En ausencia de Mediator se necesitaría un nivel muy alto de GTFs.

Conclusiones

• Mediator actúa además de forma directa estimulando la actividad kinasa de TFIIH para la fosforilación de CTD, lo que permite una transcripción eficiente por aumento del reclutamiento y estabilización de factores.

• La transcripción activada, tanto en extractos nucleares como con factores purificados, es siempre Med-dependiente.

Conclusiones

• Mediator formaría un complejo estable con TFIID, luego de lo cual se reclutaría el resto de los GTFs y la Pol II (no niega que se pudiesen unir en distinto orden, aunque de forma menos eficiente al desaparecer el efecto cooperativo) stepwise model

• Este hecho, sumado al factor correspondiente a la interacción entre Mediator y los GTFs, proveería instancias extra para el control de los niveles de transcripción plasticidad regulatoria

Críticas

• El experimento intenta acercarse a condiciones fisiológicas en cuanto al extracto utilizado; sin embargo el ADN no se encuentra cromatinizado, factor que tiene efectos sobre los niveles de transcripción in vivo.

• Concluyen que el reclutamiento de Mediator es el paso limitante, pero éste es dependiente de unión de TFIID la unión de TBP o TAFs podría ser el verdadero paso limitante

• No analiza función de Mediator en el PIC post-reclutamiento, que pueden haber afectado los niveles de transcripción observados