Por:Alejandro Eusse GarcíaMaría Paulina Henao Zuluaga

EstudiantesTercer Semestre

Facultad de Medicina UPB-2011

Medellín-Colombia

Hai-Yang Xie, Jun Cheng, Chun-Yang Xing, Jin-Jin Wang, Rong Su, Xu-Yong Wei, Lin Zhou and Shu-Sen Zheng

Hepatitis is a general term meaning inflammation of the liver and can be caused by a variety of different viruses such as hepatitis A, B, C, D and E.

This happens when liver cells die and the body's immune system sends in special cells that actually cause inflammation while trying to help the body repair the liver.

Hepatitis

Introduction

Hepatitis B

Caused by the hepatitis B virus

(HBV)

More than 2 000 million people alive today have been infected with HBV

at some time in their lives

Transmission

Blood

Saliva

Semen

Vaginal secretions

Sexual contact

Consequences

-Chronic hepatic insufficiency -Cirrhosis

-Hepatocellular carcinoma (HCC).

• Proteomics is the large-scale study of proteins, particularly theirstructures and functions.

• Proteins are vital parts of living organisms, as they are the maincomponents of the physiological metabolic pathways of cells

• The proteome is the entire complement of proteins, including themodifications made to a particular set of proteins, produced by anorganism or system.

Proteomics

• A cell line was established by transfecting a hepatoblastoma cell line(HepG2) with plasmids containing two head-to-tail dimers of the HBVgenome.

• Is an appropriate tool to identify the molecular events of the viralreplication cycle as well as the secretion of HBV particles into theintracellular environment in vitro.

RelationHepG2.2.15 cells after RNA interference of HBx by small interfering RNA(siRNA) and identify 12 proteins with altered expression that may playcritical roles in HBx-related HBV replication.

HepG2.2.15

• The X gene codes for a protein called HBx, which functions as a viraltransactivator and may play a role in viral infection and thehepatocarcinomas development.

• Promotes viral gene expression and replication by trans-activating theviral promoters and enhancer/promoter complexes.

HBx protein

Relation

Hepatitis B virus

Incresed Hbx protein

expression

Expression a lot of genes

that translated in

proteins

In this study they use

proteomics to identify proteins changes

General Objective

Evaluate the relation of HBx proteinwith the Hepatitis B virus replication

in the HepG2.2.15 cell line.

Materiales y Métodos

Cultivo celular Proceso mediante el cual las células, ya sean

procariotas, eucariotas o vegetales, pueden cultivarseen condiciones controladas.

Objetivo: En el estudio se realizo el cultivo para poderestudiar en el laboratorio estas células plasmáticas.

Materiales y Métodos

Transfección siRNA

ARN pequeño de interferencia.

Interviene en el mecanismo denominado interferencia de ARN donde el siRNAinterfiere con la expresión de un gen específico, reduciéndola.

Suprimen la expresión de los genes diana mediante el corte del ARN mensajero(ARNm) complementario en dos mitades, a través de la interacción de la hebraantisentido del siRNA con el complejo RISC (RNA-induced silencing complex).

Las dos mitades del ARNm son posteriormente degradadas por la maquinariacelular, lo que conlleva la supresión de la expresión del gen.

Objetivo: evaluar los genes relacionados con el virus de la hepatitis.

Materiales y Métodos

Análisis de AgHBs y AgHBeHBsAg Este análisis se usa para detectar la presencia del virus. Un

resultado “positivo” o “reactivo” en el análisis de HBsAg indica que la persona está infectada con el virus de la hepatitis B, lo cual puede significar una infección “aguda” o “crónica”.

HBeAg Proteína soluble de la nucleocápside. Puede encontrarse en suero porque tras su síntesis se asocia a

un péptido señalizador que lo fija al retículo endoplásmico liso.

Materiales y Métodos

Reacción en cadena de la polimerasa:

Es una técnica que aplica metodologías como:

Desnaturalización del DNA

Hibridación de una hebra sencilla con un

primer

Replicación de una hebra sencilla por una

DNA polimerasa

Ampliación del DNA

Materiales y Métodos

PCR Cuantitativa

Actualmente se usa el bromuro de etídio (BrEt), q se une estequiomátricamente a ácidos nucleícos y su intensidad es proporcional a la cantidad de ácidos que se une.

Pero a pesar de esto aún hay dificultad en la cuantificación de estos. Por esto hay un método simple de análisis de imagen que realiza una precisa cuantificación de bandas de ácidos nucleícosdesarrollados en gel de agarosa.

Materiales y métodos

2-DELas células de cada muestra fueron cosechadas y lavadas

tres veces con PBS, se re suspendieron en 1 ml de solución amortiguadora de lisis

y luego se lisan por ultrasonidos de 4 × 10segundos y se incubaron en hielo durante 1 hora. después de

centrifugación a 23 000 g durante 30 minutos, el sobrenadante

fue cosechado.

Materiales y métodos

Sds-page Es una técnica ampliamente utilizada en bioquímica, genética, biología

molecular y ciencia forense para separar las proteínas de acuerdo a su movilidad electroforética (en función de la longitud de la cadena

polipeptídica, masa molecular, modificaciones postraduccionales y otros

factores). Es el método de electroforesis empleado con mayor profusión para

analizar proteínas.

Objetivo: analizar las proteínas que están en relación con el virus de la hepatitis B. gracias al empleo de técnicas de electroforesis.

Materiales y métodos

El Western blot Es una técnica analítica usada para detectar proteínas específicas en una

muestra determinada (una mezcla compleja de proteínas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las

proteínas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc.

Resultados

Células HepG2.2.15

Sin

HBx siRNA

Tasas de supresión

AgHBs 55%

AgHBe 66%

HBx siRNA

La regulación baja de HBx inhibe la

producción y expresión de los AgHBe y AgHBs

Resultados

Células con siRNA presentaron unadisminución de la replicación del DNAcomparadas con el grupo que no tenia siRNA.

Resultados

MALDI-TOF/TOFSe identificaron 12

proteínas que tuvieron alteración en su

intensidad y volumen con la caída del HBx

5:Downregulated7:Upregulated

Resultados

Se evaluaron los cambios que tuvieron las proteínas con el siRNA.

HSP70Su nivel de expresión

disminuyo despues ed la caidade HBx

Discussion

Autor Comments Agree/ Disagree

[1] Nguyen DH, Ludgate L, Hu J.

«HBx regulates a wide range of genes. Itup-regulates the expression of HBVgenes by transactivating its ownpromoters, as well as cellular genes ofinfected hepatocytes, thereby modifyingthe environment to facilitate viralreplication.»

[22]Henkler F, Hoare J,

Waseem N, Goldin RD, McGarvey MJ,Koshy R, et al.

“The viral HBx protein has been shown to promote transcriptional activation and

viral replication in the nucleus and cytoplasm of infected cells.”

Discussion

Autor Comments Agree/ Disagree

[28]. Liu K, Qian L, Wang J, Li W, Deng X,

Chen X, et al

«It also physically interacts with HSP60and HSP90 in the HepG2.2.15 cell line toform a multi-chaperone machine thatcontributes to the HBV life cycle, sodown-regulation of HSP70 couldsignificantly inhibit the production ofHBV virions.»

[35] Bedard K, Szabo E, Michalak M, Opas

[36]Michalak M, Groenendyk J, Szabo E, Gold LI, Opas M.

“Calreticulin (CALR), one of the mostubiquitous signaling molecules mainly locatedin the endoplasmic reticulum (ER), wasupregulated after the knockdown of HBx. CALRhas important functions in the calciumsignaling pathway by homeostatic control ofcytosolic and ER calcium levels.»

Conclusions

Is very important to do more research on themechanism of HBV replication, becausethat may suggest a new way of treating orpreventing a disease that affects millions ofpeople around the world.

Conclusions

Read scientific articles continually helps usmaintain our current knowledge on many diseases,because every day we learn something new in thefuture will serve us in our career as doctors.

Conclusions

The use of different techniques applied to the field of molecular biology are a source of

esencial information that not only provides valuable information to detect and classify any disease, but provides guidelines and directs us to a focus of study to finally understand why are some diseases that threaten human life.

Conclusions

The understanding of the various molecular processes such as replication, transcription and

translation of DNA, and familiarity to the specific terms of molecular biology allow us comprendre advances and studies that are

performed daily, around the world.

Mapa ConceptualAlejandro Eusse García

Mapa ConceptualMaría Paulina Henao Zuluaga