Andrea Pérez JaramilloAnny Sarria Mena
3rd Semester StudentsMolecular Biology
MUTATION OF RUBIE, A NOVEL LONG NON-CODING RNA LOCATED UPSTREAM OF Bmp4, CAUSES VESTIBULAR MALFORMATION IN
MICEKristina A. Roberts, Victoria E. Abraira, Andrew F. Tucker, Lisa V. Goodrich, Nancy C.
Andrews
INTRODUCTION
SENSING MOTION AND HEAD POSITION
VESTIBULAR APPARATUS
FUNCTION
SEMICIRCULAR CANALS
DYNAMIC BALANCE
CRISTAE AMPULLARES RESPONDS TO THE
ROTATIONAL MOVEMENTS
VESTIBULAR ABNORMALITIES
• Debilitating dizziness .• Imbalance in human.• Circling behavior in
mice.
In the ECL mice, amalformation of thelateral semicircular canalbrings circling andhyperactivity result.
EpistaticCircler
ECL
Complex mousemutant discovered ina multi-generationintercross populationderived fromwildtypes SWR/J andC57/J mice.
CIRCLING
Interaction of:• RECESSIVEChromosome 14SWR• DOMINANTChromosome 4= C57L
C57L alleles atmodifier loci onchromosomes 3 and13 increase thecircling risk.
RUBIE MUTATION
Mouse chromosomesubstitution strain thatgenetically resembles ECL , andexhibits similar behavioral andstructural abnormalities.
Essential gene for propervestibular development and Itis located upstream of bonemorphogenetic protein 4.
It isn’t an ECL candidate, but along, non-coding RNA (ncRNA)It is co-expressed with this indeveloping semicircular canals.
Is regulating for the novelncRNA , its expression isdisrupted by a SWR-specificendogenous retrovirus.
Bmp4
GENERAL OBJECTIVE
Identify the genes that areinvolved in the generationof three- dimensionalstructures in the inner earand explain theirfunctions to betterunderstanding the innerear mophogenesis highlyprocess.
La experimentación se llevó a cabo deacuerdo con los protocolos aprobados por elHospital Infantil de Boston , de la UniversidadInstitucional Cuidado Animal Duke y de losComités de Uso (protocolo A091-11-04), deacuerdo con las directrices nacionales einternacionales de animales:. CSS-14 eldesarrollo de la cepa se realizó en base ahonorarios por servicio de Laboratorio CharlesRiver (CRL).
MATERIALS AND METHODS
ÉTICA
CLONACIÓN POSICIONAL
Estrategia para la identificación de enfermedades genéticas que localiza algen responsable basándose únicamente en su posición cromosómica.ANÁLISIS DE LIGAMENTOIdentificar y estrechar intervalo que alberga elgen enfermo en un cromosoma.• Se relaciona n las transcripciones llevadas a cabo dentro del intervalo
con la enfermedad en cuestión
• Indentificar el cromosoma 14 del cual se deriva el gen recesivo SWR/J pormedio del CSS-14 que es un ratón desarrollado por sustitución de cepas quetiene un gen SWR/J en el cromosoma 14 y un gen C57BL/10J .
• El intervalo se encuentra arriba de la morfogénesis de la proteína 4 (Bmp4) quecontiene una secuencia no codificada de ADN conocida como RUBIE (RNAupstream of Bmp4 expressed in inner ear).
DESARROLLO DE CEPAS POR MARCADORES DE ADN NUCLEAR
1. MICROSATÉLITESe tomaron dos generaciones N2 y N5 que fuerongenotificadas usando un marcador de panelmicrosatélite 99 que contenía D14Mit 126,D14Mit60, D14Mit157 and D14Mit228.
N2-N5 A cada una se le escoge un ratónreproductor de todas las generaciones de hijos quellevan un gen SWR/J no recombinado en elcromosoma 14 y entrecruzamiento de C57BL/10J.• Otro entrecruzamiento fue llevado a cabo fuera
de la colonia antes de la experimentación.
UTILIDADuna alta tasa demutación y naturalezacodominante, permiteidentificar la diversidadgenética dentro y entrerazas, además de lamezcla genética entrerazas aún cuando estenestrechamenteemparentadas.
DESARROLLO DE CEPAS POR MARCADORES DE ADN NUCLEAR
2. SNP= POLIMORFISMO DE UN SOLO NUCLEÓTIDO
El análisis de 455 SNPs confirmóque los antecedentes genéticosdel CSS-14 fue del 100% derivadode C57BL/10J y que laintrogresión genética de SWR/J enel cromosoma 14 abarca unintervalo mínimo de 92,8 Mb, quese extiende desde dbSNPrs3710916 (8.8 Mb) parars6179144 (101,6 Mb).
UTILIDADCon el SNPs de puede hallarcuantitativamente (100%) laprobabilidad de que una sustituciónde bases en un fragmento de ADN enel gen C57BL/10J pueda estarestrechamente relacionado con larespuesta a la enfermedad encuestión, además en cuanto a laintrogresión genética en el gen SWR/Jhay un intervalo que es mínimodonde puede haber algunainfiltración de genes de una poblaciónhacia otra de diferente especie.
GENOTIPIFICACIÓN DE CSS-14
PREPARACIÓN DEL GENOMA
QIAGEN Dneasy Blood&Tissue Kit
SSLP: POLIMORFISMOS DE LONGITUD DE SECUENCIA
Purificación de ADNa partir de muestrasde tejidos o sangreen este caso de colade ratón, este ADNesta libre deinhibidores de la PCRpara futurasinvestigaciones.
SSLP se encontraronentre C57BL/10J ySWR/J.
Mantenimiento de las cepasy la posiciónde laclonación.SSLP se encontraron
entre D14Mit129 yD14Mit60.
12.25 EMBRIONES Y LAS HEMIDISECCIONES DE CABEZAS
DURANTE LA NOCHE A 4°C
FIJADOR BODIAN5% Ác.acético glacial
5% Formalina75% Etanol15% Agua
LAVAR DURANTE 10 MINUTOS
ETANOL
100%
DESHIDRATAR EN ETANOL AL100% DURANTE LA NOCHE AT° AMBIENTE Y ACLARARCON SALICILATO DE METILO
LATEX BLANCO DILUÍDO A 0.025%
SALICILATO DE METILO
1
• RNA STAT-60 Extracción de ARN del tejido congelado.
• El ARN esta libre de proteínas y de contaminación de ADN.
2
3• EXTRACCIÓN CON FENOL CLOROFORMOObtención de ADN libre de proteínas y enzimas.
4
• RT-PCR (Reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa) Amplificación y formación de ADNc (ADNcomplementario).
• Técnica de cebadores aleatorios Obtención de segmentos cortos de ADN de cadena simple y saber las posiblescombinaciones de base que se pueden hacer.
5
6
EXPRESIÓN Y ANÁLISIS DE RUBIE
• Tratamiento con DNAasa I para remover el DNA genómico contaminado, a partir de la muestra de ARN.
•PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) Realizar muchas copias de un segmento de de ADN a partir de unacantidad muy pequeña de éste, en la cual los cebadores o iniciadores son Rubie y Actb.
•Tratamiento con gel de agarosa en Electroforesis.•QIAGEN Gel extraction Kit Purificación de productos PCR >100 pb eliminando impurezas de la muestra de ADN•Secuenciación
HIBRIDACIÓN IN-SITU
Se realizó en pequeñas secciones (10-12 µm) de las cabezasde embriones E11.5.
La sonda Rubie fue amplificada de la plantilla del clonRIKEN F930028D17 usando cebadores en exones 2 y 5.
La sonda Bmp4 fue generada usando una plantilla quecorresponde a las primeras 293pb del exon 4.
Colocar células en filtro específico.
Lisar células para liberar DNA
Desnaturalizar el DNAAñadir la
sonda marcada.
Hibridar sonda con DNA desnaturalizado Detectar señal emitida por la sonda
MATERIALES Y MÉTODOS
INSERCIÓN DE MAPEO DE RUBIE Y ANALISIS DE SECUENCIACIÓN
1. La inserción de retrovirus endógenos en el intron 1 de Rubie, fue respresentada por analisis de PCR del DNA genomico de SWR/J y C57BL/10J.
2. En cada PCR, se evaluó la amplificación en SWR/J y C57BL/10J como presente o ausente por medio de electroforesis con gel de agarosa.
3. Amplificacion por medio de Long PCR System (Roche), que permite:
• Amplificar secuencias largas y precisas a partir de una plantilla de ADN mediante PCR.
• Lograr un mayor rendimiento y fidelidad• Mejorar la eficiencia de la PCR.
MATERIALES Y MÉTODOS
SECUENCIACIÓN
SWR/J PCR
• Bandas purificadas por QIAGEN Gel Extraction Kit.
• Fueron clonados dentro del vectorpCR-XL-TOPO
• Secuenciación por “Primer Walking”
Secuencias largas de ADN se fragmentan, el ADN de interés es el producto del PCR.
C57BL/10J PCR
• Fueron secuenciados directamente.
ANÁLISIS DE EMPALME
AMPLIFICACION DE ADN
MEDIANTE SEMIENCAJE PCR
Realizado en elcDNA del oídointerno.
INICIADORES
1. Primers enel exon 1 deRUBIE
2. Primers endireccióncontrariaespecífico pararetrovirusendógeno ETnII-β
AMPLIFICACIÓN
RESULTADOS
Muestran hiperactividad y círculos bidireccionales que eran evidentes antes del destete y se mantuvo durante toda la vida.
SWR/J (Chr14) +
C57BL/10J (B10)
C57BL/10J-Chr14SWR/J (CSS-14)
14 R hetero.
CSS-(Chr14B10/SWR fondoB10/B10)
Generación de una Cepa de Cromosomas Sustituidos que muestra un
Comportamiento Circular
No mostró anormalidades en la conducta.
Se visualiza el oído interno de los cachorros deChr14B10/SWR Chr14SWR/SWR en el díapostnatal 0 (P0) con técnica Paint Fillestándar muestran la morfología normal conLSC intactos.
CSS-14 Circular.Prueba de la malformación del canal
semicircular lateral
Confirma que el CSS-14 y ECL círcular soncausados por el mismo tipo de malformacionesestructurales y se apoya la conclusión deque tanto el ratón modelo como el CSS-14 esresultado del mismo defecto genético.
Figura 1
CSS-14 exposiciónde la malformacióncircular del canalsemicircularlateral.
• BY232928 se encuentra arriba deBmp4, dentro de una regióngenómica se demostró quees importante para la expresiónBmp4 en el desarrollo deloído interno.
• Se confirmó la expresiónde Rubie en embrionesy postnatales (P6) oído interno porRT-PCR
Rubie es una Larga Cadena de ARN no codificado expresado en el
desarrollo Canales Semicirculares
• Rubie es una transcripción empalmada y poliadenilato,que se cree funciona como un ARNm (ncRNA) , pero sepresenta una falta de características, por tanto se definepor su incapacidad para exhibir que codifican lasproteínas estas características.
• Está involucrado en la regulación de la expresión génicay el desarrollo del oído interno.
Figura 3.
Secuencia y análisis de expresión de Rubie.
• Rubie se expresa en el desarrollo de los canalessemicirculares. Se ha descubierto que el alelo SWR / Jde Rubie se ve interrumpido por un retrovirusendógeno intrónico que causa un aberrante Splicing yuna poliadenilación prematura de la transcripción.
• Inserciones de Intronic ETnII-beta, se ha demostrado quealteran la transcripción de dos formas:
Por la aberrante secuencia de ERV de empalme en latranscripción.
El acoplamiento de aberrantes de empalme con el splicing depoliadenilación en el ERV.
Un Retrovirus Endógeno ROE-específico, interrumpe la expresión y el
Splicing del Rubie
Figura 5.La interrupción de Rubie por un retrovirus endógeno SWR-específica
• Bmp4 es esencial para eldesarrollo vestibular adecuada, se diceque Rubie es el gen mutado en losratones Ecl, que está implicado en laregulación de la expresión de Bmp4 oídointerno, y que la expresión aberrantede Bmp4 contribuye a la ECL fenotipo.
RESULTADO GENERAL
DISCUSSION
Author’s Name ¿What the author said? Is it related with the study
YES NOT
Pregizer S, MortlockDP, et al.
Bmp4, like other BMPs, regulatesmany developmental processesand displays numerousspatiotemporal-specificexpression patterns throughoutdevelopment, are controlled bymultiple tissue-specific, which areoften located far from the codingregions and promoters of thegenes they regulate.
-Chang W, Lin Z,Kulessa H, HebertJ, Hogan BL, et al.-Vervoort R,Ceulemans H, VanAerschot L,D'Hooge R, DavidG, et al.
The expression patternsof Rubie and Bmp4 are nearlyidentical in developing innerears and the anatomicalphenotype of micehaploinsufficient for Bmp4 isindistinguishable from thatof Ecl mice and CSS-14 circlers.
Chandler KJ,Chandler RL,Mortlock DP, et al.
While global Bmp4 deletioncauses embryonic lethality, it hasbeen suggested that geneticvariation within cis-regulatoryelements might affect tissue-specific Bmp4 expression andresult in tissue- or organ-restricted developmental defects.
Cowan CA,Yokoyama N,Bianchi LM,Henkemeyer M,Fritzsch B, et al.
It remains to be determinedwhether the chromosome4 Ecl gene influences BMPsignaling or operates through aparallel pathway also necessaryfor canal morphogenesis.
• It is very important to understand the auditory functions,elucidate how these may be affected and that bringsconsequences each polymorphism within the inner ear, sincebeing an organ as sensitive and important, is very susceptibleto injury, leaving serious disorders balance and proprioception.
• It is crucial to understand the process by which retroviruses andother pathogens attack, and in this way to create technical and/ or drugs to combat and help so many people to have a goodquality of life.
CONCLUSIONS
• And not only pathogens but also embryonic malformations,since this problem has a fairly high incidence worldwide, forthat reason correct his condition would be very important forthe whole population.
• It should also into account, the characteristics of eachstrain to identify where and how to fix the damage, becauseall have different patterns that determine the expression ofgenes and development.
MAPA CONCEPTUAL
MAPA CONCEPTUAL