Andrea Pérez JaramilloAnny Sarria Mena
3rd Semester StudentsMolecular Biology
MUTATION OF RUBIE, A NOVEL LONG NON-CODING RNA LOCATED UPSTREAM OF Bmp4, CAUSES VESTIBULAR MALFORMATION IN
MICEKristina A. Roberts, Victoria E. Abraira, Andrew F. Tucker, Lisa V. Goodrich, Nancy C.
Andrews
INTRODUCTION
SENSING MOTION AND HEAD POSITION
VESTIBULAR APPARATUS
FUNCTION
SEMICIRCULAR CANALS
DYNAMIC BALANCE
CRISTAE AMPULLARES RESPONDS TO THE
ROTATIONAL MOVEMENTS
VESTIBULAR ABNORMALITIES
• Debilitating dizziness .• Imbalance in human.• Circling behavior in
mice.
In the ECL mice, a malformation of the lateral semicircular canal brings circling and hyperactivity result.
Epistatic Circler
ECL
Complex mouse mutant discovered in a multi-generation intercross population derived from wildtypes SWR/J and C57/J mice.
CIRCLINGInteraction of:• RECESSIVEChromosome 14 SWR• DOMINANTChromosome 4= C57L
C57L alleles at modifier loci on chromosomes 3 and 13 increase the circling risk.
RUBIE MUTATION
Mouse chromosome substitution strain that genetically resembles ECL , and exhibits similar behavioral and structural abnormalities.
Essential gene for proper vestibular development and It is located upstream of bone morphogenetic protein 4.
It isn’t an ECL candidate, but a long, non-coding RNA (ncRNA) It is co-expressed with this in developing semicircular canals.
Is regulating for the novel ncRNA , its expression is disrupted by a SWR-specific endogenous retrovirus.
Bmp4
GENERAL OBJECTIVE
Identify the genes that are involved in the generation of three- dimensional structures in the inner ear and explain their functions to better understanding the inner ear mophogenesis highly process.
La experimentación se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por el Hospital Infantil de Boston , de la Universidad Institucional Cuidado Animal Duke y de los Comités de Uso (protocolo A091-11-04), de acuerdo con las directrices nacionales e internacionales de animales:. CSS-14 el desarrollo de la cepa se realizó en base a honorarios por servicio de Laboratorio Charles River (CRL).
MATERIALS AND METHODS
ÉTICA
CLONACIÓN POSICIONAL
Estrategia para la identificación de enfermedades genéticas que localiza al gen responsable basándose únicamente en su posición cromosómica.ANÁLISIS DE LIGAMENTO Identificar y estrechar intervalo que alberga el gen enfermo en un cromosoma.• Se relaciona n las transcripciones llevadas a cabo dentro del intervalo
con la enfermedad en cuestión
• Indentificar el cromosoma 14 del cual se deriva el gen recesivo SWR/J por medio del CSS-14 que es un ratón desarrollado por sustitución de cepas que tiene un gen SWR/J en el cromosoma 14 y un gen C57BL/10J .
• El intervalo se encuentra arriba de la morfogénesis de la proteína 4 (Bmp4) que contiene una secuencia no codificada de ADN conocida como RUBIE (RNA upstream of Bmp4 expressed in inner ear).
DESARROLLO DE CEPAS POR MARCADORES DE ADN NUCLEAR
1. MICROSATÉLITESe tomaron dos generaciones N2 y N5 que fueron genotificadas usando un marcador de panel microsatélite 99 que contenía D14Mit 126, D14Mit60, D14Mit157 and D14Mit228.
N2-N5 A cada una se le escoge un ratón reproductor de todas las generaciones de hijos que llevan un gen SWR/J no recombinado en el cromosoma 14 y entrecruzamiento de C57BL/10J. • Otro entrecruzamiento fue llevado a cabo fuera
de la colonia antes de la experimentación.
UTILIDADuna alta tasa de mutación y naturaleza codominante, permite identificar la diversidad genética dentro y entre razas, además de la mezcla genética entre razas aún cuando esten estrechamente emparentadas.
DESARROLLO DE CEPAS POR MARCADORES DE ADN NUCLEAR
2. SNP= POLIMORFISMO DE UN SOLO NUCLEÓTIDO
El análisis de 455 SNPs confirmó que los antecedentes genéticos del CSS-14 fue del 100% derivado de C57BL/10J y que la introgresión genética de SWR/J en el cromosoma 14 abarca un intervalo mínimo de 92,8 Mb, que se extiende desde dbSNP rs3710916 (8.8 Mb) para rs6179144 (101,6 Mb).
UTILIDADCon el SNPs de puede hallar cuantitativamente (100%) la probabilidad de que una sustitución de bases en un fragmento de ADN en el gen C57BL/10J pueda estar estrechamente relacionado con la respuesta a la enfermedad en cuestión, además en cuanto a la introgresión genética en el gen SWR/J hay un intervalo que es mínimo donde puede haber alguna infiltración de genes de una población hacia otra de diferente especie.
GENOTIPIFICACIÓN DE CSS-14
PREPARACIÓN DEL GENOMA
QIAGEN Dneasy Blood &Tissue Kit
SSLP: POLIMORFISMOS DE LONGITUD DE SECUENCIA
Purificación de ADN a partir de muestras de tejidos o sangre en este caso de cola de ratón, este ADN esta libre de inhibidores de la PCR para futuras investigaciones.
SSLP se encontraron entre C57BL/10J y SWR/J.
Mantenimiento de las cepas y la posición de la clonación.SSLP se encontraron
entre D14Mit129 y D14Mit60.
12.25 EMBRIONES Y LAS HEMIDISECCIONES DE CABEZAS
DURANTE LA NOCHE A 4°C
FIJADOR BODIAN5% Ác.acético glacial
5% Formalina75% Etanol15% Agua
LAVAR DURANTE 10 MINUTOS
ETANOL
100%
DESHIDRATAR EN ETANOL AL 100% DURANTE LA NOCHE A T° AMBIENTE Y ACLARAR CON SALICILATO DE METILO
LATEX BLANCO DILUÍDO A 0.025%
SALICILATO DE METILO
1
• RNA STAT-60 Extracción de ARN del tejido congelado. • El ARN esta libre de proteínas y de contaminación de ADN.
2
3• EXTRACCIÓN CON FENOL CLOROFORMOObtención de ADN libre de proteínas y enzimas.
4
• RT-PCR (Reacción en cadena de polimerasa con transcriptasa inversa) Amplificación y formación de ADNc (ADN complementario).
• Técnica de cebadores aleatorios Obtención de segmentos cortos de ADN de cadena simple y saber las posibles combinaciones de base que se pueden hacer.
5
6
EXPRESIÓN Y ANÁLISIS DE RUBIE
• Tratamiento con DNAasa I para remover el DNA genómico contaminado, a partir de la muestra de ARN.
•PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) Realizar muchas copias de un segmento de de ADN a partir de una cantidad muy pequeña de éste, en la cual los cebadores o iniciadores son Rubie y Actb.
•Tratamiento con gel de agarosa en Electroforesis.•QIAGEN Gel extraction Kit Purificación de productos PCR >100 pb eliminando impurezas de la muestra de ADN•Secuenciación
HIBRIDACIÓN IN-SITU
Se realizó en pequeñas secciones (10-12 µm) de las cabezas de embriones E11.5.
La sonda Rubie fue amplificada de la plantilla del clon RIKEN F930028D17 usando cebadores en exones 2 y 5.
La sonda Bmp4 fue generada usando una plantilla que corresponde a las primeras 293pb del exon 4.
Colocar células en filtro específico.
Lisar células para liberar DNA
Desnaturalizar el DNAAñadir la
sonda marcada.
Hibridar sonda con DNA desnaturalizado Detectar señal emitida por la sonda
MATERIALES Y MÉTODOS
INSERCIÓN DE MAPEO DE RUBIE Y ANALISIS DE SECUENCIACIÓN
1. La inserción de retrovirus endógenos en el intron 1 de Rubie, fue respresentada por analisis de PCR del DNA genomico de SWR/J y C57BL/10J.
2. En cada PCR, se evaluó la amplificación en SWR/J y C57BL/10J como presente o ausente por medio de electroforesis con gel de agarosa.
3. Amplificacion por medio de Long PCR System (Roche), que permite:
• Amplificar secuencias largas y precisas a partir de una plantilla de ADN mediante PCR.
• Lograr un mayor rendimiento y fidelidad• Mejorar la eficiencia de la PCR.
MATERIALES Y MÉTODOS
SECUENCIACIÓN
SWR/J PCR• Bandas purificadas por
QIAGEN Gel Extraction Kit.• Fueron clonados dentro del
vectorpCR-XL-TOPO• Secuenciación por “Primer
Walking”
Secuencias largas de ADN se fragmentan, el ADN de interés es el producto del PCR.
C57BL/10J PCR• Fueron secuenciados
directamente.
ANÁLISIS DE EMPALME
AMPLIFICACION DE ADN
MEDIANTE SEMIENCAJE PCR
Realizado en el cDNA del oído interno.
INICIADORES
1. Primers en el exon 1 de RUBIE
2. Primers en dirección contraria específico para retrovirus endógeno ETnII-β
AMPLIFICACIÓN
RESULTADOS
Muestran hiperactividad y círculos bidireccionales que eran evidentes antes del destete y se mantuvo durante toda la vida.
SWR/J (Chr 14) +
C57BL/10J (B10)
C57BL/10J-Chr14SWR/J (CSS-14)
14 R hetero.
CSS- (Chr14B10/SWR fondo B10/B10)
Generación de una Cepa de Cromosomas Sustituidos que muestra un
Comportamiento Circular
No mostró anormalidades en la conducta.
Se visualiza el oído interno de los cachorros de Chr14B10/SWR Chr14SWR/SWR en el día postnatal 0 (P0) con técnica Paint Fill estándar muestran la morfología normal con LSC intactos.
CSS-14 Circular. Prueba de la malformación del canal
semicircular lateral
Confirma que el CSS-14 y ECL círcular son causados por el mismo tipo de malformaciones estructurales y se apoya la conclusión de que tanto el ratón modelo como el CSS-14 es resultado del mismo defecto genético.
Figura 1
CSS-14 exposición de la malformación circular del canal semicircular lateral.
• BY232928 se encuentra arriba de Bmp4, dentro de una región genómica se demostró que es importante para la expresión Bmp4 en el desarrollo del oído interno.
• Se confirmó la expresión de Rubie en embriones y postnatales (P6) oído interno por RT-PCR
Rubie es una Larga Cadena de ARN no codificado expresado en el
desarrollo Canales Semicirculares
• Rubie es una transcripción empalmada y poliadenilato, que se cree funciona como un ARNm (ncRNA) , pero se presenta una falta de características, por tanto se define por su incapacidad para exhibir las proteínas que codifican estas características.
• Está involucrado en la regulación de la expresión génica y el desarrollo del oído interno.
Figura 3.Secuencia y análisis de expresión de Rubie.
• Rubie se expresa en el desarrollo de los canales semicirculares. Se ha descubierto que el alelo SWR / J de Rubie se ve interrumpido por un retrovirus endógeno intrónico que causa un aberrante Splicing y una poliadenilación prematura de la transcripción.
• Inserciones de Intronic ETnII-beta, se ha demostrado que alteran la transcripción de dos formas:
Por la aberrante secuencia de ERV de empalme en la transcripción.
El acoplamiento de aberrante empalme con el splicing de poliadenilación en el ERV.
Un Retrovirus Endógeno ROE-específico, interrumpe la expresión y el
Splicing del Rubie
Figura 5.La interrupción de Rubie por un retrovirus endógeno SWR-específica
• Bmp4 es esencial para un desarrollo vestibular adecuado, se dice que Rubie es el gen mutado en los ratones Ecl, que está implicado en la regulación de la expresión de Bmp4 oído interno, y que la expresión aberrante de Bmp4 contribuye al fenotipo de ECL .
RESULTADO GENERAL
DISCUSSIONAuthor’s Name ¿What the author said? Is it related with the study
YES NOT
Pregizer S, Mortlock DP, et al.
Bmp4, like other BMPs, regulates many developmental processes and displays numerous spatiotemporal-specific expression patterns throughout development, are controlled by multiple tissue-specific, which are often located far from the coding regions and promoters of the genes they regulate.
-Chang W, Lin Z, Kulessa H, Hebert J, Hogan BL, et al. -Vervoort R, Ceulemans H, Van Aerschot L, D'Hooge R, David G, et al.
The expression patterns of Rubie and Bmp4 are nearly identical in developing inner ears and the anatomical phenotype of mice haploinsufficient for Bmp4 is indistinguishable from that of Ecl mice and CSS-14 circlers.
Chandler KJ, Chandler RL, Mortlock DP, et al.
While global Bmp4 deletion causes embryonic lethality, it has been suggested that genetic variation within cis-regulatory elements might affect tissue-specific Bmp4 expression and result in tissue- or organ-restricted developmental defects.
Cowan CA, Yokoyama N, Bianchi LM, Henkemeyer M, Fritzsch B, et al.
It remains to be determined whether the chromosome 4 Ecl gene influences BMP signaling or operates through a parallel pathway also necessary for canal morphogenesis.
• It is very important to understand the auditory functions, elucidate how these may be affected and that brings consequences each polymorphism within the inner ear, since being an organ as sensitive and important, is very susceptible to injury, leaving serious disorders balance and proprioception.
• It is crucial to understand the process by which retroviruses and other pathogens attack, and in this way to create technical and / or drugs to combat and help so many people to have a good quality of life.
CONCLUSIONS
• And not only pathogens but also embryonic malformations, since this problem has a fairly high incidence worldwide, for that reason correct his condition would be very important for the whole population.
• It should also into account, the characteristics of each strain to identify where and how to fix the damage, because all have different patterns that determine the expression of genes and development.
MAPA CONCEPTUAL
MAPA CONCEPTUAL
