Molecular biology, School of MedicineFebruary 23- 2015

María Alejandra Aristizábal Giraldo and Mary Luz Bohórquez

INTRODUCTION

STEATOSIS

An accumulation of fat in the liver

Alcohol-related fatty liver disease Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD).

A threshold of <20 g alcohol per day in

women and <30 g in men is usually used to allow a diagnosis

of NAFLD.

ALCOHOL-RELATED FATTY LIVER DISEASE

LIVER ALCOHOL DEHYDROGENASE

INDICATESATP

FALSE CALORIES Storage and biosynthesis of cholesterol and

triglycerides

NON-ALCOHOLIC FATTY LIVER DISEASE (NAFLD).

The non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is defined as a steatosis entity encompassing a broad spectrum of liver damage, occurring in the

absence of chronic alcohol consumption

simple steatosis

steatosis necroinflammatory

changes associated with varying degrees of fibrosis

called steatohepatitis

cirrhosis.

include

Hepatic component of the metabolic syndrome

Prevalence among 20-30% of the population in Western countries and 15% in Asian countries

It is characterized by the increased flow and hepatic uptake of circulating free fatty acids (FFA) from excessive peripheral lipolysis, all as a result of insulin resistance (RI) in adipose tissue

FEATURES

Hepatomegaly is very common.

Splenomegaly with or without portal hypertension may occur with cirrhosis.

• Age> 45 years• BMI> 30 kg / m2• Hypertriglyceridemia • Presence of comorbidities:

Diabetes mellitus Type 2 Metabolic syndrome Sleep apnea syndrome

RISK FACTORS

INTRODUCTION

LIPID-PEROXIDATION

Is considered as the main molecular mechanisms involved in

the oxidative damage to cell structures and in the toxicity process that produce cell death.

It involves the formation and propagation of lipid radicals, the uptake of oxygen, a rearrangement of the double bonds in

unsaturated lipids and the eventual destruction of membrane lipids, with the production of a variety of breakdown products, including alcohols, ketones, alkanes, aldehydes and ethers

Cause or consequence of oxidative stress

INTRODUCTION

OXIDATIVE STRESS

Oxidative stress is essentially an imbalance between the production of free radicals and the ability of the body to counteract or detoxify their harmful effects through neutralization by antioxidants (enzymes: glutathione reductase; exogenous: Vitamin C, Beta-carotene and Vitamin E)

Oxidative stress leads to many pathophysiological conditions in the body

INTRODUCTION

HEPATOCYTEHepatocytes are the chief functional cells

of the liver and perform an

astonishing number of metabolic, endocrine

and secretory functions.

Roughly 80% of the mass of the liver is contributed by hepatocytes.

• Protein synthesis• Protein storage• Transformation of CHO• Synthesis of cholesterol,

bile salts and phospholipids.

• Detoxification, modification, and excretion of exogenous and endogenous substances

• Initiation of formation and secretion of bile

WHAT ARE THEIR FUNCTIONS?

INTRODUCTION

One of themost common chronic

liver diseases (affecting

hepatocytes)

NON-alcoholic fatty liver disease (steatosis)

oxidative stress

ROS

Balance between pro- and antioxidants is impaired

Lipid peroxidation

Oxidative stress can lead to the

modifications of biological molecules, including DNA, lipids

and proteins and has been implicated in many pathological

conditions

OBJECTIVE

Evaluate the association between alterations in

nuclear morphology and oxidative stress by identifying protein products of lipid

peroxidation (oxoLPP).

MATERIALES Y MÉTODOS

1) CULTIVO CELULAR

“Método donde los biólogos moleculares y celulares

conducen estudios experimentales sobre células

aisladas de un organismo mantenidas en condiciones

que permiten su supervivencia y crecimiento”

VENTAJAS

Facilidad para cultivar células de un único tipo específico

con propiedades homogéneas.

Las condiciones experimentales

pueden controlarse más fácilmente.

Se lleva a cabo el proceso de clonación celular, donde

una única célula puede formar una colonia de

células idénticas

DESVENTAJAS

No se encuentran en el ambiente normal, y por ende sus actividades no están reguladas por otras células y

tejidos como ocurre en células in vivo

¿Para qué se realizó esto en la investigación?

Se cultivaron células de la línea Hep62, en condiciones fisiológicas.

Se les adiciono el “fatty acid complex” (FA) para inducir in-vitro la esteatosis y observar diferentes comportamientos.

A otras se les adicionó adicionalmente CoCl2, un compuesto que regula el estrés celular exógeno.

Se dejaron muestras control.

2) VIABILIDAD CELULAR

Es una determinación de las células vivas o muertas, en base a una muestra total de

células. Por lo general se involucra tinción o aplicación de productos químicos para identificar

dicha variable.

La acumulación del Rojo Neutro ocurre por entrampamiento del colorante dentro del ambiente ácido del lisosoma

Se usó el ensayo de ABSORCIÓN

LISOSOMAL NEUTRO ROJO.

¿Para qué se realizó esto en la investigación?

Para determinar la viabilidad de las células cultivadas

Se basa en la detección de los daños que producen los compuestos tóxicos sobre la integridad de la membrana de los lisosomas y sobre el control del

flujo del colorante a través de la misma.

Como respuesta se observa una disminución en la capacidad de las células para retener al colorante Rojo Neutro en el

interior de los lisosomas, la cual es indicadora de la viabilidad celular

3) LA TINCIÓN NUCLEAR.

Método empleado para distinguir entre diferentes tipos de células o

para revelar la presencia de determinados constituyentes

celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares,

centros de actividad respiratoria, proteínas, entre otras.

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos (cationes+) que tienen alguna afinidad específica por los

materiales celulares.

¿Para qué se realizó esto en la investigación?

Para evaluar la acumulación de grasa intracelular

SE USÓ TINCIÓN CON FLUORESCENCIA

Técnica más versátil y poderosa para la localización de proteínas dentro de una célula por microscopía óptica, y observación a través de microscopio de fluorescencia.

Químico fluorescente = es aquel que es capas de absorber la luz de determinada longitud de onda (de excitación) y emite luz (fluoresce) a una longitud de onda específica más larga.

Los fluorocromos emiten luz visible (+) o infrarroja (-). En los microscopios, solo la luz fluorescente emitida por la

muestra, se usa para formar la imagen.

Se usó el fluorocromo

rojo Nilo-DMSO

4) MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

Cuando un investigador desea detectar la presencia de proteínas específicas, se recurre al método de anticuerpos unidos en forma covalente a los fluorocromos.

(microscopía de inmunofluorescencia)

La microscopía de fluorescencia convencional tiene limitaciones, la principial es :

Superposición de imágenes fluorescentes

Microscopía de barrido confocal.

¿Para qué se realizó esto en la

investigación?

Detectar los productos de la peroxidación de lípidos

(reactivos (oxoLPP).)

5) MTT.

Ensayo que se basa en la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol

(MTT) realizada por la enzima mitocondrial succinato-DH en un

compuesto coloreado de color azul(formazan), permitiendo determinar la

funcionabilidad mitocondrial de las células tratadas.

¿Para qué se realizó esto en la

investigación?

1. Viabilidad, proliferación y supervivencia celular.

2. Función mitocondrial3. Actividad de las

oxidorreductasas mitocondriales

6) EVALUACIÓN DE ROS

Se analizó mediante métodos de fluorescencia (DCFDA) la presencia de especias reactivas de oxígeno en todas las células (las que fueron tratadas con el FA complex, y las que no).

FisiológicamenteCantidades normales

Esenciales para la producción de energía. Síntesis de compuestos Fagocitosis Transducción de señales.

Envejecimiento Cáncer Enfermedades coronarias

PatológicamenteCantidades aumentadas

Detectar estado fisiológico, o patológico según la evaluación de

ROS y estrés celular

¿Para qué se realizó esto en la investigación?

7) WESTERN BLOT O INMUNOBLOT

ES UNO DE LOS MÉTODOS MÁS PODEROSOS PARA DETECTAR UNA PROTEÍNA EN PARTICULAR EN UNA MEZCLA COMPLEJA DE PROTEÍNAS.

Se utiliza un anticuerpo

específico para detectar la proteína de

interés

El resultado aporta información sobre el peso molecular de la

proteína y su cantidad relativa en la muestra

Las proteínas de la muestra

se separan mediante

electroforesis en gel en

función del peso molecular

EXPLICACIÓN

En este método se usan 2 anticuerpos diferentes, uno específico para la proteína buscada y el otro

unido a una enzima informadora (reporter).

Método que permite separar las proteínas bajo un campo eléctrico de acuerdo a su movilidad electroforética, es decir en función de su talla, o peso molecular

SDS-PAGE

SDS : Dodecilsulfato SódicoPAGE : Electroforesis en gel de

poliacrilamida

Phospho-specific (Ser139) Total histoneH2AX(CellsignalingTechnology) β-actin (BDBios- ciences)

ANTICUERPOS UTILIZADOS

¿Para qué se realizó esto en la

investigación?

Para detectar proteínas específicas como las histonas, especialmente la

H2AX

8) ESPECTOMETRÍA DE MASAS

Poderosa técnica para la medición de la masa de las moléculas como las proteínas y los péptidos.

¿Para qué se realizó esto en la

investigación?

Análisis de lípidos carbonilados y la modificación de

proteínas

Tiempo inversamente proporcional a la masa

9) ANÁLISIS “STRING”

.

Es una base de datos donde están las interacciones conocidas y predichas de las proteínas humanas.Las interacciones incluyen asociaciones directas (físicas) e indirectos (funcionales).Adicionalmente da información de proximidades en el genoma, fusión de los genes, datos bioquímico y moleculares, en resumen recolecta la información conocida de las proteínas.

¿Para qué se realizó esto en la

investigación?

Para tener un patrón establecido de las características propias de una proteína y poder analizar las

modificaciones que presenta

RESULTADOS

EFECTO DE AG Y/O COCL2 EN LA ACUMULACIÓN CELULAR DE LÍPIDOS

• Lípidos intracelulares tinción Rojo Nilo y fluorescencia• Incremento de AG en la células HepG2 • El CoCl2 no presento ningún efecto acumulativo de lípidos ni el control ni

en los hepatocitos con AG.

EFECTO DE AG Y COCL2 EN LA MORFOLOGÍA DEL NÚCLEO CELULAR

• Alteración en la forma del núcleo en células tratadas con AG y Ag/CoCL2

• Los oxoLPP mostraron gran intensidad tanto en células tratadas con AG y AG/CoCL2

• CoCL2 no mostro significancia con esta prueba

A

Bfueron evaluados con CHH y microscopio de fluorescencia

EFECTO DE AG Y/O COCL2 EN LAS PROTEÍNAS HISTONAS

• Se identificaron 3 bandas especificas por su intensidad en las muestras de Ag y AG/CoCL2

• Al analizar las bandas con MS se identificaron especies de Histonas

H2A,1 H2B,1 H3,3 Y H4

Regulan metabolismo

lipídico

Reparación de ADN

Splicing

Remodelación de cromatina

Proteínas del citoesqueleto

• Células tratadas con AG mostraron tener grandes cantidades de oxoLPP y LPP modificadas (en los grupos de AG y AG/CoCL2)

• Se pudieron evidenciar modificaciones estructurales en hnRNPs lo que lleva

Se ha demostrado que se afectan en estrés oxidativo en enfermedades hepáticas tal con la NAFLD y la

esteatosis

DISCUSSION

RESEARCHERS HYPOTHESIS PROOF

B.J. Stewart, J.R. Roede, J.A. Doorn, D.R. Petersen

Demostration of excessive acumulation of lipid in hepatocytes is

present in liver’s diseases (from HepG2 cell)

M.Marmunti,M.Gavazza,A.Catalá

Lipid peroxidation is one of the main events induced by oxidative stress and it can be particularly damaging

to the liver nuclear membrane rich in PUFA.

C.T. Shearn, D.S. Backos, D.J. Orlicky, R.L. Smathers-McCullough, D.R. Petersen,

K.S. Fritz, P. Reigan.

Although that liver can metabolized reactives oxoLPP has been shown that high level of modifications of liver and hepatocyte proteins due

reactive oxoLPP

J.J. Galligan, K.L. Rose, W.N. Beavers, S. Hill, K.A. Tallman, W.P. Tansey, L. J.

Marnett

Modifications of H3-H4 generate disruption in nucleosome formation

which may challenge chromatic dynamics and histone turnover

• An accumulation of free fatty acids, induces an increase in the concentration of reactive oxygen species, which in turn generates an activation of lipid peroxidation mechanism. This last, produces reagents (oxoLPP) involved in the destruction of the core protein structures triggering disease states, such as non alcoholic steatosis.

• With a clear knowledge of pathophysiological steatosis mechanisms, we could generate better and more efficient treatments, that can generate a stop in the disease progression reducing consequences, such as the steatohepatitis and cirrhosis.

• Based on the same foundation of the previous one, we conclude that its important to investigate and treatments to prevent and avoid the disease

CONCLUSIONS

BIBLIOGRAFÍA

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• Martínez Sánchez, Lina María; Vargas Grisales, Natalia; Toro Montoya, Andrés Eduardo; Pamplona Sierra, Ana Paulina; Queveda Orrego, Esteban. “Biología molecular”. 7. ed. Medellín, Colombia. Editorial Universidad Pontificia Bolivariana, 2014. pp: 139-140.

• Anavi, Sarit; Ni, Zhixu; Tirosh, Oren; Fedovora, Maria. “Steatosis-induced proteins adducts with lipid peroxidation products and nuclear electrophillic stress in hepatocytes”. Redox biology. 2 de Abril del 2015. 158-168

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http://docs.abcam.com/pdf/events/spanish-wb-webinar.pdf

http://catarina.udlap.mx/u_dl_a/tales/documentos/lia/baizabal_c_rh/capitulo4.pdf

MAPAS CONCEPTUALES

María Alejandra Aristizábal Giraldo