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Tecnologias de sequenciamento
- Sanger sequencing
- PNAS 74 (1977), n. 12, 5463-5467
- Sequenciador MegaBACE (1Mpb/24 horas)
- Sequências em torno de 500 bp
- Pirosequenciamento
- Science 281 (1998), n. 5375, 363-365- Science 281 (1998), n. 5375, 363-365
- Nature 437 (2005), 362-7
- Sequenciador 454 (150Mpb/24 horas)
- Sequências em torno de 400 bp
- Short reads sequencing (Solexa e Solid)
- 4000Mbp/24 horas
- Sequências em torno de 100 bp
anelamento dos primers
Sanger sequencing
denaturação
Exemplo de gel utilizado nos seqüenciadores de gel (ex.: 377). A diferença de tamanho permite a separação dos grupos de fragmentos, e esta
“distribuição normal” da passagem dos fragmentos é representada pelo eletroferograma (ou cromatograma) de cada seqüência (read).
Filme sequenciamento
- A identificação dos picos é feita através de uma transformada de fourier do sinal
- A nota está ligada com a resolução entre os picos vizinhos e a altura do background
background
Região de qualidade alta
Analisando o cromatograma
• Picos bem definidos e grandes.
• Linha de base boa.
• Distância entre picos anterior e posterior constante.
Região de qualidade média – poucas ambigüidades
• Picos razoavelmente bem definidos e de tamanho médio.
• Linha de base boa a razoável.
• Distância entre picos anterior e posterior razoável.
Região de qualidade baixa – baixa confiabilidade
• Picos mal definidos e de tamanho pequeno.
• Linha de base confusa.
• Distância entre picos anterior e posterior inconstante.
Sequenciamento produz sequencias em torno de 500bp
Onde q é a nota phred e P é a probabilidade encontrar uma base errada :
- Nota phred = 20 => 1 base errada a cada 100 (99%)
- Nota phred = 30 => 1 base errada a cada 1000 (99.9%)
Pyrosequencing
Fita simples
Science 281 (1998), n. 5375, 363-365
Câmera de CCD
Reação de degradação
Filme sequenciamento
Quebrar em pedaços aleatórios ~2000pb (shotgun)
DNA genômico
Shotgun do genoma inteiro ou cDNA
Ligação do adaptador e
separação em fita simples
- O adaptador permite que o DNAse ligue em esferasminúsculas (diâmetro de 28µm). Apenas umDNA é ligado emcada esfera
- As esferas são envolvidos emgotas de óleo que contêmtodosos reagentes necessários para amplificar o DNA
- Cada gota contendoa esferaé mantida isolada para evitar- Cada gota contendoa esferaé mantida isolada para evitarcontaminação e consegue produzir 10 milhões de cópias numareação de pirosequenciamento
- Um pmol de DNAnuma reação de pirosequenciamento produz1011 moléculas de ATP gerando mais de 109 fótons, numcomprimento de onda de 560 nm, e numperíodo de 3-4segundos. Facilmente detectado por uma câmera de CCD
Nature 437 (2005), 326-327
Câmera de CCD
Computador
Bombeamento de fluídos
Câmara de fluxo contendo as amostras e as fibras ópticas(1,6 milhões/slide)
O sequenciador 454
Computador
Nature 437 (2005), 376-380
Pirograma
Linearidade é mantida até homopolímeros de 8 nt
Solexa sequencing
Solid sequencing
Projetos de ressequenciamento
http://www.scientificamerican.com/article.cfm?id=1000-genomes-project
FIMFIM
