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Date post: 02-Aug-2020
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DNAタイピング結果解析 SBT(Sanger,NGS)法 (Sequencing Based Typing) HLA研究所 ⼩島 裕⼈ HP掲載⽤
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DNAタイピング結果解析

SBT(Sanger,NGS)法(Sequencing Based Typing)

HLA研究所⼩島 裕⼈

HP掲載⽤

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NGS(Next Generation Sequencing) 2 施設Sanger法 6 施設

参加施設数

検査方法NGS

Sanger法

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Sanger法

NGS検査対象領域

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施設結果報告(Sanger法)

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施設結果報告(Sanger法)

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施設結果報告(NGS)

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施設結果報告(NGS)

※ NGS は2施設、別法のため評価せず。

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結果相違の原因(Sanger法)

1. Ambiguityの見落とし2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定3. Codon 86 のAmbiguity4. 表記ミス5. 第3区域のAmbiguity 判定ミス

1. 最新アリル抜け2. Forward, Reverse の片方で判定(領域の端)3. 新規アリル

【要改善】 → 必ず対策が必要

【要確認】 → できれば対策が必要

【その他】

1. 検査対象領域外のAmbiguity

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【要改善】 1. Ambiguityの見落とし

A*24:03 抜け

A*24:03, A*24:07 抜け

【対策】 ダブルチェックなど

H2901: A座

区別できない

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【要改善】 1. Ambiguityの見落とし

【対策】 ダブルチェックなど

H2903: C座

C*06:04 抜け

区別できない

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【要改善】 2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定

2施設(29D24, 29D61)で、挿入/欠失多型を区別できていなかった。

例) H2901の場合: C座, DQB1座

C*12:84N ・・・ C*12:02に対して1塩基挿入DQB1*03:197Q ・・・ DQB1*03:01 に対して6塩基欠失

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【要改善】 2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定

H2902, H2903, H2904 において区別できていない挿入/欠失多型は次のとおり。

H2902: A座, B座, C座, DQB1座

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【要改善】 2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定

H2903: A座, B座

H2904: A座, DRB1座

これらの施設は、解析ソフト「uTYPE」であったが、同じく「uTYPE」を用いている他の2施設では、挿入/欠失多型を区別できていた。 → 設定の問題?

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【対策】 2. 塩基配列の挿入/欠失多型の判定 (uTYPE)

0*が付いているときはその上でダブルクリックすると…

コメントがでてくる。確認後“はい”をクリックするとNull Alleleが候補から外れます。

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【要改善】 3. Codon 86 のAmbiguity

H2901 DRB1座

2施設(29D24, 29D61)で、Codon 86 のAmbiguity を区別できていなかった。

区別できる

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【要改善】 3. Codon 86 のAmbiguity H2904 DRB1座

Codon 86 primer を使用しているが、区別できていない。→ 解析ソフト設定の問題?

区別できる

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【対策】 3. Codon 86 のAmbiguity (uTYPE)

ここを選ぶとCodon86を適応した解析結果が表れる

Codon 86 primer 使用の場合は、Filter ボタンを押すことで反映される。

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Codon 86 プライマー: Codon 86 GTG相補的プライマー

H2902

GKK GGT

H2901

増幅しない。

Codon 67 Codon 86 Codon 86

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【補足】 Codon 86 Ambiguity の重要性について

なぜ、Ambiguityが起きるのか?

→ 遺伝子が似ている組み合わせを区別できない。

Allele 1Allele 2

Allele 3Allele 4

多型部分の判定結果

(Allele1 とAllele3)、(Allele2 とAllele4)の配列が似ている。

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同一抗原内アリル多型は、配列が類似している。

(日本人頻度0.1%以上のDR座アリルを対象)

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1アミノ酸(1コドン)が異なる組み合わせ

日本人頻度0.1%以上では、codon 86 が異なる組み合わせのみが、複数(4種類)存在する。

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Allele 1Allele 2

Allele 3Allele 4

多型部分の判定結果

Allele 1Allele 3

Allele 2Allele 4

1箇所のみが異なる組み合わせが、2種類以上

日本人頻度0.1%以上では、codon 86のみ

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【参考】 なぜ、codon 86 のみが異なる多型が多いか。

<HLA-ClassⅡ分子を上からみた図>

86番アミノ酸抗原ペプチド

86番目のアミノ酸位置は、T細胞認識に重要な部分であると考えられている。

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【要改善】 4. 表記ミス

H2901 B座

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【要改善】 4. 表記ミス

H2902 DPB1座

H2904 DPB1座

【対策】 ダブルチェックなど

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【要改善】 5. 第3区域のAmbiguity 判定ミス

H2901 DRB1座 (できれば区別)

H2903 DRB1座

区別できない!

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【要確認】 1. 最新アリル抜け

例) H2901の場合: DRB1座

(IMGT登録)バージョン 3.27, 2017/01/20

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【要確認】 1. 最新アリル抜け

H2902: A座, C座, DRB1座

H2902, H2903, H2904 における最新アリルは次のとおり。

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【要確認】 1. 最新アリル抜け

H2903: A座, DRB1座, DQB1座

(H2904: なし)

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【要確認】 2. Forward, Reverse の片方で判定(領域の端)

H2901 DRB1座

H2902 DRB1座

H2904 DRB1座

片方のプライマーからの情報では確定しない施設があった。

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【要確認】 3. 新規アリル

H2904 DQB1座

Sanger法では確定することは困難。場合によっては、クローニングや他法(SSP法、NGS)によって確認する必要もある。

※undefined (29D61)DQB1*05:03/06:01 493(C>T), DQB1*05:09/06:56 MM0(exon3 未登録) 補足

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補足 Exon 3 が未登録のアリル候補について(uTYPE)

H2904 DQ座Codon 133(変異部分)

Exon 3 未登録のアリルは、赤塗で表示され、候補に含まれる。

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【その他】 1. 検査対象領域外のAmbiguity

H2902 DRB1座

H2903 DPB1座

検査対象領域によって、Ambiguity が異なっていた。

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まとめ

NGSは、2施設でキットが異なり、施設間評価は

できなかった。

Sanger法は、各施設に技術的問題は考えられず、

判定時のミスに注意をする必要がある。他法よりも正確な

データが得られる一方で、多くの情報量を判断に用いるこ

とが多いため、ソフトウェアの使用方法やcodon 86 にみ

られるようなHLAの特徴を知っておくとよい。


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