SIMPLIFYING TOMOGRAPHIC DIFFRACTIVE MICROSCOPY L. Foucault, N. Verrier, and M. Debailleul, O. Haeberlé,

IRIMAS, Université de Haute-Alsace, 61 rue Albert Camus, 68093 Mulhouse Cedex, France

Keywords: Holography, Fourier Optics, Tomographic Diffractive Microscopy Tomographic diffractive microscopy (TDM), which is also known as phase tomography, synthetic aperture microscopy, … is a more and more mature technique, finding applications in cell biology (stem or cancerous cells studies, neurosciences, 3-D cell culture, cell-to-cell or cell-to-substrate interactions etc). Commercial implementations are even now available [1,2]. TDM allows for imaging unlabeled samples with improved resolution [3,4], measuring 3-D index of refraction distribution, a new contrast technique [5,6]. The technique is an extension of holographic microscopy [7], in which the illumination of the sample is controlled. Several views are recombined, to compute 3-D images. One can vary the illumination inclination [8], rotate the sample [9], or even combining both approaches, to deliver improved- and isotropic resolution images [10]. The technique has also been used in reflection mode [11,12]. Several ways exist to further improve the method: high-speed acquisitions [13] and reconstructions/display [14] is possible. Hyperspectral imaging can increase chemical sensitivity [15]. TDM can be combined with polarization imaging, allowing for birefringence detection [16]. Plenoptic TDM allows for “one-shot” data acquisitions [17]. We present a review of these progresses, including ours: mirror-assisted tomography [19] can be tuned to perform either transmission or reflection TDM with same setup [20]. Figure 1 presents results using this technique: a 6 µm latex bead is imaged with azimuthal-only illumination with our TDM system in reflection [11]. Using a transmission reconstruction method, the obtained image shows on Fig. 1(a) the bead and its reflection. With simple demodulation technique, using symmetry properties of the imaging process, a single bead is reconstructed (Fig 1(b)), with better index reconstruction (Fig. 1(c)). Wavefront sensors [21,22] could also be used to simplify the acquisitions, as shown Figure 1(d). We discuss advantages and drawbacks of these variants and extensions of TDM, and their possible combination, which would constitute an instrument able to replace conventional transmission microscopes in an “all-in-one” instrument.

l’aide des équations (1.10) de la partie 1.3, on en déduit l’égalité suivante :

I1 + I3 ⇤ I2 + I4 . (3.17)

Expérimentalement, cette équation ne peut jamais être vérifiée strictement, c’est pourquoi le critèred’erreur " la minimisant a été proposé par Simon [35] :

" ⇤ min8>><>>:’

pixels[(I1 + I3) � (I2 + I4)]2

9>>=>>;. (3.18)

À ce critère d’erreur correspond donc un incrément de tension �V optimal. Dans mon cas, cesaut de tension, ajusté avant chaque acquisition, est d’environ 65 V.

3.3.3 Premiers résultats avec un miroir d’or

Les acquisitions sont réalisées sur des billes de polystyrène de 5µm de diamètre et d’indice1,59, avec un miroir d’or et une épaisseur de polymère de 6µm. Les résultats des reconstructionsnon démodulée et démodulée sont présentés figures 3.21(a) et 3.21(b) respectivement.

(a) (b)

0 2 4 6 8 10 12

�0,04

�0,02

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

µm

diffé

renc

ed’

indi

ce

objetrépliquedémodregression

(c)

x

z

F����� 3.21 Bille reconstruite (a) avant démodulation et (b) après démodulation. (c) Profils respectifs. Barred’échelle : 5µm.

Notons premièrement l’effet miroir permettant de distinguer l’objet de sa réplique. En nousaidant des profils tracés figure 3.21(c), on remarque que la reconstruction permet une améliorationquantitative de l’indice de réfraction, se rapprochant de la valeur attendue de 0,08.

Afin de déterminer le diamètre de la bille après démodulation, j’ai appliqué une régressionpolynomiale d’ordre 4 via la méthode des moindres carrés à la courbe en tirets-pointillés bleus.Le critère choisi pour la mesure du diamètre de la bille est la largeur à mi-hauteur de la courbe(trait plein noir). J’obtiens un diamètre de 5,5µm, soit une erreur de 10 % par rapport à lavaleur attendue. À partir de ce diamètre mesuré, j’ai pu en déduire l’épaisseur de polymère : ladistance centre à centre mesurée séparant l’objet de sa réplique étant d’environ 14µm, j’obtiensune épaisseur de polymère d’environ 4,25µm. La différence d’épaisseur entre celle mesurée etcelle attendue peut provenir des variations d’épaisseur de surface lors de l’opération de dépôt

Tomographie assistée par miroir82

(a)

l’aide des équations (1.10) de la partie 1.3, on en déduit l’égalité suivante :

I1 + I3 ⇤ I2 + I4 . (3.17)

Expérimentalement, cette équation ne peut jamais être vérifiée strictement, c’est pourquoi le critèred’erreur " la minimisant a été proposé par Simon [35] :

" ⇤ min8>><>>:’

pixels[(I1 + I3) � (I2 + I4)]2

9>>=>>;. (3.18)

À ce critère d’erreur correspond donc un incrément de tension �V optimal. Dans mon cas, cesaut de tension, ajusté avant chaque acquisition, est d’environ 65 V.

3.3.3 Premiers résultats avec un miroir d’or

Les acquisitions sont réalisées sur des billes de polystyrène de 5µm de diamètre et d’indice1,59, avec un miroir d’or et une épaisseur de polymère de 6µm. Les résultats des reconstructionsnon démodulée et démodulée sont présentés figures 3.21(a) et 3.21(b) respectivement.

(a) (b)

0 2 4 6 8 10 12

�0,04

�0,02

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

µm

diffé

renc

ed’

indi

ce

objetrépliquedémodregression

(c)

x

z

F����� 3.21 Bille reconstruite (a) avant démodulation et (b) après démodulation. (c) Profils respectifs. Barred’échelle : 5µm.

Notons premièrement l’effet miroir permettant de distinguer l’objet de sa réplique. En nousaidant des profils tracés figure 3.21(c), on remarque que la reconstruction permet une améliorationquantitative de l’indice de réfraction, se rapprochant de la valeur attendue de 0,08.

Afin de déterminer le diamètre de la bille après démodulation, j’ai appliqué une régressionpolynomiale d’ordre 4 via la méthode des moindres carrés à la courbe en tirets-pointillés bleus.Le critère choisi pour la mesure du diamètre de la bille est la largeur à mi-hauteur de la courbe(trait plein noir). J’obtiens un diamètre de 5,5µm, soit une erreur de 10 % par rapport à lavaleur attendue. À partir de ce diamètre mesuré, j’ai pu en déduire l’épaisseur de polymère : ladistance centre à centre mesurée séparant l’objet de sa réplique étant d’environ 14µm, j’obtiensune épaisseur de polymère d’environ 4,25µm. La différence d’épaisseur entre celle mesurée etcelle attendue peut provenir des variations d’épaisseur de surface lors de l’opération de dépôt

Tomographie assistée par miroir82

(b)

8 Vol. 36, No. 11 / November 2019 / Journal of the Optical Society of America A Research Article

(a) (b) (c)

(d)

(e)

(g)(f) (h)

Fig. 7. Images obtained in a simplified mirror-assisted TDM. (a)–(c) using a reflection TDM system (here with full angular scanning) in conjunc-tion with special sample supports; direct reconstruction as in Fig. 5(b) makes transparent microscrystals appear twinned, but as observed in a trans-mission TDM system. (d)–(e) Illustration of the mirroring effect with a polystyrene bead illuminated at high incidence. (f ), (g) Bead reconstructionsassuming direct reconstruction (f ) as in Fig. 5(b), and with proper demodulation (g) correcting for the mirroring effect. (h) Reconstruction profiles ofthe index of refraction variations compared to the theoretical profile; black solid line: theoretical profile; blue narrow-dashed line: demodulated bead;green dotted line: direct view of the bead; red wide-dashed line: reflected view of the bead.

limited depth of field will make it impossible to precisely record527images of the sample and its reflection in the mirror. So, flatter528objects, such as those presented in Fig. 7, are preferred for accu-529rate reconstructions, at least when using simplest reconstruction530methods based on Born or Rytov approximations.531

These first results need to be confirmed for a larger class of532objects, and elaborating more advanced reconstruction methods533to reach better resolution and observe smaller structures, but do534validate the mirror-assisted TDM concept proposed by Mudry535et al. [25] as well as the simplified approach we propose for trans-536forming a reflection TDM into a more versatile instrument, by537preparing highly transparent, low-index-contrast samples on538special supports.539

5. CONCLUSION AND PERSPECTIVES540

We have studied a derivative of mirror-assisted tomography,541initially proposed by Mudry et al. [25]. For samples that exhibit542mainly forward scattering, one can therefore neglect backward-543scattered contributions, and in that case, a mirror-assisted544tomographic microscope simplifies into a dual-view transmis-545sion microscope. As a consequence, a TDM system built for546reflection microscopy can be used as a transmission TDM,547constituting a versatile system, capable of observing surfaces548of reflecting samples, as well as transparent samples. To do so,549

one has to use special sample supports, consisting of a reflective 550layer covered by a transparent layer to have the observed sample 551placed above the mirror, and not in contact with it [25]. 552

The first experimental results presented in this paper con- 553firm the validity of the approach. While working for very basic 554samples, the simplified demodulation method we propose here, 555taking benefit of the symmetries induced by the mirroring effect 556(and formally fully equivalent to the cosine transforms used in 557the seminal paper about mirror-assisted tomography by Mudry 558et al. [25]), are, however, to be improved for optimal image 559reconstructions. In particular, the image reconstruction process 560here assumes that a perfect mirror is used. In practice, for obtain- 561ing highest-resolution images, one has indeed to use short- 562wavelength illumination [3], for which reflective surfaces may 563not be anymore considered as perfect, as well as high numerical 564apertures, at detection but also at illumination [2,3], conditions 565inducing non-negligible polarization effects when reflection 566occurs. Also, appropriate denoising techniques, applied to 567acquired holograms before image reconstruction could relax 568constraints on some acquisition parameters, e.g., helping to 569diminish the number of required holograms, or to reach ulti- 570mate resolution theoretically allowed by optical parameters. 571Possibly, a co-conception approach to the whole system could be 572used, including both the very peculiar acquisition characteristics 573

(c)

(a) (b)

0 2 4 6 8 10 12 14

0

0.5

1

µm

indi

ce(u

.a.)

DHMMTD

yx

zx

abso

rptio

nin

dice

(c)

F����� 4.11 (a) Reconstruction holographique d’une bille de 8µm de diamètre. (b) Reconstruction en MTDavec rotation d’illumination. (c) Profils d’indice normalisé correspondant. Barre d’échelle :10µm.

dissymétrie, très visible dans le plan (x–z). Ceci peut provenir du recalage des spectres dû aubalayage d’illumination non centré, pouvant s’expliquer par le plan de détection de la caméra quin’est pas exactement perpendiculaire à l’axe optique. Il peut aussi provenir des approximationslors du recalage des spectres : l’analyseur de front d’onde étant autoréférencé, il m’a été impossiblede retrouver expérimentalement la position des spéculaires, et donc des portions de sphèred’Ewald correspondantes. Le seul moyen de repositionner les fréquences a été d’utiliser lestensions appliquées au miroir, calibré avant l’acquisition. Une solution possible à ce problèmeserait de déterminer cette position à l’aide d’une minimisation de critère par exemple [164].

Par ailleurs, ayant dû réaliser les acquisitions manuellement, j’ai choisi de limiter l’acquisition à32 angles d’illumination. Bien que les résultats montrent une reconstruction de meilleure qualité,le peu d’angles utilisés impliquent un mauvais remplissage de l’espace de Fourier, pouvantexpliquer la dissymétrie de l’absorption. Un approfondissement des méthodes d’acquisitionet de reconstruction est donc à envisager pour les travaux futurs, comme il a déjà été fait enréflexion [165].

4.3 Conclusion

Dans ce chapitre, j’ai introduit les principaux analyseurs de front d’onde existant, en mettanten avant leurs avantages et inconvénients. Dans le cas de l’analyseur à décalage multilatéral,l’avantage réside dans l’utilisation d’un réseau de Hartmann, associé à un masque de phase,

Application expérimentale98

(d) Figure 1: (a)-(c): 6 µm bead imaged with mirror-assisted tomography (from [20]). (d) Bead reconstruction using

1 (left) and 32 (right) acquisitions using a quadriwave lateral shearing interferometer instead of holography. [1] https://nanolive.ch/ [2] http://tomocube.com/ [3] Opt. Lett. 34, 79 (2009) [4] Nat. Photonics 7, 113 (2013) [5] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 13730 (2008) [6] Biomed. Opt. Express 6, 3865 (2015) [7] J. Mod. Opt. 57, 686 (2010) [8] J. Microsc. 205, 165 (2002) [9] Opt. Lett. 40, 1881 (2015) [10] Optica 4, 460 (2017) [11] Appl. Opt. 53, 748 (2014)

[12] J. Opt. Soc. Am. 30, 2133 (2013) [13] Opt. Lett. 36, 148 (2011) [14] Opt. Commun. 422, 28 (2018) [15] Phys. Rev. Appl. 10, 054041 (2018) [16] J. Opt. Soc. Am. A 32, 287–292 (2015) [17] Phys. Rev. Appl. 11, 014039 (2019) [18] Opt. Lett. 35, p. 1857 (2010) [19] J. Opt. Soc. Am. A 36, C18 (2019) [20] Opt. Lett. 37, p 1631 (2012) [21] Opt. Expr. 17, p. 13080 (2009) [22] http://phasicscorp.com