Spingere, tirare o …?

Come aumentare/modificare l’amido?

Brute force is no substitute for understanding

Rilevanza dell’amido* Cibo (wheat, rice, maize & potato) >109 t/yr

* Additivo in prodotti per consumo umano (farmaci…)

* Usi industriali: (cartaria, tessile, estrattiva …) 7x107 t/yr

* Etanolo…

The UK alone consumes approximately 880,000 tonnes of starch annually, 3/4 of which is eaten, while the rest is destined for industry. Starch and its derivatives are already widely employed in the manufacture of paper, textiles and adhesives, and due to their biodegradable and renewable nature they are increasingly being considered as an environmentally-friendly alternative to the use of synthetic additives in other products, including plastics, detergents, pharmaceutical tablets, pesticides, cosmetics, oil-drilling fluids…

http://www.andrewgray.com/essays/starch.htm

E’ amido purificato (separato dal resto)

Starch Technologyhttp://www.zuckerforschung.at/inhalt_en.php?titel=STARCH%20TECHNOLOGY&nav=nstaerkeinfo_en&con=cstaerkinfo_en

Very comprehensive website on starch technology, raw materials, properties, uses and extraction.

The largest users of starch in the EU (30 %) are the paper, cardboard and corrugating industries. Other important fields of starch application are textiles, cosmetics, pharmaceuticals, construction and paints. In the medium and long run starch will play an increasing role in the field of “renewable raw materials” for the production of biodegradable plastics, packaging material and moulds.

Uso dell’amido nell’industria cartaria:

Paper industry is one of the largest users of starch. Starch is, in fact, the third most prevalent raw material component in paper, only surpassed by cellulose fiber and mineral filler. Depending on the type of paper produced, starch content in the final products may be as high as 10% by paper weight. Starch used in paper manufacture is generally found in three application areas which are wet end internal sizing, surface sizing and coating. http://www.thaitapiocastarch.org/article17.asp In Germany alone the paper and adhesives industry require 500,000 tonnes of highly purified amylopectin each year. Then there is the textile industry too, which uses the starch to glaze threats prior to weaving. The food industry is also relevant.

http://www.zuckerforschung.at/fenster_en.php?img=images/cist_dia1_g_en.jpg

~70 Mt di amido nel 2010; una crescita annua del 4%

Branched polymer with linear streches with α(1→4) glycosidic bonds and branches with α(1→6) bonds every 24 to 30 glucose units. Contains 2,000 to 200,000 glucose units

Amylopectin

Large and highly branched

Starch is made of about 70% amylopectin and 30% amylose by weight (la proporzione dipende dalla coltura, varietà, stadio…)

Amylopectin is not soluble in water.

addensante (aumenta la viscosità)

Amylose is soluble in water, assumes a spyral shape in solution

Gelificante

Amylose starch is less readily digested than amylopectin (why?) dal punto di vista nutrizionale diluisce il carico da glucosio ed è interessante per i diabetici

Linear polymer, 300-3000 units

Amylose

Biogenesis of potato starch granuleshttp://www.agfdt.de/loads/st07/visseabb.pdf

è possibile ottenere amidi modificati per mezzo di mutanti spontanei o transgenici (alterando GBSS, SSI, I & III …).

http://www.jic.ac.uk/staff/trevor-wang/appgen/starch/mutatab.html

www.jic.ac.uk/staff/trevor-wang/appgen/starch/images/starchpath2.jpg

L’industria chiede sostanze arricchite (e.g. solo amilopectina).Purificabili con procedimenti industriali (costosi).

National Center for Genetic Engineering and Biotechnology Thailand

High Amylopectin High Amylose

http://en.wikipedia.org/wiki/Waxy_cornhttp://en.wikipedia.org/wiki/Amylomaize

Varietà con un contenuto di amilosio/amilopectina alterato esistono già per numerosi organismi:Waxy mutants (maize, rice, cassava, broad bean, pea, wheat, barley, potato…, even Chlamydomonas) present little or no amylose.

High amylopectin maize mutants

All’estremo opposto: Amylomaize: a unique corn starch with high (>50%) amylose. Similar mutants in cassava…

Waxy corn: 100 % amylopectin, normal corn 75 % amylopectin

http://www.freshplaza.it/news_detail.asp?id=30541

Introduzione delle patate OGM per uso industriale e nuovi scenari nei materiali ecologici A cura di Rossella Gigli

E' notizia recente che la BASF, in collaborazione con l'olandese AVEBE, sta lavorando allo sviluppo di patate geneticamente modificate al fine di produrre tuberi con livelli maggiori di amido, soprattutto nella tipologia molecolare dell'amilopectina. Queste patate, come la già autorizzata Amflora, aprono interessanti scenari nel settore degli impieghi non-food della fecola di patate.

ELENCO DEGLI USI (interessante)

Due pesi, due misure…

http://www.basf.com/group/corporate/en/innovations/research-verbund/research-projects/products/amflora

Amflora potato: starch consists almost solely of amylopectinOttenuta nel ‘94 tramite antisenso contro un’isoforma di GBSS. Prima applicazione del 1996

15 years to get approval in the EU…

Visser RG, Somhorst I, Kuipers GJ, Ruys NJ, Feenstra WJ, Jacobsen E. (1991) Inhibition of the expression of the gene for granule-bound starch synthase in potato by antisense constructs. Mol Gen Genet. 225:289-96.

B. Kull et al.: Genetic engineering of potato starch composition: inhibition of amylose biosynthesis in tubers from transgenic potato lines by expression of antisense sequences of the gene for granule-bound starch synthase. (1995) J. Genet. & Breed. 49: 69-76

http://www.gmo-compass.org/eng/gmo/db/16.docu.html

Proof of concept:

http://www.fraunhofer.de/en/press/research-news/2009/12/super-potato.jsp

“This fall (2009), 100 tonnes of the new super potato that exclusively produces amylopectin were harvested.”

Same phenotype, essentially same genotype (loss of function)…

Muth J, Hartje S, Twyman RM, Hofferbert HR, Tacke E, Prüfer D. (2008) Precision breeding for novel starch variants in potato. Plant Biotechnol J. 6:576-84.

Forse che queste non sono modificazioni genetiche?

Super-patata del Fraunhofer Inst.

Un esempio storico consiste nell’uso di una ADP-glucosio PPasi desensitizzata rispetto all’inibitore a feedback 3-PGA (Stark et al., 1992), ma questi risultati non hanno potuto essere riprodotti da un altro gruppo (usando un’altra varietà di patata).

Il sistema modello utilizzato è principalmente la patata.Esamineremo in dettaglio alcuni tentativi di modificazione del contenuto di amido.

Oltre alla composizione (amylose vs. amylopectin) è possibile modificare ed in particolare aumentare la quantità di amido?Diversi gruppi hanno provato ad alterare gli enzimi della via biosintetica. I risultati? Modesti, nel migliore dei casi, o non riproducibili

Ingegneria metabolica per aumentare l’amido

Schema della sintesi dell’amidoDa Kossmann e Lloyd (2000), ridisegnato

CYTOSOL

PLASTID

Suc

Suc

UDP-Glucose + Fructose

Glucose-1-Phosphate

Glucose-6-Phosphate G-6-P

G-1-P

ADP-Glucose

AmyloseAmylopectin

pol. lineare 1→4 pol. ramificato 1→4, 1 → 6

G6P è un passaggio obbligato in patata

Suc

Import

Suc6P

Pi

SPP

Gluc Fru

Inv

UDPSusy

UDP-Gluc

G1P

G6PF6P

ADP

PGI

Glycolysis

HK GK

ADP

CYTOSOL PLASTID

FK

PPi

UTP

UGPase

cPGM

UDP

SPS

G6P

G1P

pPGM

ADP-Gluc

ATP

PPi

AGPase

ADPStasy

starch

APOPLAST

Termodinamica

Geigenberger et al. (2004)

Esempio di manipolazione: patata che esprime l’invertasi e che è stata poi super-trasformata con la gluco-kinasi.

Transgeni ingegnerizzati allo stesso scopo (es. Sucrose Phosphorylase) mostrano fenotipi analoghi

1° approccio: spingere

La sintesi di amido è limitata dalla disponibilità di zuccheri o zuccheri fosfati?

Aumentiamo l’idrolisi del saccarosio (invertasi citosolica, saccarosio fosforilasi, …)

Aumentiamo la capacità di fosforilare gli zuccheri (GK)

Trethewey et al. (1998) Combined expression of glucokinase and invertase in potato tubers leads to a dramatic reduction in starch accumulation and a stimulation of glycolysis. Plant J 15: 109-118

Contenuto in carboidrati

The original aim of this work was to increase starch accumulation in potato tubers by enhancing their capacity to metabolise sucrose.

Invertasi Invertasi + Glucokinasi

Zuccheri fosforilati

Un grosso aumento delle concentrazioni, ma una riduzione nel flusso ad amido. L’omeostasi dei metaboliti, specialmente degli zuccheri fosforilati è andata a pallino...

Aumenta la glicolisi e la respirazione

Tuber-specific expression of a yeast invertase and a bacterial glucokinase in potato leads to an activation of glycolysis and a reduction of starch

Altri tentitivi con lo stesso scopo (aumentare gli zuccheri fosforilati):

- Saccarosio fosforilasi

- Xilosio isomerasi

- ...

Suc

Import

Suc6P

Pi

SPP

Gluc Fru

Inv

UDPSusy

UDP-Gluc

G1P

G6PF6P

ADP

PGI

Glycolysis

HK GK

ADP

CYTOSOL PLASTID

FK

PPi

UTP

UGPase

cPGM

UDP

SPS

G6P

G1P

pPGM

ADP-Gluc

ATP

PPi

AGPase

ADPStasy

starch

APOPLAST

Xylose Isomerase

Sucrose phosphor.

Suc + Pi G1P + F

I trasformanti possiedono l’attività enzimatica attesa

Sucrose phosphorylase

Trethewey et al. (2001) Expression of a bacterial sucrose phosphorylase in potato tubers results in a glucose-independent induction of glycolysis. Plant Cell Environ 24: 357-365.

Cosa provoca la SuPho?

Meno peso in patate e minor densità (cioè meno amido per pianta)

Riduzione del contenuto di amido e della resa in tuberi

Anche in questo caso aumenta la glicolisi e la

respirazione

È possibile calcolare la quantità di amido prodotta da ciascuna pianta (come moli di C6/g di tuberi)

La sovraespressione della Saccarosio fosforilasi comporta...

Altri metaboliti

I livelli degli altri enzimi

Aumenta la sintesi del saccarosio …

…ma anche la sua idrolisi.

Che relazione tra futile cycling e ATP demand?

Tuber-specific expression of a yeast invertase and a bacterial glucokinase in potato leads to an activation of sucrose phosphate synthase and the creation of a sucrose futile cycle

Fernie et al. (2002)

Sucrose(P) biosynthesis

UDP-glucose + D-fructose 6-phosphate    UDP + sucrose 6-phosphate

SPS activity is stimulated by an increase in 1) substrates (F6P and UDP-G), 2) allosteric activator (G6P) 3) a decrease in inhibitor (Pi) 4) activation of SnRK1 (stimulated by G6P)… [what about T6P?]In the transgenics all metabolites change in the direction of an activation of SPS.

SucSuc6PUDP-Gluc

UDP

Pi

SPP

F6P

SPS

+

++

ATP scende, ADP sale

2° approccio: tirare

TEORIA: sintesi di amido limitata dall’incorporazione di ADP-G (il “rate limiting step”!) da parte della ADP-G PPasi

Aumentiamo la quantità di ADP-G PPasi o diminuiamo la sensibilità all’inibitore a FeedBack

Risultati non esaltanti (un piccolo aumento nel flusso ad amido) o non riproducibili (nel caso di ADPG PPasi desensitizzata:

A 4–5-fold increase in activity of the enzyme, achieved by transformation with the Escherichia coli ADPglucose pyrophosphorylase gene glgC-16, had no detectable effect on the starch content of developing or mature tubers. No significant effects were found on the contents of ADPglucose, UDPglucose, glucose 1-phosphate, glucose 6-phosphate, PPi, ATP and ADP.

Ma allora chi controlla la sintesi di amido???

Una sintesi dell’analisi condotta su una decina di transgeni...

Geigenberger P, Stitt M, Fernie AR. (2004) Metabolic control analysis and regulation of the conversion of sucrose to starch in growing potato tubers. Plant, Cell and Environment 27:655–673.

Circa 30 papers!!!

MCA della sintesi dell’amido

Geigenberger et al. (2004)

La sintesi dell’amido ha un RLS!

• Si tratta dell’importo di ATP dal citosol al plastidio

• La quantità di trasportatore limita il flusso• CJ è intorno a 0.9• Serie di evidenze per il ruolo del metabolismo

degli adenilati nel regolare il flusso ad amido• Ci sono anche altre reazioni con un certo

controllo…

Valori del coefficiente di controllo del flusso ad amido

Tjaden et al. (1998)

Morphology and number of wt and transgenic tubers

wt as

(a) Wild-type, (b) antisense line 676

as sense

Notare che i tuberi antisenso mostrano una strana morfologia, con numerosi bitorzoli

(c) antisense line 654, and (d) sense line 62

(a) Wild-type, (b) antisense line 676, (c) antisense line 594, and (d) antisense line 654. Note the pronounced elongation and adventitious budding.

assense wt

CJ ≈ 1

ΔG≈0

Nothing is for free

Oxygen gradients within potato tubers expressing Invertase or Sucrose phosphorylase (analysed using a microelectrode)

Bologa et al (2003)

Growing tuber Stem

Expression of an ADH1-GUS reporter-gene in wt and transgenic tubers expressing invertase in the cytosol

WT

INV

Increasing ATP consumption makes the tuber dangerously anoxic

Bologa et al (2003) Plant Physiology 132:2058-2072.

Suc Phosphorylase

Wild typePercentages of label metabolized to starch

Nei tuberi SuPho la marcatura contribuisce meno all’amido (il resto viene respirato)

Phenotype of fully mature potato tubers constitutively expressingplastidial apyrase.

Riewe et al., (2008)

Apyrase: enzima che idrolizza ATP

Il sensore è plastidiale?

(il fenotipo è simile ai tuberi antisenso per il traslocatore e che quindi probabilmente consumano meno ATP e hanno più ossigeno disponibile...)

La sintesi di amido è limitata dal flusso di ATP

• Strategia sensata nell’economia cellulare perchè se molto troppo ATP viene impiegato per fare amido, la cellula risponde aumentando la respirazione

• Il tubero rischia di andare in ipossia/anossia con tutti i conseguenti pericoli

• Altri transgeni che aumentano il flusso ad amido, se esistono, potrebbero essere molto sensibili alle condizioni colturali (es. terreni fradici)

Sono stati pubblicati altri transgeni che sembrano aumentare il flusso ad amido...

Overexpressing SnRK

Production of high-starch, low-glucose potatoes through over-expression of the metabolic regulator SnRK1

McKibbins et al. Plant Biotechnol J. 2006 4:409-18

SnRK attiva la trascrizione e stimola l’attività di due enzimi della via dell’amido

MA: Antisense expression of SnRK1 in potato tubers does not result in a decrease in starch levels (Purcell et al., 1998).

http://forosdelavirgen.org/17444/la-opinion-de-cientificos-catolicos-sobre-los-transgenicos-en-agricultura-2010-12-28/

L’aumento di amido, in questo caso, sembra più wishful thinking che reale

Evidenze sperimentali che la sintesi di amido può essere limitata dal rifornimento di ATP

* La sovraespressione (o riduzione) del traslocatore plastidiale per ATP/ADP comporta un aumento (o una diminuzione) dell’accumulo di amido in maniera praticamente lineare.

* Incubando fettine di tubero con adenina, si aumenta il pool degli adenilati e anche la velocità di sintesi dell’amido.

ci sono altri enzimi che esercitano un’azione sul metabolismo degli adenilati?

3° approccio: luck!

Nessuna differenza fenotipica nella parte aerea…

Alterare la quantità di ATP a livello del plastidio manipolando l’adenilato kinasi plastidiale

Regierer et al. (2002)

…aumenta il pool degli adenilati

ATP aumenta

ADP aumenta

AMP aumenta

ADP-G aumenta (3-7x)

ATP/ADP scende

ec costante

e aumenta il contenuto in amido!

…con differenze nella quantità, peso e densità dei tuberi e anche nel contenuto di quegli aminoacidi che richiedono ATP

…no no-one licensed the ADK patent which is a great pity. Since it is reproducible. I would also have thought a company would have approached me about the Centeno Plant Cell paper this year but they did not. I am sure regulatory costs and public perception played there parts in both decisions. However, I have no evidence for either statement. (Fernie, pers. communic.)

Altro esempio

Centeno et al. (2011) Malate plays a crucial role in starch metabolism, ripening, and soluble solid content of tomato fruit and affects postharvest softening. Plant Cell 23:1162-184.

Articolo da leggere con attenzione (uno dei pochi)

Amflora

Visser RG, Somhorst I, Kuipers GJ, Ruys NJ, Feenstra WJ, Jacobsen E. (1991) Inhibition of the expression of the gene for granule-bound starch synthase in potato by antisense constructs. Mol Gen Genet. 225:289-96.B. Kull et al (1995) Genetic engineering of potato starch composition: inhibition of amylose biosynthesis in tubers from transgenic potato lines by expression of antisense sequences of the gene for granule-bound starch synthase. J. Genet. & Breed. 49: 69-76

Muth J, Hartje S, Twyman RM, Hofferbert HR, Tacke E, Prüfer D. (2008) Precision breeding for novel starch variants in potato. Plant Biotechnol J. 2008 Aug;6(6):576-84.

VIB report (molto ben fatto): http://www.vib.be/en/news/Documents/VIB%20Background%20report%20Amflora.pdf

Sintesi di amido1 Kossman & Lloyd Understanding and influencing starch biochemistry (2000) Crit. Rev. Plant Sci. 19:171-226

2 Geigenberger P, Stitt M, Fernie AR. (2004) Metabolic control analysis and regulation of the conversion of sucrose to starch in growing potato tubers. Plant, Cell and Environment 27:655–673.

3 Sweetlove et al. (1999) The contribution of adenosine 5 '-diphosphoglucose pyrophosphorylase to the control of starch synthesis in potato tubers Planta 209:330-337.

4 Trethewey et al., (1998) Induction of the activity of glycolytic enzymes correlates with enhanced hydrolysis of sucrose in the cytosol of transgenic potato tubers Plant Cell Environ. 22:71-79

5 Trethewey et al., (1999) Combined expression of GlucoKinase and invertase in potato tubers leads to a dramatic reduction in starch accumulation and a stimulation of Glycolysis Plant J. 15:109-118

6 Fernie et al. (2002) Altered metabolic fluxes result from shifts in metabolite levels in sucrose phosphorylase-expressing potato tubers. Plant, Cell & Environment, 25:1219-1232.

Continua....

7 Urbanczyk-Wochniak et al. (2003) Expression of a bacterial xylose isomerase in potato tubers results in an altered hexose composition and a consequent induction of metabolism. Plant Cell Physiol. 44:1359-67.

8 Tjaden J, Mohlmann T, Kampfenkel K, Henrichs G, Neuhaus HE (1998) Altered plastidic ATP/ADP-transporter activity influences potato (Solanum tuberosum L.) tuber morphology, yield and composition of tuber starch. Plant Journal 16: 531-540.

9 Loef et al. (2001) Increased levels of adenine nucleotides modify the interaction between starch synthesis and respiration when adenine is supplied to discs from growing potato tubers. Planta 212: 782-791.

10 Regierer et al. (2002) Starch content and yield increase as a result of altering adenylate pools in transgenic plants. Nat Biotechnol. 20:1256-60.

11 Oliver et al. (2008) Decreased expression of plastidial adenylate kinase in potato tubers results in an enhanced rate of respiration and a stimulation of starch synthesis that is attributable to post-translational redox-activation of ADP-glucose pyrophosphorylase. J Exp Bot. 2008

12 Riewe et al. (2008) Metabolic and developmental adaptations of growing potato tubers in response to specific manipulations of the adenylate energy status. Plant Physiol. 146:1579-98.

Sweetlove LJ, Burrell MM, ap Rees T. (1996) Starch metabolism in tubers of transgenic potato (Solanum tuberosum) with increased ADPglucose pyrophosphorylase. Biochem J. 320:493-8.

Lloyd JR, Springer F, Buléon A, Müller-Röber B, Willmitzer L, Kossmann J. (1999) The influence of alterations in ADP-glucose pyrophosphorylase activities on starch structure and composition in potato tubers. Planta. 209:230-238.

Bologa et al (2003) A Bypass of Sucrose Synthase Leads to Low Internal Oxygen and Impaired Metabolic Performance in Growing Potato Tubers. Plant Physiology 132:2058-2072.