Séquençage à Haut Débit

C.ROUMIER, Laboratoire d’Hématologie, CHRU LILLE, 

Inserm U837, IRCL

20,000-100,000 measurements per

experiment

44000 à >1,000,000 measurements per

experiment

60 Gigabases read per experiment

Glass slides(1998-2000)

Affymetrix, Nimblegen, Agilent, Illumina,… (1995-2005)

High Througput Sequencing: Roche, Illumina, Applied,…(2006-)

Bref Historique des technologies haut débits

Massively Parallel Throughput – not only GigaBasesMassively Parallel ThroughputMassively Parallel Throughput –– not only GigaBasesnot only GigaBases

50M

V1

100M

V2

160M

V3

Mappable tags

300M

V3.5

450M

V4

• SOLiD™ System technology 

• Technologie de séquençage massivement parallèle  • 300 millions de séquences "étiquetées" (tags) sur une seule 

lame avec la possibilité de lancer deux lames totalement indépendantes dans chaque run. 

• La taille des fragments lues : entre 35 et 50 bases, dans un format simple tag ou tags accouplés. 

• Exactitude de lecture est >99,94% • Chimie de séquençage : ligation des sondes et codage 

dinucléotidique .

Caractéristique de la technologie Solid Applied

SOLiD™ Workflow Overview

Application specificData Analysis

Application specificData Analysis

Emulsion PCR &

substrate preparation

Emulsion PCR &

substrate preparation

Imaging and Primary/Secondary

analysis 

Imaging and Primary/Secondary

analysis Sequencing chemistry

Sequencing chemistry

Application specificsample preparation

Application specificsample preparation

Methode Sanger dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs) : DNA chain terminators.

DNA primerDNA polymeraseRadioactively or fluorescently labeled nucleotide and  modified 

nucleotides that terminate DNA strand elongation. 4  Réactions de sequence en // : (dATP, dGTP, dCTP and dTTP),  DNA polymerase , un des dideoxynucleotides (ddATP, ddGTP, ddCTP, or ddTTP)  chain‐terminating nucleotide sans le groupe  groupe 3'‐OH requis pour la formation de laliaison  phosphodiester.

Rappel

Etapes chimie SOLID3

1 : Préparation d’une librairie ( fragment à séquencer)Fragmentation de l’acide nucléique

Chimie SOLID3

Séquençage par ligation

Préparation d’une population clonale de billes en émulsion

Chaque goutte de l’émulsion se comporte comme un microréacteur de PCR contenant des nucléotides, enzyme de réaction (polymeras.e PCR reaction) et des amorces .

Amplification du fragment initial lié a la bille .

Modification des extremités 3’ autorisant une future liaison covalente à une lame de verre

Dépot des billes sur une lame de verre  modifiée,liaison covalente extremité 3’ et verre

Dépot sur la lame, en 1, 2, 4 ou 8 segments

.Une amorce reconnait la séquence du primer P1 lié à la bille

Nature des oligos : 7 nucleotides (deux premiers spécifiques, 5 suivants non spécifiques

Competition pour la ligation entre ces diffrents oligos

Specificité de la sondedinucléortidique en interrogeant les deux premieres bases de la zone de ligation.

4 types d’oligonucléotides différents par leur fluorochrome de substitution.

5 cycles de ligations

Décalage du site d’initiation de la ligation par modification de l’amorce de séquence

Chaque base est lue deux fois

Codes flurochromes

AT

Première base  (position 0) connue car c’est la dernière du primer

Color space

Base space

SOLiD™ System technology features #12 Base Pair Encoding

Multiplexage :SOLiD™ System BarcodesFor Fragment Libraries 

P2*P1* Target DNA

Sequencing read(25 ‐ 50 bases)

BC read(5/10 bases)

10 colors – 104 barcodes5 colors – 16 barcodes

SOLiD™ System A massively parallel sequencing concept

Assemble

Sequence Analysis

Deep Sequencing(Somatic Mutations, Pools)

Whole GenomeRe‐sequencing

Targeted Re‐sequencing

de novo Sequencing

Use Tags to determine Sequence and structure of DNA

Reséquençage complet de génome entier.

• Un génome humain total peut être séquencé avec une profondeur de 20 xen deux runs sur ce système

•Profondeur 1X : couverture d’un génome haploïde 3 Milliards de bases(suffisante pour la détection de 95% des mutations hétérozygotes)

•Coût total de 32.000 Euro,

•International Cancer Genome Consortium :démembrer les variations et anomalies au niveau de l’ADN participant à la cancérogenèse.

Analyse des variations structurales du génome.

• CGH arrays limite ses investigations à la détection de variation du nombre de copie de gènes,

• la technologie de séquençage massivement parallèle autorise la détection :– des insertions,– des délétions, – des duplications, – des translocations réciproques ou ;non,– des inversions peri et paracentriques

SOLiD™ OneView – overview Whole Genome view

Individual Chromosome view

Multiple SOLiD Application data‐multiple human whole genome data

Summary across Applications

subgroup analysis showeda possible adverse effect on overall survival among patients with normal‐karyotype AML and wildtype NPM1, regardless of FLT3 status (Fig. 4 in the Supplementary Appendix).

CN

NPMWT ‐FLT3itd

SOLiD™ System A massively parallel sequencing concept

Assemble

Sequence Analysis

Deep Sequencing(Somatic Mutations, Pools)

Whole GenomeRe‐sequencing

Targeted Re‐sequencing

de novo Sequencing

Use Tags to determine Sequence and structure of DNA

Reséquençage ciblé.

• Developpement et l’amélioration des performances des nouvelles méthodologies d’enrichissement de cibles génomiques 

• PCR de longs fragments, • Méthodes d’hybridation sur oligo‐array • Capture en phase liquide• Targeted resequencing : régions connues, tailles de 30 Mbases, 

• Cibler des gènes candidats impliqués  dans la leucémogenèse• Coût modeste.

Target EnrichmentGenome partitioning, targeted re-sequencing, DNA capture…

Captures genomic material of interest for next generation sequencer (Illumina, SOLiD, 454 etc…)

Remaining genomic material discarded

– Addresses a major workflow bottleneck– Focus on a subset of the genome– Saves both time and money for downstream sequencing

Agilent’s SureSelect™

SureSelect Target Enrichment System*Developed in collaboration

with the Broad InstituteDr. Chad Nusbaum et al.

SureSelect DNA Capture Array

Developed in collaborationwith Cold Spring HarborDr. Greg Hannon et al.

Agilent 60mer Array

1-3 µg gDNA

1-5 µg gDNA(with WGA)

20 µg gDNA (unamplified)

0.5µg

Bait design may be optimized depending to the read length output of sequencer

• eArray currently restricts to 2x to 5x tiling for SE sequencing

March 11, 2010

120bp 6.6Mb

end-to-end

120bp 3.3Mb

2x-tiled

Probe design for DNA capture

Cibles: MSH2, MSH6 dans HNPCC

SOLiD™ System : reverse digital microarray

count

Tag Analysis

Small RNA Profiling

Whole Transcriptome Analysis“Gene Expression”

ChIP Seq (etc.)

Methylation Studies

CGH Seq / CNV

Meta‐Genomics

Count the Number of times Sequence Tags are found RNA‐chip

ChIP‐chip

CNV‐chip

MeDIP‐ CGH

RNA‐Seq

MeDIP‐Seq

ChIP‐Seq

CGH‐ Seq

•Applications quantitatives et qualitatives, Substituer ou venir compléter les technologies µarrays •Chacun des « tags » est un événement permettant de dénombrer la présence de chaquemolécule dans l’échantillon• Mesure quantitative et hautement sensible . •Chacune des étiquette est générée à partir de l’échantillon lui-même•Aucun biais de mesure comme ceux rencontrés sur une microarray

Human Proteome~500,000 ProteinsHuman Proteome~500,000 Proteins

Human Genome~25,000 Genes

Human Genome~25,000 Genes

protein modificationprotein modification

protein degradationprotein degradation

• Alternative splicing• Alternative 5’ start sites• Alternative 3’ end sites

• Alternative splicing• Alternative 5’ start sites• Alternative 3’ end sites

Ex 1 Ex 2 Ex 3 Ex 4

Microarray Probe

SAGE™ Tag

TaqMan™ Assays

SOLiD™ Systemreads

Alternative Splicing, Mutation Detection, Fusion Transcripts, Gene Expression

SOLiD RNA Applications Workflows 

Total RNA

polyA RNA

RNA Fragments 50‐

150 bp

SREK

P1 P2

Alignment to Reference

SOLiD Libraries w/ Barcodes

Ribominus

Small RNAs (mi, pi, etc.)

PolyA Purist

rRNA Depleted (incl. ncRNA + polyA RNA

RNA Fragmentation (RNaseIII)

1 Day

2 Days

BC

1 Day

Validation

R.J. Taft and J.S. Mattick, http://genomebiology.com/2003/5/1/P1

Complex fungi

Prokaryotes

Urochordate

Simple eukaryotes

Invertebrates

Plants

VertebratesVertebrates

Ciona (urochordate)

Invertebrates

Plants

Complex fungi (Neurospora)

Simple eukaryotes (yeasts, plasmodium, Dictyostelium)

Prokaryotes

The proportion of noncoding DNA broadly The proportion of noncoding DNA broadly increases with developmental complexityincreases with developmental complexity

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•• Multiplexing with up to 20 barcodes, fullMultiplexing with up to 20 barcodes, full--slide, SOLiD 3.5slide, SOLiD 3.5

•• Analysis with pipeline v0.5Analysis with pipeline v0.5

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55’’--PP 33’’--OHOH

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IAIA bcbc P2P2P1P1

41 bp41 bpSmall RNA Small RNA sequencesequence 48 bp48 bp

RNA sample + RNA sample + adaptorsadaptors

Ligation Ligation

Reverse Reverse transcriptiontranscription

Rnase HRnase H

PCRPCR

Page Page purificationpurificationMultiplex => CostMultiplex => Cost--effectiveeffective

Small RNA profiling by HTSSmall RNA profiling by HTS