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Statistical Methods for Quantitative MS-Based Proteomics ... › pda › assets ›...

Date post: 25-Jun-2020
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76
Statistical Methods for Quantitative MS-Based Proteomics: 1. Identification & False discovery rate Lieven Clement Proteomics Data Analysis Shortcourse statOmics, Krijgslaan 281 (S9), Gent, Belgium [email protected]
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Statistical Methods for Quantitative MS-BasedProteomics:

1. Identification & False discovery rate

Lieven Clement

Proteomics Data Analysis Shortcourse

statOmics, Krijgslaan 281 (S9), Gent, Belgium [email protected]

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Source:h*p://www.domes2ka.org/

statOmics, Ghent University [email protected] 2/15

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Challenges Background

Challenges in Label Free MS-based QuantitativeProteomics

sample proteins peptides HPLC ESI ion trap

MS MS2

Quantification Identification

statOmics, Ghent University [email protected] 3/15

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Challenges Background

Challenges in Label Free MS-based QuantitativeProteomics

sample proteins peptides HPLC ESI ion trap

MS MS2

Quantification Identification

statOmics, Ghent University [email protected] 3/15

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Identification

Identification

protein sequence database

in silicodigest

YSFVATAER

HETSINGK

MILQEESTVYYR

SEFASTPINK

peptide sequences

m/z

Int

m/z

Int

m/z

Intm/z

Intin silicoMS/MS

theoretical MS/MSspectra

experimental MS/MS spectrum

in silicomatching

1) YSFVATAER 342) YSFVSAIR 123) FFLIGGGGK 12

peptide scores

Peptide fragment fingerprinting (PFF)

(slide courtesy to Lennart Martens)

statOmics, Ghent University [email protected] 4/15

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Identification

E-valuesProbability that a random candidate peptide produces a higherscore that the observed PSM score.

protein sequence database

in silicodigest

YSFVATAER

HETSINGK

MILQEESTVYYR

SEFASTPINK

peptide sequences

m/z

Int

m/z

Int

m/z

Intm/z

Intin silicoMS/MS

theoretical MS/MSspectra

experimental MS/MS spectrum

in silicomatching

1) YSFVATAER 342) YSFVSAIR 123) FFLIGGGGK 12

peptide scores

Peptide fragment fingerprinting (PFF)

statOmics, Ghent University [email protected] 5/15

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Identification

E-valuesProbability that a random candidate peptide produces a higherscore that the observed PSM score.

OMSSA all PSM

E−value (%)

Fre

quen

cy

0 20 40 60 80 100

020

0040

0060

0080

0012

000

statOmics, Ghent University [email protected] 5/15

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Identification

E-valuesProbability that a random candidate peptide produces a higherscore that the observed PSM score.

E−values we expect for random candidate peptides

E−value (%)

Fre

quen

cy

0 20 40 60 80 100

020

040

060

080

0

statOmics, Ghent University [email protected] 5/15

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Identification

E-valuesProbability that a random candidate peptide produces a higherscore that the observed PSM score.

OMSSA decoy PSMs

E−value (%)

Fre

quen

cy

0 20 40 60 80 100

050

100

150

statOmics, Ghent University [email protected] 5/15

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Identification

E-valuesProbability that a random candidate peptide produces a higherscore that the observed PSM score.

MS−GF+ (all)

E−value

Fre

quen

cy

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

020

0060

0010

000

1400

0

statOmics, Ghent University [email protected] 5/15

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Identification

E-valuesProbability that a random candidate peptide produces a higherscore that the observed PSM score.

MSGF+ (all)

−log10(E−value)

Fre

quen

cy

0 10 20 30 40

020

040

060

080

010

00

statOmics, Ghent University [email protected] 5/15

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Identification

E-valuesProbability that a random candidate peptide produces a higherscore that the observed PSM score.

A bad hit is the random hit with the best score so it is alsobound to have a low E-value.

If we look at E-values for all PSMs they are only useful as ascore.

We should know the distribution of the maximum score ofrandom candidate peptides when we want to do the statistics.

statOmics, Ghent University [email protected] 5/15

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Identification

E-valuesProbability that a random candidate peptide produces a higherscore that the observed PSM score.

A bad hit is the random hit with the best score so it is alsobound to have a low E-value.

If we look at E-values for all PSMs they are only useful as ascore.

We should know the distribution of the maximum score ofrandom candidate peptides when we want to do the statistics.

statOmics, Ghent University [email protected] 5/15

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Identification

E-valuesProbability that a random candidate peptide produces a higherscore that the observed PSM score.

A bad hit is the random hit with the best score so it is alsobound to have a low E-value.

If we look at E-values for all PSMs they are only useful as ascore.

We should know the distribution of the maximum score ofrandom candidate peptides when we want to do the statistics.

statOmics, Ghent University [email protected] 5/15

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Identification

Table of Outcomes

Called Bad Called Correct

Bad hit TN FP m0

Correct hit FN TP m1

Total NR R m

TN: number of true negatives

FP: number of false positives

FN: number of false negatives

TP: number of true positives

NR: number of non-rejections, R: number of rejections

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Identification

Table of Outcomes

Called Bad Called Correct

Bad hit TN FP m0

UnobservableCorrect hit FN TP m1

Observable Total NR R m

FDP = FPFP+TP . But is unkown! (FDP: false discovery proportion)

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Identification

Table of Outcomes

Called Bad Called Correct

Bad hit TN FP m0

UnobservableCorrect hit FN TP m1

Observable Total NR R m

FDR = E[

FPFP+TP

]. (FDR: false discovery rate)

statOmics, Ghent University [email protected] 7/15

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Identification

Search engines return score that discriminates good frombad matches

Pyrococcus Search

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

050

010

0015

00

Score threshold t?

f (x) = π0f0(x) + (1− π0)f1(x)

FDR(t) = E[

FPFP+TP

]FDR(t) = m0P[x≥t|FP]

mP[x≥t]

= mP[FP]P[x≥t|FP]mP[x≥t]

FDR(t) = π0P0[x≥t]P[x≥t]

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Identification

Search engines return score that discriminates good frombad matches

Pyrococcus Search

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

050

010

0015

00

x ≥ t

Score threshold t?

f (x) = π0f0(x) + (1− π0)f1(x)

FDR(t) = E[

FPFP+TP

]FDR(t) = m0P[x≥t|FP]

mP[x≥t]

= mP[FP]P[x≥t|FP]mP[x≥t]

FDR(t) = π0P0[x≥t]P[x≥t]

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Identification

Search engines return score that discriminates good frombad matches

Pyrococcus Search

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

050

010

0015

00

x ≥ t

Score threshold t?

f (x) = π0f0(x) + (1− π0)f1(x)

FDR(t) = E[

FPFP+TP

]FDR(t) = m0P[x≥t|FP]

mP[x≥t]

= mP[FP]P[x≥t|FP]mP[x≥t]

FDR(t) = π0P0[x≥t]P[x≥t]

statOmics, Ghent University [email protected] 8/15

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Identification

Search engines return score that discriminates good frombad matches

Pyrococcus Search

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

050

010

0015

00

x ≥ t

Score threshold t?

f (x) = π0f0(x) + (1− π0)f1(x)

FDR(t) = E[

FPFP+TP

]

FDR(t) = m0P[x≥t|FP]mP[x≥t]

= mP[FP]P[x≥t|FP]mP[x≥t]

FDR(t) = π0P0[x≥t]P[x≥t]

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Identification

Search engines return score that discriminates good frombad matches

Pyrococcus Search

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

050

010

0015

00

x ≥ t

Score threshold t?

f (x) = π0f0(x) + (1− π0)f1(x)

FDR(t) = E[

FPFP+TP

]FDR(t) = m0P[x≥t|FP]

mP[x≥t]

= mP[FP]P[x≥t|FP]mP[x≥t]

FDR(t) = π0P0[x≥t]P[x≥t]

statOmics, Ghent University [email protected] 8/15

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Identification

Search engines return score that discriminates good frombad matches

Pyrococcus Search

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

050

010

0015

00

x ≥ t

Score threshold t?

f (x) = π0f0(x) + (1− π0)f1(x)

FDR(t) = E[

FPFP+TP

]FDR(t) = m0P[x≥t|FP]

mP[x≥t]

= mP[FP]P[x≥t|FP]mP[x≥t]

FDR(t) = π0P0[x≥t]P[x≥t]

statOmics, Ghent University [email protected] 8/15

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Identification

Search engines return score that discriminates good frombad matches

Pyrococcus Search

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

050

010

0015

00

x ≥ t

Score threshold t?

f (x) = π0f0(x) + (1− π0)f1(x)

FDR(t) = E[

FPFP+TP

]FDR(t) = m0P[x≥t|FP]

mP[x≥t]

= mP[FP]P[x≥t|FP]mP[x≥t]

FDR(t) = π0P0[x≥t]P[x≥t]

P.[x ≥ t] =

+∞∫x=t

f.(x)dx

statOmics, Ghent University [email protected] 8/15

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Identification

Search engines return score that discriminates good frombad matches

Pyrococcus Search

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

050

010

0015

00

x ≥ t

Score threshold t?

f (x) = π0f0(x) + (1− π0)f1(x)

FDR(t) = E[

FPFP+TP

]FDR(t) = m0P[x≥t|FP]

mP[x≥t]

= mP[FP]P[x≥t|FP]mP[x≥t]

FDR(t) = π0P0[x≥t]P[x≥t]

FDR is a set property: FDR(t) =π0

+∞∫x=t

f0(x)dx

+∞∫x=t

f (x)dx

statOmics, Ghent University [email protected] 8/15

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Identification

Search engines return score that discriminates good frombad matches

Pyrococcus Search

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

050

010

0015

00

x ≥ t

Score threshold t?

f (x) = π0f0(x) + (1− π0)f1(x)

FDR(t) = E[

FPFP+TP

]FDR(t) = m0P[x≥t|FP]

mP[x≥t]

= mP[FP]P[x≥t|FP]mP[x≥t]

FDR(t) = π0P0[x≥t]P[x≥t]

local fdr (posterior error probability, PEP): fdr(x) = π0f0(x)f (x)

Probability that an individual PSM is a bad hit.

statOmics, Ghent University [email protected] 8/15

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Identification

How to estimate FDR?

Pyrococcus Search

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

050

010

0015

00

x ≥ t

FDR(t) = E[

FPFP+TP

]= π0P0[x≥t]

P[x≥t]

P.[x ≥ t] =∞∫tf.(x)dx

P[x ≥ t] =#x ≥ t

m⇒ FDR(t) =

π0P0[x ≥ t]#x≥tm

How to characterize f0(t) and π0 in proteomics?

statOmics, Ghent University [email protected] 9/15

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Identification

How to estimate FDR?

Pyrococcus Search

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

050

010

0015

00

x ≥ t

FDR(t) = E[

FPFP+TP

]= π0P0[x≥t]

P[x≥t]

P.[x ≥ t] =∞∫tf.(x)dx

P[x ≥ t] =#x ≥ t

m⇒ FDR(t) =

π0P0[x ≥ t]#x≥tm

How to characterize f0(t) and π0 in proteomics?

statOmics, Ghent University [email protected] 9/15

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Identification

How to estimate FDR?

Pyrococcus Search

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

050

010

0015

00

x ≥ t

FDR(t) = E[

FPFP+TP

]= π0P0[x≥t]

P[x≥t]

P.[x ≥ t] =∞∫tf.(x)dx

P[x ≥ t] =#x ≥ t

m⇒ FDR(t) =

π0P0[x ≥ t]#x≥tm

How to characterize f0(t) and π0 in proteomics?

statOmics, Ghent University [email protected] 9/15

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Identification

Target-Decoy approach to establish null distribution

Decoys

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

010

020

030

040

050

060

0

Search against decoydatabase to generaterepresentative bad hits

Reversed databases arepopular

Concatenated search

Assumption: bad hits hasequal probability to map ontarget and decoy

π0 =#decoys

#targets

Score cuttoff:FDR(x) = E

[FP

FP+TP

]

statOmics, Ghent University [email protected] 10/15

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Identification

Target-Decoy approach to establish null distribution

Pyrococcus Search

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

020

040

060

080

010

00

Search against decoydatabase to generaterepresentative bad hits

Reversed databases arepopular

Concatenated search

Assumption: bad hits hasequal probability to map ontarget and decoy

π0 =#decoys

#targets

Score cuttoff:FDR(x) = E

[FP

FP+TP

]

statOmics, Ghent University [email protected] 10/15

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Identification

Target-Decoy approach to establish null distribution

Pyrococcus Concatenated Search: Targets

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

020

040

060

080

010

00

Search against decoydatabase to generaterepresentative bad hits

Reversed databases arepopular

Concatenated search

Assumption: bad hits hasequal probability to map ontarget and decoy

π0 =#decoys

#targets

Score cuttoff:FDR(x) = E

[FP

FP+TP

]

statOmics, Ghent University [email protected] 10/15

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Identification

Target-Decoy approach to establish null distribution

Pyrococcus Concatenated Search: Targets

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

020

040

060

080

010

00 Targetf0(x): Decoyf1(x)

Search against decoydatabase to generaterepresentative bad hits

Reversed databases arepopular

Concatenated search

Assumption: bad hits hasequal probability to map ontarget and decoy

π0 =#decoys

#targets

Score cuttoff:FDR(x) = E

[FP

FP+TP

]

statOmics, Ghent University [email protected] 10/15

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Identification

Target-Decoy approach to establish null distribution

Pyrococcus Concatenated Search: Targets

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

020

040

060

080

010

00 Targetf0(x): Decoyf1(x)

Search against decoydatabase to generaterepresentative bad hits

Reversed databases arepopular

Concatenated search

Assumption: bad hits hasequal probability to map ontarget and decoy

π0 =#decoys

#targets

Score cuttoff:FDR(x) = E

[FP

FP+TP

]statOmics, Ghent University [email protected] 10/15

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Identification

Target-Decoy approach to establish null distribution

Pyrococcus Concatenated Search: Targets

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

020

040

060

080

010

00 Targetf0(x): Decoyf1(x)

Competitive Target - decoy:

FDR(x) =#decoys|X ≥ x

#targets|X ≥ x

statOmics, Ghent University [email protected] 10/15

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Identification

Target-Decoy approach to establish null distribution

Pyrococcus Concatenated Search: Targets

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

020

040

060

080

010

00 Targetf0(x): Decoyf1(x)

Competitive Target - decoy:

FDR(x) =#decoys|X ≥ x

#targets|X ≥ x

FDR(x) =#decoys

#targets

#decoys|X≥x#decoys

#targets|X≥x#targets

FDR(x) = π0

+∞∫t

f0(x)dx

+∞∫t

f (x)dx

FDR(x) = π0P0[X ≥ x ]

P[X ≥ x ]statOmics, Ghent University [email protected] 10/15

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Identification

Target-Decoy approach to establish null distribution

0 20 40 60 80

MSGF+ Score

FD

R

0.00

0.05

0.10

0.15 FDR=0.01

Competitive Target - decoy:

FDR(x) =#decoys|X ≥ x

#targets|X ≥ x

FDR(x) =#decoys

#targets

#decoys|X≥x#decoys

#targets|X≥x#targets

FDR(x) = π0

+∞∫t

f0(x)dx

+∞∫t

f (x)dx

FDR(x) = π0P0[X ≥ x ]

P[X ≥ x ]statOmics, Ghent University [email protected] 10/15

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Identification

Target-Decoy approach to establish null distribution

Pyrococcus Concatenated Search: Targets 11160 PSMs at FDR 0.01

MS−GF+ Score

# pe

ptid

es

0 20 40 60 80

020

040

060

080

010

00 Targetf0(x): Decoyf1(x)

Competitive Target - decoy:

FDR(x) =#decoys|X ≥ x

#targets|X ≥ x

FDR(x) =#decoys

#targets

#decoys|X≥x#decoys

#targets|X≥x#targets

FDR(x) = π0

+∞∫t

f0(x)dx

+∞∫t

f (x)dx

FDR(x) = π0P0[X ≥ x ]

P[X ≥ x ]statOmics, Ghent University [email protected] 10/15

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Identification

Assess TDA assumptions

We have to evaluate that

The decoys are good simulations of the bad target hits:compare distributions FD(x) with F (x)

FD(x) =

t∫−∞

fD(x)dx ↔ F (x) =

t∫−∞

f (x)dx

π0 = #decoys#targets is a good estimator for π0.

We will use Probability-Probability-plots (PP-plot) for thispurpose.

statOmics, Ghent University [email protected] 11/15

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Identification

To make PP-plots we need estimates for FD(x) and F (x).

The empirical cumulative distribution (ECDF) is used for thatpurpose

-6 -4 -2 0 2 4 6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

z

F(z)

FD(x) =#decoys|X ≤ x

#decoys, F (x) =

#targets|X ≤ x

#targets

statOmics, Ghent University [email protected] 12/15

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Identification

PP-plot

PP-plots have the property that they show a straight 45 degree linethrough the origin if and only if both distributions are equivalent.

Normal sd=1

y1

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

020

4060

Normal sd=1

y2

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

010

30

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0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

P−P plot

ECDF Normal sd=1

EC

DF

Nor

mal

sd=

1

statOmics, Ghent University [email protected] 13/15

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Identification

PP-plot

PP-plots have the property that they show a straight 45 degree linethrough the origin if and only if both distributions are equivalent.

Normal sd=1

y1

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

020

4060

Normal sd=1

y2

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

010

30

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0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

P−P plot

ECDF Normal sd=1

EC

DF

Nor

mal

sd=

1

statOmics, Ghent University [email protected] 13/15

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Identification

PP-plot

PP-plots have the property that they show a straight 45 degree linethrough the origin if and only if both distributions are equivalent.

Normal sd=1

y1

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

020

4060

Normal sd=1

y2

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

010

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0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

P−P plot

ECDF Normal sd=1

EC

DF

Nor

mal

sd=

1●

statOmics, Ghent University [email protected] 13/15

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Identification

PP-plot

PP-plots have the property that they show a straight 45 degree linethrough the origin if and only if both distributions are equivalent.

Normal sd=1

y1

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

020

4060

Normal sd=1

y2

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

010

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0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.0

0.2

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P−P plot

ECDF Normal sd=1

EC

DF

Nor

mal

sd=

1●

statOmics, Ghent University [email protected] 13/15

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Identification

PP-plot

PP-plots have the property that they show a straight 45 degree linethrough the origin if and only if both distributions are equivalent.

Normal sd=1

y1

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

020

4060

Normal sd=1

y2

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

010

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P−P plot

ECDF Normal sd=1

EC

DF

Nor

mal

sd=

1

statOmics, Ghent University [email protected] 13/15

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Identification

PP-plot

PP-plots have the property that they show a straight 45 degree linethrough the origin if and only if both distributions are equivalent.

Normal sd=1

y1

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

020

4060

Normal sd=1

y2

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

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P−P plot

ECDF Normal sd=1

EC

DF

Nor

mal

sd=

1

statOmics, Ghent University [email protected] 13/15

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Identification

PP-plot

PP-plots have the property that they show a straight 45 degree linethrough the origin if and only if both distributions are equivalent.

Normal sd=1

y1

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

020

4060

Normal sd=1

y2

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

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0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.0

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1.0

P−P plot

ECDF Normal sd=1

EC

DF

Nor

mal

sd=

1

statOmics, Ghent University [email protected] 13/15

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Identification

PP-plot

PP-plots have the property that they show a straight 45 degree linethrough the origin if and only if both distributions are equivalent.

Normal sd=1

y1

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

020

4060

Normal sd=1

y2

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

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P−P plot

ECDF Normal sd=1

EC

DF

Nor

mal

sd=

1

statOmics, Ghent University [email protected] 13/15

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Identification

PP-plot

PP-plots have the property that they show a straight 45 degree linethrough the origin if and only if both distributions are equivalent.

Normal sd=1

y1

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

020

4060

Normal sd=1

y2

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

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P−P plot

ECDF Normal sd=1

EC

DF

Nor

mal

sd=

1

statOmics, Ghent University [email protected] 13/15

Page 50: Statistical Methods for Quantitative MS-Based Proteomics ... › pda › assets › 1_Identification_Evaluation... · H[SHULPHQWDO06 06VSHFWUXP LQVLOLFR PDWFKLQJ

Identification

PP-plot

PP-plots have the property that they show a straight 45 degree linethrough the origin if and only if both distributions are equivalent.

Normal sd=1

y1

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

020

4060

Normal sd=1

y2

Fre

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−4 −2 0 2 4

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P−P plot

ECDF Normal sd=1

EC

DF

Nor

mal

sd=

1

statOmics, Ghent University [email protected] 13/15

Page 51: Statistical Methods for Quantitative MS-Based Proteomics ... › pda › assets › 1_Identification_Evaluation... · H[SHULPHQWDO06 06VSHFWUXP LQVLOLFR PDWFKLQJ

Identification

PP-plot

PP-plots have the property that they show a straight 45 degree linethrough the origin if and only if both distributions are equivalent.

Normal sd=1

y1

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

020

4060

Normal sd=1

y2

Fre

quen

cy

−4 −2 0 2 4

010

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1.0

P−P plot

ECDF Normal sd=1

EC

DF

Nor

mal

sd=

1

statOmics, Ghent University [email protected] 13/15

Page 52: Statistical Methods for Quantitative MS-Based Proteomics ... › pda › assets › 1_Identification_Evaluation... · H[SHULPHQWDO06 06VSHFWUXP LQVLOLFR PDWFKLQJ

Identification

PP-plot

Normal sd=1

y1

Fre

quen

cy

−6 −4 −2 0 2 4 6

020

4060

Normal sd=2

y2

Fre

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cy

−6 −4 −2 0 2 4 6

05

1525

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P−P plot

ECDF Normal sd=1

EC

DF

Nor

mal

sd=

2

statOmics, Ghent University [email protected] 14/15

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Identification

PP-plot

Normal sd=1

y1

Fre

quen

cy

−6 −4 −2 0 2 4 6

020

4060

Normal sd=2

y2

Fre

quen

cy

−6 −4 −2 0 2 4 6

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statOmics, Ghent University [email protected] 14/15

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Identification

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Identification

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Identification

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Identification

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Identification

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Identification

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Identification

PP-plot: pyrococcus

Pyrococcus MSGF+

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