http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Medical Fluorescence Imaging ­ 

Tutorial 

Stefan Andersson­Engels stefan.andersson­engels@fysik.lth.se 

BRIGHTER Berlin, 26 June 2009

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Aim with the presentation 

Motivate – the use of in vivo fluorescence imaging for: 

• Early cancer diagnostics •  Identification of tumour boundaries • Assessment of blood vessels • Visualisation of lymph vessels • Treatment response assessments 

– the use of laser parameters necessary: • Average power required • Pulsed mode • Robustness, compactness and user friendlyness

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Clinical use of fluorescence imaging 

White­light image (A1)  5­ALA­induced PPIX fluorescence image (A2) 

of a patient with squamous cell carcinoma. 

Hautmann et al. Respir. Res., 8 (2007) 

Fluorescence angiography 

Fluorescein angiographic features before and after PDT for choroidal neovascularization (CNV)  Hikichi et al., RETINA 21 (2001) 

In­vivo kinetics of inhaled ALA­Induced PpIX fluorescence in bronchial tissue 

Stummer et al. Lancet Oncol. (2006) 

Fluorescence­guided resection of malignant gliomas

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Fluorescence detection of malignancies in the urinary bladder 

The Storz D­Light system M. Kriegmair et al. Munich

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Fibre endoscope 

Coherent fibre bundle

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Cross­section of the distal end 

Guided light fibre bundle 

Biopsy channel 

Guided light fibre bundle 

Air/fluid channel 

Image channel

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Endoscopical PDT – in combination with fluorescence detection 

Vocal fold carcinoma in situ

ENT­Department with Dr. Roland Rydell Lund University Hospital

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

The diagnosis 

White­light mode  Fluorescence video mode 

Imaging using the Storz D­light system for larynx diagnostics 

Rydell et al. Head & Neck (2008), Rydell et al (unpublished) 

Important developments: Multispectral analysis Simultaneous white light and fluorescence

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Typical fluorescence spectra 

500  600 

Intensity 

400  700nm 

Normal Malignant

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Multivariate analysis 

X  =  t 1  t 2 

p 1  p 2 E +  + 

Model 

Principal components Residual 

Decomposition: 

Partial Least Squares (PLS): Principal components chosen for best correlation with y­variable (histopathology)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Diagnostic potential 

Hyperplasia & Metaplasia  Low grade dysplasia & High grade dysplasia 

Predicted y value 

True pos. (25) 

True neg. (19)  False neg. (3) 

False pos. (4) 

• 89% sens., 83% spec. 

To be useful for diagnostic purpose separation is often required on individual point basis

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Biological applications of in vivo fluorescence imaging 

•  Animal models widely used in biomedical research •  More than 90% of animals used are mice •  Non­invasive imaging studies very valuable tool •  Allow non­invasive longitudinal and dynamic studies 

GFP Mouse 

Hoffman and Yang Nature Protocols (2006) 

Sharma et al. Am. J. Physiol. (2007)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Osamu Shimomura Marine Biological Laboratory (MBL), MA and Boston University Medical School, MA 

Martin Chalfie Columbia University, N.Y. 

Roger Y. Tsien UCSD, La Jolla, CA Japanese citizen, born 1928 in Kyoto, 

Japan. Ph.D. in organic chemistry 1960, from Nagoya University, Japan. Professor emeritus at Marine Biological Laboratory (MBL), Woods Hole, MA, USA a nd Boston University Medical School, MA, USA. 

US citizen, born 1947, grew up in Chicago, IL, USA. Ph.D. 1977 in neurobiology from Harvard University. William R. Kenan, Jr. Professor of Biological Sciences at Columbia University, New York, NY, USA, since 1982. 

US citizen, born 1952 in New York, NY, USA. Ph.D. in physiology 1977 from Cambridge University, UK. Professor at University of California, San Diego, La Jolla, CA, USA since, 1989. 

2008 Nobel Prize in Chemistry for the discovery and development of the 

green fluorescent protein, GFP

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Green Fluorescence Protein ­ GFP 

Aequorea victoria – a jellyfish in the Northern Pacific Ocean 

What is GFP? A small naturally occuring protein which is highly fluorescent. GFP consists of 238 amino acids, linked together in a long chain. This chain folds up into the shape of a beer can. Inside the beer can structure  the amino acids 65, 66 and 67  form  the chemical group that absorbs UV and blue light, and fluoresces green. 

http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP­ww/GFP­1.htm

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Fluorescence protein labeling in biology 

Baby mice fathered by mice receiving a donation of spermatogonial stem cells from mice expressing green fluorescent protein. Only half the baby mice show the green color. This is because each spermatogonial stem cell has only one copy of the gene for green fluorescent protein. When the spermatogonial cell divides, only half the cells that result from it have the gene for green fluorescent protein. 

http://www.nichd.nih.gov/news/releases/green_brown_mice.cfm

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics Fluorescence Proteins in all colours – Roger Y. Tsien 

Agar Plate of Fluorescent Bacteria Colonies 

Using DNA technology, various amino acids in different parts of GFP were exchanged 

http://www.tsienlab.ucsd.edu

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

What is fluorescence? 

Molecular  energy 

Absorption of light 

Fluorescence emission

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Fluorescence induced by exposure to ultraviolet light in vials containing various sized Cadmium selenide (CdSe) quantum dots. This is a file from the Wikimedia Commons, http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Fluorescent minerals. This is a file from the Wikimedia Commons, http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Fluorescence 

J. Johansson, Dissertation thesis, LTH (1993). af Klinteberg et al. (1999) 

337 nm excitation 

400  500  600  700 

Carotene NADH Elastin 

Collagen 

Wavelength  (nm) 

Fluo

rescen

ce in

tens

ity [a

.u.] 

Tissue autofluorescence 

405 nm excitation 

500  550  600  650  700  750 Wavelength (nm) 

Protoporphyrin IX 

Protoporphyrin IX

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

ALA 

Haem 

Iron 

Tumour 

635 nm 

Red laser 

Fluorescence diagnostics of skin tumour following ALA administration 

1. Administration of ALA 

2. Production of PpIX 

3. Diagnostics 

4. Treatment 

Blue laser Protoporfyrin IX

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Haematoporphyrin derivative (HpD), (Photofrin)  630 nm δ­aminolevulinic acid (ALA)  635 nm Mesotetrahydroxyphenychlorin (mTHPC), (Foscan)  652 nm Tin Etiopurpurin (Pyrlytin)  660 nm Benzoporphyrin, (Verteporfin)  690 nm 

720 nm Phthalocyanins Lutetium texaphyrin (Lutrin)  732 nm Bacteriochlorophyll (Tookad)  760 nm 

Tumour localising agents 

RED Absorption 

Peak 

Photosensitisers (PDT) Fluorescent tumour markers (LIF)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 23

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Background light interference 

Without funnel  With funnel 

Haj­Hossini et al. unpublished (2009)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Skin measurements 

Non­treated  ALA­treated 

Haj­Hossini et al. unpublished (2009)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Ambient light shielding

Rigid metal tube 

Non­ transparent plastic funnel 

Haj­Hossini et al. unpublished (2009)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Brain measurement 

Healthy tissue  GBM 

Richter et al. Unpublished (2009)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Astrocytoma PpIX fluorescence 

5 mm 

­2000 

­1000 

0 

1000 

2000 

3000 

4000 

5000 

6000 

7000 

440  490  540  590  640  690 

15 mm 

0 

20000 

40000 

60000 

80000 

100000 

120000 

140000 

440  490  540  590  640  690 

35 mm 

0 

5000 

10000 

15000 

20000 

25000 

30000 

440  490  540  590  640  690 

5 mm 

0 

10000 

20000 

30000 

40000 

50000 

60000 

70000 

400  450  500  550  600  650  700 

15 mm 

0 

20000 

40000 

60000 

80000 

100000 

120000 

400  450  500  550  600  650  700 

35 mm 

0 

10000 

20000 

30000 

40000 

50000 

60000 

70000 

80000 

90000 

400  450  500  550  600  650  700 

Autofluorescence 

Pålsson et al. unpublished (2009)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

MR and fluorescence spectra 

400  450  500  550  600  650  700  750 

0.5 

1 

1.5 

2 

2.5 

3 

3.5  x 10 5 

­40 mm Normal ­35 mm Normal ­30 mm Normal ­25 mm Normal ­20 mm Normal ­15 mm Oedema ­10 mm Glioblastoma IV ­5 mm Glioblastoma IV Target Glioblastoma IV 

400  450  500  550  600  650  700  750  800 

0.5 

1 

1.5 

2 

2.5 

3 

3.5 

4  x 10 5 

337 nm excitation 

Wavelength (nm) 

Wavelength (nm) 

Fluorescence Intensity 

Fluorescence Intensity 

405 nm excitation 

­40 mm Normal ­35 mm Normal ­30 mm Normal ­25 mm Normal ­20 mm Normal ­15 mm Oedema ­10 mm Glioblastoma IV ­5 mm Glioblastoma IV Target Glioblastoma IV 

a.  b. 

c. 

Pålsson et al. unpublished (2009)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Point monitoring: Whole spectrum in one small tissue site 

Imaging: Less spectral information but in larger area 

Fluorescence diagnostics

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

400  450  500  550  600  650  700  750 

Fluorescence specrum 

Fitted curve 

PpIX peak 

A  Autofluorescence 

B 

Ratio = A 

B 

Wavelength (nm) 

Intensity

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Dermatological Multicolour Fluorescence imaging 

Intensified CCD camera 

White­light CCD camera 

G R 

B 

Beam splitter 

Laser 

Lens 

Optical fiber 

0 

1 

2 

3 

4 

5 

450  500  550  600  650  700  750 

Fluorescence Intensity (a.u.) 

Wavelength (nm) 

D 

A 

8 

0 

4 

1 2 3 

5 6 7 

TAE 

TAE 

nBCC 

nBCC 

sBCC

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

White light image 

Digitally processed image 

Multicolour Fluorescence Imaging

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Spectraphos multispectral fluorescence imaging system 

Svanberg et al. Acta Radiol (1998)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Multicolour fluorescence imaging 

470 nm  630 nm 

600 nm  Ratio 

Rodent brain fluorescence following i.v. administration of ALA 

Andersson­Engels et al. Bioimaging (1995) Andersson­Engels et al. Appl Opt (1992)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Hyper Spectral Diagnostic Imager 

Science & Technology Inc, USA 

Combines: • video image • reflectance scan • fluorescence scan 

Aim: • interactive diagnostics • integrated colposcope

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Halo naevus 

16 year old male Located at left waist 

520 nm

/ 500 

nm

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Pigmentented BC or malignant melanoma 

83 years old female located next to the eye went for surgery 

470 nm

 / 570 nm

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

X­Ray source 

Image plate 

Rotation 

Object 

Rotation 

Object 

Light source  Detector 

Detector 

Detector 

Detector 

Linear image reconstruction  Non­linear image reconstruction 

Diffuse Optical Tomography

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Absorption and scattering

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Absorption spectra of important tissue chromophores

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Rotation 

Object 

Light source  Detector 

Detector 

Detector 

Detector 

Fluorescence­mediated tomography

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Instrumentation from Lund Medical Laser Centre on its way to National Technical University in Athens 

Collaboration with BioLitec, Bonn, Germany

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Joint WP6 campaign Instrumentation •405nm laser, developed at Risö •Additional LEDs •EMCCD camera •Liquid Crystal Tunable Filter 

During the last period we have spent much  effort in evaluating the fluorescence imaging data from the measurement campaign in Jena.

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Tomographic Reconstruction 

Measure Excitation light, 652 nm Fluorescence light, 720 nm 

Extinction coefficient  Fluorescence Spectra 

Svenmarker et al. unpublished (2009)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Svenmarker et al. unpublished (2009) 

In vivo non­invasive FosPeg Images 

2D View  3D View

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Novel nanoparticles as fluorescence markers 

Fluorescence imaging of a rat leg 

Xu et al. Appl Phys Lett (2008) Xu et al. Appl Phys Lett (2009)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

IPDT during radiation 

Soto Thompson et al. JEPTO (2006) Johansson et al.  JBO (2007)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Measurements of light fluence 

Interactive dosimetry – eliminates treatment failure 

Soto Thompson et al. JEPTO (2006) Johansson et al.  JBO (2007)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Measurements of Sensitizer concentration 

Assess sensitizer level using fluorescence 

635  705 

Wavelength (nm) 

Sensitizer fluorescence (a.u.)

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Fluorescence tomography of mTHPC concentration during prostate cancer PDT 

Assessment of distribution of the photosensitiser mTHPC during photodynamic therapy of prostate cancer 

Axelsson et al. Opt. Express (2007) Xu et al. Appl. Phys. Lett. (2008) 

Svenmarker et al. (manuscript ) Axelsson et al. Opt Lett. (2009) 

Monitoring of PDT progress – prostate cancer

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

The Group The Group 

Stefan Andersson­Engels Katarina Svanberg Sune Svanberg 

Erik Alerstam Johan Axelsson Niels Bendsøe Dmitry Khoptyar 

Haichun Liu Emilie Krite Svanberg Pontus Svenmarker Tomas Svensson 

Haiyan Xie Can Xu Jonas Johansson Peter Andersen Jakob Thomsen

Visiting professors: Jonas Johansson – Pharmaceutic Optics Peter E. Andersen – Optical Coherence Tomography 

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics

http://www.atomic.physics.lu.se/biophotonics 

Acknowledgements of Support 

This work was supported by: 

EU  Integrated  Projects  BRIGHTER,  Molecular Imaging and the Swedish Research Council, the Wallenberg Foundation, as well as SpectraCure AB