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8/10/2019 Sublethal Stress in Escherichia Coli a Function of Salinityt
1/6
8/10/2019 Sublethal Stress in Escherichia Coli a Function of Salinityt
2/6
1 1 4 8
ANDERSON, RHODES,
N KATOR
w e r e
h a r v e s t e d
b y
c e n t r i f u g a t i o n
( 1 , 0 0 0
x
g )
a t
r o o m
t e m p e r a t u r e
f o r 1 0
m i n
a n d
w a s h e d
t h r e e t i m e s
i n
p h o s p h a t e - b u f f e r e d
w a t e r
( p H
7 . 2 ) .
C e l l s
w e r e
r e s u s -
p e n d e d t o a n
o p t i c a l d e n s i t y
a t
5 4 0
nm
( O D s 0 )
o f
0 . 2
t o
0 . 3 i n s e a w a t e r
( p H
7 . 4 t o
7 . 6 )
o f s e l e c t e d
s a l i n i t i e s .
S e a w a t e r
e x p e r i m e n t s .
A
1 0 - f o l d d i l u t i o n
o f
t h e
f i n a l
w a s h e d c e l l
s u s p e n s i o n
was
made i n 9 0
m l
o f
s e a w a t e r
p r e v i o u s l y
e q u i l i b r a t e d
t o t h e
t e s t
t e m p e r a -
t u r e
i n
1 2 5 - m l
s t e r i l e
s c r e w - c a p p e d
f l a s k s .
S e a w a t e r
a t
s e l e c t e d
s a l i n i t i e s w a s
p r e p a r e d
b y
d i l u t i n g
a g e d ,
f i l -
t e r e d o c e a n w a t e r
( 3 5 o )
w i t h r e v e r s e
o s m o s i s - g l a s s -
d i s t i l l e d
w a t e r
a n d
s t e r i l i z e d
b y
a u t o c l a v i n g .
S e a w a t e r
f r o m
t h e m i d- At l a n t i c c o n t i n e n t a l
s h e l f
was t h e
s o l e
s o u r c e
f o r a l l
p r o c e d u r e s .
S a m p l e s
w e r e
r e m o v e d
a f t e r
v a r i o u s t i m e i n t e r v a l s f o r e n u m e r a t i o n
b y s p r e a d
p l a t -
i n g
o n
T S A , d e t e r m i n a t i o n
o f
E D T ,
a n d
i n d u c t i o n o f
, B - g a l a c t o s i d a s e .
M e d i a u s e d f o r b o t h EDT
a n d
, B - g a -
l a c t o s i d a s e
s t u d i e s i n c l u d e d
E C ,
medium
A - 1
( 1 ) ,
a n d
T r y p t i c a s e s o y
b r o t h
( T S B ) . F o r e n z y m e
s t u d i e s ,
T SB
w a s
m o d i f i e d
t o c o n t a i n l a c t o s e i n s t e a d o f
g l u c o s e .
A l l
t e s t s
w e r e r u n a t
4 4 . 5 C . C o l o n y
c o u n t s w e r e
m a d e
a f t e r c a .
2 4
h
o f
i n c u b a t i o n
a t
3 5 C .
T o t a l
e x p o s u r e
t i m e
t o s e a w a t e r
b e f o r e z e r o
t i m e
s a m p l i n g
r a n g e d
f r o m
2
t o 5
m i n , w h e r e a s
e x p o s u r e
t i m e t o m e d i a a t
4 4 . 5 C
b e f o r e d i l u t i o n
f o r
p l a t e
c o u n t s w a s
l e s s t h a n
3 0 s .
D e t e r m i n a t i o n
o f EDT.
I n s t r u m e n t a t i o n f o r
d e -
t e r m i n i n g EDT
c o n s i s t e d
o f
a
t e s t t u b e
( 2 5
b y 1 0 0
mm)
c o n t a i n i n g
t w o
p l a t i n u m e l e c t r o d e s
a n d
1 8
m l
o f
m e d i u m t o
w h i c h
2
m l
o f
E .
c o l i - s e e d e d s e a w a t e r w a s
a d d e d .
T u b e s
w e r e f i t t e d
w i t h
a
n o .
4 r u b b e r
s t o p p e r
c o n t a i n i n g
e l e c t r o d e s o f
g r a d e
A
p l a t i n u m
a l l o y w i r e ,
2 4
g a u g e ( 0 . 5 0 8
mm)
( E n g e l h a r d
I n d u s t r y ,
C a r t e r e t ,
N . J . ) . E l e c t r o d e s
w e r e i n s e r t e d
i n t o
s l i t s
made i n
t h e
s t o p p e r , a n d
t h e s t o p p e r
w a s b o u n d w i t h
w i r e
o r
e p o x y
o r b o t h
t o p r e v e n t
e l e c t r o d e
s l i p p a g e .
E l e c t r o d e s
w e r e
d e s i g n e d
s u c h
t h a t t h e
r a t i o o f t h e i r
l e n g t h s b e l o w t h e
s u r f a c e o f t h e
medium
w a s
c a . 1 : 4 .
S t e r i l i z a t i o n
w a s b y
f l a m i n g
o v e r a n
a l c o h o l
l a m p .
T h e
l o n g e r
e l e c t r o d e
w a s c o n n e c t e d
t o t h e
n e g a t i v e
t e r m i n a l
a n d t h e
s h o r t e r
o n e
w a s
c o n n e c t e d
t o t h e
p o s i t i v e
t e r m i n a l
o f
a s t r i p
c h a r t
r e c o r d e r
( m o d e l
1 9 4 ,
H o n e y w e l l I n d u s t r i a l
D i -
v i s i o n ,
F o r t
W a s h i n g t o n ,
P a . ;
m o d e l
S R - 2 0 4 ,
H e a t h
C o . ,
B e n t o n
H a r b o r , M i c h . ; o r m o d e l
3 2 0 , S a n b o r n
C o . ,
W a l t h a m ,
M a s s . ) . EDT
w a s
m e a s u r e d a s t h e
t i m e
e l a p s e d
b e t w e e n
c h a l l e n g e
a n d t h e
maximum
c h a n g e
i n
p o t e n t i a l .
, 8 - G a l a c t o s i d a s e a s s a y .
C e l l s
e x p o s e d
t o
s e a w a t e r
f o r
v a r i o u s
t i m e
i n t e r v a l s
w e r e d i l u t e d
1 0 - f o l d i n t o
E C ,
medium
A - 1 , a n d
T S B , e a c h
c o n t a i n i n g
0 . 5
l a c t o s e .
A f t e r 1 5 0
m i n
o f i n d u c t i o n ,
t w o 1 0 - m l
p o r t i o n s
w e r e
f i l t e r e d
t h r o u g h
25-mm
N u c l e p o r e f i l t e r s
( 0 . 4 , u m )
w i t h
1 0 - m l
h y p o d e r m i c s y r i n g e s
e q u i p p e d
w i t h
S w i n n y
a d a p t e r s . O n e
p o r t i o n
w a s
w a s h e d o n c e w i t h p h o s -
p h a t e - b u f f e r e d
w a t e r
c o n t a i n i n g
m a g n e s i u m
s u l f a t e
( 0 . 1 3
g / l i t e r )
a n d
a s s a y e d
b y t h e
o - n i t r o p h e n y l - , 8 - D -
g a l a c t o p y r a n o s i d e
(ONPG) m e t h o d ( 1 5 ) .
The
s a m p l e
w a s
r e s u s p e n d e d i n
1
m l
o f a
t r i s ( h y d r o x y -
m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e
( T r i s ) - m a g n e s i u m
s u l f a t e
b u f f e r
( T r i s , 0 . 0 1 M ;
MgSO4 7 H 2 0 ,
0 . 0 1
M ;
N a C l , 0 . 0 5
M ; a d j u s t e d
t o
pH 7 . 4 ) .
A f t e r a d d i t i o n
o f 1
d r o p o f
t o l u e n e ,
t h e
s a m p l e
w a s
b l e n d e d i n a
v o r t e x
m i x e r a n d
i n c u b a t e d
a t
3 5 C
f o r
3 0
m i n . A
0 . 2 - m l
a m o u n t o f
ONPG
( 0 . 1 3
M
i n
T r i s - m a g n e s i u m b u f f e r ,
pH
7 . 4 ) w a s
a d d e d ,
a n d t h e
s a m p l e
w a s i n c u b a t e d
a t 2 8 C
u n t i l
a
y e l l o w
c o l o r
d e v e l o p e d .
The
r e a c t i o n w a s
s t o p p e d
b y
a d d i t i o n
o f 0 . 5 m l
o f 1 M
N a 2 C O 3 .
O D w a s
m e a s u r e d
a t
b o t h 5 5 0
a n d 4 2 0 n m w i t h
a B a u s c h
a n d Lomb
S p e c t r o n i c
7 0 . O n e
u n i t o f
e n z y m e
w a s d e f i n e d
a s t h e
amount
o f
e n z y m e
t h a t
r e l e a s e d
1
n m o l
o f
o - n i t r o p h e -
n o l
p e r
m i n
a t
2 8 C , pH
7 . 4 .
E n z y m e
u n i t s
w e r e
c a l c u l a t e d
f r o m
t h e
e q u a t i o n e n z y m e
u n i t s =
[ O D 4 2 0
-
( 1 . 6 5
O D 5 5 o ) ] / [ ( t i m e
o f
i n c u b a t i o n ,
m i n u t e s )
( 0 . 0 0 7 5 ) ] .
The
s e c o n d
1 0 - m l
p o r t i o n
w a s
a s s a y e d f o r
p r o t e i n
b y
t h e
m e t h o d o f
L o w r y e t a l .
( 1 1 ) .
The
s a m p l e w a s
w a s h e d
t w i c e w i t h
p h o s p h a t e - m a g n e s i u m
s u l f a t e
b u f f e r a n d
r e s u s p e n d e d
i n
1
m l
o f
1
N NaOH
b e f o r e
a s s a y .
A
s t a n d a r d c u r v e
f o r
p r o t e i n
w a s
d e v e l o p e d
w i t h s e r u m
a l b u m i n
( 1
m g / m l
i n
w a t e r ) .
D i l u t i o n s
o f
s e r u m
a l b u m i n w e r e
made i n
0 . 1
N
NaOH.
E n z y m e
s p e c i f i c
a c t i v i t y
w a s
d e f i n e d a s
e n z y m e
u n i t s
p e r
m i -
c r o g r a m
o f
p r o t e i n .
S t a n d a r d
c u r v e s
and
d a t a
a n a l y s i s .
The r e l a -
t i o n s h i p o f E DT t o
i n o c u l u m
d e n s i t y
f o r
u n s t a r v e d
c e l l s w a s d e t e r m i n e d
w i t h
E C ,
A - 1 ,
a n d
T SB
m e d i a .
T e n f o l d d i l u t i o n s
o f a n E .
c o l i
s u s p e n s i o n ,
p r e p a r e d a s
d e s c r i b e d
f o r s e a w a t e r
e x p e r i m e n t s ,
w e r e made
i n
2 5 o
s e a w a t e r
a t
2 0 C .
E x p o s u r e
t o s e a w a t e r n e v e r
e x -
c e e d e d
5
m i n .
A f t e r
s a m p l e s f o r i n i t i a l v i a b l e
c o u n t s
w e r e
r e m o v e d , d i l u t i o n s w e r e i n o c u l a t e d
i n t o
e a c h
t e s t
medium a n d
i n c u b a t e d
a t
4 4 . 5 C f o r
d e t e r m i n a t i o n
o f
EDT. A
minimum o f 1 8 E DT
m e a s u r e m e n t s
w e r e
p e r f o r m e d t o
c o n s t r u c t a s t a n d a r d c u r v e
f o r e a c h
t e s t
m e d i u m .
D a t a w e r e
a n a l y z e d b y
a l i n e a r
l e a s t - s q u a r e s
r e g r e s s i o n
t e c h n i q u e w i t h
a
9 5
c o n f i d e n c e
i n t e r v a l
( 1 6 ) .
S t a n d a r d
c u r v e
d a t a w e r e
u s e d a s f o l l o w s .
D u r i n g
e x p o s u r e
o f c e l l s
t o
s e a w a t e r
( s t a r v a t i o n ) ,
s a m p l e s
w e r e
r e m o v e d a t t i m e d
i n t e r v a l s
f o r
d e t e r m i n a t i o n
o f
v i a b l e
c o u n t s
( T S A ) a n d E DT i n
t e s t m e d i a .
V i a b l e
c o u n t s
w e r e u s e d t o d e r i v e a
p r e d i c t e d
EDT
f r o m t h e
a p p r o p r i a t e s t a n d a r d
c u r v e . D i f f e r e n c e s
o b t a i n e d
b y
s u b t r a c t i o n o f
t h e
p r e d i c t e d
f r o m
t h e o b s e r v e d
v a l u e s
w e r e p l o t t e d
f o r
e a c h
t e s t medium a s
a f u n c t i o n
o f
e x p o s u r e
t i m e i n
s e a w a t e r .
R E SUL T S
E f f e c t
on
v i a b i l i t y .
S u r v i v a l
s t u d i e s
o f
E .
c o l i i n
s e a w a t e r o f
s e l e c t e d
s a l i n i t i e s ( T a b l e
1 )
i n d i c a t e d
t h a t
d e c r e a s i n g s a l i n i t y w a s
a c c o m p a -
n i e d
b y
i n c r e a s i n g s u r v i v a l . A t
s a l i n i t i e s o f
1 5
a n d
3 0 o ,
maximum
l o s s i n
v i a b i l i t y
o c c u r r e d
d u r i n g t h e
f i r s t 2
d a y s
o f
e x p o s u r e ,
w h e r e a s a t
1 0 o
t h e d e a t h
r a t e
was
a p p r e c i a b l y s l o w e r .
E f f e c t
on EDT.
S t a n d a r d
c u r v e
d a t a
( T a b l e
2 )
w e r e
u s e d
t o
e v a l u a t e t h e
r e s p o n s e s o f
s t a r v e d
c e l l
p o p u l a t i o n s
u p o n
t r a n s f e r t o
m e d i a a t
4 4 . 5 C .
S t r e s s ,
d e f i n e d a s
o b s e r v e d
m i n u s p r e -
d i c t e d
EDT, w a s
a
f u n c t i o n o f
b o t h
s a l i n i t y a n d
t e s t
medium
( F i g .
1 ) .
G e n e r a l l y ,
maximum
s t r e s s
d e v e l o p e d e a r l y
d u r i n g
t h e
s t a r v a t i o n p e r i o d a n d
s u b s e q u e n t l y d e c r e a s e d o r
r e m a i n e d
c o n s t a n t
a f t e r e x t e n d e d
e x p o s u r e . Maximum
d e l a y i n d e -
t e c t i o n
t i m e
o c c u r r e d
i n
EC
medium a f t e r
e x -
p o s u r e
t o
3 0 o
s e a w a t e r .
Medium A - 1 w a s
s u -
A P P L . E N VI R ON . M I C R O B I O L .
8/10/2019 Sublethal Stress in Escherichia Coli a Function of Salinityt
3/6
DETECTION OF SUBLETHAL S T R E S S IN E .
COLI
1 1 4 9
p e r i o r
t o EC
i n
e n u m e r a t i n g s t r e s s e d
E .
c o l i a n d
w a s a s
e f f e c t i v e
a s T S B . D i f f e r e n c e s i n
e n u m e r -
a t i o n
e f f i c i e n c y
f o r t h e t h r e e
m e d i a
w e r e
m o s t
o b v i o u s
e a r l y
i n t h e s t a r v a t i o n
p e r i o d
a n d
d i -
m i n i s h e d
w i t h e x t e n d e d s t a r v a t i o n .
E f f e c t
on
g r o w t h r a t e . G r o w t h
r a t e s
o f E .
c o l i
i n d i f f e r e n t t e s t
m e d i a
w e r e m e a s u r e d w i t h
i n o c u l a
b e f o r e
a n d
a f t e r
s t a r v a t i o n
f o r v a r i o u s
t i m e i n t e r v a l s
i n 1 0
a n d
3 0 o
s e a w a t e r .
A s n o t e d
a b o v e , s o m e l o s s o f
v i a b i l i t y
o c c u r r e d d u r i n g
e x p o s u r e
t o
s e a w a t e r
( T a b l e
1 ) . A f t e r i n o c u l a -
t i o n i n t o
t e s t m e d i a , t h e r e w a s a n i m m e d i a t e
d i e - o f f
r e l a t e d t o d u r a t i o n o f
e x p o s u r e t o
s e a -
w a t e r , s a l i n i t y , a n d t e s t medium ( T a b l e
3 ) . D i e -
o f f
w a s
m o s t
p r o n o u n c e d w h e n c e l l s e x p o s e d t o
3 0 o s e a wa t e r w e r e
i n o c u l a t e d
i n t o
EC m e d i u m .
I n o c u l u m
r e d u c t i o n
w a s l e s s
e x t e n s i v e
i n m e -
d i u m
A - 1
a n d
n e g l i g i b l e
i n
T S B .
D i e - o f f
w a s
e v i d e n t a f t e r
o n l y 3 0
s o f
e x p o s u r e t o t h e
t e s t
m e d i u m . C e l l d e n s i t i e s
a t z e r o
t i m e
s h o w n
i n
F i g . 2
r e f l e c t e d b o t h
l o s s o f
v i a b i l i t y i n s e a w a t e r
a n d i m m e d i a t e d i e - o f f
u p o n
e x p o s u r e
t o
t h e
t e s t
m e d i u m a t 4 4 . 5 C . T h e r e a f t e r , n o o b v i o u s d i f -
f e r e n c e s i n
l a g
t i m e s o r
g r o w t h
r a t e s f o r
a n y
o f
t h e
i n o c u l a
w e r e
o b s e r v e d .
E f f e c t on
P - g a l a c t o s i d a s e
a c t i v i t y
a f t e r
TABLE 1 .
P e r c e n t
s u r v i v a l o f
E .
c o l i
i n
s e a w a t e r
a d j u s t e d
t o
s e l e c t e d
s a l i n i t i e s
S a l i n i t y
E x p o s u r e
S u r v i v a l '
M O
( d a y s )
1 0
2
1 0 0 . 6
5
8 7 . 6
8
5 3 . 5
1 5
2
2 7 . 9
5 1 1 . 7
8 7 . 1
2 5
2
8 . 6
5
5 . 1
8
4 . 3
3 0
2 1 . 7
5
0 . 7
8
2 . 0
a
B a s e d o n
z e r o
t i m e d e n s i t i e s
o f
E .
c o l i
i n s e a w a t e r
( c a .
1 0 7 c e l l s
n e r
m l ) .
E a c h
d a t a
p o i n t
r e p r e s e n t s
t h e
mean o f t w o
e x p e r i m e n t s .
i n d u c t i o n
i n T S B - l a c t o s e ,
medium
A - 1 ,
and
E C .
, B - G a l a c t o s i d a s e
s p e c i f i c a c t i v i t y
d e c l i n e d
w i t h i n c r e a s i n g s t a r v a t i o n
t i m e
a n d s a l i n i t y
( F i g .
3 ) .
I n
c e l l s e x p o s e d
t o 2 o
s e a w a t e r , enzyme
a c t i v i t y d e c r e a s e d s l i g h t l y i n
t h o s e c e l ls i n d u c e d
i n
T S B - l a c t o s e
a n d
not
i n
cells i n d u c e d
i n
EC or
medium A - 1 . Enzyme a c t i v i t i e s
d e c l i n e d
approx-
i m a t e l y 5 0 t o 80 a f t e r 7
d a y s i n
1 0 o seawater
r e g a r d l e s s
o f
i n d u c t i o n
m e d i u m . C e l l s s t a r v e d i n
3 0 o s e a w a t e r e v i d e n c e d
a
p r e c i p i t o u s d e c l i n e i n
s p e c i f i c a c t i v i t y i n a l l t h r e e
m e d i a .
DISCUSSION
C o n s i d e r a b l e
c o n t r o v e r s y r e m a i n s
c o n c e r n i n g
causes
f o r t h e
d i e - o f f o f
E . c o l i i n a q u a t i c e n v i -
r o n m e n t s . D i e - o f f
h a s
most
o f t e n
b e e n m e a s u r e d
b y
v i a b l e c o u n t
t e c h n i q u e s
e m p l o y i n g s t a n d a r d
E . c o l i
A
1 O 0 .
1 5 o
25 o
30 .
2
X
0
1 0
0
1 0
0
1 0
0
1 0
E . c o l i
B
10 o
3 0 0
E
JE
1
10
2 3
0 1 0
20
3 0
DAYS
I N
SEAWATER
F I G .
1 . I n c i d e n c e
o f
s t r e s s i n E .
c o l i
d u r i n g expo-
sure t o s e a w a t e r
as
measured
b y
t h e
e l e c t r o c h e m i c a l
d e t e c t i o n
m e t h o d . S t r e s s
was
d e f i n e d
as t h e
d i f f e r e n c e
b e t w e e n
o b s e r v e d
EDT i n t e s t
media
an d
p r e d i c t e d
EDT b a s e d on
s t a n d a r d
curves.
T he
p r e d i c t e d
EDT
was d e r i v e d
f r o m
a
l i n e a r
r e g r e s s i o n
l i n e based
on
t h e v i a b l e
c o u n t
i n t h e s e a w a t e r
s a m p l e .
TABLE
2 .
S u m m a r y o f
s t a n d a r d c u r v e d a t a
i n v a r i o u s
m e d i a a t
4 4 . 5 0 C
N o .
o f
sam-
D e t e c t i o n
t i m e
C o r r e l a t i o n
c o e f - 9 5
C o n f i -
T e s t
o r g a n i s m
T e s t m e d i u m
p l e s
S l o p e
i n t e r c e p t
f i c i e n t d e n c e
l i m i t s
( b )
E .
c o l i
A EC
2 0 - 1 . 2 3
1 0 . 9 4
- 0 . 9 9
0 . 5 0
T SB
2 2
- 1 . 0 4
9 . 8 5 - 0 . 9 7 + 0 . 5 6
E .
c o l i
B
EC
1 8
- 1 . 0 5 1 0 . 2 6 - 1 . 0 0
0 . 1 1
A - 1
1 8 - 0 . 8 0
8 . 1 1 - 1 . 0 0
0 . 1 3
T SB
1 8
- 0 . 9 2
8 . 9 9 - 1 . 0 0
0 . 2 2
V O L .
3 8 ,
1 9 7 9
8/10/2019 Sublethal Stress in Escherichia Coli a Function of Salinityt
4/6
1 1 5 0
ANDERSON,
R H O D E S ,
AND
KATOR
TABLE
3 .
D i e - o f f
o f
E .
c o l i B
i n
t e s t m e d i a
a t
4 4 . 5 C
a f t e r e x p o s u r e
t o
s e a w a t e r
S a l i n i t
E x p o s u r e
D i e - o f f ' i n :
( o ) ( d a y s )
EC
A - i
T SB
1 0
0
0 . 0 9 . 1
0 . 0
2
2 1 . 4 2 8 . 6
1 4 . 3
5
0 . 0
0 . 0 0 . 0
7
0 . 0
0 . 0 0 . 0
9
5 . 6
1 1 . 1
0 . 0
1 4 1 3 . 3 1 3 . 3
0 . 0
2 4
7 . 7 7 . 7
0 . 0
3 0 0
6 2 . 3 2 9 . 2
0 . 0
2
9 8 . 8 9 0 . 7
1 1 . 1
5 9 8 . 1
5 6 . 6
1 1 . 3
7
9 8 . 9
6 1 . 7 5 . 6
9 9 5 . 9
3 9 . 4
1 2 . 7
1 4
6 6 . 9
0 . 0 0 . 0
2 4
7 7 . 1
3 5 . 3
2 3 . 5
T h e
o c c u r r e n c e
o f
d i e - o f f
i n a
g i v e n
t e s t
medium
w a s d e t e c t e d
b y
c o m p a r i s o n
o f
v i a b l e
c o u n t s
( o n
T S A )
o f
E . c o l i
t a k e n f r o m
s e a w a t e r f o r
i m m e d i a t e
e n u m e r -
a t i o n a n d t h o s e e n u m e r a t e d a f t e r
a
3 0 - s
p a s s a g e
t h r o u g h
a
g i v e n
t e s t m e d i u m a t
4 4 . 5 C .
P e r c e n t
d i e -
o f f
=
[ 1
-
( v i a b l e
c o u n t f r o m
t e s t
m e d i u m / v i a b l e
c o u n t f r o m
s e a w a t e r ) ]
x
1 0 0 .
m e d i a .
R e c e n t l y ,
i t h a s
b e e n
n o t e d
t h a t
t h e
e n u m e r a t i o n
p r o c e s s
i t s e l f
may
b e
r e s p o n s i b l e
f o r
t h i s
a p p a r e n t
d i e - o f f
i n
n a t u r a l w a t e r s .
O l s o n
( 1 3 )
n o t e d
t h a t m o r e t h a n
h a l f o f
t h e w a t e r
s a m p l e s
f r o m
C a l i f o r n i a b e a c h e s
p r o d u c e d
f a l s e
n e g a t i v e s
i n
t h e s t a n d a r d
f e c a l
c o l i f o r m
m o s t
p r o b a b l e n u m b e r
t e s t ,
i . e . ,
g r o w t h
b u t
n o g a s i n
t h e
p r e s u m p t i v e p o r t i o n
o f
t h e t e s t
f o l l o w e d
b y
g r o w t h
a n d
g a s
p r o d u c t i o n
i n
b o t h
t h e
c o n f i r m e d
a n d
e l e v a t e d
t e m p e r a t u r e
p o r t i o n s o f
t h e t e s t .
T h e s e
r e s u l t s
s u g g e s t e d
t h a t
a
p r o p o r t i o n
o f t h e
f e c a l
c o l i f o r m s
i s o l a t e d
may
h a v e b e e n
s u b l e -
t h a l l y
d a m a g e d a n d ,
t h e r e f o r e , w o u l d b e
u n d e -
t e c t e d
b y
u s u a l
e n u m e r a t i o n
p r o c e d u r e s .
B i s s o n n e t t e
e t a l .
( 2 )
s u g g e s t e d t h a t
c o l i f o r m s
i n t r o d u c e d
i n t o
a n
a q u a t i c
e n v i r o n m e n t e x h i b i t
t h e
f o l l o w i n g
r e s p o n s e s :
d e a t h ,
s u r v i v a l
w i t h
e n u m e r a t i o n
p o s s i b l e
b y
s t a n d a r d
p r o c e d u r e s ,
a n d
s u b l e t h a l s t r e s s
f o l l o w e d
b y
d e a t h
i n
s t a n -
d a r d
e n u m e r a t i o n m e d i a .
S t r e s s e d c e l l s
w e r e
i d e n t i f i e d
b y
t h e i r
a b i l i t y
t o
g r o w o n a
n o n s e l e c -
t i v e , b u t
n o t
o n a s e l e c t i v e
m e d i u m .
S i m i l a r l y ,
K l e i n
a n d
Wu
( 1 0 ) d e t e c t e d
t h e p r e s e n c e
o f
s u b l e t h a l
s t r e s s
i n
b a c t e r i a
s t a r v e d
i n f r e s h w a t e r
b y
s u b j e c t i n g
t h e c e l l s
t o
a
t r a n s i e n t
w a r m i n g
s t r e s s
b e f o r e
p l a t i n g o n n u t r i e n t
a g a r .
W i t h
t h e
r e c o g n i t i o n
o f
s u b l e t h a l
s t r e s s , e f -
f o r t s
h a v e
b e e n
d i r e c t e d
t o w a r d
d e v e l o p m e n t
o f
e n u m e r a t i o n
p r o c e d u r e s
w h i c h r e t a i n
s e l e c t i v i t y
f o r
f e c a l
c o l i f o r m s
b u t
a l l o w r e c o v e r y o f
s t r e s s e d
c e l l s .
S t u a r t
e t a l . ( 1 8 )
d e v e l o p e d
a b i l a y e r
p l a t e
c o n t a i n i n g b o t h a s e l e c t i v e
a n d
a
n o n s e l e c t i v e
medium f o r
r e c o v e r y
o f
f e c a l
c o l i f o r m s s t r e s s e d
b y
t h e
a q u a t i c e n v i r o n m e n t .
S p e c k
e t a l .
( 1 7 )
d e v e l o p e d
a
s i m i l a r
b i l a y e r
p l a t i n g p r o c e d u r e f o r
e n u m e r a t i n g
i n j u r e d
c o l i f o r m s i n f r o z e n
f o o d s .
Many
w o r k e r s
h a v e
a t t e m p t e d
i n c o n c l u s i v e l y
t o e v a l u a t e
t h e
i n f l u e n c e
o f
s a l i n i t y o n E . c o l i
d i e - o f f
i n
m a r i n e
e n v i r o n m e n t s
( 5 , 7 , 1 4 ,
1 9 ) .
R a t h e r t h a n
e m p l o y i n g
a n a l l - o r - n o n e
r e s p o n s e
t o
d e t e r m i n e
t h e
e f f e c t o f s a l i n i t y , we
c h o s e
i n s t e a d
t o
m e a s u r e g r a d e d
r e s p o n s e s ,
i . e . ,
d e v e l -
o p m e n t
o f a n i n c r e a s e
i n p o t e n t i a l ,
e n z y m e
s p e -
c i f i c
a c t i v i t y ,
a n d
g r o w t h
r a t e
i n s e l e c t i v e
a n d
n o n s e l e c t i v e m e d i a .
I t
h a s
b e e n
o u r
e x p e r i e n c e
t h a t
s o u r c e ,
s t o r a g e
c o n d i t i o n s , a n d
c u l t u r a l
h i s -
t o r y
o f t h e
o r g a n i s m s
g r e a t l y
i n f l u e n c e d
t h e i r
r e s p o n s e t o
e x p e r i m e n t a l
s a l i n i t y r e g i m e s ( u n -
p u b l i s h e d
d a t a ) .
S u b l e t h a l
s t r e s s
w a s
m o s t
a p -
p a r e n t i n
f r e s h l y i s o l a t e d E . c o l i a s
o p p o s e d t o
i s o l a t e s s t o r e d
f o r
l o n g p e r i o d s
o f
t i m e e i t h e r
o n
s l a n t s
a t S o C
o r
i n
4 0
g l y c e r o l a t
- 5 C .
E .
c o l i
p r e g r o w n i n
a
r i c h
medium
( T S B ) a n d
t h e n
e x p o s e d
t o s e a w a t e r e x h i b i t e d a
f a s t e r ,
m o r e
e x t e n s i v e
d i e - o f f
when t e s t e d
i n
a
s e l e c t i v e
m e -
d i u m
( E C ) t h a n
d i d c e l l s
p r e g r o w n i n
a
m i n i m a l
m e d i u m .
G r a d e d r e s p o n s e s w e r e
m e a s u r e d
w i t h
t w o
s t a n d a r d s e l e c t i v e
m e d i a ,
EC
a n d
medium
A - 1
a t
4 4 . 5 0 C ,
t o m a x i m i z e
t h e
e x p r e s s i o n o f
s t r e s s .
T SB s e r v e d a s a
n o n s e l e c t i v e t e s t
medium
t o
m i n i m i z e
t h e
e x p r e s s i o n
o f
s t r e s s .
R e s u l t s
w i t h t h e EDT
t e c h n i q u e
c o n f i r m
t h e
o b s e r v a t i o n o f
W i l k i n s a n d
B o y k i n
( 2 3 ) t h a t
l 0 .
8
7
' I
- 0
5
1
O
8
-
w 7-
z
o ,
6-
0
- J
5 -
4 -
3-
0
A - - ~
0
2
A
, . . .
s D :
e
0
3 0 .
0
x
t o 1 y
HOURS
I N C U B A T I O N AT
4 4 . 5 - C
F I G .
2 .
G r o w t h
o f E . c o l i
B i n
t e s t
m e d i a
a t
4 4 . 5 0
C
b e f o r e
and
a f t e r
s t a r v a t i o n i n 1 0 an d
3 0 o
s e a w a t e r .
S y m b o l s : 0 ,
O
d a y ;
0 ,
2 d a y s ;
x ,
5
d a y s ;
A , 7 d a y s o f
s t a r v a t i o n .
A P P L .
E N V I R O N .
M I C R O B I O L .
i1
8/10/2019 Sublethal Stress in Escherichia Coli a Function of Salinityt
5/6
DETECTION OF
SUBLETHAL S TR ESS IN
E . COLI
1 1 5 1
1 0 0 -
8 0 -
6 0 -
4 0 -
L I J
a l .
U
c L )
c n )
20 ]
1 0 0 -
80-
60-
40-
20-
1 0 0 -
80-
60-
4 0 -
20-
0 O
0
2 4
DAYS
I N
SEAWAT
F I G .
3 . E f f e c t o f
s t a r v a t i o n a t s e l e c t e d
s
enzyme
s p e c i f i c a c t i v i t y e x p r e s s e d as pet
zero
t i m e
a c t i v i t y .
Enzyme
was
i n d u c e d
m e d i a a t
4 4 . 5 C .
S y m b o l s :
0 ,
E C ;
0,
T SB
c o l i f o r m s f r o m e s t u a r i n e w a t e r s e x h i b
d e t e c t i o n
t i m e s
r e l a t i v e
t o
t h o s e
f r o m r
t e r . C e l l s s t r e s s e d
b y
i n
v i t r o
e x p o s u w
s a l i n i t y
d i s p l a y e d
EDT
responses
l a t e r
d i c t e d
f r o m s t a n d a r d curves. Of
t h e t w 4
m e d i a ,
s t r e s s
was
c o n s i d e r a b l y
more
p r
i n
E C t h a n
i n
medium
A - 1 .
Based on
we
s u g g e s t
t h a t t h e
EDT
t e c h n i q u e
s u i t a b l e
f o r
c o l i f o r m
e n u m e r a t i o n
as
b y
W i l k i n s a n d
B o y k i n ( 2 3 )
p r o v i d e (
s t a n d a r d
c urves are
d e v e l o p e d
f o r t h e
c o n d i t i o n s i n
t h e e n v i r o n m e n t
b e i n g
n
( i i )
f e c a l c o l i f o r m s
i s o l a t e d from
n a t u
ar e u s e d i n
e s t a b l i s h i n g
t h e s e
s t a n d a
2
( i i i ) medium
A -1 o r
a
s i m i l a r
b e n i g n y e t s e l e c t i v e
medium i s u t i l i z e d f o r
d e t e r m i n a t i o n o f
EDT.
The
l i k e l i h o o d
o f u n d e r e s t i m a t i n g c o l i f o r m
d e n -
s i t i e s w o u l d
i n c r e a s e
i f
s a m p l e s
w e r e
t a k e n
f r o m
h i g h - s t r e s s a r e a s ,
f o r e x a m p l e ,
d o w n s t r e a m o f
a
s e w a g e
t r e a t m e n t
p l a n t o r
i n d u s t r i a l
o u t f a l l .
A
p o s s i b l e m o d i f i c a t i o n o f
t h e
EDT
t e c h n i q u e t o
i m p r o v e d e t e c t i o n o f
s t r e s s e d c o l i f o r m s , f o r e x -
a m p l e ,
w o u l d
u t i l i z e
p r e i n c u b a t i o n a t
a
t e m p e r -
a t u r e
l o w e r
t h a n
4 4 . 5 C
o r i n a medium
c o n d u -
c i v e
t o
r e p a i r
o f d a m a g e d
c e l l s
b e f o r e e x p o s u r e
t o
s e l e c t i v e c o n d i t i o n s .
A d d i t i o n a l
w o r k i s n e c e s s a r y t o
c o m p a r e t h e
1 0 / o
e f f i c i e n c y o f
t h e E T t e c h n i q u e
t o s t a n d a r d
m o s t
p r o b a b l e
n u m b e r
o r
f i l t r a t i o n
t e s t s
f o r
e n u -
m e r a t i o n o f
s t r e s s e d f e c a l
c o l i f o r m s .
The
a p p l i -
c a t i o n o f t h e
EDT
t e c h n i q u e s t o
e n u m e r a t i o n o f
o t h e r
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8/10/2019 Sublethal Stress in Escherichia Coli a Function of Salinityt
6/6