Taninos condensados y su efecto sobre los parásitos
gastrointestinales de ovinosCiencia Unisalle Ciencia Unisalle
2009
Taninos condensados y su efecto sobre los parásitos Taninos
condensados y su efecto sobre los parásitos
gastrointestinales de ovinos gastrointestinales de ovinos
Claudia Patricia Lascano Goenaga Universidad de La Salle,
Bogotá
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El parasitismo gastrointestinal ha sido una de las mayores causas
de baja productividad en los sistemas de ganadería ovina. Para
contrarrestar éste problema, productores y técnicos han intentado
controlar las infecciones con vermífugos químicos, usándolos
continua e indiscriminadamente. Sin embargo, el control parasitario
basado únicamente en el uso de químicos no es sostenible a largo
plazo debido a problemas de desarrollo de resistencia a los
antiparasitarios, además de generar altos costos y residuos en
carne y leche. En los últimos 20 años se han generado esfuerzos en
desarrollar estrategias de control complementarias/alternativas
especialmente no químicas. La inclusión de leguminosas forrajeras
con taninos condensados, en los sistemas de pastoreo, se considera
una estrategia de control de parásitos gastrointestinales novedosa.
Sin embargo, para que esta alternativa de control sea efectiva es
necesario describir los diferentes tipos de taninos existentes, su
concentración y estructura química que varía dependiendo de la
especie de planta y de factores ambientales, ya que éstos podrían
tener implicaciones en el control de parásitos internos en ovinos.
Numerosas investigaciones se han realizado con resultados positivos
en el control de parásitos con leguminosas con taninos condensados
(TC). Se describen dos mecanismos mediante los cuales los TC
controlan parásitos gastrointestinales, estos pueden ser directos
(eclosión de huevos, sobrevivencia de larvas) o indirectos (mejoras
en el sistema inmune) dado su efecto en la protección de proteínas
de la planta en el rumen que resulta en mayor absorción de
proteínas en el tracto posterior del rumiante. Para determinar si
el efecto es directo diversos autores proponen diferentes
metodologías para evaluar in vitro la efectividad de los TC en el
control de parásitos gastrointestinales. Finalmente, se presentan
una conclusiones haciendo énfasis en la investigación que se debe
realizar para poder integrar en los sistemas de producción de
ovinos el control de parásitos mediante el uso de leguminosas con
taninos.
2
1. INTRODUCCIÓN
La población de ovinos en Colombia está predominantemente en manos
de pequeños productores, cumpliendo una importante función
económica en las comunidades agrícolas y otras zonas de
concentración de pobreza. A diferencia de otros sistemas de
producción animal, como son el bovino, el porcino, y el avícola los
sistemas de producción ovino no han logrado un adecuado desarrollo,
en gran parte, debido a un inapropiado manejo de la sanidad y
sistemas de producción. En la actualidad, esta situación está
cambiando, dada la orientación de la producción ovina artesanal
hacia una producción más comercial, cumpliendo con exigencias del
mercado que resulte en mayores beneficios económicos para los
productores. A esto puede contribuir, que la exportación de carne
ovina ha venido creciendo en forma significativa. En el periodo
comprendido entre 1991-2006 se produjo un en Colombia un total de
4.311 toneladas de carne caprina y ovina, con un total de
participación de esta última del 98% (Martínez, 2006). Sin embargo,
la productividad de los ovinos no ha llegado al óptimo rendimiento
debido probablemente a las efectos dañinos que los parásitos
gastrointestinales ocasionan en estos pequeños rumiantes, los
cuales se reflejan en baja producción y pérdidas por (Otero et al.,
2004). Estudios realizados por Poppi et al., (citados por Molan et
al., 2000) indican que las infecciones por helmintos de
manifestación sub-clínica pueden generar pérdidas del orden de 40%
en ganancia de peso vivo, lo cual está asociado con una disminución
de ingestión de alimento que va de 6% a 30% en corderos. La
producción de leche se ha reportado que puede disminuir en un 40%,
la lana hasta en 15% en animales parasitados (Poppi et al., citados
por Molan et al., 2000) y la mortalidad llega hasta un 50%
(Castells et al., 1991). De otra parte, para contrarrestar los
problemas asociados con los parásitos gastrointestinales en ovinos,
productores y técnicos controlan las infecciones con vermífugos
químicos. Sin embargo, el uso indiscriminado y continuo de estos
compuestos químicos ha conducido a la aparición de resistencia en
estos parásitos a los principales principios activos empleados para
el control, lo cual agrava la problemática de los parásitos en los
sistemas de producción ovina, por el incremento de las pérdidas
económicas que las resistencia genera (Márquez, 2007). Lo anterior
impone la necesidad de cambiar los métodos actualmente empleados
para el control de los parásitos en ovinos, so pena de que se
agoten los antihelmínticos químicos en un futuro cercano (Cuellar,
2007). En consonancia con lo anterior, y debido a los problemas
asociados con los altos costos de los medicamentos antihelmínticos,
a la resistencia generada por los endoparásitos y al incremento de
la demanda de carne libre de
3
residuos químicos (Márquez, 2008, Waller y Thamsborg, 2004; citado
por Heckendorn et al., 2007), existe notable interés en controlar
las infecciones parasitarias por métodos que no dependan en su
totalidad del uso de químicos para su tratamiento. Alternativas
como el empleo de ovinos resistentes a los endoparásitos, manejo
del pastoreo (rotación), manejo alterno bovino-ovinos, uso de
taninos condensados y el control biológico, entre otros, con base
en escarabajos estercoleros y hongos ( spp. y Duddingtonia
flagrans), constituyen herramientas promisorias de control
parasitario en los sistemas de producción ovino (Márquez, 2007). En
particular, la inclusión de plantas con taninos condensados en los
sistemas de pastoreo como Lotus uliginosus (Lotus Makú) y Lotus
corniculatus, han demostrado las bondades de estos arbustos en
reducir el número de parásitos gastrointestinales en los ovinos y
mejorar la capacidad productiva de estos rumiantes, tal como han
demostrado diferentes estudios (Kimambo et al., 2002, Min y Hart,
2003). De las plantas con taninos condensados, L. uliginosus es una
alternativa forrajera que se encuentra en avanzado estado de
evaluación (después de 10 años de introducida al país) en sistemas
de producción de bovino, ovinos y caprinos en las ecorregiones de
clima frío en Colombia (Cárdenas et al., 2007) Debido a que la
concentración y la estructura química de los taninos en especies
forrajeras de clima templado y tropical son muy variables, (Min y
Hart, 2003), se hace necesario determinar el efecto directo de los
taninos contra los parásitos gastrointestinales y definir las
concentración con las cuales se logren mejores resultados en cuanto
a la disminución de los mismos, particularmente en Colombia con el
propósito de desarrollar sistemas de producción sustentables.
4
2. OBJETIVOS
Esta Monografía tiene como objetivo describir el efecto de taninos
condensados obtenidos de leguminosas forrajeras en huevos y larvas
de nematodos gastrointestinales en ovinos como una opción
complementaria para el Control Integrado de Parásitos (CIP) y
evitar así la resistencia generada por los antihelmínticos
químicos. Para alcanzar este objetivo general se ha realizado: a)
Una revisión de la literatura sobre la importancia de la inclusión
de un nuevo método en el control de los nematodos
gastrointestinales en ovinos dada la creciente resistencia de los
mismos a antihelmínticos comúnmente usados b) Una revisión de
literatura sobre los taninos y sus efectos en el control de los
parásitos gastrointestinales en ovinos. Adicionalmente, se
describen algunas metodologías in vitro para evaluar el efecto
directo de taninos condensados purificados sobre eclosión de los
huevos de nematodos y sobre la viabilidad y motilidad de las larvas
L2- L3. Finalmente, con base en la revisión realizada se resumen
algunas recomendaciones sobre necesidades de investigación para
lograr impulsar el uso de leguminosas con taninos en el control de
parásitos gastrointestinales en ovinos.
5
3. RESISTENCIA DE PARÁSITOS GASTROINTESTINALES A
ANTIHELMÍNTICOS
La elevada prolificidad, adaptabilidad y resistencia a diversas
condiciones climáticas hacen que los nematodos gastrointestinales
(NGI) tengan una amplia distribución geográfica y una alta
prevalencia, tanto en regiones con clima templado como tropical
(Quiroz, 2003, citado por Cuellar, 2007). Por lo anterior, y con la
finalidad de contrarrestar los efectos negativos de los NGI, se han
utilizado antihelmínticos, como las avermectinas, benzimidazoles e
imidazoles para lograr un buen estado de salud de los animales.
Infortunadamente, el uso excesivo de compuestos químicos, las
rotaciones inadecuadas de los mismos, la aplicación de dosis
menores a las terapéuticamente recomendadas (Cuellar, 2007) y el
desconocimiento de los factores intrínsecos de los parásitos han
facilitado el surgimiento de la resistencia de los NGI a productos
químicos (Márquez, 2007). En las primeras décadas del siglo veinte,
ya los expertos en el manejo y control de parásitos del ganado
advertían sobre el riesgo de depender exclusivamente del uso de
fármacos antiparasitarios en el control del gusano gástrico,
(Haemonchus contortus) de los pequeños rumiantes (Swales, 1937), En
1998, una encuesta realizada en 77 países miembros de la
Organización Internacional de Epizootias (OIE) reporto que en 55%
de los países encuestados se había diagnosticado resistencia por lo
menos a un agente antiparasitario y, de éstos, 86% informó tener
diagnostico de resistencia a antihelmínticos especialmente en
ovinos (Márquez, 2003). Tras la evaluación de 60 predios en África
se encontró que el 90% de los mismos presentó cepas resistentes a
por lo menos un principio activo y que el 40% fue resistente a más
de tres grupos antihelmínticos de los que fueron probados
(benzimidazol, levamisol, salicilanilida, ivermectina) (Márquez,
2007). En Argentina, Brasil, Paraguay y Uruguay se reportó altos y
extensos niveles de resistencia a los antihelmínticos, creyéndose,
que los grupos más utilizados, benzimidazoles y levamisol/morantel,
habían llegado al fin de su efectividad terapéutica (Márquez,
2007). Entre los ganaderos, la selección de los principios activos
usados para el control de los parásitos internos se basa en la
disponibilidad, precio y en los resultados que ellos perciben de
sus propios esfuerzos. Márquez (2007) y Benavides (2007) coinciden
en señalar algunos factores de importancia asociados con la
resistencia de NGI a productos químicos, sobresaliendo entre
ellos:
Tamaño de la población en refugio (hábitat y localización de los
parásitos que se pretende remover)
Inmunidad del hospedero (fisiología del huésped)
6
Antihelmínticos adecuados (uso del mismo principio activo y de
larga acción)
Tratamientos estratégicos (técnicas de administración de diversos
antihelmínticos e intervalos, intensidad y dosis de los
tratamientos)
Conocimiento de las contraindicaciones
El concepto de parásitos en refugio juega un papel más importante
en la resistencia antihelmíntica actualmente que otros factores
comúnmente mencionados como son la frecuencia de tratamientos y las
sub- dosificaciones (Márquez, 2007). Refugio se refiere a la
proporción de la población parasitaria que no está expuesta a una
medida de control en particular, escapando así a la selección para
resistencia (Van Wyk, 2001). En el caso de los NGI, esto incluye
generalmente la proporción de la población de nematodos que vive
fuera del huésped, en la pradera. Cuando este número en refugio es
alto, las larvas que son ingeridas por los huéspedes son pocas en
relación a las que permanecen en las praderas tras el pastoreo.
Estas mantienen su característica de susceptibilidad y su capacidad
de aportar estos genes en los cruces con las poblaciones de
nematodos expuestas a antihelmínticos que fueron seleccionados por
resistencia, dando como resultado híbridos con características de
susceptibilidad que permiten retrasar la aparición de poblaciones
de parásitos resistentes (Márquez, 2007).
Muchos individuos del refugio suelen perderse como consecuencia de
condiciones ambientales (rayos solares, desecación), depredadores o
simplemente porque no coincidieron con el huésped apropiado y
llegaron al límite de sus reservas (Papadopoulos et al., 2001).
Esta condición junto con una inadecuada rotación de potreros y un
inadecuado suministro de antihelmínticos en épocas de sequía causa
una desaparición casi en su totalidad de la población en refugio.
En esta situación se incrementa la presión de selección porque los
parásitos resistentes que han sobrevivido tienen la oportunidad de
repoblarse en las praderas que están poco pobladas. La relevancia
epidemiológica de este proceso, está basada en el enorme potencial
biótico de los parásitos, que les permite cambiar sucesivamente la
composición genética del refugio (Johnsonn, 2003).
De acuerdo con la Organización de las Naciones Unidas para la
Agricultura y la Alimentación (FAO, 2003), el concepto MIP (Manejo
Integrado de Plagas) aplicado a la ganadería implica el uso
conjunto de diversas herramientas y estrategias químicas y no
químicas de control, para lograr la mayor eficiencia en su
combinación, manteniendo los plagas a niveles inferiores a su
umbral de daño, minimizando el uso de químicos. En términos de
resistencia parasitaria se creó el concepto del control Integrado
de Parásitos (CIP) que se describe a continuación.
7
3.1 MÉTODOS INTEGRADOS DE CONTROL DE PARÁSITOS GASTROINTESTINALES
Debido a que la dependencia de los antiparasitarios químicos para
el control de los parásitos ha resulta insostenible ambiental,
económica y socialmente por el incremento de los costos, la
aparición de la resistencia parasitaria y la presencia de residuos
químicos de los antiparasitarios en carne y leche, se hace
necesario el cambio de estos enfoques de control, siendo el enfoque
del Control Integrado de Parásitos el esquema propuesto en la
actualidad para un adecuado control de parásitos (Márquez, 2007),
en tanto la combinación de distintas herramientas ha demostrado
mayor eficiencia. El Control Integrado de Parásitos (CIP) combina
varias herramientas de control, a efectos de desestabilizar la
formación de aquellas poblaciones parasitarias con mayor proporción
de individuos genéticamente resistentes, manteniendo un nivel
adecuado de productividad en los sistemas de producción ganadera
(Benavides, 2007). El principio de estos métodos es que la
eliminación de la máxima cantidad de parásitos internos de los
rumiantes no es necesaria, y que de hecho, la sobrevivencia de
algunos de estos puede ser beneficiosa (Van Wyk, 2001; Vercruysse y
Dorny, 1999; Waller, 1999, citado por Ketzis et al., 2006). Algunos
investigadores han indicado que la máxima la eficacia de los nuevos
métodos de control de parásitos gastrointestinales depende del
conocimiento epidemiológico, de la especie del huésped (vaca, oveja
o cabra), el estado fisiológico de los animales (estado inmune,
exposición previa, nivel nutricional y estado de producción), el
nivel de infección, el estrés ambiental (condiciones climáticas),
la especie parasitaria y el sistema de manejo de los animales
dentro de la explotación (Corwin, 1997; Stromberg, 1997; Stromberg
y Averbeck, 1999; Vercruysse y Claerebout, 2001; Citado por: Ketzis
et al., 2006) Todos estos factores determinan un umbral económico,
entendido como el máximo número de parásitos adultos y/o larvas que
un heospedador puede tener sin experimentar una disminución en los
parámetros de producción (Jonsson, 2005). El CIP, que busca la
sostenibilidad del sistema de producción combinando diferentes
alternativas (químicas y no químicas) de control, ha demostrado ser
más eficaz que la dependencia en un sólo método de control y además
considera la creciente demanda por productos provenientes de
sistemas de producción orgánica o limpia (Chafton, 2006). De
acuerdo con Niezen et al. (1995) se ha utilizado forrajes ricos en
taninos como medida alternativa de control de helmintos en ovejas,
reduciendo el uso de químicos, el costo en el tratamiento y
mejorando el manejo del rebaño, (Cenci et al., 2007) al mismo
tiempo que se asegura una adecuada nutrición.
8
4. LOS TANINOS EN LEGUMINOSAS
Los taninos se encuentran ampliamente distribuidos en tallos, hojas
e inflorescencias de diversas especies forrajeras y plantas
dicotiledóneas. Junto con la lignina hacen parte del grupo de
polifenoles, que son componentes secundarios, que las plantas
tienen para defenderse contra el ataque de microorganismos (hongos
patógenos, virus y bacterias) y la destrucción por herbívoros
(insectos y vertebrados) (Pabón y Ossa, 2005). Los taninos se
clasifican en base a su estructura molecular en taninos condensados
(TC) o taninos hidrolizables (TH), siendo los primeros los más
abundantes en la naturaleza. Los TH tienen un carbohidrato en
posición central (Figura 1), generalmente d-Glucosa y presentan
bajo peso molecular (500-3,000 dalton) haciéndolos más solubles en
agua y de fácil absorción en el intestino delgado por lo que son
potencialmente tóxicos para los rumiantes cuando se suministran en
grandes cantidades sin el suficiente tiempo de adaptación de la
flora microbial (Min et al., 2003, citado por Márquez y Suárez,
2008). Los TC no tienen carbohidratos y son polímeros compuestos de
flavan 3-ol (catequinas), flavan–3-4-diol (leucoantocianidina) y
sus derivados. Tienen un peso molecular entre 1900-28,000 y no son
fáciles de hidrolizar. Estos tienden a polimerizarse en productos
insolubles y estables en presencia de ácidos (Fahey y Jung, 1989)
unidos mediante enlaces carbono-carbono y no son susceptibles de
degradación enzimática anaerobia. Por lo general los TC se
encuentran en las vacuolas y pueden presentarse en forma libre
(soluble o extractable) o ligados (insoluble) a proteínas o a los
carbohidratos de la pared celular; .Solamente los TC solubles son
responsables de la depresión en la digestibilidad de la proteína y
de la fibra (Barahona y Lascano, 1996; citado por Pabón y Ossa,
2005) en rumiantes. ..
Figura 1. Estructura química de los taninos hidrolizables (A) y
condensados (B)
A B
9
Fuente: Hess, H.; Noto, F. y Tiemmann, T. Efecto del sitio de
producción en la composición química y las
características de fermentación ruminal de Caliandra calothyrsus
var. Patulul. Segundo Taller Tninos en la nutrición
de rumiantes en Colombia. Memorias. Editores: Hans Dieter Hess,
Julia Gómez y Carlos Lascano. Publicación
CIAT, n 352, ISBN 958-694-087-X. Cali, Colombia, 2006. Citado por
Márquez, D. y Suárez, A. 2008.
4.1 TANINOS CONDENSADOS Y SU CONCENTRACIÓN Como resultado de
numerosos estudios se ha concluido que hay varios factores que
determinan la concentración de TC en leguminosas forrajeras. Entre
estos factores están la especie de la planta (factores genéticos),
la madurez de la planta, la temperatura ambiental, la humedad del
suelo y la fertilidad del suelo (Lascano et al., 2000; Acuña et
al., 2003). En la Tabla 1 y Tabla 2 se resumen los contenidos de
taninos y sus pesos moleculares en especies forrajeras de trópico
alto.
Tabla 1. Concentración de taninos totales en plantas de clima
templado.
Fuente: Terril et al. (1992); Barry y McNann (1999). Tomado de
Otero e Hidalgo (2004)
Tabla 1. Fenoles totales y cantidad de taninos en forrajes
leguminosos
tropicales (g/kgMS)
Fuente: Norton, B.(1999). Tomado de Márquez y Suárez (2008)
En la revisión realizada por Lascano et al. (2000) se resumen
estudios realizados bajo condiciones controladas en cámaras de
crecimiento e invernaderos. Los resultados en general muestran que
la concentración de TC en el follaje incrementa en especies como
Lotus pedunculatus y L. cuneata cuando la temperatura ambiental
aumenta. Por otra parte, la falta de humedad (sequia) en el suelo
es un factor de estrés que causa disminución en el rendimiento de
biomasa y aumento en la concentración de TC en la planta.. Tanto en
leguminosas de clima templado y tropical la concentración de TC
aumenta cuando los nutrientes del suelo son deficientes y afectan
el crecimiento de la planta. Adicionalmente, la fertilización con P
y S han mostrado reducir la concentración TC de algunas de las
leguminosas de clima templado (Lotus sp.) y tropical (Desmodium)
(Lascano et al. 2000). Shultze-Kraft y Benavides (1998, citado por
Schmidt, et al., 1997, citado por Pabón y Ossa, 2005) señalaron que
el contenido de taninos de una misma especie de planta puede variar
bajo idénticas condiciones ambientales y puede variar también entre
accesiones, como fue reportado en Desmodium ovalofolium por Lascano
y Barahona (1997). En general, la concentración incrementa con la
madurez y va directamente asociada al incremento de lignina que
esta inversamente relacionada a la digestibilidad. Es decir, a
grandes cantidades de lignina, se espera encontrar grandes
cantidades de taninos y una disminución considerable en la
digestibilidad y palatabilidad del forraje.
11
Estudios realizados por Cano et al. (1994; citado por Pabón y Ossa,
2005) describen que en plantas de trópico alto (ej. Flemingia
macrophylla) el 79% de los taninos fueron extractables (solubles) y
sólo el 14% estuvieron ligados a proteínas. Este mismo grupo de
trabajo describió, al igual, algunas variedades de leguminosas de
trópico alto (clima templado) y encontraron que la fracción de
taninos extractables fue del 55% y que los taninos ligados a
proteínas llegaron al 32%. Recordando que los problemas de
digestibilidad se asocian a las fracciones extractables es
importante determinar dietas particulares e identificar los efectos
nutricionales de los taninos en los animales, cuantificar estos
factores y conocer la estructura química y la fisiología del animal
objeto de estudio (Sturm et al., 2007).
4.2 EFECTOS NUTRICIONALES Y ANTIPARASITARIOS DE LOS TANINOS
CONDENSADOS 4.2.1 Efectos Nutricionales: Existe un creciente
interés en integrar leguminosas con TC en las dietas de los
rumiantes debido a que pueden resultar en proteína de paso, que es
proteína que escapa la degradación en el rumen y llega al intestino
delgado, lo cual repercute en forma positiva en producción de leche
y carme. En los estudios con TC se han encontrado cuatro tipo de
enlaces que son dependientes del pH y reversibles: covalentes,
iónicos, puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas, siendo
los dos últimos los más frecuentes (Min et al., 2003, citado por
Márquez y Suárez, 2008). Cada proteína tiene su pH distintivo y
óptimo para unirse a los TC. Un ejemplo de esto es la albúmina del
suero bovino que puede unirse a los TC en un pH de 4.1 a 6.1 y
disociarse cuando el pH es menor a 3.5 (Jones y Mangan, 1997,
citados por Min et al., 2003, citados por Márquez y Suárez, 2008).
En general, en un rango de pH de entre 5 y 7,5 en el rumen e
intestino delgado, la proteína permanece unida a los taninos, pero
a pH bajos (pH < 3,5) (Hagerman et al., 1992) o >8 (Andrabi
et al., 2005, citado por Márquez y Suárez, 2008) la proteína es
ligada por TC es liberada. Otros factores que influyen en el grado
de enlaces de TC-proteína son su peso molecular, y su estructura
química. En la leguminosa Lotus corniculatus los TC están
compuestos principalmente por unidades de Cyanidina mientras que en
Lotus pedunculatus los TC están compuestos por unidades de
delphinidina que los hace ser mas reactivos con proteínas en
comparación con los TC de L. corniculatus (McNabb et al, 1997).
Estas diferencias en la estructura química de los TC en leguminosas
pueden tener implicaciones no solo en la protección de proteína
dietética sino también en su capacidad de controlar parásitos
gastrointestinales. Se sugiere, por lo tanto, que para
12
poder entender el efecto de TC presentes en leguminosas forrajeras
en el control de parásitos gastrointestinales es necesario no solo
estudiar los efectos de concentración, sino también el efecto de su
estructura química definida esta en términos de composición
monomérica. La concentración de TC también afecta el efecto de
estos en la nutrición de rumiantes (Otero et al. 2004). Por
ejemplo, se ha encontrado que a altas concentraciones de TC (5-10 %
de la materia seca), se deprime el consumo y la digestibilidad del
forraje mientras que a menor concentración (2-4 % de la materia
seca), se reducen las pérdidas de amonio en el rumen producida por
la proteólisis por los microorganismos y se incrementa la cantidad
de proteína que llega y es absorbida en el duodeno (proteína de
paso o sobrepasante) (Waghorn et al., 1997; citado por: Otero et
al., 2004). Ésto en virtud a la capacidad que tienen los TC para
unirse a las enzimas y formar complejos polifenoles con un efecto
inhibidor sobre celulasa, ureasa celulasa, ureasa, alda-amilasa,
proteasas, beta-glucosidasa y lipasa . Al inhibir las enzimas
proteolíticas se reduce, consecuentemente, la degradación de la
proteína de la dieta (McSweeny et al., 2001, Min et al., 2005,
citado por Márques y Suárez, 2008) aumentando su absorción en
intestino delgado. 4.2.2 Control de parásitos: Existen reportes en
lo9s cuales se señala que los TC presentes el leguminosas actúan
sobre los parásitos. Así, por ejemplo, Niezen et al. (1995) indica
que se han utilizado forrajes ricos en TC como medida alternativa
de control de helmintos en ovejas, reduciendo el uso de químicos,
el costo en el tratamiento y mejorando el manejo del rebaño (Cenci
et al. 2007), al mismo tiempo que se asegura una adecuada
nutrición. El efecto de las plantas ricas en taninos más
comúnmente
reportado es una notable disminución del conteo de huevos en
materia fecal. En algunos estudios. se ha encontrado una
disminución de la carga parasitaria cercana al 50% cuando se usan
especies de leguminosa del
género Lotus con respecto a alfalfa y raigrás (Niezen et al 1995).
Hekerdon
et al. 2007 reporta que el L corniculatus redujo la cantidad del
parásito en abomaso (H. contortus) y disminuyó el conteo de huevos
en materia fecal en un 60 % con respecto control. Dado que la
proteína ligada a los TC no es degradada en el rumen, está
disponible para la digestión en el abomaso e intestino delgado. La
disociación de los complejos taninos- proteína en el tracto
digestivo posterior debido a cambio de pH resulta en proteína
sobre-pasante que podría resultar en un efecto indirecto en control
de parásitos ya que una mayor absorción de proteína mejora el
estado inmunológico del animal e incrementa la respuesta inmune a
los PGI (Min et al., 2000, citado por Min et al., 2003 y
13
MacRae, 1993; Barry y McNabb, 1999, citado por Min et al., 2003)
desarrollando resistencia (Van Houter y Sykes, 1996; Donaldson et
al., 1997; citados por: Iqbal et al., 2007; Mangan, 1988; citado
por: Mateos-Sanza et al., 2005). Asimismo, este mecanismo de
protección puede causar un efecto directo en el parásito al
producir una reducción en la disponibilidad de proteína para los
mismos y por ende un estado de inanición de la larva y su
consiguiente muerte (Iqbal et al., 2007). En otros estudios se ha
comparado el efecto de leguminosas con y sin TC. Por ejemplo,
Niezen et al (1995) evaluaron el efecto de Sulla (con TC) y alfalfa
con ovinos en pastoreo a los cuales dosificaron con 20.000
Trichostrongylus colubriformis, y un grupo fue tratado
farmacológicamente. Los resultados indicaron que no hubo
diferencias significativas en ganancia de peso y producción de lana
dentro de los animales tratados que pastoreaban las dos
leguminosas. Sin embargo, en el grupo de los animales no tratados
con antihelmínticos, se observó una ganancia de peso significativa
los que pastoreaban Sulla con TC (129g/día vs. -39g/día). Cuando se
sacrificaron los animales, en los no tratados y que pastorearon
Sulla, el conteo de huevos y el número de T. colubriformis fue
menor que en los animales que pastorearon alfalfa (Figura 2).
Figura 2 . Conteo de hpg en corderos parasitados no tratados
farmacológicamente pastoreando alfalfa o sulla. (Niezen et al.,
1995).
Forrajes como la Sericea lespedeza (SL) y la Sulla demostraron una
reducción significativamente alta en el conteo de huevos en la
material fecal (1320 and 2220 huevos/g, respectivamente) en
comparación a la leguminosa Medicago sativa (sin TC) (Niezen et
al., 1995). En estudios recientes, Min et al. (2004) encontró que
el pastoreo de SL inhibe el desarrollo de larvas y Butter et al.
(2000, citado por Min et al., 2004) sugiriere que los TC extraídos
de hojas de Quebracho (Schinopsis spp.) tienen una acción
antihelmíntica directa en Trichostrongylus colubriformis (intestino
delgado).
14
A través de estudios realizados in vitro, Molan et al. (2000,
citado por Cenci et al., 2007) demostró que extractos de taninos de
sulla y Lotus spp. inhibieron el desarrollo de huevos de T.
colubriformis a L1 y de L1 a L3. La motilidad de la larva también
se redujo y se encontró una mortalidad del 20%. Estos autores
sugieren que los forrajes que contienen TC pueden alterar el ciclo
de los nematodos y reducir la contaminación en las pasturas con L3.
Estudios han demostrado que la ingesta de leguminosas con TC
incrementa la disponibilidad de aminoácidos esenciales, lo que
conlleva a un aumento del crecimiento corporal (Aerts et al., 1999;
citado por: Iqbal et al., 2007) y a su vez en un efecto indirecto
en el desarrollo de resistencia parasitaria por mejor nutrición del
los animales. En otros estudios se ha reportado que los TC causan
un aumento de la hormona de crecimiento. En ovejas alimentadas con
forrajes con TC provenientes de L. pedunculatus se encontró una
correlación positiva entre su concentración en la dieta y los
niveles plasmáticos de la hormona de crecimiento (Barry et al.,
1986; citados por: Iqbal et al., 2007) estimulando por esta vía la
retención de nitrógeno en el animal (Muir et al., 1983. citados
por: Iqbal et al., 2007). Un mecanismo de acción directa de los TC
sobre el control de nematodos propuesto por Iqbal et al. (2007) es
el de la unión de estos a la cutícula de la larva, la cual está
compuesta por una alta cantidad de glicoproteínas (Thompson y
Geary, 1995.), que al ser destruidas y disminuidas producen la
muerte del parásito. Asimismo se ha reportado que cuando hay una
alta carga parasitaria, los TC minimizan algunos efectos adversos
como son episodios de diarrea (Nietzen et al., 1995; Robertson et
al., 1995; citados por: Iqbal et al., 2007). Por otro lado, dado
que los TC no son totalmente absorbidos en el tracto digestivo
(Terrill et al., 1994; citados por: Iqbal et al., 2007), puede
haber una alta concentración de estos en la heces, lo cual de
suceder podría afectar la eclosión de los huevos de los nematodos,
causando una disminución en la contaminación de los pastos (Iqbal
et al., 2007). En varios estudios se encontró que cuando se
descontinuaba la administración de TC, aumentaba la excreción de
huevos de T. colubroformis y Haemonchus contortus (Athanasiadou et
al., 2000; Min et al., 2005; Lange et al., 2006; citado por:
Heckendorn et al., 2007), lo cual sugiere que los TC
reducen temporalmente la fecundidad de la hembra y directamente a
los
parásitos adultos. El efecto directo de los TC sobre parásitos
gastrointestinales se ha comprobado en ensayos in vitro, en los
cuales se ha demostrado que al incubar larvas parasitarias en
extractos crudos de TC se reduce su
15
desarrollo, viabilidad, motilidad y habilidad migratoria
(Athanasiadou et al., 2007; Butter et al., 2001 Molan et al., 2002;
citado por Ketzis et al., 2006). En estudios realizados por Ketzis
et al., (2006) se determino que la acción directa de los TC en la
mayoría de los casos resulta en un control aproximado al 100%.
Finalmente, Heckendorn et al. (2007) indican que el control
efectivo de parásitos con TC en experimentos in vivo e in vitro
realizados en periodos cortos de tiempo con cabras y ovejas soporta
la hipótesis de un efecto directo de los TC sobre parásitos
gastrointestinales, ya que en estudios de corto plazo el tiempo
para permitir el desarrollo y expresión de una respuesta inmune del
hospedador es poco (Molan et al., 2000b, 2003; Paolini et al.,
2003a, 2004; Heckendorn et al., 2006). Además, estudios realizados
por Min et al.,(2005) con animales menores de 6 meses, incapaces de
responder inmunitariamente a una infección de nematodos, muestran
una efectividad considerable sugiriendo un efecto directo de los TC
contra los PGI. En resumen, los resultados en la literatura
muestran el gran potencial que tiene el uso de compuestos orgánicos
naturales como son los TC para reducir el impacto de las
infecciones parasitarias, disminuyendo así el problema de las
resistencias a vermífugos comerciales, pérdidas económicas por
infecciones y contribuyendo al desarrollo de una agricultura
orgánica que actualmente presenta una gran demanda por muchos
consumidores. 5. METODOLOGÍA PARA EVALUAR LA EFECTIVIDAD DE LOS
TANINOS EN EL CONTROL DE PARÁSITOS GASTROINTESTINALES
Se sabe que a través de estudios in vitro se puede evaluar el
potencial de los TC presentes en leguminosas de climas templados
(ej. Sabana de Bogotá) y cálidas en el control directo de parásitos
internos en ovinos. La prueba más usada mundialmente para probar la
eficacia de antihelmínticos es la de reducción en el conteo de
huevos (FECR, por sus siglas en inglés) (Coles et al., 1992, citado
por Várady et al., 2005). Aunque esta técnica estandarizada es muy
buena, resultan más económicas y prácticas de realizar pruebas in
vitro en un principio. La prueba de eclosión de huevos (egg hatch
test –EHT) y la de desarrollo larvario (larval development test –
LDT) son las más usadas in vitro (Mitchel et al., 1991; Hong et
al., 1992; Bartley et al., 2003, citado por Várady et al., 2005). A
continuación se describen los métodos in vitro empleados para
evaluar la efectividad de TC purificados de leguminosas contra
larvas y huevos de nematodos recolectados en heces de ovejas
infestadas. Se describe además, la metodología para la obtención de
los TC purificados, la
16
recolección de la materia fecal, los coprocultivos, la obtención de
larvas y su identificación por género y hasta especie, la
separación de los huevos y la evaluación del efecto ejercido en
huevos y larvas de nematodos gastrointestinales en función de los
TC. 5.1 PURIFICACIÓN DE TANINOS CONDENSADOS Una vez se haya
seleccionado la leguminosa con la que se quiere trabajar para la
evaluación de la actividad antiparasitaria de sus TC se debe cortar
la parte foliar de la misma y emplear métodos para la conservación
de la muestra que alteren lo menos posible el nivel y la actividad
biológica de éstos (Pabón y Ossa, 2005). Cano et al. (1994, citado
por Pabón y Ossa, 2005) indican que la liofilización es el mejor
método de conservación de las muestras para el análisis de taninos,
conclusión a la que llegaron después de comparar con el secado al
horno (60 C) y la conservación de hojas frescas y congeladas. Estos
autores encontraron que en varias leguminosas secadas al horno se
reducían los TC extractables y se generaba un aumento de los TC no
extractables en comparación con las muestras liofilizadas. Los
extractos de taninos de leguminosas pueden obtenerse por los
métodos que a continuación se describen, cuyos resúmenes aparecen
en el artículo Métodos de Extracción y Caracterización de Taninos
Condensados, Utilizados en CIAT, Ventajas Y Desventajas (Vargas P,
A. 2006). 5.1.1 Protocolo A de purificación de taninos condensados:
El protocolo está basado en el descrito por Jones et al., (1976);
Foo y Porter, (1981) y Horigome et al., (1988) en el cual la se usa
como solución extractora (taninos solubles): acetona 70% más acido
ascórbico 0.1%, eter dietílico, etil acetato, metanol (50%),
acetona (70%), Sephdex LH-20. Para la extracción y cuantificación
de taninos libres o extractables se pesan 15-20g de forraje en
erlenmeyers de 250 ml y se adicionan 45 ml de la solución
extractora (acetona más ácido ascórbico) hasta que quede totalmente
mojado el forraje. Luego los frascos se agitan por aproximadamente
75 minutos y se pasa la muestra de los erlenmeyers a tubos falcon
de 50 ml usando embudos con doble gasa. A los tubos se les adiciona
igual cantidad de eter dietílico, y se agita y succiona el eter por
vacío, realizando este lavado por tres veces con similar volumen
(10 ml/muestra). El paso anterior se repite tres veces, pero
adicionando etil acetato, agitando y succionando por vacío. Luego
se evapora la acetona, eter y etil acetato preferiblemente en un
concentrador de muestras (con agujas). Las muestras
17
se almacenan en la nevera hasta el día siguiente. Al otro día, se
agrega metanol 50% (50 ml), se agita con el vortex y se centrifuga
por 15 minutos a 3500 rpm. Se transvasa el sobrenadante a las
botellas con sephadex con cuidado quedando en el fondo el pellet
que se descarta. A las botellas de sephadex más extractos de
taninos se les adiciona metanol 50% (130 ml) a cada botella y se
agita muy bien antes de centrifugar por 5 minutos a 3500 rpm (botar
el sobrenadante). Se repite el proceso de centrifugación de Sepadex
más metanol hasta que el líquido quede transparente. El número de
centrifugaciones depende de la muestra. Cuando el líquido este
transparente se cambia el metanol 50% por acetona al 70% y se
repiten las centrifugaciones por 5 minutos cada vez recuperando el
sobrenadante en tubos nuevos con papel filtro. El sobrenadante
recuperado en beakers llevar al concentrador de muestras para
evaporar la acetona. Paso posterior congelar y llevar al
liofilizador (2-3 días). El rendimiento de taninos purificados,
varía según la especie de leguminosa. Preparación del Sephadex:
Compuesto que ayuda a extraer los taninos, se pesan 10 g de
Sephadex LH-20 se adiciona metanol 50% (130 ml), centrifugar por 15
minutos a 3500 rpm. (repetir este paso por 3 veces). Almacenar en
nevera, proteger de la luz. 5.1.2 Protocolo B de purificación de
taninos condensados: En este procedimiento desarrollado por Carulla
(Comunicación Personal) se utiliza como solución extractora alcohol
al 96% (70%), agua destilada ( 30%), acido fórmico (0.5%),y acido
ascórbico (0.05%). Esta solución extractora se complementa con una
solución de acetona al 50%. Se debe además preparar una columna de
Sephadex LH-20, pesando 15 g de Sephadex LH- 20 y adicionando
alcohol al 96%, a cual se debe refrigerar un día antes. El material
de leguminosa a la cual se le va a extraer los TC se pesa en el
erlenmeyers 40 g de leguminosa y se adiciona la solución extractora
(400 ml) y se agita en el shaker (60 minutos). Posteriormente la
mezcla es filtrada a un beaker utilizando un embudo con filtro
(whatmanfibra de vidrio cat1820 de 150 mm de diámetro) y gasa
doble. El filtrado se pone en el concentrador por espacio de 30
minutos para nivelar los volúmenes, se pasa por la columna y se
centrifuga con alcohol al 96% hasta que este completamente
transparente. Cuando está listo, se cambia el proceso con acetona
al 50% y se alistan beakers pirex con filtros de 150 mm para
recoger el sobrenadante que contiene los taninos. Una vez se ha
evaporada la acetona se coloca gasa a los beaker y se llevan al
congelador para posterior liofilización. 5.2 RECOLECCIÓN DE HECES
FECALES
18
En esta sección se resume la metodología de recolección y
procesamiento que se encuentra en la guía RVC/FAO para el
diagnóstico parasitológico veterinario y en el capítulo de
diagnóstico parasitológico del libro Parasitología para
Veterinarios de Bowman y colaboradores (2004). Para la recolección
de la materia fecal se necesita el siguiente equipo:
Botella de tapa-rosca con boca ancha.
Recipientes de plástico con tapas.
Guantes desechables para toma de muestras
Bolsas de plástico
Marcador para etiquetado
Contenedor térmico para transporte de muestras (recipiente de
icopor, aserrín y hielo)
Refrigerador en laboratorio apropiado para almacenamiento de
muestras fecales (4 °C)
Las muestras para examen parasitológico son, preferiblemente,
tomadas directamente del recto o mientras el animal defeca sin
dejar tocar el piso para evitar la contaminación por nematodos de
vida libre o parásitos de vegetales (Vázquez y Herrera, 2005). Se
deben usar guantes desechables apropiados. El recipiente de las
heces se debe llenar a toda su capacidad antes de cerrar con la
tapa o atar el guante desechable tan cerca de las heces como sea
posible. Es importante excluir el aire del recipiente dado que esto
retardará el desarrollo de los huevos. Cada muestra debe ser
cuidadosamente etiquetada con la identificación del animal del que
se toman las heces, la fecha y el lugar de colecta. Si se hace un
banco de heces, las bolsas se rotulan según el grupo de animales
(ej. Edad de los animales). Tan pronto como las muestras lleguen al
laboratorio se almacenan en un refrigerador a una temperatura de
4°C hasta que estas sean procesadas a fin de que las estructuras
parasitarias presentes en las heces no continúen su desarrollo
embrionario. Las muestras se pueden mantener en refrigeración hasta
por tres semanas sin presentar cambios significativos en el conteo
de huevos y en su morfología. Si no es posible almacenar las
muestras en un refrigerador por algún tiempo después de su
colección, se les puede añadir solución salina fisiológica
formolada (SSFF al 5% en proporción de una parte de heces por tres
de solución. Sin embargo, estas heces no servirán para coprcultivo
sólo para coproscópico. Para la preparación se requiere de formol
comercial (50 ml), cloruro de sodio (8g) y agua destilada (1,000ml)
(Vázquez y Herrera, 2005):
19
5.3 DILUCIONES DE TANINOS CONDENSADOS En los estudios in vitro las
larvas y huevos obtenidas se exponen a los extractos de taninos en
diferentes diluciones (i.e, 100μg/ml, 200μg/ml y 300μg/ml). En cada
prueba es necesario tener un control positivo (benzimidazol o
albendazol) , si se trabaja con huevos, (0.55 mg/ml) y un control
negativo usando una solución de PBS Tampón Fosfato salino)
recomendado por Várady et al. (2006) o acuoso o metanólico como
describe Paramita et al. (2006). Es recomendable la adición de
amphotericin B a una concentración de 5μg/ml a la suspensión de
huevos para inhibir el crecimiento de hongos (Várady et al., 2006).
Los platos/recipientes se incuban por 7 días 27C y la incubación se
da por terminada con la adición de 10μl de Lugol (solución), si no
se va a evaluar motilidad de las larvas. Se han utilizado
cantidades variables de huevos y larvas para la evaluación del
efecto de diferentes concentraciones de TC in vitro. Várady et al.
(2006) dice que en cada pozo debe haber como mínimo 300 huevos. En
el caso de las larvas según comunicación personal con Márques
(2009) debe haber como mínimo 1,500 mientras que Paramita et al.
(2006) indica que con 50 larvas es suficiente. 5.4 COPROCULTIVO
PARA LA RECUPERACIÓN DE LARVAS Y HUEVOS Es importante tener en
cuenta que las distintas especies de nematodos tienen condiciones
óptimas distintas para la eclosión, desarrollo y supervivencia. En
consecuencia, la abundancia relativa de especies de larvas de fase
3 obtenidas de los cultivos no es una función directa de la
abundancia relativa de especies de huevos de estrongiloides que
había en un principio. Le Jambre et al., (2007) constataron que
aunque se encuentre una proporción alta de larvas de H. contortus
en cultivo, el Trichostrongylus spp. puede ser la causa principal
de parasitosis in vivo dado que la capacidad de ovoposición de H.
contortus es mucho mayor. Siempre que hay huevos de Haemonchus
contortus o Strongyloides en las heces, las larvas de estas
especies acostumbran a predominar en el cultivo. Soulsby, 1994
(citado por Vázquez, 2004) anota que por su característica
reproductiva Haemonchus spp. es considerado uno de los nematodos de
mayor diseminación en los potreros ya que una hembra adulta y
madura sexualmente llega a ovopositar de 5,000 a 10,000 huevos por
día. Teniendo en cuenta lo anterior, Heckerdon et al. (2007)
describieron un método de cultivo de materia fecal y separación de
larvas. Cada muestra de 2g de materia fecal debe ser homogenizada
para asegurar la distribución uniforme de los huevos. Estos se
cuentan (FEC: Fecal egg count) para determinar el número de los
mismos pre-cultivo. Para cada cultivo, se
20
colocan 12g de la materia fecal en envases de poliestireno y se
incuban por 10 días a 20C, bajo condiciones de máxima humedad.
Posteriormente, las larvas se extraen por 24h usando un aparato de
Baermann y se transfieren a tubos Falcon. Una vez identificadas las
larvas se cuentan en 10 alícuotas de 50μg (500μg) y el valor se
extrapola al volumen total del cultivo. Bowman et al. (2004)
propusieron un método de cultivo de heces y obtención de larvas.
Con este método se parte del hecho de que las heces bien formadas
de ovejas contienen una cantidad adecuada de agua, por lo que
habitualmente se pueden cultivar simplemente colocando algunas
bolas en un frasco tapado lavado con una solución de carbonato
sódico al 0.1% para inhibir el crecimiento de los hongos y dejando
el frasco en una mesa o estante oscuro a temperatura ambiente
durante 7 a 10 días. Para esto, las paredes del frasco siempre
tienen que estar cubiertas con gotas de humedad condensada, de lo
contrario se deben añadir algunas gotas de agua o solución de
carbonato sódico. Cuando se vuelve a sacar el frasco a la luz tras
la incubación enseguida se observan las larvas agitándose en las
gotas de condensación de las paredes del frasco. Cuando las larvas
se encuentran nadando en las gotas de humedad condensada en las
paredes del frasco de cultivo se procede a hacer lo
siguiente:
Lavar el frasco con una pequeña cantidad de agua y recoger la
solución de lavado
Someter la solución de lavado a centrifugación.
Poner a decantar el tubo antes de retirar el sobrenadante para
evitar pérdida de larvas
Así se puede recoger el sedimento que contiene las larvas en un
pequeño volumen de agua retenido por cohesión y transferir con una
pipeta a un portaobjetos para mirar bajo el microscopio. En la
literatura existe una técnica de cultivo de materia fecal y
separación de huevos en la que la materia fecal es licuificada y
separada en grupos que van entre 100 y 200g (Várady et al. (2006).
Los huevos de nematodos son colectados al pasar la materia fecal
procesada por varios tamices (poros de 250, después de100 y
finalmente de 20μm) El material retenido en el último tamiz se lava
con agua y sedimentados. Los huevos son posteriormente recuperados
por flotación con una solución salina saturada. Por otra parte,
Hubert et al. (1982) describe dos métodos de cultivo larvario bajo
la premisa de que para el desarrollo de larvas de vida libre se
requiere un ambiente adecuado (temperatura, humedad, oxigenación y
nutrición). Uno
21
de los métodos intenta controlar estas variables y se basa en la
separación de los huevos de la materia fecal. Estos huevos se lavan
y se incuban en agar-agar neutro al que se le adiciona un medio
nutritivo (Solución salina de Earl’s fortificada con extracto de
levadura), a una temperatura de 22-23C con una humedad relativa de
85-90%. Trece días después se recolectan las larvas lavando
suavemente el fondo del medio de cultivo y pasando por una malla
los volúmenes recolectados. El otro método descrito por Hubert et
al.,(1982) empieza con una muestra de materia fecal fresca de 1250g
que se homogeniza para posteriormente estimar la cantidad de huevos
por gramo en 10 alícuotas de 1ml cada una. Después del conteo de
huevos los 1200 gramos restantes se distribuyen en 25 vasos de
vidrio (14 x 9.5 x 4 cm) tapados, en los que se han introducido 40g
de materia fecal previamente homogenizada. Tras el conteo de huevos
se estima que cada vaso contiene 22,000 huevos de Strongylídos. Las
condiciones del cultivo incluyen una incubadora humidificada que
mantenga una temperatura de 22-23C y una humedad relativa de
85-90%. La oxigenación se mantiene tras mezclar diariamente con una
espátula los cultivos. La extracción de larvas se realiza trece
días después. La Guía RVC/FAO para el Diagnóstico Parasitológico
Veterinario propone un cultivo larvario en el que no es necesario
una incubadora humidificada. Tras romper las heces en un recipiente
con una espátula u otro implemento de agitación se debe asegurar
que las heces estén húmedas y desmenuzables. Si las heces están muy
secas se debe añadir agua hasta obtener la consistencia correcta. Y
si por lo contrario, están muy húmedas se debe añadir carbón o
heces estériles de ovino hasta obtener la consistencia correcta.
Cuando ésta se logre se transfiere la mezcla a vasos o recipientes
plásticos o de icopor y se deja el cultivo a temperatura ambiente
por 14-21 días, tiempo en el cual las larvas deberán haber
alcanzado la fase infectiva (L3). Se añade agua a los cultivos
regularmente si la mezcla se está secando demasiado,
aproximadamente cada 1-2 días. Si se tiene disponible una
incubadora, el cultivo puede ser colocado a 27C y dejado por 7-10
días. Transcurrido este tiempo el recipiente se llena de agua y se
pone boca a bajo contra un recipiente Petri manteniendo una leve
inclinación para que las larvas sean transportadas hacia el borde
del recipiente de Petri.
Otra opción es la Técnica de Corticelli Lai descrita por Vázquez
(2004) en la que se pesan 20 g de heces y se homogenizan en agua
destilada. Éste homogenizado de heces se coloca en una caja de
Petri de 10 cm de diámetro extendiéndolo perfectamente. La caja de
Petri más pequeña junto con el contenido se colocan en la caja de
Petri de 15 cm de diámetro, a la cual se le agregan de 20 a 25 ml
de agua destilada y se tapa. Se incuba a 27 C se humedece con agua,
destapando una hora diariamente por 8 días. Transcurrido el tiempo
se coloca el líquido en un vaso de precipitado y se
22
inicia el conteo de larvas. Con esta técnica se obtienen larvas
totalmente limpias, no requiriendo emplear el aparato de Bearmann.
Es una técnica práctica en la que se puede encontrar presencia de
larvas al día siguiente. 5.4.1 Separación de larvas con la Técnica
de Baermann: La técnica de Baermann es usada para separar las
larvas del material fecal. Con esta técnica se toma un embudo y se
ajusta un pedazo corto de tubo en el cuello. Se cierra el tubo con
el clip. Se sujeta el embudo a una base sencilla. (Figura 3). Si se
requiere procesar más de una muestra al mismo tiempo se usa un
tablón con agujeros para colocar varios embudos. Luego se coloca
una doble capa de papel filtro (Figura 4) o toallas dentales sobre
una toalla de papel desechable o equivalente sobre la mesa de
trabajo. Se usa una cuchara o espátula para pesar o medir
aproximadamente 5-10 gramos de material fecal y se coloca la
materia fecal en el centro de la estopilla. Se forma una bolsa
conteniendo la materia fecal juntando las cuatro esquinas de la
estopilla y moldeándola alrededor de la misma. Esta bolsa que
contiene la materia fecal se coloca en el embudo y corta el exceso
de estopilla. Se llena el embudo con agua tibia, asegurándose que
la materia fecal quede sumergida. Esta materia fecal se deja
reposar en el aparato por 24 horas y se drenan unos cuantos
mililitros de fluido por el cuello del embudo hacia un tubo de
ensayo. Después se deja sedimentar por lo menos durante 30 minutos
o si se dispone de una centrífuga, el fluido puede ser drenado en
un tubo de centrífuga y centrifugarse a 1000 rpm por 2 minutos.
Posteriormente, se examina una muestra de sedimento en una lámina
porta objetos para lo cual se añade una gota de yodo para fijar la
larva y colocar cuidadosamente un cubreobjetos sobre la gota.
Cualquier nematodo de vida libre se coloreará de café oscuro muy
rápidamente mientras que las larvas de especies parásitas se
colorearán muy lentamente debido a que la vaina larvaria protege el
cuerpo. Las larvas se examinan en un microscopio compuesto con un
aumento de 10 x 10.
23
Figura 3: Embudo de Bearmann Figura : Embudo de Bearmann con papel
filtro.
5.4.2 Recolección de huevos: En la literatura se describe un método
de separación de huevos presentes en la materia fecal de animales
infestados que consiste en lavados con solución salina y posterior
sedimentación por centrifugación suave (Soulsby, 1982; citado por
Iqbal et al., 2006). Los huevos son lavados en agua destilada
varías veces y ajustados a una densidad conocida en agua usando la
técnica de McMaster (Whitlock, 1960; citado por: Iqbal et al.,
2006), que será descrita posteriormente. Otra alternativa de
recolección de huevos y larvas consiste en la colección de
parásitos adultos del abomaso (Haemonchus) de ovejas adultas en el
matadero en la que los parásitos son escogidos manualmente y
posteriormente coleccionados en una botella con PBS (solución
buferada – pH 7.2) (Iqbal et al., 2006). Después estos parásitos
son transferidos a solución salina al 0.9% e incubados a 37C por 24
horas. La técnica de separación de los huevos depositados por los
adultos es la misma descrita anteriormente. Éste método se puede
usar siempre y cuando se decida que las muestras se van a tomar de
animales (adultos en su mayoría) en el matadero. 5.5 CONTEO DE
HUEVOS CON LA TÉCNICA DE MC MASTER Esta técnica es usada para
contabilizar huevos de helmintos en muestras fecales utilizando
cámaras de conteo que permiten el examen microscópico de un volumen
conocido de suspensión fecal (2 x 0.15 ml). Por lo tanto, si se usa
un peso de heces y un volumen de líquido de flotación conocidos
para preparar la suspensión, entonces el número de huevos por gramo
de heces (h.p.g.) puede ser calculado. Las cantidades son elegidas
de tal manera que el conteo de huevos fecales puede ser fácilmente
derivado al multiplicar el
24
número de huevos dentro de las áreas marcadas por un simple factor
de conversión. Es indispensable para comparar la cantidad de huevos
que quedaron después de exponer los huevos a los diferentes
tratamientos (diluciones) y poder determinar el efecto de los TC en
los huevos de parásitos gastrointestinales. Para implementar la
técnica se pueden utilizar tres tipos de fluido de flotación. Éstos
son:
a. Solución salina saturada Gravedad específica: 1.18 - 1.20
Solución de propósito general. Cloruro de sodio: 400 gramos Agua:
1000 ml Revolver cuidadosamente antes de usar. Puede deformar los
huevos.
b. Solución Sal/azúcar Gravedad específica: 1.28 Solución de
propósito general. Cloruro de sodio: 400 gramos Agua: 1000 ml
Azúcar: 500 gramos Disolver la sal en agua para hacer una solución
saturada. Agregar el azúcar a la solución salina saturada. Revolver
hasta que el azúcar se disuelva.
c. Nitrato de sodio Gravedad específica: 1.18 Esta solución algunas
veces es usada para huevos de strongílidos.. Nitrato de sodio: 400
gramos Agua: 1000 ml Agregar nitrato de sodio al agua mientras se
revuelve. Puede formar cristales y deformar los huevos si se deja
por más de 20
minutos La cámara de McMaster tiene dos componentes, cada uno
marcado con una rejilla sobre la superficie superior. Cuando la
cámara es llenada con una suspensión de heces en fluido de
flotación, muchos de los detritos se van al fondo mientras los
huevos flotan hacia la superficie, en donde pueden ser fácilmente
vistos y los que están dentro del la rejilla pueden ser contados.
Para determinar cantidad de huevos por gramo de heces (h.p.g.) se
siguen los siguientes pasos:
25
Se pesan 4 gramos de heces frescas y se colocan dentro de un
recipiente.
Se añaden 56 ml del fluido de flotación seleccionado.
Se revuelve cuidadosamente el contenido
Se filtra la suspensión fecal a un segundo recipiente y se
revuelve
Se utiliza una pipeta Pasteur para retirar una sub-muestra con el
que se llena el primer compartimiento de la cámara de conteo
Se procede a llenar el segundo compartimiento con otra
sub-muestra
Se deja reposar la cámara de conteo por 5 minutos. Esto es
importante ya que permite que los huevos floten hacia la superficie
y que los detritos se vayan al fondo de la cámara.
Se examina la sub-muestra del filtrado bajo un microscopio
compuesto con aumento de 10 x 10 y se identifica y cuenta todos los
huevos dentro del área gravada de ambas cámaras.
El número de huevos por gramo (h.p.g.) se calcula contando el
número de huevos dentro de la rejilla de cada cámara, ignorando
aquellos fuera de los cuadros y multiplicando el total por 50
5.6 IDENTIFICACIÓN DE LARVAS Es importante la identificación de las
larvas obtenidas por cualquiera de los métodos descritos
anteriormente ya que va a permitir diferenciar el efecto que los TC
ejerce sobre diferentes especies o géneros de parásitos
gastrointestinales. Por lo general se requiere el sacrificio de las
mismas (de una fracción) y su preparación en extensión. La mejor
forma de conseguirlo es calentando cuidadosamente la gota de agua
antes de poner el cubre objetos y mirarlos en el microscopio.
“Relajación” es el eufemismo que acostumbra a aplicarse a la muerte
técnica de los nematodos. A veces los Strongyloides se reavivan,
por lo que es posible que se deba hacer un calentamiento nuevo. Se
debe tener cuidado de no calentar excesivamente las larvas porque
esto las distorsiona. Una posible alternativa al calor es una gota
de de solución Lugol añadida al borde del cubre objetos (RVC/FAO,
2004). Esto relaja las larvas a la vez que la tiñe. Posteriormente,
la identificación de las larvas se puede hacer por micrometría o
por morfología. 5.6.1 Micrometría: Con el objetivo de identificar y
clasificar por especie las larvas de nematodos es necesario
observar su morfología y su micrometría. Mediciones de la cutícula
de la larva, de la larva y de la relación entre estas dos resultan
importantes en la caracterización de las mismas. Con este fin se
procede a calibrar un microscopio, con el que se realizarán todas
las mediciones correspondientes.
26
Los pasos en la técnica de micrometría incluyen:
Colocar el micrómetro ocular en la parte interior del ocular 6X y
en la platina del microscopio el micrómetro objetivo, manteniendo
el revolver en 10x.
Sobreponer el punto 0 de la escala del micrómetro objetivo con el 0
de la escala del micrómetro ocular.
Verificar a la izquierda la superposición de las líneas que
demarcan las divisiones de la escala, escogiendo las superpuestas,
que están más próximas al cero de dichas escalas, ya que así, se
reducirá el margen de error.
Para determinar el valor real de las divisiones del micrómetro
ocular se cuentan las divisiones que hay entre el 0 de las dos
escalas superpuestas, hasta las líneas superpuestas que están más
próximas al 0 de dichas escalas. Es necesario contar las divisiones
de las escalas del micrómetro ocular y del objetivo, con ocular 6x
y objetivo 10x y 40x. Conociendo las divisiones de las dos escalas,
se puede calcular cuantas divisiones de la escala del micrómetro
objetivo están contenidas en un número determinado de intervalos
del micrómetro ocular y definir cuantas divisiones del micrómetro
objetivo comprenden un especio determinado en el micrómetro ocular.
Por ejemplo, si se cuentan 70 divisiones en la escala del
micrómetro ocular y 68 divisiones en el micrómetro objetivo 10x, se
considera que cada división del micrómetro objetivo equivale a 10
μm, por lo que se multiplica 68 x 10 para convertir en μm y se
realiza el siguiente cálculo: 68*10 / 70 = 9.71. Para el objetivo
de 40x se realizó el mismo cálculo: 5*10 / 20 = 2.5.
Esto significa que una división del micrómetro ocular, con el
objetivo de 10x equivale a 7.71μm, puesto que se divide el total de
las divisiones del micrómetro objetivo, multiplicadas por 10, entre
las divisiones del micrómetro ocular. En caso de usar el objetivo
40x, cada división del micrómetro ocular equivale a 2.5μm. Una vez
realizados los cálculos, se retira el micrómetro objetivo de la
platina y se coloca la lámina que contiene el espécimen a ser
medido. Posteriormente, se enfoca el ocular y poniendo el extremo
del espécimen en el 0 de la escala del micrómetro ocular, se
cuentas las divisiones que abarca el ejemplar, de un extremo a
otro. El número de divisiones obtenidas se multiplica por el valor
que la calibración arrojó dependiendo del objetivo que se haya
usado. Si se desea utilizar otro objetivo, éste se debe
calibrar.
27
Una vez calibrado el microscopio se utilizan las claves
micrométricas (Niec, 2003) para la identificación por especie de
las larvas L3 (Ver Anexo 1) apoyándose en las claves morfológicas
descritas en el Anexo 2. 5.7 EVALUACIÓN DEL DESARROLLO LARVARIO Y
VIABILIDAD DE HUEVOS IN VITRO EN FUNCIÓN DE LA ACCIÓN DE LOS
TANINOS Los estudios in vitro realizados hasta el momento han
investigado si realmente existe una acción directa de los taninos
condensados sobre los nematodos gastrointestinales. La metodología
sugerida en todos estos estudios es similar. Las principales
especies de nematodos gastrointestinales (larvas u huevos) que
parasitan a los pequeños rumiantes son expuestas a diferentes
concentraciones de extracto de TC, obtenido de leguminosas
tropicales de diferentes géneros (Lotus, Schinopsis y Plagiochila,
entre otros). Paramita et al. (2006) propone evaluar los efectos
inhibitorios de los TC por la mortalidad de las larvas. Los
parásitos muertos se reconocen fácilmente por su apariencia rígida
y por la ausencia de movimiento de la cabeza y la cola. Los
estudios liderados por Mateos-Sanza et al. (2005) valoran la
actividad antihelmíntica de los taninos determinando la capacidad
migratoria de las larvas de tercer estadio (L3) de los nematodos.
Esto se realiza a través de una malla de nailon de 20 mm de tamaño
de poro. Para evaluar el desarrollo larvario se debe tener muy
claro las características de las diferentes especies en sus fases
evolutivas. Y se propone una calificación con puntajes de 1-10 en
diferentes momentos de la incubación, horas 0,2, 4, 6 y 8 post
exposición Iqbal et al. (2007). Una opción es presentar los
resultados como LC50 y LC99, definidos como la concentración
antihelmíntica requerida para inhibir el desarrollo hacia L3 en un
50 y 99%. Otra opción es en forma de MIC (Concentración Inhibitoria
Mínima) que esta dada por la concentración mínima necesaria para
inhibir completamente la el desarrollo hacia L3 en el tiempo de
incubación estipulado.
28
6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Con base a la literatura revisada se concluye que para poder llegar
a la formulación de sistemas de pastoreo para ovinos con base a
leguminosas con TC como una alternativa de control de parásitos
gastrointestinales es necesario en forma sistemática realizar una
seria de estudios como los que se resumen a continuación:
1. Dilucidar el efecto de la concentración y estructura química de
taninos de leguminosas forrajeras en el control de huevos y larvas
de nematodos en ovinos.
2. Definir como cambios en fertilidad de suelos, temperatura
ambiental y
precipitación pluvial afectan la concentración y estructura química
de leguminosas con potencial de ser incluidas en sistemas de
pastoreo de ovinos y como a su vez estos cambios en los TC afectan
su efectividad en el control de parásitos.
3. Evaluar en sistemas de producción de ovinos en pruebas un vivo
la efectividad de TC de leguminosas incluidas en sistemas de
pastoreo o utilizados como extractos aplicados vía oral.
4. Definir como si es favorable combinar el uso de antihelmínticos
comerciales con leguminosas con TC como componentes en un sistema
de control integrado de parásitos internos.
29
CLAVES MICROMÉTRICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE NEMATODOS L3 POR
ESPECIE Bunostomum trigonocephalum
La más pequeña de las larvas de nematodos gastrointestinales de
bovinos y ovinos.
Cavidad bucal de paredes gruesas, en forma de embudo.
Esófago bastante largo con ensanchamiento bulboso.
Dieciséis células intestinales, pocas veces bien
diferenciadas.
Terminación de la cola de la larva obtusa.
La cola de la vaina larval, fina y bastante larga en relación con
el largo total de la larva.
En temperatura óptima de 22-24° C se forman larvas infectantes en
6- 7 días. MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Largo cola vaina larval
Sin envoltura de la segunda muda (vaina).
Esófago muy largo, aproximadamente 1/3 del total de la larva y de
color claro.
Intestino bastante corto formado por células no diferenciables, con
oscuras granulaciones.
En larvas de cultivos viejos no se distingue bien el esófago del
intestino.
La cola larval termina trifurcada; vista de costado aparece
bifurcada.
Evolución de huevo a larva infectante a 10-15° C en 7-8 días; a
20-25° C en 30-70 horas.
ANEXO 1
30
Figura 1. Terminación de la cola larval MEDIDAS MÍNIMAS Y
MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Largo cola vaina larval
75-95 80-92
Oesophagostomum venulosum
Larvas de tamaño mediano, provistas de una vaina gruesa y floja,
que forma bien visibles ondulaciones.
La cavidad bucal recta, de paredes engrosadas.
Treinta y dos (32) células intestinales, triangulares Cantidad de
células intestinales características para cada especie.
Evolución de huevo a larva infectante es de 7-8 días a temperatura
de 22-24° C.
MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Morfológicamente muy parecida a la de Oesophagostomum
venulosum.
Células intestinales, 28-32, por lo general 32, de forma
rectangular.
Las larvas infectantes se obtienen tras seis días a 22-24° C.
MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
131-220 ____ ____
En cultivos mixtos con 0. venulosum y Chabertia ovina, se considera
(según varios autores) a las larvas menores de 700 micrones como de
Chabertia ovina y a las mayores de 800 micrones como 0. venulosum.
Las larvas con medida entre 700-800 micrones, no son diferenciables
entre sí. Trichostrongylus axei (Cobbold, 1879; citado por: Niec,
2007)
Larva de tamaño mediano, sin cavidad bucal.
Dieciséis células intestinales.
Cola de la vaina larval; corta, cónica, aguda.
En temperaturas de 22-24° C se forman larvas infectantes en 6-8
días. MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Larva relativarnente chica, sin cavidad bucal.
Dieciséis células intestinales.
La cola larval termina en una o dos protuberancias.
Cola de la vaina larval muy corta, cónica, recta.
En temperatura de 22-24°C se forman larvas infectantes en 7-8 días.
MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Dieciséis células intestinales.
La punta de la cola de la larva con una hendidura semejando una
W.
Cola de la vaina larval corta, cónica.
En temperatura de 22-24°C se forman larvas infectantes en 7-8 días.
MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Dieciséis células intestinales.
Terminación de la cola de la larva, obtusa-redondeada.
Cola de la vaina larval corta, puntiaguda, a menudo con desviación
a la altura de la punta de la cola larval.
En temperaturas de 22-24° C se forman larvas infectantes en 6-7
días. MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Cavidad bucal en forma de pera.
En el sitio donde empieza el esófago existe una cinta fibrilosa la
que a la observación microscópica se ve como dos puntos
refringentes o una línea clara, detalle morfológico característico
para el género Cooperia.
Dieciséis células intestinales.
Terminación de la cola larval obtusa y redondeada.
La cola de la vaina larval, por lo general ligeramente ondulada, se
reduce gradualmente en una terminación obtusa.
En cultivo se forman larvas infectantes en siete días a 22-24° C.
MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Cooperia curticei
Larvas más chicas (más cortas y delgadas) que las de C.
oncophora.
Se observan los característicos cuerpos refringentes pero más
pequeños y más juntos entre sí que los de C. oncophora
Dieciséis células intestinales.
Terminación de la cola larval obtusa.
La cola de la vaina larval recta, reduciéndose en una terminación
filamentosa.
Las larvas infectantes de estas especies cultivan en 7-8 días a
22-24° C.
MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
Cavidad bucal ovalada.
En muchos casos a la altura de la cavidad bucal se observa una
pequeña plaqueta quitinosa, oscura.
Dieciséis células intestinales.
Terminación de la cola larval cónica, en muchos casos
arrugada.
La cola de la vaina larval, que adelgaza gradualmente, termina en
una prolongación filamentosa.
MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
35
119-149 124-160 ____
Nematodirus spp. N. filicollis, N. spathiger; N. battus (Crofton y
Thomas, 1951-1954); N. helvetianus (May, 1920)
Entre todas las larvas infectantes de nemátodos gastrointestinales,
las de Nematodirus spp. son las de mayor tamaño.
La cavidad bucal en forma de tubo recto.
El intestino está compuesto de ocho grandes células.
La forma de la terminación de la cola larval es característica para
cada especie (ver fig. 4 en Anexo 3).
La cola de la vaina larval es larga, en forma de látigo.
La larva infectante se desarrolla dentro del huevo del parásito en
15- 30 días, según especie, a 24-28° C.
MEDIDAS MÍNIMAS Y MÁXIMAS
Característica Varios autores (μm)
CLAVES MORFOLÓGICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE NEMÁTODOS L3
Estas claves del libro Manual of Veterinary Parasitological
Laboratory Techniques permiten identificar las larvas hasta género
y son de gran utilidad si no se tiene la forma de calibrar el
microscopio
1. Esófago rabditiforme De vida libre Esófago no rabditiforme 2 2.
Sin vaina, esófago a la mitad del cuerpo Strongyloides
Con vaina, esófago menos de la mitad del cuerpo 3
3. Cola de la vaina corta o mediana 4 Cola de la vaina muy larga 7
4. Dos cuerpos ovales refractiles o una banda transversa brillante
entre la cavidad bucal
y el esófago. Cooperia Sin banda y sin cuerpos ovales retractiles
5
5. Larva delgada, cola de la vaina mediana, terminación en punta, a
veces con un leve
doblez Haemonchus Cola de la vaina muy corta y cónica 6
6. Larva mediana o grande con cola
redondeada Ostertagia Larva pequeña, cola con tuberosidades o
indistintamente redondeada Thrichostrongylus 7. Larva muy grande, 8
células intestinales, cola con muesca, bilobulada o trilobulada
Nematodirus Larva mediana, 32 células intestinales pentagonales,
luz del intestino ondulado. Oesophagostomum Larva mediana, 32
células intestinales
cuadradas, lumen del intestino derecho. Chabertia Larva muy pequeña
con 16 células intestinales Bunostomum
ANEXO 2
38
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