+ All Categories
Home > Documents > The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial...

The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial...

Date post: 25-Aug-2016
Category:
Upload: manuel
View: 213 times
Download: 1 times
Share this document with a friend
13
J Biol Inorg Chem 2001) 6 : 504±516 DOI 10.1007/s007750100219 ORIGINAL ARTICLE Alexander N.P. Hiner ´ Josefa Hernµndez-Ruiz JosØ Neptuno Rodríguez-López ´ Marino B. Arnao Ramón Varón ´ Francisco García-Cµnovas Manuel Acosta The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate Received: 4 August 2000 / Accepted: 22 January 2001 / Published online: 29 March 2001 SBIC 2001 Abstract The inactivation of horseradish peroxidase A2 HRP-A2) with H 2 O 2 as the sole substrate has been studied. In incubation experiments it was found that the fall in HRP-A2 activity was non-linearly dependent on H 2 O 2 concentrations and that a maxi- mum level of inactivation of approximately 80% i.e. ~20% residual activity) was obtained with 2000 or more equivalents of H 2 O 2 . Further inactivation was only induced at much higher H 2 O 2 concentrations. Spectral changes during incubations of up to 5 days showed the presence of a compound III-like species whose abundance was correlated to the level of resist- ance observed. Inactivation was pH dependent, the enzyme being much more sensitive under acid con- ditions. A partition ratio r 1 "1140 at pH 6.5) between inactivation and catalysis was calculated from the data. The kinetics of inactivation followed single exponen- tial time curves and were H 2 O 2 concentration depend- ent. The apparent maximum rate constant of inactiva- tion was l max =3.560.0710 ±4 s ±1 and the H 2 O 2 concentration required to give l max /2 was K l =9.94 0.52 mM. The relationship l max <k i has been shown to apply and thus the rate constant of inactivation has been calculated as k i =1.910 ±3 s ±1 . HRP-A2 possessed catalase-like oxygen gas-releasing activity, the catalytic constant being k 3 =2.2 s ±1 , and the affinity for H 2 O 2 as K 2 =23 mM. Catalase-like activity was pH dependent and favoured under more basic conditions. A mech- anistic model has been developed and used to explain the behaviour of HRP-A2. The model suggests that, in common with HRP-C, mechanism-based suicide) inactivation is being observed but that a fraction of the HRP-A2 is protected from inactivation in the form of a modified compound III species. Keywords Horseradish peroxidase A2 ´ Catalase ´ Mechanism-based inactivation ´ Resistance ´ Hydrogen peroxide Abbreviations ABTS: 2,29-azinobis3-ethylbenzthia- zoline-6-sulfonic acid) ´ HRP: horseradish peroxidase ´ m-CPBA: m-chloroperoxybenzoic acid ´ TNM: tetranitromethane Introduction Peroxidases donor:hydrogen peroxide oxidoreductase, EC 1.11.1.7.) are a widely distributed group of enzymes that oxidize a variety of substrates at the expense of hydrogen peroxide. Horseradish peroxidase HRP) is a class III secretory enzyme in the classifica- tion system based on amino acid sequence comparison developed by Welinder [1] for the superfamily of haem peroxidases from plants, fungi and bacteria. It occurs as a family of isoenzymes [2], which may be broadly divided into acidic A), slightly basic or neu- tral C) and strongly basic E) types [3], although up to 40 isoenzymes types A to E) have been tentatively detected [4]. HRP-C is the most abundant isoenzyme and has been the most often used both for research and applications, but essentially pure commercial preparations of the acidic isoenzymes HRP-A1 and HRP-A2 are also available [5]. Strongly basic HRP-E A.N.P. Hiner ´ J. Hernµndez-Ruiz ´ M.B. Arnao M. Acosta ) ) Departamento de Biología Vegetal Fisiología Vegetal), Universidad de Murcia, 30100 Espinardo, Murcia, Spain E-mail: [email protected] Phone: +34-968-364940 Fax: +34-968-363963 J.N. Rodríguez-López ´ F. García-Cµnovas Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A, Universidad de Murcia, 30100 Espinardo, Murcia, Spain R. Varón Departamento de Química-Física, Escuela Universitaria PolitØcnica de Albacete, Universidad de Castilla-La Mancha, 02071 Albacete, Spain
Transcript
Page 1: The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate

� ���� ���� �� ������ � � ���������� ���������������������

��� �!"# "�$�#%

��������� � � ��� � ������ ������������ ����� ������ ��������������� � ��� �� �������!�� "���� � #���$ �$� %��$���&���'�������� �$����

��� ���������� � �� ����� � ������� � � ������ ���� ������� �������� �� ������� � ������� �� � ����� ���� ��� ������� � � ����� ������ ������������

��&��'�(� � "))�* ���� � "&&�+*�(� �� �,�),�- ���� � .)/�����( ������� �� 0,�&� ����� 1�� ����

�(����$� $�� ��,&*�',*��� �2 ������,(��� +���3�(,��"� �4�.5"�� 6�*� 4��� ,� *�� ���� �)/�*�,*� �,�/��� �*)(��(� �� ��&)/,*��� �3+��� ��*� �* 6,� 2�)�(*�,* *�� 2,�� �� 4�.5"� ,&*�'�*- 6,� ���5����,��-(�+��(��* �� 4��� &��&��*�,*���� ,�( *�,* , ,3�5 ) ��'�� �2 ��,&*�',*��� �2 ,++��3� ,*��- 7�8 �����9��8 ����(),� ,&*�'�*-� 6,� �/*,���( 6�*� ���� �� ��� �:)�',���*� �2 4���� ;)�*��� ��,&*�',*��� 6,����- ��()&�( ,* )&� ����� 4��� &��&��*�,*�����1+�&*�,� &�,��� ()��� ��&)/,*���� �2 )+ *� � (,-����6�( *�� +�����&� �2 , &� +�)�( ���5��<� �+�&���6���� ,/)�(,�&� 6,� &�����,*�( *� *�� ��'�� �2 �����*5,�&� �/���'�(� ��,&*�',*��� 6,� +4 (�+��(��*= *����>- � /��� )&� ��� �����*�'� )�(�� ,&�( &��5(�*����� " +,�*�*��� �,*�� �������� ,* +4 ���� /�*6�����,&*�',*��� ,�( &,*,�-��� 6,� &,�&)�,*�( 2�� *�� (,*,�$�� <���*�&� �2 ��,&*�',*��� 2����6�( ����� �3+����5*�,� *� � &)�'�� ,�( 6��� 4��� &��&��*�,*��� (�+��(5��*� $�� ,++,���* ,3� ) �,*� &���*,�* �2 ��,&*�',5*��� 6,� � ,3?@���A����B��

�� ��� ,�( *�� 4���&��&��*�,*��� ��:)���( *� �'� � ,3�� 6,� ��?����A���� 0� $�� ���,*������+ � ,3C�� �,� /��� ���6� *�,++�- ,�( *�)� *�� �,*� &���*,�* �2 ��,&*�',*��� �,�/��� &,�&)�,*�( ,� ��?���B��

�@ ���� 4�.5"� +�������(

&,*,�,��5��<� �3-�� ,�5����,��� ,&*�'�*-= *�� &,*,�-*�&&���*,�* /��� �@?��� �

��= ,�( *�� ,22���*- 2�� 4��� ,���?�@ 0� ,*,�,��5��<� ,&*�'�*- 6,� +4 (�+��(��*,�( 2,'�)��( )�(�� ��� /,��& &��(�*����� " �&�5,���*�& �(�� �,� /��� (�'���+�( ,�( )��( *� �3+�,��*�� /��,'��)� �2 4�.5"�� $�� �(�� �)��*� *�,*=�� &� �� 6�*� 4�.5= �&�,��� 5/,��( ��)�&�(����,&*�',*��� �� /��� �/���'�( /)* *�,* , 2�,&*��� �2*�� 4�.5"� �� +��*�&*�( 2�� ��,&*�',*��� �� *��2�� �2 , �(�2��( &� +�)�( ��� �+�&����

)�*+���� 4�����,(��� +���3�(,�� "� D ,*,�,�� D0�&�,��� 5/,��( ��,&*�',*��� D �����*,�&� D 4-(����+���3�(�

�((��' �� ��� ����� �=��5,>���/���@5�*�-�/��>*��,5>�����5�5�)�2���& ,&�(� D �� ������,(��� +���3�(,�� D�� ��� �5&�����+���3-/��>��& ,&�( D ����*�*�,��*�� �*�,��

����������

.���3�(,��� �(������-(���� +���3�(� �3�(���()&*,��=% ���������� ,�� , 6�(��- (��*��/)*�( ��)+ �2��>- �� *�,* �3�(�>� , ',���*- �2 �)/�*�,*�� ,* *���3+���� �2 �-(���� +���3�(�� 4�����,(��� +���3�(,���4�.� �� , &�,�� ��� ��&��*��- ��>- � �� *�� &�,���2�&,5*��� �-�*� /,��( �� , ��� ,&�( ��:)��&� &� +,�����(�'���+�( /- E����(�� F�G 2�� *�� �)+��2, ��- �2�,� +���3�(,��� 2�� +�,�*�= 2)�� ,�( /,&*���,� �*�&&)�� ,� , 2, ��- �2 �����>- �� F�G= 6��&� ,- /�/��,(�- (�'�(�( ��*� ,&�(�& �"�= ����*�- /,��& �� ��)5*�,� �� ,�( �*����- /,��& �%� *-+�� F@G= ,�*��)� )+*� �� �����>- �� �*-+�� " *� %� �,'� /��� *��*,*�'��-(�*�&*�( F�G� 4�.5 �� *�� ��* ,/)�(,�* �����>- �,�( �,� /��� *�� ��* �2*�� )��( /�*� 2�� ����,�&�,�( ,++��&,*����= /)* �����*�,��- +)�� &� ��&�,�+��+,�,*���� �2 *�� ,&�(�& �����>- �� 4�.5"� ,�(4�.5"� ,�� ,��� ,',��,/�� F�G� 1*����- /,��& 4�.5%

"�!�.� 4���� D �� 4���H�(�>5�)�> D 0��� "��,�0� "&��*, �����+,�*, ��*� (� �����I, J��*,� �;������I, J��*,��=K��'����(,( (� 0)�&�,= @���� %�+��,�(�= 0)�&�,= 1+,��%5 ,��� ,&��*,L) ���.����� M@�5��75@�����;,3� M@�5��75@�@��@

��!� ��(�I)�>5#N+�> D ;� ,�&I,5H��',���+,�*, ��*� (� ���:)I �&, - �����I, 0���&)�,�5"=K��'����(,( (� 0)�&�,= @���� %�+��,�(�= 0)�&�,= 1+,��

�� J,�N���+,�*, ��*� (� O)I �&,5;I��&,=%�&)��, K��'����*,��, .���*P&��&, (� "�/,&�*�=K��'����(,( (� ,�*���,5#, 0,�&�,= ����� "�/,&�*�= 1+,��

Page 2: The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate

���

�� ��* �,���- ,',��,/�� ,�( �,� /��� &� +,�,*�'��- ��*5*�� �*)(��(�4�.5 �,� /��� &�,�,&*���>�( ,� , ��� ���& �-5

&��-�,*�( +��-+�+*�(� �2 @�7 , ��� ,&�(� F�= �G &��5*,���� ��� +��*��,� �Q +���*��*�& ��)+ ,�( *6��*�)&*)�,� &,�&�) ���� F7GR *�� *�*,� ���&)�,� 6���*�� ,++��3� ,*��- �@=���� $�� &�-�*,� �*�)&*)�� �24�.5 �,� /��� (�*�� ���( F�G� $���� ,�� �)/�*,�*�,�+�-��&,�= &�� �&,� ,�( <���*�& (�22����&�� /�*6��� ���5��>- �� " ,�( F@G� $�� , ��� ,&�( ��:)��&�� �24�.5 ,�( 4�.5" ,�� ���� *�,� ��8 �(��*�&,� F��G=,�*��)� *�� ,&*�'� ��*� ����()�� ,�� �,���- &�����'�(R��� �2 *�� *6� +���-�,�,���� ����()�� �;���� ,�����(, ���� �� ��()&�� �)/�*�,*� /��(�� �� 4�.5 ����+�,&�( /- ',���� �� 4�.5" F��G� $�� ,&�(�& ���5��>- �� ,�� ��� ��,'��- �-&��-�,*�( ��@8 &� 5+,��( *� �78 /- 6���*� F��G� $�� ������&*��& +���*�+�� �2 4�.5" �� @�� ,,���* 7�7 2�� 4�.5 F@G� ��252����&�� �� *�� �+�� �*,*� �2 *�� 2����& ���� &��*�� �,'�,��� /��� ��+��*�( F��G�$�� ����,� �&�,��� �2 4�. ,�( ��* �*���

+���3�(,��� �� �� ��,� ,�( +��&��(� �� *���� (��*��&*�*�+� F�G� 4��� ��,&*� �,+�(�- 6�*� *�� 2����& ��>- ��� , *6�5���&*��� +��&��� *� ����,*� *�� ��*�� �(�,*�<��6� ,� &� +�)�( �� � +�)�( � �*���� *�� *6��3�(�>�� �:)�',���*� 2�� +���3�(� ,� �3-2���-� ����F;���J�?�G ,�( , �5&,*��� �,(�&,� (���&,��>�( �'��*�� �,� ��� F��G= *�)� �'�� , 2�� ,� �3�(,*����*,*� �2 M�� �� *�� &�,���&,� +���3�(,�� &-&��= &� 5+�)�( � �� (��&�,��( �� *6� ��:)��*�,� �����5���&*�����,&*���� 6�*� ��()&�� �)/�*�,*�= +��()&�� �,(�&,�+��()&*� ,�( 6,*��� �3-2���-� ����5&��*,���� &� 5+�)�( �� �2�� ,� �3�(,*��� �*,*� M�� �� 2�� �( /- *��2���* ��()&*��� �*�+= ()��� 6��&� *�� �5&,*��� �,(�&,��� ��)*�,��>�(R �� *�� ��&��( �*�+= &� +�)�( �� ����()&�( *� ������,*� 2����& +���3�(,��� $�� �+�&�2�&��()&�� �)/�*�,*� +�����* (�*�� ���� *�� �,*�� �2*���� *6� �*�+�= /)* *��- ,�� ��� ,��- ���6�� *�,� *�����*�,� ��,&*��� 6�*� +���3�(� ,�( �� ��* &,��� *����()&*��� �2 &� +�)�( �� �� �,*� �� �*��= *��� ��*��5 �(�,*� *�)� /��� �/���'�( )�(�� �*�,(- �*,*� *)��5�'�� &��(�*���� F�@G��� '�*��= 4�. &,*,�-��� *�� �3�(,*��� �2 , 6�(�

�,�� �2 �)/�*�,*�� ��&�)(�� ,�- +������= ,�� ,*�&, ����= *���,������� ,�( ��(�(�= /- 4��� F�= �@= ��=��G� 4�6�'��= *�� �+�&�2�& +�-������&,� �)/�*�,*� ���)/�*�,*�� �2 4�. ,�( *�� ����� +�,-�( /- *�� (�22��5��* �����>- �� �� ,�� �,*��� �/�&)��� ��22����&���,'� /��� �(��*�2��( �� *�� <���*�& /��,'��)� ,�( �)/5�*�,*� �+�&�2�&�*- �2 *�� " ,�( �����>- �� �2 4�.�$�� ��,&*��� �2 *�� 2����& ��>- � 6�*� 4��� *� 2�� &� +�)�( � �,� ,� ,++,���* ��&��(5��(�� �,*� &��5�*,�* �2 ��S��

� 0�� ��� �� *�� &,�� �2 4�.5 /)* ��,++��3� ,*��- ��52��( ���6�� 2�� 4�.5"= 6��������B��

� 0�� ��� F��G� " �� ��,� �22�&* �� ����,��-���� 6��� &� +�)�( � �� 2�� �( )��� �*��� �-(��5+���3�(�� F�@= ��G= /�*� ,�<-� ���� �*�-�= �*�-�= +��+-��� /)*-� +���3�(�� ,�( ,�� ,*�& ���� �5��*��+���3-5/��>��& ,&�(= �5&�����+���3-/��>��& ,&�(�� $�� +�,=

��>� ����� �*���& �22�&*�� ,�( ��+�+����&�*- �2 *�� �-(��5+���3�(�� ,�� ,22�&* *�� �,*� �2 ��,&*���= /)* *� (�22����*(����� �� *�� *6� �����>- ��= &�,��� 2�� 4�.5+���&�+,��- /��� ���,*�( *� +�, ,�( 2�� 4�.5" *���>� ,�( ��+�+����&�*-� $�� ,&*�'�*- �2 *�� �����>- ��6�*� ��()&�� �)/�*�,*�� �� ,��� (�22����* F��G� �� ��5��,�= 4�.5" �� ��� ,&*�'� )�(�� ,&�( &��(�*����*�,� ,* ��)*�,� +4= *�� ��'���� /��� *�)� 2�� 4�.5�4�.5 �� , /�**�� &,*,�-�* �2 *�� 4���5��(�+��5

(��* �3�(,*��� �2 *�� +�,�* ��� ��� ��(���5@5,&�*�&,&�( ��""� *�,� �� 4�.5" F@G= /)* ()��� *��� ��,&5*��� *�� ��>- � �� �����*�'� *� ��,&*�',*��� /- *��+��()&* 2�� �( �, �-(��+���3�(�� F�7G� � +�)�( ��2 4�.5 6��� ,��� ��,&* 6�*� 4��� ,� ,� ���&*���(���� ����� ��()&*,�*� �� , &� +��3 ��* �2 ��,&*�����$���� ��&�)(� , *6�5���&*��� +��&��� ���)�*�� �� *��2�� ,*��� �2 ���&)�,� �3-�� �&,*,�,��5��<� ,&*�'�*-�,�( , ��� ��� ,� +���3�(,��5*-+� +,*�6,- �� 6��&�&� +�)�( ��= &� +�)�( ��� �,��� *�� �( �3-+���35�(,�� ���&� �* ,- /� &����(���( ��*��� ,� , 2����&5�)5+���3�(� &� +��3 �� ,� , 2����)�5(��3-�� &� +��3=�:)�',���* *�= 2�� �3, +��= �3- -���/��= ���)�*�� ��, 2�� ,� �3�(,*��� �*,*� �2 M�� ,�( �)+���3�(� ,�������

�� ,�� 2�� �(� ;��,��-= , +,*�6,- ��,(�� *� *��+�������'� ����'����/�� ��,&*�',*��� �2 *�� ��>- � *�2�� ,� ��,&*�'� +��()&*= '��(��,� �&��� � .���F��G= �,� /��� �/���'�(� $���� +��&����� ,�� �� &� 5+�*�*���R *�� &,*,�,��5��<� ,�( &� +�)�( ��� ��)+��5�3�(�� +,*�6,-� �,'� , +��*�&*�'� �22�&* ,,���* ��,&5*�',*��� F��G� $�� +�'�*,� +���* �2 +,�*�*��� /�*6���+��*�&*��� ,�( ��,&*�',*��� �,� /��� �(��*�2��( ,� *��&� +��3 /�*6��� &� +�)�( � ,�( +���3�(� F��G� E��,'� +��'��)��- �*)(��( ��,&*�',*��� ,�( +��*�&*��� ��(�*,�� )��� 4�.5 �6��(5*-+�= ��&� /��,�* ,�( )*,�*�� 6�*� 4��� F�= ��= ��= ��= �@G ,�( �5&�����5+���3-/��>��& ,&�( ��5.�"� F��= �@= ��= ��G= 6��&��� ��* , �)/�*�,*� 2�� *�� &,*,�,��5��<� +,*�6,-� "<���*�& �(�� ,�( �&�,��� �,'� /��� (�'���+�(=�)++��*�( /- *�,�����* ,�( �*�,(- �*,*� <���*�& (,*,=*� �3+�,�� *�� ��,&*��� +,*�6,-�� E� �,'� ,��� +��5'��)��- +�����*�( �� � &� +,�,*�'� (,*, 2�� 4�.5,�( 4�.5" �"� ,�( "�� �� ��,&*��� 6�*� 4��� F�@G�1���2�&,�* (�22����&�� 6��� �/���'�( �� *�� /��,'��)��2 4�.5" *�,* &�)�( ��* /� �3+�,���( )��� *�� �, � �(�� ,� *�,* 2�� 4�.5� 1+�&�2�&,��-= , 2�,&*��� �,+5+��3� ,*��- ��8� �2 *�� ���*�,� +���3�(,�� ,&*�'�*- �2, �� �����)� �, +�� �2 4�.5" ,++�,��( *� �����*��,&*�',*��� /- 4���= 6����,� 4�.5 ,&*�'�*- 6,�&� +��*��- ,/������( F�= �@G�$��� +,+�� +�����*� ��6 (,*, �� *�� ��,&*���� �2

4�.5"� 6�*� 4��� ,�( , <���*�& �(�� 6��&��3*��(� �)� )�(���*,�(�� �2 *�� ��,&*�',*��� ,�( +��5*�&*��� �&�,��� 2�� *��� �����>- � 6�*��� *��2�, �6��< �2 �&�,��� 5/,��( ��)�&�(�� ��,&*�',*��������,��- (�'���+�( 2�� 4�.5= /)* ,��� ���'�� *�������* *�� (�'����&� �� *�� /��,'��)� �2 *�� ���5��>- ��� $�� �/���'�( (�22����&�� )�(�� &��(�*�����2 �3�(,*�'� �*���� &�)�( +�*��*�,��- �,'� � +��*,�*+�-������&,� &����:)��&���

Page 3: The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate

���

�������� ��� �����

%�>- ��

#-�+����>�( 4�. �����>- �� 6��� �/*,���( 2�� ���>- � #,/����,��,'��= E,���= KT�R +��()&* &�(�� 4�.5�= �U����@���7��?@���= ,�( 4�.5��= �U?@���� 4�.5� �,� /��� &��52�� �( /- ������&*��& 2�&)��� �.�,�* �-�*� = .�,� ,&�,� *� /�&� +���( �2 �����>- � "� F�GR �*� &��&��*�,*��� 6,� (�*��5 ���( )��� ���@?��� 0

�� & ��� 4�.5�� 6,� �����>- � F�GR���@?��� 0

�� & �� 6,� )��( *� &,�&)�,*� �*� &��&��*�,*����$�� �+�&�2�& ,&*�'�*��� �2 *�� �����>- �� �,'� +��'��)��-

/��� (�*�� ���( )��� �=��5,>���/���@5�*�-�/��>*��,>�����5�5�)�52���& ,&�(� �"�$1� �+4 ���� ,�( ),�,&�� �+4 ���� ,� *�� ��()&5�� �)/�*�,*�� F�G� 4�.5� �"�� �,( , �+�&�2�& ,&*�'�*- 6�*��� 0 "�$1 �2 ��@�A�� �K �� ��0 2�� "�$1?� 0� ,�(6�*� ),�,&�� �2 7�A� �K ��R *�� �:)�',���* ',�)�� 2��4�.5�� �� 6��� �@��A@� �K �� )��� ��� 0 "�$1��0?��� 0� ,�( ���A�� �K

�� 2�� ),�,&�� �� �K 6��� 2�� � V �� �2 +��()&* �� � �� ,* *�� �+�&�2��( +4 ,�( �� W��

�� �&,��

"�$1= ,� *�� &�-�*,���>�( , ���) �,�*= 6,� �)++���( /- 1�5 ,� $�� &��&��*�,*��� �2 "�$1 6,� (�*�� ���( )����@��?@� 0

�� & ��� 4-(���� +���3�(� �@�8 '�'� 6,� ,��� 2�� 1� , ,�( �*� &��&��*�,*��� 6,� &,�&)�,*�( )��� ����?�@��0�� & ��� ),�,&�� ��5 �*��3-+������ ,�( *�*�,��*�� �*�,���$!0R (����*-?���@� #��= 0E?�����@� 6��� 2�� "�(��&��#5"�&��/�& ,&�( �����?�7�� 0

�� & ��� 6,� �/*,���( 2�� 1&�,�5�,)� �)22�� �)/�*,�&�� �0��&<� 6��� �2 *�� �����* ,�,�-*�&,��,(� ,�( ,�� ���)*���� 6��� +��+,��( )��� (�����>�( 6,*��2�� , 0����5O �-�*� �0����+�����

%:)�+ ��*

1+�&*��+��*� �*��& �,�)�� ��*� 6��� ,(� �� , .��<��5%� �� #, /(,5� KJ5'���/�� �+�&*��+��*� �*�� &��*�����( /- ,. �)���� (�(�&,*�( ��2*6,��� $�� &)'�**� *� +��,*)�� 6,�*��� ��*,*�&,��- &��*�����( ,* ��A��� W )��� , 4,,<� �� &��5&)�,*�� 6,*�� /,*��������'�( �3-�� &��&��*�,*���� 6��� (�*�� ���( )��� ,

4,��,*�&� �T��� #-��= KT� ��� �3-�,+� )��* &��*�����(2�� , .� $�� �3-�,+� )��* )��� , �,�<5*-+� ���'���+�,*��) ���&*��(� 6�*� , ������ $�2��� � /�,��� 1, +��� �� #�6��� &��*��)�)��- �*����( ,�( *�� *� +��,*)�� 6,� &��*�����( ,*�� W ,� ,/�'�� $�� )��* 6,� &,��/�,*�( 6�*� &,*,�,�� ,�( 4���=*,<�� ��*� ,&&�)�* *�� �*��&��� �*�- �2 *�� ��,&*��� 6����� ���� �2 4��� ����,*� � ��� �2 ��� "((�*���,��-= *�� *-����5�,����5����5/)*-�&,*�&��� &,��/�,*��� �*��( 6,� )��( F��G�

"�$1 ,�( ),�,&�� ��>- � ,&*�'�*- ,��,-�

4�. ,&*�'�*- ������>- �� "� ,�( � 6,� (�*�� ���( )���"�$1 ���� � = �,(�&,� +��()&*= ����?@��� 0

�� & ��� �� ),�,5&�� ���� � = �3�(�>�( +��()&*= ����?���� 0

�� & ��� ,� *�� ��()&5�� �)/�*�,*� �'�� *�� +4 �,�� @���7�� �� *�� 2����6�� ,��,-�-�*� �� �� 0 "�$1 �� �� 0 ),�,&�� ,�( �� 0 4��� ���� 0 ��(�) &�*�,*� �+4 @��= ��� ,�( ����= �� 0 ��(�) +���+�,*� �+4 ��� ,�( ���� �� �� 0 ��(�) &,�/��,*��+4 7���= ,� *�� ����,� ��&��,�� �� ,/���/,�&� ()� *� *�� 2��5 ,*��� �2 *�� �3�(�>�( +��()&*�� $�� *�*,� '��) � �2 *�� ,��,-�6,� � #� $�� +4 &����� 2�� *�� �,�)�� ��* �2 4�.5"�,&*�'�*- �� �*��� �3+��� ��*� 6,� +4 ��� 2�� "�$1 ,�( +4 ���2�� ),�,&���

%�(5+���* ��&)/,*����

$�� (�+��(��&� �2 4�.5"� ��,&*�',*��� �� *�� �) /�� �2�:)�',���*� �2 4��� 6,� �,�)��( �� ��� # ��&)/,*���� &��5*,���� ��>- � �� V0R �� �&&,����= ����� &��&��*�,*���� �24�.5"� 6��� )��( �� ��&)/,*���� *� �/*,�� �+�&*�,� ,�( +���35�(� ,* *�� ��:)���( �,*�� �F4���G�F4�.5"�G� �� *�� �,������=��� �� �� 0 /)22��� �,� ,/�'�� +4 @���7��� ,* �� W� $��+���3�(,�� ,&*�'�*- 6�*� "�$1 �� ),�,&�� �� ,���� 6,�,��,-�( ,2*�� ,* ��,�* �� � � �,�)�� ��*� ,* )+ *� � (,-� 6���,��� ,(��� $�� +��&��* ����(),� ,&*�'�*- ���� 6,� &,�&)�,*�(2�� *�� 4�. ,&*�'�*- +�����* ,* *�� �*,�* ���� ,�( 2����� ��*��2 *�� ��&)/,*���� $�� (,*, 6��� +��**�( )��� 1� ,.��* 2��E��(�6� �'������ �= �,�(�� 1&���*�2�& 1�2*6,��= 1,� �,2,��= ,�5�2�= K1"�� $�� +,�*�*��� �,*��� ��� 6��� &,�&)�,*�( ,� (��&)���( ��*�� ���)�*� ��&*��� ,�( *�� "++��(�3�

��*�&*��� ,�( �� �',� �2 �3&��� +���3�(�

�� �� � ��&)/,*��� �3+��� ��*� *�� &��&��*�,*��� �2 ,�-�� ,���� 4��� 6,� ,��,-�( ,* *�� ��(5+���* /- ,((�*��� �2�3&��� "�$1 ,�( , 2���� �, +�� �2 4�.� $�� &��&��*�,*��� �2�,(�&,� 6,� (�*�� ���( ,* ��� � ,�( *�� &��&��*�,*��� �2 +��5�3�(� �� ,���� �� *�� ��&)/,*��� �(�) 6,� *�)� &,�&)�,*�(*,<�� ��*� ,&&�)�* *�,* *6� "�$1 �,(�&,�� ,�� 2�� �( 2�� �,&� ���&)�� �2 +���3�(� &���) �(� �� �, +��� &��*,���� �3&���4���= *�� ,((�*��� �2 � �:)�' �2 ,�&��/�& ,&�( 6,� )��( *��� �'� *�� +���3�(��

��&)/,*���� 6�*� *�*�,��*�� �*�,��

4�.5"� ���� V0� 6,� ��&)/,*�( 6�*� �,*��� �2 4��� �2 �= ����=���� ,�( @��� �� *�� +�����&� �2 �= �= �= � ,�( �� V0 $!0 2���7 �� "2*�� *��� *� � *�� "�$1 ����(),� ,&*�'�*��� 6��� &,�&)5�,*�( ,�( �+�&*�, 6��� �/*,���(�

T���*�&� �2 ��,&*�',*���

$�� ��,&*�',*��� �2 4�.5"� 6,� 2����6�( ,,���* *� � ,*+4 ��� ,� *�� 2,�� �� +���3�(,�� ,&*�'�*-� 4�.5"� �� V0� 6,���&)/,*�( 6�*� 4��� ��= �= �= @= �= ��= �� ,�( �� 0�� "* ,++��5+��,*� *� �� ,2*�� ,((�*��� �2 *�� ��>- �= ,��:)�*� 6��� �� �'�(,�( *�� ,&*�'�*- 6�*� "�$1 6,� (�*�� ���(� $�� ����(),� ,&*�'�5*��� �8� 6��� &,�&)�,*�( 2�� �,&� *� � +���* ,�( 4��� &��&��5*�,*���� $�� (,*, 6��� +��**�( ,�( �3+����*�,� 2�*� ,(� )���1� ,.��* 2�� E��(�6�� 1+�&*�,� &�,��� �&&)���� �'�� *� �6��� ,��� �/���'�(�

�3-�� ,� +��()&*���

$�� &,*,�,��5��<� +��()&*��� �2 �� /- 4�.5"� 6,� �/���'�( ��*�� �3-�,+� �-�*� � $�� +4 (�+��(��&� �2 �� ����,*��� 6,�2����6�( �'�� *�� �,�� +4 @���7�� )��� ���� V0 4�.5"� 6�*���� 0 4��� �� �� 0 /)22��� �,� ,/�'��� $�� (�+��(��&� �2*�� ��,&*��� �� 4��� &��&��*�,*��� 6,� �/���'�( �'�� *�� �,������� 0 4��� 6�*� ���� V0 4�.5"� �� �� 0 ��(�) +���5+�,*� /)22�� �+4 ����� $�� (�+��(��&� �� 4�.5"� &��&��*�,5*��� 6,� (�*�� ���( )��� �� 0 4��� ,�( ��� V0 4�.5"��� �� 0 ��(�) +���+�,*� /)22�� �+4 ����� �� �,&� &,��= ,��( >��� 6�*��)* ��>- � 6,� �/*,���( /- /)//��� !� *���)�*�� ���*�,� 4��� ���)*���� $�� ���*�,� �,*� �2 �� +��()&*���= ,2*��,((�*��� �2 4�.5"�= 6,� &,�&)�,*�( 2�� *�� &)�'� �/*,���(�$�� *�*,� +��()&*��� �2 �� /- , �, +�� �2 4�.5"� /�2��� �*���,&*�',*��� �*�� ��5&,���( ��2���*� +��()&*= � F��G� 6,� (�*��5 ���( )��� � 0 4��� ,�( ����� �0 4�.5"� ,* +4 ���� $����,&*��� 6,� ,���6�( *� +��&��( *� &� +��*��� *� �/*,�� *��2��,� &��&��*�,*��� �2 ��� .��'��)��- ��,&*�',*�( �/- ��&)/,*����4�.5"� 6,� ,��� )��( �� *�� �3-�,+�� K�(�� &��(�*���� 6����

Page 4: The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate

���

�3&��� 4��� �,( /��� (�*�&*�( �� ,� ��&)/,*���= *�� &,*,�,��5��<� ,&*�'�*- �2 ,� ,��:)�* �2 *��� �, +�� 6,� ��*��� �,�)��((���&*�- �� *�� 4��� 6,� +��'��)��- �� �'�( /- ,((�*��� �2� �:)�' �2 ,�&��/,*� ,�( �3-�� +��()&*��� 6,� *��� (�*��5 ���(�

�� ���

.���3�(,�� ,&*�'�*-

$�� ,&*�'�*��� �2 4�.5 ,�( 4�.5"� 6�*� "�$1 ,�(),�,&�� 6��� (�*�� ���( �'�� *�� +4 �,�� @���7���E�*� "�$1 �* 6,� &��,� *�,* 4�.5 �,( , '��- +�� 5����* +�,< �2 ,&*�'�*- ,* +4 ���= 6����,� 4�.5"� 6,�,&*�'� �'�� , /��,(�� +4 �,�� 6�*� , +�,< ,*+4 �������� E��� ),�,&�� 6,� )��( ,� *�� ��()&���)/�*�,*�= /�*� �����>- �� ���6�( ,3� ) ,&*�'�*-,* +4 ��� /)* �� *��� &,�� 4�.5 �� ,���( �,*��� ��� ,&*�'� ,* ��� /,��& +4 ,�( 4�.5"� 6,� ���,&*�'� ,* ��� ,&�(�& +4= /��,(�- �� ���� 6�*� �3+�&*,5*����� �* ���)�( /� ��*�( *�,* ,* +4 @�� *�� ��>- ��,++�,��( *� /� :)�*� )��*,/�� ,�( 2,���- :)�&<�- ���*,&*�'�*-R �� &��*�,�*= ,* +4 7�� *�� 4��� �� *�� ,��,-�6,� (�&� +���(= *�)�= ,* ��,�* �� *�� &,�� �2 4�.5=�� �*�� *�� ��>- � ,&*�'�*-�

%�(5+���* ����(),� ,&*�'�*- ,�( *�� (�*�� ��,*����2 +,�*�*��� �,*���

�� , +��* �2 8 4�.5"� ����(),� ,&*�'�*- �,* *�� ��,&5*��� ��(5+���*� ,,���* *�� F4���G�F4�.5"�G �,*���;�� �� , ����,� (�&��,�� �� ,&*�'�*- �� ���+���� *� ��� 4��� 6,� ���- �/���'�( ,* �,*��� /�*6��� � ,�(,++��3� ,*��- ���� �+4 ����� E��� ��� 4��� *�,�*��� 6,� +�����* �� *�� ��&)/,*���� �* 6,� 2�)�( *�,**�� ��>- � ,&*�'�*- (�( ��* (�&��,�� 2)�*��� ��3&�+*,* �,*��� �2 �'�� ��=���� ,�( , +��+��*��� �2 *����>- � ,++�,��( *� /� �����*,�* *� ��,&*�',*��� �9��8����(),� ,&*�'�*- �� ,���(�� " ���� �3*�,+��,*�( 2�� *�� ����,� ���+�� ��&*��� �2 *�� +��* *� *��F4���G�F4�.5"�G ,3�� ��*����&*�( �* ,* , �,*�� �2,++��3� ,*��- ���� �+4 ����= ,� ��* (�)/�� *�� ',�)��/���'�( 2�� 4�.5 )�(�� �� ��,� &��(�*�����4�.5"� *����2��� ,++�,�� *� /� �,*��� ��� �*,/���� *�� +�����&� �2 4���� "((�*���,��-= 4�.5 ,'� ,����,� +��* (�6� *� �8 ����(),� ,&*�'�*- ����� �� �����*5,�&� 6,� �/���'�(� F�= �@G�$�� +4 �2 *�� ��&)/,*��� �(�) �,( , �,��

�22�&* �� *�� ��,&*�',*��� �2 4�.5"� �� ��&)/,*�����;�� �= ����*�� "* +4 ���= *�� �3*�,+��,*�( ���� ��*��5��&*�( *�� F4���G�F4�.5"�G ,3�� ,* ,/�)* ��� �:)�'�2 4��� ,�( ,* +4 ��� *�� ',�)� �/*,���( 6,� ����=��(�&,*�� *�,* 4�.5"� 6,� &����(��,/�- ��� �)�5&�+*�/�� *� ��,&*�',*��� ,* ��� ,&�(�& +4 ',�)�����&)/,*���� ,* +4 @�� 6��� ��* �)&&���2)� �6�� *�*�� �����*�,��- *�*,� ���� �2 ��>- � ,&*�'�*- ���� �'���� *�� ,/���&� �2 4��� ,�( +���) ,/�- ()� *� (��,*5)�,*��� �2 *�� ��>- �� "* +4 ��� *�� ��*��&�+* 6,� ,*

����= �� �6�,* ����� *�,� ,* +4 ���� "* +4 7�� ����,&*�',*��� 6,� �/���'�(= +���) ,/�- /�&,)�� �2(�&� +���*��� �2 *�� 4��� ()��� *�� ��&)/,*���� "*,�� +4 ',�)�� 6���� ���)�*� 6��� �/*,���( �* 6,� ��*�(*�,* ,* ��,�* ��8 �2 *�� ��>- � 6,� �����*,�* *� ��,&5*�',*����$�� ����(),� ,&*�'�*��� �� ��&)/,*���� 6��� ��� ,��-

�,�)��( ,2*�� ,++��3� ,*��- �� �� 1� � �3+��� ��*�6��� ,���6�( *� &��*��)� 2�� )+ *� � (,-�= ,2*�� 6��&�*� � *�� ����(),� ,&*�'�*��� 6��� �� ��,�R ��6�'��= �*6,� ��*�( *�,* &�,��� �� *�� �+�&*�, �2 *�� 4�.5"��,( �&&)���( ()��� *��� +����(� E�*��� @ �� �2 *���*,�* �2 *�� ��&)/,*���� *�� �+�&*�) �2 &� +�)�( ���6,� �/���'�(R *���= �'�� , +����( �2 ,++��3� ,*��-� �= *�� &��&��*�,*��� �2 &� +�)�( ��� (�&��,��(6����* *�� �+�&*�) �2 ��,&*�'� '��(��,� �&��� �.��� /�&, � ��&��,����- +�� ����* �;�� ��� $����52���= ()��� *�� �,��- �*,�� �2 ��&)/,*��� *�� �(�,6��� ���� �� &���)�� "* �� � *�� ��&)/,*���� &��*,��5�� *�� ��6��* F4���G�F4�.5"�G �,*��� ���� ���= �����,( ��*)���( *� , /��6� &���)� ,�( &��*,���( 2����&4�.5"�� $�� +��&��� �2 ������,*��� �2 2����& +���35�(,�� 6,� &��,��- '���/�� /- �-� �,* �)22�&���* ��>- �&��&��*�,*����� ,�( 6,� &��2�� �( )��� *�� �+�&*��5+��*� �*��� �'�� , +����( �2 ,++��3� ,*��- � (,-�=��&)/,*���� &��*,���� ����� �,*��� �2 4��� 6����/���'�( *� *)�� /��6� ,� 2����& +���3�(,�� 6,�

# � , 1����*�'�*- *� ��,&*�',*��� �2 4�.5"� ,* (�22����* ��,��,*��� �2 4��� �'�� , �,�� �2 +4 ',�)��� 4�.5"� �� V0� 6,���&)/,*�( 6�*� , �,�� �2 &��&��*�,*���� �2 4��� *� �'�F4���G�F4�.5"�G �,*��� 2�� � *� ��=��� �)+ *� @��� ���6�� ���� 0 /)22���� +4 ��� ���= +4 ��� ���= +4 ��� ��� ,�( +4 ������� $�� ����(),� ��>- � ,&*�'�*- �� ,���� 6,� (�*�� ���()��� "�$1 ,2*�� �� � ��&)/,*��� ,* �� W� ������ +��* �2 *����*��&�+*� ,* *�� F4���G�F4�.5"�G ,3�� 2�� 2�**�( ����� *� *��(,*, ,* *�� �, � +4 ',�)��� ��&)/,*���� ,* +4 @�� ,�( 7�� 6�����* �)&&���2)�

Page 5: The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate

��7

������,*�( )�*�� ���- ��&)/,*���� &��*,���� ���*�,� ���� �:)�' �2 4��� �*��� �3��/�*�( , �+�&*�) *�,* ,++�,��( *� /� &� +�)�( ���� ;�)�� @ ���6� *���+�&*�, �/*,���( �� , ��* �2 ��&)/,*���� ,2*�� , +����(�2 � (,-�� $���� �,� &��,��- /��� , 2,�� �� *�� ��*����*-�2 *�� 1���* +�,<�= 6��&� &�����,*�� *� *�� ����(),���>- � ,&*�'�*- �� *�� �, +��= ,� ���6� �� ;�� ��"((�*���,��-= *�� �+�&*�) �2 &� +�)�( ��� 6,� ������ *�� ��&)/,*���� ,* F4���G�F4�.5"�G �,*��� �2 ����=���� ,�( @���� $�� &�,�,&*����*�& ,/���+*��� +�,< ,*��� � �2 '��(��,� �&��� � .���= ,�*��)� +�����*=6,� ��* +,�*�&)�,��- �'�(��* �� �+�&*�, *,<�� ,* � (,-��4�6�'��= .��� �� �,*��� )��*,/�� ,�( *��(� *� �'��'�*� , &���)����� �+�&��� �'�� *��� +����( �2 *� ��;�� *�� ���+� �2 *�� ���� �/*,���( 2�� ��&)/,5

*��� �3+��� ��*� �;�� �� ,�( )��� *�� �&�,��� ���6� �� 1&�� � � ,�( %:�� "@@ ,�( "@� ����"++��(�3�= , +,�*�*��� �,*�� ���� /�*6��� ��,&*�',*���,�( *�� &,*,�,��5��<� ,&*�'�*- �2 4�.5"� &�)�( /� &,�5&)�,*�(�

�� � �@��

���

�'�� �������� $6� �*��� +,�*�*��� �,*��� 6���(�2���( �� 1&�� � ��

# � - 1+�&*�,� &�,��� �� *�� '���/�� ����� �&&)���� �� *�����*�,� � � �2 ,� ��&)/,*��� �2 4�.5"� 6�*� 4���� 4�.5"� �,+5+��3� �7 V0� 6,� ��&)/,*�( 6�*� ���� �:)�' �2 4��� ,* +4 ����$�� ���*�,� �+�&*�) �� �2 2����& 4�.5"� �+�,< ,* ,/�)* ��� � �+���� *� ,((�*��� �2 4���� E�*��� � �� �2 *�� �*,�* �2 *�� ��,&5*��� *�� ,3� ) ��'�� �2 &� +�)�( ��� �+�,<� ,* ��� ,�(�7� � � �� ��,&��(� $����,2*��= *�� &��&��*�,*��� �2 &� +�)�(��� �� ���� *� 2,�� 6����* *�,* �2 .��� �+�,< ,* ��� � � ������������ ��(�&,*� *�� &�,�� �2 ,/���/,�&� /�*6��� � �� ,�(��� � ,2*�� ,((�*��� �2 4���� "2*�� ,++��3� ,*��- � � *�� &��5&��*�,*��� �2 .��� *��(� *� (�&��,�� �6�� *� 2)�*��� (��,(,5*��� �2 *�� ��>- � *� &���)����� +��()&*�

# � . 1+�&*�, ,2*�� � (,-� ��&)/,*��� �2 4�.5"� 6�*� 4����4�.5"� �,++��3� � V0� 6,� ��&)/,*�( 6�*� &��&��*�,*����,*��� �2 4��� �2 �= ���= ���= ����= ����= ����= ���� ,�( @����,� ��(�&,*�( �� *�� +��*� 2�� � (,-� ,* +4 ���� $�� �5(,- �+�&*�,,* ���*�,� F4���G�F4�.5"�G �,*��� 2�� � *� ���� ���6 2����&4�.5"� 6����* *���� ,* �,*��� 2�� ���� *� @��� ��'�,� *��+�����&� �2 , &� +�)�( ���5*-+� ,*���,�� $���� �� , &��,� ���,5*������+ /�*6��� *�� 1���* ,3� ) ,/���/,�&� ,�( *��F4���G�F4�.5"�G �,*�� �� *�� ��&)/,*���� �� *�� �3+,�(�( ��&5*��� *�� '���/�� ����� ,* �,*��� �2 ���� ,�( ���� �3��/�* 2����&,�( &� +�)�( ���5*-+� /,�(�= ���+�&*�'��-

/$0�!� , .��+���( �&�,��� �2 *�� &,*,�-*�& *)���'�� ,�(��,&*�',*��� �2 4�.5"� ,* 4��� &��&��*�,*���� 6���� ��>- ������*,�&� �� �/���'�(� %= 2����& 4�.5"�R 1= 4���R %1= &� +��3�2 2����& 4�.5"� ,�( 4���R %�= &� +�)�( �R %�1= &� +��3/�*6��� &� +�)�( � ,�( 4���R %��= &� +�)�( ��R %�= ��,&*�'�4�.5"�R %��1= &� +��3 /�*6��� &� +�)�( �� ,�( 4���R %���=&� +�)�( ���R %#= �,*��* ��>- � �����*,�* *� ��,&*�',*���/- 4���= +����/�- , �(�2��( 2�� �2 &� +�)�( ���� $�� �:),5*��� /���6 *�� �&�� � ���6� *�� ������,*��� �2 4��� 2�� ��

Page 6: The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate

���

�� � ����

���

�� *�)� /��� *�� +,�*�*��� �,*�� /�*6��� *�� &� 5+�)�( ��� +,*�6,- ,�( ��,&*�',*���= ,�(�

�@ � �7��

�@�

6���� �@ �� *�� +,�*�*��� �,*�� /�*6��� *�� (�&� +���5*��� �2 &� +�)�( ��� *� 2����& 4�.5"� ,�( *�� 2��5 ,*��� �2 �,*��* ��>- � �%#= +����/�- , �(�2��( &� 5+�)�( ��� �+�&����� �* 6,� ��* +����/�� *� (���&*�-�/*,�� *�� ',�)�� �2 �� ,�( �@ 2�� *�� (,*, �/*,���(�� *�� +�����* �*)(-� 4�6�'��= ',�)�� �2 ���� ,�( �@������ %:� "@7� ,- /� +��*)�,*�(= �2 �* �� ,��) �( *�,**�� /��,'��)� �2 4�.5"� 6�*� *�� +�6��2)� �)�&�(���,&*�',*�� �5.�" �� �� ��,� *� *�,* �2 4�.5 F��=�@= ��= ��G� .���� ��,�- ���)�*� ���* ���6�� *��( *��)��* *�,* *��� �� ��(��( *�� &,���

��*�&*��� ,�( �� �',� �2 �3&��� +���3�(�

E��� *�� +�����&� �2 �3&��� )���,&*�( 4��� 6,�*��*�( 2��= /- ,((�*��� �2 "�$1= �� �5(,- ��&)/,*�����* 6,� 2�)�( *� /� +�����* ���- �� �, +��� *�,* �*����3��/�*�( *�� �+�&*�) �2 &� +�)�( ��� ,�( 6��� ��*�� &���*,�* ��&*��� �2 +��*� �2 ����(),� ,&*�'�*- ,,���*F4���G�F4�.5"�G ����� �����*,�&� 6,� ������ !� �3&���4��� 6,� (�*�&*�( �� �, +��� ,* F4���G�F4�.5"�G�,*��� �� *�� ���+�� +,�* �2 �)&� +��*� �)+ *� �,*��� �2,++��3� ,*��- �����= ,� ���6� �� ;�� ��4,'�� (�*�� ���( *�� &��&��*�,*��� �2 4���

�� ,���� �� , �, +��= �* &�)�( /� �� �'�( /- ,((�5*��� �2 ,* ��,�* *6�&� *�� &��&��*�,*��� �2 ,�&��/,*��

"2*�� *��,* ��* �� *��� 6,- *�� �+�&*�) �2 2����&4�.5"� 6,� ��&�'���(= ��(�&,*�� *�,* *�� &� +�)�(��� �+�&��� +�����* 6,� �*��� &,+,/�� �2 ��,&*��� 6�*���()&�� �)/�*�,*��= �'�� �2 �*� ��,&*�'�*- 6�*� 4���6,� �3*�� ��- ��6� �� �',� �2 *�� �3&��� 4��� )���&,*,�,�� 6,� ,��� ,**� +*�(� �� *��� &,�� *�� �+�&*�) �2 &� +�)�( �� 6,� �)/��:)��*�- �/���'�(� $�� ��*��<��- �3+�,�,*��� 2�� *��� �� *�,*= �6�� *� *�� �����,22���*- �2 +���3�(,�� 2�� 4���= &,*,�,�� �� )�,/�� *���*����- �� �'� *�� �3&���R *�� ����()� �2 4��� *�����,&*� 6�*� ������,*�( 2����& 4�.5"� *� 2�� &� 5+�)�( ���

��&)/,*���� 6�*� *�*�,��*�� �*�,��

$!0 �� , +�6��2)� �&,'���� �2 ��� ,�( �,� /���

���6� *� ���,�&� *�� ������,*��� �2 2����& +���35�(,�� 2�� &� +�)�( ��� F��G� E��� ��&)/,*����3+��� ��*� 6��� &,����( �)* 6�*� ��6 &��&��*�,*�����2 $!0 +�����*= *�� ��'�� �2 �����*,�* 4�.5"��/���'�( ,2*�� �� � 6,� ��6�� *�,� �� �*� ,/���&�� $���22�&* 6,� (�+��(��* �� *�� &��&��*�,*��� �2 $!0,((�( �� ��&)/,*���� ,* @��� F4���G�F4�.5"�G� � V0$!0= �7��8 ��R � V0= ����8R � V0= �@��8R � V0=����8R ,�( �� V0= ����8� $�)�= *�� ��'�� �2 ����(),�,&*�'�*- +�����* �� *�� �����*,�* 2�,&*��� 6,� ��()&�(/- ,++��3� ,*��- ��8� "�*��)� *�� &�,��� �� ����(5),� ,&*�'�*- 6��� ��* �,��= *�� ���)�* 6,� /��,(�- ��,��� ��* 6�*� +��'��)� 6��< F��G� �� ��&)/,*���� ,*��6�� �,*��� �2 4��� �)+ *� ����� *�� ,((�*��� �2$!0 �,( �� �,�)�,/�� �22�&* �� *�� ����(),� ,&*�'�5*-�

# � 1 �����,*��� /�*6�������(),� ,&*�'�*- ,2*�� � (,-���&)/,*��� ,�( *�� 1���* ,3�5 ) ,/���/,�&�� E��� *������(),� ,&*�'�*- ��� 2�� ,���&)/,*��� �2 4�.5"� 6�*�4��� ,* +4 ��� �� +��**�(,�����(� *�� ,/���/,�&� ,**�� 1���* ,3� ) ��= ���;�� @�= *���� �� ,� �/'��)�&�����,*��� /�*6��� *�� ���� �2,&*�'�*- ,�( �2 ,/���/,�&��"((�*���,��-= �3&��� 4��� ���6,� (�*�&*�( )��� "�$1 ���, +��� &��*,����F4���G�F4�.5"�G �,*��� 2�� ���� *� @��� 6���� , &� 5+�)�( ��� 6,� (�*�&*�( �+�&5*���&�+�&,��-

Page 7: The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate

���

$� � &�)��� �2 ��,&*�',*���

$�� ��,&*�',*��� �2,�� �� ,&*�'�*- 6�*� "�$1� �24�.5"� �� V0� ,,���* *� � 6,� 2����6�( 2�� ��'��,���)�� �'�� , �,�� �2 4��� &��&��*�,*���� ��= �= @= �=��= �� ,�( �� 0�� $�� ���)�*� ,�( ����� �3+����*�,�&)�'� 2�*� *� *�� (,*, ,�� ���6� �� ;�� �,� ;�)�� �/(� ���*�,*�� *�� �-+��/���& 4��� &��&��*�,*���(�+��(��&� �2 ��,&*�',*���� ;�� *��� +��* ,� ,++,�5��* �,*� &���*,�* �� ,3� ,�( , (����&�,*��� &���*,�*

���� 6��� &,�&)�,*�( *� /� @���A����B���� ��� ,�(����A���� 0= ���+�&*�'��-��* �� � +��*,�* *� ��*� *�,* �6�� *� *�� <���*�&

/��,'��)� �2 *�� �-�*� ���� %:� "�� *�,* � ,3C���4�6�'��= �� &,� /� &,�&)�,*�( 2�� *�� ',�)� �2 ��,�( �@ ���� %:� ���

�� � ���� ���@ ��� ���"((�*���,��-= �2 *�� ',�)� �2 �� �� ,��) �( *� /�,++��3� ,*��- �= ,� �� �/���'�( �� *�� &,�� �2 4�.5=*��� 2�� %:� � , �� ',�)� &,� /� &,�&)�,*�(�

�� � @�7� ���@ ��� ���

,*,�,��5��<� &-&�� �2 4�.5"�

�� &� �� 6�*� 4�.5= *�� &,*,�,��5��<� �3-��5+��5()&�� ,&*�'�*- �2 4�.5"� ,++�,�� *� +��'�(� *��+���&�+,� +��*�&*�'� �&�,��� ,',��,/�� *� *����>- �= (� ��,*�� *�� +���3�(,��5��<� �)+���3�(�+,*�6,-� $�� +4 +��2��� �2 *�� &,*,�,��5��<� &-&���;�� �� ����,��- +,�,�����( *�� +4 +��2��� �2 *����&)/,*��� �3+��� ��*�= �)��*�� *�,* *�� &,*,�,��5��<� ,&*�'�*- 6,� *�� ,�� *)���'�� +,*�6,- �� *����,&*��� �2 4�.5"� 6�*� 4���� $�� ��(�+��(��*�-&,�&)�,*�( ',�)� �2 �� �/*,���( 2�� *�� ���+� �2 *���*�,��* ���� 2�**�( *� *�� ',�)�� �2 *�*,� �3-�� +��5()&*��� +���� *� ��,&*�',*��� �*�� ��2���*� +��()&*= ��,,���* *�� ���*�,� &��&��*�,*��� �2 4�.5"� 6,��?����A��� ���* ���6��� $��� ',�)� 6,� /��,(�- ��,��� ��* 6�*� *�,* �/*,���( �� ��(5+���* ��&)/,5*����= ,�*��)� �* ���)�( /� ��*�( *�,* *�� ��2���*�+��()&* ���- ,'� ,� ,++��3� ,*� ���)�* �6�� *� *��

# � 2�3 $� � (�+��(��&� ,�( <���*�&� �2 *�� ��,&*�',*��� �24�.5"� /- 4���� � ��,&*�',*��� �2 4�.5"� 2����6�( �'��*� �� 4�.5"� �� V0� 6,� ��&)/,*�( 6�*� 4��� ,* 0 &��&��5*�,*���� �2 ��� ���= ��� ���= @�� ���= ��� ���= ���� ��� ,�( ������� �� +���+�,*� /)22�� ��� 0= +4 ���= �� W�� "��:)�*� �2�� V# 6��� ,��,-�( ,* *�� �+�&�2��( *� �� 2�� ����(),� ,&*�'�*-6�*� "�$1� 1���� �3+����*�,� *� � &)�'�� 6��� 2�**�( *� *��(,*, *� �/���'�( �,*� &���*,�*� �2 ��,&*�',*���= ��/�� .��* �2��/� ,,���* F4���G ���6�� *�� �-+��/���& &)�'� 2�*� $�� ,++,�5��* �,*� &���*,�* �2 ��,&*�',*��� �� ,3� ,�( *�� (����&�,*��� &��5�*,�* ���� 6��� �/*,���( )��� 1� ,.��* 2�� E��(�6�

# � 4 +4 (�+��(��&� �2 *�� &,*,�,��5��<� ,&*�'�*- �2 4�.5"��$�� ���*�,� �,*� �2 +��()&*��� �2 �3-�� ,� 2�� 4������� 0� /- 4�.5"� ����� V0� �� *�� +4 �,�� @���7����� 0 /)22���= � ��(�) &�*�,*�= � ��(�) +���+�,*�=���(�) &,�/��,*�= � # *�*,� '��) �� 6,� (�*�� ���( )��� ,��3-�,+� �-�*�

Page 8: The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate

���

���*� �2 *� � ��:)���( *� &,��- �)* *�� �3+��� ��*�,� �)��*�( 2�� *�� <���*�&� �2 ��,&*�',*����� $��,22���*- ��0?��� �2 4�.5"� 2�� 4��� �� *�� &,*,�,��5��<� &-&�� &,�&)�,*�( 2�� *�� �-+��/���& +��* �2 ���*�,��3-�� +��()&*��� ,,���* F4���G �;�� �� 6,����7 0 ,�( *�� &,*,�-*�& &���*,�* ��@?� ,3�F%G� 6,���� ���� $�� &,*,�,��5��<� ,&*�'�*- 6,� ����,��- (�+��(5��* �� *�� &��&��*�,*��� �2 4�.5"� ���* ���6���$�� &,*,�,��5��<� ,&*�'�*- �2 4�.5"� *�,* �,( +��5

'��)��- /��� ��&)/,*�( 6�*� 4��� 6,� +��+��*���,� *�*�� ����(),� ,&*�'�*- �,�)��( )��� *�� "�$1 ,��,-�4�6�'��= 2���* ��(�&,*���� �)��*�( *�,* *�� �����*,�*2�� �2 4�.5"� ����� ,2*�� ��&)/,*��� ,*F4���G�F4�.5"�G �,*��� �2 ���� �� @���= 6���� *���+�&*�) �2 &� +�)�( ��� 6,� �/���'�(� +�������( , )&� ��6�� ��'�� �2 &,*,�,��5��<� ,&*�'�*- *�,��3+�&*�( �'��*),��- )�(�*�&*,/���� 4�6�'��= 6���,�&��/,*� 6,� ,((�( *� *�� �(�) *� ������,*� *��2����& ��>- �= *�� +��+��*���,*� ��'�� �2 �3-�� +��5()&*��� �9��8� 6,� �,�)��(� $��� ���)�* 2)�*��� &��52�� � *�,* *�� �����*,�&� *� 4��� ���� �� 4�.5"� ��()� *� *�� +�����&� �2 , �*,/�� &� +�)�( ���5��<� �+�5&���= 6��&� ��,&*� '��- +����- 6�*� 4��� /)* �� &,+,5/�� �2 ��,&*��� 6�*� ��()&�� �)/�*�,*�� �)&� ,� "�$1=),�,&�� �� ,�&��/,*��

T���*�& �(��

$� ,&&�)�* 2�� *���� ���)�*� , <���*�& �(�� ����1&�� �� � ,�( �= ,�( *�� "++��(�3� �,� /��� (�'��5�+�( )��� ,� �*� /,��� , +��'��)� *�����*�&,� �3, ��,5

*��� �2 *�� <���*�&� �2 �&�,��� 5/,��( ��)�&�(�� ��,&5*�',*��� F�7G ,�( �)� +��'��)� 6��< �� 4�.5 F�= �7=��= ��= ��= ��= �@= ��= ��G�$�� +���&�+,� &�,�,&*����*�&� �2 *�� �(�� ,�� ,�

2����6�� 4�.5"� )�(����� , �,+�( �&� +,��( *� ,��*�� �*����� ��,&*��� 6�*� 4��� *� 2�� &� +�)�( ���� *�� ,/���&� �2 ��()&�� �)/�*�,*�� �)&� ,� "�$1�� ),�,&��= &� +�)�( � 2�� � , &� +��3 6�*� , ��&5��( ���&)�� �2 4���� " +,�*�*��� ��6 �&&)��/�*6��� , &,*,�,��5��<� +��&��� �� 6��&� �3-�� ,� ������,��(= , +,*�6,- ��,(�� *� *�� ����,*��� �2 &� 5+�)�( ��� ,�( ��

�= ,�( ��,&*�',*��� �.��� 2�� ,*�����4�6�'��= *� �3+�,�� *�� /��,'��)� �2 4�.5"� 6�

�,'� ��*��()&�( , ��6 +,*�6,- ��,(�� 2�� &� 5+�)�( ��� *� , :),��5�*,/�� ��*�� �(�,*� �%#� *�,* ,-/� , 2�� �2 &� +�)�( ���= ,� +��'��)��- �)��*�( /-!,<,X� , ,�( Y, ,>,<� F��G� %# +����/�- &��*,��� ,*��*�- /�)�( ��

� ,�( 6�)�( *����2��� /� ���&*����5&,��- �:)�',���* *� �3-2����)� +���3�(,��� "� �)&�= �*��'��*� ���- '��- ���6�- *� 2����& +���3�(,�� ,�( �,�'��- ��6 ,&*�'�*- 6�*� 4��� ��� &,*,�,�� ,&*�'�*-�= /)*�� ,((�*��� �2 , ��()&�� �)/�*�,*� �)&� ,� ,�&��/,*��* 6��� ������,*� 2����& ��>- �� $����2���= %# ��+5�����*� , +��� �2 ��>- � *�,* �� �*,/�� �� *�� +�����&��2 4��� ,�( 6��� *�)� ��* /� �����*�'� *� ��,&*�',*����*�� �����*,�* ��>- � 2�,&*��� �/���'�( �� ��(5+���*��&)/,*��� �3+��� ��*���E� �,'� ,��� ��*��()&�( , ��&��( +����/�� ,((�5

*���,� +,*�6,- �1&�� � �� ��,(�� 2�� &� +�)�( ���*� &� +�)�( �= �)&� , +,*�6,- �,'�� /��� �/���'�(F��G� $��� +��&��� 6�)�( �+��,*� ���- ,* '��- ���&��&��*�,*���� �2 4���= 6���� &� +�)�( ��� /�&� ���,*)�,*�( 6�*� 4���= ,�( �3+�,��� *�� <���*�&��/���'�( )�(�� �)&� &��(�*����= 6���� 4�.5"� ����(5

# � 5 4-+��/���& F4���G &��&��*�,*��� (�+��(��&� �2 *�����*�,� �,*� �2 &,*,�,��5��<� �3-�� +��()&*��� /- 4�.5"�� $�����*�,� �,*�� �2 �3-�� +��()&*��� /- 4�.5"� ����� V0� 2�� 4��� �� *� ��� 0� �� �� 0 +���+�,*� /)22�� �+4 ����� $�� ,3� ) �,*� �2 4��� +��()&*��� �� ,3� ,�( *�� ,22���*- �24�.5"� 2�� 4��� ���� 6��� �/*,���( 2�� , +��* �2 ���*�,��,*�� ,,���* F4���G )��� 1� ,.��* 2�� E��(�6�

/$0�!� - .��+���( �&�,��� �2 *�� &,*,�-*�& *)���'�� ,�(��,&*�',*��� �2 4�.5"� ,* 4��� &��&��*�,*���� 6���� �� ����(5),� ��>- ,*�& ,&*�'�*- �� �/���'�(� %= 2����& 4�.5"�R 1= 4���R%1= &� +��3 �2 2����& 4�.5"� ,�( 4���R %�= &� +�)�( �R %�1=&� +��3 /�*6��� &� +�)�( � ,�( 4���R %��= &� +�)�( ��R %�=��,&*�'� 4�.5"�R %��1= &� +��3 /�*6��� &� +�)�( �� ,�(4���R %���= &� +�)�( ���R %���1= &� +��3 /�*6��� &� +�)�(��� ,�( 4���� $�� �:),*��� /���6 *�� �&�� � ���6� *�� ����5��,*��� �2 4��� 2�� ��

Page 9: The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate

���

),� ,&*�'�*- �� ���� *� 2,�� *� >��� ����� *���� �� �������*,�* 2�,&*�����" �) ,�- �2 *�� &���*,�*� ,�( +,�*�*��� �,*���

�/*,���( 2�� *�� ���)�*� ,�( �(�� �� �'�� ��$,/�� ��

�� �� ��

$�� ���)�*� +�����*�( ���� 2�� 4�.5"�= *,<��*��*��� 6�*� +��'��)��- +)/�����( ���)�*� 2�� 4�.5F�= �7= ��= ��= ��= ��= �@= ��= ��G ,�( *�� *�����*�&,�*��,* ��*� �2 *�� *6� �����>- ��= +��'�(� 2�� �'�(��&� 2�� *�� ����,� �&�,��� �2 ��,&*�',*����+��*�&*��� ���6� �� 1&�� �� � ,�( �� $�)�= �* ,++�,��*�,* 4�.5"� ��,&*�� 6�*� 4��� �� *�� ,/���&� �2��()&�� �)/�*�,*�� �� �)/X�&* *� , +�������'� ���� �2,&*�'�*- *�,* �� &�,�,&*���>�( /- , �)�&�(� �)/�*�,*�5/,��( �&�,��� � �� &� �� 6�*� 4�.5= *���� ,��*6� &,*,�-*�& +,*�6,-� *�,* &� +�*� 6�*� ��,&*�',*���,�( ���+ ,��*,�� ��>- ,*�& ,&*�'�*-= ,* ��,�* 2�� ,*� ��$�� +���&�+,� +��*�&*�'� �&�,��� �2 4�.5"�

�,�( 4�.5� �� , &,*,�,��5��<� +��&��� *�,* ��,(� *�*�� ����,�� �2 �3-�� ,�� ,*,�,�� ,&*�'�*- �� 4�.�,� )�*�� ��&��*�- /��� �,*��� , +��/�� ,*�& �)/X�&*F�GR ��6�'��= �* �� ��6 &��,� *�,* *�� ,X���*- �2 +��5�3�(,��� 6��� ,&* �� *��� 6,- *� , ��,*�� �� ������(����= ,�( *�,* *�� �3*��* *� 6��&� *��- (� �,�� +��*,�* &����:)��&�� 2�� *�� �*,/���*- �2 *�� ��>- �*�6,�(� +���3�(��� $�� &,*,�,��5��<� ,&*�'�*- �2 4�.��= �� 2,&*= �,*��� 6�,<R �� , �,�<�� �2 ���,*�(��>- �� �* �� &���� *� *�� /�**� �2 *�� ���*� *�)� &,*,5�,����/,&*���,� &,*,�,��5+���3�(,���S&�����+���3�5(,���S4�.S,�&��/,*� +���3�(,��� F@�= @�= @�= @@G��,&*���,� &,*,�,��5+���3�(,��= ,� �*� �, � �)��*�= ��, '��- �22�&*�'� &,*,�,�� ,�( �� '��- �*,/�� 6�*� 4������ &��*�,�*= ,�&��/,*� +���3�(,�� �".Q� ��� � *���*����- �,&< &,*,�,��5��<� ,&*�'�*- ,�( �� ��,&*�',*�( /-���- , 2�6 �:)�',���*� �2 4��� F@@G� $�)�= ,� ��(�5&,*�( /- *�� (,*, +�����*�(= 4�. �� ��*�� �(�,*� ���*� ,/���*- *� +��*�&* �*���2 ,,���* *�� �22�&*� �2 4����

$�� ,X�� (�22����&� �� *�� /��,'��)� �2 4�.5"�&� +,��( *� 4�.5 �� *�� +�����&� �2 ��>- �= �� *��&,�� �2 4�.5"�= *�,* ��*,��� ,&*�'�*- 6��� ,��,-�(6�*� ��()&�� �)/�*�,*�� �'�� ,2*�� ��� ��&)/,*����)�(�� &��(�*���� 6���� 4�.5 6�)�( /� &� +��*��-��,&*�',*�(� E� �,'� �/���'�( , 4�.5"� ��*�� �(�5,*� 6�*� , &� +�)�( ���5��<� �+�&*�) �� ��&)/,*�����,�*�� � (,-� ,�( �� *�� +�����&� �2 �3&��� 4���=��(�&,*�� *�,* *��� ��>- � 2�� �� ��*��� ���- ���5 ,��- ,&*�'� �� (��� ��* ��,&* ,* ,�� 6�*� 4���� 4�65�'��= *��� �+�&��� ,++�,�� *� ��,&* ��� ,��- 6��� ,��()&�� �)/�*�,*� �� ,((�( ,�( *����2��� ,++�,�� *�/� , ��� ,� ��>- ,*�& �+�&��� �,*��� *�,� , �(�2��(2�� �)&� ,� *�,* �/���'�( 2�� ".Q F@@G= 6��&� (� 5���*�,*�� ,�*���( �,�( ��6��� ,&*�'�*- 6�*� ��()&*,�*�=���� *�� ��8 ����(),� ,&*�'�*- �2 4�.5"� �� ()� *���8 �2 *�� �����,� ��>- � ��,&*�� ��� ,��-= �,*���*�,� , ��,*�� +��&��*,� �2 *�� ��>- � 6�*� ��6��,&*�'�*- ,� �� ".Q� �* �,� /��� �)��*�( +��'��)��-F��G *�,* +���3�(,�� &,� 2�� *6� *-+�� �2 &� +�)�(��� 6��&� ,�� (�22����*�,*�( /- *�� +�����&� ��,/���&� �2 , �-(����5/��(�( 6,*�� �� *�� ,&*�'� ��*�,��� 6�*� *�� �)+���3�(� ,���� ���

�� &���(��,*�( *�*�� 2����& ���� &��*�� ��� (��3-�� /�)�( *� 2����)����� /- ,�,��- 6�*� �3- -���/���� $�� &� +�)�(��� 2�� &��*,���� *�� 6,*�� 6��� /� &� +,�,*�'��-)��*,/�� ���&� *�� ��

� �� ���- 6�,<�- /�)�( ,�( &,�*�)� /� �,���- ���*= ������,*�� *�� �,*�'� 2����&��>- � �*��� 2�� �2 &� +�)�( ��� ,- /� &����(���(*� /� Z��� ,�[�� E���= ��6�'��= *�� 6,*�� ���&)���� ���* 2�� *�� ,&*�'� ��*� *�� ��

� /�&� �� )&� ��� *��*�- /�)�( ,�( ���&� �,�(�� *� (����(�R *���*-+� �2 &� +�)�( ��� 6��� *����2��� /� )&� ����*,/��� E� �)��* *�,* X)�* �)&� , &� +�)�( ��� ���52����( *� ,� �,*��* ��>- �= %#� ,&&�)�*� 2�� *�� �����*5,�* 2�,&*��� �2 4�.5"�� $�� 2�� ,*��� �2 %# ��4�.5"� 6��� /� ��(�+��(��* �2 4��� &��&��*�,*���,�( , +,�*�*��� /�*6��� �*� 2�� ,*��� ,�( *�� ������5,*��� �2 2����& +���3�(,�� 2�� &� +�)�( ��� 6����3��*� �� *�� &,�� �2 4�.5= �* �� +����/�� *�,* *�� 2��5 ,*��� �2 , �� ��,� %# �+�&��� �� <���*�&,��- (��52,'�)��(= ��,(�� *��� �����>- � *� &� +��*� ��,&*�',5*���� $����2���= *�� �&�,��� �2 ��,&*�',*��� �24�.5 ,- /� &����(���( ,� , �+�&�,� &,�� �2 *�,*���6� �� 1&�� � �= �� 6��&� *�� ',�)� �2 �� �*�� �*�+2�� &� +�)�( ��� *� %#� �� '��- � ,�� &� +,��( *��7 �*�� �*�+ 2�� &� +�)�( ��� *� 2����& 4�.�� ��&��*�,�*= 6� ��*� ,*� *�� �,*�� �2 2����& ��>- � ����5��,*��� &� +,��( *� %# 2�� ,*��� ��7���?�@� *� /� ��� *�� &,�� �2 4�.5"�R *�)� *��� �����>- � 2�� � ,&����(��,/�� , �)�* �2 %# �9��8� ,�( �*� ,&*�'�*- ��+��*�&*�( *� , )&� ��,*�� �3*��* �� ��&)/,*���� 6�*�4���� $�� +4 (��� ��* ,++�,� *� ��,*�- ,22�&* *��2�� ,*��� �2 %#� ,&���� *�� �,�� +4 �������= ,++��35� ,*��- *�� �, � ��'�� �2 �����*,�* ��>- � ,&*�'�*- 6,� �,�)��(� 4�6�'��= *�� +4 (�( &�,�� *�� �) /�� �2�:)�',���*� �2 4��� ��:)���( *� &,)�� ��,&*�',*����)�(�� ��� ,&�(�& &��(�*���� *�� ��>- � 6,� )&� ��� �����*�'�� " �� ��,� +4 �22�&* �,� /��� �/���'�(

6�(�� , ���*,�*� ,�( +,�*�*��� �,*��� &�,�,&*���>�� *�� ,&*�'5�*- ,�( ��,&*�',*�� �2 4�.5"� 6�*� 4���� �@ ,�( �� ,�� *��&,*,�-*�& &���*,�* ,�( ,22���*- &���*,�* 2�� 4��� �/*,���( 2�� �,�)�� ��*� �2 *�� &,*,�,��5��<� ,&*�'�*- �2 4�.5"�� �� �� *����,&*�',*��� �,*� &���*,�* 2�� 4�.5"� 6�*� 4���� �� �� *�� �,*�&���*,�* 2�� *�� 2�� ,*��� �2 &� +�)�( ��� $�� +,�*�*��� �,*���,��� �� /�*6��� *�� &,*,�,��5��<� &-&�� ,�( ��,&*�',*���R ��/�*6��� *�� &� +�)�( �����)+���3�(� +,*�6,- ,�( ��,&*�',*���R�@ /�*6��� (�&,- �2 &� +�)�( ��� *� 2����& 4�.5"� ,�( 2��5 ,*��� �2 %#

���*,�* .,�*�*��� �,*��

�@ ��� ��� �� ��@���� ������ �@ 0 �� ������� �,�� ���B���@ ��� �@ ��7���� ��� @�7B���@ ���

,J,�)� 2�� 4�.5 6�*� �5.�" *,<�� 2�� F��G

Page 10: The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate

��@

2�� 4�.5 ,�( �,� /��� ,**��/)*�( *� *�� &,*,�,��5��<� +,*�6,- /��� (��2,'�)��( ,* ��6�� +4� 4��&�*���� �� , &�����,*��� /�*6��� *�� �) /�� �2 �:)�'5,���*� �2 4��� ���(�( *� ��,&*�',*� *�� ��>- � /- ,�'�� , �)�* ,�( *�� &,*,�,�� ,&*�'�*-� %3,&*�- *���, � &����&*��� ,- /� ,(� 2�� 4�.5"�= ,,��� +�,��>�� *�� � +��*,�* +��*�&*�'� ���� �2 *�� &,*,5�,�� &-&��� $�� ��'�� �2 �����*,�* 4�.5"� 6,� ��6���(/- ��&)/,*��� �� *�� +�����&� �2 *�� ��

� �&,'����$!0� $��� &� +�)�( 6��� 2,'�)� *�� ��&�'��- �2 2��5��& +���3�(,�� 2�� &� +�)�( ��� �'�� *�� 2�� ,*����2 %#R �* *����2��� ��()&�� �����*,�&� 6�*��)* &�,���*�� *�*,� �) /�� �2 �:)�',���*� �2 4��� )��(�$�� /��,'��)� �2 4�.5"� ,* '��- ��� &��&��*�,5

*���� �2 4��� �/�*6��� ��=��� ,�( ��=��� �:)�'� ���� �6�,* (�22����* *�,� ,* ��6�� ��'���� "* *���� &��5&��*�,*����= *�*,� ��,&*�',*��� �2 *�� +���3�(,�� ���/���'�(= �� /�*� ��&)/,*��� ,�( <���*�& �3+��� ��*��$� ,&&�)�* 2�� *��� &�,�� 6� �,'� ,((�( , ��)*��1&�� � �� ��,(�� (���&*�- 2�� &� +�)�( ��� �M��3�(,*��� �*,*�� *� &� +�)�( � �M� �3�(,*��� �*,*��=,� �,� +��'��)��- /��� +��*)�,*�( ,�( �/���'�( F��G�4��� ���)�( /� ,/�� *� &,��- �)* *��� �����5���&*�����()&*��� �2 &� +�)�( ���= 2�� �� ��

� �� *�� +��&5���= ,�( �2 *�� &��&��*�,*��� �2 4��� ,((�( �� ������)� *� �,*)�,*� *�� &� +�)�( ��� *�� ��6 +,*�6,-6��� ��,( *� *�*,� 4�.5"� ��,&*�',*��� ���&� '��*),��-�� %# 6��� /� ,/�� *� 2�� �.�,�*� ,++�,� *� �3+���� , �,*��� �,�� �) /�� �2

���+���3�(,���= 2�� �3, +�� ����������� ���������*�,�� &����� �,� /��� ���6� /- ,�,�-��� �2 *�� (,*,5/,�� �2 �3+�����( ��:)��&� *,� �(/%1$� *� +������ ,*�*,� �2 ,* ��,�* �� +���3�(,��� F@�G= ��&�)(�� , 2, ��-�2 &�,�� � ,�&��/,*� +���3�(,��� F@�G� K�(�)/*�(�-=�� � �2 *��� (�'����*- 6��� /� ,&&�)�*�( 2�� /- �3+���5���� ,* (�22����* *� �� �� ��&,*���� ,�( )�(�� (�22����*&��(�*����= 2�� ���*,�&� �2 �3�(,*�'� �*����R ��6�'��=*���� ,- ,��� /� , &��*,�� , �)�* �2 ��()�(,�&- �22)�&*���� $����2���= *�� +�-������&,� 2)�&*���� �2 *��(�22����* ���+���3�(,��� ,�� ,* +�����* ��* '��- &��,�=,�*��)� *���� �� *�� ,+�+�,�*�& �+,&�= �)&� ,�4�.5"� F@�G= ,�� +��/,/�- ��'��'�( �� +��&����� �)&�,� ����2�&,*���� $�� +��+��*��� �2 4�.5= 6��&� ��2�)�( �� *�� ',&)��� F@�G ���� ,22���*- 2�� 4���= �,+�(2�� ,*��� �2 ��= ,�( ��� ,&*�'�*- ,* ��6 &��&��*�,5*���� �2 ��()&�� �)/�*�,*�� �)��* *�,* �* &�)�( ,&* ,�,� �22�&���* (�*�3�2-�� �-�*� *� ��� ��,*� �3&��� +��5�3�(�= +���,+� /- ��,&*��� 6�*� &� +�)�(� �)&� ,�2�,'����(� F@�G� $��� ���� �� ��� ,��- ,���&�,*�( 6�*�&,*,�,�� ,�( ,�&��/,*� +���3�(,�� �� *�� &-*�+�,� ,�( ��,������ F@7= @�G� 4�6�'��= ,� �,� ��&��*�- /������6� �� '�'� �� �)+�� �-+�&�*-�� 2�� *�� 4�.55��<������>- � #).5�� F��G= *�� ����*�- /,��& ���+���35�(,��� ,�� ,��� �,*��� �����*�'� *� �,+�( ,�( *�*,� ��,&5*�',*��� 6��� ���)22�&���* ��()&*,�* �� ,',��,/�� *���,&* 6�*� &� +�)�( �� �� 2,&*= *��� ��,&*�',*��� ,-/� )��2)� *� *�� +�,�* )�(�� &��*,�� &��&) �*,�&����)��� *�� Z�-+�������*�'� ���+����[ *� +,*�����&,**,&< ,� �3�(,*�'� /)��*= 6�(��- /����'�( *� /� ()� *�

4��� ,�( ��� �F��G ,�( ��2����&�� *�������= ��,(� *�

&��� (�,*�= *�)� 2�� �� , /,����� *� 2)�*��� ��&)�������*� ��,�*�- *���)� /- *�� +,*���� �F��G ,�( ��2��5��&�� *�������� $�� �����*,�&� �2 ,* ��,�* , � ,�� +,�*�2 *�� ,&*�'�*- �2 4�.5"� *� *�� �22�&*� �2 ,� �3�(,5*�'� /)��* ,- ,���6 *��� �����>- � *� ,&* �� �� �6,- ��&� *�� �*���� �,� +,���(= 2�� ���*,�&� *� ����52��&� *�� �� ,���� &��� 6,��� �2 *�� /,�����= /)* 6�*�5�)* ��()&�� *�� �22�&���&- �2 *�� /)��* �*���2�.���3�(,��� �,'� ,&*),� �� +�*��*�,� ,++��&,*���� ��

/����,&*���= (�*����*� ,�( 2�� (�&��*, ��,*��� ����6,*�� +���)*�( 6�*� +�������� 1)&� ,++��&,*���� �2*����:)��� *�� ��>- � *� 6��< )�(�� �,��� &��(�*���� �2*� +��,*)��= ,&�(�*- ,�( �3�(,�* &��&��*�,*��� 2��&����(��,/�� +����(�� 1��&� �* �� &��,� *�,* ,X�� (�252����&�� �3��* �� *�� ,&*�'�*- ,�( �����*�'�*- �2 *��,&�(�& ,�( ����*�- /,��& ���+���3�(,���= *�� &���&� �2��>- � 6��� ���( *� *,<� ��*� ,&&�)�* ,�� *�� 2,&*���,/�'�= ��&�)(�� *�� ��,&*�',*��� &�,�,&*����*�&� ����(�� *� ,&���'� *�� (�����( ���)�* ��* �22�&���*�-�$��� �*)(- �� 4�.5"� �,� &��2�� �( ,�( �3*��(�(

*�� �&�,���*�& �(�� *�,* �,� /��� (�'���+�( *��3+�,�� *�� ��,&*���� �2 +���3�(,�� 6��� 4��� �� +��5'�(�( ,� *�� ���- �)/�*�,*�� $�� �(�� 2�� 4�.5 (�(��* +��'�(� , +��2�&* �3+�,�,*��� 2�� *�� ��,&*�',*����2 *�� ,&�(�& ���+���3�(,��= /)* �* ��6 ,++�,�� *�,* /-/)��(�� �� *�� �3��*�� 2�, �6��< *�� (�22����&�� ��/��,'��)� �,'� /��� &�,��2��(� 4�.5"� �� &��,��- ���5��*�'� *� ��,&*�',*��� /- 4��� /)* �� �6�,* ���� *�,��� 4�.5� $�� �&�,��� ��*,��� *�� &,*,�,��5��<�&-&�� *�,* ,&*� ,� *�� ,X�� +��*�&*�'� ,&*�'�*- �24�.= ,�( ,��� *�� &� +�)�( ��� +,*�6,-= 6��&�,�*��)� �2 &� +,�,*�'��- ���� � +��*,�&� �� *�� ��2 *)���'�� �� ��6 &��,��- ��&���>�( ,� '�*,� 2�� *�����5*�� ,��*��,�&� �2 �� � +���3�(,�� ,&*�'�*- /-4�.5"� )�(�� �*����- �3�(�>�� &��(�*�����

�$7��+�����!���� $��� 6��< 6,� �)++��*�( �� +,�* /- , �,�*2�� *�� %K $�,���� ,�( 0�/���*- �2 ����,�&���� .���, �$0� !�*6��< Z.���3�(,��� �� "��&)�*)��= *�� %�'���� ��*,�( ��()�*�-[ �&��*�,&* ;0�Q5$�75����� ,�( 2�� *�� � �5��N� ��*�� ����*���,� (� ���&�, - $�&����I, �1+,��� ��Y$5"#��75������ ��4��� �,� , �,�* 2�� ,X,0)�&�, �1+,����"�!�.�4� �,� , �,�* 2�� *�� $0� ��*6��<� $�� ,)*���� ,�� ��* ��(�/*�( *� .��2����� 4��� �)�2��( 2�� 2�)�*2)� (��&)�������� *��� 6��<�

��������

0�&�,���*�& �&�� �� ,�( ����,� &�,�,&*����*�&��2 ��,&*�',*���

"* &� +,�,*�'��- ��6 F4���G�F4�.5"�G �,*��� 2�� �*� ����= 4�.5"� �� ��* 2)��- ��,&*�',*�( ,�( ����(),�,&*�'�*- 6�*� ��()&�� �)/�*�,*�� �� ,���� $�� ����(),�,&*�'�*- �� ()� *� *�� 2�� ,*��� �2 *�� �,*��* ��>- �2�� = %#= ,� ���6� �� 1&�� � ��4�6�'��= ,* ����� F4���G�F4�.5"�G �,*��� *��

��>- � �� 2)��- ��,&*�',*�(= �)��*�� *�� +�����&� �2

Page 11: The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate

���

, +,*�6,- *�,* ,'��(� *�� 2�� ,*��� �2 %#R *��� ��)*��� ���6� �� 1&�� � �� �� ��(�� *�,* *�� ��>- � /�2)��- ��,&*�',*�( �* �� ��&���,�- *�,* 2��� &� +�)�( ����� ��* +�����* ����� &� +�)�( ��� �� �,*)�,*�( 6�*�4���� ,�( *�)� *�� �*�+� ��,(�� *� *�� ������,*����2 2����& 4�.5"� ,�( *�� 2�� ,*��� �2 %# &,� /� (��5&�)�*�(�

T���*�&� �2 ��,&*�',*���

"� �,� +��'��)��- /��� (� ���*�,*�( 2�� 4�.5= *����,&*�',*��� +��&��� �2 4�.5"� +��&��(� �� *�� *�,�5��*��� �*,*� *�6,�(� *�*,� ��,&*�',*���� $�� <���*�&,�,�-��� &����(��� �� *� /� *�� � ,����* �,*� &���*,�*=�� *�,* F1�GSSF%�G= ���SS��� ,�( *�� �:)���/��, ��= ��,�( �� ,�� �,+�(� K�(�� *���� &��(�*����= *�� <���*�&���)*��� ���

%� � %����� �"��6���� %� �� *�� &��&��*�,*��� �2 ��,&*�'� ��>- ��.����= %� �� *�� ���*�,� ��>- � &��&��*�,*��� ,�( � ��*�� ,++,���* �,*� &���*,�* �2 ��,&*�',*���� �� *��� 6,-*�� 2����6�� �:),*��� �� ��*,/�����(�

�� � %� � %�%�

� ���� �"��

6���� �� �� *�� ����(),� ,&*�'�*- ,�( *����2����

���� � ��� �"@�$�)� +��**�� ���� '���)� � -���(� *�� ',�)� �2 �= *��,++,���* �,*� &���*,�* �2 ��,&*�',*����K��� , +��'��)� <���*�& ,�,�-��� �2 �&�,��� 5

/,��( ��,&*�',*��� F�7G= ,� �3+������� 2�� � &,� /��/*,���( 6��&� �'���

� ��������

�� ������� ���� ������� � 1�� ��@������������������ ������ � ����������� �

���� ������� ������ ������� � � 1�� ��"��

*�,* �,� *�� 2�� �2 *�� 0�&�,����50��*�� �:),*���,�( &,� /� �3+�����( ��� �� +�- ,��

� � � ,3 1�� ��� � 1�� � �"��

6���� � ,3 �� *�� ,3� ) ,++,���* �,*� &���*,�* �2��,&*�',*��� ,�( �� �� *�� ���*�,� &��&��*�,*��� �24��� �F1�G� *�,* �'�� � ,3��� $�)�= 2�� , +��* �2 �'���)� F1�G *�� ',�)�� �2 � ,3 ,�( �� ,- /� �/*,���(�!�*� *�,*�

� ,3 �� �"��C

6���� �� �� *�� �,*� &���*,�* �2 ��,&*�',*����

1*��&��� �*�- �2 +���3�(� &���) +*���

;�� 1&�� � � *�� �*��&��� �*���� �2 *�� ',���)�+,*�6,-� 2����6�( /- 4�.5"� ��,&*�� 6�*� 4���&,� /� ��*,/�����(�

,*,�,��� ��<� +,*�6,- � �4��� �� � �4�� �"��

��,&*�',*��� +,*�6,- � �4��� %� �4�� �"7�

� +�)�( ��� +,*�6,- � �4��� �� � �4�� �"��

;�� ,*��� �2 %# � �(�2��( &� +�)�( ���� ��4��� �� � �%# � �4��

�"���

$����2���= *�� �*��&��� �*�- �2 4��� &���) +*��� ��(��*��&*= (�+��(�� �� 6��&� ��)*� �� 2����6�(= ,�(*�� *�*,� &���) +*��� 6��� /� *�� �) �2 ,�� *�� (�22��5��* +,*�6,-��

%3+��� ��*� �� *�� ��(5+���* ����(),� ,&*�'�*-

�� ��(�� *� �/*,�� )��2)� ��2�� ,*��� �* �� ��&���,�- *��/*,�� , ���,*������+ /�*6��� 4��� �1�� ,�( ��,&*�'���>- � �%��R *����2���= *�� 2����6�� (�22����*�,� �:),5*���� 6��� (�'���+�(�

( ��� �&(� � �@ %1� � �&,*,�,��� ��<� �3-�� +��()&*����

�"���( %�� �(� � �� %1� � ���,&*�',*���� �"���

( %#� �(� � �� %� � 2�� ,*��� �2 %#� � �"�@�

( ��� ���(� � �

�( ���

�� ���(� � �

� �� %1� �

��3-�� +��()&*��� 2�� &� +�)�( �� 2�� ,*�����"���

( ��� ����(� � �

�( ���

�� ����(� � �

��7 %� �

��3-�� +��()&*��� 2�� &� +�)�( ���*� 2����& 4�. �*�+�

�"���

( ��� �%#(� � �

� �� %1� � � �

��7 %� �

�3-�� +��()&*��� 2�� %# 2�� ,*���� ��"���

$�� ���,*������+ /�*6��� &� +�)�( ��� ,�( F&� 5+�)�( �D4���G ���

%� � � ���7 � ��

%1� � �"���,�( *�)��

( %#� �(�

� ����

�7 � ��%1� � �"�7�

Page 12: The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate

���

( ��� ����(�

� ���7

���7 � ��

%1� � �"���

,�(�

( ��� �%#(�

� ���� %1� � � �

��7

���7 � ��

%1� � � ���� � ���7 � ��

%1� ��"���

$�� /,�,�&� �2 ,*���,� �� *�� ��,&*��� �6����1��4���� ���

1� � � �@�� %� � �%� ���

���7�7 � ��� ��� %� �

��

�����7 � ��� ��� %�

�"����2 +,�*�*��� �,*��� /�*6��� *�� (�22����* +,*�6,-� ,����6 (�2���(= �� *�,* �� �� *�� +,�*�*��� �,*�� 2�� *��&,*,�,��5��<� +,*�6,- ,�( ��,&*�',*����

�� � �@��

�"���

�� �� *�,* /�*6��� *�� &� +�)�( ��� ��)*� ,�( ��,&*�5',*����

�� � ����

�"�@�

,�( �@ /�*6��� &� +�)�( ��� ,�( %#�

�@ � �7��

�"���

%:),*��� "�� &,� ��6 /� &��'�����*�- �3+�����(�

1� � ���%� � �%� � ���@

�� �@%� � ��

���� �@

%� �"���

�� �� *�� � �2 *�� ����(),� ,&*�'�*- �����

��� %��%�%�� �� �� �@

�� ���� ������ ��@ � ����@ � ���@

1�%�

�"���%:),*��� "�� �'�� *�� ���+� �2 *�� 2�**�( ���� �� ,+��* �2 ����(),� ,&*�'�*- ,,���* F4���G�F4�.5"�G ,**�� ��6��* �,*��� 2�� � *� ,++��3� ,*��- ����= 6����,�� *�� ,',��,/�� 4��� �� &���) �( ()��� *�� &�)����2 *�� ��&)/,*��� �3+��� ��*�"* *�� ��( �2 *�� ��,&*��� *�� /,�,�&� �2 ,*���,�

�� *�� � �2 *�� ��>- � �+�&��� �� ��&)/,*���� 6�����3&��� 4��� �� +�����* ,* *�� ��(5+���* ���

%� � %# � %� �"���,�(�

(%#(%�

� �� ���7���

���"�7�

$�)��

%� � %# �� �7 � ��� �����

� ��"���

,�(�

%� � %# �� �� �7 � ��� �����

� ��"@��

4��&� *�� 2����6�� ���,*������+ ,++�����

%#%�

� �������� � �7 � ��� ��� �"@��

6��&� &,� /� ��6��**�� �� *�� � �2 +,�*�*��� �,*����

%#%�

� �������� � �7 � ��� ��� �"@��

%:),*��� "@� �� , &���*,�*= �:)�',���* *� *�� ',�)� �2*�� ����(),� ,&*�'�*- 6��� �����*,�&� �� �/���'�( �� ,+��* �2 ����(),� ,&*�'�*- ,,���* F4���G�F4�.5"�G ,*�,*��� 2�� ,++��3� ,*��- ���� *� ����� $�� ����(),�,&*�'�*- �� ()� *� *�� +�����&� �2 *�� �,*��* ��>- �2�� = %#�

,�&)�,*��� �2 ��= ��= �@= �� ,�( ��

K��� %:�� "�� ,�( "@� ,�( *�� �,�)��( ',�)� �2�@= �* �� +����/�� *� &,��- �)* ',���)� &,�&)�,*�����;�� , +��* �2 ����(),� ,&*�'�*- '���)� F4���G�

F4�.5"�G *�� ���+� ��� �2 *�� ���� �'�� �� %:� "�� ,- /� �/*,���(�

� � �� �@�� ��� � ����� � ��@ � ����@ � ���@

�"@@�

#�<�6���= *�� ',�)� �2 %:� "@� �� <��6� 2�� *������(),� ,&*�'�*- �2 �����*,�* ��>- �� "((�*���,��-= *��+���* � �=!�� *�,* �,*��2��� /�*� �:),*���� �� (�*��5 ���(= 6�����

� � �� ��� � ����� � ��@ � ����@ � ���@�� �� � �@

�"@��

,�(�

!� � ���� �� � �@

�"@��

,��� 6�*� *�� +���* � �=�� 6���� *�� ���� &������ *�� 5,3���

� � �� ��� � ����� � ��@ � ����@ � ���@�� �@

� ��

�"@��

K��� *�� �3+��� ��*,��- �/*,���( ',�)�� �2�?���B���� ���*� *�,* )��� %:� "@� *�� ',�)� ,/�'�-���(� ����= �� ,��� ��* 6�*� *�� �3+��� ��*,��-�/���'�( ',�)�R ��� ;�� ��= !����� ,�( ���7��= �* &,�/� ���� *�,*�

Page 13: The inactivation of horseradish peroxidase isoenzyme A2 by hydrogen peroxide: an example of partial resistance due to the formation of a stable enzyme intermediate

���

��� � ���� �� � �@

�"@��

4��&��

�@ � ��� � � �"@7�,�(�

�� � �� ����� ����7�

� ���

�"@��

�'�� ��������!�6= )��� %:� "�� ,�( *�� �3+��� ��*,� ',�)� �2

�@?��� ���= *�� �,*� &���*,�* �2 ��,&*�',*��� &,� /� &,�5

&)�,*�(�

�� � �@��

� �������

� ���� ���@ ��� �"���

$�� ',�)� �2 �� �� ��* ,',��,/�� 2�� *�� (,*, +��5���*�( �� *��� �*)(- 6�*� 4�.5"�R ��6�'��= *�� �:)�'5,���* ',�)� 6�*� 4�.5 �,� /��� (�*�� ���( *� /� �)��� *�� '��- �*��� ��,&*�',*�� ,��* �5.�" F��G��* �� '��- ��<��- *�,* *�� ',�)� 6��� /� �� ��,� 2��4�.5"�R *����2���= �2 ���� *��� �@���;)�*��� ���= 2�� %:� "�@ *�� ',�)� �2 �� ,-

��6 /� &,�&)�,*�(�

�� � �� � �� � �������@� �� � � @�7� ���@ ��� �"���

���������

��� E����(�� T ������ )�� �+�� 1*�)&* ���� ��@77�@�@��� 1�,���� #0= T,- %= #�6 �Y ������ � ���� ��

��������������@� Y, ,>,<� �= !,<,X� , � ���7�� .�-��&�5&�� �&,� &� +,��5

��� /�*6��� ������,(��� +���3�(,��� " ,�( � ��� ��++��4= .���� = ,�+,� $� ��(�� 0���&)�,� ,�( +�-������&,�,�+�&*� �2 +�,�* +���3�(,���� K��'����*- �2 ���',= ���',=++ ���7�

��� �)�2��( 4� ������ 4�����,(��� +���3�(,��� �*�)&*)�� ,�(<���*�& +��+��*���� ��� %'���� �= %'���� T%= ����, 0���(�� .���3�(,��� �� &�� ��*�- ,�( /����-� � .����=��&, �,*��= ++ ����

��� 4���� "!.= 4���H�(�>5�)I> �= "��,� 0�= ,�&I,5H��',�;= "&��*, 0 ������ ���*�&���� ����� ����������

��� E����(�� T ������ ;%�1 #�** �������@��� E����(�� T ������ %)� � ���&�� ����7@�����7� 4,�&�<� �4= ;���(��22 �0 ����7� ���&�� ���+�-� ���

� )� 7����@��������� ,X��(� 0= 1&�)���� ��= 4����<��� "= 1 �*� "$= .�)���

$# ������ !,* 1*�)&* ���� ����@����@7��� 1*�22�� �= �,� )���� �= E����(�� T ������ " ��� ,&�(

��:)��&� �2 ,&�(�& ������,(��� +���3�(,�� "� ��� #�/,�5>�6�<� 4= ��++�� 4= .���� = ,�+,� $� ��(�� ���&�� �5&,�= ���&)�,�= ,�( +�-������&,� ,�+�&*� �2 +�,�* +���35�(,���� K��'����*- �2 ���',= ���',= ++ �@���

��� ;��� "= 4�6�� ��= ��(�,�� = 1 )��'�&� ����7� � �, ,�1+�&*���& ����@@��@7

��� ���+��� �= ;�� ,� "= ��� �= ;,X�� �= ;��*�� �4 ��������&��* ��� ��' "��& ;��( �� �7�������7

�@� �)�2��( 4�= 1*��� ,� �1 ������ ���( �� ��'����7�����

��� 4,���� �U= !�6 �-�� 1#= ��*�> (� 0��*���,�� .� ����@� ����� �� ��7���@������

��� "�,��� $= 0�-���� T= Y, ,>,<� � ������ ���&�� ��*�-���@����@��@

��� ������� .5�= .,)� T5 = E��( 1 ���7�� "&*, �� 1&,�(1�� � @7�7�@�7��

��� 0,�<�)�( 1= ������� .5�= �+,�, "= .,)� T5 ������ ���5&�� ���+�-� "&*, @���@���@�@

�7� "&��*, 0= "��,� 0�= (�� ��� �"= ,�&I,5H��',� ; ���7�����&�� ���+�-� "&*, ��������

��� "��,� 0�= "&��*, 0= (�� ��� �"= J,�N� �= ,�&I,5H5��',� ; ������ ���&�� ���+�-� "&*, ������@���

��� ��(�I)�>5#N+�> �!= 4���H�(�>5�)I> �= ,�&I,5H��',� ;=$�������- �!;= "&��*, 0= "��,� 0� ������ � ���� �� �������������

��� "��,� 0�= "&��*, 0= (�� ��� �"= ,�&I,5H��',� ; ���������&�� ���+�-� "&*, ��@7�7��7�

��� "&��*, 0= "��,� 0�= 4���H�(�>5�)I> �= ,�&I,5H��',� ;����@� ��,&*�',*��� �2 +���3�(,�� /- �-(��+���3�(��� ���E����(�� T = �,� )���� 1T= .���� = ��++�� 4 ��(��.�,�* +���3�(,���� /��&�� ��*�- ,�( +�-�����-� K��'����*-�2 ���',= ���',= ++ �������

�@� 4���� "!.= 4���H�(�>5�)I> �= ,�&I,5H��',� ;= 1 �*�"$= "��,� 0�= "&��*, 0 ������ %)� � ���&�� �@���������

��� "��,� 0�= 4���H�(�>5�)I> �= J,�N� �= ,�&I,5H��',� ;="&��*, 0 ������ � 0�� ,*,� " �����������

��� "��,� 0�= ,�&I,5H��',� ;= "&��*, 0 ������ ���&�� 0�� ���� ��* @��������

��� ��(�I)�>5#N+�> �!= ���50,�*I��> ��= J,�N� �= ,�&I,5H��',� ; ������ "�,� ���&�� ����@���@��

��� !,<,X� , �= Y, ,>,<� � ���7�� � ���� �� �����������7��7� $)(��, �= ,�&I,5H��',� ;= J,�N� �= ,�&I,5,� ��, ;=

H�'�> �= #�>,�� �" ���7�� ���&�� ���+�-� "&*,������7����

��� T�/,-,��� T= 4,-,��� T ���7�� � ���� �� ������@�����@��

@�� !�&����� .= 1&���/,) � ����@� ,*,�,���� ��� ��-�� .�=#,�(- 4= 0-�/,&� T ��(�� $�� ��>- ��� "&,(� �& .����=!�6 Y��<= ++ �������

@�� 4�&� ,� "= ��(/�� � ������ ���&�� ���+�-� "&*,���������@��

@�� 1)� E= T,(� , $"= .�&<,�( 0"= �)�2��( 4� ������ ���5&�� ��� ���� ���@���@@�

@@� 4���� "!.= ��(�I)�>5#N+�> �!= "��,� 0�= #��-( �,'��%= ,�&I,5H��',� ;= "&��*, 0 ������ ���&�� �@�7�@���@�7

@�� E����(�� T = ���+����� 40= TX\��]�( �J4= ^�*��,,�(#= "/���<�' "T= 4,���� #!= �,� )���� 1T ������ ����/���� = �)���� K= %/�� ,�� �= .���� = ��++�� 4��(�� .�,�* +���3�(,���� /��&�� ��*�- ,�( +�-�����-� K��5'����*- �2 ���',= ���',= ++ ��@���7

@�� ���+����� 40= TX\��]�( �J4= ^�*��,,�( #= E����(�� T ������ ���&�� � @���@���@��

@�� E����(�� T ������ ��� .���� = ,�+,� $�= ��++�� 4��(�� .�,�* +���3�(,��� ��7������� $�+�&� ,�( (�*,���( ��*5��,*)�� �� ���&)�,�= /��&�� �&,�= ,�( +�-������&,� ,�+�&*��K��'����*- �2 ���',= ���',= ++ ����

@�� Y, ,�,<� 4= 1,<��, , Y= �<��,�, ! ������ .�,�* .�-�����������������

@7� 1,��� 0# ���7�� .�-���� .�,�* ����7���7�@�� 0�>)�� 0= T, �� 0= $�)&��(, 4 ����7� ���&�� 0�� ����

��* ������������� 4���H�(�>5�)I> �= ��(�I)�>5#N+�> �!= ,�&I,5H��',� ;=

"&��*, 0= "��,� 0� ������ ���&�� ���+�-� "&*,���7��7�77

��� 0�**��� �= ;�� Q= ���� 0 ����7� .�,�* ��� ���������@��� 0�**��� �= 4,��,< 4��� %= #,�)� ��',� �= ',� , + E=

E����<��� 4= ��>P �= %���� �% ������ .��& !,*� "&,( 1&�K1" ��������������


Recommended