+ All Categories
Home > Documents > The role of amino acids and Gcn4p in the shift of ...

The role of amino acids and Gcn4p in the shift of ...

Date post: 06-Jan-2022
Category:
Upload: others
View: 1 times
Download: 0 times
Share this document with a friend
221
The role of amino acids and Gcn4p in the shift of Saccharomyces cerevisiae from anaerobic to aerobic conditions A thesis presented for the degree of Doctor of Philosophy by Bonny Man-Ying Tsoi College of Health and Science School of Biomedical and Health Science University of Western Sydney Australia 2009
Transcript

The role of amino acids and Gcn4p in the shift of Saccharomyces cerevisiae from

anaerobic to aerobic conditions

A thesis presented for the degree of Doctor of Philosophyby

Bonny Man-Ying Tsoi

College of Health and ScienceSchool of Biomedical and Health Science

University of Western SydneyAustralia

2009

Acknowledgements

To my supervisors

Vince- Many thank you to Vince for teaching me how to prepare a good presentation, which I used to hate and scared of. Now it’s a piece of cake. For all your helps and supports. Thank you very much, Vince.

Ian- There is too many thank you that I want to say to you, from offering me the scholarship all the way to editing my final draft of thesis. Really appreciated for yourguidance advises and helps through my research years. Without you, Dr. B Tsoi would never exist. Thank you so much, Ian.

Peter- Thank you for being one of my supervisors and interested in my project. All yourencouragements over the years are appreciated. Thank you, Peter.

To everyone in Vince lab and Dawes lab

Thank you for all the helps and friendship. It’s great to have some fun besides working on experiments, especially when they didn’t work.

To all those special people

Thank you to the people who gave me helps and let me borrow their stuffs. Anthony Beckouse for all the helps and the ideas on Gcn4p, and of course your discovery on Gcn4p. Mark Raftery for the mass spectrometry works. Cristy Gelling for the advises on one-carbon and your plasmids. Abraham Tsoi for the HPLC. Geoff Kornfeld for all the helps on experimental works. Steven Fai for your advises on the phospholipids. Malcom Noble for the scillination counter. Russell Cail for the freeze drier. Ika Kristiana for the TLC materials. PhaikEe Lim for all your advises and helps. Prof. Gerhard Braus, Georg August University Göttingen for the plasmids. And everyone who had help in many ways in the college of health and science, UWS and the school of BABS, UNSW.

To my family

My dearest parents- your kindness, love and patience. Thank you for supporting me oncome back to do my PhD and always there when I needed you. My brother Abraham- for being helpful and supportive in many ways. Thank you, my brother!

Statement of Authentication

___________________________Bonny M Tsoi

The work presented in this thesis is, to the best of myknowledge and belief, original except as acknowledgedin the text. I hereby declare that I have not submittedthis material, either in full or in part, for a degree at

this or any other institution.

� ��

���������������

��������� ���� � � � � � � � �������������

���� �������������������� � � � � � �������������������������

��������������������������������������������

���������������������������������������������

������������������������������������������������

�������������������������������������������

���������������������������������������������

���������������������������������������������

� �����������������������������������������������������������������

������� !��"#������������������������������������

� �������� ����� ���� �����������������������������

� ��������������������������� �������������� ������������������

��$�%��&�����������������������������������!�

� ��"������#����������� ��������������������������!�

� ��"���$� ���������%��� ���������������������������������&�

� ��"�����'�����������������������������������&�

� ��"�����(��������������������������������������)�

� � ��"���"���#���������������������������)�

� � ��"���!�*����������������������� ����������������+�

� � � ��"���!�����#������������������������+�

� � � ��"���!���,����� ������������������-�

� � � ��"���!�"�,������ ������������������-�

� � � ��"���!�!�.���� ��������������������/�

� � � ��"���!�0�1��������������������������/�

� � � ��"���!�&�,������2������ 2�#������� �������������������

� ��"�"�� ��������������� �����������������������������

� � ��"�"�������%��� ������� ������������������� ���������������

� � ��"�"��������������� �����������#������������� �����������������

� � ��"�"�"������������ ������������������� ����������������"�

� ��"�!�$�������������������� �����������������������������!�

� � ��"�!���3��������� �����������������������������!�

� � ��"�!���3��������������������������������������!�

� � ��"�!�"������#������������������ ��������������������0�

� � ��"�!�!�������������������������� ��������#�������������&�

� � ��"�!�0�3�������� ���������������������������)�

� ��"�0�,�������#����� ������� ������������������������)�

� � ��"�0���4����������������������������)�

� � ��"�0���3 ���5, ����5�������63,�7�#����� ������������+�

� � ��"�0�"��������������� ���������������������������+�

� ���

� � � ��"�0�"���$���������6�����������7������������-�

� � � ��"�0�"���4��������������������������������/�

� � � ��"�0�"�"�3���������������������������/�

� � � ��"�0�"�!���� ��2������������ ����������������

� � � ��"�0�"�0���#�������������������������

� � � ��"�0�"�&�$����������������������������

� ��"�&�3����������������������������������� �������������������

��'������������(((((((((((((((((((((((((���(���$�

� ��!���$����������������������������������������������"�

� � ��!�����3�����������������������������!�

� � ��!������ �����������%��� ���������������������0�

� � ��!���"�4��������������������������������������������0�

��)��&������#������*�+������#�&��������&(((((((((((((((�,�

� ��0���� ����������#����� �� �6� ���������#� ��7����������-�

� ��0���8������������ ������������� �������#����� �������������""�

� ��0�"�(��������������5�#������9��������������������""�

� ��0�!�4�5������� ������ ���������������������"0�

� � ��0�!���( �������������������������"+�

� � ��0�!����5�����������������������������"+�

� ��0�0���������������������������������"-�

��-��+���"���������.�'/((((((((((((((((((�((((��'��

� ��&������#������#��������������������������!��

� ��&��������#���������������������������������������!��

� ��&�"�:�������������������������������!��

� � ��&�"���;��� ���������� ���������������������!��

� � ��&�"���.���� ����#�����������������������!!�

��0���&(((((((((((((((((((((((((((((((')�

���������1������2�����1�� ��3((((((((���('0�����.������&����������#�&��+�#�(((((((((((((((((((�'0�

� ������,��������������������������������!)�

� ������(����#�����������������������������0/�

� ����"����� ��������� ���������������� �����������������2�#�� ��������

� � #�� ����������������������������0��

� � ����"�������� �����������������������������������0��

� � ����"����������������������������������������0)�

� � ����"�"���� �������������������������0)�

� � ����"�!���� ���������������������������&/�

� ����!�,���2�����������������������<'���������� ��������������&/�

� � ����!���:���� ���������������������������������������&/�

� � � ����!������������������������ ���������������&��

� � � ����!������������������������#���������������&��

� � ����!����������� ��������������������������������������&"�

� � ����!�"��������� ���������������������������&"�

� � � ����!�"���.���������������������������#�����������&!�

� � � ����!�"���.���������������������������#�����������&!�

� ����

� � � ����!�"�"�.��������������������������#������������&0�

� � ����!�!�<���� �������������������������������&0�

� ����0(���� �������������������������������������&&�

� � ����0���<'�������������������������������&)�

� � ����0���3������#���#������������#���=�������� ��������������&)�

� � ����0�"��� ����������������������������������&+�

��������/+*�����!*�&��+�#��((((((((((((((((((((�((-4�

� ������<�� ������������������ �������� ���� ����������������&+�

� ������<�� ������������������ � �����������#��#���� ����������������&-�

� ����"��#��������������������������������&-�

��$��������&��+�#�(((((((((((((((((((((((((��-,�

� ��"������������������������β9���������������� ������������&-�

� ��"�������������������������� ���������������������)/�

� ��"�"����� �����β9������������������� ����������������)/�

��'��&������#����*���((((((((((((((((((((((((�0��

� ��!���� ������������ ����� �>��.�������������������)��

��)�����������������������((((((((((((((((((((((��(�0��

� ��0�����#�����������������#��������� ����� � �����#���� �� ������)"�

� ��0���,�����#���� �������� ��������������������������)!�

��-���#���������������!����+�$ 525�����((((((((((((((��((0)�

� ��&������ ���� ��#�� �����������������������)0�

� ��&���*��������������������������������������������)0�

��0��������������������������((((((((((((((((((((��(���0-�

� ��)���*������������������#����������������������)&�

� ��)���*�����������#���#���#����� ���5�� ������������� ���

������������������������� ������#� �6�<5��.7���������������������))�

� ��)�"�.���������������� �����������������������������������)+�

� ��)�!�*��������������������������#���#���#����������������)+�

������$���+����2���%���������� ��6��3����3���3���

������������3�3((((((((((((((((((��(�0,�$�������#"������#���&((((((((((((((((((((((��(0,�

$���������"��&��������*�#����������#���������������*�����(((((((��(0,�

$�$��������/��������������������&������#�����*�+����(��(4$��

� "�"���(��!#������ �������������#�������������������� ������������� ��� �������

� �������������� ��������������������������������+"�

� "�"������������ #�����������������#���������� ��������������������� �

� ��������������������������������������������������������+0�

� "�"�"������������������������������������������#����������������

� �����������������������������������������������������+&�

� "�"�!� !�"����� !������������������������������������������+-�

� "�"�0�<�����������������������������#���������������������������-��

� "�"�&����#�$�∆�������������#���������������������������� ������##������� ��������� ���������������������������������-"�

$�'�%"��+������*��������+���������*�����+��!�������������/��+��*�����������������������������������

�����������(((((((((((((((((((((((((((��,-�

� ���

$�)�25���������!�*�����##�����&�� �#�*���#"��#��+���7��#�#���!�/+�����

����������+������∆∆∆∆��&"����#"��!������������((((((((((((((�(,0�

$�-�1"������������#�������*�+��������25���������!�*����#��/��*�����&�����

/+���*/������+������∆�&"����#"��!������������((((((((((��8��

� "�&���3���������#�������#�$�∆� ��������������������������������������

� �����������������#�����%��� ����������;:!)!"������������������/&�

� "�&���.��������%��� �������5���������� ������������������������������

� #�$�∆� �������������������������������/-�

$�0�����"����(((((((((((((((((((((((((((�����$�

������'��������3���9�29���������5���������������������������������������

1�����2�31����������������3�3((�(���)�'�������#"������#���&(((((((((((((((((((((����������)�

'���%��&��������"����+��#���*�#���!�/+�����������∆∆∆∆�&"������������������#�����((((((((((((((((�(((�((((((((����0�

'�$�����/��#�������+*#��7*&��+*�������������������*�������:"���#������

���������������!����+���&��&���&�#�"&(((((((((��((((((����8�

'�'�1"�������������#������5������&��������&�+������������������������

!����+((((((((((((((((((((((((((���((����$�

'�)�������������������/��#�.�'/�#"��!��+���+������������������(((���((��-�

'�-���������"��������������25������#��������#"��!��#�/�������������������

������!����+��#�.�'/������:"���#�/�����������&/�������������25�����((((�$��

'�0�����������25�+�������+�������7��#�#���!�/+����������#5�*/���������

������"#��������������(((((((((((((���((((((((((���$)�

'�4�����7/�����������#"��#�#"��!��������������#����#�/�#������+��

�����������*����25�������#�.�'/((((((((((((((((((�(�$0�

'�,�����"����((((((((((((((((((((((((((�(���$,�

������)��� ���3�3��%�253������������������3�3(����'��)�������#"������#���&(((((((((((((((((((((���(��'��

)�������*�+��������25�*�������#�!�"���+������:"���#�25�����((((((��'$�

� 0�����;��� �����������5� �������������������������!"�

� 0�����;��� ���������������������������������������!0�

� 0���"���������������%��� �������5����������������������� �����������5��

� ���������� ���������������������������������������!+�

)�$�����*�+��������/+��/+���/�#�(((((((((((((((((��((�)8�

� 0�"���8��������������?��� �#����� �����������������0��

� 0�"�������#����� ������ ���������������������������0!�

)�'�3/���������:"���&�������25����������/�������*�+����(((((((���(��)0�

� 0�!����5������%��� ��������� ����� #�����������������0-�

� 0�!����5����������#�������������#���#���#�������������������&/�

� 0�!�"��5���������%���������������� ���������������#�������������&"�

)�)�����*�+������������������&��/���������:"�������+�!+��&�"�����25��������-)�

)�-�����"����((((((((((((((((((((((((((���(�0��

� ��

� 0�&�������������������������������#��������8'��������5������� ��

� ������������� ��������������������������������)��

������-����3�33���((((((((((((((((���0'�-���%"�"���#���������((((((((((((((((((((((((���00�

��%�����((((((((((((((((((((((���0,�

�������;�

� ���

2��������������

�����������*��������������������������� 5���� �������� �����������

������������������������������������������������������������������)�

����������(������������#��#������ � ���������������������������� ���������

��������������� ��������� �������� ���� ������ ����������

�����������������������������#���������������������������������+�

��������$��#������� ��������������������������������� ���������#� �������"��

��������'�(�������������������� �(��!#���� ���� �������� ����� ������"0�

����������,��������������������������#���� ��������#�� ����������!)�

��������������� ������������������������������� ���������������0��

��������$�4����������������������������������������� �������������0)�

��������'���� ������������������� ����������������������0+�

��������)���� �������������������� ��������������������&/�

��������-���## �������������<� ��� �����������������&��

������$���$����������������#5���������������������� ������� �����������+��

������$���(�������5������������������������������������������������+��

������$�$���������������������������������������5����� ��������������������++�

������$�'�3���������������� �����������������#���2����������� �����������

������������������� ������������5� #�����#�$�∆ �����������������������

������������������������������������������������������������--�

������$�)����������������������������� ����������������#���� �����������

������������������<.� �����������������������������/��

������$�-����������������������������������� ��������������������������

��������������������������#�����������������#����;:!)!"�������++���

�����������������#�������#������������������������������������/&�

������'���3������������������5������� �����������������#���2����������� �

���������������������������� ������������5� #�����#�$�∆� �����������������

���������������������������������������������������������������������������+�

������'���������#���2����������� ������������ ������������ �����������

�������������������5��������������������<.� ������������������������

������������������������������������������������������������&�

������'�$�3���������5�����������������#�������������5� #�����#�$�∆��

����������������� ������������������������������������������������������������"&�

������)���������#����2����������� ������������� ����������������

������������������������������������� ���������������<.� �����������## ���������

��������������������0/�µ,���������������������������������������������������������������������!)�

������)������������������������������������������������������������

������������������������#���� ����������<.� �����������## ����������������2��

������������������5�����������������!+�������������������������0��

������)�$�3�����������������������#��������������#���������� ��������

��������������������������5� #�����#�$�∆� �������������������������������������������

���������������������!+�������������������������������0"�

������)�'�@���������������#������������� �������������������������������&&�

� ����

������)�)�,�����#���� �� ���� ��������������##����������������5� #��������������������������������������������������

#�$�∆� ������������������� �#������������������������������)/�

� �����

2�������%�!"����

�%�!"����������������������5������� ������ ������� ���2��5����������

��������������������� ��������������������������������������� ������������

������������������� ��#�� ����� �������������������������������")�

%�!"���$���������������������������������5� #�;:!)!"�����#�$�∆� �������

������������������������!+���#���������������������������+)�

%�!"���$���<�� �����������������������������������������������#���������

� ������!+���������������������������������-/�

%�!"���$�$�(��������������������������������� ���������������������������������-��

%�!"���$�'�.�������� ������������ �����������������5� #��������������������������

������������������������������������������-0�

%�!"���$�)�(�����������������������������������������������������������������

������������������ ����������#��������!+�������������������������//�

%�!"���$�-��������������������������������� ∆�����#��∆� ���������� �����

��## ���������� �������A����5�����������������/0�

%�!"���$�0�������������������������������������������������#����6;:!)!"7�������

#�������#����6��++.7�����������������������������/+�

%�!"���$�4���������������������������������#���� ���������## ����������

��������������������������������������������� ��������5�����������������/�

%�!"���$�,�4#������������������������������� �#�������#����������������

����������������� ��������5�������## ���������� ��������������

%�!"���$��8����������������������������#�$�∆� ��������� ������## �����

�������������������������� ��������5����������������������������

%�!"���'����������������4�5.������ ������ ���� ����������������&�

%�!"���'���������������������������������#�$�∆� ����������<.� ��� ��

��## �����������5�����������������������������-�

%�!"���'�$���������������������������� ���������������� �����������<.��

������������������ ��� ���## ����������������� ���������������������

%�!"���'�'�(���������������5������� ������ �������� ��������� ����������0�

%�!"���'�)�3�#�����������������������������5� #�����#�$�∆�����%�∆��

������������������ ������������������������������������������������� ��� ��

��������������������## �������������������5����������������������������-�

%�!"���'�-�3�#�����������������������������5� #����� �������������������

��������������������������������������� ��������������������5���������������������"/�

%�!"���'�0�;��� �������#����� �������5����2�� ���2��5�������2��5��#�������

�����������������������5� �������������� �<5�������������� ���������������"��

%�!"���'�4�*���������������������������5����2�� ���2��5� ����2��5�������2��

�������������������5��#�����������5��#�������������5� #��������!� ���������������

���������������������������������������������������������������"!�

%�!"���'�,�3�#����������������������������5� #2�#�$�∆�����%�∆� ��������

������������������������������������������ ��� ���## ���������

����������5����������������������������������"+�

%�!"���)���;��� �������#����� �����5� ������������� �����������������!!�

� ���

%�!"���)���;��� �������#����� ���������������������� ����������������!0�

%�!"���)�$�.�������������������������6µ �A�/+���7����������5� #������

������������������#�$�∆� ��������������������������������������������� �������

������������������� �>��.����������������������������!-�

%�!"���)�'�������������#���#���#������� �������5� #��������#�$�∆� ������

����������#������������.� �������������������0&�

%�!"���)�)�">5�5����������� ��� ���������.��#���#����� ������������5� #�����

����#�$�∆� �����������������������������������������������������0+�

%�!"���)�-���������������� ���������������#�����������">������5���������

���������������������������������������������������5� #�;:!)!"�����#�$�∆� �������

����������������������0������!��������������������������������������������������&��

%�!"���)�0���������������� ���������������#�����������">������5���������

���������������������� �B���#���#���#�����������5� #�;:!)!"�����#�$�∆� ����������

�������������������0������!���������������������������������������������������&!�

%�!"���)�4������������ !��##����������������5� #��������#�$�∆� �������

������������������������/2��!�����!+������������������������������������������������&-��

� ��

�������������

�02��/5�.>�5�>!����� 02��/5 �� ������� ��������

�#� ����#����

.<�5<(� � ������0C5��#���#���5���� � ����

(.83� �����������5��#������ ���

>��.� �����#�������%�������� ������#� �

�;� �����5;������6 ��� 7�

,�� �����#���� �� �

4<&//� �#���������� � ���������&//� �

48$� �#������������ �

�;�� #���#���5������������

�.8� #� ������������������

�.� #���#����� ������

�3� #���#����� ������ ���

�*� #���#����� ��������

��� #���#����� �����

�..� � ��������� #��6 ��� 7�����������## ��������

�<� � �������������6 ��� 7�

�<.� � ��������� #��6 ��� 7������������ �����������

,�A,�� ���� �,��

>!����� ����� ��������

��.� ����5� ������ ������#� ��

:3�<� �����������##�����������6�� #�� ��� 7��

���� ��������� ������������������������ ������5���� � ����2�������� �

���� ���� �(���� ����� ������D�2��� �����������#����D�����������������

����� ��� ���� ����� � <����� ��� ��������� � � ∆�� � ������� ��� #������� ��� �� ��

��������������������� 2����8� ���� #2���������������������#����D���������������

9#����

� ���

�"������������

����<� ���1�<�;������2����(�2�(���2�.�� ��2�8���� 2�,�� E�2�.���2� E�2�����2����,�2�

���������2���2�8����2����E�2�>������2�F��E�2�<���2�*��G��6�//-7��3���������������5

������� ������ �����(��!#�����;���#���������#�������������������������#����������

��������� ������� ��� ���� ������� �� �������� &�' $�� �(� �����#���� ������) �2�

�+!6�)7=���/05����0���

��������/�����������

����<����1�2�;������2����(�2�.���2�E�2�8����2����E�2�>������2�F��E�2�<���2�*��G�����

������(��!#�������#��������������������������������� ��������� ��������HH***���

*����������� .������� ��� :���� (������ ���� ,������ ;���� 2� ,�����2�

���������6/�5/&�E� 2��//)7��

����<����1�2�;������2����(�2�.���2�E�2�8����2����E�2�>������2�F��E�2�<���2�*��G�����

��� ��� (��!#� ��� ���#������� ��� ��������� ������� ��� ���� ������� �� ��������

.� ;���//)�6��;,;72�� �� 2�����������6��5�)��#� ��2��//)7���

����<����1�2�;������2����(�2�.���2�E�2�8����2����E�2�>������2�F��E�2�<���2�*��G�����

������� ��������������(��!#�������������������� ��������� ���������� ����������

��� ������� ������������IG��8������ ������� #����������� ���� 2� � �� 2� ����������

6�//&5��//-7����

� ����

�����������;������ ����������� ���� �� ����� ������ #���������� ���� ��� ������ � �������

���� �#�� �D�J� �� ��� ��� ������ ������ ��� ������ � ������� ������� �� �������

����� ������� ������������ *�� ������2� ��������� � ������ ���� ��� #������ �����

������������������������������������%������������� ��������������� ������ J�

�����2���������#������� ��������� � ���������� ����������#������������� �����

������� ������������#����������������(��!#���������������� ����������������� ����

����� ������ � ��� ��� �� ������� ���� ��� �%����� ���� ��� ��������#������ ��#���� ���

� ���������������������>�������������������(��!#�#� ����#������ ��������������

��� ��������� ���#������� ��� ��������� �������� � �� #�$�� ������ �������� �� ���� �

���������#�����������������������������������������������������5������#�������

*�� ��������2� ;���#2� ��� ��������#������ �������� ��� ��� ��5������� ������ � ����

#����� ���� ����������� ������ � �%����� ���� ��������� ������� ���� ��������� �� ��� �

��� ����5����� � �������� ���%�� �������� ���� ���������� ��� ��5������� ������ �

������������������� ������� ��� ������� ��� ��## �����5����� ��� � ���� ��������

��������#����� ����I��������� �������#�� �����##������2���� �������������

������������#��������������#� ���������� �������������5��������� ������� ������

���� ��� �������� � ���� ������� ���#������� ��� ������������� ����� �������� �5�����

�%��� ��� ��� ���� �� ���� ������������ � ��������� �������2� ���������*��

$����� ������������������ �������� �����5����� ����#������������������������

���������������������������������*�������� 2���������������������������������5

����2�������������� ������������#������� ������������������2���������������

������������������� � ������ ������������ #����������� ��������

� 1

������������� ������

�����������

��������������� � is widely used as a model eukaryotic organism for research

studies due to the ease of molecular manipulation and the fact that its genome has

been sequenced. This organism, also known as baker’s yeast, has been part of human

life since 2000-6000 BC (Walker, 1998b), when it was first used to leaven bread

dough and produce alcoholic beverages, such as beer and wine. However, the earliest

record on the usage of alcoholic fermentation of plant saps and fruits juices was

around 3000 BC (Hardwick, 1994) or even back to 7000 BC (McGovern ������, 2004).

��� ��� � ferments sugars to ethanol and carbon dioxide under anaerobic

conditions and therefore is a useful tool for studying the anaerobic process. The aim

of this thesis is to determine the role of amino acids on yeast growth in anaerobic

conditions, and to determine the role of the ���� transcriptional activator under

anaerobiosis.

��������������

������ !��"�� ��#� ��!$���""!��

About 75-80% of the yeast cell is water, however, on a dry weight basis a growing

yeast cell is composed of around 40% protein. These proteins are mostly in the form

of enzymes, and are usually situated in the cell wall and bound to the cell membranes

(Hammond, 1993; Hornsey, 1999). The cell wall contains approximately 35%

polysaccharides; followed by 7% minerals; 5% phospholipids; 3% triglycerides and

0.5% DNA, vitamins and fibre (Hornsey, 1999; Walker, 1998b). The yeast cell is

bounded by a cell wall which protects the delicate plasmalemma which is located

� 2

immediately inside the cells. The plasmalemma controls the flow of compounds

going into and out of the cell. The endoplasmic reticulum (ER) connects both the

plasmalemma and the nuclear membrane. Many organelles are located within the

cytoplasm; these include vacuoles, mitochondria, and polyribosomes. Glycogen

accumulates in the cytoplasm and this is a source of reserve food for the cells

(Algranati and Cabib, 1960 ).

Membrane structures play an important role in the organization of the yeast

cell such that up to 85% of the cell wall dry weight is attributed to two structural

polysaccharides, β-glucans and mannoproteins (Hornsey, 1999). β-glucans are the

glucose polymers that hold the inner layers of the cell wall and have major functions

in determining the cell shape and wall rigidity (Qadota� ������, 1996). On the other

hand the mannoproteins, also known as the α-mannans, are the mannose polymers

that are linked covalently to peptide chains, and constitute the outer layer of the cell

wall which is involved in porosity and environmental reception (Dagger�������, 1997).

Proteins (8%), hexosamine (2-4%), and inorganic materials (3%) are also present

inside the cells (Hornsey, 1999; Wainwright, 1971). The proportion of the cell

constituents varies according to the strain of yeast as well as the growth medium and

conditions. For example supplementation of anaerobic cells with a high level of D-

glucose leads to a greater β-glucan content in the cell walls (McMurrough and Rose,

1967; Morris, 1958).

���������!����#����$���"���#� ��!$��������!$� �

��� ��� � has been used in brewery fermentation processes for centuries; this is

due to their high tolerance of ethanol and sugars, as well as the low oxygen

requirement during the fermentation process (Egli� ��� ���, 1998; Fleet� ��� ���, 1984;

� 3

Hansen� ��� ���, 2001; Schqtz and Gafner, 1993). In present times yeast is not only

being used in the fermentation and food industries, but also industrial and

biotechnological processes. These diverse uses of yeast include their studies in

environmental technology such as bioremediation, utilization of waste, crop

protection and biosorption of metals; in the health-care industries, such that

pharmaceuticals, vaccines, probiotics and hormones can now be synthesized from

yeast; studies in drug metabolism; and in biomedical research on human diseases or

disorders such as cancer, AIDS and human genetic disorders. Yeast has been widely

used as a tool for fundamental biological researches and in studies involving cell

biology, biochemistry, genetics and molecular biology (Walker, 1998b).

At the commercial scale, the brewing conditions using yeast have been

extensively studied to optimise alcohol production in a cost-effective manner to

maximise profit. Although brewing is one of the oldest forms of biotechnology in

existence; little is known about the physiology and metabolism of ������ � under

these conditions. Brewing begins when anaerobically stored yeast cells are pitched

into aerated wort. Aeration is vital for biomass and metabolite production for

subsequent fermentation. Oxygen becomes limiting when the biomass has increased

significantly. In order to keep up with the energy demand for cellular processes, yeast

cells continue to generate ATP by the fermentative pathway under anaerobic

conditions. However, fermentation typically takes days to complete. The

requirement of cell metabolites for the production of alcohol and flavour in brewing

can be varied from batches.

� 4

�%�&��'��$�$����

�%������(����!!��#�#��'��$�$�����

The process of fermentation can be classified into several stages, however, these

stages may overlap in time and the functions of the yeast are different in any of the

stages. During the initial stage, processes such as cell wall preparation, and the

uptake of nitrogen, sugars and oxygen can take place. It is interesting to note that the

permeability of the yeast cell is very important for the uptake of nitrogen and sugars

from the wort, since this is required for the synthesis of sterols (Higgins�������, 2003).

The uptake of nitrogen is very crucial; lack of nitrogen can inhibit the growth of yeast,

and this may lead to lengthy and disordered fermentation (Mendes-Ferreira� ��� ���,

2004). The duration of the initial period depends on the viability of yeast, such that

well-fed, vigorous yeast cells are able proceed through this stage quickly (Fix, 1996).

In addition, irregular behaviour occurring at the initial stage can be an indication of

cells starvation (Fix, 1996). Once the cells are well prepared, each individual cell can

start taking in the amino acids, elementary peptides and sugars in a particular order.

The energy requirements for growth must be satisfied prior to the fermentation

process. The Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pathway begins with glucose and

produces pyruvate, even when oxygen is plentiful (Dickinson, 1999). However, the

cells become gradually derepressed when the levels of D-glucose decline, which

results in the induction of respiratory enzyme synthesis. This results in oxidative

consumption of ethanol, when the cells enter a second phase of growth known as a

"diauxic shift". These cells switch to a fully respiratory metabolism by catabolizing

the carbon compounds via the tricarboxylic acid (TCA) cycle and oxidative

phosphorylation in the mitochondria (Dickinson, 1999). This pathway not only

� 5

enables the oxidation of the accumulated fermentation products, it is also a highly

efficient way for generating ATP.

The growth cycle of yeast can be divided generally into three stages; lag phase,

exponential growth phase and stationary phase (Munroe, 1994). Most of the yeast

activity occurs during the lag phase of the fermentation, yeast cells need to adjust

themselves both physiologically and metabolically in order to adapt to the new

environment even when provided with a full set of nutrient supplementation. This

adjustment is mainly for the syntheses of the essential enzymes that are required for

utilizing nutrients, as well as for supporting cell growth (Munroe, 1994).

After the lag phase, there is a short transition into the exponential growth

phase. In the exponential phase, the cell population increases logarithmically in the

presence of rich substrate and cell proliferation can occur by cell budding (Munroe,

1994). The mass and volume of individual cells increases to a definite size when new

buds are formed, hence a maximum growth rate of the yeast cells can be reached

during this phase (Hornsey, 1999; Munroe, 1994). The maximum fermentation rate

depends on the cell population but not the cell growth rate (Fricker, 1978). The pools

of unsaturated fatty acids and sterols can be distributed among the increasing cell

population, and can slow down the growth rate (Hornsey, 1999; Munroe, 1994). As

the sugar concentration falls and flocculation begins, the yeast will gradually shift to

the stationary part of the growth phase (Hornsey, 1999). An increased amount of

glycogen can be detected since it acts as the energy supply during this period of

fermentation when there is a high demand of ATP for synthesis of sterols and fatty

acids (Murray�������, 1984; Walker, 1998b). The yeast total dry weight can increase

throughout the fermentation process, and should slightly decrease approaching the

end of the process (Stassi�������, 1987). It is interesting to note that acetyl coenzyme

� 6

A (acetyl-CoA) is the first fermentation product that contains sulphur, which is

important for the biosynthesis of esters (Lilly�������, 2000). It plays an important role

in the Krebs cycle, which mainly generates the source of metabolic energy and

provides carbon dioxide as the end product.

The overall growth requirement of yeast in brewing processes include: the

carbon and energy sources, which provide the resources such as the fermentable sugar.

Nitrogen source is also required as the growth factors (vitamins; inorganic ions; other

elements and water). Oxygen is needed for the biosyntheses of sterols and fatty acids,

especially during the early stage of the fermentation process for the growth of the

cells (Hornsey, 1999; Rosenfeld�������, 2003). Towards the end of the fermentation,

flocculation occurs and this is related to the increases in the proportion of β-glucan in

the cell wall (Jin and Speers, 1998). The depletion of growth factors, such as the level

of inositol in the wort can occur at this stage, and cause the increase in the β-glucan

formation (Wainwright, 1971).

�%���&��'��$�$������)����'��$!�

�%������$������!������

Yeast grows on ammonia as the sole nitrogen source, but can be grown faster with

supplementation of suitable mixtures of amino acids. Nitrogen is required for the

synthesis of essential cell constituents which are derived from amino acids. Thus, it is

important to monitor the amino acid concentration of the wort. Amino acids are taken

up and utilized sequentially, according to the presence of amino acids and the

appropriate transport enzymes located in the membrane (Hornsey, 1999). The cell

itself produces amino acids by transamination and/or by synthesis from various acids

in the keto acid pool. It has been found that in some yeast strains, amino acids such as

� 7

L-arginine, L-histidine and L-lysine are produced by the cells themselves rather than

from the supplemented medium (Hornsey, 1999). �

�%�����*���$��#��$��!�

In the brewing process, growth factors such as vitamins are available from the wort

and yeast strains vary widely in their requirements of these for growth (van Iersel����

���, 1999). Biotin, thiamine, nicotinic acid, riboflavin, calcium pantothenate, inositol

and pyridoxine, pyridoxal and pyridoxamine are available in the wort during

fermentation (Bartnicki-Garcia and Nickerson, 1961; Ough�������, 1989; Taherzadeh�

��� ���, 1996). Biotin is a member of the B-complex family that is needed for the

metabolism of amino acids and essential fatty acids. In many fermentations,

pantothenate and inositol are required, since inositol is essential in the biosynthesis of

phospholipids required in membrane synthesis (Rosenfeld�������, 2003).

�%���%�+�(��!�

The cell membrane commonly contains a mixture of phospholipids, which include the

cardiolipin, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and

phosphatidylinositol. The lipid compositions in the cell and membrane varies

depending on several factors, such as temperature (Okuyama� ��� ���, 1979), carbon

source (Jakovcic�������, 1971), and lipid precursor supplement (Ratcliffe�������, 1973).

Biosyntheses of sterols, fatty acids and phospholipids occur in the cytoplasm,

microsomal membrane and mitochondrion. Lipids are critical under aerobic

conditions, and unsaturated fatty acids are essential for growth under anaerobiosis.

However, the syntheses of unsaturated fatty acids and sterol in yeast can only occur in

the presence of oxygen. Thus, the supplementation of ergosterol as a source of sterol

� 8

is required for growth of the anaerobic cells (Andreasen and Stter, 1953; Andreasen

and Stter, 1954 ). One study has suggested that the unsaturated alkyl side chain in the

sterol has a role in ethanol tolerance, as well as being a property of the plasma

membrane (Thomas�������, 1978). Nevertheless, the synthesis of membrane depends

on unsaturated fatty acids, sterols and oxygen (Hough, 1985).

�%���,�������������!������$�����"�'��$!�

There are a number of inorganic ions that are required for the growth of yeast cell

during the fermentation process. Phosphate (Archer and Castor, 1956); sulphate

(Yamauchi� ��� ���, 1995); essential cations (Conway and O'Malley, 1946); and

metallic elements such as zinc, iron, or copper ions (Agte�������, 1999; Mrvčić�������,

2007) are crucial for supporting the structure of the cells and enzymatic purposes.

� �%���,��-�"(����

Sulphur is a component of the amino acids, methionine and cysteine, therefore it is an

important factor in determining protein structure. Within the cells, the other most

critical sulphur-containing compounds are coenzyme A, lipoic acid, thiamine

pyrophosphate (TPP) and glutathione. A metabolic by-product derived from sulphur

utilization during fermentation is hydrogen sulphide (H2S). It is generated in the most

significant noticeable quantities during the exponential phase of cell growth. The

concentration of H2S is usually low at 5 ppb and this level is below its flavour

threshold. A detectable smell of H2S in beer is one of the indications of bacterial

infection. The mercaptans (thio-alcohols), thio-aldehydes and thio-ketones are the

major sulphur by-products of yeast metabolism which all greatly contribute to the

flavour of the beer.

� 9

� �%���,���.�$�""����"�'��$!�

There are three major groups of metallic ions that play important roles in the brewing

process. The macro-elements, which are required in a concentration between 0.1 and

1.0 mM, include K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, and Mn2+. The next group is the

micro-elements with required concentrations of between 0.1 and 100 mM and these

are Co2+, Cd2+, Cr3+, Cr6+, Cu2+, Mo2+, Ni2+, and V2+. The group classified as the

inhibitors need to have concentrations as low as possible in the fermentation system

(i.e. between 10-100 mM); these inhibitors are Ag+, As3+, Hg+, Li+, Os2+, Pd2+, Se4+,

and Te4+ (Hornsey, 1999). The concentrations of Mg2+, Zn2+, K+ and Co2+ have the

greatest effect on the system. However, the optimum concentration of any one of

these elements is related to the concentration of other ions, such that it is critical to

maintain the correct ratio of zinc and manganese, as well as for calcium and

magnesium (Hornsey, 1999).

� �%���,�%�.����!��'�

Magnesium plays a role in the regulation of pyruvate metabolism; with the glycolytic

enzymes hexokinase, phosphofructokinase, endolase and pyruvate kinase being

activated by magnesium (Hornsey, 1999). It has been suggested that magnesium is

fundamental to the metabolic and physiological functions of the cell (Pironcheva,

1998; Walker, 1994; Walker, 2004; Walker and Maynard, 1997). Magnesium has

other functions: in ethanol tolerance (Ciesarová� ��� ���, 1996); protection against

temperature and osmotic stress (Birch and Walker, 2000; Walker, 1998a); membrane

stabilisation of nucleic acids, ribosomes, lipids and polysaccharides (Walker, 2004);

stimulation of fermentation of high-gravity worts (Walker, 1998a); ribosome structure;

� 10

neutralization of electrostatic forces in polyphosphate, DNA, RNA and proteins

(Walker, 2004); as well as participating in cell growth and cell division (Duffus and

Patterson, 1974; Hornsey, 1999; Walker, 2004; Walker and Duffus, 1980).

� �%���,�,���"���'�

Calcium is an important element required for the structure and function of the yeast

membrane (Ciesarov������, 1996). Calcium stimulates the growth of cells; even if it

is not a critical growth requirement. The calcium concentration requirement is very

specific and the minimum requirement is between 0.25-0.5 mM, but not exceeding 25

mM. Excess calcium results in its acting as an inhibitor in the fermentation process

(Hornsey, 1999). Calcium is mainly important for the extracellular needs such as the

maintenance of the membrane and for the cell wall integrity (Klotz� ��� ���, 1993).

Accordingly, the relative amount of calcium ions and magnesium ions are known to

be critical during cell growth, and increases in the ratio of magnesium to calcium

levels in the cell can provide rapid initial fermentation rates (Ree and Stewart, 1997)

as well as increase the level of alcohol production at the end of the fermentation

process (Hornsey, 1999).

� �%���,�/�0����

Zinc is stored in the vacuole of the cells. It has numerous functions and some of these

can not be replaced; these include: stimulation of the uptake of maltose and

maltotriose (Walker, 2004); the enhancement on the synthesis of growth factors, such

as riboflavin; stabilization of the membrane; the activation of acids and alkaline

phosphatases (Walker, 2004); and acting as a catalytic centre for several important

enzymes such as aldolase, acetaldehyde dehydrogenases and alcohol dehydrogenases

� 11

(Hornsey, 1999; Walker, 2004). However, the concentration of zinc also needs to be

monitored carefully during the fermentation process, since an excess leads to an

inhibitory affect on growth (Hornsey, 1999).

� �%���,�1�.������!�2�!����'2�(�$�!!��'������$���!�

Other metallic ions such as manganese are required as regulators of several key

intracellular enzymes (Walker, 1998b). Cells do not accumulate sodium ion inside

the cells, and the cation is being continually excreted from the cytosol to maintain a

very low level in the cells (Wikén�������, 1962). Potassium ions are taken up actively

by the cells, and are required for D-glucose and other fermentable sugar metabolism.

Decreases in potassium concentration can result in the failure to metabolize available

glucose or fructose causing a stuck fermentation (Kudo�������, 1998). The K+ uptake

system is closely related to the excretion of hydrogen ions from the cells (Hornsey,

1999; Wikén�������, 1962). The ratio of potassium to hydrogen ion does not affect the

rate of growth or formation of maximal cell biomass, but has a slight impact on the

maintenance of cell viability, which could became a contributing factor to the arrest of

fermentation (Kudo� ��� ���, 1998). Overall, a distinct affinity for divalent cations

uptake can be observed during fermentation, with the order of the metal uptake being

Mg2+, Co2+, Zn2+, Mn2+, Ni2+, Ca2+, followed by Sr2+ (Hornsey, 1999).

� 12

�%�%��'��������!����#��'��$�$����

�%�%���'��������!���)����'��$!��������#��'��$�$����

The nitrogen requirements of brewer’s yeast are very simple - only needing

ammonium salts as the sole nitrogen source, although in wort, the requirements for

nitrogenous nutrients are supplied by amino acids and low molecular weight peptides.

�%�%��������������#��'��������!��($�����������#��'��$�$����

The uptake of amino acids during fermentation follows an unique sequence, such that

groups of amino acids have been identified in ale fermentation. The first group of

amino acids are those classified as the rapidly absorbed and assimilated during the

first twenty hours of brewing where biomass production dominates. This group

includes L-arginine, L-lysine, L-aspartate, L-asparagine, L-glutamate, L-glutamine,

L-serine, and L-threonine (Jones and Pierce, 1964). The second group of amino acids

which are gradually absorbed during fermentation include L-leucine, L-isoleucine, L-

valine, L-methionine, and L-histidine (Jones and Pierce, 1964). The third group of

amino acids which are absorbed after the lag phase include L-alanine, glycine, L-

phenylalanine, L-tryptophan and L-tyrosine (Jones and Pierce, 1964). L-proline is

grouped as a hardly absorbed amino acid (Hough, 1985; Pierce, 1982). The uptake of

different amino acids taken at various phases indicates that yeast cells have specific

requirements for amino acids at different stages of the fermentation process. In the

fermentation of lager, the order of amino acid uptake is similar, although L-arginine,

L-aspartate and L-glutamate tend to be taken up more slowly from the fermentation

broth compared to ale fermentation (Palmqvist and Ayrapaa, 1969).

Amino acids which are classified in the first two groups are transported into

yeast by specific permeases; and once ammonium ion has been used up, the third

� 13

group of amino acids are taken up via the general amino acid permease (GAP) (Pierce,

1982). The presence of ammonia in the wort represses the synthesis of GAP, such

that GAP cannot be synthesized at the early stage of brewery fermentation (Jauniaux

and Grenson, 1990).

�%�%�%�������"�!��#��'��������!��������#��'��$�$����

The quality of beer is affected by amino acid metabolism. Amino acid metabolism

can be linked not only to yeast growth but also to the production of sulphur

compounds, fusel alcohols and esters, which are all important determinants of beer

flavour (Hammond, 2000). At the initial phase of fermentation of wort, amino acid

absorption by brewer’s yeast is deficient for protein synthesis, which may be due to

peptides in the wort being hydrolysed by the cells.

Simultaneously, there are a number of amino acids such as glycine, L-alanine

and L-proline that are excreted from the cells and released into the medium (Marquis�

��� ���, 1993). During the fermentation of wort, amino acids are a main source of

nitrogen. But towards the end of the fermentation, polypeptides are assimilated

despite the fact that some amino acids, and particularly the imino-acid proline are

present in the wort (Hough� ��� ���, 1971 -b). Of the amino acids, L-glutamate, L-

aspartate and L-asparagine act as effective sources of nitrogen, whereas glycine, L-

lysine, and L-cysteine are scarcely used (Christensen, 1990). Growth can be

increased by about 10% when pairs of amino acids are provided instead of

individually. However, if a mixture of glycine, L-lysine and L-cysteine is given, a

further 8% increase in the growth yield can be achieved (Hough�������, 1971 -b).

� 14

�%�,�&��$��!�$��$��##��$�#��'��$�$�����

�%�,���##��$��#��'��������!��

The rate of uptake of amino acids is important since they can influence the aroma of

the fermentation products. Amino acids are selectively absorbed from wort, and

different patterns of amino acid removal are found in different fermentations. In

almost all cases, L-proline is hardly removed from wort, even though it can serve as

the sole nitrogen source for yeast (Large, 1986).

Peptides and proteins are either hydrolysed or synthesized from amino acids.

All of the amino acids can be synthesized from carbohydrate and ammonium salts,

and their synthesis during brewing is extensive (Taillandier�������, 2007; Wainwright,

1971). However, amino acids are essential for protein biosynthesis and have

important roles in the formation of permeases and other enzymes. The addition of

amino acids can accelerate the fermentation process and shorten the lag phase if the

wort does not contain adequate α-amino nitrogen in suitable compounds.

The amino acid composition of wort does have an effect on fermentation, and

is reflected in the flavour of the beer rather than the rate of fermentation (Wainwright,

1971). Furthermore, the relative rate of amino acid uptake can influence the aroma of

the fermentation products.

�%�,����##��$��#����3���!����!��

The ability to ferment D-glucose, maltose and maltotriose can be diminished when

cells are starved of amino acids, which commonly happens towards the end of the

fermentation. Therefore, yeast usually grows on sucrose, glucose and fructose until

the permeases have been synthesized (Thevelein�������, 2005).

� 15

In commercial brewing fermentation, the major carbon energy sources are the

sugars which are a mixture of maltose, dextrin, maltotriose, glucose, fructose and

sucrose (Hornsey, 1999). It is interesting to note that these sugars behave differently;

glucose and fructose tend to be taken up by the cell and rapidly consumed; unlike

sucrose which is hydrolysed and broken down outside the cell prior to absorption.

Sugars like maltose and maltotriose are transported across the cell membrane and are

hydrolysed in the cell cytosol (Hornsey, 1999; Hough, 1985). D-glucose is

commonly the only source of energy supplied in the anaerobic medium for a

laboratory strain. D-Glucose is broken down via the glycolytic pathway in order to

produce ATP as the energy source, and the pyruvate formed will then be further

metabolised to ethanol as one of the fermentation products. Conversely, some sugars

are converted into other metabolites, when D-glucose is utilised under anaerobic

conditions, for example, the triose phosphate glyceraldehyde 3-phosphate reacts with

NADH to yield glycerol (Compagno�������, 1996).

High concentrations of D-glucose can have the effect of inhibition of

respiration in brewing. Under anaerobic conditions, the enzymes involved in the

citric acid cycle and the glyoxylate cycle have lower activity, and these low enzymatic

activities can also been observed aerobically when the medium contains 10% D-

glucose (Chapman and Bartley, 1968; Rodrigues�������, 2006; Wainwright, 1971).

�%�,�%�����!(��$�$�����������#��'��$�$����

Under fermentation, most components of the wort diffuse freely through the yeast cell

wall to the plasmalemma, although the hop resins, proteins and polyphenols tend to

absorb onto the outer surface of the cell wall (Hough, 1985). Substances present at

the plasma membrane penetrate readily if they are lipid soluble, but much more

� 16

slowly if they are water-soluble or not fat-soluble (Hough, 1985). There are three

methods of entry; simple diffusion of un-dissociated organic acids, catalysed diffusion

for some sugars, and active transport which uses the transport of amino acids (Hough,

1985). Simple diffusion and catalysed diffusion are both dependent on the presence

of a concentration gradient, but catalysed diffusion involves a rapid entry since it is

catalysed by enzymes. Expenditure of energy in the form of ATP is required for

active transport, and the specific transport enzymes or permeases are known as part of

the mechanism (Hough, 1985). Some of the substances that have been taken up from

the medium may not be used immediately, but may survive for a short time in the

storage pools before they are consumed (Hough, 1985).

�%�,�,������##��$��#��$����"����$���#��'��$�$����(����!!�

The determination on whether a strain is suitable for fermentation is judged by the

level of ethanol tolerance and the number of times the yeast could be re-pitched into

later fermentations (Lentini� ��� ���, 2003). The major goal of brewing yeast in the

fermentation process is to produce ethanol, carbon dioxide and flavour-active

compounds. It is the flavour from the by-products of fermentation that distinguish

specific beer products from other alcoholic products. Although ethanol is a desirable

product of fermentation, its accumulation during fermentation can result in a

significant stress on the cells. It can act as a stressor and trigger an impact to the cells

both physiologically and metabolically. These impacts include: inhibition of cell

growth and impairment of cell viability; alteration in the metabolic pathways;

increases in the duration of the fermentation process; modification of the cell wall and

membrane structure and function; as well as modifications in the gene expression,

� 17

such as the genes that are related to the induction of stress response (Lentini�������,

2003).

Highly ethanol-tolerant yeast contain a higher percentage of unsaturated fatty

acids, mainly higher acyl chain fatty acids, in their cells (Chen, 1981). Thus, the

fluidity of the cell membrane in response to the physical effect of ethanol tightening

the membrane is increased in the presence of a high level of unsaturated fatty acids.

The changes in the ratio of the saturated to unsaturated fatty acid indicates that the

cells may remove the saturated fatty acids in order to enable a greater proportion of

unsaturated fatty acids to be accommodated by the membrane causing an increase in

ethanol tolerance (Lentini�������, 2003).

�%�,�/��##��$��#� ��!$���""���""��

The cell wall of yeast has certain important properties in the brewing industry. Some

brewing yeasts rise to the surface of the fermenting wort towards the end of

fermentation (top yeasts) while others sediment to the bottom (bottom yeasts). This

distinction is a reflection of the differences in composition of the yeast cell walls

(Hough�������, 1971 -a).

�%�/��.�$�3�"���(�$��� !����#��'��$�$����

�%�/�����������

The minium requirements for yeast to grow are simple sugars, amino acids, salts and

vitamins. The sugars provide for the energy production as well as for biosynthesis of

required metabolites, the amino acids are for the biosynthesis of proteins, while the

salts and vitamins play important metabolic roles. In addition, the yeast also needs

sterols, unsaturated fatty acids and dissolved oxygen (Hough, 1985). �

� 18

The pathway of alcohol formation from an amino acid can be divided into

three steps. Firstly, an amino acid is converted into its α-keto analogue,

decarboxylated to an aldehyde, and then reduced to an alcohol with one less carbon

atom than the original amino acid (Wainwright, 1971). These events can occur with

amino acids such as L-phenylalanine, L-tyrosine, and L-tryptophan.

�%�/����'3���4.� ����#4�����!�5�.�6�(�$��� �

The main energy-generating process for the yeast is through the glycolytic or

Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pathway, which was discovered by Ehrlich in the

early 1900 (Ehrlich, 1907). This pathway has been reviewed several times since then,

most recently by Hazelwood ������(Hazelwood�������, 2008). In the presence of D-

glucose, the cells can efficiently generate ATP molecules via glycolysis by substrate

level phosphorylation, and subsequently the carbon source is oxidized completely into

carbon dioxide and water in the TCA cycle. Many species of Yeast, such as

����������� ���� will oxidize pyruvate completely to carbon dioxide and water

(respiration) under aerobic conditions; and will ferment only under anaerobic

conditions. However, ��� ��� � prefers fermentation to respiration even in the

presence of oxygen and produce ethanol aerobically when the right carbon sources are

supplemented (Fix, 1996).

�%�/�%�������$!��#�#��'��$�$����

In the excessive supplementation of D-glucose, the major product is ethanol; however

a small part is converted to acetyl-CoA. The acetyl-CoA is important for cell

metabolism. It is involved in the syntheses of sterols, fats and esters, as well as amino

acids (Hough, 1985). Under anaerobic conditions, mitochondria are not fully

� 19

developed in the presence of D-glucose, but will begin to develop once the

concentration of the D-glucose is reduced to a low level. This is also known as

substrate inhibition (Hough, 1985). On the other hand, aerobic metabolism is

obviously more effective in terms of energy yield than anaerobic metabolism, and

therefore less glucose is required to fulfil the requirements of growth and maintenance.

However, if the yeast can metabolise ethanol under aerobic condition, this will yield

energy almost equivalent to the difference between aerobic and anaerobic metabolism

of D-glucose. Not all D-glucose is metabolised via the EMP pathway, some goes

through the pentose phosphate pathway which yields not only energy but also pentose

sugars that are important for the syntheses of nucleotides and nucleic acids as well as

the formation of NADPH for biosynthetic reactions (Caubet�������, 1988).

In addition, there are number of minor products of fermentation produced

beside ethanol and carbon dioxide. Examples of these are including fusel alcohols,

acids, esters, aldehydes, ketones, glycerol, sulphur, and flavouring products.

� �%�/�%��&�!�"��"����"�5��������"����"6

Fusel alcohols are higher alcohols whose production is largely governed by the amino

acid composition of the wort and a plentiful availability of sugar (van Iersel� ��� ���,

1999; Willaert and Nedovic, 2006). These higher alcohols can be produced in two

different pathways. The Ehrlich pathway is one of the pathways whereby higher

alcohols can be produced: amino acids are taken up from wort and transaminated in

the cell to α-keto acids (Sentheshanmuganathan, 1960). These acids are subsequently

decarboxylated to aldehydes which are reduced to alcohols with one less carbon atom

than in the initial amino acid (Sentheshanmuganathan, 1960). High levels of an

amino acid can lead to enhanced levels of the fusel alcohol analogue. For example,

� 20

excess L-valine promotes the production of isobutanol during fermentation through a

pathway from oxo-acid to α-oxoisovaleric acid and then to the aldehyde

isobutyraldhyde (Yamauchi�������, 1995). An alternative route in the penultimate step

of the amino acid biosynthetic pathways is the formation of α-keto acid which is

transaminated to form an amino acid. If the α-keto acids are decarboxylated and then

reduced as in the Ehrlich pathway then higher alcohols are liberated (Guymon, 1964).

Nevertheless, in both pathways the final reduction of aldehyde to alcohol involves

NADH, and it is thought that the production of higher alcohols by yeast is partly

aimed at maintaining redox balance (Sentheshanmuganathan, 1960).

� �%�/�%���������������!�

A broad range of organic acids is generated during fermentation, and some of these

make critical contributions towards the flavour of the product (Willaert and Nedovic,

2006; Yamauchi�������, 1995). Two groups of acids can be found in the fermentation;

one is comprised of the volatile organic acids which are produced by the hydrolysis of

acetyl-CoA. The other group of acids is the non-volatile organic acids. These include

the oxo-acids, such as pyruvic acid and products of the Krebs cycle such as succinic

acid (Richardson�������, 1989). The production of oxo-acid is closely related to the

composition of amino acid in the wort (Yamauchi�������, 1995).

� �%�/�%�%��!$��!

Esters are by-products in any fermentation process, and are produced by the

interaction between alcohols and carboxylic acids, they range from C3, (ethyl acetate)

to C17 (3-methylbutyl dodecanoate)] (van Iersel� ��� ���, 1999; Yoshioka and

Hashimoto, 1981). Carboxylic acid is activated by coenzyme A (CoA) prior to

� 21

esterification, and ester synthesis requires acyl-CoA, the formation of which is a

cytosolic process and is dependent on the supply of acetyl-CoA as a precursor

(Nordstrom, 1962). They are derived from oxo-acids which are produced either from

carbohydrate metabolism, such as pyruvic acid, oxoglutaric acid or from amino acids

by transmination with existing oxo-acid. From oxovalerate, it can be aminated or

transaminated enzymically to produce L-valine. Alternatively, oxovalerate will

enzymically decarboxylate to produce isobutyraldehyde, followed by reduction using

NADH and alcohol dehydrogenase, to produce isobutanol. This is analogous to

pyruvate that will give ethanol and carbon dioxide as products. Diketones such as

diacetyl are known as powerful flavour substances produced during fermentation

which arises from the excretion of the compound acetolactate and confers a toffee

taste.

Esters play a crucial role in determining of beer flavour. Their presence,

especially in excessive quantities, leads to an “off-flavour”. Acetic acid is a by-

product of fermentation and ethyl acetate can be formed by its direct esterification

with ethanol (Yoshioka and Hashimoto, 1983).

� �%�/�%�,��"��� ��!2���$���!������" ����"

Aldehydes and ketones are by-products of fermentation and contribute to flavour.

One of the most flavour-active compounds produced during fermentation is diacetyl

which gives a toffee or butterscotch taste (Russell, 2006).

Glycerol is function as a compatible solute in osmoregulation which enable to

cells to grow in high sugar or salt environments. Many yeast can use glycerol as a

sole carbon source under aerobic conditions, but glycerol is a non-fermentable carbon

source for ������ �. Glycerol is produced at the early stages of fermentation and

� 22

as a result of a mechanism to prevent the build-up of NADH which occurs during the

early stages of fermentation. NADH is used to reduce dihydroxyacetone phosphate to

glycerol phosphate which is subsequently de-phosphorylated to glycerol.

� �%�/�%�/�-�"(�����

Sulphur compounds are potent flavouring and aromatic substances. They arise

primarily from organic sulphur compounds in wort, such as the amino acid L-

methionine or sulphur-containing proteins. In the absence of organic sources of

sulphur, flavour compounds can be derived from sulphate. Hydrogen sulphide is the

simplest form of the sulphur volatiles and is produced particularly during active yeast

growth (Hough, 1985).

� �%�/�%�1�&"������

In industrial fermentations, amino acids are important not only for yeast biomass

production but are catabolized in the Ehrlich pathway where they are deaminated and

decarboxylated to produce higher alcohols like isobutanol and isopentanol. These

higher alcohols are the metabolites that produce flavours in fermented beverages and

are derived from the α-keto acid intermediates accumulated from biosynthetic

pathways of amino acids when they are not utilized due to the shortage of amino

groups from transamination.

�%�1��!!��$��"�#��$��!����$���3�����������!$� �

The expression of genes up-regulated during fermentation has been studied to give

insight into methods of maximising the production and profile of aroma and flavour

compounds produced in brewing processes. Genes that participate in the glycolytic

� 23

pathway have been found up-regulated for the generation of ethanol from D-glucose

under anaerobiosis (Wu�������, 2004).

On the other hand, studies such as the over-production of the exoglucanase

gene (����) in yeast has been used to enhance the production of aroma during

fermentations in order to improve the flavour profile of the products (Gil�������, 2005).

Alternately, enhancing the activity of yeast alcohol acetyltransferase (����) can

increase the level of flavour production (Fujii�������, 1994; Lilly�������, 2000). More

than 1000 volatile compounds have been identified and of these, more than 400 are

produced by yeasts during fermentation (Nyka¨nen, 1986). The characteristic fruity

odours of the fermentation bouquet are primarily due to a mixture of hexyl acetate,

ethyl caproate (apple-like aroma), isoamyl acetate (banana-like aroma), ethyl

caprylate (apple-like aroma), and 2-phenylethyl acetate (fruity, flowery flavor with a

honey note) (Lilly� ��� ���, 2000). The major volatile products of yeast metabolism,

ethanol and carbon dioxide, have a relatively small contribution to flavor. Conversely,

organic acids, higher alcohols and esters and to a lesser extent acetaldehyde constitute

the main group of compounds that form the fermentation by-products (Rapp and

Versini, 1991; Romano�������, 2003).

�,�������3��!�!�

�,��&��$��!�#���������3�������$���

Yeast is a facultative organism which can survive and grow in either the presence or

absence of oxygen. However, when cells are shifted from one condition to the other,

the physiology and metabolism of the cells are altered so that the cells can adjust for

adapting to the new condition in order to survive. There are some essential

requirements and factors for anaerobic growth of yeast cells.

� 24

Major changes in gene expression occur during fermentation as was observed

in a gene expression study on wine yeast (Rossignol�������, 2003). More than 2000

affected genes were found as the yeast cells adapted to the changing nutritional,

environmental and physiological conditions. The observed patterns of regulation

were found consistent and suggested a complex interplay of signalling and regulatory

networks under these changing conditions (Rossignol� ��� ���, 2003). Expression of

genes that code for the involvement of critical metabolic pathways such as glycolysis

and ergosterol uptake were strong throughout the entire fermentation process. A

significant number of the strongly expressed genes are regulated by anaerobiosis,

these include genes that are involved in sterol uptake, trafficking, cell wall proteins,

fatty acid desaturation (Rossignol�������, 2003). Nevertheless, it is necessary for the

cells to change their gene expression patterns in order to adapt the changing

environment.

�,�������!$���"��

Sterols are integral structural components of the cell membrane. In yeast, ergosterol

is crucial for maintaining the fluidity of plasma membrane in cellular functions (Nes�

������, 1978). However, ergosterol can only be synthesized in the presence of oxygen

therefore supplementation of ergosterol is crucial in the medium for anaerobic

growing yeast (Andreasen and Stter, 1953; Reiner�������, 2006). A microarray study

found that genes involved in the biosyntheses of ergosterol were highly induced

during the initial stages of a lager fermentation (Higgins�������, 2003) and indicated

the importance of ergosterol requirement for protection against oxidative stress.

� 25

�,�����'��������!���)����'��$!��

Compared to mammalian cells, yeast cells can synthesize all 20 amino acids and can

grow in the medium without any supplementation of these nutrients in most

conditions. One of the ways to interfere with the ability of yeast to synthesize an

amino acid is by mutating or inhibiting a biosynthetic enzyme; or by culturing yeast in

an imbalanced medium where an amino acid present in excessive can inhibit an

enzyme involved in biosynthesis of a second amino acid lacking in the medium

(Dever and Hinnebusch, 2005). During starvation of amino acids, yeast cells induce

the transcription of over 70 genes encoding enzymes that function in the biosynthesis

of all 20 amino acids (Natarajan and Hinnebusch, 2002).

Genes that are involved in the biosynthesis of L-serine (��������������� ��

and� ��� ) have been found to be up-regulated in wine yeast during fermentation

(Rossignol� ��� ���, 2003), as well as in a laboratory strain during anaerobiosis (de

Groot�������, 2007). A similar study was performed by Varela ������, 2005 with wine

yeast under winemaking conditions (Varela� ��� ���, 2005), and found that !���

(encoding for 3-phosphoglycerate kinase) was highly expressed. !��� is involved in

the metabolic pathway of D-glucose to L-serine biosynthesis. Also, a mutant lacking

���� was unable to grow anaerobically (Reiner� ��� ���, 2006), even with the

supplementation of ergosterol and unsaturated fatty acids (Tween 80) in a rich

medium (YPD). These results suggested that there may be some role for L-serine

biosynthesis under anaerobic conditions.

�,��%��$�����!!��$��"�����!�#���������3�������$��

Several differences between aerobic and anaerobic growth are evident, for example

the energy yield is much lower under anaerobic conditions. These differences may be

� 26

due to the requirement for oxygen in several biosynthetic pathways. Under anaerobic

conditions, the plasma membrane contains more saturated fatty acids, less total sterol,

less ergosterol and less squalene. This may be due to the inability of the cell to

synthesize these specific sterols in the absence of oxygen (Nurminen� ��� ���, 1975).

The synthesis of heme is highly dependent on oxygen, such that there is no other

alternative pathway that can eliminate this requirement (Kwast� ��� ���, 2002).

Moreover, the biosynthesis of sterols is another pathway which requires oxygen. In

the absence of oxygen, the cells lose the ability to synthesis sterols and instead need to

take it up from the medium (Andreasen and Stter, 1953) and hence supplementation

with a sterol such as ergosterol is essential for anaerobic growth (Higgins�������, 2003;

Reiner�������, 2006), and Tween 80 is also required as a source of unsaturated fatty

acids whose synthesis is also oxygen-dependent.

Numerous studies have employed genome-wide screen technology to

investigate the groups of genes which are induced when cells are under anaerobic

conditions (James�������, 2003; Kwast�������, 2002; Lai�������, 2005; van den Brink����

���, 2008). Genome-wide transcriptional adaptations to aerobiosis and anaerobiosis

have been studied as well (Alimardani�������, 2004; Lai�������, 2006; ter Linde�������,

1999). Table 1.1 illustrated that genes within the functional groups of transcription,

protein folding and degradation, transport, oxidative responses, stress responses, cell

wall biogenesis, sterol and fatty acid metabolism, and metabolism were differentially

expressed in transcriptional studies involving anaerobic/aerobic shifts.

� 27

��3"��� Induced genes within the functional groups found in several genome-wide

microarray studies of anaerobiosis or shifts between aerobic and anaerobic conditions.

James1 Kwast2 Lai3 van den Brink4 Alimaedani5 Lai6 ter Linde 7

Transcription √ √ √ √ √ √ √

Protein

folding,

degradation

√ √ √ √ √ √

Transport √ √ √ √ √ √

Oxidative

Responses √ √ √ √ √ √ √

Stress

responses √ √ √ √ √ √ √

Cell wall

biogenesis √ √ √ √ √ √ √

Sterol and

fatty acid

metabolism

√ √ √ √ √ √ √�

Metabolism √ √ √ √ √ √ √

1. (James� ��� ���, 2003) – dextrose medium, bottom-fermenting lager (Guinness 6701),

beginning vs. end of fermentation phase (Day 8). 2. (Kwast�������, 2002) – galactose medium,

JM43 (MATα), aerobic vs. anaerobic conditions. 3. (Lai� ��� ���, 2005) – glucose medium,

JM43 (MATα), aerobic vs. anaerobic conditions. 4. (van den Brink�������, 2008) – glucose

medium, CEN.PK113-7D (MAT�), aerobic vs. anaerobic conditions. 5. (Alimardani�������,

2004) – glucose medium, FY1679α (MATα), aerobic vs. anaerobic conditions. 6. (Lai�������,

2006) – galactose medium, , JM43 (MATα), aerobic vs. anaerobic conditions. 7. (ter Linde����

���, 1999) - glucose-limited medium, CEN.PK113-7D (MAT�), aerobic vs. anaerobic

conditions.

Transcript levels of the cell wall mannoprotein genes �"!� and �"!� were

found to be decreased in a study of gene expression in anaerobic cells (Klis� ��� ���,

2002). Table 1.2 illustrates that almost all of the cell wall mannoprotein genes, such

as #��, �$� and !�% were found to have increased expression during the studies

� 28

(Kwast, 2002; Lai, 2005; Lai, 2006) and some of the others genes were identified in

other studies (Alimardani, 2004; James, 2003; ter Linde, 1999; van de Brink, 2008).

��3"�� �� Genes in the cell wall mannoproteins that are involved in cell wall

biosynthesis found in the genome widescreen microarray analyses from the same

research groups listed in Table 1.1.

*����� James1 Kwast2 Lai3 van den Brink4 Alimaedani5 Lai6 ter Linde 7 �$�� √ √ √ √ √ �$�� √ √ √ √ √ √ �$� √ √ √ √ √ �$�� √ √ √ √ √ √ √ �$!� √ √ √ √ √ √ #��� √ √ √ √ √ √ #��� √ √ √ √ √ #�� √ √ √ #��� √ √ √ √ !�%� √ √ √ √ !�%� √ √ √ √ √ !�% √ √ √ √ !�%� √ √ √ √ !�%& √ √ √ √ !�%' √ √ √ √ √ !�%( √ √ √ √ !�%)*�� √ √ √ 1. (James� ��� ���, 2003) – dextrose medium, bottom-fermenting lager (Guinness 6701),

beginning vs. end of fermentation phase (Day 8). 2. (Kwast�������, 2002) – galactose medium,

JM43 (MATα), aerobic vs. anaerobic conditions. 3. (Lai� ��� ���, 2005) – glucose medium,

JM43 (MATα), aerobic vs. anaerobic conditions. 4. (van den Brink�������, 2008) – glucose

medium, CEN.PK113-7D (MAT�), aerobic vs. anaerobic conditions. 5. (Alimardani�������,

2004) – glucose medium, FY1679α (MATα), aerobic vs. anaerobic conditions. 6. (Lai�������,

2006) – galactose medium, , JM43 (MATα), aerobic vs. anaerobic conditions. 7. (ter Linde����

���, 1999) - glucose-limited medium, CEN.PK113-7D (MAT�), aerobic vs. anaerobic

conditions.

The inability of anaerobic cells to synthesise sterols and unsaturated fatty

acids greatly influences the structure and regulation of the cell wall and the cell

� 29

membrane and does lead to a greater requirement for these sterols and fatty acids, as

well as increased efficiency of their uptake from the supplemented medium (Snoek

and Steensma, 2007).

�/���'��������!�3��! �$��!�!�����'�$�3�"�!'�

�/���'����������($����! !$�'�5�'���������(��'��!�6�

Amino acids are essential for cell growth. Yeast cells can either synthesize their own

amino acids or take them up from the medium. Two types of amino acid uptake

system can be found in yeast (Cooper, 1982). The first system is a low specificity

general transporter that can uptake all naturally occurring amino acids. This is the

general amino acid permease (GAP). The other system involves transporters that

display specificity for one or a small number of related amino acids (Large, 1986).

The regulation of amino acid uptake by GAP is controlled by level of expression level

of the ��! protein, which is strongly dependent on the nature and availability of a

nitrogen source. Thus, ��! is not synthesized when yeasts are grown in nitrogen-

rich media such as ammonium ions (Grenson�������, 1970; Rytka, 1975), and hence

the presence of ammonium ions may inhibit the uptake of the amino acids. Gap1p is

subjected to ammonium catabolic repression, and the specific amino acid transport

systems in yeast are not considered to regulate by repression mediated by the

metabolite. By regulating the expression of amino acid transporters, the cells are able

to adapt to fluctuations on amino acid availability (Bungard and McGivan, 2004).

The membrane transport efficiency in yeast cells can be greatly affected by the

relative availability of amino acids and the concentration of ammonium ions which

may therefore lead to an influence on the brewing process. In industrial fermentations,

the type and the amount of amino acids present have an impact on the spectrum of

� 30

metabolites produced by cells. However, the addition of mixtures of amino acids or

just L-glutamate to fermentation media can stimulate yeast growth so that the duration

of the fermentation can be reduced (Thomas and Ingledew, 1990). Furthermore, the

supplementation of amino acids to defined growth medium can increase the yield of

ethanol and diminish the production of glycerol (Albers�������, 1996). The amount of

higher alcohols produced is dependent on the availability of amino acids from

metabolism (Albers�������, 1996). For some yeast strains, the presence of ammonium

salts may enhance cell growth (Mendes-Ferreira�������, 2004), however, for brewer’s

yeast, the addition of an amino acid mixture is preferred for rapid cell growth. On the

other hand, the presence of ammonium ions can inhibit the uptake of amino acids and

lead to delayed growth. A list of amino acid permeases is provided in Table 1.3,

which shows the specificity of each amino acid permease for the uptake of different

amino acids. The genes encoded for permeases such as ��!�, +�!�, ����, ��!�,

��!�, ,-!� and .%! are all under the regulation of the general control of nitrogen

metabolism control system mediated by the transcription factor Gcn4p (Ahmad and

Bussey, 1986; Grauslund� ��� ���, 1995; Isnard� ��� ���, 1996; Jauniaux and Grenson,

1990; Schreve�������, 1988; Sychrova and Chevallier, 1993; Zhu�������, 1996).

� 31

��3"���% Specificity and regulation of the genes encoding amino acid permeases

*����

��'��

�'��������!�$���!(��$��� ����"�$���� ��#�������

�,!�� Arg, Lys (Cationic amino acid) (Regenberg�������,

1999)

��!�� Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu,

Pro, Phe, Ser, Trp, Tyr

Gcn4p, Stp1p, Stp2p (Schreve�������,

1988)

��!�� Ile, Leu, Met, Thr, Val Osmotic stress (Aouida�������,

2005; Schreve

and Garrett, 2004)

��! � Ile, Leu, Met, Thr, Val Sulphur limitation (Boer�������,

2003; Schreve

and Garrett, 2004)

+�!�� Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp,

Tyr, Val

Gcn4p, Stp1p,

Stp2p, Leucine

(Grauslund�������,

1995)

+�!

(!�!�)

Cys, Ile, Leu, Met, Phe, Trp,

Tyr, Val

Abt1p, Stp1p, Stp2p,

Leucine

(Regenberg�������,

1999)

����� Arg, Lys (Cationic amino acid) Gcn4p, Gln3p (Ahmad and

Bussey, 1986)

#$!&� Ala, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly

Ser, Thr

Arg80p, Arg81p (Regenberg�������,

1999; Regenberg�

������, 1998)

��!�� All 20 amino acids Gcn4p, Gln3p,

Leu3p

(Jauniaux and

Grenson, 1990;

Springael and

André, 1998)

��!�� Asn, Cys, Glu, Gln, Leu, Lys,

Met, Ser, Thr

Grr1p, Gcn4p,

Stp1p, Stp2p

(Regenberg�������,

1999; Zhu�������,

1996)

/$!�� His (Farcasanu�������,

1998; Tanaka and

Fink, 1985)

,-!�� Arg, Lys (Cationic amino acid) Gcn4p (Sychrova and

Chevallier, 1993)

� 32

*����

��'�

�'��������!�$���!(��$�� ����"�$��� ��#������

.�!�,

.�!�,

.�!

NH3 NCR (Lorenz and

Heitman, 1998;

Marini�������,

1997; Marini����

���, 1994)

.%! � Met Met4p, Met28p,

Met31p, Met32p,

Cbf1p, Gcn4p

(Isnard�������,

1996)

.%!�� Met Stp1p, Stp2p (Isnard�������,

1996; Kosugi����

���, 2001)

!%��� Ala, Gly, Pro, GABA* Gln3p (Jauniaux�������,

1987; Vandenbol�

������, 1989)

��.�� S-adenosylmethionine (Thomas, 2000;

Thomas and

Surdin-Kerjan,

1991)

..!�� S-methylmethionine (Rouillon�������,

1999)

�����

(��!�)

Cys, His, Ile, Leu, Trp, Tyr, Val, Stp1p, Stp2p,

leucine induction

(Bajmoczi�������,

1998; Schmidt����

���, 1994)

�����

(��.�)

Cys, Phe, Trp, Tyr (Regenberg�������,

1999; Schmidt����

���, 1994)

%���� GABA* (Andr������,

1993; Correa

García�������,

1997)

*GABA = gamma-aminobutyric acid

� 33

�/�������"�$�����#��'���������3��! �$��$���(�$��� !�

The regulation of amino acid biosynthesis by the general control system has been

comprehensively researched by the Hinnebusch group at both the transcriptional and

translational level (Hinnebusch, 1984; Hinnebusch, 1990; Hinnebusch, 1997;

Hinnebusch, 2005; Hinnebusch and Fink, 1983; Hinnebusch and Natarajan, 2002).

These studies elucidated the mechanism of regulation based on Gcn4p ( General

Control Nonderepressible ) that include how cells coordinate the repression and

derepression of the amino acid biosynthetic pathway enzymes in regard to amino acid

availability. �

�/�%�*�����"����$��"����4��(��!!�3"��4������

In yeast, Gcn4p (General Control Nonderepressible) is a principle transcriptional

activator that directly activates over 30 amino acid biosynthetic genes and regulates

the synthesis of 19 out of 20 amino acids. The Gcn4p-binding motif is located

upstream of many genes which are induced during amino acid starvation (Large,

1986; Natarajan� ��� ���, 2001). However, it also directly or indirectly regulates the

expression of genes for the biosynthesis of purine, biosynthesis of organelles,

autophagy, glycogen homeostasis, and several multiple stress responses (Hinnebusch

and Fink, 1983). Gcn4p has been shown to bind the consensus sequence TGACTC,

located upstream of many genes induced during amino acid starvation (Large, 1986;

Meimoun� ��� ���, 2000; Natarajan and Hinnebusch, 2002; Natarajan� ��� ���, 2001).

Apart from the activation of amino acid biosynthesis during cell starvation, Gcn4p

also regulates the expression of genes that are responsible for several environmental

stress stimuli (Natarajan�������, 2001).

� 34

Natarajan ��� ���� (Natarajan� ��� ���, 2001) have employed microarray

technology for the genome-wide analysis of genes whose expression is regulated by

Gcn4p. Table 1.4, summarises functions of the 543 genes that are targets of Gcn4p.

� 35

��3"�� �,� *���� #���$���!� ����"�$��� 3 � *��,(� #��'� $��� '�������� � !$�� � �#�

��$���7��������2��88�

*����#���$���!� ��'3��!� �#� ����!�

#�������"�$���

Amino acids biosynthetic genes 73

Vitamin/ cofactor biosynthetic genes 16

Mitochondrial carrier protein genes 8

Amino acid precursor biosynthetic genes 4

Purine biosynthetic genes 5

Peroxisomal genes 6

Regulatory molecules: Protein kinases, Phosphatase

regulatory subunits, Transcription factors

11, 4, 26

Energy metabolism: Glycogen and trehalose homeostasis 10

Salvage pathway: Autophagy, Vacuolar protease 3, 2

Other known genes or genes of unknown function 375

Repressed genes: Ribosomal proteins and translation

factors

Data not shown

�/�,����4���3���'�$�3�"�!'�

Gcn4p has been shown to regulate genes involved in one-carbon metabolism when

cells are under aerobic conditions (Sudhakar �����, 1999, Garcia-Barrio �����, 2002).

Glycine and L-serine are the two amino acids which are involved in one-carbon

metabolism. They donate their one-carbon units for the synthesis of tetrahydrofolate

(THF) in the cytoplasm and mitochondria. Formate is another metabolite which

donates its carbon unit in one-carbon metabolism. �

� One-carbon metabolism encompasses the reactions whereby one-carbon units

are transferred from the donors L-serine, glycine or formate via THF derivatives to

essential biosynthetic processes including methyl group biogenesis and the synthesis

� 36

of nucleotides, vitamins and some other amino acids (Cook, 2000; Piper�������, 2002).

This metabolism plays an important role in several metabolic pathways in yeast,

plants and mammals (Christensen and MacKenzie, 2006). In many organisms, L-

serine is the main one-carbon donor and its conversion to glycine via cytoplasmic

serine hydroxymethyltransferase (encoded in ��� ��� � by �/.�) leads to the

formation of the key intermediate 5,10-methylene tetrahydrofolate (5,10-CH2-

H4folate). Figure 1.1 provides an overview of one-carbon metabolism in yeast.

Cytoplasmic 5,10-CH2-H4folate is reversibly converted to other H4folate derivatives

at different oxidation states by the trifunctional enzyme encoded by �#� � and the

dehydrogenase encoded by .�#�. These reactions are duplicated in the

mitochondrion, catalysed via the mitochondrial serine hydroxymethyltransferase

(encoded by �/.�) and the mitochondrial trifunctional C1-H4folate synthase

(encoded by .$��)�

� 37

�������

�������

��� � ��� �

������ � ������ �

����

����

����

��

����

���

����

�������� � ����

��������

���

���� ����

���

������������

��� ���

������������

����

������� � �

����

�������� �

�����������

�����

������

��������� �

���

!������ "����������

����

��

����

&������ � An overview of one-carbon metabolism with glycine, L-serine and

formate as the three one carbon donors that can move between the cytoplasm and

mitochondria (Piper�������, 2000).

� 38

�/�,��*" ������

Glycine is a one-carbon donor via the action of the strictly mitochondrial glycine

decarboxylase complex encoded by ��0�����and� and ,!#�. Formate is activated

to 10-formyl-H4folate via the synthetase activity encoded by �#� in the cytoplasm

or .$�� in the mitochondrion. One-carbon units can be transferred between the

mitochondrion and the cytoplasm via formate as an intermediate. The interconversion

of one-carbon donors and intermediates is highly regulated at the level of enzyme

activity as well as at transcription (Cook, 2000; McNeil�������, 1996). In ������ �,

many of the genes involved form a regulon that responds to the cytoplasmic level of

5,10-CH2-H4folate (Gregory�������, 2000; Hong�������, 1999; Pasternack�������, 1996;

Piper�������, 2000).

�/�,���+4-�������

L-serine is the main source of the single carbon pool required for the syntheses of

purine nucleotides, thymidylate, and L-methionine. It also donates the carbon chain

to L-tryptophan and phospholipids. The two carbons of its chain are thus

incorporated into purines and heme though glycine.

Two of the three known metabolic pathways to L-serine and glycine have been

shown to be present in prototrophic yeast strains; the phosphorylated pathway from

glycolytic intermediates and the glyoxylate pathway using intermediates from the

TCA cycle. Two L-serine-glycine auxotrophs (��∆ and ��∆) were found to be

blocked in the phosphoglycerate pathway (Ulane and Ogur, 1972). The ���� gene

encodes 3-phosphoserine aminotransferase, and the ���� gene phosphoserine

phosphatase. Another pathway to glycine from isocitrate, is repressed by growth in

media are supplemented with D-glucose. This pathway is derepressed by growth to

� 39

stationary phase in D-glucose media yielding high activity of these enzymes (Ulane

and Ogur, 1972). Hence, the phosphoserine pathway appears to be the principal

biosynthetic pathway to L-serine and glycine during growth on sugar media (Ulane

and Ogur, 1972).

�/�1��� �

The transcription factor Bas1p regulates purine and histidine biosyntheses (Piper� ���

���, 2000). It is also involved in regulating the expression of genes related to the one-

carbon regulon (Daignan-Fornier and Fink, 1992; Gelling�������, 2004; Piper�������,

2000; Piper� ��� ���, 2002; Subramanian� ��� ���, 2005; Zhang� ��� ���, 1997). It is

interesting to note that Bas1p binds to the same binding site as Gcn4p with the

consensus sequence TGACTC.

However, both Bas1p and Bas2p are required for the regulated expression of

the �#� genes under adenine limited conditions (Arndt�������, 1987; Daignan-Fornier

and Fink, 1992; Pinson�������, 2000; Zhang�������, 1997). The derepression of Gcn4p

stimulates +��� expression under amino acid starvation (Natarajan� ��� ���, 2001).

Recent studies from Joo ��� ��� demonstrated that Gcn4p and Bas1p maintain the

expression of �#� gene at a basal level, while derepressed Gcn4p stimulates the

transcription which is capable of overcoming the stress conditions by activating

amino acid biosynthetic genes such as �#� �(Joo�������, 2009).

� /$�( is an important gene and its gene product is required for the biosyntheses

of L-histidine and purines (Kunzler�������, 1993). The activation of the expression of

/$�(� can be triggered by the limitation of purines or starvation of amino acids

(Springer� ��� ���, 1996). However, under amino acid starvation Gcn4p binds at the

two binding sites (Gcn4p-recognition elements) GCRE1 and GCRE2 which activates

� 40

/$�(. Whereas, Bas1p and Bas2p (required both at the same time) share a common

binding site GCRE2 (Springer� ��� ���, 1996; Valerius� ��� ���, 2003) under purine

limitation. Nevertheless, under amino acids and purine starvations, the /$�(

promoter can simultaneously targeted by both Gcn4p and Bas1p/Bas2p that activates

its transcription (Springer�������, 1996; Valerius�������, 2003).

� These two transcriptional factors (Bas1p and Bas2p) can activate the /$����

/$����and�/$�(�genes (Devlin�������, 1991; Springer�������, 1996), which are needed

for the biosynthesis of L-histidine, as well as �,�����/.���.�#� that are involved

in the biosynthesis of L-glutamine, glycine and 10-formyl tetrahydrofolate (Arndt����

���, 1987; Denis and Daignan-Fornier, 1998).

Conversely, the promoter of the ���� gene contains a potential Bas1p binding

site (TGACTC), which is also a possible target for Gcn4p binding. The

transcriptional regulation of one carbon metabolism regulon by Bas1p and Gcn4p

under aerobic condition has been studied by Subramanian ������ (Subramanian�������,

2005). Shm2p plays an important role in one-carbon metabolism by regulating the

levels of tetrahydrofolate in response to glycine concentration. The Regulation of

�/.� promoter by glycine requires Bas1p, but not Bas2p (also known as Pho2p) or

Gcn4p. In addition, Bas1p has a role in the activation of adenylate biosynthetic genes

when cells are under adenine depletion (Koehler�������, 2007; Som�������, 2005).

� 41

�1�����#���$���!��#�*��,(�

�1�����($������!(��!�!�

Gcn4p plays numerous roles in cellular responses such as the adaptation to new

environments and to starvation of amino acids. One example of the adaptive property

of ���� is shown in its response to methylglyoxal (Nomura� ��� ���, 2008).

Methylglyoxal is 2-oxo-propanal (CH3-CO-CH=O), a reactive aldehyde that is

derived as a by-product of glycolysis. It is an endogenous metabolite, but at high

concentrations, it can have deleterious effects on cellular functions. Nomura ����.,

(Nomura�������, 2008) demonstrated that a mutant which lacks ���� loses its ability

to respond to methylglyoxal, whereas a high tolerance adaptive response was

observed in the wild-type cells under the same conditions.

�1���+�#��!(�������������

Furthermore, Gcn4p has recently been found to be related to lifespan and aging.

Studies (Chiocchetti�������, 2007; Steffen�������, 2008) have shown that a reduction in

60� ribosomal subunit levels slows down aging in yeast. A significant increase on the

replicative life span was also observed when 60� subunit biogenesis was inhibited.

Gcn4p reduces 60� subunit abundance and hence acts as a potential longevity and a

nutrient-responsive transcription factor by diminishing the 60�� subunits (Steffen� ���

���, 2008). This finding suggests that reduced 60� subunit abundance and Gcn4p

activation extend yeast life span.

� 42

�1�%�9��!$���""���""�

�1�%�����! �$��!�!��#� ��!$���""���""��

The cell wall of yeast comprises 15-30% of the dry weight of the cell. The main

structural constituents of the yeast cell wall are polysaccharides which are made of

three sugars, D-glucose, mannose, and N-acetylglucosamine which accounts for 80-

90% (Cabib� ������, 1982; Sentandreu and Northcote, 1969). Proteins present in the

cell wall have a high content of L-glutamic acid and L-aspartic acid (McMurrough

and Rose, 1967). Figure 1.2 illustrates an overview of the yeast cell wall (Pitarch����

���, 2008), and identifies several methods for the yeast cell fractionation based on a

distinctive property of each component. The cell walls of yeast are principally β*

linked glucans and mannans with a minor proportion of chitin. β(1→3)glucan is one

of the glucose polysaccharides which provide the structural and strength component

of the cell wall whereas β(1→6)glucan plays an essential role in cross-linking.

However, the amount of β(1→6)glucan is relatively less than β(1→3)glucan (Bacon�

������, 1969). Mannose polysaccharides are linked to the proteins to form a layer of

mannoproteins which are located at the external surface of the cell (Lesage and

Bussey, 2006). This mannoprotein layer makes the inner layer less accessible to cell

wall-degrading enzymes and acts as a filter for large molecular weight compounds

(Zlotnik�������, 1984). It is also involved in cell-to-cell recognition events (Snoek and

Steensma, 2007). Chitin in yeast has a central role in septation which is important for

cell survival (Bulawa, 1993).

It is crucial for the cell to maintain cell wall integrity at all times. This

includes the stages of the cell cycle which involve extensive remodelling of the cell

wall, including budding, cell division, sporulation and pseudohyphal formation. It

also includes situations of stress that may occur in extreme conditions such as heat

� 43

shock, osmotic shock and pH changes (Cabib, 2001; Horie, 2001; Klis, 2006; Lesage,

2006). The cell wall has numerous roles in cell survival by protecting the cell

contents. It is necessary for the cell wall to constantly change its pattern in order to

adapt to any dramatic environment and conditions. Therefore, the role of cell wall

synthesis is not only for cell protection but also for cell growth and division.

� 44

�1�%�����""���""�'����(��$���!�

As the major component of the cell wall, mannoproteins comprise 40% of the cell

mass and they determine the permeability of the cell wall (Zlotnik� ��� ���, 1984).

Mannoproteins are glycoproteins with 1-linked oligomannoses and �-linked high-

mannose-type oligosaccharides which have highly branched outer chain of mannose

(Klis, 1994). The mannoproteins contain many L-serine and L-threonine residues

which carry short oligomannosyl chains and provide the polypeptide backbone of the

cell wall. Glycosylphosphatidyl-inositol (GPI) -anchored mannoproteins made up one

of the major cell wall components of eukaryotic microorganisms including yeast and

fungi. Some GPI-anchored proteins are localized at the plasma membrane but others

are processed at the plasma membrane and are covalently linked to β(1→6)glucan of

the cell wall through the GPI portion. However, certain mannoproteins have

important roles in mating and during the transition to hyphal growth (Roy� ��� ���,

1991). Cwp2 mannoprotein is one of the most abundant proteins in the cell wall and

along with Cwp1 has a role in stabilise the cell walls (van der Varrt� ��� ���, 1995).

Interestingly, Cwp1 and Cwp2 are expressed under normal growth conditions whereas

other mannoproteins tend to be expressed and are triggered by environmental stress.

Genes that are related to the #��2�$� group (#����� #����� #�� �� #����� �$����

�$�����$� ���$����34��$!�) are induced during anaerobic growth (Abramova�������,

2001b). These genes are required for anaerobic growth and the expression of �"!�

and �"!� is switched off during anaerobiosis (Abramova� ��� ���, 2001b) as

summarised in Table 1.2. An essential requirement for adaptation to anaerobiosis is

having one group of proteins replacing another group. Hence, the expression of

#�����#��� and the �$� genes was found largely induced within the first hours of

anaerobiosis (Abramova�������, 2001b), such that these genes are required to switch

� 45

on in order to adapt to the anaerobic condition for cell survival and growth. On the

other hand, �"!� and �"!� were down-regulated more than 10-fold within the first

2.5 hours following the shift to anaerobiosis (Abramova�������, 2001b). Nevertheless,

#���, �$�� and �$�� are not essential for anaerobiosis (Cohen�������, 2001), while

�$� and �$�� are crucial since mutants lacking �$� or �$�� are unable to grow

anaerobically (Abramova�������, 2001a).

The genes and enzymes responsible for cell wall assembly are potential targets

of anti-fungal reagents (Tsukahara� ��� ���, 2003). The gene encoding GPI-anchored

wall protein transfer (Gwt1p) was identified as a new anti-fungal drug candidate

target. �"�� is involved in the acylation of the inositol during the GPI synthetic

pathway (Umemura�������, 2003). The composition, structure and function of the cell

wall in ��34 4����5 ��3 and ������ � have been reviewed by several groups and

there are similarities (Bishop�������, 1960; de Groot�������, 2004; Fleet, 1991; Klis����

���, 2006; Lesage and Bussey, 2006; Shepherd, 1987). The mannoproteins of the

pathogenic yeast �����5 ��3 have been determined as the mediator of cell adhesion to

the host tissues and virulence (Sundstrom, 2002).

�:���'�

This thesis was initiated by Anthony Beckhouse (PhD, UNSW 2008) who reported

that cells lacking Gcn4p transcription factor regulating genes involved in amino acid

metabolism have a growth defect under anaerobic conditions indicating that there may

be an altered requirement for some Gcn4p-dependent aspect of amino acid

biosynthesis in anaerobic cells compared to aerobic. The aim of this thesis study was,

to identify the role of Gcn4p transcription factor in the adaptation of cells to

anaerobiosis, and to determine which processes regulated by Gcn4p were involved.

� 46

The phenotype of a mutant lacking Gcn4p was found to result from an altered cellular

requirement for L-serine and/or glycine when cells adapt to anaerobic conditions.

Therefore the aim was extended to explore the link between one-carbon metabolism

and the adaptation of cells to anaerobic conditions. Results show a remarkable shift

in metabolic networks as cells adjust to anaerobic conditions.

The synthetic medium used in the previous anaerobic study by Anthony

Beckhouse (Beckhouse, 2006) was purchased from a commercial source and is

composed of D-glucose, inorganic nitrogen source, 12 amino acids and other growth

supplements. There were eight amino acids that were not included in the culture

medium for anaerobiosis; these are L-alanine, L-asparagine, L-cysteine, L-glutamate,

L-glutamine, glycine, L-proline and L-serine. The absence of these eight amino acids

provided the opportunity to investigate which amino acids were essential for

adaptation to anaerobic growth, their importance for anaerobiosis, as well as their

roles in metabolism. HPLC analysis was employed to provide us a better insight of

how the metabolic system is influenced by the lack of oxygen and an understanding of

one-carbon metabolism, Bas1p, L-serine and glycine.

An additional aim was to determine the basis for the additional requirement

for L-serine of cells entering anaerobiosis. This was traced to alterations of cell wall

proteins and hence another aim of this work was to identify changes in cell wall

mannoproteins as cells entered anaerobiosis.

47

CHAPTER 2. MATERIALS AND METHODS

2.1 General materials and methods

2.1.1 Materials

Table 2.1 Materials and reagents used for performing the experiments

Material/Reagent Source

Acetic acid Ajax FineChem, NSW

Agar type 1 Oxoid Ltd., NSW

Agarose (DNA grade) Progen Industries, QLD

Ammonia solution (28% w/w) APS Chemicals Ltd., NSW

Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) Sigma-Aldrich, NSW

Ammonium sulphate Difco, NSW

Ampicillin (sodium salt) ICN Biomedicals, NSW

Anaerobic sachet (AnaeroGenTM

) Oxoid Ltd., NSW

Anaerobic jar indicator (BR0055B) Oxoid Ltd., NSW

Bacteriological peptone Oxoid Ltd., NSW

-mercaptoethanol BDH Laboratory Supplies, Poole, England

Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, NSW

Bradford reagent BioRad, NSW

Calcium chloride APS Chemicals Ltd., NSW

Chloroform APS Chemicals Ltd., NSW

Choline Sigma-Aldrich, NSW

ClonNAT (nourseothricin) Werner BioAgents, Jena, Germany

D-glucose Ajax FineChem, NSW

Diethyl pyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich, NSW

48

Di-sodium hydrogen orthophosphate Ajax FineChem, NSW

Dithiothreitol Astral, NSW

Ergosterol 75% Sigma-Aldrich, NSW

Ethanol (EtOH) Ajax FineChem, NSW

Ethidium bromide Sigma-Aldrich, NSW

Ethylene glycol Sigma-Aldrich, NSW

Ethylenediaminetetra-acetic acid di-sodium salt APS Chemicals Ltd., NSW

Formic acid (90% w/w) Ajax FineChem, NSW

Geneticin (G418) Sigma-Aldrich, NSW

Glycerol APS Chemicals Ltd., NSW

Herring sperm DNA Boehringer Mannheim GmbH, Germany

Hydrochloric acid (HCl) Ajax FineChem, NSW

Hydrogen peroxide Ajax FineChem, NSW

Iodine (crystal) Sigma-Aldrich, NSW

Iodoacetamide Sigma-Aldrich, NSW

Isoamyl alcohol (3-methyl-1-butanol) Sigma-Aldrich, NSW

Lithium acetate Sigma-Aldrich, NSW

Magnesium chloride (MgCl2) APS Chemicals Ltd., NSW

Magnesium sulphate BDH Laboratory Supplies, Poole, England

Manganese chloride BDH Laboratory Supplies, Poole, England

Methanol (MeOH) APS Chemicals Ltd., NSW

Media supplements (amino acids) Sigma-Aldrich, NSW

Nitrogen (high purity) BOC gases, NSW

o-Nitrophenyl ß-D-galactopyranoside (ONPG) Sigma-Aldrich, NSW

Peptone Oxoid Ltd., NSW

49

Perchloric acid (70% v/v) Ajax FineChem, NSW

Phenol Sigma-Aldrich, NSW

Phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich, NSW

Phosphatidylcholine (PC) Sigma-Aldrich, NSW

Phosphatidylethanolamine (PE) Sigma-Aldrich, NSW

Phenylisothiocynanate (PITC) Sigma-Aldrich, NSW

Proteinase inhibitor Roche, NSW

Phosphatidylserine (PS) Sigma-Aldrich, NSW

Polyethylene glycol 3350 (PEG) Sigma-Aldrich, NSW

Potassium acetate APS Chemicals Ltd., NSW

Potassium chloride (KCl) APS Chemicals Ltd., NSW

Potassium hydroxide (KOH) APS Chemicals Ltd., NSW

Potassium phosphate APS Chemicals Ltd., NSW

Resazurin Sigma-Aldrich, NSW

Ribonuclease A (RNase A) Sigma-Aldrich, NSW

Scintillation solution –AQUASOL-2 PerkinElmer, USA

Sodium acetate Sigma-Aldrich, NSW

Sodium carbonate Sigma-Aldrich, NSW

Sodium chloride Ajax FineChem, NSW

Sodium di-hydrogen orthophosphate Ajax FineChem, NSW

Sodium dithionite Sigma-Aldrich, NSW

Sodium dodecyl sulphate (SDS) Sigma-Aldrich, NSW

Sodium formate Sigma-Aldrich, NSW

Sodium hydrogen carbonate Ajax FineChem, NSW

Sodium hydrogen phosphate Ajax FineChem, NSW

50

Sodium hydroxide (NaOH) APS Chemicals Ltd., NSW

Sulfuric acid (98%, w/w) APS Chemicals Ltd., NSW

Trichloroacetic acid (TCA) May and Baker Ltd., UK

3H-L-(G)-Serine PerkinElmer, USA

Tris-HCl Merck Pty Ltd., NSW

Tri-sodium citrate Ajax FineChem, NSW

Tryptone Oxoid Ltd., NSW

Tween80 (Tw80) Sigma-Aldrich, NSW

Yeast extract Oxoid Ltd., NSW

Yeast nitrogen base (without amino acids or

ammonium sulphate)Difco, NSW

Zinc acetate Merck Pty Ltd., NSW

Purified water from a MilliQ system (Millipore, NSW) was used in the

production of all buffers, solutions and media.

2.1.2 General procedures

Sterilisation of media, heat-stable solutions, glass-ware and non-disposable plastic-ware

were autoclaved for 15 min at 120°C (125kPa). Sterilisation of heat-labile solutions

was filtered using 0.22 m sterile filters (Millipore, NSW).

RNase were deactivated in solutions by adding DEPC (0.1% v/v) to the MilliQ

water (MQ water) prior to autoclaving for 15 min at 120°C (125kPa). DNases were

inactivated by autoclaving. All biological materials and waste were autoclaved prior to

disposal using approved methods.

51

2.1.3 Saccharomyces cerevisiae and Escherichia coli strains, plasmids

and primers

2.1.3.1S. cerevisiae strains

Table 2.2 summarises the strains used in the studies. Unless otherwise stated, the

majority of the strains used are in the BY4743 background. All strains were subject to

genotype confirmation using PCR or phenotypic characteristics or a combination of

both.

Table 2.2 S. cerevisiae strains used in this study

Strain Genotype SourceBY4741 MATa; his3; leu20; lys20; MET15; ura30 Euroscarf

BY4742 MAT; his31; leu20; LYS2; met150; ura30 Euroscarf

BY4743 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2; MET15/met150; ura30/ura30

Euroscarf

S288c MATa, Sul2, gal2, mal, mel, flol, flo8-1, hap1 (Mortimer

and

Johnston,

1986)

BY4743 arg4 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

arg4::kanMX4/arg4::kanMX4

Euroscarf

BY4743 arg5,6 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

arg5,6::kanMX4/arg5,6::kanMX4

Euroscarf

BY4743 asn1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

asn1::kanMX4/asn1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 asn2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

asn2::kanMX4/asn2::kanMX4

Euroscarf

BY4743 bas1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

bas1::kanMX4/bas1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 bap2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

bap2::kanMX4/bap2::kanMX4

Euroscarf

BY4743 cho1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

cho1::kanMX4/cho1::kanMX4

Euroscarf

52

BY4743 cys3 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

cys3::kanMX4/cys3::kanMX4

Euroscarf

BY4743 cys4 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

cys4::kanMX4/cys4::kanMX4

Euroscarf

BY4743 fun12 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

fun12::kanMX4/fun12::kanMX4

Euroscarf

BY4743 gcd1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

gcd1::kanMX4/gcd1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 gcd6 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

gcd6::kanMX4/gcd6::kanMX4

Euroscarf

BY4743 gcd7 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

gcd7::kanMX4/gcd7::kanMX4

Euroscarf

BY4743 gcn1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

gcn1::kanMX4/gcn1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 gcn2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

gcn2::kanMX4/gcn2::kanMX4

Euroscarf

BY4743 gcn3 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

gcn3::kanMX4/gcn3::kanMX4

Euroscarf

BY4743 gcn4 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

gcn4 ::kanMX4/gcn4::kanMX4

Euroscarf

BY4743 gcn20 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

gcn20 ::kanMX4/gcn20::kanMX4

Euroscarf

BY4743 gln1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

gln1::kanMX4/gln1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 gln3 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

gln3kanMX4/gln3kanMX4

Euroscarf

BY4743 gly1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

gly1::kanMX4/gly1::kanMX4

Euroscarf

53

BY4743 his2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

his2::kanMX4/his2::kanMX4

Euroscarf

BY4743 his3 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

his3::kanMX4/his3::kanMX4

Euroscarf

BY4743 his4 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

his4::kanMX4/his4::kanMX4

Euroscarf

BY4743 his5 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

his5::kanMX4/his5::kanMX4

Euroscarf

BY4743 ilv1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

ilv1::kanMX4/ilv1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 ilv2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

ilv2::kanMX4/ilv2::kanMX4

Euroscarf

BY4743 ilv3 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

ilv3::kanMX4/ilv3::kanMX4

Euroscarf

BY4743 ilv4 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

ilv4::kanMX4/ilv4::kanMX4

Euroscarf

BY4743 ilv6 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

ilv6::kanMX4/ilv6::kanMX4

Euroscarf

BY4743 leu1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

leu1::kanMX4/ leu1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 leu2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

leu2::kanMX4/ leu2::kanMX4

Euroscarf

BY4743 leu4 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

leu4::kanMX4/ leu4::kanMX4

Euroscarf

BY4743 leu9 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

leu9::kanMX4/ leu9::kanMX4

Euroscarf

BY4743 met3 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

met3::kanMX4/met3::kanMX4

Euroscarf

54

BY4743 leu12 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

leu12::kanMX4/ leu12::kanMX4

Euroscarf

BY4743 leu20 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

leu20::kanMX4/ leu20::kanMX4

Euroscarf

BY4743 leu21 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

leu21::kanMX4/ leu21::kanMX4

Euroscarf

BY4743 met2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

met2::kanMX4/met2::kanMX4

Euroscarf

BY4743 met3 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

met3::kanMX4/met3::kanMX4

Euroscarf

BY4743 met6 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

met6::kanMX4/met6::kanMX4

Euroscarf

BY4743 met10 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

met10::kanMX4/met10::kanMX4

Euroscarf

BY4743 met14 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

met14::kanMX4/met14::kanMX4

Euroscarf

BY4743 met16 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

met16::kanMX4/met16::kanMX4

Euroscarf

BY4743 pro1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

pro1::kanMX4/pro1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 pro2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

pro2::kanMX4/pro2::kanMX4

Euroscarf

BY4743 ser1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

ser1::kanMX4/ser1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 ser2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

ser2::kanMX4/ser2::kanMX4

Euroscarf

BY4743 ser3 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

ser3::kanMX4/ser3::kanMX4

Euroscarf

55

BY4743 ser33 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

ser33::kanMX4/ser33::kanMX4

Euroscarf

BY4743 shm1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

shm1::kanMX4/shm1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 shm2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

shm2::kanMX4/shm2::kanMX4

Euroscarf

BY4743 sit4 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

sit4::kanMX4/sit4::kanMX4

Euroscarf

BY4743 sui1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

sui1::kanMX4/sui1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 sui2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

sui2::kanMX4/sui2::kanMX4

Euroscarf

BY4743 thr1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

thr1::kanMX4/thr1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 thr4 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

thr4::kanMX4/thr4::kanMX4

Euroscarf

BY4743 tip1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

tip1::kanMX4/tip1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 tir1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

tir1::kanMX4/tir1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 tir2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

tir2::kanMX4/tir2::kanMX4

Euroscarf

BY4743 tir3 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

tir3::kanMX4/tir3::kanMX4

Euroscarf

BY4743 trp1 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

trp1::kanMX4/trp1::kanMX4

Euroscarf

BY4743 trp2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

trp2::kanMX4/trp2::kanMX4

Euroscarf

56

BY4743 trp3 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

trp3::kanMX4/trp3::kanMX4

Euroscarf

BY4743 trp4 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

trp4::kanMX4/trp4::kanMX4

Euroscarf

BY4743 trp5 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

trp5::kanMX4/trp5::kanMX4

Euroscarf

S288c gcn4 MATa, Sul2, gal2, mal, mel, flol, flo8-1, hap1;

gcn4 ::kanMX4/gcn4::kanMX4

This study

S288c gcn2 MATa, Sul2, gal2, mal, mel, flol, flo8-1, hap1;

gcn2 ::kanMX4/gcn2::kanMX4

This study

S288c gly1 MATa, Sul2, gal2, mal, mel, flol, flo8-1, hap1;

gly1 ::kanMX4/gly1::kanMX4

This study

BY4743;

SHM2::lacZMATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2; MET15/met150; ura30/ura30

SHM2::lacZ

This study

BY4743 gcn4;

SHM2::lacZ

MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2; MET15/met150; ura30/ura30

gcn4 ::kanMX4/gcn4::kanMX4

SHM2::lacZ

This study

BY4743 bas1;

SHM2::lacZ

MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2; MET15/met150; ura30/ura30

bas1::kanMX4/bas1::kanMX4;

SHM2::lacZ

This study

S288c; GCRE::lacZ MATa, Sul2, gal2, mal, mel, flol, flo8-1, hap1;

GCRE::lacZ

This study

S288c gcn4;

GCRE::lacZ

MATa, Sul2, gal2, mal, mel, flol, flo8-1, hap1;

gcn4 ::kanMX4/gcn4::kanMX4

GCRE::lacZ

This study

S288c bas1;

GCRE::lacZ

MATa, Sul2, gal2, mal, mel, flol, flo8-1, hap1;

bas1::kanMX4/bas1::kanMX4;

GCRE::lacZ

This study

BY4743;

GLY1::lacZMATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2; MET15/met150; ura30/ura30

GLY1::lacZ

This study

BY4743 gcn4;

GLY1::lacZ

MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2; MET15/met150; ura30/ura30

gcn4 ::kanMX4/gcn4::kanMX4

GLY1::lacZ

This study

BY4743 bas1;

GLY1::lacZ

MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2; MET15/met150; ura30/ura30

bas1::kanMX4/bas1::kanMX4;

GLY1::lacZ

This study

57

BY4743

shm1gcn4 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

shm1::natMx/gcn4::kanMX4

This study

BY4743

gcn4shm2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

gcn4::natMX/shm2::kanMX4

This study

BY4743

shm1shm2 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

shm1::natMX/shm2::kanMX4

This study

BY4743

ser2gcn4 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

ser2::natMx/gcn4::kanMX4

This study

BY4743

ser3gcn4 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

ser3::natMX/gcn4::kanMX4

This study

BY4743

ser33gcn4 MATa/; his31/his31; leu20/leu20;

lys20/LYS2;MET15/met150;ura30/ura30

ser33::natMX/gcn4::kanMX4

This study

2.1.3.2E. coli strains

Table 2.3 was routinely used for propagation of plasmids.

Table 2.3 Outlined the E. coli strains used in this study

Strain Genotype

JM109

recA1, endA1, gyrA96, thi, hsdR17,

supE44, relA1, Δ(lac-proAB)/F'

[traD36, proAB+, lacIq, lacZΔM15]

2.1.3.3 Primers

The primers listed in Table 2.4 were used for confirmation of EUROSCARF knock-out

strains, construction of deletion mutant in different background or construction of

double mutants.

58

Table 2.4 Primers used in this study

Primer name

Sequence 5' to 3' Notes

BAP2F CAGGGTGAAATGCCACTTCTTTGATGAConfirmation of

strain

BAP2R GAATCCGACGTGATAGACTCAACGCCConfirmation of

strain

BAS1F GGGTCCAGTCACAGAATAAAGCCCCAGG

Confirmation of

strain and making

new background

BAS1R GCAAACACATCCTCTAGGGCATCGCGC

Confirmation of

strain and making

new background

GAC1 GATCGGATGACTCATTTTTTConfirmation of

strain

GAC2 GATCAAAAAATGAGTCATCCConfirmation of

strain

KANB CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT

Confirmation of

strain and making

new background

GCN4A ATGGCTTGCTAAACCGATTATATTT

Confirmation of

strain,

construction of

double mutant

and making new

background

GCN4D TTTAAAGTTTCATTCCAGCATTAGC

Confirmation of

strain,

construction of

double mutant

and making new

background

GCN4NATFACCAATTTGTCTGCTCAAGAAAATAAATTAAATA

CAAATAA AATGCGTACGCTGCAGGTCGAC

Construction of

double mutant

and making new

background

GCN4NATRAAATAAAAGGTAAATGAAATCAGCGTTCGCCAAC

TAATTTCTTTAATCGATGAATTCGAGCTCG

Construction of

double mutant

and making new

background

GCN2F GTTGGAAAGCCTCGTTGTCT

Confirmation of

strain and making

new background

GCN2R CTGATGCCTTATAGCGCCG

Confirmation of

strain and making

new background

GLY1F CTCCATGTGTCCTTCTCGTCTATCTT

Confirmation of

strain and making

new background

GLY1R CAGCGCACCTAGCGACTAACTAC

Confirmation of

strain and making

new background

59

NATMX CCTCGATGTCCTCGACGGTCAG

Confirmation of

strain and making

new background

SHM1F AGCCGACATTTCCACATCGAGTCConfirmation of

strain

SHM1R CGATAGGTGCGGCGTTCATCACConfirmation of

strain

SHM2F CGCTGTACAGAGGATCCGTTTCACAGT

Confirmation of

strain,

construction of

double mutant

and making new

background

SHM2R TTGGACGTTAACACCCCATTTGTCTGGA

Confirmation of

strain,

construction of

double mutant

and making new

background

SIT4F ACGTAATGGAGCATTGAAGAGCTACAGACConfirmation of

strain.

SIT4R CCACGATCCACGTAATCACCGAGConfirmation of

strain.

SUI1F GTATTATCACCAATAACGGGTCGGGTAACAConfirmation of

strain.

SUI1R TTGGTCATCCCTGCAACTGAATAATCTCCConfirmation of

strain.

SUI2F TCTGCTGCCTCACGCACCTTCTATAATAConfirmation of

strain.

SUI2R ACACGAAGAACAACGGCGACATCATConfirmation of

strain.

60

2.1.3.4 Plasmids

Table 2.5 Plasmids used in this study

Plasmid Name Notes Constructed by

pCG1 Construction of SHM2::lacZ Cristy Gelling

pME1112 Construction of GCRE6::lacZProfessor Braus G.H.

lab, Germany

pME1108 Construction of UAS::lacZProfessor Braus G.H.

lab, Germany

p4339Construction of (pCRII-

TOPO::natMX4) for double mutantsCristy Gelling

pLL1 Construction of GLY1::lacZ reporter Cristy Gelling

pFA6a-

natNT2Construction of double mutant Anita Ayer

2.1.4 Media, growth conditions and DNA transformations

2.1.4.1 Yeast media and growth conditions

Yeast was routinely propagated on YEPD medium containing 2% (w/v) glucose, 2%

(w/v) bactopeptone, 1% (w/v) yeast extract. S. cerevisiae was grown in SD medium

contained 2% (w/v) glucose, 0.5% (w/v) ammonium sulphate, 0.17% (w/v) Yeast

Nitrogen Base, or in SDC medium which is SD medium contains all the amino acids

outlined in Table 2.6, or in or in SCC, which was SDC with the addition of L-alanine,

L-asparagine, L-cysteine, L-glutamine, L-glutamate, glycine, L-proline, and L-serine

(76 mg/l). Supplements were added to SD media for selection of strains according to

their auxotrophic requirements or transformants containing plasmids in the

concentrations.

61

Table 2.6 Supplements added to SD medium

Supplement Final concentration (mg/l)

Ade 10

L-Arg 50

L-Asp 80

L-His 20

L-Ile 50

L-Leu 100

L-Lys 500

L-Met 20

L-Phe 50

L-Thr 100

L-Trp 50

L-Tyr 50

Ura 20

L-Val 140

Solid media was prepared with 2% (w/v) agar technical type 1. For selection of

strains containing the KanMX4 marker, Geneticin (G418) (200 g/ml) was added to

YEPD solid medium. ClonNAT (100 g/ml) was used to select for NatMX marker.

Yeast cells were incubated at 30C with shaking to allow adequate aeration

when in liquid media. For short term storage, cells were propagated on either on a

YEPD plate or SD plate with amino acids supplemented prior their storage at 4C.

Long term storage at -80C was undertaken in 15% (v/v) glycerol.

2.1.4.1.1 Anaerobic growth in media

Anaerobic growth was performed using modified methods of (Panozzo et. al., 2002;

Skoneczny and Rytka, 2000). S. cerevisiae was grown in SD medium, or in SDC

62

medium, or in SCC medium depend on the experiment. These media were produced

(pH 4.5) with 0.1 M NaOH and supplemented with the redox-indicator dye resazurin (2

mg/l). The medium was then aliquoted into 100 ml penicillin bottles and purged with

high purity nitrogen gas for 20 minutes. Bottles were plugged with butyl-rubber

stoppers and sealed with aluminium cap seals (Wheaton Science, Millville, NJ) prior to

autoclaving. Prior to inoculation, 500 l of a fresh stock solution of ergosterol (4

mg/ml) and Tween 80, 40% (v/v) in ethanol was added to each 100 ml bottle of SDC

medium via a syringe through the rubber stopper. The reducing agent, sodium

dithionite was added to a final concentration of 100 mg/l to remove any traces of

oxygen. Cultures were incubated at 30C with shaking at 250 rpm. Growth of the

culture was measured by spectrophotometry at an absorbance of 600 nm. Anaerobic

bottle were pre-inoculated at OD600 of 0.2.

2.1.4.1.2 Anaerobic growth on plates

Agar technical type 1, 2% (w/v) was used for the preparation of solid YEPD or SD with

amino acids supplemented media. Prior to inoculation, 100 l of a fresh stock solution

of ergosterol (4 mg/ml) and Tween 80, 40% (v/v) in ethanol was added to each plate.

These plates were then placed in anaerobic jar (2 litres Anaerobic jar, OXOID, N.S.W.)

along with anaerobic sachet and anaerobic indicator, for the removal of any trace of

oxygen in the anaerobic jar.

63

2.1.4.2E. coli media and growth conditions

E. coli strains were grown at 37C with shaking at 250 rpm in Luria-Bertani (LB)

medium which contains 1% (w/v) tryptone, 0.5% (w/v) yeast extract, 1% (w/v) NaCl,

and supplemented with ampicillin (50 g/ml) when selecting for growth of cultures

containing plasmids. Strains were also grown on LB plates (2% (w/v) agarose) and

ampicillin (50 g/ml) was added where necessary. These plates were stored at 4C, for

up to four weeks. Long-term storage was stored in LB medium:glycerol (1:1) at -80C.

2.1.4.3 Transformations

Yeast was transformed using the lithium acetate method described by (Gietz et. al.,

1992). YEPD medium was used to culture competent cells for transformation and

sheared, denatured herring-sperm DNA was used as carrier DNA. Transformed yeast

were grown on SD drop-out selective plates or on antibiotic plates and grown for up to

3 days.

E. coli competent cells were prepared by the calcium chloride method described

by (Sambrook et. al., 1989). Cells were stored at -80C and thawed on ice when

required. For transformation, cells (50-100 l) were mixed with DNA, incubated on ice

for 30 min, heat shocked at 42C for 90 s, recovered in 1 ml LB for 1 h and then plated

onto selective plates.

64

2.1.4.3.1 Construction of the SHM2::lacZ reporter

The pCG1 reporter was constructed by PCR amplification of SHM2 using the primers

(5’-CGCTGTACAGAGGATCCGTTTCACAGT-3’ and 5’-TTGGACGTTAACACCC

ATTTGTCTGGA-3’), which resulted in the introduction of a BamHI restriction site at

position -1527 of SHM2. The PCR product was digested with BamHI and HindIII and

ligated into plasmid YEP356 (Myers et. al., 1986) generating an in-frame fusion of

SHM2 (-1527 to +1289) to the E. coli lacZ gene. This construct was transformed into

appropriate strains under uracil selection and the identity of all resultant clones were

confirmed by PCR.

2.1.4.3.2 Construction of the GCRE::lacZ reporter

Plasmids pME1112 and pME1108 (Albrecht et. al., 1998) were kindly provided by

Professor Braus G.H. from Georg-August-Universität, Göttingen, Germany. The

pME1112 and pME1108 were constructed by using the yeast integration vector pLI4

(Sengstag and Hinnenbach, 1988) containing the CYC1::lacZ reporter gene (Guarente et.

al., 1982). pME1112 (GCRE6::lacZ) was used to integrate a Gcn4p regulated lacZ

gene carrying six general control responsive elements (GCRE) in the CYC1 promoter

region into the genome. And pME1108 ( UAS::lacZ) was constructed without the

GCRE which was used as a control. Replacement of the upstream activation site (UAS)

of the CYC1::lacZ with GCREs was achieved by first cutting out the XhoI fragment

containing the UAS. Re-ligation of the XhoI site resulted in pME1108. Then, two

synthetic oligonucleotides (GAC1, 5'-GATCGGATGACTCATTTTTT-3' and GAC2,

5'-GATCAAAAAATGAGTCATCC-3') were annealed to form an optimal double-

65

stranded GCRE (Hope and Struhl, 1985). For the production of multimeric GCRE

DNA probes T4 was prepared with the addition of DNA ligase. The products were then

blunt ended with Klenow and inserted into the blunt ended XhoI site of pME1108. The

resulting plasmid pME112 contains six GCRE sites as determined by nucleotide

sequence analysis (Tabor and Richardson, 1987).

2.1.4.3.3 Construction of the GLY1::lacZ reporter

The GLY1::lacZ reporter pLL1 was constructed by ligation of an XbaI-PstI fragment

spanning positions -1109 to +77 relative to the GLY1 start codon into the integrative

vector YIP358 (Myers et. al., 1986). This was converted into a centromeric construct

by exchanging the 2.5 kb BsaI digestion product for the CEN6/ARS4-bearing BsaI

fragment from the plasmid pYLZ-6 (Hermann et. al., 1992).

2.1.4.4 Double mutant generation

The double mutants shm1gcn4, shm2gcn4 and shm1shm2 were constructed via

mating of MATa haploids with MAT haploids of the deletion mutants as described by

(Tong et. al., 2001). The geneticin-resistance marker (KanMX) within the shm1 MATa

and the gcn4 MATa haploids was replaced with the nourseothricin-resistance marker

(NatMX) by transforming each respective haploid with the p4339 plasmid (pCRII-

TOPO::natMX4) and selecting on clonNAT. The MATa deletion mutants harbouring

the NatMX-resistance gene were then crossed with MAT deletion mutants containing

the geneticin-resistance marker (KanMX). Resultant heterozygous diploids were

selected on media containing both antibiotics. Diploid strains were then sporulated to

66

form haploid meiotic spore progeny. The genotype of each derived strain was

confirmed using PCR. The confirmed MATa and MAT haploid double mutants were

then crossed to generate homozygous diploid double mutants.

The double mutants ser2gcn4, ser3gcn4 and ser33gcn4 were

constructed as described by Janke et. al., (Janke et. al., 2004). The specific pairs of

primers 5’-ACCAATTTGTCTGCTCAAGAAAATAAATTAAATACAAATAAAATG

CGTACGCTGCAGGTCGAC-3’ and 5’-AAATAAAAGGTAAATGAAATCAGCGT

TCGCCAACTAATTTCTTTAATCGATGAATTCGAGCTCG-3’ are used to amplify

the GCN4 deletion cassette (KanMX). These PCR amplified fragments were then

transformed with the pFA6a-natNT2 plasmid which consists of NatNT2 marker. Each

successful transformant should contain both KanMX and NatNT2 cassettes.

2.1.5 General methods and reagents

Composition of buffers, as well as methods for agarose-gel electrophoresis and DNA

quantification were performed as described (Sambrook et. al., 1989). DNA marker

standards were from MBI fermentas (QLD). Recovery of DNA fragments from agarose

gels was performed using the Qiagen Gel extraction Kit (NSW), according to the

manufacturer's instructions. Otherwise, double precipitation of nucleic acid with 70%

(v/v) ethanol was used. Enzymatic manipulation and cloning of DNA were performed

as described by (Sambrook et. al., 1989).

67

2.1.5.1 DNA isolation

Small scale purification from E. coli grown in liquid culture was performed using the

Qiagen (NSW) mini-plasmid purification kit according to the manufacturer's

instructions.

Yeast genomic DNA extraction was as described by Breeden Lab, Fred

Hutchinson Cancer Research Centre. USA. Genomic DNA was extracted from 5 ml of

overnight culture of yeast in YEPD medium. Cells were initially washed with sterile

water, followed by resuspension of cells with lysis buffer which contained 100 mM Tris

pH 8.0, 50 mM EDTA and 1% SDS. Acid-washed glass beads (0.25-0.50 mm) were

added prior to the 3 min of beating with the glass beater (Mini-glass beater, Biospec.).

Liquid phase was collected and transferred to a new tube with 7 M Ammonium acetate

pH 7.0. Samples were then heated at 65ºC for 5 min, followed by another 5 min on ice.

Chloroform was added prior a 2 min vortex and DNA was separated by centrifugation.

Supernatant was collected and followed by double precipitation with ethanol. Genomic

DNA was resuspended with sterile water and stored at -20C.

2.1.5.2 Ethanol precipitation and phenol:chloroform extraction

Ethanol precipitation was employed to desalt and/or to concentrate DNA samples

(Sambrook et. al., 1989). When necessary, phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1)

extractions was performed to remove proteins from DNA samples.

68

2.1.5.3 Polymerase chain reaction

Polymerase chain reaction (PCR) was used for DNA amplification. The standard

reaction (50 l volume) contained template DNA (1g – 100ng), dNTPs (10 M of

each of dATP, dTTP, dGTP and dCTP), forward and reverse primers (1 M), MgCl2

(2.5 mM), 1 buffer and 1 U AmpliTaq™ DNA polymerase (Applied Biosystems,

NSW). Typical cycling conditions were 95C, 3 min; 30 cycles of denaturation step at

95C for 30 s, annealing step for 30 s (45-58C), extension step at 72C for 1 min per 1

kb final product; followed by 5 min extension at 72C. A DNA Engine Tetrad Peltier

Thermal Cycler (MJ Research, Minnesota) was used. Annealing temperatures for each

primer pairs were varied for optimisation of each reaction. The desired size of the PCR

product was confirmed via agarose gel electrophoresis.

2.2 Cell Physiology methods

2.2.1 Determination of viability as colony formation

100 l culture samples were serially diluted (10 fold) in YEPD and suitable dilutions

plated on YEPD plates. Plates containing colony numbers between 30 - 300 were

counted after 2 – 3 days of growth. Survival was determined as colony-forming units

present to the initial culture.

69

2.2.2 Determination of viability measured with propidium iodide

exclusion

Cells were harvested and washed twice with phosphate buffered saline PBS (sodium

chloride (18 g/l), potassium chloride (0.2 g/l), di-sodium hydrogen phosphate (1.44 g/l)

and potassium dihydrogen phosphate (0.24 g/l) and pH 8 with HCl. 200 l of

propidium iodide (50 g/ml) was added in the dark and was covered with foil, prior the

examination of cells using a fluorescence microscope (Olympus BX60) (Krishan, 1975).

2.2.3 Spot tests

Cultures of yeast strains were grown to exponential phase in YEPD medium and then

diluted to an optical density (OD600) of 2.0 and 0.2. Dilutions were then spotted (2 l)

onto YEPD agarose plates. Spots were allowed to dry and plates were incubated at

30°C for 2-3 days. The presence or absence of spots on the agar plates was recorded.

2.3 Protein methods

2.3.1 Protein extraction for -galactosidase assays

Cultures were grown anaerobically and aerobically to exponential phase (OD600 of 1.0).

Anaerobic samples (20 ml) were taken via a syringe from the anaerobic cultures and

centrifuged (3,350 g, 4C, 2 min) whilst the remaining culture was aerated for the

indicated period of time. Each time-point sample (20 ml volume) was then harvested

identically and treated as described by (Rose and Botstein, 1983) with some

70

modification. All sampling was performed in triplicate. Harvested cells were washed

in 1 ml of cold breakage buffer which contained 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20% (v/v)

glycerol, 1 mM -mercaptoethanol and transferred to a 1.5 ml screw-cap tube prior

resuspending in 250 l cold breakage buffer. The suspension had 12.5 l of 40mM

PMSF added along with acid-washed glass beads (0.25-0.50 mm) prior to cell breakage

in a mini-bead beater (Biospec. NSW) at 4C for 40 seconds. An additional 200 l of

breakage buffer was added to each sample and was vortexed to mix. Cell debris and

glass beads were removed by centrifugation (14,000 g, 4 C, 15 min). Cell extracts

were stored at -20C.

2.3.2 Protein concentration estimation

Concentration of proteins was determined using the method described in Bradford

(Bradford, 1976). Cell extracts were diluted 1:10 with breakage buffer and then 10 l

of the cell suspension was added to a 1.5 ml tube containing 790 l H2O and 200 l

Bradford reagent. Protein concentration was then estimated by measuring the

absorbance at 595 nm and comparing to a standard curve prepared with known

concentrations of bovine serum albumin (BSA).

2.3.3 Assay for -galactosidase activity

Enzyme activity was assayed essentially as outlined by (Rose and Botstein, 1983).

Tubes containing 100 l crude cell extract and 900 l Z buffer (60 mM Na2HPO4.7H2O,

40 mM NaH2PO4.H2O, 10 mM KCl, 2 mM MgSO4, 34 mM -mercaptoethanol, pH 7.0)

71

were equilibrated to a temperature of 28C. The reaction was initiated by addition of

200 l ONPG (4 mg/ml in Z buffer). Reactions were allowed to proceed until a pale

yellow colour developed and incubation time was recorded once the addition of 500 l

1M Na2CO3 was used as a stop reagent. The optical density at 420 nm was measured

for calculation of specific activity using the following formula:

OD420 Total reaction volume (ml)

0.0045 time (min) extract volume (ml) protein concentration (mg/ml)

where OD420 is the optical density of the product, o-nitrophenol (o-NP) at 420 nm;

0.0045 is the optical density of a 1 nmol/cm solution of o-NP. The specific activity is

expressed as nmol hydrolysed ONPG per mg protein per min.

2.4 Amino acid analysis

An overnight culture was inoculated into a 250 ml anaerobic bottle with 100 ml of

medium to an OD600 of 0.2. Cultures were harvested immediately (time 0), at 15, 30, 60,

120, 240 and 360 min after inoculation and the cells density measured. Upon

harvesting, 50 ml of culture was filtered through a glass fibre pre-filter (Sartorius) and

immediately washed with 50 ml of chilled (4°C) SD medium without amino acids. The

pre-filter was immersed in 30 ml cold 5% (v/v) perchloric acid for 5 min to lyse the

cells and the lysate was adjusted to pH 7.0 with cold 5 M potassium hydroxide. The

volume of the lysate was recorded and 10 ml of the supernatant and 1 ml of the medium

filtrate stored for subsequent HPLC analysis.

72

2.4.1 Amino acid analysis by HPLC

Amino acid composition of each sample was analysed using a modified Pico-TAG

amino acid analysis method (Waters, Milford, MA). An aliquot of cell lysate (2 ml) or

diluted growth medium (900 l) was added to a glass vial, frozen at -80C for 2 h and

freeze-dried overnight at -50C. The samples were resuspended in 200 l of 0.2 M

methionine sulfone (internal standard) and 50 l was transferred to a glass sampling

tube. The sample was dried under vacuum, resuspended in 10 l of drying solution

(2:2:1 methanol: 1 M sodium acetate: triethylamine) and dried again. The dry sample

was resuspended in 10 l of derivatisation reagent (7:1:1:1 methanol: triethylamine:

water: phenylisothiocynanate (PITC)), mixed by vortex and kept at room temperature

for 20 min in the dark. The samples were dried under vacuum and resuspended in 100

l of Pico-TAG sample diluent (Waters, Milford, MA) and transferred to a sealed vial

for HPLC analysis. Chromatographic separation of derivatised amino acids was

achieved using Pico-TAG eluent 1 and Pico-TAG eluent 2 as described in the Pico-

TAG amino acid analysis operator’s manual (Waters, Milford, MA). Amino acids were

quantified by measuring peak area in comparison to standard curves obtained using pure

standards.

2.5 Isolation of Cell Walls

Cell wall isolation was performed using the procedures described in De Groot et. al. (de

Groot et. al., 2004), and Yin et. al.(Yin et. al., 2005). Cells from anaerobic cultures

were harvested by centrifugation at various time points, and were washed with cold

water, then washed with 10 mM Tris-HCl, pH 7.5. Acid-washed glass beads (0.25-0.50

73

mm) were added along with protease inhibitor (Complete EDTA-free) for cell wall

extraction using mini-glass beater (Biospec., N.S.W.). Isolated cell walls were then

washed extensively with 1M NaCl, and extracted twice with 2% (w/v) SDS, 100 mM

Na-EDTA, 40 mM -mercaptoethanol, and 50 mM tris-HCl, pH 7.8, for 5 min at 100°C.

SDS-extracted cell walls were then washed three times with water. Samples were

aliquoted, freeze-dried, and stored at -20°C until needed.

2.5.1 Preparation for cell wall protein analysis by mass spectrometry

Freeze-dried cell walls (2 mg) were measured by weight and resuspended in 500 l of

100 mM NH4HCO3 containing 10 mM dithiothreitol, and incubated for 1 h at 56°C.

After centrifugation, the pellet was S-alkylated in 500 l of 100 mM NH4HCO3

containing 55 mM iodoacetamide for 45 min at room temperature in the dark. Cell

walls were then washed three times with 100 l of 50 mM NH4HCO3 and dried under

vacuum.

Cell walls were digested proteolytically with a modification of the method of

Yin et al. (Yin et. al., 2005) using their assumption that cell walls accounted for

approximately 2% (w/w) of the cell wall dry weight. Cell walls were resuspended in 50

mM NH4HCO3 and digested with trypsin (using a CWP/enzyme ratio of 50:1, Promega,

Madison, WI, USA) overnight at 37°C. In this study, proteolytic digestion with trypsin

did not reveal significant differences between aerobic and anaerobic cell walls. Hence,

the samples were digested further with AspN (~100:1, Roche, NSW) overnight at 37°C.

74

2.5.2 Mass spectrometric analysis of cell walls

Digested samples were centrifuged and the solubilized peptides were separated by

nano-LC using an Ultimate 3000 HPLC and autosampler system (Dionex, Amsterdam,

Netherlands). Samples (2.5 µl) were concentrated and desalted onto a micro C18

precolumn (500 µm x 2 mm, Michrom Bioresources, Auburn, CA) with H2O:CH3CN

(98:2, 0.05 % HFBA) at 20 µl/min. After a 4 min wash the pre-column was switched

(Valco 10 port valve, Dionex) into line with a fritless nano column (75µ x ~10cm)

containing C18 media (5µ, 200 Å Magic, Michrom) manufactured according to Gatlin

(Gatlin et. al., 1998). Peptides were eluted using a linear gradient of H2O:CH3CN (98:2,

0.1 % formic acid) to H2O:CH3CN (55:45, 0.1 % formic acid) at 350 nl/min over 30

minutes. High voltage (1800 V) was applied to low volume tee (Upchurch Scientific)

and the column tip positioned ~ 0.5 cm from the heated capillary (T=200°C) of a LTQ

FT Ultra (Thermo Electron, Bremen, Germany) mass spectrometer. Positive ions were

generated by electrospray and the LTQ FT Ultra operated in data dependent acquisition

mode (DDA). A survey scan m/z 350-1750 was acquired in the FT ICR cell (resolution

= 100,000 at m/z 400, with an accumulation target value of 1,000,000 ions). Up to the 7

most abundant ions (>2500 counts) with charge states of +2 or +3 were sequentially

isolated and fragmented within the linear ion trap using collisionally induced

dissociation with an activation q = 0.25 and activation time of 30 ms at a target value of

30,000 ions. M/z ratios selected for MS/MS were dynamically excluded for 30 seconds.

Peak lists were generated using Mascot Daemon/extract_msn (Matrix Science,

London, England, Thermo) using the default parameters, and submitted to the database

search program Mascot (version 2.2, Matrix Science). Search parameters were:

75

Precursor tolerance 4 ppm and product ion tolerances ± 0.6 Da; Met(O) and Cys-

carboxyamidomethylation specified as variable modification, enzyme specificity was

trypsin, 1 missed cleavage was possible and the NCBInr database (Jan 2008) searched.

Scaffold (version Scaffold-2_00_01, Proteome Software Inc., Portland, OR) was used to

validate MS/MS based peptide, protein identifications and estimate relative protein

abundances.

2.6 Radioactive labelling with 3H L-serine

2.6.1 Preliminary experiment

Anaerobic cells were harvested at various time points with a funnel and pump though a

25 mm glass microfibre made filter paper (Whatman), 5 µCi of 3H L-serine was used in

each of the 100 ml anaerobic cultures. One ml of the cultures was collected as the total

radioactive counts, prior the separation of the cultures from the media though the filter

paper. Another ml of the radioactive media counts was collected and the protein

radioactive counts were collected from the resuspension of the cells collected on the

filter paper with 10% cold TCA solution. All radioactive counts samples were mixed

with the scintillation solution prior reading from scintillation counter (Liquid

Scintillation analyser Tri-Cab 2100TR (Parkard, Canberra).

2.6.2 Isolation of cell fractions

Cells from aerobic and anaerobic cultures were inoculated with 1 μCi of 3H-L-serine in

100ml SDC medium at time 0 and were harvested at 5 h and 24 h by centrifugation

(3,000 x g, 5 min), followed by 10 mM tris-HCl pH 7.5 washes. Wet weights of the

76

samples were recorded prior to resuspension with 10 mM tris-HCl pH 7.5. Cell

suspensions were divided into three portions: one for isolation of cell wall, one for the

isolation of whole cell lipids and one for cell fractionation by differential centrifugation.

2.7 Isolation of cell fractions

2.7.1 Isolation of whole cell lipids

Whole cell lipids isolation was performed using the procedures described by Schneiter

and Daum (Xiao, 2006), and Folch et. al. (Folch et. al., 1957). Anaerobic cells with

densities approximately 5 x 106 cell/ml were harvested by centrifugation at various time

point. These samples were then washed with deionized water, followed by 100% (v/v)

methanol. Acid-washed glass-beads (0.25-0.50 mm) were added to the cell suspension

and vortex in the maximum speed for four periods of 30 s with 30 s cooling intervals.

Chloroform was added to the suspension to give a ratio of chloroform:methanol (2:1

(v/v)) prior to stirring on a flat-bed stirrer for 1 h at room temperature. The suspension

was transferred to a new tube and the glass-beads were then washed extensively with

chloroform:methanol (2:1 (v/v)). A 0.2 volume of 0.034% MgCl2 was added to the

extract prior to another stirring for 10 minutes. The organic phase of the extract was

washed with 2 N KCl/methanol (4:1 (v/v)), and extensively with chloroform:

methanol:water (3:48:47 (v/v/v)) until the phase boundary became clear. Samples were

aliquoted, dried under vacuum, and dissolved in 100 μl (approximately 0.1-1.0 mg

lipids/ml) with chloroform:methanol (2:1 (v/v)) and stored in a glass vial at -20°C.

Every mg of cells (wet weight) contains approximately 0.25 – 2.5 mg of lipids

according to Schneiter and Daum (Xiao, 2006b; Xiao, 2006a). Hence, all the

77

calculation performed in this thesis assumes that 0.25% of the wet weight of cells is

total lipids.

2.7.2 Isolation of phospholipids by one - dimensional thin layer

chromatography (1D- TLC)

A TLC chamber was filled with 150 ml of 25% chloroform:methanol:ammonia (50:25:6)

solution for 2 h with a cover for saturation. A silica gel TLC plate with a spore size of

60Å (Merck, NSW) was used as an absorbent and was pre-heated at 80°C for 10 min

prior to use for removal of any moisture from the plate. A fine spotting line was drawn

with a pencil about 2 cm from the bottom of the pre-heated TLC plate. Diluted

standards, phosphatidylserine (PS), phosphatidylethanolamine (PE) and

phosphatidylcholine (PC) (5 μg each) and extracted lipid samples (80 μg) were spotted

with a microsyringe (Hamilton) along the spotting line. All the spotted standards and

samples were then dried for approximate 5-10 minutes. The TLC plate was gently

submerged into the chamber with pre-saturated solvent inside. The system was stopped

by the removal of the TLC plate after 1.5 - 2 h when the solvent line reached about 2-3

cm from the top of the plate. The plate was then dried in the flume hood for 30 min,

prior to visualisation by sulphuric acid charring with spraying 50 % sulphuric acid (v/v)

to the plate and incubated at 150°C for 15 minutes. These plates were scanned with a

photo scanner (Cannon, Australia) for data analysis.

78

2.7.3 Cell fractionation by differential centrifugation

Cell fractionation was performed using the procedures as described in isolation of cell

wall. Radioactive cell suspensions were broken up with acid-washed glass-beads

together with protein inhibitors via a mini-glass beater. These suspensions were then

centrifuged at 1,000 x g, 20 min, 4ºC. The top of the supernatant was collected as

expected the cell membrane fraction, and the rest of the supernatant was collected and

centrifuged at 15,000 x g, 30 min, 4ºC. Collected pellet was resuspended with sterile

water as P15,000 fraction and the supernatant was further centrifuged at 100,000 x g, 60

min, 4ºC with using an ultracentrifuge (TL-100, Beckman, USA). Both supernatant

(S100,000) and pellet (P100,000) were collected and resuspended with sterile water. All of

these samples were stored at -20ºC for further manipulations.

2.7.4 Isolation of radioactive labelled phospholipids

Whole cell lipids were extracted as described previously, and approximate 80 μg of

extracted total lipids were spotted on a TLC plate and was run in the same solvent

system as described previously in Chapter 2.7.2 for 2 h. The TLC plate was dried in a

fume hood for 30min, prior to place it in a chamber with iodine crystal. This chamber

system was heated up to 50ºC. The TLC plate was removed once the lipids were

spotted. Images were saved by scanning into computer for record purposes and the

spotted phospholipids were cut out and put into a vial with scintillation solution for

radioactivity counting.

� ���

������������������� �������������������

�������������������������

�����������������������

����������������������� �� ���� �� ������������� ������������ ���������

������������������ ������������� � ��������� �������������� ���������������� ���

�������� ��������� ������������� ����������������������������������������

�������� ������ ������������������������������� ��������������� �����������

����� ���� ��� ������� ��� ��� �������� �� ������ ��������� ��� � �� ��������� ���

��������������������������������������������������� ��������������������

��� ������ ��� �� ����� � ��������� �������������� �����������!�� � "���� �� ������ �

������������������� ����#������������������ ������������������� � �����������

�� ��� ���!����������"� ����� ������#"��$� $���!� �� �% ��� ���

������&��!�!����"��!��

$�����%����� �������������� ��������� �������������������������������������

��� ������� ����� ��� ����� ��� ���� ��������� ��� ��� ���� ����� ������ � �� �������� �

������������� �����������$������������&''�(�)�����������&''&(����*�������������

+���!�� � ���� ������ ��� ������%����� ��������� ������� ��� ������� ���� ��� ���

�������������������������� ��������������������������&,����������������������

���������������-��������������&'',!������������������������������������������

��������� ���� ��������� ��������� ,�+�� �.� ������ ��� ��������� ��������� �������

�������� ������ ��� ����� �������� ����� ���� ����� ��� �����%������������� ����

������������������������������������������ ���������-���������������������

� /'�

�������������������������������� �������������������������������������������

����������� �������� ���������������������������"����������������������������

��� ������ ��� ���� ��������� ����� ����� ������ �� ��� ������� ��������� �� ���

���������������� ���������������� ��� ������������������������������������

� ��� ��� ������� ���� ������ �� ������������ ���� ��� ����� ���� �������� ����

��������� ������� � "��� ��� ������ �� �#�� ��� �� ���� ������� �� �� ������� ��

����������� ������������� ������#�������������� ����������� ��0�������������

���� ���������� ������������������������� �������������������������������#�����

������ � ��� ����� ����������� � ����� ��� ��� ���� ��� ��� ���� ���� �������� ��� ���

���� ��������������1����������������������� �������������� ������������(���

�������2���������������������� ������������������� ��������������������� ��

���������������������������������� �������������.������������3����+�4,(�

5�� ��������+��/(�6�������� ��������&'',!�� � ������������ �������� ������������ ���

������ �� ����������� �� ������ ��� ���� �� ����� �� ������������ �� �� �� ������ ����

��������������������� �7������������������������� ������ ��������������������

�������������

� /+�

��&%���� �������!��#��'���()��$�%�����$���!�����'��#��!��'�����#������������%�

#�������������

$�������� ����������������%�����������+������������������������� ����������

���&,����������� ����� �������������� �$������������������������������������

����������� �����-��������������&'',!����

����$��"� ��������$���!�����'��!'�#��

8��������������� ���������������������������� ����!������"#�

*����������������������� �"���� ��� $�� �%�� ���� ���� �$�� �&��'����� ������ ��"���( ����

()����!�"���!�"�&��"(*����+"��

.������ ������������ ,"�-��� �)���� �)�#�� �"���� )�.�� )��%�� )����� �+!���

!'(���!'(-��!'(--���,�������&��)("�%�/�

� .������� � �������������������� ������������������������ �� ������

������ ������������� � �� ������ � �������� ���������� ��� ����� ��������� ��� ����

����� ������� ������ ���� ����� ��������� ���� ������ � ��� ��������� �����

����%��������� �9� #������ &'':!�� ������� ,�&� �������� ��� ��� ��� ����%���������

������������������� ��������������������������������������� � ����������.�

�������������������������������������������� �������������������������

���������������� ����������������� ��������������-�������������������������

��������� ��� ���� ����� ������� ������ ���� ����� ��������� ���� ������ � ���

�������������� ���� ��� ����� ����� ���� �����&,����������� ������ ���������� �

������������������,�+!��-��������������&'',!����

� /&�

��&%����*���!���+�)��$�%����������$����������&����������&���!'�#��$���������

����� ������ �� ��� ������ ����� ����%��������� �� ���� ��%����� ���� ���� �������� ��

������������������ ����������� �����9� #������&'':!����

����$��"� ,�+�)��$�%�����$���!�

8��������������� �,�����������0�������"�����"�����"��

*����������������������� ,"�����"�����0,,#��'����� ,�����+1���( �����+"��

.������ ������������ ,�����,��#��,"����,"�$�&��,"�#����2���� ����'(����

'�����'��#�� )���� )��������&������-������#������.��

��������������������"!#�

� ;����������������&'������������������������� ���������������������%

���������������9� #����<������9� #������&'':!���.������ �����������������

��������� ��� #� ���� ������� ������� �� ����� �� ������ ����������� ��� ����

���������� � ����� ����� ���� ���� ��� ���������� ��������� ��� ������ � ���

�������� � ����� ���� ��� �� ������ ����� ���� ���� ���� ������ ������ �������� �

�������������������������� �������������������������������� �.������ ���

��������� � ��� ��� ���� ������������� ��� ������ ��� �� ��������� ���� ��� ����

�������������� ���������#���������������������������� ��������� ���.��������

�����+��:!���8�������������� ����#����������������� ����������������������� �

���� ���(� ������� ��������������� ������� ��������� ����������� �����������

���������������� �������������%��������������������������� ���������������

�������������� � �����������

� /,�

�����!���(�����%����� ������#������������&��!"��'�!�!�

�� *��-(� �!� �� ��!���� ����!���(�����%� ���� ����� �#� ������ �����

&��!"��'�!�!�

=�������� ���������������� ����������������������� ������������� ��������

���������� �������������������������������-������ ���+�/>(�-������ ���+���(�

-������ ��� &''4(� -������ �� ���� "��#�� +�/,(� -������ �� ���� 5����2���� &''&!���

���� �������������� �� �� ����� ��� ������������������������������� ��������� ���

��� ������� � ������� �� ������ � ��� ������������ ��� ����� ������ ��� ������ �

�����������

� ���� ������������#� � ����� ��� ��� ���� �� ���������������� �������� �����

����� ��� ����������� ������� ��������#� ��� ������������������� ������� ��

�������������������.=$��������������;6"���;6"+%>!��� ����������4?��������

������� ��� ������#��65.� �������#� ������� ��������� �� ���� � � �� ��������

��������� ��� �� ��������� �-������ ��� +�/>(�-������ ��� +�//(�-������ �� ����

"��#��+�/,(�@���������������+�/�!�� �������������������� ������������;6"+�����

�� ������%� ������������������������ �����;6"���=������������ �������

�������� �� ��� ��%� ������ ����� �� ������ ��� �;6"� ���� ���� �� �������

����������-������ ���+�//!����

� ���#� �� ��� ��� ����� ���%� ���� ������� ��������� ��� ��� �������� ������

����� � ������ ��������%����%���� �� ���� ������� ���� ��� ����������� �������

�$�� ��%9��������������&'''!�������������� �����������������$ �>���������������������

=����� ������� ��������� ���$ �+�� ������� ��� ��������� ������#� �-��������

���� -������ ��� +�/:!(� ��������� ������ ������������� ���� ��#�� ������ � ���

���������������� ��������������������� ���������� ��� �����������������������

���� ����%� �� ��������� �������� �� ��������� ��� ������ ��� �� �� ��� �������

� />�

������� ���#� ��������� �-�������� ���� -������ ��� +�/:!�� � -�� ���

�������������������������������������#����� ��������������������� ���&����"%

&!� ��� ��� ������� #����� ����� ������� ����������� ������ ��� ��� ����

��� ��������� � ������ ���#� ������ �������� ��� �������� �8���#����� ����

-������ ���&'',(�8�������������+��,(�A�������������+��&(�3������������-������ ���

&'''!����

� ����� ��� ���� �������� �� ����� �������3����%� ����������� ������� ��

��� 5%�������� ������� ��� ����� �$�� ��%9������ ��� ����� &'''(� 3�������� ����

-������ ���&'''!���.�8%������������������������������&'4&%&>&/!����������

�� ��� �� ����� ���� ���� ���� ���� ������������� ��� ����� ���� ��� ������ � ����� ���

�������� �������� �� ��� 8%�������� ������� �������� �� ������� ��� .��&&4�� ���

�� �������������������������� �������������-�� ������������������������������

� ����� ��� �� ������������ � ������� ��� �� ������� 65.�� � ���� �������� ���

������������� ��� ����������� ������#� ��������� ��� ��� ������������ ��� ������

� ����3������������-������ ���&'''(�7�#���������+�/�!���;� �����#����� ����

���� �� ������� ���� � ����� ��� ����� ��� ���� ������� �� ������ � ��� ���������

�-������ ���+�/4!�����������4���#���������������������������������������

�@��������#� ��� ����� &''4!�� ��� ��� ��������� ��� ���#� �� ���� ��� ��� �� ����%

���������������������������%����� ������������ ������� �������������������� ���

��������� �-��������$ �>�� �� �������������������� ������ �������������� �� ���

�������� �� �������� �-������ ��� +�/>(�-������ ��� +���(�-������ �� ���� "��#��

+�/,!�� � ���� ���� ��� ��� ������ �� �� �������� ��� ����� ������� ��� ��� $ �>��

��� ��������� ��������������������� �������������������

� /4�

��������!���(�������#����'�����(��������#�"��!����%%!�+'���!'�#����

#��������&������������&������������!�

B�������������������������������������� ����������� �������������������

����%��������� ����� ���� ���� ������ ����� �������� � �� ������ � ��������

�9� #������ &'':(� *��� ��� ����� &''4!�� � ����� ����� ���� ��2� ��� �� ������ ��� ���

$ �>�� ��� ������� �� ���� ���� ���� ���� ��� ��������� ��� ��������� �� ������ ���

��� �������� ��� ��� ��� ���� �� ������������ � ��� ������ �� ���� ��� ���������� ���

���������������������������������9� #������&'':!��������������������5�6#∆�

����� ��� ������� �� ����� �������� ����� ���� +�� �� ����� �� ���� ����� ������ � ��

�������� � ��������� � ���� ���������� ��� ���������� ����� ��� ������ ����� ���

����������� ��� 5�6#∆���������� �� �� ��� ��������� ������#� ����(�9@)>&/�

��������C8�4'%���#!���������� ��� �C8�4'!��������������#������� ����������

������ ��� ��� ������ ����� ������� ������ ��� ��� ����� �� �������%���� �������

���� �������������� ��������������$ �>��������� ��������� ������������������

���������� ���������������

� /:�

� �� !������ %��.��$� ����� �/'�&����� ��� �/������� %�$� ('�!��

#�%%�+��$��'��!'�#�����������&��!�!�

8�������������� ��� ������� ��������#� ��������� ��� �������� ���������� �������

���������� ��� ��� ���������� ������� �� ��� ��� 9� #����� �9� #������ &'':!���

.������� �������������5�6#∆ �������������%�������� �������3A8�����������

�������������������������>/�������� ������������������������������ � �������������

��� ���� ������������� ���5�6#∆� ��������������� �������������&>��� ����������

��� ���������������������� ������������������ �����������������������%����

����� ����� ��������� ����� �� ����� ����� ���� �"������ ,�+!�� � 1���������� ������ ��� ���

5�6#∆�������������������&>���������������� ������� �����������������>'������

�������� ���������7��������������� ��������������������������5�6#∆���������

������������������������%������������������ � ���������������,�,!���

� /��

���

��

� � �� �� �� �� ��

�� ���

�����

�$���� �� ������&��� $��+�'� .������!� �#� +�%�)�"(�� ��-0-� ���� ����∆� �������

� �����-1�'�(�������

$����� #���� � ���������� ������� �� �������� � �������� ��� �������%���� �����9C>�>,�

��!������5�6#∆��������!����3A8���������������������� ���������� �������:''������

���� ���������� ��� ���������� ����� ������� ��� ����� ��� ���� ����� ���� ������ �� ���

�������������������������������

� //�

��&%���������&���$��+�'��'��������!���!��#�����)��%������������ !�����!� 2���

��-0-�&��.$�����3��.������� �������#���� ������ ������������������������

������������>/����������������������������������������������� �������� �������

�������������������������������������������������3�A�!����

*����

��%������

��$�('�!��

2'3�

,��&%��$������

2'�4��,3�

�,566�����'���

�#����-1�'�

2'4�,3�

7��&�%��"����

'���8"$��!�

��(%����

3� 4� >�,�D�'�&,� ,�+/�D�'�'/� �

5�6#∆� &,� ��+��±�'�+:� &�>4�±�'�+'� �

786��∆� >�4�� 4�&:�±�'�&:� &�>4�±�'�&&� �

5�9�∆� >� >�+>�±�'�'�� ,�'�±�'�,&� �

5�9�∆� %� %� %� ���������

5�9&∆� >� >�&��±�'�+�� ,�,�±�'�&/���� �

5�9.∆� >� >�'4�±�'�':� &���±�'�,:� �

5�9��∆� %� %� %� ���������

5�6�∆� &>� 4��,�±�'�+:� +�&/�±�'�'�� �

56��∆� &&� :�>,�±�'�&�� &��:�±�'�&:� �

5�6�∆� &>� :�+&�±�'�'�� +�&�±�'�+>� �

5�6�%∆� &>� 4�:��±�'�4:� '��&�±�'�++� �

5��.∆� %� %� %� ���������

6 :�∆� %� %� %� ���������

:���∆� %� %� %� ���������

8 �∆� >� 4��:�±�'�,/� &�:/�±�'�,+� �

8 �∆� >� 4�:&�±�'�,&� &�/��±�'�+/� �

8 �∆� %� %� %� ���������

�#∆� 4� 4�,��±�'�&�� &�4:�±�'�&:� �

��:#�∆� %� %� %� ���������

� 7$∆� %� %� %� ���������

� 7��∆� %� %� %� ���������

� 7��∆� %� %� %� ���������

����∆� :� >�/,�±�'�+:� ,�+4�±�'�'�� �

����∆� %� %� %� ���������

� ��∆� >� >�&4�±�'�&+� �,����±�'�&4� �

� /��

-����������������!!�����%�#���������&���$��+�'�

��� ������ ��� ��� ������ ����� ����� ������ �� � �������� � ��������� �� ���

������� �� ������� �� �������� ������ ���� �������� � ������� ������,�4��"� �������

��������� ���� ������,�����,�����,�����,�#����!�����"�����"�����"���69���"#�

�� ���������%�������%�� �� �������������������������������� ������������������

����2��� ����� ��� �������� � ������ �.�������� ��� ����� &''+!�� ��� ��� ���� ��� ���� ����

������������������ ���������8����������������������;!�������;!�������������

�� ��� ����%��������� ������ ������������ ������ ����,�E��"� ������������ �����

������������ �������� �.�������� ��� ����� &''+(�8����� ��� ����� &''+!�� �3����������

����� �����������������"�����"��������"#���������������� �������� ���� �����

��� �� �� ��� ���� ������� �� ������� ���� �������� � ��������� �.�������� ��� �����

&''+!����������������������������������������������������������������������

������������������� � ���������������������������������������������� ������

����������������������������"������,�&������������ ��∆������ �#∆�����������

������������������������ �����������������������9�6�∆������ ��∆����������

�� ������� ������ ������ �� ��� ����%���� ����� � ����� ����� ������� ��"�� ����

��"#� ���� ������� ���� �������� � ���������� � ����� ��� � ��∆��������� ���� �� ��

����������������� ������������������������������������

� �'�

���

��

� �� �� �� �� ��

�� ���

�����

�$������,��������������#��!!�����%�$���!�#���������&���$��+�'������(�������#�

-1�'��

.������� �������#���� ���� �������%���� �����9C>�>,� �����5�6#∆������ ��!��9�6∆��

����� ����� � ��∆������ ���� � ��∆������ ��!�� ���� � �#∆������ ��� ���3A8����������

���� ���������� ��� ���������� ����� ������� ��� ����� ��� ���� ����� ���� ������ �� ���

�������������������������������

� �+�

9�,�%�������#���� ��%!���/����!��'��%�$�('�!��������������&��!�!���

=������������ ��������������������������������������������������#������� ���

���������%�����������������-������ ���+���!��������������������������5�6#∆�

����5�6�∆��������� ��������������%��� ����������� �������������������������

����� ��� ������ � ������ ��� 3A8� ������� ��� ��������� ����� �� 4'� ����� �������

���������������� �������� ����������������� ������������� ��������� ���������%

���� 9C>�>,� ����� ���� ��� ������ � � ��∆������ ����� �� ������ ���� �����������

=����� ������ � �������� �"������,�,.!�� �������%���������� ����5�6�∆� ����5�6#∆�

�������������������������&�4�����������������������������������������������

���������+'�������������� �������������������=������������� � ���������"������

,�,9!�� ���5�6#∆������������������������������������������������������������

��������������&>����������� ������������������������������������ ���������>4�

�� ��%��� ������� �� �������� � .� ������� ����� ��� �������� ��� ��� 5�6�∆� �����

������ ��� �������� �������������������������� �������� � ������� ����� ���� ���

������#������������������������������� �������������� ������������������������

� �&�

� �

� �� �

���

��

� �� �� �� �� ��

�����

�����

� � ��

���

��

� �� �� �� �� ��

�����

�����

�$�����*��+�'�.������!�#�%%�+��$���!'�#��#��������&������������&������������!��

��� .����� � ������ #���� � ��� ��� ����%���� ����� 9C>�>,� ��!�� 5�6#∆� ����� ��!� ����

5�6�∆������ ���� ��� 3A8������������ .������� � ������ #���� � ��� �������%���� �����

9C>�>,������5�6�∆����������5�6#∆ �������������� ��∆�������������3A8�����������

� �,�

5� �'������∆∆∆∆� ������&��� %�$� ('�!�� ���� ���� ��� %�!!� �#� ��&�%��"� ���

!�((��!!�����������!�

�������������� �������������������������������������������������������������

����� ���� ������ �� ��� ���� ���� ������ ��� ���� � ��� ��� ��������� �� ��%��������

��������� ��� #��� ����� ������� ���� ��������� �� ������������ ��� �� ��� ������ ���

�������� ����� ������� ��� ��� ������� � ���� �������� ���� ����� ���� ��� 5�6#∆�

��������� ���� ����� ����� ���� �� ��� ����� ��� �����2����� ��� ���� ������� ����

���������������������������� �����������������������������������������

� �����������������������%��������5�6#∆� ���������������������������������

�����������������������������������������������������B�!���������B���������

�� �������� ���� �� ��������� ������� ������� ���� ���%������� ���� �C��� ��� �����

+�/+!�������5�6#∆��������������������������������������������� �������������

����%����� ����#�� ��� � ��∆� ������ ������ ��� �� ��������� �� ������ ��� ���� ����

�"������,�>!�� ����� ����������������� ���5�6#∆������������ �������� � ��������

��� ��� ���� �� ��� ��� ���� ��� ��������������� �� �� ������� ����� ����� >/�

����� �������� � ������ ��� ���5�6#∆������ ������ ��� �������� ���� ����������

�����������%����������������������� ��������� ��������������������� ����������� �

�������"������,�,.�����9!���������������� ����������5�6#∆����������� �����

��������������� ����������������������������� ����������� � ����������� ���

����� ��� ��������� ��� ���������� �� ��������� � ����� ����� ���� ��� ��� ������

������ � ���������$ �>������������������ ����������� �������������������� ���

�������������� #�������#��������������������������� �����������������������

�������� ����������

� �>�

� ����������������� ����������� ����������������������5�6#∆������

�������������� � �������������������������� ����������������������������

��� ����������������

� �4�

��

���

� � �� �� �� �� ��

�� ���

������� �� ���� ������

�$����-���%%� ��&�%��"��#� �����!�������!������'��+�%�)�"(��#�%%�+��$��'��!'�#��

���������&������������!��

.������� � �������������������������������������� ������������������������������%����

�9C>�>,!������5�6#∆����������� � ��∆�������������∆��������� ����5���∆������

��� ����� ��� ���� �� �������� � 3A8� �������� � ���� ���������� ��� ���������� �����

������� ��� ����� ��� ���� ����� ���� ������ �� ��� �������� ��� ���� ���� ����� ��� ����� ���

�����������������������������

� �:�

-� ���'��� ���%"!�!� �#� �'�� ���� ��"� �#� �'�� $�����%� ������%�

(��'+�"����������&��!�!�

1��������� ����� ���������� ��� ������ �� ��������� ������� ��� �������� ��� ���� ���

������������� ��������������������������������������������,�,������������

�������� �������#���� ������� ����������������������������� ��������������

��� ���� ������ ��� ��������� ���� ���� ��� ��� ��� ������ ��� ���� ����� >/� �� ������

�������������������������������������������������������������������������

��� ��� ����� ���������� ���������� ���� ����� ��� ������ �� ����� ���� ����� ���� ����

��������� � -�� ��� $ �+��� $ �&��� $ �:��� ����$ ���� ���� ������� ���� ��������� ���

������� ��������� ����� ������ � ��� ���� ��������� �������� $ �+��� $ �&��� ����

$ �,�� ���� �� ������ �� � ����� ��� ��������� ������#� �65.� ������� ������ � ���

�������� �-�������� ��������+�/�(�-������������-������ ���+�/:!�� ����� �����

���� ��� ��� 5�6�∆�� 5�6�∆�� 5�6�∆� ���� 5�6�%∆� ����� ��� �� #� ��� ������� ��

����������������������$ �>���������������������������������������� ������

������������ ��������������������������� ������������������$ �>������������� �

��������� ������� ����� ����������� ��� ����������� ����������������

� ���

9� �)!������ ��� $%"����� ��������� ���.��%"� �������� �'��

�/�������%�$�('�!���#��'������∆�������������$�������&��!�!�

���� 3A8� �������� � ������� ���� ��� ������ *%��������� *%����������� *% �������

*%���������*%������������� �����*%�����������*%�������.�� ���������&''>!������������

������������������������������������ ���������������������5�6#∆� �������

�������� � ������� 3A8� ������� ����������� ���� �� �� ��� ��� ������ � ��� ���

��� ������ ���� ��� ����%���� ���� 5�6#∆� ����� ���� ������ ���� ����� ���� ����

�������������������������� ���� ���������� � �������� �������,�>!�� ���������%

��������5�6#∆������������������ ���������3A������������ ����������������

���� ��������� � �� �������� �*%��������� *%��� ����� *%����� ���� ���� ��� ��!�� ����

388������������ ������������������������������� ���������������������������

������,�>����

� 3������������� ���� ������ *%������ ��� ��� ���� ������ ����� �������� ���

��������� ������ ��� ���5�6#∆������ ������� ,�>� ����"������ ,�4!�� � *%8������ �����

������� ���� ��� ��� ������ ���� �������� ��� ���� ����� ������ � ��� ���� ��� ���� � ���

������ �� ����� � 3�� �� 3A8� ������� �������� �� ������� ��� ������ � ���� ��� ������

����������������������������������3A������������������������� ��������� �����

5����������������������� �����������������������������������5�6#∆�����������

��������������������������������!����

9������ ��������*%��������������������������������������������#�����

���� ������������ ������% ���������������� ����������� ����� ���� ���� ������%

������������������������������������������� �����������������������������

��������������������� �������������������������������������% ���������������

������� ������ � ���� �������� � ����� ���� ���$ �>������� ��� �������� ����� ��� ���

� �/�

�������� ��������������������� �������% �������������������� ��������������

��������������������.������������������������$ �>����������������% ������

������������� ������������8������>������������

� ������������������ �������� ���� ���� ��� ���388������������ �� �� ������

���������������������� ������������������ ������������������������������

5�6#∆ ����������� ���������������� ���� ���3A8����������� �� ��� ���������

�����&&�������&>������� ������������������������� ��������������� �����������

������������� �������� ���� ��������� �������#����� ���*%������������ ���� ���

��� ����� �� ��� ���� ��� ��� ������ � ���� ����#� �������� �� ������� ��� ������ � ���

��������� �� ���� ���� ��� ������ +�,�� ��������� �� �� ������� ��� ��� �������� ���

���#� ����������������� ��������������������������� ���������������� ������

����� ���� &'� ������ � ��� ���� ������ ���� ���� ������ ���������� ��� ������ ��

��������� ������� ��� ��� ��� ���� #�� #��� ����� ��� ���� ������ � ���

�����������������������+�,����������������.����>/�������������� ��������������

���� ����� ��������� ��� �������� ���� ����� �� �������� ��� ��� 5�6#∆� �����

�������������!����

� ���

��&%��-��##�����#� �����!�����&�%���!�����'��%�$�('�!�:����&%��$����������#���%�

��%%� "��%�� �#� �'�� +�%�)�"(�� ���� ����∆� ������� ������ �� !'�#�� ��� ������&���

���������!���������� ��������������� �������#���� ������ ���������������������

���>/������� ������������������ ���������������������� ��� ����� ������������

���� ���������������������������������������������3��A�!����

;������ ��$�('�!��

2'3�

,��&%��$������

2'�4��,3�

�,566�����'���

�#����-1'���������

2'�4��,3�

��<�%�)�"(����-0-� � � �

3A� >� ,�/:�D�'�'/� ,�&&�D�'�'��

3A8� 4� >�,�D�'�&,� ,�+/�D�'�'/�

3A8�F�*%�������� >� ,�4+�±�'�+,� >�,+�±�'�+>�

3A8�F�*%���������� >� ,��4�±�'�'>� >�&:�±�'�&+�

3A8�F�*% ����� >� ,�&4�±�'�&+� >�>4�±�'�'4�

3A8�F�*%��������� >� ,�/&�±�'�&4� >�,:�±�'�+&�

3A8�F�*%��������� >� &�/:±�'�+4� >�+/�±�'�+/�

3A8�F���� ���� >� ,��4�D�'�':� &�/4�D�'�'>�

3A8�F�*%�������� >� ,��+�±�'�&+� >�4&�±�'�'��

3A8�F�*%������ >� >�+4�D�'�'/� &�4�D�'�'4�

388� >� >�+��D�'�'�� ,�4�D�'�+4�

� � � �

������∆�������� � � �

3A� )� )� )�

3A8� &>� ,�'>�D�'�'/� &�>�D�'�'4�

3A8�F�*%�������� &>� 4�>4�±�'�'/� +�>+�±�'�'+�

3A8�F�*%���������� &>� 4�44�±�'�+,� +�>,�±�'�'��

3A8�F�*% ����� &>� ,�,��±�'�&�� +�>4�±�'�+��

3A8�F�*%��������� &>� :�4/�±�'�,&� +�,/�±�'�'>��

3A8�F�*%��������� &>� 4�44�±�'�+&�� +�,/�±�'�',�

3A8�F���� ���� :� ,�4�D�'�&�� >�/4�D�'�+��

3A8�F�*%�������� &>� >�4:�±�'�&,� +�>4�±�'�',��

3A8�F�*%������ >� ,�D�'�'/� >��4�D�'�'>�

388� &&� /�D�'�&4� &�>�D�'�'&�

� � � �

=�3A�������������������������� ������������ � �� �������� �*%���������*%

��� �����*%����� ����������� ��!���

� +''�

���

��

� � �� �� �� �� ��

�� ���

�����

�$����9�*��+�'�.������!�#�%%�+��$�����!#������������&������������!���� �����!�

������� �����(�������#�-1�'���!��

.������� ���������� �������%���� �����9C>�>,� ���� ���3A8��������� ���� ��� ���5�6#∆�

��������3A8����������������3A8���������������0���� ��������� ���������������*%

������ ����� � ���� ���������� ��� ���������� ����� ������� ��� ����� ��� ���� ����� ����

������������������������������������������

� +'+�

5�;�����!� �##������ ��� &��!"��'�!�!� �#� �)!������ ��� $%"�����

��!(%�"� �� !���%��� ('����"(�� ��� �'�� ����∆� ������� �����$�

������&��!�!�

����������������������������������������� ������������� �����������������

���� �� ��������� ��� �� �� ��� � ������ � ��� ����� �� ������ ��� ��� �������� �

������� ���� �������� � ������� � ����� ����� ���� ����� ��� ������ ,�4� ���� ��� ����

�������������������������������� ������������;�����4,���������� ��������������

��2����� ��������� �� ��������� ������� �� ��� ��� ��� ����%���� ��� ���� ����

�������� �����"���� )�� ����)��� ������ ������� ��������� �� ��� ��� ���5�6#∆�

��������������������∆������������������������������������

��&%��9�������&���$��+�'�.������!��#��������������/����('���������!�����,��

������������������ �������#���� ������ ������������������������������������

>/����������������������������������������������� �������� ���������������

����������������������������������

� *����

��%������

��$�('�!��

2'3�

,��&%��$������

2'±±±±��,3�

���%���,566�

����'����#����-1�

2'±±±±��,3�

7���%�����9C>�>,!� %� 4� >�+/�±�'�'/� >�,'�±�'�&,�

� � � � �

;���&�%���(��'+�"� 5�6#� &,� ��+��±�'�+:� &�>4�±�'�+'�

� 5�6�� &&� :�>,�±�'�&�� &��:�±�'�&:�

� � � � �

��$�������"��'�!�!�� ��5#� 4� >�:&�±�'�&+� &��/�±�'�+/�

� ��5$�&� 4� >�>/�±�'�'>� &�>4�±�'�>&�

� � � � �

�!(���$�����"��'�!�!�� �6�� >�4� >�+,�±�'�&/� &��:�±�'�&��

� �6�� >� ,��/�±�'�&&� ,�':�±�'�>/�

� � � � �

�"!�������"��'�!�!�� ���� &>� ��,>�±�'�,:� '�&:�±�'�'/�

� ��#� 4� 4�&,�±�'�:�� ,�&�±�'�+��

� � � � �

*%���������"��'�!�!�� 5�6�� 4� >��/�±�'�&4� ,�'4�±�'�&+�

� 5�6�� 4� 4�+&�±�'�,>� &��4�±�'�,,�

� � � � �

*%"������"��'�!�!�� 5���� &'� 4�,��±�'�&>� '�&,'�±�'�&'�

� +'&�

��!��������"��'�!�!� � �� 4� ,�>+�±�'�,� ,�,&�±�'�+4�

� � �� 4� ,����±�'�++� ,�44�±�'�'��

� � �� 4� ,�,/�±�'�'>� &��'�±�'�+&�

� � #� 4� >�/&�±�'�'/� ,�/��±�'�',�

� � $� 4� 4�4��±�'�'&� ,��+�±�'�'/�

� � .� 4� ,�&:�±�'�&+� ,�:>�±�'�&&�

� � � � �

�!�%��������"��'�!�!�� ���� >� >�4:�±�'�&+� ,�+&�±�'�&,�

� ���� >� >�,+�±�'�+:� ,�:��±�'�4&�

� ���� >� >�>&�±�'�'4� ,�4/�±�'�,/�

� ��$� >� >�+/�±�'�'4� ,�>:�±�'�&+�

� ��&� >� >�&4�±�'�'�� &��:�±�'�4:�

� � � � �

���������"��'�!�!�� �8�� >� ,��/�±�'�+&� ,�4�±�'�&>�

� �8�� 4� ,�/4�±�'�'>� ,�+4�±�'�44�

� �8#� >� >�+&�±�'�&:� ,�&4�±�'�&+�

� �8�� >� >�&>�±�'�&>� ,�&>�±�'�+>�

� � � � �

�"!�����"��'�!�!�� ���� >� ,�&��±�'�'/� ,�/��±�'�':�

� ���� >� ,�/��±�'�+>� ,�,4�±�'�+��

� ��#� >� ,��4�±�'�+�� ,�&>�±�'�'4�

� ���� >� ,�&��±�'�'�� ,�44�±�'�+,�

� ������ >� ,�4:�±�'�&+� ,�>>�±�'�+&�

� ���%� >� ,�:&�±�'�&>� ,�&+�±�'�&��

� ����� >� ,�&>�±�'�+&� ,�++�±�'�,/�

� � � � �

;��'��������"��'�!�!�� ���� >� ,�4�±�'�+��� ,�4,�±�'�,+�

� ���� >� ,��/�±�'�&+� &��,�±�'�>&�

� ��&� 4� ,��>�±�'�',� ,�&4�±�'�&&�

� ���%� >�4� ,��/�±�'�+�� ,�,�±�'�&4�

� ���#� >�4� ,�4:�±�'�+4� ,�>4�±�'�,+�

� ���&� >�4� ,����±�'�&:� ,�+>�±�'�&:�

� ���.� 4� >�+/�±�'�':� ,�+��±�'�+4�

� � � � �

���%�����"��'�!�!�� :���� 4� 4�,:�±�'�+4� &��,�±�'�+4�

� :���� 4� >�/:�±�'�+&�� ,�'+�±�'�&+�

� � � � �

��������"��'�!�!� ��� &&� 4����±�'�>,� &�+>�±�'�++�

� ��� :� >�,:�±�'�'&� &��/�±�'�,&�

� ��� 4� >�:��±�'�+:� ,�+&�±�'�&��

� ���� 4� >�&4�±�'�&:� >�+&�±�'�&4�

� � � � �

��"(��('����"��'�!�!� ��:�� >� ,�:&�±�'�+&� ,��/�±�'�,>�

� ��:�� >� ,��&�±�'�'4� &��4�±�'�&:�

� ��:�� >� >����±�'�++� ,�>'�±�'�+>�

� ��:#� >� ,�:��±�'�'/� ,�&,�±�'�+&�

� ��:$� >� ,�&4�±�'�'�� ,��4�±�'�+'�

� � � � �

� +',�

� � � � �

�'���������"��'�!�!�� ����� >� ,�/��±�'�+4� ,�+�±�'�+>�

� ���#� 4�4� >�+:�±�'�,&� +��/�±�'�++�

��

� ���� �������� �������� � ������ � ������ ����� *%������ ��� ��� ���� ���

��������������������������������∆������������������ �����������*%�����!�

�������������������5���∆�������"������,�:!�� ���������������������������

*%������ �� ���� ��� ��������� ���5���∆�� ��� ��� ��∆��������� ��� �� ���� ���

��� ���� �������������� ����� �������� ������������5���∆� ���� ��∆���������

����������� �������� ��� ������� ����������� ���� ���� ��� ���� ���� *%��������

$��+�������������������������� �� ���������� �����������*%����%�������������*%

��������� ���� ��� ���� �@�� ���� ��� ����� +���!�� ���� ��� �� �� ��������� ��� ���

��������������� ������3��+������,%��������������������������������� ������

�������������������*%������������� ����������������������������������� ������

���������� �����������������������$ �>���@�� ������������+��4!��@�� �����+��4!��

"������,�:�����������������������������*%������ ������������������������

�����������5���∆��������������������∆���������������������� �������

*%���������� ������������������ �����������������"������������������������*%

�������������������"����������� �������������� �����������������������*%

������ ��������(� 3��&�� �� ��� ������ �������� � A������� ��� ��"�� �� ������ ����

�������� � ������ ��� ��� ���� ����� ���� *%������ ������������� �6������ ��� �����

&'':!����� ������� ������� ����������������������∆��5���∆������ ��∆�������������

�����!����������� ������������"������,�>�� �-�������� ����������� ����������

� +'>�

�����∆�����5���∆������ �������� �������������������������������������

��� ��������������*%���������

.����� ���������������������������������������������������∆������

����� ��� ���� �� �������� � �������� ������� ,�4!�� ��� �� ������ ��� ����� ��� ���

����������������������*% ��������������� ������5�6#∆�������������,�>!����

8�������������������� ��������������������������� ������������*%������

������� ������������������������������������ �������������� ������������� ���

���� ���� ������� ����� ���� ��� �� �� ��� ����� ��� �� �������� �� ����� ���� ���

���������������������� ���������������������������������*%������������� ����

������������������������8������>�������������

� +'4�

���

��

� �� �� �� �� ��

�� ���

�����

��

�$����5�������&���$��+�'�.������!��#� �'������∆���������∆�������!� ���������

!�((%��������+��'�$%"��������>����)!��������

.������� ���������������∆���������3A8����������������������0���� �������� �

������ ����� ��� ���� ���� *%������ ���(� ��� ��� 5���∆������ ��� 3A8� ����������� ���0�

��� ���������*%�������������� ��������*%������ ����� ���������������������������������

������� �������� ����������������������������������������������������������

� +':�

5���/�������%�$�('�!���#�����∆�����������������&���$��+�'��!�����

���������/����('�����?��������!��#��'����-0-�!�������

��� ������ �� ������� ��� ��� �������� ����� ����� ��� ���� �� ��� ��������� �

�� ��������������5�6#∆�������������������������������������#��������������

������� ���� ����� �3&// !� ���� ��� �� ��������� � ���� ������� ����� ��� ��� ���

9C>�>,� �� #������� ��� �� �� ����� ��� ���� *%�������� ���� *%��� ���� ���� ��������

.������� � ������ ��� ��� 5�6#∆ ���� 5�6�∆� ����� ��� ��� ��������� � 3&&/ �

�� #��������������9C>�>,��� #�����������������������������,�:������������� �����

�������� � ������ ����� ��� ��� ��������� � 3&&/ � �� #������� ���� 9C>�>,�

�� #������� ���� ����� ��� "������ ,��.� ���� ��� 5�6#∆ ���� 5�6�∆� ����� ��� ���

��������� �3&&/ ��� #�����������9C>�>,��� #�������������������"������,��9����

��&%�� 5� ������&��� $��+�'� �'��������!���!� �#�������!� �##������ ��� �'�� $�����%�

������%� ��!(��!�� ��� �'�� ��/����('��� ��-0-� ���� ��11�� (�������('���

&��.$�����!�

���.$������ *������%������ ��$�('�!��2'3� ,��&%��$������

2'�4��,3�

�,566�����'���

�#����-1�'��������

2'�4��,3�

9C>�>,� %� 4� >�+/�±�'�'/� >�,'�±�'�&,�

9C>�>,� 5�6#� &,� ��+��±�'�+:� &�>4�±�'�+'�

9C>�>,� 5�6�� &&� :�>,�±�'�&�� &��:�±�'�&:�

3&// � %� >� +�>'�±�'�+>� ,��'�±�'�,>�

3&// � 5�6#� ++� &�::�±�'�+�� &�&4�±�'�,+�

3&// � 5�6�� +&� &�4,�±�'�&+� &��4�±�'�+��

���� ����� �� ���� ��� ��� ���������� ��� ��� ����� ��� �� ������ ��� ���

��������� �� �������������� ���3&//8�5�6#∆� ����� �������� �� �� ������ ����� ��

����������������������9C>�>,������������9C>�>,����������������������������

���� �� ������ ��� ��� ������ �� �������� ����� ������������ ��� 3&// � ���5�6#∆�

�3&// !��������������� ������������� � ���������"������,���.�����9!������������

� +'��

������������������� ��� �����������9C>�>,���5�������������������������

���#������ ��� ����������������������&>�����������������������

� +'/�

� � ����

���

��

� �� �� �� �� ��

�� ���

�����

� � ��

���

��

� �� �� �� �� ��

�� ���

�����

��

�$����0�����&�������������&���$��+�'�.������!��#� �'����/����('��� 2��-0-3�

����(�������('���2��11�3�!�����!����.����� �������������9C>�>,���������3&// �����.������� �������������9C>�>,�����

����3&// � �������.����� �������������5�6#∆�������9C>�>,!����� ����5�6#∆������

�3&// !� ����� .������� � ������ ��� ��� 5�6#∆������ �9C>�>,!� ���� ���� 5�6#∆������

�3&// !�����

� +'��

5�� �������%� ��?��������� �#� �)!������ ���� $%"����� #��� ������&���

$��+�'��#�����∆���������

B��������������"������,�4����� �����������������������*%������������ ���� ���

�� ��� ��� �������� ���� ����� ��� ��� 5�6#∆� ������ � ���� ����� �� ��� ������

������� ���� �� �������� ���� ���� �� ��� � ���� ������ ����� �� ������� �������

������������������� �������(���� ��� ���� ���� �� ������ ���� ���� �������� ���

��������������������������������� �� �����������*%������������� �������������

������ �����������∆�����5���∆���������� �������"������,�/�.�����9!���;�� ���

������������� ������� ������������������������� �������� �� �������������

�� �������������������"������,���.�����9�������������������������'�'4�µ@����

������������� ����������������� ��������������� ��� ����������������������

���� ����� ��� ��� ��������� ���������� �"������ ,�+'!� ������ ��� '�'4� µ@� ���

��� ���� ��� *%������ �� ��� �������� �� �������� ��� �� �� ������ �� �� ��� ���

�������� ���� ����� ���5�6#∆������� �� �� '�''4�µ@���� ������ ������ � ��� ���� ���

���������������������������������������������������������������� �������

���� ��������� ������� �� ���� ������� �� ������ ������ ��� ��� ���������� ���� �����

��������� �������*%���������������������������������������������������������������

��� ������������ ������������ �������8������>��������������

� ++'�

� � �

� � ��

���

��

� �� �� ��

�� ���

�����

�� � ��� � �

���

��

���

� �� �� ���� ���

�����

��

�$���� 1�����&��� $��+�'�.������!� �#� ��/����('���������!� !�((%��������+��'�

�����!��������������!��#�$%"���������)!�������

���5���∆���������������������'�µ@������������µ@� ����'�'4�µ�� �����'�4�µ@� �����

����4� µ�� ���� ��� ��� ���������∆���������������������'�µ@������ '�''4�µ@� ����

'�'4�µ�������'�4�µ@����������4�µ���������*%�������

� +++�

� � ��

� � � � � � � � � � � � � � �

� � � � � � � � � � � � � ! � � � � � � µµµµ " �

��

���

��

� � ��

� �

� �

� � � � � � � � � � � � � � �

� � � � � � � � � � � � � # $ % � � � � � µµµµ " �

��

���

���

�$����@��(����%����!����!�����'������ !��������"�('�!������(%�������$���!�� �'��

���������������#�$%"���������)!������!�((%������������'���������

���5���∆���������������������������µ@��'�'4�µ���'�4�µ@������4�µ�� ���������� ������������

����∆���������������������������µ@��'�'4�µ���'�4�µ@������4�µ���������*%��������

� ++&�

� � �

� � ��

���

��

� �� �� �� �� ��

�� ���

�����

� � ��

���

��

� �� �� �� �� ��

�� ���

�����

��

�$�����6�������&���$��+�'�.������!��������∆∆∆∆�����������������!�((%��������

+��'�$%"���������)!��������

��������������������������'�µ@����(�'�''4�µ@����������'�'4�µ@����������� ������

��������������������������'�µ@������'�''4�µ@����������'�'4�µ���������*%�������

� ++,�

0�,�!��!!�����.���������� ��� ���� ��� ����� ���������� ������ ����� �� �������� � ����������

9�������� ��� ���������� ���� ����� �������� ���� ������ � ��� ���� ��%���������

������ �������� � ��������� �������� ��� ������� �� ��� ��%���������� ���� �����

�������� �������������������������������� #������������-��������������&'',(����

*�������������+���!���6����������������������������������� ��������������������

���� ����� ���������� � ���� ���������� ���� ���� ��� ��� ���� ����� �� ������ �����

�������������������������������������������

� 1�������� �� �� ����� ���� ���� ��������� ��� �� �� �� ������ ���� ����

���� ����� ����������� ��� ������� �������� ������� ��� ������ ���� ������ ���

��� ����� �-�� ��� ����� ��������� ��� ��� ��������� ��� ��������� ���� ������� ����

��������������������������������� ����������������������������������������#��

��� �� �� �� �� ���� ��� ����� ��� ���� ������� � 3�������� ���� ������ � ��� ��� ���

��� �� ��� ����� �� �� ���������� ���� ���� ��� �� ���� >'� ����� ��� +&� �������

�� ������ ���� ���������������������� ��� �-������ ���+�/>(�-������ ���+�//(�

-������ ��� +��'(�-������ �� ����5����2���� &''&(�5����2��� ��� ����� &''+!�� � ����

����� �������� ����� ����� ����� ��� ������ �������� � �������� ����� ���� �����

������������� ��� ������ � ���� ��� ����� ���� �������� ������#� �������� ��� ���

��������������������&>��������A����������������������������#��� ����5�6�∆��

5�6�∆� ���� 5�6�%∆� ����� ����� ����� �������� �� ����� �� ������� ���� �������

-�������� ������������ �������������� ������ ��� ���� ��� *%������ �������� ���

����������������������������������������������������������������������������

� )��������"���������9�����"������� )������������$ �>�������������@�� �����

&''4(�@�� ���� ��� ����� +��4(� 5����2��� ��� ����� &''+!�� � ���� ������� ��� ������

$ �>�� ����������� ��� ���� ���� *%������ ����� ������� �� ��� ��������� �����������

� ++>�

-�������� ���������������� ����������� �������� �������#� �����������������

������������������������������ �������������������������������������5�6#∆�

����� ������ ���� ������ �� �������� � ���� 5�6#∆� ����� ���������� �� ������� ����

����� �� �� ���������� ������ ����� � ���� ����� ���� ���� ��� ��� ����� �� ������

������������ ���������������� ���������������������������� ����������������

���#�� � "������ ����������� ��� ���� ��� ���� ���� *%������ �� �� ������ ���� ���

���������� �� ����� �� ���� ����� ������� ��� ��������� ���� ���� ������ � ���

��������� ��������������� ���� ���� ��� ��� ������������ ������������������������ ���

���������� �������������������

��

� ����

�������� � ����� ��� � ������� � � � ��

����� � ����������� � ����

� �����������

��������������������� �

�������� ���������� ����������������������������������� ���������������� ���

������ �� �� ���� �������� ��� ���� ��� ����� ������������� ���� �

������������� ����������� � ������ ������������ ���� �� ��� � ����� �������

���������������������� !"#�$����%�� et. al.��&''�#�(� ������������������� ")*��

+�� ������ "�� ��� ,��� ������ ����� ��� gcn4∆ ������� �������� ��� ������ ��� �����

,��� � �� ,� ������� ���� ������ ��� �������� ����������*� � ��,��� �����

���� �����,���� -.���� �� � ����� ����� ��� � ���� ��� ����� ��� ���gcn4∆�

���������������������*��/�������� ��������,���� �������������������,����

� ��������SER1���GLY1*��-.��������� ��������������������������������.������

����� ����,����� ��� �� ������ � � � �� ������ ��� ��� ��������� ������� � ������

����� �������������������� ����������������������������������0�� et. al.��&'''#�

1��������� et. al.��&''�)*� �/������,������.����������� ������� � ����������

����� �*�*� � 2�.������ ����� ���� ��� ����� �� ���� ������� ��� ��� � � ���

���'.���� �� ��������� ��� �0�� et. al.�� &''')*� �2�.������������ �� �����

���� ��� �������� ����� -.����� � ����� ���� �����*� �3�� ������� ����� ������

,�������������������4���������-.��������� ���������� ����������� ����

��� ��.������ � �,�,��� � �� �� ������� ���� ������ ��� �������� ����������� ���

� ��5�

, � ��� ��� ������ ��� � � ��������� ��� ��� �� ������ ��� ��.����������� ����

��������������*���

�������

�������

��� � ��� �

������ � ������ �

����

����

����

��

����

���

����

�������� � ����

��������

���

���� ����

���

������������

��� ���

������������

����

������� � �

����

�������� �

�����������

�����

������

��������� �

���

!������ "����������

����

��

����

!�"��#�������$#�$�#%��&���#����'��� #��'�(�) ����*#�)���

2�.����������� �������������������������,������.���������������������

���� ��� ������ � ������ -.���� �� ������ ���� ��������� ��� ��������� ��� ������ �

������������ ������� ��� ���������� � ����� ��������� ���� ��� ��������� ��� ��� �������

����������������������������������0�� et. al.��&''')*���

� ��6�

+�!�� ��#��#)��#)��,#��#(�*#��(�"�-,�)#��&�����∆∆∆∆� ������

������#��'������������)��

-.��������� �����,�����,�������������.�������������������������� ����

��� ����� �������� ��� ��� gcn4∆� �������� ��� ������� ��� ��� ������� �����*��

������ ��� ��� ���� ��.������ ����� ��� ��.����������� ���� ��� ����� ������

�*�)*���

/������� ��,��� ��� ���gcn4∆�������� ��� 178������� ���� �����,����

������ �� �,�� �� ���� �� ������ ��� ������,���� ���� -.���� ��,���� � ����� ���

������� ��� ��� ����� ��� ��� gcn4∆� ������� �3�� � �*�� ���� ����� �*&)*� 2�� ��

���� ������������������������������.���������������������� �������������

���� ���� ��������������gcn4∆������������������������������.����������� ����

��� ��� ����� ��� ��� ����� ���� ����� ��� ������� ��� ��� gcn4∆� ������� ������

����������*���

� ��!�

��'(#����&&#����&�$�����)���#����'��� #��'�(��#)���� (�"�-,�)#.����'(��"� �� #�

���� &���(� �#((� *�#(�� �&� �,#� %�(���*-#� ���� ����∆∆∆∆� ������ &�((�%��"� �� ),�&�� ���

���#��'������������)����,���������,� �.��������gcn4∆�����������������17��178��

188� ���� 178� ����� ,���� ���� ��������� ��� ���� ��� ��� ��� ��� ��.������

����� ���������� ������,����� �,����������������� �*��3�������������

��� ����� ���� ��������������� ��������������������������������,������������

��������*���

�#��� � ��"�-,�)#�

/,0�

���'(��"��� #�

/,�1���0�

��233��#��,#��

�&�#��4,�/,�1�

��0�

��5�(���*-#��678� � � �

17� �� "*!5�9�'*'!� "*&&�9�'*' �

17�:�-.���� �� "* ��9��'*'!� ��*&!�9�'*'6�

17�:�� ������ �� "*5 �9�'*'�� "*���9�'*'��

17�:������� �� "* &�9�'*&�� "*�"�9�'*�&�

178� �� �*"�9�'*&"� "*�!�9�'*'!�

178�:�-.���� �� �*���9�'*'!� &*��9�'*'��

178�:�� ����� �� "* ��9�'*'5� &*!��9�'*'��

178�:������� �� "*6��9�'*�"� &* �9�'*���

188� �� �*� �9�'*' � "*��9�'*���

� � � �

������∆� ������ � � �

17� �� �� ��

17�:�-.���� !� !*&�9�'*'6� �*!��9�'*�"�

17�:�� ������ !� !*'�9�'*'�� &* �9�'*���

17�:������� !� 6*!��9�'*��� &*�!�9�'*�"�

178� &�� "*'��9�'*'!� &*��9�'*'��

178�:�-.���� �� "�9�'*'!� �* ��9�'*'��

178�:�� ����� 5� �*!��9�'*�6� "*��9�'*& �

178�:������� �� &*���9�'*���� �*56�9�'*���

188� &&� !�9�'*&�� &*��9�'*'&�

� �� �

�#�

��

� �� $� %�

����&'�(

)*%��

��

!�"��#� +� ���#��'��� "��%�,� 9��#���)� �&� �,#� ����∆∆∆∆� ������ ��� ���� #��� �

)�--(# #��#��%��,���#����'��������)���

/������� ��,��� �������� ��� ��� gcn4∆� ������� ��� 178� ������ �� ��� 178� �����

���� �����,����-.�������#�,����� ��������#�����,�������������� �3�����������

,��� ����� ���� ������ ��� ����� � ��� ������ ���� �� ��� �� ����� ��� ����� ,���� ��������

��������*���

� �&'�

8���)�-�����)#���#�,*���:* #�,*(����)&#��)#�����$��*���#�

�#;���#��&������#��'���"��%�,���� ��� �(� #��� �

3�� ����� ������ ��� � � ���� �� ������ ��� ��.����������� �������� ��������

������������ �������� ��,��� ��� 178������� ���� ��� 178� ���� ����� ,���� -.

������ ��������������������������������������������.����������� ����,���

������� ��� ���,� �.���� ����gcn4∆ ������*� �3��������� ������� ��� ����shm2∆�

� ������� ����� ������ ���� ���������� �������)�� shm1∆� � �������

����������� ��������������� �������)��������� �shm1∆shm2∆ �����������

,����� ��.����������� ���� ���� �� �� �� �������� ��� ��� ����������� � � �����

� �����������)�����gcn4∆ shm2∆�����gcn4∆ shm1∆����� ��������*���

� 3��� �������;�����������������������,���� ����������������������bas1∆

������� ������� ����� ����� ������������ ������ ������ ��� ���� 7$/������� ��� ������

�3�/838)*��;���������������,����������� ��������������� ��������.������

����� ���� ���� ������ ����������*� � +�� ��� � ��� ���� ��� ����� ������������

�7������.���������������� &#�� ��� et. al.��&''�)*� �+���������������178�

���������������������������������bas1∆��������4���������������,��*��

��,���� ����������,������� �����178����������� ���������bas1∆�������)�

���������������������178�������������178����������������������������

��������.����������� �����������*")*���

+������� ��� ��� ������������������� ��������.����������� ������� ��

��� ���� � shm1∆� ���� shm2∆� �������� �,� ���� �� ���� ����������#� ���� ���

bas1∆� ������ ���� ������� ���������gcn4∆ shm1∆��gcn4∆shm2∆� ����shm1∆shm2∆

����������,����� ��������*"/)*��3��������������������������� ���������� �������

��� ��� ���� ���������� ��������� �SHM)� ��� ������� ��� �������� ��,��*��

� �&��

/ ���� �����.������� ��.�� ������ ��� ���� ���� ���� ��� ��� ��.������

����� ������������� � �������������,�������������� ���gcn4∆shm1∆���� ���

gcn4∆shm2∆ ���� � ������� �,�� ���� ��� ���� � shm1∆ ���� shm2∆ �������� ���*��

(�� ���� ��������������������;������������������������,��������� ������������

��,��� ��� ������ � ������ ����������� ������ ���� ,��� ���� ������ � ��� ������

��,��������������������������<���� et. al.��� 6)*��=���� �����,���������� �

������� ����� ��� bas1∆� ������� ����� ���� �,� �������� �*� � +�� ,��� � ���

������ ����� � � ������� ����� ��� gcn4∆� ������ ���� ��� ������ ��� ����*� � 3��

shm1∆shm2∆ �������,������,������� �,�������������������������,���

��� ������ �*";)*� � -.���� �� ������ �������� ��,��� ��� � � ��������� ,���� ��

����� � ����� ��� ��,��� ���� �������� ��� ��� ������ ��� ��� bas1 ������

�������*"8�����7)*� �3��shm1∆shm2∆ ���� �������� �������,���� �, �� ���

��� ����� ��� � ����� �� -.����� ���� ,���� �� � ���� �� ����� ��� ��� �����*��

2�� �� ���� ��� ��� ���� ���������� ���SHM2� �,����� ������ ��� ����� ������

���� ���������� �������)� ������ ��� �� ��� ������ � ��� �������� ��,���

�����SHM1������������������������ ��>��)*��3����� ���������������������

������� � 4������ �����.����������� �������� �������� ��������������� ���

����������,������������ �������� �������������������� ��������� �������

���������� ���������.����������� ���*���

� �&&�

�� � � � � � ����

� � � � � � �

�� � � � � � ���

!�"��#�8����#��'���"��%�,�9��#���)��&� �����)��������'(#� �����)�������� #��� �

)�--(# #��#��%��,�$�����)� #��'�(��#)��

��,����������� �� �,���� ������ ������������������������� ���shm1∆� ���� shm2∆ ���

gcn4∆�����bas1∆�����gcn4∆shm1∆����� gcn4∆shm2∆ ��, shm1∆shm2∆ (���������� ���

178�����������178���������� �����,���������������� ���*��*����178������*���

,����� ����*��*�,����-.���*��*�,���������*��3����� ������������ ����� ���� ������

����������������������������������*���

�#�

��

� + �% �$ �� $� $+ �%

����&'�(

)*%��

�#�

��

� + �% �$ �� $� $+ �%

����&'�(

)*%��

�#�

��

� + �% �$ �� $� $+ �%

����&'�(

)*%��

�#�

��

� + �% �$ �� $� $+ �%

����&'�(

)*%��&

� �&"�

� ��������)� �#(��#�� ��� ��#����'��� #��'�(�) � ,�$#� ���

#&&#���������#��'���"��%�,�

1����SHM1�����SHM2,�,����������������.����������� ��������������������

�������� ������������ ���� �������� ��� ����� ����� ��� ����,��� ,� ����������

�GCV1��GCV2��GCV3��LPD1�ADE3, MTD1 ��� MIS1�������,�����������*�)*��3���

��������,���������������������������������������������������������!�������

������� ������������� ����������������� �� ��� ��,�����*��

������ ��� ���3� �������� ��� �������������� � � ������������ ��� ���� ��

�GDC)� ����� ��� 4���� ��� ��� ������ ���� ��� � ����� ��� ���'.���� ��

��������� ������������������������ ������� ��� � ��������'.���� �.3���

��� �������� ������ ��� et. al.��&''�#�0�� et. al.��&''')*� �GDC� ������� ���>���

���� �� ����� ���� �>�� ��� ���� � ��������� � ����� ��� � ����� ����� ������

��������������������1��� ����� �#�1��� �� et. al.��� 5)*��3���������������������

GDC ���� �� �� ���&�� �0� �������)�� ���"�� ��� �������)�� ���� -����� �-� �������)�

�1��� �������7�,���� �#�1��� �� et. al.��� 5)*� �GCV3� �����.�� �������� �����

���� ����� ��� ��� ����� ��� �������� ����� 4��� ��.������ ������ ��� ����

��������� �1��� �� et. al.�� � 5)*� � +�� ���������� �� ������ ���GCV3� ��� ��� ��� �

���������������� ����������������������������������� ������ � �����GCRE1�

GCRE2� GCRE3,� ���� 3/3/� ���� ������� ��� ��� GCV3� ���� ������ ����

�$����%�������1������� 6)*���

MTD1� ��� �� $/7:.������� ���'.���� ���������� ��� ����������

���� ��������������������������� ��������.�����������*��+���������������� ����

���;���������;��&������������������7������.���������������� &#�1�� et.

al.��&''�)����������������������������� �������� ����7��������7������.������

� !#� =���� � 5#� =�� et. al.�� � 5)*� � �������� MIS1� ��� �� ����������� �

� �&��

8�.��������� ��� �������� ,����� ��� ���� ��� ��� ��� ������������ ��,��

������� ���������� ������ ��� ��������� ��� ��������� ���� ������� ���������� ���

���� .3��� ���������� ����� .3��� ��� ����� ���� ���� ���� �.3���

�����������1�����������(�����,��>��� !!)*���

3�� ����� ������ ��� 3�� � �*&� � � �� ���,� ����� SHM1� ���� SHM2� ���� ��

����������� ��� ���� ���� ��� ������ ������ �� ������ �*")*� � 1��� � ��� � ����� ���

MIS1, ADE3 � MTD1�� ,����� �� ���� ��� ��� ��� ������������ ���

���'.���� ���������� ������������������������� ������������������������

�����������������������,����������*��3��������MIS1��ADE3�����MTD1)�,�

������ ��� �� ��.�� ���� ��� ��� ������ ��� ��� � ����.�������� ���������� ���

?����,����et. al.��&''5��?���,��� et. al.��&''5)*��$��� ������������������%��

� � �����.�� �����������������SHM1��SHM2*� � +�� ��������� � ����� ���������

��������������� ��������.����������� ������������� �����������������

��������������*���

� �&��

������� �������

��� � ��� �

�� ���� � �� ���� �

��������

���� ���

��� ���

������������������������

����

!������ "����������

,�$- -&�)�

������

����

!�"��#��<#�#)���$�($#�������#����'��� #��'�(�) ��������� �����������������

� �&5�

��'(#�+��,#�(�"�-,�)#.����'(��"��� #�����&���(��#((�*�#(���&��#(#����� �����)��&�

��#����'����#(��#��"#�#)�������� #����&�((�%��"���),�&��������#��'������������)��

3�� ����� �� ���� ��� ����� � ��� ������ ���� ��������� ��� ����� ��� ��� ���� ,����

�������������������������*���

� <#�#�

�#(#�����

��"�

-,�)#�/,0�

���'(��"��� #�

/,�1���0�

��233��#��,#��

�&�#��4,�

/,�1���0�

��#����'��� #��'�(�) � shm1� �� �*&"�±�'*��� "*&��±�'*&"�� shm2� �� �*&5�±�'*&�� "*"��±�'*�!�

� gcv1� �� �*�!�±�'*��� "*�5�±�'*'��

� gcv2� �*�� �*���±�'*�"� "*���±�'*'!�

� gcv3� �� �* &�±�'*&�� "*&��±�'*�"�

� lpd1 �� "* ��±�'*'�� "* &�±�'*�6�

� mis1 �� "*6&�±�'*�!� "*!��±�'*���

� ade3 �*�� �*���±�'*&�� "*�&�±�'*'!�

� mtd1 �� "*!��±�'*��� "*! �±�'*�&�

� � � �

3���� ��������� � 4������ ��� -.���� ���� �������� ��,��� �����������

������ ������ ��� ������� � ��� -.���� ������������ ���� � ��� ����� ����

".�������� ����� ��� ��� SER1� ����,��� �@ �� et. al.�� � �)*� � 3���� -.����

4������ ��� ���� ��� ��� ��� ������� ��� ��� ��.������ ����������� �� ���

��������� ����� ��������� ��� ���� ��.������ ������� � ����� �� ������� ���� ����

���� ��,��� ��� ��� shm1 shm2 ���� �������*� � 3��� �� ��� �������� ����� ����

�������������������� ���,���4���� ���������������-.����������.������

����� ���*� � 3����� ��� ������ ������ ���,�� ����� ��� �������� ��� ��.������

����� ���� ����������������������������S. cerevisiae�� ��,��������-.����

����� ���� ".�������� ����� ��� ��� ����� ��.������ ����*� � A��� ��������

�������������������������������.������������ ����������������������-.����

���� ����������������������������)*����������GLY1������������� ����������� ����

�������� ���������-.�������������� ���������������,��������������������� �

����������������������������������������������������.�����������*���

� �&6�

=� ����$���#)� �&� ��)�-� ���� <��-� �����"� �,#� ),�&�� ���

���#��'��)�)�

;���� ;����� ���� ������ ������������ ������� ���� �� 4���� ��� ����������� ���

����������*� � +�� ,��� ����� ������� ��,� ��� ��� ����

���������� �������� ���� SHM2� ,��� �� ���� �� �,���� �� ������ ���

����������������������������������������� ���������������������� � ����

;����� �7���� ���� 7������.������ � !#� 1��������� et. al.�� &''�)� ���� ������

�@�$� et. al.�� � �)*� � 3�� ,� �.���� ;B�6�"�� bas1∆� ���� gcn4∆� ������� ,�

��������� ,���� ��� SHM2::lacZ ���� ���� �������� ��� β.�� ����������

������� ��� ���� ������ ������� ��� �������� 178� ������ ���� ��� 178� �����

���� �����,��������� ������-.�����������*��3��������������������������

���������������������������������,�������� ��������������������������,� �.

����1&!!������gcn4∆��������������,�������GCRECClacZ �����������������/ ����

et. al.��� !)�������������������������������������*���

� A��� � � ����������� ��� �������� ��,��� ��� SHM2::lacZ ���� ���� ����

���,� ������ � ��������� ��� ��� ������ ��� ;������ ����������� ����� ����� ������������

������ ��� ������ � ��� �������� SHM2� �������� ������ �*�)*� � +�� ��� ,� �.�����

SHM2� �������� ,��� ������� ���.� ��� ���.�� �� ,������ ���� ����� ��� ��� ������ ���

�������� ����������� ���� ������ ����� ��� ���� ��,��� ����*� � +�� ��� gcn4∆�

����������,���������������� �������SHM2���������,��������������������

��� ������� ��� ��� ����� � �� ����� ��� ���,� �.���*� �=���-.���� �� ������

,�����������,����� ������� �����������SHM2������������� �������*��+�����

��������� ������SHM2 ��������������,� �.�������������.�� ���� ������

� �&!�

��,����������������������gcn4∆���������������������� ����������,����������

��������������������������������,��*���

� 3�� �������� ��������� ��� β.�� ���������� ,��� ������� ��� ��� ��������� ���

������������������� ����������������������������������������*��/�������������

��� ,� �.���� ������ ��������� ������� ���� ��� ������ ��� �������� ������������

���������������.�� ���������������&�����������*5)*��3��������������������������������

,���������������������������������������������-.���������������������

� ����*� �3���� �������������,���� ��� ������ ������������������������������������-.

�������������������������� ��������������������������������������� ��*���

+�� �������� ����������� ��� ������������ ��� ;����� ���� ������ ��� ������ �

����������������������������������������������*��3����������,�����������

��������������-.����������������������� ������������ ����*��1����;�����

���������������,��������������������� ��� ���������.�����D����������������

������������ ��������� ���������������,��������������� ������������-.

�������������������������������������*���

7����� ����� ������������ �������� � �� 4��� ��� ��������� � ��������� ���

�������>�-.������������� ������������������������������������������������

;����� � ��� ��������� � �� ��� �� ������ ���� ����*� � ;����� ��� ��� ��������� ���

�� ��� �ADE� ���� ������ADE3)� ���� ��� ���� ��� �������� �����BAS1����� �� ��

���������������$����%�� et. al.��&''�)*��3�����;��������������HIS4 �/��� et. al.��

� !6), HIS7 �1���� et. al.��� 5) , SHM2 and MTD1 �7��������7������.������

� !)*���

� �& �

�� � � � � � ���

�� � � � � � ���

!�"��#� =� �:-�#))���� �&� ���������� ��� �,#� %�(���*-#� ���� ����∆∆∆∆� ���� ���∆∆∆∆�

�����)�&�((�%��"���),�&��������#��'������������)���� #��� �)�--(# #��#��%��,�

$�����)���#����'��������)��

E�������� ��� SHM2::lacZ ���.�� ���������� ��� � �� ������� �� �,���� ������ ���

�������� ����������� ��� ��� ,� �.���� ������ ;B�6�"� ����� gcn4∆ ������� ���� ���� bas1∆

��������������178�����������178���������� �����,���������������� ���*���*����

178� �����*��*� ,���� � ����*� �*� ,����-.���*��*� ,���� �����*� � 3���� ������� ,���

����� ���� ��� ��� ����� � ��� ������ ���� �� ��� �� ����� ��� ��� ����� �������� ��������� ���

��� ������������,��������������������������������������*���

���

���

���

$��

���

%��

.��

+��

� + �% �$

����&'�(

/�������&�������&'���#����#�� (

���

���

���

$��

���

%��

.��

+��

� + �% �$

����&'�(

/�������&�������&'���#����#�� (

���

���

���

$��

���

%��

.��

+��

� + �% �$

����&'�(

/�������&�������&'���#����#�� (

���

���

���

$��

���

%��

.��

+��

� + �% �$

����&'�(

/�������&�������&'���#����#�� (

� �"'�

�� � � � � � ���

�� � � � � � ���

!�"��#�2��:-�#))�����&���������������,#�%�(���*-#����� �����)�&�((�%��"��,#�

),�&�����#��'��)�)���� #�������������"��,#���#����'��������)��

E�������� ��� GCRE::lacZ ���.�� ���������� ��� � �� ������� ���� ��� ��,��� ��������

�� �,���� ������ ����������������������������,� �.����������1&!!�������gcn4∆ �������

���� ���� bas1 ������� ���� ��� 178� ������ ���� 178� ����� ���� ����� ,���� �������

����� ���*� ��� ���178������*��*�,����� ����*��*�,����-.���*��*�,���������*� �3����

�������,������������������ ����� ���� ������������ ���������������������������

����������������������� ������������,��������������������������������������*���

���

���

���

$��

� + �% �$

����&'�(

/�������&�������&'���#����#�� (

���

���

���

$��

� + �% �$

����&'�(

/�������&�������&'���#����#�� (

���

���

���

$��

� + �% �$

����&'�(

/�������&�������&&'���#����#�� (

���

���

���

$��

� + �% �$����&'�(

/�������&�������&'���#����#�� (

� �"��

2� ������#((�(��� (#$#()� �&� ��)#���#� �#��#�)#� �����"�

���-������� ��� ���#��'��� "��%�,� ���� <��-� �)� �#;���#�� ���

-�#$#����� -(#�#�(�))��&���)#���#�

3�� �� ��� �� �������� ����� -.���� ��� ����� �� ��� ��� ������ ����� ���� ��� ���

������������������*��/�� ������������������������� � �����������������������

������ ���� ��� ���� ����� ��� ����,���� ���� �� ������ ���� ��������� ����� ,����

�������,���� �� �� ������� ��� ����������*� �3�� ������������� ���-.����

������ ����������� ��� �������� ����������� ������ �� �� �� ��� ��������� ���

����� � �� ������������ ��� ���� ��� ��� ������ ������� -.��������� -.����������

� ������-.�����������-.������������������������������������ ��� �� �����

���-.�����������������������*6)*���

8 �� ��� ���,� �.���� ����gcn4∆�������� ��,�� ������ �� ��� ��� ����� ���

178� ������ ,� ������� ��� �������� ����������� ���� ���� �� ������� ���

������ ����� ��� ���� ��� ����� �� ��� ���� ����*� � 3���� ����� ,��� ������ ����� ���

����� ��� ���� ��� � ��� ����������� ��� ��� ,� �.���� � �*� � �0-8� ��� ����� ��� ���

����� � �� � ����������������� ������������ ��,��������� ����� ���������

,���� /*� 3����� �;/;1�� A$1=)*� � 3�� ����� ��� ������� ��� ����� ������ ������ ��

���������������*!������ ������������������������� �������/������������

�*���

� �"&�

!�"��#�7����)*��,#����-��,%�*)�&�����)#���#.�"(*���#.����,�#����#.����)-�����#�

�������*)�#��#��#��$#��&�� ���"(���)#�������������������

� �""�

� 3��,����������������������� � ��-.����������,� �.������� �,��

��� �� ����� ��� "'F� ��� ��� ������ � � ��� ��� ���� ���� ������ ���� ���� ��

������� ������ ��� ��� ������������ ��� � ����� ���� -.������� ������ �*!)*��

+���� � �� � ������ ����������������������������������,����� �������������

���-.������������-.������������,��������������� � ������������������������

��� gcn4∆� ������� ������ �*!)*� � +�� ��� gcn4∆� �������� ����� � �� -.���� ,���

���� � �� �� ��� ��� ���� ������ ����������� ����� ��� ��� ������ ��� ������ ��� � �

��� ����������������������-.���������������*��� ������ ���������������

gcn4∆�����������������&'F�������� � ����������� �*� �-.�����������������

��������������������,��������������178����������*���

� �"��

!�"��#� 4� ������#((�(��� ����#��������)� �&� ��)#���#.� "(*���#.� ���*)�#��#.� ��

�,�#����#.����)-�����#��������)-���"��#����%�(���*-#�����"��� ������&�((�%��"�

��),�&��������#��'��)�)��

3�� ������� ,� ��,�� ��� ���. ��� ����� ��� 178������� ������ �� ���� ������� ���

�������� ����������� ��� ���� >�� ��� ��� ��������������*� �=� �.���� ;B�6�"� ����� ����

gcn4∆������������ ���178������*��+���� � �����������������C���)�-.1#���)�� �#���0�

-.8��#���0�-.��#�/�0�-./��#�����/!0�-./���������������������������� ������,������

���*���

� �"��

7��')#��#��&����,�#����#�),�%)����#:�#��#�� (�"�-,�)#��&�

%�(���*-#��#(()����#�����#��'��)�)�

3�� ����� ��� ���� ��������� ��� -.������� ��� ��� ��� ������ ���� ���� ���� ����

���� �� ��� ��������,� �.��������gcn4∆����������� ����������3�� ��*"*�� +��S.

cerevisiae� � ����� ��� ���� �� ����� ���� -.������� ��� ��� ������� ��� �������

� �� ������������GLY1��@������� et. al.��� 6)*��$��������178�����188������

�������������-.������*��3�����������-.���������������� ��������������

,� �.����� ����'�����)��,��������������,���,�������������������gcn4∆�

������*� � 3���� ��������� -.������� ��� ��������� ��� �������� ��,��#� �������

�����������������������,�������������-.����������� ����������� �������� ���*��

+�� ���������� ��� ����� ���� ��� �������� ��,��� ������ ��� ��� gcn4∆� ������� � ���

���������� ��� ���������� ��� ��� ��������� ��� -.�������� ��� -.������*� � 3����

����� �������������� �������GCN4� ��������� �������� �����*���

� �"5�

��'(#�8��&&#����&����,�#����#�����,#�(�"�-,�)#��&��,#�%�(���*-#���������∆∆∆∆�

���������#����),�&��������#��'������������)��3�����������,���������������

��� ����� ���� ������������ ����������������������������,��������������������*���

�#��� � ��"�-,�)#�

/,0�

���'(��"��� #�

/,�1���0�

��233��#��,#��

�&�#��4,�/,�1�

��0�

��5�(���*-#��678� � � �

17� �� "*!5�9�'*'!� "*&&�9�'*' �

17�:�-.������� �� "*6"�9�'*��� "*��9�'*'6�

17�G�-.�������:�-.���� �'� �*�!�±�'*�6� �*!"�±�'*���

178� �� �*"�9�'*&"� "*�!�9�'*'!�

188� �� �*� �9�'*' � "*��9�'*���

� � � �

������∆∆∆∆� ������ � � �

17� �� �� ��

17�:�-.������� &�� !*���9�'*�6� �*" �9�'*'5�

17�G�-.�������:�-.���� .� .� .�

178� &�� "*'��9�'*'!� &*��9�'*'��

188� &&� !�9�'*&�� &*��9�'*'&�

+�� S. cerevisiae,� � ����� ��� ���� �� ����� ���� -.������� ��� ��� ������� ���

�������� �� ������������GLY1��@������� et. al.��� 6)*��GLY1����������� ��

����� �������GCN4� �$����%�� et. al.��&''�#�1��������� et. al.��&''�)�����BAS1�

�1��������� et. al.�� &''�)*� �7����� ����������� ��� ����������� ��� ��� ����� ��

������ ��������������� ���������������������������������-.���*� �3����

����� �������������� ������������� ����� ��������������.����������� ����

���� ��� ��� �� ������ ��� -.���*� � 1���� � ����� ��� ���� �� �������>�� ����

�������� �� ����� ���)������������������������ ���������GLY1���������,���

������*���

� �"6�

4��� �� #:-�#))���� �)� �����#�� �����"� ���#��'��)�)� ���� �)�

�#-#��#�������,#��$��(�'�(��*��&���)#���#�����<��-�

/�� ��� ����� ��� GLY1� �������� ���� �� �������� ,���� GLY1� ���� �� � � ��� ���

������������-.������� ���� ��������� ����������*� �3��,� �.���� ����gcn4∆�

������� ,� ��������� ,���� �� GLY1::lacZ ���� ���� �������� ��� β.

�� ������������������������������������������������������178�����������

178���������� �����,����� ������-.�����������*��+����������� �������

-.�������������GLY1���������������,� �.��������� �����������������

��������� ��5�������������* )*� � +�������������� ������GLY1���������,���

��� ����� ��� ���gcn4∆ ������� ����,��� ������� ��� ���,� �.���*� ���,��� ��� ���

��������-.������ ������� ��������������GLY1 ,������ �,� ������� ���

,� �.������gcn4∆��������������.� �3��bas1∆������������ ��� �,��������������

GLY1�,��� ������,���� ���,� �.���� ��gcn4∆�������� ������� ��� ���� �����������

����*� �3���� �� �� ��������� �������� ��������������������������� ���GLY1����

���� �� ����� ���� �� �� ������ �� ��� ��� ���� ��� ���� ��� -.���� ����� �����

� ����)����������������������������������������������������������� �������

-.���*� � 3�� � �,� ���������� ��� ��� ��� ���� �� ��� ��� ��� ����� � �� ��� ���

����� � ��-.������������������������������������������*�

� �"!�

�� � � � � � ���

�� � � � � � ���

!�"��#�>��:-�#))�����&��� �����������,#�%�(���*-#.�����∆∆∆∆��������∆∆∆∆� �����)�

&�((�%��"���),�&�� ������#��'������������)���� #��� �)�--(# #��#��%��,�$�����)�

��#����'��������)��

E�������� ��� GLY1::lacZ ���.�� ���������� ��� � �� ������� ���� ��� ��,��� ��������

�� �,��������������������������������������,� �.����������;B�6�"������gcn4∆ �������

���� ���� bas1∆ ������� ���� ��� 178������� ���� 178� ����� ���� ����� ,���� �������

����� ���*� ��� ���178������*��*�,����� ����*��*�,����-.���*��*�,���������*� �3����

�������,������������������ ����� ���� ������������ ���������������������������

����������������������� ������������,��������������������������������������*���

���

���

���

$��

���

%��

� + �% �$

����&'�(

/�������&�������&'���#����#�� (

&

���

���

���

$��

���

%��

� + �% �$

����&'�(

/�������&�������&'���#����#�� (

���

���

���

$��

���

%��

� + �% �$

����&'�(

/�������&�������&'���#����#�� (

���

���

���

$��

���

%��

� + �% �$

����&'�(

/�������&�������&'���#����#�� (

� �" �

>���)��))�����

2�.������ ����� ���� ��� ������ � ��� ��� ��������� ��� ��� ���� � ������

��� �����������������������������������������������������*��3������ ���������

��� ���� ��� ��� ��� ��� ����� ���� �� ������ -.���� ���� �����)� ����� ���

GCN4������������������������ ���������������������,��*��;����GCN4�����

BAS1� �� ������������ ������� ����� ��� S. cerevisiae �� ������ � ��� ������ ����� ����

����� �� ��.������ ����� ���� ������ �� �7������.����� ���� ������ � &#�

� ��� et. al.�� &''�)*� � 7 ����� ���GCN4� �� ��� ��� ��� ������ ��� ����� ,���

�,������ ��� �������� ��,����,���� ��� � ����� ���BAS1� �� ��� ��� ��� ��,���

����!�����*��3����� �������������������������������������������������������

�������,���������������� ����������������������,�����������BAS1��������

���� ��� ��� ������������� ����������*� ������ ��� ��� ���������GCN4��BAS1�����

������������������������� �������������� ��������� ���������-.����

����������������������������������*���

� ��,��� ��� ������ ��� ������ ������ ��� ���� ��� GCN4� �� BAS1�

������� ,� ������� ��� ��� ���� ��������� ��� -.���� ����� ��������*� � 3����

���,�������-.�������������������������,��GCN4�����BAS1������������ ���

��� ��� ����������� 4�����*� � -.���� ������������ ��� �� ���� ��� ������

�$����%��� ���� ����������� &''&#� $����%�� et. al.�� &''�)� ��� ���� ��� ��� � � ����

SER1��������������@ �� et. al.��� �)�������������� �������GCN4������������

������� ����������������������������������*��GCN4���������������� ����������

���������������������������������,���������� ���������-.�������������������

���������� ��� ��� ��������� ��� -.������� ��� � ����*� � 3����� GCN4� ������ ���

�� ���GLY1� �������� ���� �������� ����������*� � 3�� �� ��� ��� ��� � � ���

���� ��� ��� ����� � �� ������ ������ ���� �� �� ��� � ����� ���GCN4��,����� ���

� ��'�

4���� ��� ��� �� ������ ��� -.���� �����������*� � 3�� ����� ���� ��� ��,�

�������� ��������������ser1∆�����������, ������� �������������������������

-.����������� ���������GLY1�������������������,�������-.����������������

��� ,������ ��� �� ��� ��� ��� ������ ��� -.���� ������ ��� ����������� ���

����������*���

� 8���� ��� GCN4� ���� �� ��� ��� ������ ����� ����� ���� ��������

����������#� ��� ��� � ��� ������ � ����� ��� ��� �� �� ���� ����������� ��� ������ ���

������������,������������ �����*���������������������������������������

GAP1, BAP2, CAN1 ��� AGP1�,� ����� �� ���������� ��� ������������"/3� ��� ��

GCN4������������� �$����%�� et. al.��&''�)������MUP3� ����LYP1���������

�����#����������������������������������������������������������������� ����

� �*��3�����5����������������������������������������������������������

���������� ��� ��� ������ ����$����%���et. al*��&''�� �$����%�� et. al.��&''�)*� �3���

���� ���������� ��� ��� ������������ ��� �������� $/7�� 3���� ���� ������

������� ��������� ���� ���>��� /*� � ����� ��������� ���� ���� ��� ��������� ���

�����������������,�������4��������������������������,��*��3������������

������������� ������ �������������������������������������������� ���������

������ �������������� �������� �$����%�� et. al.��&''�)*� �2�� ������������� ����

�$����%�� et. al.�� &''�)� � ��� ������ �����FOL2� ,����� ��� ���� ��� ��� ��� �� ��� �����

��������� ,��� �� ������ ����*� � 3����� ��� ������ ��� ����� ������ ��� ���

gcn4∆�������� ���� �� � ��� ��� ��� ��� ������������� ��� ������� ��� �������� ���� �� �

,����� ��� 4���� ��� ��� ���������� �� ��� ��������� ��� ��� ������ ������

����� �������,�������������������*���

� $��� ����������� ������������-.�������������������������������

GCN4�,������������������������*�������������������������,�����������

� ����

���������-.������������� ��������������������������������,�,�����������

����������������������� �,���������*��

� ����

������������� ���������������������������������

�������� ��������������

������� �������������������������������������������������������������������������

��� �� ��� ���� ����� ���� ������ �� �� �������� � ��� � ����� ��� �� ����� ������������

������ �� ����� ��������� ������ ������������ �������������� ����������������

������ ������� � ������������������ ��� ���������! �� ����� � �� ����� �"����������

������� ������ �������������������������������� ����������� �����������������

�� �! �� ��������������� ���������������� ����������#�����������������������������

����������������������$��������������� �%�� �������� �! �� �����������! �� �������

������������� ������ � #���� �������������� ��������� ��� ���� �������� �� ������� ���

��������������� ������������ ���������� ��������! �� �����������������&������������

������� �'���� ��������������� �������������������(�������������������� ���

�� �����������������������������������������������������)*���� �� ��������++,&�

#����� ��������++-.&� ����� ��������� ���� ��� �������� ����������������������������

������� ���������� ����������� �%�� ��! �� ������ ���� ��������� �� ��������

"�������� ���� �%�� ������ �� � ! �� ���� ������ ����������� �� ���� ������� ���

�� ����������� ����� ����� ��� �� �������� ������� ��������� ��� ��������� �� � ������

���������������� �! �� ����� �#������������� ���� ��� � �������� ��������������� �� ���

�������� ���������������� ������� �������������∆���������������� ����� ����� ���

�� ���� ���� ��� �� ���� ���� ����� � ���������� ! �� ���� ��� ��� ������������ � ��� ����

��������������� �������� ���������� ������������������������ ���������� ���!

������������������� ���������/� ���/� ����/� �����/� ��)"��� ��� �������

�++�&�0����� �� ��������--1.���������������� �������� ���������������������������

�������� ��� �������� ��� �� ���� ��� ���������� ���� ��� ��� � ���� ���� ��� ���

� ����

� ��������������� �! �� ���� ��� � ��� �� ����� ����� �� � ������ ���������� ������

� ��������������� ���� ���� ���������� ��� ! ���������� ����������� ��� �����������

�������������� ����� �#���������� ��������� � �������������������� ��� ���������

�� ���������������������� �����! �� ������ ������ ������ ����������������� �������

������������������ �������������������������� �������� ������ ��������

������ �������������� �����������!" �����������# ������

�������

������� �������������� ��������

! ��������� ��� �� ����� � ��� ! �� ���� �� � � ���� ��� ��� ������ ��� � ��� ������� � �

! ����������� �� � ���� ����� �� � #��� ������������� ��� ! ��������� ��� ������ �����

������ ���� )� ��� � ���� ��� ������ ������ ��� ����.� )2��� � �� ����� �---.��

����� 3�"������/����������������������������������������0�������0���4�

)3��(���+++.���3���������������������������� ����� ���������������������! �� ����

��� ������������� ��� �������� ������ ��� �������� ��� ������ � #��� ����� ���� ��� ����

������������� ��� ! ��������� ��� �� ����� � ��� ������������� ��� ������������� ���

�����������������������#��������� �������������������! ��������� �� ��� ���������

������������� ��� �������� )���.� ��� ������������� ��� ����� )���.�� ������

����� ���������� ����������������)5��� ��1��.����

� ����

���������

����������

��

�������

������������

������������

������

��

�������������������

���������������

��� �� ����

����

����

����

���

�����

�� ��

$�! ��������� ��������%���&� ������� �����������������������

����� ��� ����� �� ��������� ��� ���� ������������� ��� ! ��������� )5��� �1��.��

��� ��� ������������������������������������� �����������������/63�����������

������ ���� � ������� ��� � ��� �� ��������� � #��� ������� ������ ���� ��� #���� ��1� ���

3��� � �� ����� ���� ���������� ��(���� ����� ��� �� �� ���� ������� ��� � ��� ���� �

�� ��������� � #���� ��� ������ ��� ���� ��� ��� � ��� ���� ��������� ��� � �� �� �����

��������� ����� ��� ���� �����%����� ���������� ����� � ������ �� ���� ����∆� ������

����������������1���� � ������� ����� ������ ����������� ��� ����� � ��� ��������

���� �� ���� � 2�� ���� ���� � ����� �� ����� � ����� ��� ���� ���� ���� ��� ���� ����∆�

�������� �������� ������� ������������/���������������������������! ���������

�������� ����������������������������∆���������� ������������ ����������������

���� ������ ���� ������������ �����������������! �� ����� � �������� )#�������� ���

5��� ����1.���#���������� �����������������������������������������! ������������

������������ ������ �������������������∆����������� � �� ���������������� �#���

��������� ��� ������ �! ������������� �������7!3� ���3��� ��� ����������� ����

� ��1�

������������������������! �� ����� �! �� ����������������������������������������

! �����������#����� �����������������������������(��������������������� �%�� �������� �

! �� ������ ������ �������������������������������������� �������! ������������

������� �����������!" ���������

���������������� ����������������������������������������� ��������������������������

��� ! �������� ��� ! ��������� ��� ������ ! γ ����������������� �������� ��� γ

���������������������������)'���.���#�����������������������������������)��������

�������������������������������������.�������� ��������������������'�������������

��������� ��� ����� )' ��� � �� ����� �--,&� !��� � �� ����� �++�.�� � ���� ���������� �� � �����

����� �� ��� ����� ��� ������ ��� ����� � ������� �� ����� �� ��� ������ ���� ��������� ���

��������� ����� ��� ������� ��� ���� ����� � '���������� ��� ���� ����� �� �

� ��� ����� ����� ����� � ���� ���� ���� ���� ��� �� ���� ������ ��� ���� γ ��������

������)2��8����-4-�.����

����� � �� ���������

�� ��������������� �������

��� �����

���

����

����� ��� �� ������������

�������

$�! ��������� ��������%���&� ����!" ������������������������

� ��,�

6�������� ������� ��� ����� ��� ����� �� �� ���������� ����� /63� �������

����������� ����� ����������&� �� ����� � ����� ��� �������� �� ������ ���� ���

#����1�����#��� ������������������������������������� ������� ���������������������

��� ����� ��� �� ����� � ������ �������� ���� ��!�∆� ������ ��� � ��������� ����� �

��������� ��������� ��������� ��������� ��������� ��� ��� ������!�∆�������� �#�����

������ �������� �������������������� ��� ������ ��������

� ��4�

���"��������"�!�%�����'��� �"��!���������������"���""� ��"�������"������� ������

���� !" ��������� ���� �������� !����� ��� ()�� ������ � %%"�������� &���� *� µµµµ+�

!" ��������� ����� �� ������ ��� ���������� ����������� �#���� ����� ��� ��� �� �����

� �����(������������������������� ��� ��������9���� ���������� ���������� ����

���� ����� ���������� � �������� ��� ������� �� �� ���� ��� ���� ��� � ����� ���� ��

������������

� ,����

��"������

��!�

%�����-�.�

)� �"��!������

-��/�().�

0)1**���������

������23��

-��/�().�

," ������������� �������� ��!�� �� �����±�+���� ��91�±�+����� ��!�� 1� 1�,��±�+��,� ��-9�±�+�+9�

� � � � �

��� ��������� ���� ��������� ��� ������ � ����������� ��� �������� ���� �������∆�

������ ������������� ��� ����7!3����� � ����� � ����� ��� �� ����� �������������

*����������������5��� ��1������������������������������� ������ �������������������

� ������������������� �������������� ��������������� ������� ������������������

���������� ���������������������������������∆���������������#����������������

���������������������������������������������������������� ������������������������

�� ���� ���� � � ����� ���������&� ������ ���� ������ ��� ����������� ��� � ����� ������ ���

�������� ����������� � �� ��� ��� �%�� ��� �� � ���� ���� ��� ��� ��������� ��������������

������� ��� ������� � ��� ��� ����� ������ ���� ����������� ����� ���� ���� � ��������� ���

��������� � ��� ��������� �� ���� ���� � �� ����� ����������� )!��� � �� ����� �++�.���

������ �� ���� ��� ������ � ������ ��� ����������� ��� ����� � (����� �� ���� ����

������������ ������������������������ �����������∆�������)5��� ��1��.����������

���� ��� ����� ��� ����������� ��� ������������������ ��� ��� ��� �� ���� � ���(� �� � !

�� �������

� ��9�

�4� ���� ���������"� ��# �������� ��� ��������� ��� ���� ���� ����

���� �������������� ����������!" ����������

2�� ��������������(����������� ����������������������� �! ���������� �������������� �

�� ����� ������� ������ ���� �������� ��� ! ��������� ����� ������ �������� ����

������� ���� ���������� ���� ! ��������� ���������� ��� ����� � ����� �� ��� ����

��������� �%�� ������ �� � ! �� ����� �:����� ���� ����∆� ������ ������� � ��� �� ����

�� ��������� ���� ����∆� ������ ���� ����� � #���� ��� ��� ���� ��� ���� ����������� ���

������������������������∆��������� ��� ����������������������! �� �����������������

�������������������∆���������#�����������������������������������������������

������������� �����������∆��������������������������������������������! �� ����

��������� ������ �������������

� ��-�

����

����

� � �

���� ���

������ ����µ�������������

��

$�! ��� 4� �������������� ��� !" ��������� -µµµµ��"5�*3� ��""�.� ��� ���� &�"��� %�� ����

��� ∆∆∆∆�� �������""�� ������������������������������������������ ����� ��������

#������� ������ ���;<�4���)����������∆�������)������� �� �����������������#�������

������ ���;<�4���)����������∆�������)������� ��� �����������������#������� ������

��� � �� ���� ������ ���������� � �������� ��� ������� ��������� �� ���� �� ��� ��� ����

������� �������������������)µ���=�+9������.���������� ��������������

� �1+�

4����� �����������%���%��"�%����

7����������� ������������������������� ���� ����������� ���������� ��������������

����� �� �� ���� ���� ��� ����� �� ������ ��� ���������� ���� ��������� ��� ���� ���

�������)>����� ��������--�.���#�� �� �����8� �����������������������������������

���� ����� ����������������� )73.�� �������������������� )7?.��

������������������)7�.���������������� ����)7/.&�������������� ������� ����

���� ������� �������������� ��� )7'.� ��� � �������� )3!.� )3 ��� ��� ��� ���

�-9-.�� � 73�� 7?�� 7�� ��� 7/� �� ��������$��� �� ���� ��� ���� ���������� ���������

)?*.��������������������7?������������$������������������� ��)������*����� �������

�--1.����

� 7/��7?�����73���������������$���� �����������������)7".��������367

6'� ��������� 1@ �������� ���������� ��� ������ ������ 7?� ��� 73� ��� ���� ���

��������$����������>�������)367 �����������367 ����������.������)3 ���

��� A�����$�� �--,&� 7������ �--�.�� � /������ ���� �8� � ���������� 73� ��� ���

�� ����� � ���7"����367 6'� ��� ���� �� ��� � �������������������� ���7"�

��������73�������������� ��������������� ���� �367 �������������)"�(������� ��

������-9+�.���7����������� ������������)3���.���� �������������������������� ����

����� �� ����� ! �� ����� ������������ ��� �������� )3 ��� ��� ��� ��� �-9-.���

0������ ���������� ��� 7/� �������� )"�(������ � �� ����� �-9+�.� ��� 7/� ��� ��������

)# ���� � ��� B���(� �� �--1.� ��� ���� ��������$�� 73� ��� ����� �� ����������� �����

������������ �������� �� ���� �������� ��� ���� �������� ��� ��������� )>������ � �� �����

�-99.���?��������������������� ������������������$��7?����73��������>�������

�����)3 ��������� ����-9-.���?������������������������������������������

��� ��������� ���� >������� ����� ���� ������� ��� ���� ���������� ��� 73�� ���� ��������

� �1��

�%�� ��� ��� �� ����� � ��� ���� �� ���� � ��� 73� ������������ ��� ���� 367 6'� �����

)0�'���� ��������--�&�0�0��� ����;������--�.����

� #��� ����������� ��� 7/� �������� �������� ��� 73� ��� 7�� ��� ��� �%�� ��� ���

���������� ���� �� ��� ��� ���� ���� ���� � ��� ��� ���������� � ���� ����������� ���

������������ ���������������������������������� ���������������&������� �� ����

�� ����� �������������� �������������� ������ ��� �����������5� ��������

�� ��� ���� ��� 7�� ����� ���� ��� � ��� ���� ��� 7/�� �"�(������ � � ����� )"�(������ � �� �����

�-9+.������������������� ���������� ��������� � ��� �����������! �� ���������

7/�������� ������7?��� ��� ��� ������73�������� ����� �����������������������������

7/������������73������� ��������7/�������������������������������� ����������

���� ���)>����� ��������--�.���0�������������������7/�������������������������$��

������� � � ����� ��� 7/� ������� ����� �� ����������� ����� ����� ������� ��� ! �� ����

)"�(������ � �� ����� �-9+&� "�(������ � �� ����� �-9+�&� C�(�� ��� <������� �-9�.���

2��� ������ ������ ������� �%�� �� ������������ ���������� �� �������� ���

������������� ����������� �� �����)"�(������� ��������-9+&�"�(������� ��������-9+�&�

C�(�����<��������-9�.����

4����"��������"�������6����� �%���&� ��

��� ������ �������� ��� ������ 73� ��� 7?� ��� ���� >������� ����� �������� ����

��������������� �� ���� )"�(������ � �� ����� �-9+�&�7����� ���>��������� �--�.�� ����

�!"�∆�����������������������������7/������������� ����������������������������

7/� � �������� )"�(������ � �� ����� �-9+.�� � #���� 1��� ������ ������� ��� ���� � �����

(�������� ��� �!"�� ������ ������ ���� � � ����� ��� �� ����� ����������� �������������

#����!"�∆�������� �����(������ �������/63���������������������������������

����� ���������� �! �� ����� ������� ���������������� �������!"�∆������������ ���

� �1��

�� �������� ��� ���� ������� ��� ��������� ����� ������� �� �� �������� � :�� ��� ����

����������! �� ���������� ����������������������! �� ���������������������!"�∆�

������� ������������� � �� �������� ��� ��� �������� ���������������������

�����������

���"�� �� �������� ���� ���������� !��&��� 7�������� ��� ���� ��"������ ��� ���"����

� 8����%����� ��������()��������&����� %%"�����������������"���'�������������

������9���23��� ��� �#���� ��� ��� ������ ������ �����(������������!"�∆�������

��� ��� ��������9���� ���������� ���������� ���������������������� �����������

������������ �������������� ���������� ��������������

+��� �� ��!�%�����-�.� )� �"��!������

-��±±±±�().�$���"�0)1**���������

������23�

���������� � � �

/63�D�3�������� �� ��91�±�+���� �����±�+����

/63�D�/� ���� �� ��+1�±�+��,� ���1�±�+����

/63�D�/� ����D3�������� �� ��9-�±�+���� ��41�±�+����

� � � �

������������� � � �

/63�D�3�������� ��� ���+�±�+��4� +�4�±�+�+1�

/63�D�/� ���� 9� ��9-±�+���� ��1��±�+��4�

/63�D�/� ����D3�������� �� �����±�+�+9� �����±�+����

� � � �

� ?�� ������� �� �� �� ��� � � ���� ���� ���� � �� ����� ����������� ����� ����

���� ���� �������∆��������� �� ���������� �����/63�������� ����������������

��������)#����1��.�� �#�����������������������������/63���������������� ����������

����∆�������������� ������ ��������������������������������������������������� �

�� ����� � ������ � #��� ��� ������ ��� ���� ���� ���� ��� ����������� �����������

�����! �� ������� �����!"�∆������� ���������� ����! �� ���� ��� ����� ����������������

������������ ������ ��� ������ ������������� ��������������������������!"�∆�

��������������������������$����������������������������������������������������

� �1��

��������� ���������������������� ��� ��������������������������������������!

�� ������������

� �

���"��4��������������"�����������"�!�%�������������"��%����"������� �������������

����&�"��� %��������� ∆∆∆∆�� ����� �����23��� ����������������������������#����

��� ��������� ������ �����(������������������ �����������∆���������� ��� ����

��� �9� ��� ��� ���� ��� ������ ��� � ���� ���� ��� ���������� � �������� ��� �������

��������� ������� ������������� ���������� ���������������

+��� �� ��!�%�����

-�.�

)� �"��!������

-��/�().�

$���"�0)1**���������

������23��-��/�().�

��:�"��� %���;2<24� � � �

/6� �� ��9,�E�+�+9� �����E�+�+-�

/63� 1� ����E�+���� ���9�E�+�+9�

/63�D��������� �� ��94�E�+�+1� ��94�E�+�+��

/33�D��������� �� ���-�E�+�+-� ��1�E�+��1�

� � � �

����� ∆�� ����� � � �

/6� �� �� ��

/63� ��� ��+��E�+�+9� ����E�+�+1�

/63�D��������� ��� ��1�E�+��,� ��9�E�+�+,�

/33�D��������� ��� 9�E�+��1� ����E�+�+��

� � � �

� #��� ������ ��� ����� �*C"� ��� ������ ��� ��� ���� ��� ������� ��� �������

�� �������)!��� ��������++,.�����������������������(������������� ��� ��� ��������

� ������������ ���������� ���� �%�� ��� �� ��� ���� ��� ���� �������� ��� ���� �����

� ��� ���� ��� ����� ���� ���� ������������ ��� ��� ����� ��� ���� ���� ��� ��� �����

�� ������� )3���� ���3 ���� �++4.�� � ����� � ��� ��� ��� ��� ���� ��� ���� ���� ��

�*C"� ����� ������ ��� ��� ��� ������ ���� � ����(� ��� ����>������� ����� �� �

���������� ���������� ��� ���� ���������� �� � ���� ��������� ��� 7/� �������� ���

�*C"����������)3�������3 �����++4.����

� �1��

4������%����� "�������� ���������

7���������� ����������� � ���� � �������� ��������� ��� � ����� �������������

" ��������� 9F���� ��������� ��� ����������� �� 7/�� �"�(������� � ����� ����

�����������!"�∆�������� ���������������7/����������� ��������������� ������ ���

�����������������������������������������)"�(������� ��������-9+&�"�(������� ��

����� �-9+�.�� � ���� ���������� ����� � ��( ������ � ������� ��� ���� ���� 7/� ��������

��������� � ������� 7/� ��� ��������$��� ��� �������� ������� �������� 7?� ��� � ��� !

�� ����)>��� ���-9+.����

� 3������ ��� ���������� ����������� ��� ������ ��� � � � ���� ��� ���� ��� ��

���������� ���� ������ ��� �� ����� ����������� �� �� ������� ��� ���� ��� �

�� ����� ���)#!3.������� �� ���������������������� ��������������������������

����� ���� ���� ������ ��� ����∆� ������ ������ �� �� ���������� ����� /63� �������

�������� �������� ��� ! �� ����� � #���� ������ � ��� ��� ����� �������� �� ��� ��� �#!3�

���� ����� ������� ��������73��7?����7/�)5��� ��1��"����;.���6��� ��������

�������� ����������������73��7?����7/����� �� ���������� ������������� ��

73��7?����7/�������������������������

� 5��� �� 1��"� ������ ���� ���� ��� ����� ����������� � ��� �������� ���� �������

���5��� ��1��;����� �����������∆�������������� �#������������������������������

����������� ������ ����������������� ��������0�� �������0���������#�� ��� ���

������� ������������� �������� ������� ����������������� ������������������

#��������������������������� �73��7?����7/������������ ������������ ��%���������� �

��� ��������� ������ ����������������∆�������� �#����� �������������������������

������ ��� ! �� ���� ��� ���� �� � ���� ���������� ��� ������������ ������ ��� �� ��� ���

����������� ����� ����� �������� ���� ���� ���� ������ ��� ����∆� ������� ������ ��� ����

������ ��� ������������ ��� ������� ��� ! �� ���� ��� ������� �� � ���� ���������� ���

� �11�

����������� ���� ���� ���� ������ ������ �� ���� ��� ��������$�� ���� � ���� ! �� ����

��������������������������� ������������� ����������������∆����������������

�����������������$��! �� �������� ��� �����������

� 0� ���� �� �� ��������� �%�� ������ �� � ���������� ���������� �� ���� ����

������� ����� �������� �������(���� ������ ���� ��������� �������������� ���� ��� ����

�!"�∆����������������������������������� ��� ���������������)#����1��.���#���

��������������������������� ����������������������������∆�������)#����1��.����

� �1,�

��:�"��� %�� � �

�����������������������+�����������������������������������������������������������������������������1��������������,���

����� ∆∆∆∆�� �����

���������������������+�����������������������������������������������������������������������������1���������������,���

$�! ���2��#������ ����������������� ����������� ������������� ������ �������

�#!3����� �������#������ ����������������� �����������∆���������������#���

���� �������������73��7?����7/� ����������� ��� �����)���.���

� �14�

2�(%���������# �������������������������%�������� ��������

��� � �� � ��� ������ ���� ����� �� � ��������� ! �� ���� ��� �� ����� ������� �����������

���������� ! �� ���� ��� ����� ��� � �(� ��� �� ��� ��� ���� � ���� ����� ������ �� ��

������������� ��������� �#��� ������ �������� �������� ���������������� ��������

�����������������(���� ���������! �� ����� ��������������������� � �����������

������ � ���������#������� ���������� �� �������������������� ������������ ���

��������� ����������� ������������ ���������������#3"�������� ��������������� �

�������������� ��� �������������#������������� �������������������������������

����#3"� ������������ �������������� �����������∆������������� �������� ����

���5��� ��1�1���#��� �������������������� ! �� ��������(������ �����������������

�������� ������������ ��� �������������������∆����������������� ���������������

��� ���� ����� ��� ���� ����� ��� ���� � ���� ����� #3" ��������� ��� ����

����������������� ���������

� �19�

��

��

���

���

���

� � ���� ��

��� �������� ����

$�! ����4���������������������� �������������%����%����"���������"����&�"��

� %��������� ∆∆∆∆�� �������""������������������������������������������

*��������� ������� ����� ! �� ���� � ��� ���� �������� � ������� � ��� �������� ���� �� ���

;<�4���)����������∆�������)��������������������������������� ����������� ������ ���

;<�4��� )��� ��� ����∆� ������ )���� � #���� ��� ������ ��� � ���� ���� ������ ����������

� �������� ��� ������� ��������� �� ���� �� ��� ��� ������ ! �� ���� ������� ��� 0;%� �����

���� ��������������

� �1-�

� #��� ����� � ������� ����� ! �� ���� ������ ��� ���� �������� ��������� ����

�� ����������������������(�����! �� ����� ����� �� �������� ���������������������

� ������� ������� ! �� ���� ��� ���� � ����� ���� ������ ��� ���� ���� ���� ��� ����∆�

������ �� �� � ���� ��� � ��� � ����� ��� � ������ ��� �� ����� � ��� � ����� ���

�� ����������������������� ������������ ! �� ����)4����0�����4+�;%=��.��������

���� � ����� ����� � ����� ����� � ������� ��� ����� ���� ������� � 5���� �8� � ������ �

� ��������� ����������� ���������� ������������ ������������0�� �������0���������

#����� ��������G� ����� ���� ������� )3:.&� ���� ������ ��� � �1�+++� �� �� ���� ���������

)7�1(.� ������ ��������� ��������� ��� ���� ���� ���� �������� ?*� ���

� ��������&�������� �������� ��++�+++��������� ���������)/�++(.����������������

���� �������� ������ � ��� ������ � �������� �������� ���������� ������� ���

������� � ��� �� ���� ��� ������&� ���� ������� ������ ��� � �++�+++� �� ��

���� ��������� )7�++(.������� ���������'������ ���������� ������������� ��� ���

� ��� �� ��������&� ��� ���� ����� ����������� � 5��� ��� 1�,"� ��� ;� �����������

������ ��������� ����������� � ���������������� ������� ���������1���� ��������

��� ��� ��������� ��� ������������������� ����������� ���������∆����������������

2�������������# �������������� ���""����%�������

#��� �����������(� �������� ���������� ��� ��1�+++����� ���� ��������� )7�1(.�������

���������������������� ����������� ������������?*�� �� �����������������

��������������������! �� ���� �%�� ���������� �����������#��������������������� ��

�������� ��� ����� � � ����� � � �� ����� ������ ����� ��� ��� ���� 1� ��� ��� ��� �

������� �������� ���� ��� ��������∆������� ������ ��� ����� � ������� )5��� ���1�,"�

���;.��������� ��������������������������������������������� � �������� ��������

������������������������� ������������ ����������� ���������� ��������������

� �,+�

#��� ��� ����� ���������� ��� � �++�+++� �� �� ���� ��������� )/�++(.� ������

������������������� ������� ���������� ��������������������������� �������� �

������� � ��� �� ���� ��� �������� � #����� �� �� ���� ���� ��������� �� � ������

��� �����������! �� ����������� �#������ ������ �������� �������� �������� ����

��� ����∆� ������ ��� ��� ����� ������� ��� ���� � ����� ��� � ��� ��� �� ���� �����

� ������������������ ����������������! �� �������

#��� ��� ��� ��� ���� ������� ������ ���������� ��� � �++�+++� �� �� ���� ���������

)7�++(.� ������ �������� ������ ���������� ���� ���� ������� ��� '������ ���������

���� ���� ��� � ��� �� ������������� ���� ���� ���� ���(� �� � ���� ��������� ! �� ����

�%�� ������ �� ���� �� ��������� � #��� ������� ��� ���� � ����� ��������� � ��� �����

� �������� ���� �� ��������� ��������������� �� ����������� ��� �������� �������

��������∆������������� ��������������

2����������������%�������������%���%��"�%����

5��� ��1�,������� ��������� ���������� ���������! �� ���������������� ������������

��� ���� � ���� ��� ���� ��� ���� ������������ 7?�� 73� ��� 7/�� � #������� ���� ������

������������������������������73�������������������� ���������� �����������73����

7/����� �� ����������������� ������� ������������������� ����������� ���� ��������

�� ����� ������������ ���� ������� ��� ! �� ���� ���� � ���� ��� 7?� ��� 7/� ��� ������

��� ��� 73� ������� ��� �������� �� ��� ��� ��� �2�� ���� ���� � ����� ���� � ������� ���

! �� ���� ��������� ��� 7?�� 73� ��� 7/� ����������� ��� ���� ����∆� ������ ������ ���

��� �������� ������� ��� ��� ����������7/� ��� ����� �������� ��� � ������ ������ �����

��� ������ ������� � �� ����� ������������ ����7?� �������� ����� ���� ����������73�

������������ ��������7/� ��������������������� ��������������������� �� ��������

���� � � ����� ������������ �1F� ��� ���� ����� ����������� �� 73� ��� �+F� �� 7?&�

� �,��

������ 1+F� �� �� 73� ��� �+F� �� �� 7?� ���� � �� ����� ����������� )H������ � �� �����

�-,9.���2� ���������� ������� ���� ���������������� ��������������73������������

��� ���� ����� ������ ��� ���� ���� ������ ��� 73� ��� ����� ����� ������ �� �� �������� ���

�� ��������� ������� �� ���� ������������ �����7?������ ���������������������� ���

��������� ���� )H������ � ��������-,9.������� � ������ �������� ����� � ���������7?� ���

����� � ������������ �2�� ���� �� � ������� ���� ���� ����� ����8� � ����� ������ ��������

� ����� ����� ����������� ��� �������������� �������� ����������� ���� ����� ����� ������

��������������������������������! �� ������������� ���������������������������������

���������� ����������� ���� ���������� �������������������

� �,��

��

��

$�! ���1����������������"���� ��������""� �����%�������&����4��"���"�������������������

��=���%���%��"�%��������&�"��� %���;2<24�������� ∆∆∆∆�� ��������������2��� ��� �����

�������� ���� ���������� ����������� � 7� ����� ��� ����� ������ ��� ����� ���� � ������������

�������! �� ���� ��� �������8� ������������7?��73����7/�� ���7� ������������������!

�� ���� �� � ���� ��� ���� ������ � � ������� ��� ����� ������ ��� ����� ���� � ���� ��� ���� ����

;<�4���� ��� ����∆�������� �#���� ��� ��������� � ���� ���� ��� ���������� � �������� ���

���������������� ������� ����������� ����������� � �������������� ��������������

���� ��!�"� � ��� ��!�"� ���� ��!���� � ��� ��!����

#����� �!����$�� ���!�%!$���$����$�&�!�'�

#( #� #)

���� ��!�"� � ��� ��!�"� ���� ��!���� � ��� ��!����

#����� �!����$�� ���!�%!$���$����$�&�!�'�

� �,��

24���������������# ����������������� �������������""�&�""�%���������

#���������5��� ��1�4"����� ���������� (������ ��� � �� ��������! �� �������

���� � ���� ����� ���� ��������� � ��������� �������� ������ ���� �� ����������������

)�+F���1������1+F��������.���� ������� ����������������)�+F���1�������+F���

����.���#������ �������(�����! �� �������� ��� ���������������������������������

��������� �%�� ������ �� � ! �� ���� ��� ������� �� � ����� ���� �������������� � I��� �

�� ��������� �� � ��������∆�������������� ��������� ��� ������ �! �� �������������� ���

��������� ���� ������� ��� ����� �� �� � (��� ����� 41F� ��� ���� ����� ����� ������

���� � ���� ��������������� ���������� ���������� ����� ��������)������F�� �������.�

)5��� ��1�4;.���#����������������������������� ��������������������������! �� ����

�������������������� ����� ����������������� ��� ������ �%�� ����� � �����������������

���������������� ���������������� ���������

� �

� �,��

� ��

� ��

$�! ���<����������������"���� ��������""������%�������&����4��"���"��������������������

��� ���� ��"" "��� ���������� ���� &�"��� %�� �;2<24� ���� ��� ∆∆∆∆� � ����� ��� � ���� �2� �� ���

���������������������������������������#��������� �� ������� ����������� �������)�:.��

�������� ��� � �1�+++� �� �� ���� )��7.�� ��� ����� ��� � �++�+++� �� �� ���� )(�**7.��

����������� ��++�+++���������)��**7.�������������������)"�%���.�� ����������� ���������

7� ����� ������ ������� ! �� ���� �� � ���� ��� ���� ������ � � ������� ��� ����� ������ ��� �����

���� � ���� ������� ����;<�4������ ����∆�������� �#���� ��� ��������� � ���� ���� ���

����������� ����������� ���������������� ������� ����������� ����������� � ����������

���� ��������������

��

��

��

��

���� ��!�"� � ��� ��!�"� ���� ��!���� � ��� ��!����#����� �!����$�� ���!���!%� �����!�'�

�* #�"+ )���+ #���+ ��$�&�

��

��

��

��

���� ��!�"� � ��� ��!�"� ���� ��!���� � ��� ��!����#����� �!����$�� ���!���!%� �����!�'�

� �,1�

����� �������������""�&�""������%����������# ���������!����� ������

�����������

2�������� ��� ����������������� �� �! �� ���� ������ � ��� ������������� ������ ���� ��

���������� �%�� ����� ��� ������ �����)>����� ��������---&�!��� ��������++1&�!��� ��

������++,&��� �!������ ��������---.���#�������������� �������������������� �������

������������#$����#�%�����&'��%�� )"� ���� � �� ����� �++�&�"� ���� � �� �����

�++��&� 3����� � �� ����� �++�.�� ����� � ����������� ��� J�1 �+F� ��� ���� ����� ����

��������������! �� ����)#����1��.���#������������������� �������������������������

����������� �������� �� 3��� ��� 3��� ������ �� ������������ � ��������

)"� ����� ��������++��&������ �B ��� ��������--1.����������� ��#� � ���6�� ��

���#���)"� ����� ��������++�&�"� ����� ��������++��&�>���(��� ��������--4&�

>����� ��������++�&�>�����������������--�.� ������������� ��� ������ �����������

���� ��������� ��������� ������ � ��� �� �������� )"� ���� � �� ����� �++��&��� ���

��� ������� �++�� .�� � 3����� ��� ������ ���� ����� ���� ������� ��� ���� $'(� ��������

������ �� ����� ���� ������ �� �� �������� ��� �� ����� ������������ 6�� ��� #� � ���

#��� 8���� 3��� ��� 3��� ��� ���� ����� ����� ������ 3��� ��� 3��� �� ����

����������� ��� ������ �����)"� ����� ��������++��.�� �#������� ��������������

������ �� ������� ��� ���� ��� ������������ ����� ������� )#�������.����������� ����������

�#�%� ��#$�����&'�������������������������������� ��������������� ��������)���

' ����� ��������++4&��� �!������ ��������---.���"� ����� �����������������#� ��#���

�#� �&'��%�� ����������� ����������� ���������������������������#������#��

�� ��������� �� � �� ����� � ������ ������ �� �#�� ��� �������� ��� �� ��������

)"� ����� ��������++�.����

� 3���� ������ ������������� ������� ������ ��� � ����� ���������� �� (�����

���� �! �� ������������ )�� ����9�1F.�)/���#����1��� �� � ����3������3��.���

� �,,�

/����� ����� ��� ���� �� ��� ���� ���� ������� �� �������� ���� ��� ������ �� �� ��

�� ������ �����)"� ����� ��������++��&�>����� ��������++�&�!��� ��������++1.���� ��

���������� ��������������������������������������������)!�(�����2�������--9.�

��� ����������� ������� ���������� �%�� ������ �� �! �� ����� ������� �� �����������

��������������� ���������� ���������������� �! �� ���������������������8�����������

����������� ���� �� ���� ����� ������ �������� ���� ����� �����%����� ����������

���������������������������������� ����������

���"��2�> ��������������%����������9�"���" ��� ����������������������""�&�""�

(�����

��?%�����

%�������

����" �

0�� ��0�� @�����

������

�� "�

����� ���

+�"�� "��5

��""�

(������

����� ���

(������5�

��""��

A����

(������

������

��

#��� � √� ��+� �1�,++� 1,� ��--��,++� �����

#� �� � √� �1�� ,��� ,�� �-���-� ���9�

#� �� � √� �1�� �++� ,�� �9�,++� �1���

#� �� � √� ��+� � �-� � �-�

#� �� � √� �94� � ��-� � �+�,�

6��� � √� �-9� 41�� ,+� �1���+� �+�1�

6��� � √� ���� 4-� 9� ,��� ,�1�

6��� � √� ��+� 4-� �+� 4-+� 9���

6��� � √� ��,�� � �,�� � ���,�

3��� √� √� ��-� ,4�+++� 1�� ����4�+++� �����

3��� √� √� -�� ��1-+�+++� �+� �1�-++�+++� �+�-�

3����� √� √� ���� �19�+++� ��� ������+++� �+�1�

� � � � � � � �

0��B��������'���0��B����������'�@��B�@ �����

� �,4�

� <���� ��������� ��������������� ��� ������� ��������� �� ��� �� ��� ��� ���

��������� �������� ��� � ����������������� � 2��� ��� ���� �������� ������� ������

β)�→�.������� ��� ���� �8� � �� ���� �� ��������� ��� ���� ����� ����� � "����� �

β)�→,.��������� ������������� �)3����� ��������++�.���#������he roles of cell wall

mannoproteins include ����������� ��������������� � ��������������������� �������

��������������� �������� ��������)���' ����� ��������++1.���3�����������������������

�� ������� ������ �������������������������� ������%�����������������)3����� ��

������++�.����

���� �� � ������� ������������ ������������ ������������� ���� ���������� � ���

� ����� ��� �� ����� ������������ ����� ����� �� �� � ��� � ��� � ����� ������ ���

�� ����� ������ ��� ���� ���� ���� ��� ����∆� ������ �� ������ �� ���� ��� � �����

����� )/63� �������� /63� ������� ����� ! �� ���� ����������.� ���� � �� �����

����������� ��� ���� � ����������� ������� ������� ���� ���� ��� � #���� ��� ������

��� � ���� ���� ��� ������ ����������0��*��� ��� )�++9�� ;0/5��IC/:.��������

������������ � �����������!3 0/������������������������������������������� ��������

� �� ���� ��� <��� � � ���� )<��� � �� ����� �++1.�� ���� ���� ����� ��� � (��� ����� ������

�������� ���� � ����� ��� �� ����� ����� ��� ���� ���� ���� ������� ��� ����� ��� ����

���� ������� ��������� �� � �� ����� � ����� ��� ���������� � ������ �� �� ��� �

���������� ��� ���� �����������"�C� ������ ���� ��� ���� �������������� ��� #� �� ���

#����������������������������� ������������������������� ���������������∆�

������������� ����������! �� �������

#���� 1�,� ������ ���� ������� ��������� ������ �� �� ����� � ��� ����� ����

��������������� ������� �������������������� ������������������������ ����������

���� ����� ���� ������ ������� � "� ����� ������� ��� ���� ��� ��� ��� ���� "������ ��������

)"������#�����.���"������ ������� ���������������� ���������������#��������

� �,9�

��������������� ������������ ��������������� ���������������)���,F.����� �������

�����������������������∆���������+���� �������� ���� ������)5��� ��1�9����#����

1�1.�� ������ �� ��� ����� ������� ��� �#�� ������ �� �� ��������� ����� ���� ����∆�

������ ������ ��� ������ ���� ������ �� ���� )�,�4F� �� �9� �.� � ������ ����������

�������� ������������������! �� ������� ������)�9F�������.���#���� ���������������

��������������������� �! �� ��������� ������������� ������������������������������

���� �������� ������ ���� ��� ������ � ������ ��� ! �� ���� ��� ���� ���� ���� ������ ���

������������� ������������������������������� �������������������;�������������������

����� ���� �� ��������������� �����������$�� �������������� �%�� ������ �� �! �� �����

��� ��� �������������������������������������������8������������������ �����������

������������������������ ���������������� ������������������ ��������������

����������������! �� �������

� �,-�

��

��

��

�����

���� !�

�����

����

�"�

���"

�����

!�

���"

�����

�"�

���"

�����

"#�

���"

�����

�"�

���� ��

�����

#����� �!�%!����!$�$��&�!%��&!�'�

$�! ���3���������!����������%�%������� ������&�"��� %����""��������� ∆∆∆∆�� �����

��""�����*'��2�����23��� ��� ���������������������������������������7� ����������

�#��������������������� �����������������∆����������������/63����������+����

������ ��9����� ����/63�������������! �� �������������������������

� �4+�

���"���+����(%��������� ����" ���������""�&�""�%�%�������� ������&�"��� %��

������� ∆∆∆∆�� ��������9���� �������%������ �����������������C���

��������� @ ��������������-A������""�&�""�%�%������� ��.�

� &�"��� %�� ��� ∆∆∆∆��� *�� �2�� *�� �2�� 23�� �2�-���.CC�

��&�2%� �1�),�4.� �+�)1�9.� ��)+�4.� ��)���.� ��)���.� ��)��+.��

���4%� 9�)��,.� ���)9��.� 4�)1�+.� ��)���.� ��)�+�+.� ��)9�+.�

����%� ���)1��.� 9�)��4.� 4�)1�+.� ��)���.� ��),�4.� ��)9�+.�

����%� 1�)���.� ��)+�,.� ��)���.� ��)���.� +� +�

�&%�%� �,�)4��.� 9�)��4.� 9�)1�4.� 4�)4�,.� 1�)�,�4.� 1�)�+�+.�

���44%� -�)��+.� ���)4�+.� ��)��9.� ��)���.� ��),�4.� ��),�+.�

,���%� ���)1��.� ,�)��1.� ��)��9.� ��)���.� ��)���.� ��)��+.�

,��4%� -�)��+.� ��)���.� �+�)4��.� 4�)4�,.� +� ��)��+.�

,��%� ���)��-.� 4�)���.� ��)��9.� ��)���.� ��)���.� ��)��+.�

,"��%� �4�)����.� 4�)���.� �1�)�+�,.� 9�)9�4.� +� +�

,"��%� +� �4�)-�-.� �1�)�+�,.� +� +� +�

����%� ���)1��.� ���)���+.� �4�)����.� ���)���+.� +� 4�)���+.�

����%� +� +� +� +� +� +�

���4%� 1�)���.� +� +� +� +� +�

����%� -�)��+.� ��)+��.� ��)��9.� 1� +� ��)��+.�

����%� -�)��+.� 1�)+��.� 4�)1�+.� ,�),�1.� +� ��)��+.�

���2%� ,�)��4.� ��)+��.� ��)���.� ��)���.� +� +�

�� 4%� ��)��9.� ��)+��.� ��)���.� +� +� +�

?���%� ���)�9�9.� -�)1��.� �+�)����.� �,�)�4��.� +� +�

(�&2%� 1�)���.� +� 1�)��1.� ��)���.� +� +�

��%�� ��)+��.� ��)���.� ��)���.� ��)���.� ��),�4.� ��)��+.�

����%� ��)+�+.� �+�)���,.� ��)+�4.� +� 1�)�,�4.� -�)�9�+.�

����%� +� +� +� +� ��)����.� ��)��+.�

���4%� +� +� +� +� ��)���.� ��)��+.�

����%� ��)+��.� +� +� ��)���.� +� +�

;!%�%� ��)+��.� 4�)���.� ��)���.� ��)���.� ��)�+.� ��)9�+.�� � � � � � �

����"D� ��4� �<�� �2�� E�� 4*� *�K6���� ��������� �������)6.����0�������� �� �����������-�%%����8����"���.�

))����∆� ������ �� �� � ���� ������ ���� � �� �������� ����� ! �� ���� ����������� /63�

���������#������� ���������������������������� ����������*������� ������� �����������

����� ����������������������� ���������������������� ���������������

� �4��

1�)��� ������

#��� ������� ������������ ���� �� �������������� ���� ������������� �%�� �������� �

! �� ������ ���������������� ��������������������� � ��������������������������

���� ������� � #��� ����� ��� ���� ����∆� ������ ��������� ���� ���� ������ ���

���� ������������������������(����������������� ����������������� ���� �

������� ������� �� ��������� �������� ������������������ ���� �'���� ��������!

�� ���� �������������� ��� ��� � �� ��� � ��� C� 8�� � �� ����� )C� 8�� � �� �����

�++�.� ��� ���� ����∆� ������ ��� ������ ����� ��� ���� ������ ��������� ��� ! �� ����

������������� �� ���� � '���� ���������� � #����� ���� ������ ��(���� ����� ������

�%�� �� ����� �������� ��� ! �� ���� �� � �� ����� � ������ ������ ����� �� �� ������ ���

��������$�� ���� � ���� ��� ���� � ��� ������ � ���� ��� ! �� ���������� ��� ������� ������

C��� ����������������� �������������(���1+F��������! �� ���������������� �������

������� ��� ����� ������ �������� ���� ����� ������� ����� ������ ��������$�� ���� � ����

���������� ��� ������������������� �! �� ������ ���������������������������� ���

� �� � ��� ��� ��� ���� ���� ���� �������� � #��� ���� ������� ��� ���� ����� ����

����������� ������� ���� ���� �� ���� ��������� � ��������� ����� ������ ��� #� =#��

������ ��������� �� ������ ��� �������� ���� ��������� ����������� ��������������

���� ������ �� �� ��� ���� ��� ���������� ���� )��� � ����� ��� � ���� �� � ����

���� ������ �� �������.�� � "�� ���� ���� ������ ������ ����� ��� ������ ����� ! �� ����

������������ ���������������������������∆�������������)�������� �������� ��� ���

���.�������� ���������������������� ��������� ��������� �����������������������

��� ��9������������������������ ������2���������� �������������������∆���������

��� ����������������������������! �� ��������������������������������� �����

#� =#�� ������ ��� �� ����� �� ��������� ��� ���� ���� ���� �� ���� ���� ����� ��� �

��������������

� �4��

5 ����/�������;�������� ������������������������������ �� ������������

����� ������ ���� ����� ��� ���� ����� (�� ��� ����� ��������� ���� ���� ��� ����������

��������� ���������� ������ ����� ��������� ����� ������������� ��� �������������

������������������� ���������� �#������ ���� �������� ���� ��� �� ������ ���� ����

��� ���������������������! �� ������ ��������������� ����������������������3��������

������ ������������� � �� ��� �(�� �� ���� ��� � ���� � �������� ��������� ���� �

�� �������������������������! �� ������������������� ��������� �������� ���� ����

������� ���������������� ������������������������������������������� ��������

���������2�������������� ������ ���������������������� ���� ������ ��������������

�� ������������������ ���������������

1������"���9���� ��������������������%�����!���@����������������

���� ���������

"������ �������� ������������ )� �������� ����� ���������� �����.������� ��

����4+F�����������������I3I�� �I33�)�� ���������� �� ������*C"��������������

����������.�������� ��������I3"�)���*C"�.��I3'�)���*C".��"'3�� �"'I�)���*C".�

)7� ������ � �� ����� �--4.�� � /� ���� ������ ����� �� � ���� ���� ������ ������ ���

��� ����� ����� ���� ��� ��� �� ���� ������ ����� �� � ��� ������� ��� ������ ���� ���

"������5��� ����)"��;����3.���#���������������������������(�������������������� �

������� �� ������ ������ ��� ������� �������� ��� ���� �� ��������� �*C"��

)7� ������ � �� ����� �--4.�� � 2�� ���� ������ ��� ������ ��� �� �������� � �������� ��� ����

������������������ ���������������������������� ���������������� �����������������

������������� ���������� �����������*C"���������������� ����������������� ��

�� ���� ��� ! �� ����� ���� ������ ���� ��� ����� ���� ������� ��� ��� ������� �*C"�

� �4��

����������� �������! �� ������� ��� ���������� ��������������������������������� �

��������� ������ ����������

174

CHAPTER 6 DISCUSSION

During adaptation to anaerobiosis in S. cerevisiae, demand for L-serine is greatly

increased. This is probably to manufacture anaerobic cell wall mannoproteins, and

this requirement must be met not only from glycolytic intermediates via the pathway

requiring SER1, SER2 and SER3/33, but also from increased synthesis from L-

aspartate via L-threonine and glycine requiring GLY1. It has previously been noted

that SER1 is essential for anaerobic but not aerobic growth in rich medium (Reineret.

al., 2006). The reason why there is a shortfall in L-serine synthesis from glycolytic

intermediates may come from the demonstration that metabolites from the lower

section of the glycolytic pathway decrease quite dramatically with decreasing oxygen

in the medium; this includes 3-phosphoglycerate, which is the substrate for the SER1-

dependent pathway (Wiebe, 2008; Wiebeet. al., 2008).

Gcn4p clearly has a major role in cell physiology that has not previously been

documented and for which the gcn4 mutant exhibits a very strong phenotype that

has not been seen under anaerobic conditions. This general amino acid transcription

factor is required for rapid adaptation to anaerobiosis and it probably functions in this

respect through up-regulation of SHM2, GLY1 and other functions associated with

synthesis of L-serine and one-carbon metabolism such as the glycine-cleavage

reaction. The data also show that in minimal medium under anaerobic conditions the

Bas1p transcription factor is essential for growth. This requirement goes beyond its

involvement in the syntheses of purines (Denis and Daignan-Fornier, 1998), since the

bas1 mutant phenotype under anaerobic conditions was not alleviated by addition of

adenine. This requirement could however, be met by the addition of L-serine, hence

under anaerobiosis Bas1p has a major role in the syntheses of both L-serine and

purines.

175

This work has also demonstrated that the threonine aldolase (Gly1p) is

required for rapid adaptation to anaerobic conditions in the absence of L-serine, and

that GLY1 expression is markedly induced under the same conditions. The induction

of GLY1 was dependent on both Bas1p and Gcn4p, and the lack of GLY1 induction in

the bas1 and gcn4 strains may contribute to their respective anaerobic growth

defects. In addition, the lack of anaerobic induction of GLY1 in the gcn4 strains

might explain its accumulation of L-threonine, and both of these phenotypes were

relieved by L-serine supplementation. Evidence for regulation of GLY1 by Gcn4p

was also observed in transcriptomic analysis (Natarajanet. al., 2001). However, the

effect of Gcn4p and Bas1p on GLY1 expression is likely to be indirect, since the

GLY1 promoter region lacks a canonical Gcn4/Bas1p response element and was not

bound by either transcription factor in aerobic genome-wide location analyses

(Harbison, 2004; Mieczkowski, 2006; Mieczkowskiet. al., 2006).

The cell wall of the human pathogen Candida glabrata governs initial host-

pathogen interactions that underlie the establishment of fungal infections. Electron

microscopy has revealed a bilayered wall structure in which the outer layer is packed

with mannoproteins. Biochemical studies shows that C. glabrata walls incorporate

50% more protein than Saccharomyces cerevisiae walls (de Grootet. al., 2008).

Mass spectrometric analysis identified 23 cell wall proteins including 4 novel

adhesin-like proteins, Awp1/2/3/4p and Epa6p, which are involved in adherence to

human epithelia and biofilm formation (de Grootet. al., 2008).

Candida albicans is a common opportunistic pathogen of the human body.

Infections are associated with the formation of biofilms on host tissues. As a result of

the intrinsic resistance of C. albicans biofilms to most antifungal agents, new

therapeutic strategies are needed (Pierceet. al., 2009).

176

The cell wall is responsible for the specific shape of the cell. This function is

associated with specific molecules. The cell wall not only plays a significant role in

pathogenesis; it is also involved in the host-parasite relationship. The components of

cell wall can act as adhesive molecules mediating microbial attachment to the host

cells, thus initiating the infectious process and there is some evidence that the

mannans are responsible for the adherence to the tissues (Kanbeet. al., 1993). The

status of the cell surface hydrophobicity is linked to the distinctiveness of the cell

walls structure. The surface layer of the C. albicans cell walls contains fibril

structures which are made of mannoproteins (Cassoneet. al., 1978; Trinelet. al.,

1997). The ability of C. albicans to regulate cell surface hydrophobicity in fact

relates to an ability to alter the confirmation of the mannoprotein fibrils (Hazen and

Hazen, 1992). Hence, hydrophobic cells are more adherent to a variety of host tissues

and the pattern of adherence is more widespread (Hazen, 1989; Hazenet. al., 1991).

An intact cell wall is essential for the normal functioning of the fungus, thus

disrupting the wall or interfering with the biosynthetic pathways of some of its

components can be detrimental to the pathogens (Segal, 1994). While S. cerevisiae

has about 20 cell wall genes, some fungal pathogens have more serine-rich proteins

that show homology to TIR3 from S. cerevisiae. For example, analysis of the genomic

sequence of Candida albicans identified many more genes that encode serine-rich

proteins. Many of these genes are annotated as cell wall proteins that are induced by

stress or antibiotics, or they are involved in cell adhesion or pathogenicity (Chaffinet.

al., 1998; Garcia-Sanchezet. al., 2004; Li and Palecek, 2003). Infection with C.

albicans is normally treated by antimycotic drugs such as fluconazole, which inhibits

the biosynthesis of ergosterol (White, 1997). Resistance to anti-fungal drugs has been

found (White, 1997), and the fungal infection can be severe (Sanglardet. al., 1995).

177

Upc2p regulated the expression of a gene which is involved in ergosterol synthesis

(MacPhersonet. al., 2005). A mutant with the deletion of this gene has impaired

growth under anaerobic conditions, and the rendered cells are highly susceptible to

the antifungal drugs betoconazole and fluconazole (Bokenet. al., 1993). Thus, the

overexpression of UPC2 increases resistance to azole drugs (MacPhersonet. al.,

2005). Upc2p increases the expression of ERG genes by directly binding to their

promoters (MacPhersonet. al., 2005) and azole resistance is commonly found in the

over-expression of genes which encode the efflux pumps or the azole target lanosterol

demethylase (ERG11) (Lopez-Ribotet. al., 1998; Sanglardet. al., 1995). If so, then

adaptation of these pathogens to tolerate antibiotics, as well as to anaerobiosis, may

also depend on increased supply of L-serine. Thus, the inhibition or alteration of

L-serine biosynthesis may prevent or inhibit the growth of C. albicans during

pathogenic infection. Azaserine is an anti-neoplastic agent which can cause DNA

damage. Also it inhibits purine metabolism (Levenberget. al., 1957). However, as

an inhibitor of seryl-tRNA synthetase it may have anti-fungal activity, or of in

conjunction with other antibiotics, it may increase the efficacy of these available

antifungal antibiotics. Nevertheless, it will be worthwhile to determine if the

inhibition or the blockage on the L-serine biosynthesis, in order to prevent the C.

albicans infection is warranted in this study.

6.1 Further directions

While Klis and his colleagues carried out an elegant investigation of the mannoprotein

composition of the aerobic cell wall (Kliset. al., 2002), there is now a case to extend

this work to anaerobic conditions. An extensive study following the changes in cell

wall composition during the transition between aerobic and anaerobic conditions can

178

be undertaken, since there are substantial changes in the pattern of expression of the

mannoprotein genes following a shift to anaerobic conditions (Abramovaet. al.,

2001).

Although this thesis has illustrated how the complexity of the mannoprotein

composition and the metabolism in S. cerevisiae are related, there are still several

interesting questions that remain. It is not clear why there is a major requirement for

remodelling of the cell wall mannoproteins during anaerobiosis, nor why there is a

need for an increase in the seryl residues in the anaerobic cell wall. It has been

suggested that almost all of the anaerobic seripauparin genes may be up-regulated to

modify cell wall porosity (Laiet. al., 2005), so that the cell wall can accommodate the

transport and processing of any specific requirements during the shift to anaerobiosis.

Some of this may reflect changes in composition of the cell membrane resulting from

the altered supply of ergosterol and unsaturated fatty acid. The increase in serine

residues may reflect a need for more extensive mannosylation of cell wall proteins

under these conditions, which might be reflected in the morphology of the mannan

layer. However, from the perspective of systems biology, the difference in the

patterns of gene regulation and metabolic networks vary when cells are under

anaerobic conditions. On the other hand, the implication for the hierarchy of

utilisation of L-serine for synthesis of various cell components should provide an

insight into the demand of L-serine. Under anaerobic conditions, the cell wall protein

biosynthesis in S. cerevisiae appears to take priority over that of other proteins.

Although there are numerous studies to determine genes that are up- or down-

regulated during the anaerobic shift, it is still necessary to investigate genes that have

greater priority to be expressed when the cells are under anaerobiosis.

����������

Abramova, N. E., Cohen, B. D., Setil, O., Kapoor, R., Davies, K. J. A. and Lowry, C. V. (2001a). Regulatory mechanisms controlling expression of the Dan/Tir mannoprotein genes during anaerobic remodelling of the cell wall in ��������������� �. ��� �, 157, 1169-1177.

Abramova, N. E., Sertil, O., Mehta, S. and Lowry, C. Y. (2001b). Reciprocal regulation of anaerobic and aerobic cell wall mannoprotein gene expression in ��������������� �. ���������������� �����, 183, (9): 2881-2887.

Agte, V., Gokhale, M. K. and Paknikar, K. M. (1999). Effect of fermentation using baker's yeast on bioavailable iron and zinc from cereals and legumes. ������������������ ����������������, 36, (6): 551-554

Ahmad, M. and Bussey, H. (1986). Yeast arginine permease: nucleotide sequence of the �����gene. ���������� �, 10, (8): 587-592.

Albers, E., Laizé, V., Blomberg, A., Hohmann, S. and Gustafsson, L. (2003). Ser3p (Yer081wp) and Ser33p (Yil074cp) are phosphoglycerate dehydrogenases in ��������������� �. ������������ ���� ������� ���, 278, (12): 10264-10272.

Albers, E., Larsson, C., Liden, G., Niklasson, C. and Gustafsson, L. (1996). Influence of the nitrogen source on ������������ ��� � anaerobic growth and product formation ���� ��������� ��������� ���! �����, 62, 3187-3195.

Albrecht, G., Mösch, H. U., Hoffmann, B., Reusser, U. and Braus, G. H. (1998). Monitoring the ���" protein-mediated response in the yeast� ��������������� �. ������������ ���� ������� ���, 273, (21): 12696-12702.

Algranati, I. D. and Cabib, E. (1960 ). The synthesis of glycogen in yeast. � ��� � �����! ���� �������, 43, 141-142.

Alic, N., Felder, T., Temple, M. D., Gloeckner, C., Higgins, V. J., Briza, P. and Dawes, I. W. (2004). Genome-wide transcriptional response to a lipid hydroperoxide: adaptation occurs without induction of oxidant defences. ���#�� ����� ���������� � � �, 37, (1): 23-35.

Alimardani, P., Regnazq, M., Moreau-Vauzelle, C., Ferreira, T., Rossignol, T., Blondin, B. and Berges, T. (2004). �$��-promoted sterol uptake involved the ABC transporter Aus1 and the mannoprotein Dan1 whose synergistic action is sufficient for this process. � ���� �����������, 381, 195-202.

André, B., Hein, C., Grenson, M. and Jauniaux, J. C. (1993). Cloning and expression of the $��"�gene coding for the inducible GABA-specific transport protein of ��������������� �. ��������������������� �, 237, (1-2): 17-25.

Andreasen, A. and Stter, T. (1953). Anaerobic nutrition of ��������������� �. I. Ergosterol requirements for growth in a defined medium ������������������������������� ����� �����, 41, 23-26.

Andreasen, A. and Stter, T. (1954 ). Anaerobic nutrition of ��������������� �. II. Unsaturated fatty acid requirements for growth in defined medium. ������������������������������� ����� �����, 43, 271-281.

Aouida, M., Leduc, A., Poulin, R. and Ramotar, D. (2005). ��%&�encodes the major permease for high affinity polyamine import in ������������ ��� �' (����������� ���� ������� ���, 280, (25): 24267-24276.

Archer, T. E. and Castor, J. G. B. (1956). Phosphate changes in fermenting must in relation to yeast growth and ethanol production ��� ����(���������������������� � ������, 7, (2): 62-68.

Arndt, K. T., Styles, C. and Fink, G. R. (1987). Multiple global regulators control )*�"�transcription in yeast. �� ��, 237, (4817): 874-880.

Atkinson, K., Fogel, S. and Henry, S. A. (1980a). Yeast mutant defective in phosphatidylserine synthesis. �������� ��� � ���� ���� ��� ���, 255, (14): 6654-6661.

Atkinson, K., Jensen, B., Kolat, A. L., Storm, E. M., Henry, S. A. and Fogel, S. (1980b). Yeast mutants auxotrophic for choline or ethanolamine �������� �������� �����, 141, (2): 558-564.

Bacon, J. S., Farmer, V. C., Jones, D. and Taylor, I. F. (1969). The glucan components of the cell wall of baker's yeast (������������ ��� �) considered in relation to its ultrastructure. � ���� �����������, 114, (3): 557-567.

Bajmoczi, M., Sneve, M., Eide, D. J. and Drewes, L. R. (1998). �����encodes a low-affinity histidine transporter in ������������ ��� �. � ���� ���� ����! ���� ���������������� ��� ��, 243, (1): 205-209.

Bartnicki-Garcia, S. and Nickerson, W. J. (1961). Thiamine and nicotinic acid: Anaerobic growth factors for ����� ���+ � ���������������� �����, 82, (1): 142-148.

Beckhouse, A. G. (2006). The transcriptional and physiological alterations in brewers yeast when shifted from anaerobic to aerobic growth conditions. School of Biotechnology and Biomolecular Sciences. Sydney, University of New South Wales ��������� �������.

Birch, R. M. and Walker, G. M. (2000). Influence of magnesium ions on heat shock and ethanol stress responses of ������������ ��� �. ��,��� ����� ���! ������������, 26, (9-10): 678-687.

Bishop, C. T., Blank, F. and Gardner, P. E. (1960). The cell wall polysaccharides of ���� � �� ��! ���: glucan, mannan and chitin. ����� ��� �������� ������ ���, 38, 869-881.

Boer, V. M., de Winde, J. H., Pronk, J. T. and Piper, M. D. (2003). The genome-wide transcriptional responses of ������������ ��� � grown on glucose in aerobic chemostat cultures limited for carbon, nitrogen, phosphorus, or sulfur. ������������ ���� ������� ���, 278, (5): 3265-3274.

Boken, D. J., Swindells, S. and Rinaldi, M. G. (1993). Fluconazole-resistant ���� �����! ���. �� � ����*���� ���- �, 17, (6): 1018-1021.

Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. ������ ����� ���� ���, 72, 248-254.

Bulawa, C. E. (1993). Genetics and molecular biology of chitin synthesis in fungi. ��������� .����� ���! �����, 47, 505-534.

Bungard, C. I. and McGivan, J. D. (2004). Glutamine availability up-regulates expression of the amino acid transporter protein ASCT2 in HepG2 cells and stimulates the ASCT2 promoter. � ������', 382, 27-32.

Cabib, E., Roberst, R. and Bowers, B. (1982). Synthesis of the yeast cell wall and its regulation. ��������� .����� ���� ���, 51, 763-793.

Cabib, E., Roh, D.-H., Schmidt, M., Crotti, L. B. and Varma, A. (2001). The yeast cell wall and septum as paradigms of cell growth and morphogenesis. ������������ ���� ������� ���, 276, (23): 19679-19682.

Carman, G. M. and Henry, S. A. (1989). Phospholipid biosynthesis in yeast ��������� .����! ���� ���, 58, 635-669.

Carman, G. M. and Zeimetz, G. M. (1996). Regulation of phospholipid biosynthesis in the yeast ��������������� �. ������������ ���� ������� ���, 271, (23): 13293-13296.

Cassone, A., Mattia, E. and Boldrini, L. (1978). Agglutination of blastospores of ���� �����! ��� by concanavalin A and its relationship with the distribution of mannan polymers and the ultrastructure of the cell wall. ����������������� ���! �����, 105, (2): 263-273.

Caubet, R., Guerin, B. and Guerin, M. (1988). Comparative studies on the glycolytic and hexose monophosphate pathways in ���� ��� ����� �� � and ��������������� �. ���� ������ ���! �����, 149, (4): 324-329.

Chaffin, W. L., Lopez-Ribot, J. L., Casanova, M., Gozalbo, D. and Martinez, J. P. (1998). Cell wall and secreted proteins of ���� ��� ��! ���/ identification, function, and expression. ���! ������ ���� �������� � ������ �� ., 62, 130-180.

Chapman, C. and Bartley, W. (1968). The kinetics of enzyme changes in yeast under conditions that cause the loss of mitochondria. � ���� �����������, 107, (4): 455-465.

Chen, E. C. (1981). Release of fatty acids as a consequence of yeast autolysis. ����������������� ������� ��������. ������ �, 39, 117-124.

Cherkasova, V. A. and Hinnebusch, A. G. (2003). Translational control by TOR and ��%"&� through dephosphorylation of eIF2alpha kinase ���&. ��� ����-�������, 17, (7): 859-872.

Chiocchetti, A., Zhou, J., Zhu, H., Karl, T., Haubenreisser, O., Rinnerthaler, M., Heeren, G., Oender, K., Bauer, J., Hintner, H., Breitenbach, M. and Breitenbach-Koller, L. (2007). Ribosomal proteins Rpl10 and Rps6 are potent regulators of yeast replicative life span. �+�� ������ ����������, 42, (4): 275-286.

Choi, H.-S. and Carman, G. M. (2007). Respiratory deficiency mediates the regulation of CHO1-encoded phosphatidylserine synthase by mRNA stability in ��������������� �. ������������ ���� ������� ���, 282, (43): 31217-31227.

Christensen, H. N. (1990). Role of amino acid transport and countertransport in nutrition and metabolism. %�� ���� ������ ., 70, 43-77.

Christensen, K. E. and MacKenzie, R. E. (2006). Mitochondrial one-carbon metabolism is adapted to the specific needs of yeast, plants and mammals. � ����� /� �.� ���� �� .� �� ��������0� �������� ���� �����������

! �����, 28, 595-605. Ciesarová, Z., Šmogrovičová, D. and Dömény, Z. (1996). Enhancement of yeast

ethanol tolerance by calcium and magnesium ��� �� ���! ���� ��, 41, (6): 485-488.

Cigan, A. M., Bushman, J. L., Boal, T. R. and Hinnebusch, A. G. (1993). A protein complex of translational regulators of ���"�mRNA is the guanine nucleotide-exchange factor for translation initiation factor 2 in yeast. %���'�����'�����'��� '�$'�'�', 90, (11): 5350-5354.

Cohen, B. D., Setil, O., Abramova, N. E., Davies, K. J. A. and Lowry, C. V. (2001). Induction and repression of�-��� and the family of anaerobic mannoprotein genes in ������������ ��� � occurs through a complex array of regulatory sites. ���� ���� ��#����, 29, (3): 799-808.

Compagno, C., Boschi, F. and Ranzi, B. M. (1996). Glycerol production in a triose phosphate isomerase deficient mutant of ������������ ��� �. � ����������������, 12, (5): 591-595.

Conway, E. J. and O'Malley, E. (1946). The nature of the cation exchanges during yeast fermentation, with formation of 0·02n-H ion. � ���� ���� (������, 40, (1): 59-67.

Cook, R. J. (2000). Defining the steps of the folate one-carbon shuffle and homocystenine metabolism. ��� ��� ���� (������� ��� �� � ���� ���� � ��, 72, 1419-1420.

Cooper, T. G., Ed. (1982). Transport in ������������ ��� �. The molecular biology of the yeast �����������. Metabolism and Gene expression. Cold Spring Harbour, New York, Cold Spring Harbour Press.

Correa García, S., Bermúdez Moretti, M., Ramos, E. and Batlle, A. (1997). Carbon and nitrogen sources regulate delta-aminolevulinic acid and gamma-aminobutyric acid transport in ������������ ��� �. ��� *������ ����������������� ���� ����1������ �����, 29, (8-9): 1097-1101.

Dagger, R. K., Reinhold, B. B., Petráková, E., Yeh, H. J. C., Ashwell, G., Drgonová, J., Kapteyn, J. C., Klis, F. M. and Cabib, E. (1997). Architecture of the Yeast Cell Wall - β (1->6)-GLUCAN INTERCONNECTS MANNOPROTEIN, β (1 -> 3)-GLUCAN, AND CHITIN. ������������ ���� ������� ���, 272, (28): 17762-17775.

Daignan-Fornier, B. and Fink, G. R. (1992). Coregulation of purine and histidine biosynthesis by the transcriptional activators ���� and����&. %���� ������������ ����������������� ��, 89, 6746-6750.

de Groot, M. J. L., Daran-Lapujade, P., van Breukelen, B., Knijnenburg, T. A., de Hulster, E. A. F., Reinders, M. J. T., Pronk, J. T., Heck, A. J. R. and Slijper, M. (2007). Quantitative proteomics and transcriptomics of anaerobic and aerobic yeast cultures reveals post-transcriptional regulation of key cellular processes. ���! �����, 153, 3864-3878.

de Groot, P. W., de Beor, A. D., Cunningham, J., Dekker, H. L., de Jong, L., Hellingweif, K. J., de Koster, C. and Klis, F. M. (2004). Proteomic analysis of ���� ��� ��! ���� cell walls reveals covalently bound carbohydrate-active enzymes and adhesins. ��2����� �����, 3, (4): 955-965.

de Groot, P. W., Kraneveld, E. A., Yin, Q. Y., Dekker, H. L., Gross, U., Crielaard, W., de Koster, C. G., Bader, O., Klis, F. M. and Weig, M. (2008). The cell wall of the human pathogen ���� ��� ���!����: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. ��2����� �����, 7, (11): 1951-64.

de Groot, P. W., Ram, A. F. and Klis, F. M. (2005). Features and functions of covalently linked proteins in fungal cell walls. ���������� ������� �����, 42, 657-675.

Denis, V. and Daignan-Fornier, B. (1998). Synthesis of glutamine, glycine and 10-formyl tetrahydrofolate is coregulated with purine biosynthesis in ��������������� �. ��������������������� �, 259, 246-255.

Dever, T. E., Feng, L., Wek, R. C., Cigan, A. M., Donahue, T. F. and Hinnebusch, A. G. (1992). Phosphorylation of initiation factor 2 alpha by protein kinase ���&�mediates gene-specific translational control of ���" in yeast. ���, 68, (3): 585-96

Dever, T. E. and Hinnebusch, A. G. (2005). ���& whets the appetite for amino acids. ������������18, 141-148.

Devlin, C., Tice-Baldwin, K., Shore, D. and Arndt, K. T. (1991). #�%��is required for ����/���&- and ���"-dependent transcription of the yeast )*�"�gene. �������� ��', 11, (7): 3642-51.

Dickinson, J. R., Ed. (1999). Carbon metabolism. The Metabolism and Molecular Physiology of ��������������� �. Philadelphia, PA, Taylor & Francis.

Duffus, J. H. and Patterson, L. J. (1974). Control of cell division in yeast using the ionophore, A23187 with calcium and magnesium. �����, 251, 626 - 627

Egli, C. M., Edinger, W. D., Mitrakul, C. M. and Henick-Kling, T. (1998). Dynamics of indigenous and inoculated yeast populations and their effect on the sensory character of Riesling and Chardonnay wines. ��������������� �� ���! �����, 85, 779-789.

Ehrlich, F. (1907). U¨ ber die Bedingungen der Fuselo¨lbildung und u¨ber ihren Zusammenhang mit dem Eiweissaufbau der Hefe. �� ���� ��� -��������� ������������, 40, 1027-1047.

Farcasanu, I. C., Mizunuma, M., Hirata, D. and Miyakawa, T. (1998). Involvement of histidine permease (Hip1p) in manganese transport in ��������������� �. ��������������������� �, 259, (5): 541-548.

Fix, G. (1996). %� �� ��������. ����� ��. Colorado, Brewers Publication. Fleet, G. H., Ed. (1991). Cell walls. Yeast organelles. London, Academic Press. Fleet, G. H., Lafon-Lafourcade, S. and Ribe´reau-Gayon, P. (1984). Evolution of

yeasts and lactic acid bacteria during fermentationand storage of Bordeaux wines. ���� ��������� ��������� ���! ������48, 1034-1038.

Folch, J., Lees, M. and Solane-Stanley, G. H. (1957). A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. �������� ���� ���� ������� ���, 226, 497-509.

Fricker, R. (1978). The design of large tanks. ��.'������', 107, (5): 28-37. Fujii, T., Nagasawa, N., Iwamatsu, A., Bogaki, T., Tamai, Y. and Hamachi, M. (1994).

Molecular cloning, sequence analysis, and expression of the yeast alcohol acetyltransferase gene. ���� �� ���� ��� ��������� ���! �����, 60, 2786-2792.

Garcia-Barrio, M., Dong, J., Ufano, S. and Hinnebusch, A. G. (2000). Association of ����3���&4 regulatory complex with the N-terminus of eIF2alpha kinase ���&�is required for ���&�activation. � �5��, 19, (8): 1887-1899.

Garcia-Sanchez, S., Aubert, S., Iraqui, I., Janbon, G., Ghigo, J.-M. and d’Enfert, C. (2004). Biofilms of ���� �����! ���/ a developmental state associated with specific and stable gene expression patterns. ��2����� ������3, 536-545.

Gatlin, C. L., Kleemann, G. R., Hays, L. G., Link, A. J. and Yates, I. J. R. (1998). Protein identification at the low femtomole level from silver-stained gels using a new fritless electrospray interface for liquid chromatography-microspray and nanospray mass spectrometry. ������ ����� ���� ���, 263, 93-101.

Gelling, C. L., Piper, M. D. W., Hong, S.-P., Kornfeld, G. D. and Dawes, I. W. (2004). Identification of a novel One-carbon metabolism regulon in ��������������� �. ������������ ���� ������� ���, 279, (8): 7072-7081.

Gietz, D., St Jean, A., Woods, R. A. and Schiestl, R. H. (1992). Improved method for high efficiency transformation of intact yeast cells. ���� ���� ��#����, 20, 1425.

Gil, J. V., Manzanares, P., Genoves, S., Valles, S. and Gonzalez-Candelas, L. (2005). Over-production of the major exoglucanase of ��������������� � leads to an increase in the aroma of wine. *������ ����� �������� ��� ����� ���! �����, 103, (1): 57-68.

Grant, C. M., MacIver, F. H. and Dawes, I. W. (1996). Glutathione is an essential metabolite required for resistance to oxidative stress in the yeast ��������������� �. ���������� ��29, (6): 511-515.

Grauslund, M., Didion, T., Kielland-Brandt, M. C. and Andersen, H. A. (1995). ��%&, a gene encoding a permease for branched-chain amino acids in���������������� �. � ��� � �����! ���� �������, 1269, (3): 275-280.

Gregory, J. F., Cuskelly, G. J., Shane, B., Toth, J. P., Baumgartner, T. G. and Stacpoole, P. W. (2000). Primed, constant infusion with [2H3] serine allows in vivo kinetic measurement of serine turnover, homocysteine remethylation, and transulfuration processes in human one-carbon metabolism. ��� ��� ����������������� � �������� � ��, 72, 1535-1541.

Grenson, M., Hou, C. and Crabeel, M. (1970). Multiplicity of the amino acid permeases in� ������������ ��� �. IV. Evidence for a general amino acid permease. ���������������� �����, 103, (3): 770-777.

Guarente, L., Yocum, R. R. and Gifford, P. (1982). A ��6�43�7�� hybrid yeast prometer identifies the ��6" regulatory region as an upstream sites. %���� ������������ ����������������� ��, 79, (23): 7410-7414.

Guymon, J. F. (1964). Studies of higher alcohol formation by yeasts through gas chromatography %��������������)��������� � ��, 11, (2-4): 194-201.

Hammond, J. (2000). Yeast Growth and Nutrition. Brewing yeast fermentation performance. K. Smart. Oxford, Oxford Brooks university�75-85.

Hammond, J. R. M., Ed. (1993). Brewer's yeasts. In the Yeasts. London, Academic Press.

Hansen, H., Nissen, P., Sommer, P., Nielsen, J. C. and Arneborg, N. (2001). The effect of oxygen on the survival of non-������������yeasts during mixed cultures fermentations of grape juice with ��������������� �. ��������������� �� ���! �����, 91, 541-547.

Harashima, S. and Hinnebusch, A. G. (1986). Multiple ��- genes required for repression of ���", a transcriptional activator of amino acid biosynthetic genes in ������������ ��� �. �������� � ������ ��� ��� ���, 6, (11): 3990-3998.

Harbison, C. T., Gordon, D.B., Lee, T.I., Rinaldi, N.J., MacIsaac, K.D., Danford, T.W., Hannett, N.M., Tagne, J.B., Reynolds, D.B., Yoo, J., Jennings, E.G., Zeitlinger, J., Pokholok, D.K., Kellis, M., Rolfe, P.A., Takusagawa, K.T., Lander, E.S., Gifford, D.K., Fraenkel, E., Young, R.A. (2004). Transcriptional regulatory code of a eukaryotic genome. �����, 431, 99-104.

Hardwick, W. A. (1994). History and antecedents of brewing. Handbook of brewing. W. A. Hardwick. New York, Marcel Dekker, Inc.�p37-51.

Hazelwood, L. A., Daran, J.-M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T. and Dickinson, J. R. (2008). The Ehrlich Pathway for Fusel Alcohol Production: a Century of Research on ������������ ��� � Metabolism. ���� �� ����

��� ��������� ���! �����, 74, (8): 2259-2266. Hazen, K. C. (1989). Participation of yeast cell surface hydrophobicity in adherence

of ���� �����! ����to human epithelial cells. *���� �������*���� ��, 57, (7): 1894-1900.

Hazen, K. C., Brawner, D. L., Riesselman, M. H., Jutila, M. A. and Cutler, J. E. (1991). Differential adherence of hydrophobic and hydrophilic ���� �����! ��� yeast cells to mouse tissues. *���� �������*���� ��, 59, (3): 907-912.

>azen, K. C. and Hazen, B. W. (1992). Hydrophobic surface protein masking by the opportunistic fungal pathogen ���� �����! ���. *���� �������*���� ��, 60, (4): 1499-1508.

Hermann, H., Hacker, U., Bandlow, W. and Magdolen, V. (1992). �768� vectors: ������������ ��� �9���� �� �� ��� � shuttle plasmids to analyze yeast promoters. ��, 119, 137-141.

Higgins, V. J., Beckhouse, A. G., Oliver, A. D., Rogers, P. J. and Dawes, I. W. (2003). Yeast genome-wide expression analysis identifies a strong ergosterol and oxidative stress response during the initial stages of an industrial lager fermentation. ���� ��������� ��������� ���! �����, 69, 4777-4787.

Hinnebusch, A. G. (1984). Evidence for translation regulation of the activator of general amino acid control in yeast. %���� ������������ ����������������� ��, 20, 6442-6446.

Hinnebusch, A. G. (1985). A hierarchy of trans- acting factors modulates translation of an activator of amino acid biosynthetic genes in ���������������� �. ������������� �����, 5, (9): 2349-2360.

Hinnebusch, A. G. (1988). Mechanisms of gene regulation in the general control of amino acid biosynthesis in ������������ ��� �. ���! ���� ����#� .�52, (2): 248-273.

Hinnebusch, A. G. (1990). Transcriptional and translational regulation of gene expression in the general control of amino acid biosynthesis in���������������� �. ���� ���� ��#��������� ��������� �����, 38, 195-240.

Hinnebusch, A. G. (1997). Translational regulation of yeast ���"' A window on factors that control initiator-tRNA binding to the ribosome. �������� ���� ���� ������� ����272, (35): 21661-21664.

Hinnebusch, A. G. (2005). Translation regulation of ���" and the general amino acid control of yeast. �������#� .���� ���! �����, 59, 407-405.

Hinnebusch, A. G. and Fink, G. R. (1983). Positive regulation in the general amino acid control of� ������������ ��� �. %���� ��� ��� ��� ��� ����������������� ��, 80, (17): 5374-5378.

Hinnebusch, A. G. and Natarajan, K. (2002). Gcn4p, a master regulator of gene expression, is controlled at multiple levels by diverse signals of starvation and stress. ��2����� �����, 1, (1): 22-32.

Hong, S. P., Piper, M. D., Sinclair, D. A. and Dawes, I. W. (1999). Control of expression of one-carbon metabolism genes of ������������ ��� � is mediated by a tetrahydrofolate-respsonsive protein binding to a glycine regulatory region including a core 5'-CTTCTT-3' motif. ������������ ���� ������� ���, 274, (15): 10523-10532.

Hope, I. A. and Struhl, K. (1985). ���" protein, synthesized in vitro, binds� )*�: regulatory sequences: implications for general control of amino acid biosynthetic genes in yeast. ���, 43, (1): 177-88.

Horie, T. and Isono, K. (2001 ). Cooperative functions of the mannoprotein-encoding genes in the biogenesis and maintenance of the cell wall in ��������������� �. 7��, 18, 1493-1503.

Hornsey, I. S. (1999). ��. ��. Cambridge, The Royal Society of Chemistry Hough, J. S. (1985). ��� ! ����������� ��� ���� ��� ���� !�. ��. Cambridge,

Cambridge University Press. Hough, J. S., Briggs, D. E. and Stevens, R. (1971 -a). Biology of yeasts. Malting and

brewing science. J. S. Hough, D. E. Briggs and R. Stevens. New York, Halsted Press.

>ough, J. S., Briggs, D. E. and Stevens, R. (1971 -b). Metabolism of wort by yeast. Malting and brewing science. J. S. Hough, D. E. Briggs and R. Stevens. New York, Halsted Press.

Isnard, A. D., Thomas, D. and Surdin-Kerjan, Y. (1996). The study of methionine uptake in ������������ ��� � reveals a new family of amino acid permeases. ����������� ��������� �����, 262, (4): 473-484.

Jakovcic, S., Getz, G., Rabinowitz, M., Jakob, H. and Swift, H. (1971). Cardiolipin contents of wild type and mutant yeasts in relation to mitochondrial function and development. ���������������� �����, 48, 490-502.

James, T. C., Campbell, S., Donnelly, D. and Bond, U. (2003). Transcription profile of brewery yeast under fermentation conditions. �������� ��� ���� �� ���! �����, 94, 432-448.

Janke, C., Magiera, M. M., Rathfelder, N., Taxis, C., Reber, S., Maekawa, H., Moreno-Borchart, A., Doenges, G., Schwob, E., Schiebel, E. and Knop, M. (2004). A versatile toolbox of PCR-based tagging of yeast genes: new fluorescent proteins, more markers and promoter substituation cassettes. 7��, 21, 947-962.

Jauniaux, J. C. and Grenson, M. (1990). ��%�, the general amino acid permease gene of ��������������� �. Nucleotide sequence, protein similarity with the other bakers yeast amino acid permeases, and nitrogen catabolite repression. �������������������� ���� ���, 190, (1): 39-44.

Jauniaux, J. C., Vandenbol, M., Vissers, S., Broman, K. and Grenson, M. (1987). Nitrogen catabolite regulation of proline permease in ��������������� �. Cloning of the %$�"�gene and study of %$�"�RNA levels in wild-type and mutant strains. �������������������� ���� ���, 164, (3): 601-606.

Jin, Y.-L. and Speers, R. A. (1998). Flocculation of ��������������� �. �����#�����*������ ����, 31, (6-7): 421-440

Jollow, D., Kellerman, G. M. and Linnane, A. W. (1968). The biogenesis of mitochondria. 3. The lipid composition of aerobically and anaerobically grown ������������ ��� �� as related to the membrane systems of the cells. ���������������� �����, 37, (2): 221-230.

Jones, M. and Pierce, J. S. (1964). Absorption of amino acid from wort by yeasts. ��������������*�� ���������. ��, 70, 307-315.

Joo, Y. J., Kim, J. A., Baek, J. H., Seong, K. M., Han, K. D., Song, J. M., Choi, J. Y. and Kim, J. (2009). Cooperative regulation of �-�:� transcription by Gcn4p and Bas1p in ��������������� �' ��2���������', 8, (8): 1268-1277.

Kanbe, T., Han, Y., Redgrave, B., Riesselman, M. H. and Cutler, J. E. (1993). Evidence that mannans of ���� �����! ����are responsible for adherence of yeast forms to spleen and lymph node tissue. *���� �������*���� ��, 61, (6): 2578-2584

Kanfer, J. N. (1980). The base exchange enzymes and phospholipase D of mammalian tissue. ����� ��������������� ���� ���, 58, 1370-1380.

Kelley, M. J., Bailis, A. M., Henry, S. A. and Carman, G. M. (1988). Regulation of phospholipid biosynthesis in ��������������� ��by inositol. Inositol is an inhibitor of phosphatidylserine synthase activity. �������� ��� � ���� ������� ���, 263, 18078-18085.

Kent, C., Carman, G. M., Spence, M. W. and Dowhan, W. (1991). Regulation of eukaryotic phospholipid metabolism. ��� ����� ��� ��� ��� ���� ��� � ������+�� ������� �����, 5, 2258-2266.

Klis, F. M. (1994). Cell wall assembly in yeast 7��, 10, 851-869.

Klis, F. M., Boorsma, A. and de Groot, P. W. J. (2006). Cell wall construction in ��������������� �. 7��, 23, 185-202.

Klis, F. M., Mol, P., Hellingwerf, K. and Brul, S. (2002). Dynamics of cell wall structure in ��������������� �. �� �� ���! ������#� .�26, 239-259.

Klotz, S. A., Rutten, M. J., Smith, R. L., Babcock, S. R. and Cunningham, M. D. (1993). Adherence of ���� ��� ��! ��� to immobilized extracellular matrix proteins is mediated by calcium-dependent surface glycoproteins. ���! ���%������ , 14, (2): 133-147.

Koehler, R. N., Rachfall, N. and Rolfes, R. J. (2007). Activation of the ADE genes requires the chromatin remodeling complexes SAGA and SWI/SNF. ��2���������', 6, 1474-1485.

Kosugi, A., Koizumi, Y., Yanagida, F. and Udaka, S. (2001). $%�, high affinity methionine permease, is involved in cysteine uptake by ��������������� �. � �� ��0�� ����������0������ ���� ���, 65, (3): 728-731.

Kresnowati, M. T. A. P., van Winden, W. A., Almering, M. J. H., ten Pierick, A., Knijnenburg, T. A., Daran-Lapujade, P., Pronk, J. T., Heijnen, J. J. and Daran, J. M. (2006). When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. �������������� �����, 49, 1-16.

Krishan, A. (1975). Rapid flow cytofluorometric analysis of mammalian cell cycle by propidium iodide staining. ���������������! �����, 66, (1): 188-193.

Kudo, M., Vagnoli, P. and Bisson, L. F. (1998). Imbalance of pH and potassium concentration as a cause of stuck fermentations. ��� ����(����������������������; � ������, 49, (3): 295-301.

Kunzler, M., Balmelli, T., Egli, C. M., Paravicini, G. and Braus, G. H. (1993). Cloning, primary structure, and regulation of the )*�<� gene encoding a bifuncational glutamine amidotransferase:cyclase from ��������������� �. ���������������� �����, 175, 5548-5558.

Kwast, K. E., Lai, L. C., Menda, N., James, D. T., Aref, S. and Burke, P. V. (2002). Genomic analyses of anaerobically induced genes in ��������������� �: functional roles of #�+��and other factors in mediating the anoxic response. ���������������� �����, 184, 250-265.

Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V. and Kwast, K. E. (2005). Dynamical remodelling of the transcirptiome during short-term anaerobiosis in ������������ ��� �/� differential response and role of �& and/ or �" and other factors in galactose and glucose media. �������� ����� �����, 25, (10): 4075-4091.

Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V. and Kwast, K. E. (2006). Metabolic-state-dependendt remodeling of the transciptome in response to anoxia and subsequent reoxygenation in ������������ ��� �. ��2����� �� ���, 5, (9): 1468-1489.

Large, P. J. (1986). Degradation of organic nitrogen compounds by yeasts. 7��, 2, 1-34.

Lee, J.-C., Straffon, M. J., Jang, T.-Y., Higgins, V. J., Grant, C. M. and Dawes, I. W. (2001). The essential and ancillary role of glutathione in ��������������� � analysed using a grande ���� disruption strain. �� �� 7���#����, 1, 57-65.

Lentini, A., Rogers, P., Higgins, V., Dawes, I., Chandler, M., Stanley, G. and Chambers, P. (2003). The impact of ethanol stress on yeast physiology.

Brewing yeast fermentation performance. K. Smart. Oxford, Oxford Brooks university�25-38.

Lesage, G. and Bussey, H. (2006). Cell wall assembly in ������������ ��� �. ���! ���������� ��������� ������#� ., 70, (2): 317-343.

Levenberg, B., Melnick, I. and Buchanan, J. M. (1957). Biosynthesis of the purines, XV. The effect of aza-L-serine and 6-diazo-5-oxo-L-norleucine on inosinic acid biosynthesis ������. ������������ ���� ������� ���, 225, 163-176.

Li, F. and Palecek, S. P. (2003). ��%�, a ���� �����! ��� gene involved in binding human epithelial cells. ��2����� �����, 2, 1266-1273.

Lilly, M., Lambrechts, M. G. and Pretorius, I. S. (2000). Effect of increased yeast alcohol acetyltransferase activity on flavor profiles of wine and distillates. ���� ��������� ��������� ���! �����, 66, (2): 744-753.

Lipke, P. N. and Ovalle, R. (1998). Cell wall architecture in yeast: new structure and new challenges. ���������������� �����, 180, (15): 3735-3740.

Lopez-Ribot, J. L., McAtee, R. K., Lee, L. N., Kirkpatrick, W. R., White, T. C. and Sanglard, D. (1998). Distinct patterns of gene expression associated with development of fluconazole resistance in serial ���� �����! ��� isolates from human immunodeficiency virus-infected patients with orpharyngeal candidiasis. ��� � ���! ����������������������, 42, 2932-2937.

Lorenz, M. C. and Heitman, J. (1998). The �%&� ammonium permease regulates pseudohyphal differentiation in ��������������� �. � �5�(������, 17, (5): 1236-1247.

MacPherson, S., Akache, B., Weber, S., de Deken, X., Raymond, M. and Turcotte, B. (2005). ���� ��� �� ! ���s zinc cluster protein Upc2p confers resistance to antifungal drugs and is an activator of ergosterol biosynthetic genes. ��� � ���! ����������������������, 49, (5): 1745-1752.

Magazinnik, T., Anand, M., Sattlegger, E. and Hinnebusch, A. G. (2005). Interplay between ���&� and ���"� expression, translation elongation factor 1 mutations and translational fidelity in yeast. ���� ���� ��#�����33, (14): 4584-4592.

Marini, A. M., Soussi-Boudekou, S., Vissers, S. and Andre, B. (1997). A family of ammonium transporters in ��������������� �. ������������� �����, 17, (8): 4282-4293.

Marini, A. M., Vissers, S., Urrestarazu, A. and André, B. (1994). Cloning and expression of the �%�� gene encoding an ammonium transporter in ��������������� �. � �5�(������, 13, (15): 3456-3463.

Marquis, C. P., Barford, J. P., Harbour, C. and Nobbs, D. M. (1993). Evaluation of the batch kinetics of the amino acid metabolism of a mouse hybridoma and human lymphoblastoid cell line using a pre-column FDNDEA derivitisation, HPLC technique � ��������������� =�, 7, (11):

McGee, T. P., Skinner, H. B., Whitters, E. A., Henry, S. A. and Bankaitis, V. A. (1994). A phosphatidylinositol transfer protein controls the phosphatidylcholine content of yeast Golgi membranes. �������� ��� ����� �����, 124, (3): 273-287.

McGovern, P. E., Zhang, J., Tang, J., Zhang, Z., Hall, G. R., Moreau, R. A., Nunez, A., Butrym, E. D., Richards, M. P., Wang, C. S., Cheng, G., Zhao, Z. and Wang, C. (2004) Fermented beverages of pre- and proto-historic China. %���'�����'�����'��� '�$'�'�', 101(51):17593-17598.

McMaster, C. R. and Bell, R. M. (1994). Phosphatidylcholine biosynthesis in ������������ ��� �. Regulatory insights from studies employing null

and chimeric sn-1,2-diacylglycerol choline- and ethanolaminephosphotransferases. ������������ ���� ������� ���, 269, (45): 28010-28016.

McMurrough, K. and Rose, A. H. (1967). Effect of growth rate and substrate limitation on the composition and structure of the cell wall of ��������������� �. � ���� �����������, 105, 189- 203.

McNeil, J. B., Bognar, A. L. and Pearlman, R. E. (1996). In vivo analysis of folate coenzymes and their compartmentation in ��������������� �. ��� �, 142, (2): 371-381.

McNeil, J. B., McIntosh, E. M., Taylor, B. V., Zhang, F. R., Tang, S. and Bognar, A. L. (1994). Cloning and molecular characterization of three genes, including two genes encoding serine hydroxymethyltransferases, whose inactivation is required to render yeast auxotrophic for glycine �������� ��� � ���� ������� ���, 269, (12): 9155-9165.

Melcher, K., Rose, M., Künzler, M., Braus, G. H., and Entian, K.D (1995). Molecular analysis of the yeast ��#� gene encoding 3-phosphoserine aminotransferase: regulation by general control and serine repression. ���������� �, 27, (6): 501-8.

Mendes-Ferreira, A., Mendes-Faia, A. and Leão, C. (2004). Growth and fermentation patterns of ������������ ��� � under different ammonium concentrations and its implications in winemaking industry. �������� ������� �� ���! �����, 97, (3): 540-545.

Mieczkowski, P. A., Dominska, M., Buck, M. J., Gerton, J. L., Lieb, J. D. and Petes, T. D. (2006). Global analysis of the relationship between the binding of the Bas1p transcription factor and meiosis-specific double-straind DNA breaks in ��������������� �. ������������� �����, 26, 1014-1027.

Monschau, N., Stahmann, K. P., Sahm, H., McNeil, J. B. and Bognar, A. L. (1997). Identification of Saccharomyces cerevisiae �67� as a threonine aldolase: a key enzyme in glycine biosynthesis. �� �� ���! ���6���, 150, (1): 55-60.

Morris, E. O., Ed. (1958). The chemistry and biology of yeasts. New York, Academic press.

Mortimer, R. K. and Johnston, J. R. (1986). Genealogy of principal strains of the yeast genetic stock center. ��� �, 113, (1): 35-43.

Mrvčić, j., Stanzera, D., Stehlik-Tomasa, V., Škevina, D. and Grbaa, S. (2007). Optimization of bioprocess for production of copper-enriched biomass of industrially important microorganism ������������ ��� �. �������� ���� �� �������� ��� �� ��, 103, (4): 331-337

Mueller, P. P., Harashima, S. and Hinnebusch, A. G. (1987). A segment of ���"�mRNA containing the upstream AUG codons confers translational control upon a heterologous yeast transcript. %���'� ����'� ����'� �� '� $'�'�', 84, (9): 2863-2867.

Munroe, J. H. (1994). Fermentation. Handbook of brewing. W. A. Hardwick. New York, Marcel Dekker, Inc.�323-353.

Murray, C. R., Barich, T. and Taylor, D. (1984). The effect of yeast storage conditions on subsequenct fermentation. �������� ����>��������21, (4): 189-194.

Myers, A. M., Tzagoloff, A., Kinney, D. M. and Lusty, C. J. (1986). Yeast shuttle and integrative vectors with multiple cloning sites suitable for construction of Lacz fusions. ��, 45, (3): 299-310.

Nagarajan, L. and Storms, R. K. (1997). Molecular characterization of ��;:, the ������������ ��� � gene coding for the glycine cleavage system hydrogen carrier protein. �������� ��� � ���� ���� ��� ���, 272, (7): 4444-4450.

Natarajan, K. and Hinnebusch, A. G. (2002). Gcn4p, a master regulator of gene expression, is controlled at multiple levels of diverse signals of starvation and stress. ��2����� �����, 1, (1): 22-32.

Natarajan, K., Meyer, M. R., Jackson, B. M., Slade, D., Roberts, C. and Hinnebusch, A. G. (2001). Transcriptional profiling Gcn4p is a master regulator of gene expression during amino acid starvation in yeast. ������������! �����, 21, (13): 4347-4368.

Nes, W. R., Sekula, B. C., Nes, W. D. and Adler, J. H. (1978). The functional importance of structural features of ergosterol in yeast. ������������ ���� ������� ���, 253, (17): 6218-6225.

Nikawa, J. and Yamshita, S. (1981). Characterization of phosphatidylserine synthase from ��������������� � and a mutant defective in enzyme. � ��� � �����! ���� �������, 665, (420-426):

Nomura, W., Maeta, K., Kita, K., Izawa, S. and Inoue, Y. (2008). Role of ���"� for adaptation to methylglyoxal in ������������ ��� �" methylglyoxal attenuates protein synthesis through phosphorylation of eIF2α. � ���� ��������! ���� ���������������� ��� ��, 376, (4): 738-742.

Nordstrom, K. (1962). Formation of ethyl acetate in fermentation with brewer's yeast. III Participation of coenzyme A. ��������������*�� ���������. ��, 68, 398-407.

Nurminen, T., Konttinnen, K. and Suomalainen, H. (1975). Neutral lipids in the cells and cell envelop fractions of aerobic bakers's yeast and anaerobic brewer's yeast. ��� ��������%�� �����6 � �, 14, 15-32.

Nyka¨nen, L. (1986). Formation and occurrence of flavour compounds in wine and distilled alcoholic beverages. ��� ���������������������������; � �������37, 84- 96.

Okuyama, H., Saito, M., Joshi, V., Gunsberg, S. and Wakil, S. (1979). Regulation by temperature of chain length of fatty acids in yeast. �������� ��� � ���� ������� ���, 254, 12281-12284.

Ono, B. I., Hazu, T., Yoshida, S., Kawato, T., Shinoda, S., Brzvwczy, J. and Paszewski, A. (1999). Cysteine biosynthesis in ������������ ��� �: a new outlook on pathway and regulation. 7��, 15, (13): 1365-1375.

Osuji, G. O. (1979 ). Glutathione turnover and amino acid uptake in yeast: evidence for the participation of the gamma-glutamyl cycle in amino acid transport. �����6���, 105, (2): 283-285.

Ough, C. S., Davenport, M. and Joseph, K. (1989). Effects of certain vitamins on growth and fermentation rate of several commercial active dry wine yeasts ��� ���������������������������; � ������, 40, (3): 208-213

Palmqvist, U. and Ayrapaa, T. (1969). Uptake of amino acids in bottom fermentations. ��������������*�� ���������. ��, 75, 181-190.

Paltauf, F., Kohlwein, S. D., and Henry, S. A. (1992). Regulation and compartimentalization of lipid synthesis in yeast. The molecular and cellular biology of Yeast ������������ ��� �: Gene Expression. E. W. Jones, Pringle, J. R., and Broach, J. R. N.Y., Cold Spring Harbour Laboratory Press�415-500.

Panozzo, C., Nawara, M., Suski, C., Kucharczyka, R., Skoneczny, M., Becam, A.-M., Rytka, J. and Herbert, C. J. (2002). Aerobic and anaerobic NAD+ metabolism in ��������������� �. �����6���, 517, 97-102.

Pasternack, L. B., Littlepage, L. E., A., L. J. D. and Appling, D. R. (1996). 13C NMR analysis of the use of alternative donors to the tetrahydrofolate-dependent one-carbon pools in ������������ ��� �. ���� �� ��� � ���� ���� ����� ���� �, 326, (1): 158-165.

Percudani, R., Pavesi, A. and Ottonello, S. (1997). Transfer RNA gene redundancy and translational selection in ��������������� �. ����������� ��������� �����, 268, 322-330.

Pierce, C. G., Thomas, D. P. and López-Ribot, J. L. (2009). Effect of tunicamycin on����� ��� ��! ��� biofilm formation and maintenance. ��� �������� ������ � ���! �������������, 63, (3): 473-479.

Pierce, J. S. (1982). Amino acids in malting and brewing. ����������� ���*�� ���������. ��, 88 228-233.

Pinson, B., Gabrielsen, O. S. and Daignan-Fornier, B. (2000). Redox regulation of AMP synthesis in yeast: a role of the Bas1p and Bas2p transcription factors. ��������� ���! �����, 36, (6): 1460-1469.

Piper, M. D., Hong, S. P., Ball, G. E. and Dawes, I. W. (2000). Regulation of the balance of one - carbon metabolism in ��������������� �. ������������ ���� ������� ���, 275, (40): 30987-30995.

Piper, M. D., Hong, S. P., Eissing, T., Sealey, P. and Dawes, I. W. (2002). Regulation of the yeast glycine cleavage genes is respsonsive to the avaliability of multiple nutrients. �� ��7���#����, 2, (1): 59-71.

Pironcheva, G. L. (1998). The effect of magnesium ions during beer fermentation. ����! �, 94, (377): 135-139.

Pitarch, A., Nomela, C. and Gil, C. (2008). Cell wall fractionation for yeast and fungal proteomics. ����� �� ��������� �����, 425, 217-239.

Qadota, H., Python, C. P., Inoue, S. B., Arisawa, M., Anraku, Y., Zheng, Y., Watanabe, T., Levin, D. E. and Ohya, Y. (1996). Identification of Yeast Rho1p GTPase as a Regulatory Subunit of 1,3-beta -Glucan Synthase �� ��, 272, (5259): 279-281.

Rapp, A. and Versini, G., Eds. (1991). Influence of nitrogen compounds in grapes on aroma compounds of wine. Proceedings of the International Symposium on Nitrogen in Grapes and Wines. Davis, C. A., American Society for Enology and Viticulture.

Ratcliffe, J., Hossack, G., Wheeler, G. and Rose, A. (1973). Modifications to the phospholipid composition of ��������������� � induced by exogenous ehtanolamine. ����������������� ���! �����, 76, 445-449.

Ree, E. M. R. and Stewart, G. G. (1997). The effects of increased magnesium and calcium concentrations on yeast fermentation performance in high gravity worts. ��������������*�� ���������. ��, 103, 287-291.

Regenberg, B., Düring-Olsen, L., Kielland-Brandt, M. C. and Holmberg, S. (1999). Substrate specificity and gene expression of the amino-acid permeases in ��������������� �. ���������� �, 36, (6): 317-328.

Regenberg, B., Holmberg, S., Olsen, L. D. and Kielland-Brandt, M. C. (1998). Dip5p mediates high-affinity and high-capacity transport of L-glutamate and L-aspartate in ��������������� �. ���������� �, 33, (3): 171-177.

Reiner, S., Micolod, D., Zellnig, G. and Schneiter, R. (2006). Genomewide screen reveals a role of mitochondria in anaerobic uptake of sterols in yeast. ��������� ���������������, 17, (1): 90-103.

Richardson, A. J., Calder, A. G., Stewart, C. S. and Smith, A. (1989). Simultaneous determination of volatile and non-volatile acidic fermentation products of anaerobes by capillary gas chromatography. 6���� ������ �� ���! �����, 9, (1): 5-8.

Rodrigues, F., P., L. and Leao, C. (2006). Sugar metabolism in yeasts: an overview of aerobic and anaerobic glucose catabolism. Biodiversity and Echophysiology of yeasts. P. Gabor and R. Carlos. Heidelberg, Springer 101-121.

Rolfes, R. J. and Hinnebusch, A. G. (1993). Translation of the yeast transcriptional activator GCN4 is stimulated by purine limitation: implications for activation of the protein kinase GCN2. ���� ������', 13, (8): 5099-5111.

Romano, P., Fiore, C., Paraggio, M., Caruso, M. and Capece, A. (2003). Function of yeast species and strains in wine flavour. *������ ����� �������� ��� ����� ���! �����, 86 169-180.

Rose, M. and Botstein, D. (1983). Construction and use of gene fusions to ���8 (beta-galactosidase) that are expressed in yeast. ����� ����,�������, 101, 161-80.

Rosenfeld, E., Bertrand Beauvoit, B., Blondin, B. and Salmon, J. (2003). Oxygen consumption by anaerobic ������������ ��� � under enological conditions: Effect on fermentation kinetics. ���� �� ���� ��� ��������� ���! �����, 69, (1): 113-121.

Rossignol, T., Dulau, L., Julien, A. and Blondin, B. (2003). Genome-wide monitoring of wine yeast gene expression during alcoholic fermentation. 7���20, 1369-1385.

Rouillon, A., Surdin-Kerjan, Y. and Thomas, D. (1999). Transport of sulfonium compounds. Characterization of the s-adenosylmethionine and s-methylmethionine permeases from the yeast ������������ ��� �. ������������ ���� ������� ���, 274, (40): 28096-28105.

Roy, A., Lu, C. F., Marykwas, D. L., Lipke, P. N. and Kurjan, J. (1991). The �����product is involved in cell surface attachment of the ��������������� � cell adhesion glycoprotein a-agglutinin. �������� ���� � �����, 11, 4196-4206.

Russell, I. (2006). Yeast Handbook of Brewing. F. G. Priest and G. G. Stewart. New York, CRC Press�288-332.

Rytka, J. (1975). Positive selection of general amino acid permease mutants in ��������������� �. ���������������� �����, 121, (2): 562-570.

Sambrook, J., Fritsch, E. and Maniatis, T. (1989). ������������ ��/���6�!�������� �����. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory.

Sanglard, D., Kuchler, K., Ischer, F., Pagani, J. L., Monod, M. and Bille, J. (1995). Mechanisms of resistance to azole antifungal agents in ����� ��� ��! ��� isolates from AIDS patients involve specific multidrug transporters. ��� � ���! ����������������������, 39, 2378-2386.

Sattlegger, E. and Hinnebusch, A. G. (2000). Separate domains in �����for binding protein kinase ���&� and ribosomes are required for ���&� activation in amino acid-starved cells. � �5��, 19, (23): 6622-6633.

Schmidt, A., Hall, M. N. and Koller, A. (1994). Two FK506 resistance-conferring genes in ������������ ��� �, ���� and ���&, encode amino acid

permeases mediating tyrosine and tryptophan uptake. ������������� �����, 14, (10): 6597-6606.

Schqtz, M. and Gafner, J. (1993). Analysis of yeast diversity during spontaneous and induced alcoholic fermentations. ��������������� ������� �����, 75, 551-558.

Schreve, J. L. and Garrett, J. M. (2004). Yeast Agp2p and Agp3p function as amino acid permeases in poor nutrient conditions. � ���� ���� ���� � ���� ����#����������� ��� ��, 313, (3): 745-751.

Schreve, J. L., Sin, J. K. and Garrett, J. M. (1988). The ������������ ��� ��7��? (YCL025c) gene encodes an amino acid permease, Agp1, which transports asparagine and glutamine. ���������������� �����, 180, (9): 2556-2559.

Segal, E. (1994). Cell wall. Pathogenic yeast and yeast infections. E. Segal and G. L. Baum. Salem, CRC Press�23-32.

Sengstag, C. and Hinnenbach, A. (1988). A 28-bp segment of the ��������������� � %)4? upstream activator sequence confers phosphate control to the CYC-���8 gene fusion. ��, 67, (2): 223-228.

Sentandreu, R. and Northcote, D. H. (1969). Yeast cell-wall synthesis. � ���� ���, 115, 231-240.

Sentheshanmuganathan, S. (1960). The mechanism of formation of higher alcohols from amino acids by ��������������� �. � ���� ���, 74, 568-576.

Shannon, K. W. and Rabinowitz, J. C. (1988). Isolation and characterization of the Saccharomyces cerevisiae *��� gene encoding mitochondrial C1-tetrahydrofolate synthase. �������� ��� � ���� ������� ���, 263, (16): 7717-7725.

Shepherd, M. G. (1987). Cell envelope of ���� ��� ��! ���. �� � ���� #� .� �� ���! �����, 15, 7-25.

Sinclair, D. A. (1995). Biochemcial and genetic charcterisation of �-�. Molecular Biology and Biochemistry. Sydney, UNSW. ����.

Sinclair, D. A. and Dawes, I. W. (1995). Genetics of the synthesis of serine from glycine and the utilization of glycine as sole nitrogen source by ��������������� �. ��� �, 140, (4): 1213-1222.

Sinclair, D. A., Hong, S.-P. and Dawes, I. W. (1996). Specific induction by glycine of the gene for the P-subunit of glycine decarboxylase from ��������������� �. �������� ���! �����, 19, (3): 611-623.

Skoneczny, M. and Rytka, J. (2000). Oxygen and haem regulate the synthesis of peroxisomal proteins: catalase A, acyl-CoA oxidase and Pex1p in the yeast ������������ ��� �; the regulation of these proteins by oxygen is not mediated by haem. � ���� ���, 350, 313-319.

Snoek, I. S. I. and Steensma, H. Y. (2007). Factors involved in anaerobic growth of ��������������� �. 7��, 24, 1-10.

Som, I., Mitsch, R. N., Urbanowski, J. L. and Rolfes, R. J. (2005). DNA-bound Bas1 recruits Pho2 to activate �-��genes in ��������������� �. ��2����� �����, 4, (10): 1725-1735.

Springael, J. Y. and André, B. (1998). Nitrogen-regulated ubiquitination of the �����permease of ��������������� �. ��������� ���������������, 9, (6): 1253-1263.

Springer, C., Künzler, M., Balmelli, T. and Braus, G. H. (1996). Amino acid and adenine cross-pathway regulation act through the same 5'-TGACTC-3' motif in the yeast )*�<� promoter. �������� ��� � ���� ���� ��� ���, 271, (47): 29637-29643.

Stassi, P., Rice, J. F., Munroe, J. H. and Chicoye, E. (1987). Use of CO2 evolution rate for the study and control of fermentation. �������� ����>��������23, (2): 37-43.

Steffen, K. K., Mackay, V. L., Kerr, E. O., Tsuchiya, M., Hu, D., Fox., L. A., Dang, N., Johnston, E. D., Oakes, J. A., Tchao, B. N., Pak, D. N., Fields, S. and Kennedy, B. K. (2008). Yeast life span extension by depletion of 60S ribosomal subunits is mediated by ���". ���, 133, 292-302.

Subramanian, M., Qiao, W.-B., Khanam, N., Wilkins, O., Der, S. D., Lailch, J. D. and Bognar, A. L. (2005). Transcriptional regulation of the one- carbon metabolism regulon in ������������ ��� � by Bas1p. �������� ���! �����, 57, (1): 53-69.

Sundstrom, P. (2002). Adhesion in ���� �����' �������� ���! �����, 4, (8): 461-469.

Sychrova, H. and Chevallier, M. R. (1993). Cloning and sequencing of the ������������ ��� ��gene 67%��coding for a lysine-specific permease. 7��, 9, (7): 771-782.

Tabor, S. and Richardson, C. C. (1987). DNA sequence analysis with a modified bacteriophage T7 DNA polymerase. %���� ������������ ����������������� ��, 84, (14): 4767-4771.

Taherzadeh, M. J., Lidén, G., Gustafsson, L. and Niklasson, C. (1996). The effects of pantothenate deficiency and acetate addition on anaerobic batch fermentation of glucose by ������������ ��� �. ���� �� ���! ������ ����� ����������, 46, (2): 176-182.

Taillandier, P., Portugala, F. R., Fuster, A. and Strehaian, P. (2007). Effect of ammonium concentration on alcoholic fermentation kinetics by wine yeasts for high sugar content ����� ���! �����, 24, (1): 95-100

Tanaka, J. and Fink, G. R. (1985). The histidine permease gene ()*%�) of ��������������� �. ��, 38, (1-3): 205-214.

ter Linde, J. J., Liang, H., Daris, R. W., Steensma, H. Y., van Dijken, J. P. and Pronk, J. T. (1999). Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostate cultures of ������������ ��� �. �������� ��� ����� �����, 181, (24): 7409-7413.

Thevelein, J. M., Geladé, R., Holsbeeks, I., Lagatie, O., Popova, Y., Rolland, F., Stolz, F., Van de Velde, S., Van Dijck, P., Vandormael, P., Van Nuland, A., Van Roey, K., Van Zeebroeck, G. and Yan, B. (2005). Nutrient sensing systems for rapid activation of the protein kinase A pathway in yeast. � ���� ������� ���������� ��, 33, 253-256.

Thomas, D., Becker, A., and Surdin-Kerjan, Y. (2000). Reverse methionine biosynthesis from S-adenosylmethionine in eukaryotic cells. �������� ���� ���� ������� ���, 275, (52): 40718-40724.

Thomas, D., Hossack, J. and Rose, R. (1978). Plasma membrane lipid composition and ethanol tolerance in ��������������� �. ���� ������ ���! �����, 117, 239-245.

Thomas, D. and Surdin-Kerjan, Y. (1991). The synthesis of the two S-adenosyl-methionine synthetases is differently regulated in ������������ ��� �. ��������������������� �, 226, (1-2): 224-232.

Thomas, K. C. and Ingledew, W. M. (1990). Fuel alcohol production: effects of free amino nitrogen on fermentation of very-high gravity wheat mashes. ���� ��������� ��������� ���! �����, 56, 2046-2050.

Tong, A. H. Y., Evangelista, M., Parsons, A. B., Xu, H., Bader, G. D., Page, N., Robinson, M., Raghibizadeh, S., Hogue, C. W. V., Bussey, H., Andrews, B., Tyers, M. and Boone, C. (2001). Systematic genetic analysis with ordered arrays of yeast deletion mutants. �� ���294, 2364-2368.

Trinel, P. A., Lepage, G., Jouault, T., Strecker, G. and Poulain, D. (1997). Definitive chemical evidence for the constitutive ability of����� �����! ��� serotype A strains to synthesize beta-1,2 linked oligomannosides containing up to 14 mannose residues. �����6���, 416, (2): 203-206.

Trotter, P. J. and Voelker, D. R. (1995). Identification of a non-mitochondrial phosphatidylserine decarboxylase activity (%�-&) in the yeast ��������������� �. ������������ ���� ������� ���, 270, (11): 6062-60670.

Tsoi, B. M., Beckhouse, A. G., Gelling, C. L., Ratfery, M. J., Chui, J., Tsoi, A. M., Lauterbach, L., Rogers, P., Higgins, V. and Dawes, I. W. (2009). Essential role of one-carbon metabolism and Gcn4p and Bas1p transcriptional regulators during adaptation of anaerobiosis growth of ��������������� �. ������������ ���� ������� ���, 284, (17): 11205-11215.

Tsukahara, K., Hata, K., Sagane, K., Watanabe, N., Kuromitsu, J., Kai, J., Tsuchiya, M., Ohba, F., Jigami, Y., Yoshimatsu, K. and Nagasu, T. (2003). Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. �������� ���! �����, 48, 1029-1042.

Ulane, R. and Ogur, M. (1972). Genetic and physiological control of serine and glycine biosynthesis in �����������. ���������������� �����, 109, (1): 34-43.

Umemura, M., Okamoto, M., Nakayama, K., Sagane, K., Tsukahara, K., Hata, K. and Jigami, Y. (2003). GWT1 gene is required for inositol acylation of glycosylphosphatidylinositol anchors in yeast. �������� ��� � ���� ������� ���, 278, (26): 23639-23647.

Valerius, O., Brendel, C., Wagner, C., Krappmann, S., Thoma, F. and Braus, G. H. (2003). Nucleosome position-dependent and independent acitivation of )*�<�expression in ��������������� ��by different transcriptional activators. ��2����� �����, 2, (5): 876-885.

van de Rest, M. E., Kamminga, A. H., Nakano, A., Anraku, Y., Poolman, B. and Konings, W. N. (1995). The plasma membrane of ��������������� � structure, function and biogenesis. ���! ���� ����#� ., 59, (2):

van den Brink, J., Daran-Lapujade, P., Pronk, J. T. and H., d. W. J. (2008). New insights into the ������������ ��� � fermentation switch: Dynamic transcriptional response to anaerobicity and glucose-excess. � ������ �, 9, (100):

van der Varrt, J. M., Caro, L. H., Chapman, J. W., Klis, F. M. and Verrips, C. T. (1995). Identification of three mannoproteins in the cell wall of ��������������� �. ���������������� �����, 177, (11): 3104-3110.

van Iersel, M. F. M., van Dieren, B., Rombouts, F. M. and Abee, T. (1999). Flavor formation and cell physiology during the production of alcohol-free beer with immobilized ������������ ��� �. ��,��� ���� ���! ��� ���������, 24 (7): 407-411.

Vandenbol, M., Jauniaux, J. C. and Grenson, M. (1989). Nucleotide sequence of the ��������������� � %$�"�proline-permease-encoding gene: similarities between ����, )*%��and %$�"�permeases. ��, 83, (1): 153-139.

Varela, C., Cardenas, J., Melo, F. and Agosin, E. (2005). Quantitative analysis of wine yeast gene expression profiles under winemaking conditions. 7��, 22, 369-383.

Wainwright, T. (1971). Biochemisty of Brewing. Modern brewing technology. W. P. K. Findlay. London, Macmillan press�129-163.

Walker, G. M. (1994). The roles of magnesium in biotechnology. �� � ����#� .� ��� ����������, 14, (4): 311-354.

Walker, G. M. (1998a). Magnesium as a stress-protectant for industrial strains of ������������ ��� �. �������� ��� ��� ��� ���� ��� ��� ��� ��. ������ ���56, (3): 109-113.

Walker, G. M. (1998b). 7������ ����������! ����������. Chichester, John Wiley & Sons.

Walker, G. M. (2004). Metals in yeast fermentation processes. Advances in Applied Microbiology A. I. Laskin, J. W. Bennett and G. M. Gadd. New York, Elsevier Academic Press. ���197-230.

Walker, G. M. and Duffus, J. H. (1980). Magnesium ions and the control of the cell cycle in yeast. ����������������� ��, 42, (1): 329-356.

Walker, G. M. and Maynard, A. I. (1997). Accumulation of magnesium ions during fermentative metabolism in ������������ ��� �. �������� ��� *����� ��� ���! ����������� ����������, 18, (1): 1-3.

Wek, R. C., Jackson, B. M. and Hinnebusch, A. G. (1989). Juxtaposition of domains homologous to protein kinases and histidyl-tRNA synthetases in ���&�protein suggests a mechanism for coupling ���"� expression to amino acid availability. %���'�����'�����'��� '�$'�'�', 86, (12): 4579-4583.

West, M. G., Horne, D. W. and Appling, D. R. (1996). Metabolic role of cytoplasmic isozymes of 5,10-methylenetetrahydrofolate dehydrogenase in ��������������� �. � ���� ���, 35, (9): 3122-3132.

West, M. G., Horne, D. W., Appling, D. R (1996). Metabolic role of cytoplasmic isozymes of 5,10-methylenetetrahydrofolate dehydrogenase in Saccharomyces cerevisiae. . � ���� ���, 35, (9): 3122-32.

White, T. C. (1997). Increased mRNA levels of �#��@, �-#, and -#��correlate with increases in azole resistance in ���� �����! ����isolates from a patient infected with human immunodeficiency virus. ��� � ���! ��� ����� ��������������, 41, 1482-1487.

Wiebe, M. G., Rintala, E., Tamminen, A., Simolin, H., Salusjärvi, L., Toivari, M., Kokkonen, J. T., Kiuru, J., Ketola, R. A., Jouhten, P., Huskonen, A., Maaheimo, H., Ruohonen, L. and Penttilä, M. (2008). Central carbon metabolism of ������������ ��� � in anaerobic, oxygen-limited and fully aerobic steady-state conditions and following a shift to anaerobic conditions. �� ��7���#����, 8, 140-154.

Wikén, T. O., Verhaar, A. J. M. and Scheffers, W. A. (1962). The influence of potassium and sodium ions on the negative pasteur effect in� ���������������� �custers ���� ����� ���! �����, 42 (2): 226-236.

Willaert, R. and Nedovic, V. A. (2006). Primary beer fermentation by immobilised yeast—a review on flavour formation and control strategies. �������� ������ ��������������1�� ����������, 81, (8): 1353-1367.

Wu, J., Zhang, N., Hayes, A., Panoutsopoulou, K. and Oliver, S. G. (2004). Global analysis of nutrient control of gene expression in ������������ ��� � during growth and starvation. %���� ��� ��� ��� ��� ����� ������� ����� ��, 101, 3148-3153.

Xiao, W., Ed. (2006). Methods in Molecular Biology: Yeast Protocols. Extraction of Yeast Lipids. Totowa, New Jersey, Humana Press Inc.

Yamauchi, Y., Okamoto, T., Murayama, H., Nagara, A., Kashihara, T., Yoshida, M. and Nakanishp, K. (1995). Rapid fermentation of beer using an immobilized yeast multistage bioreactor system ���� ��� ���� ���� ����� ����������, 53, (3): 245-259.

Yeh, C. J., Hsi, B. L. and Faulk, W. P. (1981). Propidium iodide as a nuclear marker in immunofluorescence. II. Use with cellular identification and viability studies. �����������*�������� ���� ����, 43, (3): 269-275.

Yin, Q. Y., de Groot, P. W. J., Dekker, H. L., de Jong, L. and Klis, F. M. (2005). Comprehensive proteomic analysis of ������������ ��� � cell walls. ������������ ���� ������� ���, 280, (21): 20894-20901.

Yoshioka, K. and Hashimoto, N. (1981). Ester Formation by Alcohol Acetyltransferase from Brewers' Yeast. ��� �������������� ���� ������� ���, 45, (10): 2183-2190.

Yoshioka, K. and Hashimoto, N. (1983). Cellular Fatty Acid and Ester Formation by Brewers' Yeast. ��� �������������� ���� ������� ���, 47, (10): 2287-2294.

Zhang, F., Kirouac, M., Zhu, N., Hinnebusch, A. G. and Rolfes, R. J. (1997). Evidence that complex formation by Bas1p and Bas2p (Pho2p) unmasks the activation function of Bas1p in an adenine-repressible step of �-� gene transcription. ������������� �����, 17, 3272-3283.

Zhu, X., Garrett, J., Schreve, J. and Michaeli, T. (1996). ��%�, the high-affinity glutamine permease of �'���� �. ���������� �, 30, (2): 107-114.

Zlotnik, H., Fernandez, M. P., Bowers, B. and Cabib, E. (1984). ��������������� � mannoproteins form an external cell wall layer that determines wall porosity. ���������������� �����, 159, (3): 1018-1026.

Appendix Table 1. Proteins peptide found in various time point in wild type BY4743 and gcn4 mutant by mass spectrometry Protein Measured mass (Da) Mascot score % of peptide found no. of time found

name wt gcn4 wt gcn4 wt gcn4 wt gcn4

Yin Tsoi Yin Tsoi Yin Tsoi Yin Tsoi

0h 0h 24h 0h 24h 48h 24h* 0h 0h 24h 0h 24h 48h 24h* 0h 0h 24h 0h 24h 48h 24h* 0h 0h 24h 0h 24h 48h 24h*

Ccw14p YLR391wp 1583.8 1001.5 871.41 1524.6 1258 871 871 116 20 31 57 20 21 40 11.8 8.93 6.47 0.81 1.72 3.33 2 1 1 2 2 1 1 1

2221 1072.5 1001.5 1525 39 38 26 47 1 2 2 2

3475.7 1395.6 1138.5 29 49 36 1 2 2

2675 1520.6 1395.6 32 53 39 1 2 1

2803.1 1583.8 1524.6 40 62 51 1 4 2

1272.4 1653.6 1653.6 24 60 66 1 2 2

2259 1723.7 45 28 1 2

2130.9 2037.9 142 53 1 2

2152.9 56 2

2675.1 34

Cis3p YJL158cp 828.48 828.48 828.48 1900 828 828 85 59 62 56 59 59 4.02 8.82 5.28 2.87 10 8 2 2 7 3 2 2

960.55 943.41 1899.9 1902 1075 1075 42 28 66 77 27 32 2 1 6 2 1 2

1554.8 1074.6 29 45 1 1

1556.7 1226.6 23 43 1 2

1899.9 1469.7 32 57 1 1

1901.8 1669.8 50 21 2 1

1724.9 21 1

1899.9 61 2

1901.8 50 2

2020 43 2

Crh1p YGR189cp 808.41 653.35 713.47 713.46 823.4 713 713 27 34 24 37 46 24 36 8.82 4.46 4.12 5.28 2.87 6.67 8 1 2 2 4 1 1 1

1241.6 713.47 1213.6 823.38 1214 1214 823 111 25 36 49 52 26 27 1 1 1 2 2 1 1

1121.5 1246.5 1246.5 934.48 1462 1214 23 48 57 51 59 35 1 2 2 3 2 1

1325.6 1461.7 2012.9 1213.6 1326 24 54 90 58 34 1 2 2 2 1

1081.6 1781.8 1461.7 49 90 56 1 2 2

1209.7 2012.9 45 77 1 1

Crh2p YEL040wp 1826.8 1077.5 1087.6 1077.5 1078 17 83 30 92 72 2.94 1.34 2.35 1.63 1.15 1 1 2 4 2

1110.6 1205.5 1205.5 22 33 29 1 1 2

1487.7 31 1

Cwp1p YKL96wp 1250.6 638.26 908.46 907.46 908.5 845 958 63 31 38 47 49 22 33 19.1 7.14 5.29 6.5 12.1 16.7 10 1 2 2 4 4 1 1

1136.7 908.46 1086.5 1086.5 1087 1090 1089 49 22 52 41 33 33 44 1 1 2 2 4 2 1

1945.9 936.46 1089.5 1214.7 1215 1228 1228 90 21 63 61 50 35 42 1 1 2 4 5 1 1

1352.8 1048.6 1329.7 1225.6 1330 1251 1251 57 34 54 42 59 29 33 1 1 2 2 8 1 2

1640.8 1089.5 1640.75. 1329.7 135 46 53 55 1 1 1 4

1882 1166.5 83 29 1 2

1847.9 1250.6 102 43 1 2

1397.6 1329.7 89 48 1 2

2225.1 1470.7 84 60 1 3

958.49 1640.8 65 41 1 1

2030 59 1

1089.5 63 1

1544.8 35 1

Ecm33p YBR078wp 1202.6 1286.7 754.33 754.33 1003 1203 1045 43 63 36 34 31 33 20 7.35 2.68 7.06 3.25 2.87 6.67 6 1 1 2 3 1 1 1

1574.9 1507.8 1002.5 1002.5 1287 1526 1287 65 30 49 40 76 54 48 1 2 2 2 1 1 1

1318.6 1525.8 1078.6 1286.7 1331 1526 60 71 20 79 62 59 1 2 1 2 1 1

1623.8 1574.8 1095.6 1705.9 1478 56 40 20 49 56 1 1 1 1 2

1751.9 1330.7 10 22 1 1

1507.8 22 1

1525.8 78 2

1574.8 56 2

Gas1p YMR307wp 1255.7 828.48 828.48 1127.6 963.5 1255 828 18 31 31 26 31 31 26 5.88 5.36 3.53 3.25 3.45 3.33 4 1 2 2 4 2 1 1

1699.8 956.58 1322.6 1423.7 1128 1255 48 28 30 40 50 60 1 1 2 1 2 1

1694.8 1078.5 1588.7 1662.8 1424 48 40 50 57 45 1 2 2 3 1

1192.5 1254.7 1663 57 92 39 1 2 1

1310.6 30 1

1322.6 36 2

1588.7 62 2

Gas3p YMR215wp 1427.7 1062.5 1097.5 996.49 996.5 1307 33 25 35 45 21 30 7.35 4.02 2.35 7.72 7.47 2 1 2 2 4 1 1

1543.8 1135.6 1306.6 1135.6 1062 86 35 33 22 43 1 2 1 1 1

1577.8 1423.6 1423.6 1266.6 1136 58 63 51 42 68 1 2 1 2 3

1513.7 1621.6 1423.6 1267 23 61 70 67 1 2 3 1

1256.6 1782.9 1580.8 1581 43 48 78 46 1 1 2 2

1621.6 1622 47 29 2 3

1724.9 1725 54 64 3 2

1782.9 28 2

Gas5p YOL030wp 1125.6 1159.6 1159.5 1289.6 1988 1160 1160 34 30 25 41 67 21 31 5.88 4.46 5.88 2.85 1.72 3.33 4 1 2 2 5 3 1 2

886.49 1182.6 1182.6 1987.9 22 55 54 61 1 2 1 2

1819.8 1289.6 1313.6 17 44 27 1 2 1

1599.8 1393.7 1393.7 42 88 46 1 1 1

1987.9 1528.7 74 40 3 1

1632.7 42 2

1987.9 75 2

Gls1p YGL027cp 1168.6 606.35 713.48 357.8 49 25 27 27 12.5 8.24 11.8 8.62 2 1 2 1

1243.5 614.38 766.39 420.2 28 21 23 30 2 1 2 1

1310.6 694.4 771.42 437.7 31 23 29 23 1 1 1 1

1330.6 713.48 873.44 585.3 45 21 22 51 2 1 2 2

1344.7 1110.6 1002.5 607.9 37 24 27 39 1 1 1 1

1383.6 1168.6 1213.7 624.3 46 42 46 74 2 1 2 2

1425.8 1243.5 1243.5 873.4 46 24 33 25 2 2 2 1

1529.7 1425.8 1257.7 897.5 31 57 23 65 1 2 1 1

1615.8 1511.8 1258.6 1214 56 38 30 29 2 2 2 1

1783.9 1529.7 1313.6 1426 56 50 27 93 4 2 4 2

1819.8 1315.6 1793 68 42 70 2 2 2

1826.9 1425.8 60 84 2 2

1942 1476.7 32 40 1 3

2041 1942.1 58 68 2 3

2108.9 88 2

Gls2p YGL027cp 606.35 713.48 25 27 6.1 2

614.38 766.39 21 23 1

694.4 1213.7 23 46 3

713.48 1243.5 21 33 3

1088.5 1258.6 39 30 2

1168.6 1425.8 42 84 1

1243.5 1476.7 24 40 1

1364.7 1810.9 41 21 1

1425.8 1942.1 57 68 1

1463.8 43

1511.8 38

1529.7 50

1793.9 41

1810.9 62

2090.9 66

Pir1p YKL164cp 1078.5 828.48 759.41 759.41 1805 759 86 85 25 22 52 33 4.41 5.36 13.5 13.4 13.8 14 1 2 2 4 3 3

1675.7 945.39 828.48 828.48 1868 828 18 22 59 62 74 59 1 1 2 5 11 3

2175.9 1072.4 958.38 1804.9 1904 1079 82 33 51 56 55 32 1 2 2 3 1 1

1078.5 1072.4 1867.9 2418 30 28 68 28 1 2 3 3

1455.7 1226.6 1903.8 2522 21 43 68 50 1 2 4 6

1513.6 1455.7 2146.9 37 22 43 1 2 4

1556.7 1469.7 2418.2 23 57 43 1 1 6

2168 1620.7 2522.2 62 39 30 2 1 4

2522.3 1627.7 36 30 1 1

1867.9 43 2

2020 43 2

2168 26 1

2522.2 37 3

Pir2p YJL159wp 1092.5 83 2.94 1

1376.7 58 1

Pir3p YKL163wp 2270.1 828.48 50 85 1.47 4.46 1 2

837.36 29 2

945.39 22 1

1455.7 21 1

1556.7 23 1

2168 62 2

2522.3 36 1

Pmt1p YDL095wp 857.53 875.49 875.48 965.4 1028 20 22 22 33 31 3.13 1.18 3.25 6.32 4 1 1 2 2 1

965.42 1027.5 1128.7 1082 1129 26 56 57 36 29 1 1 1 3 1

1027.5 1239.7 1259 54 23 40 2 1 3

1261.6 1369.7 1370 39 38 30 2 1 1

2021.9 1459.7 1460 127 40 32 1 1 2

1505.8 56 2

Pmt2p YAL023cp 1187.7 861.47 766.4 1370 802 52 20 29 43 24 3.13 3.53 5.28 6.32 2 1 1 4 5 1

1369.8 976.52 1369.7 1441 39 22 47 38 2 2 2 3

1440.7 1417.8 1440.7 1647 41 39 33 80 2 1 4 2

1646.7 1440.7 1646.7 1835 80 29 80 43 1 1 2 1

1834.9 1650.8 1834.9 34 57 58 1 1 1

Pmt4p YJR143cp 615.37 615.37 1247.7 28 26 34 2.23 1.76 1.22 1 1 1

1247.7 798.5 1444.7 30 31 31 2 1 2

1444.7 1867 78 50 2 1

1866.9 45

Pry3p YJL078cp 1677 974.41 1084.5 1067.5 21 47 31 32 2.94 1.79 1.18 2.03 1 2 2 2

1084.5 1084.5 1368.6 22 45 37 1 2 3

Pyr1p YKL216wp 729.4 1028.6 813.37 813.4 28 42 30 27 19.6 3.53 15.4 18.4 2 2 2 2

785.43 1453.8 815.43 913.6 34 39 34 47 1 1 1 3

808.41 1541.9 913.56 967.5 26 29 43 21 2 2 2 1

813.37 1638.8 976.51 1020 23 49 49 31 1 1 2 1

872.51 1026.5 1026 35 38 34 2 2 1

1006.5 1028.6 1051 21 45 27 1 3 1

1028.6 1274.7 1113 28 53 65 2 2 2

1054.6 1307.7 1226 33 37 22 2 2 1

1083.5 1363 1255 29 38 65 2 2 2

1136.7 1392.8 1257 28 69 78 2 2 2

1233.7 1444.7 1282 30 29 52 2 2 3

1234.7 1470.7 1308 30 53 40 2 1 2

1251.6 1490.7 1364 39 39 56 1 1 2

1256.6 1541.9 1445 45 58 21 1 3 2

1267.8 1602.9 1471 48 21 31 2 2 2

1317.6 1638.8 1535 23 68 50 1 1 3

1434.8 1745 1542 40 38 82 2 2 1

1453.8 2276.1 1639 56 29 73 2 2 1

1467.7 2334.3 25 29 2 2

1470.7 2393.2 76 44 2 2

1541.9 44 2

1543.8 31 1

1602.9 33 2

1638.8 79 2

1891.9 83 2

2097.1 32 1

Scw4p YGR279cp 1533.7 908.42 980.46 980.5 51 29 31 31 10.3 2.68 1.22 4.02 1 2 2 2

2018 1087.6 1251.6 1024 93 21 49 30 1 1 1 2

1685.8 1251.6 1085 113 50 23 1 2 1

1049.5 1504.7 1107 49 25 52 1 1 2

1257.7 37 1

1108.6 42 1

980.51 11 1

Ser3p

**

YER081wp 1064.5 616.39 730 800 41 23 29 29 2 2 1 1

1181.6 730.39 800 879 32 21 27 28 2 1 1 1

1478.9 800.48 879 1018 31 27 29 34 2 1 1 1

1769.9 844.42 1018 1055 57 30 35 23 2 1 1 1

2036 879.49 1055 1065 75 28 24 49 2 2 1 1

950.49 1065 1083 61 37 20 2 1 1

981.44 1182 1110 34 35 43 2 1 1

1065.5 1285 1182 24 35 37 1 1 1

1082.6 1419 1260 31 32 32 1 1 1

1109.6 1285 22 56 1 1

1175.6 1419 27 40 1 2

1272.7 2036 43 59 1 1

1310.6 44 1

1345.7 60 1

1418.6 68 2

1475.9 52 3

1702.8 65 2

1769.9 78 3

2036 87 4

Shm2p YLR058cp 897.41 650.36 1513 822 822 31 24 45 34 35 1 2 1 1 1

**

43 35 33 25 30 26 1 2 2 1 1

48 35 29 25 1 1 1

44 23 20 1 1

6.5 39 2

6.6 22 1

2.7 45 4

9.7 33 1

3.9 39 1

p .2 7 4 1 1 1 3 4 1 1

0.6 23 1 1 1

6.8 84 2

p 0.41 1 1

3.7 5 813 84 45 72 28 45 1 1 2 2 1

1.6 24 30 65 1 1 5

3.7 48 72 58 7 1 2

8.7 34 2

0.7 29 5

6.7 50 1

1.9 20 1

6.8 83 2

2 100 2

p 408 928 28 25 13.3 4 2 2

465 29 1

634 43 1

p 26 31 3.33 2 1 1

.7 45 4.41 1

.7 13 1

.6 44 1

9 8 1 1 2 1 1 1

9 1 1 3 1 1 1

0.7 1.6 30 53 57 56 32 2 2 2 1 1

3 45 41 45 1 3 1

0.7 23 1

8 39 2

998.45 840. 215

8 1015 1008

157

1.8 916. 1015

939. 1120

107

114

151

152

170

Tip1 YBR067cp

2070

1696.8

669.44 1696.8 169

784 784 69 66 27 26 43 33 28 1.47 0.45 2.35 1.22 2.3 6.67

116 1697 1697 50 50

169

Tir1 YER011wp

1983 1246.6 669.41 1540.7 722 722 33 24 22 30 23 21 2.94 0.89 14.1 16.7 18 1 1 1 1

1621 128

960. 1247

125 1247 1284

128 1284 1541

133

154

155

181

182

201

Tir2

Tir3 1212 1212

Tos1p

YBR162cp

1417

2899

1050

Ygp1p

YNL160wp

803.38 975.49 1188.7 118 1018 1018 20 27 22 28 30 26 1.79

4.71

2.03

4.02

10

1129.6 1129.6 2553.3

119 1130 1073 24 26 56 49 32 45

141

126 1788 118

9 1130

1403.7 255

1189

141

178

* Medium supplemented with L-serine 68 224 170 246 174 30 50

** Are not cell wall proteins

0

0.03

0.06

0.09

0 3 6Time (h)

Co

nc (µ m

ol/

10

8 c

ell

s)

0

0.2

0.4

0.6

0 3 6Time (h)

Co

nc (µ m

ol/

10

8 c

ell

s)

0

0.02

0.04

0.06

0 3 6Time (h)

Co

nc (µ m

ol/

10

8 c

ell

s)

D

0

0.05

0.1

0.15

0 3 6Time (h)

Co

nc.

(µ mo

l/10

8 c

ell

s)

0

0.25

0.5

0.75

0 3 6Time (h)

Co

nc (µ m

ol/

10

8 c

ell

s)

0

0.15

0.3

0.45

0 3 6Time (h)

Co

nc (µ m

ol/

10

8 c

ell

s)

A B

C

E F

Appendix Figure 1. Intracellular concentrations of L-Ala(A); L-Arg (B); L-Gln (C); L-Glu (D);

L-His (E); L-Ile (F) in wild-type and gcn4 mutant following a shift to anaerobiosis.

L-Ala L- Arg

L-GlnL-Glu

L-His L-Ile

0

0.15

0.3

0.45

0 3 6Time (h)

Co

nc (µ m

ol/

10

8 c

ell

s)

0

0.2

0.4

0.6

0 3 6Time (h)

Co

nc (µ m

ol/

10

8 c

ell

s)

0

0.15

0.3

0.45

0 3 6Time (h)

Co

nc (µ m

ol/

10

8 c

ell

s)

0

0.2

0.4

0.6

0 3 6Time (h)

Co

nc (µ m

ol/

10

8 c

ell

s)

0

0.4

0.8

1.2

0 3 6Time (h)

Co

nc (µ m

ol/

10

8 c

ell

s)

0

0.1

0.2

0.3

0 3 6Time (h)

Co

nc (µ m

ol/

10

8 c

ell

s)

G H

IJ

K L

L-Leu

L-Met

L-Pro

L-Lys

L-Phe

L-Try

Appendix Figure 1. Intracellular concentrations of L-Leu(G); L-Lys (H); L-Met (I); L-Phe (J);

L-Pro (K); L-Try (L) in wild-type and gcn4 mutant following a shift to anaerobiosis.

0

0.05

0.1

0.15

0 3 6Time (h)

Co

nc (µ m

ol/

10

8 c

ell

s)

0

0.2

0.4

0.6

0 3 6Time (h)

Co

nc (µ m

ol/

10

8 c

ell

s)

M NL-Tyr L-Val

Appendix Figure 1. Intracellular concentrations of L-Tyr(M); L-Val (N) in wild-type and gcn4 mutant

following a shift to anaerobiosis.

Appendix Figure 2A. Serine codon usage for mannoprotein genes in comparison

with the overall serine codon usage for all proteins in percentage (%). B. Total numbers

of serine condons contain in each mannoprotein genes. C. Percentage of serine in gene

product (%).


Recommended