Insert Code: SIN184, Version: 5 th November 2010, Page 1 of 12 HUMAN IgG SUBCLASS LIQUID REAGENT KITS For use on the Roche cobas® 6000 For in-vitro diagnostic use only Product codes: NK006.CB, NK007.CB, LK008.CB, LK009.CB Product Manufactured by: The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk Telephone: +44 (0)121 436 1000 Fax: +44 (0)121 430 7061 e-mail: [email protected]cobas® is a registered trademark of F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland 1 INTENDED USE This kit is intended as an in vitro diagnostic test for the quantification of Human IgG Subclasses in serum on the c501 module of the Roche cobas 6000 series turbidimetric analyser. Measurement of these immunoglobulins aids in the diagnosis of abnormal protein metabolism and the body’s lack of ability to resist infectious agents and should be used in conjunction with other clinical information. 2 SUMMARY AND EXPLANATION In normal adults, IgG constitutes approximately 75% of the total serum immunoglobulins. Within the IgG class, the usual order of concentration of the 4 subclasses is IgG1> IgG2> IgG3> IgG4, but the actual concentration of each may vary markedly between individuals. The four IgG subclasses show considerable differences in their properties, including ability to fix complement, to bind to macrophages and to pass through the placenta. Abnormal levels of one or more subclasses may be associated with certain conditions, including anaphylaxis, autoimmune and gut diseases as well as hypo- and hypergamma- globulinaemia (ref 1). In particular, reduced production of IgG2 in children may be associated with recurrent infections (ref 2). The subject has been reviewed (refs 3, 4 and 5). Roche turbidimetric analysers permit fully automatic, rapid quantitative measurement of precipitation reactions for protein determination and can run IgG1-4 assays concurrently. 3 PRINCIPLE OF THE ASSAY The determination of soluble antigen concentration by turbidimetric methods involves the reaction with specific antiserum to form insoluble complexes. When light is passed through the suspension formed a portion of the light is transmitted and focused onto a photodiode by an optical lens system. The amount of transmitted light is indirectly proportional to the specific protein concentration in the test sample. Concentrations are automatically calculated by reference to a standard curve stored within the instrument. Latex-enhanced antibodies: s ome antibody-antigen reactions do not form sufficiently large immune-complexes to be detected turbidimetrically. If the antibody is coated onto latex particles of a suitable size, the light scattering ability of the immune complexes formed with antigen is enhanced sufficiently to enable turbidimetric detection. 4 REAGENTS 4.1 Human IgG1/IgG2 antisera . These are monospecific for the relevant subclass and are supplied in stabilised liquid form. They contain 0.5% BSA and 0.099% sodium azide, 0.1% E-amino-N-caproic acid (EACA) and 0.01% benzamidine as preservatives. 4.2 Human IgG3/IgG4 latex reagent . Monospecific for the relevant subclass and supplied in stabilised liquid form. They contain 0.099% sodium azide as a preservative. 4.3 Calibrators and controls . These consist of pooled human serum and are supplied in liquid stabilised form. They contain 0.099% sodium azide, 0.1% EACA and 0.01% benzamidine as preservatives. The concentration of IgG subclasses given on the vial label has been obtained by comparison with the DA470k international reference material (ref. 6). 4.4 Reaction buffer . Contains 0.099% sodium azide as a preservative. 5 CAUTION All donors of human serum supplied in this kit have been serum tested and found negative for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibodies to human immunodeficiency virus (HIV1 and HIV2) and hepatitis C virus. The assays used were either approved by the FDA (USA) or cleared for in vitro diagnostic use in the EU (Directive 98/79/EC, Annex II); however, these tests cannot guarantee the absence of infective agents. Proper handling and disposal methods should be established as for all potentially infective material, including (but not limited to) users wearing suitable protective equipment and clothing at all times. Only personnel fully trained in such methods should be permitted to perform these procedures. WARNING: This product contains sodium azide and must be handled with caution; suitable gloves and other protective clothing should be worn at all times when handling this product. Do not ingest or allow contact with the skin (particularly broken skin or open wounds) or mucous membranes. If contact does occur wash with a large volume of water and seek urgent medical advice. Explosive metal azides may be formed on prolonged contact of sodium azide with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of water to prevent azide build up. This product should only be used by suitably trained personnel for the purposes stated in the Intended Use. Strict adherence to these instructions is essential at all times. Results are likely to be invalid if parameters other than those stated in these instructions are used. Reagents from different batch numbers of kits are NOT interchangeable. If large numbers of tests are performed care should be taken to ensure that all the reagents are from the same batch. 6 STORAGE AND STABILITY The unopened kit should be stored at 2-8°C and can be used until the expiry date shown on the kit box label. DO NOT FREEZE. The Reagent and Reaction Buffer may be stored in the c-pack for up to one month on the analyser after opening. The standard and controls may be stored at 2-8°C for up to 3 months after opening providing precautions to prevent evaporation and contamination are taken. 7 SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION Use fresh or deep frozen serum samples. Blood samples should be collected by venepuncture, allowed to clot naturally and the serum separated as soon as possible to prevent haemolysis. The serum may be stored at 2-8°C for up to 8 days prior to assay, or for prolonged storage kept undiluted at -20°C or below. Repeated freezing and thawing should be avoided. Microbially contaminated, haemolysed and lipaemic serum and samples containing particulate matter should not be used. 8 METHODOLOGY 8.1 Materials provided Code: NK006.CB, NK007.CB, LK008.CB, LK009.CB 8.1.1 1 x Human Antiserum for C6000 (IgG1 and IgG2) or Human Latex Reagent for C6000 (IgG3 and IgG4) to the appropriate subclass 8.1.2 1 x Antisera Reaction Buffer for C6000 (IgG1 and IgG2) or Latex Reaction Buffer for C6000 (IgG3 and IgG4) for the appropriate subclass 8.1.3 1 x 1.5mL Human IgG1/2/3/4 Subclass Calibrator for C6000 8.1.4 2 x 1mL Human IgG Subclass Low Control for C6000 8.1.5 2 x 1mL Human IgG Subclass Control for C6000 8.2 Materials required but not provided 8.2.1 Equipment for collection and preparation of test samples, eg sample tubes, centrifuge etc. 8.2.2 A fully operational and equipped cobas 6000. 8.2.3 Cobas c pack MULTI (Cat no. 04593138 190, available from Roche). 8.2.4 Cobas c pack MULTI open/close tool (available from Roche). 8.3 Loading reagents for the cobas 6000 series Transferring R1 and R2 into a c pack MULTI (see Figure 1) 8.3.1 Always use a new cobas c pack MULTI when preparing fresh reagent. 8.3.2 Filling the cobas c pack MULTI bottles incorrectly may result in a reduced number of tests or refusal of the cobas C pack MULTI by the instrument. 8.3.3 Transfer the antisera/latex reagent (R2) into position B and cap securely using a blue Roche opening tool. 8.3.4 Transfer the reaction buffer (R1) into position A (middle bottle) and cap securely using a Roche blue opening tool. 8.3.5 Leave position C empty. Figure 1: Transfer of reagents to c pack MULTI 8.4 Complete kit implementation instructions for the cobas c systems analysers are available. Please contact your local Binding Site distributor for further information. 8.5 Assigning reagents to Open Channel applications (To be carried out once the parameters have been entered into the open channel (see Appendix)). 8.5.1 Select Open Channel on the Reagent > Settings screen. 8.5.2 Select the appropriate test. 8.5.3 Select Reserve and OK to close the window. 8.5.4 Load a filled C pack MULTI onto the instument to assign it to the selected test. 8.6 Test procedure 8.6.1 Chemistry Parameters for cobas 6000 series are supplied in the attached appendix. 9 RESULTS Results are automatically printed in mg/L concentrations. No further calculations are necessary. Any results with LIM.L or LIM.H comments should not be used. The re-run results will however be correct. Results lower than the assay sensitivity should not be used (see below for approximate sensitivity). Quality Control: Values obtained for the control provided should be within 15% of the concentration stated on the QC certificate (SIN184.QC). If control results outside this range are obtained, check the instrument and the parameters and repeat the assay.
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cobas® is a registered trademark of F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland
1 INTENDED USE
This kit is intended as an in vitro diagnostic test for the quantification of Human IgG Subclasses in serum on the c501 module of the Roche cobas 6000 series turbidimetric analyser. Measurement of these immunoglobulins aids in the diagnosis of abnormal protein metabolism and the body’s lack of ability to resist infectious agents and should be used in conjunction with other clinical information.
2 SUMMARY AND EXPLANATION
In normal adults, IgG constitutes approximately 75% of the total serum immunoglobulins. Within the IgG class, the usual order of concentration of the 4 subclasses is IgG1> IgG2> IgG3> IgG4, but the actual concentration of each may vary markedly between individuals. The four IgG subclasses show considerable differences in their properties, including ability to fix complement, to bind to macrophages and to pass through the placenta. Abnormal levels of one or more subclasses may be associated with certain conditions, including anaphylaxis, autoimmune and gut diseases as well as hypo- and hypergamma-globulinaemia (ref 1). In particular, reduced production of IgG2 in children may be associated with recurrent infections (ref 2). The subject has been reviewed (refs 3, 4 and 5). Roche turbidimetric analysers permit fully automatic, rapid quantitative measurement of precipitation reactions for protein determination and can run IgG1-4 assays concurrently.
3 PRINCIPLE OF THE ASSAY
The determination of soluble antigen concentration by turbidimetric methods involves the reaction with specific antiserum to form insoluble complexes. When light is passed through the suspension formed a portion of the light is transmitted and focused onto a photodiode by an optical lens system. The amount of transmitted light is indirectly proportional to the specific protein concentration in the test sample. Concentrations are automatically calculated by reference to a standard curve stored within the instrument.
Latex-enhanced antibodies: some antibody-antigen reactions do not form sufficiently large immune-complexes to be detected turbidimetrically. If the antibody is coated onto latex particles of a suitable size, the light scattering ability of the immune complexes formed with antigen is enhanced sufficiently to enable turbidimetric detection.
4 REAGENTS
4.1 Human IgG1/IgG2 antisera. These are monospecific for the relevant subclass and are supplied in stabilised liquid form. They contain 0.5% BSA and 0.099% sodium azide, 0.1% E-amino-N-caproic acid (EACA) and 0.01% benzamidine as preservatives.
4.2 Human IgG3/IgG4 latex reagent. Monospecific for the relevant subclass and supplied in stabilised liquid form. They contain 0.099% sodium azide as a preservative.
4.3 Calibrators and controls. These consist of pooled human serum and are supplied in liquid stabilised form. They contain 0.099% sodium azide, 0.1% EACA and 0.01% benzamidine as preservatives. The concentration of IgG subclasses given on the vial label has been obtained by comparison with the DA470k international reference material (ref. 6).
4.4 Reaction buffer. Contains 0.099% sodium azide as a preservative.
5 CAUTION
All donors of human serum supplied in this kit have been serum tested and found negative for hepatitis B surface antigen (HBsAg) and antibodies to human immunodeficiency virus (HIV1 and HIV2) and hepatitis C virus. The assays used were either approved by the FDA (USA) or cleared for in vitro diagnostic use in the EU (Directive 98/79/EC, Annex II); however, these tests cannot guarantee the absence of infective agents. Proper handling and disposal methods should be established as for all potentially infective material, including (but not limited to) users wearing suitable protective equipment and clothing at all times. Only personnel fully trained in such methods should be permitted to perform these procedures.
WARNING: This product contains sodium azide and must be handled with caution; suitable
gloves and other protective clothing should be worn at all times when handling this product. Do not ingest or allow contact with the skin (particularly broken skin or open wounds) or mucous membranes. If contact does occur wash with a large volume of water and seek urgent medical advice. Explosive metal azides may be formed on prolonged contact of sodium azide with lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of water to prevent azide build up.
This product should only be used by suitably trained personnel for the purposes stated in the Intended Use. Strict adherence to these instructions is essential at all times. Results are likely to be invalid if parameters other than those stated in these instructions are used.
Reagents from different batch numbers of kits are NOT interchangeable. If large numbers of
tests are performed care should be taken to ensure that all the reagents are from the same batch.
6 STORAGE AND STABILITY
The unopened kit should be stored at 2-8°C and can be used until the expiry date shown on the kit box label. DO NOT FREEZE. The Reagent and Reaction Buffer may be stored in the c-pack for up to one month on the analyser after opening. The standard and controls may be stored at 2-8°C for up to 3 months after opening providing precautions to prevent evaporation and contamination are taken.
7 SPECIMEN COLLECTION AND PREPARATION
Use fresh or deep frozen serum samples. Blood samples should be collected by
venepuncture, allowed to clot naturally and the serum separated as soon as possible to prevent haemolysis. The serum may be stored at 2-8°C for up to 8 days prior to assay, or for prolonged storage kept undiluted at -20°C or below. Repeated freezing and thawing should be avoided. Microbially contaminated, haemolysed and lipaemic serum and samples containing particulate matter should not be used.
8 METHODOLOGY
8.1 Materials provided
Code: NK006.CB, NK007.CB, LK008.CB, LK009.CB
8.1.1 1 x Human Antiserum for C6000 (IgG1 and IgG2) or Human Latex Reagent for C6000 (IgG3 and IgG4) to the appropriate subclass
8.1.2 1 x Antisera Reaction Buffer for C6000 (IgG1 and IgG2) or Latex Reaction Buffer for C6000 (IgG3 and IgG4) for the appropriate subclass
8.1.3 1 x 1.5mL Human IgG1/2/3/4 Subclass Calibrator for C6000 8.1.4 2 x 1mL Human IgG Subclass Low Control for C6000 8.1.5 2 x 1mL Human IgG Subclass Control for C6000 8.2 Materials required but not provided
8.2.1 Equipment for collection and preparation of test samples, eg sample tubes, centrifuge etc.
8.2.2 A fully operational and equipped cobas 6000. 8.2.3 Cobas c pack MULTI (Cat no. 04593138 190, available from Roche). 8.2.4 Cobas c pack MULTI open/close tool (available from Roche). 8.3 Loading reagents for the cobas 6000 series
Transferring R1 and R2 into a c pack MULTI (see Figure 1)
8.3.1 Always use a new cobas c pack MULTI when preparing fresh reagent. 8.3.2 Filling the cobas c pack MULTI bottles incorrectly may result in a reduced
number of tests or refusal of the cobas C pack MULTI by the instrument. 8.3.3 Transfer the antisera/latex reagent (R2) into position B and cap securely using a
blue Roche opening tool. 8.3.4 Transfer the reaction buffer (R1) into position A (middle bottle) and cap securely
using a Roche blue opening tool. 8.3.5 Leave position C empty.
Figure 1: Transfer of reagents to c pack MULTI
8.4 Complete kit implementation instructions for the cobas c systems analysers are available. Please contact your local Binding Site distributor for further information.
8.5 Assigning reagents to Open Channel applications (To be carried out once the parameters have been entered into the open channel (see Appendix)).
8.5.1 Select Open Channel on the Reagent > Settings screen. 8.5.2 Select the appropriate test. 8.5.3 Select Reserve and OK to close the window. 8.5.4 Load a filled C pack MULTI onto the instument to assign it to the selected test.
8.6 Test procedure
8.6.1 Chemistry Parameters for cobas 6000 series are supplied in the attached appendix.
9 RESULTS
Results are automatically printed in mg/L concentrations. No further calculations are necessary. Any results with LIM.L or LIM.H comments should not be used. The re-run results will however be correct. Results lower than the assay sensitivity should not be used (see below for approximate sensitivity). Quality Control:
Values obtained for the control provided should be within 15% of the concentration stated on the QC certificate (SIN184.QC). If control results outside this range are obtained, check the instrument and the parameters and repeat the assay.
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10 LIMITATIONS
10.1 Turbidimetric assays are not suitable for measurement of highly lipaemic or
haemolysed samples or samples containing high levels of circulating immune complexes (CICs) or rheumatoid factors due to the unpredictable degree of non-specific scatter these sample types may generate. Unexpected results should be confirmed using an alternative assay method e.g. radial immunodiffusion.
Samples containing paraproteins are not suitable for this assay due to their highly variable nature which may result in antigen excess.
10.2 The results obtained from measuring IgG subclasses should not be used in assessing atopy in allergic patients.
10.3 Diagnosis cannot be made and treatment must not be initiated on the basis of IgG subclass measurements alone. Clinical history and other laboratory findings must also be taken into account.
10.4 Customers are strongly recommended to run both controls with every batch of samples being assayed. Should a control value obtained be out of range when run against a stored curve the assay must be recalibrated. If they fall outside the acceptable limits against the new calibration curves the instrument and the parameters entered should be checked before repeating the assay. If problems persist, refer to supplier.
10.5 The measuring ranges of the kit are as given:
Specificity Approximate measuring range
(mg/L) Approximate sensitivity
(mg/L)
IgG1 1000 – 20000 333.3
IgG2 600 – 10000 60
IgG3 70 – 1312.5 14
IgG4 67.5 – 810 9
11 EXPECTED VALUES
The ranges provided below have been obtained from a limited number of British samples and are intended for guidance purposes only. Wherever possible it is strongly recommended that local ranges are generated.
11.1 Adult normal ranges
These ranges were obtained by measuring the subclass content of sera provided by the Birmingham Blood Transfusion Service taken from healthy adult donors.
Protein Number
(n) Mean (mg/L)
Median (mg/L)
95 percentile range (mg/L)
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
30 30 30 30
6330 4528 790.7 280.0
6085 4541 706.4 215.3
3824 2418
218.2 39.2
- - - -
9286 7003 1761 864
11.2 Paediatric ranges
These ranges were obtained by measuring the total IgG and subclass content of paediatric serum samples from a Birmingham Hospital using Binding Site Radial Immunodiffusion products. All concentrations are in mg/L.
0-2 years N Mean 95%ile range
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
39 39 39 39 39
5248 838 445 129
6640
1940 – 8420 225 – 3000 186 – 853 5 – 784
3270 – 12700
2-4 years
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
36 36 36 36 36
5495 1146 396 171
7770
3150 – 9450 360 – 2250 173 – 676 10 – 537
4680 – 12500
4-6 years
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
49 49 49 49 49
6149 1496 531 329
9280
3060 – 9450 605 – 3450 99 – 1221 18 – 1125
5320 - 13400
6-8 years
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
43 43 43 43 43
5758 1754 437 331
8860
2880 – 9180 440 – 3750 155 – 853 4 – 992
4540 – 13600
8-10 years
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
32 32 32 32 32
6345 2126 521 349
9700
4320 – 10200 720 – 4300 127 – 853 19 – 932
5680 - 13600
10-12 years
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
46 46 46 46 46
6421 1980 620 323
10200
4230 – 10600 760 – 3550 173 – 1730 16 – 1150
5680 - 14900
12-14 years
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
54 54 54 54 54
6581 2486 583 409
10500
3420 – 11500 1000 – 4550 283 – 1250 37 – 1360
6640 – 14900
14-18 years
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
48 48 48 48 48
6057 2614 708 521
10100
3150 – 8550 640 – 4950 230 –1960 110 – 1570
5500 – 14400
12 PERFORMANCE CHARACTERISTICS
The following data was obtained using a Roche cobas 6000.
12.1 Within run precision A study was performed following CLSI Evaluation of Precision Performance of Clinical Quantitative Measurement Methods; Approved Guideline (CLSI Document EP5-A2). The study was performed over 21 working days, with two runs per day. One user assessed three different samples using three different reagent lots on one analyser.
12.2 Linearity The linearity of these assays has been confirmed using serially diluted serum samples, giving regression equations of:
IgG1 y=1.033x – 12.05 (mg/L), R2 =0.9991
(y = measured IgG1 conc., x = theoretical conc.) over the range of 425-19425mg/L.
IgG2 y=1.015x – 30.56 (mg/L), R2 =0.9991
(y = measured IgG2 conc., x = theoretical conc.) over the range of 62.4 – 8916mg/L.
IgG3 y=1.007x – 9.03 (mg/L), R2 =0.9989
(y = measured IgG3 conc., x = theoretical conc.) over the range of 23.5 – 1175mg/L.
IgG4 y=1.01x – 2.25 (mg/L), R2 =0.9994
(y = measured IgG4 conc., x = theoretical conc.) over the range of 79.1 – 777mg/L.
12.3 Interference No significant assay interference by 200mg/L bilirubin or 5g/L haemoglobin (Hb) and 1540 FTU chyle has been demonstrated upon addition to IgG subclass control serum. All testing was performed at the minimum sample dilution.
Based on CLSI document EP17-A - Protocols for Determination of Limit of Detection and Limit of Quantitation; Approved Guideline.
Specificity Limit of detection (mg/L) Limit of quantitation (mg/L)
IgG1 80.77 991.75
IgG2 14.98 560.54
IgG3 5.39 69.4
IgG4 2.73 70.5
12.5 Comparison
A correlation study was performed using this kit on the cobas 6000 and the Modular P for IgG1-4. The study demonstrated agreement with the following Passing Bablok plots:
IgG1 y = 0.97x + 57.27mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P)
correlation coefficient r = 0.984 (calculated by linear regression) n= 91 (30 normal serum and 61 clinical serum)
IgG2 y = 0.99x + 43.68mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P) correlation coefficient r = 0.994 (calculated by linear regression) n= 104 (30 normal serum and 74 clinical serum)
IgG3 y = 0.95x + 12.44mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P)
correlation coefficient r = 0.988 (calculated by linear regression) n= 108 (30 normal serum and 78 clinical serum)
IgG4 y = 1.00x + 9.78mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P) correlation coefficient r = 0.993 (calculated by linear regression) n= 91 (30 normal serum and 61 clinical serum)
12.6 Antigen excess These assays were tested to the levels shown in the table below. No antigen excess was observed at these concentrations.
Specificity Concentration (g/L)
IgG1 55.77
IgG2 21.0
IgG3 4.82
IgG4 2.76
Insert Code: SIN184, Version: 5th November 2010, Page 3 of 12
13 BIBLIOGRAPHY
1. Shakib, F & Stanworth, D R (1980). Human IgG subclasses in health and
disease (Part II). La Ricerca Clin. Lab. 10, 561-580.
2. Shackleford, P G, Polmar, S H et al. (1986). Spectrum of IgG2 subclass deficiency in children with recurrent infections: Prospective study. J. Pediatr. 108,
647-653. 3. Hamilton, R H (1987). Human IgG subclass measurements in the clinical
laboratory. Clin. Chem. 33, 1707 – 1725. 4. Schur, P H (1987). IgG subclasses – a review. Annals of Allergy, 58, 89-99.
5. Vlug, A & Van Remortel, P (1989). The structure and function of human IgG subclasses. Eur. Clin. Lab. 8 (5), 26-35.
6. Williams, D.R., Wilson, C.T., Carr-Smith, H.D. (2009). Assignment of IgG Subclass Values to the Protein Reference Preparation DA470k. Clin. Chem. Vol. 55, No. S6, PS C-90.
IgG SUBKLASSEN (HUMAN) KIT ZUR VERWENDUNG AUF DEN ROCHE
Hergestellt von: The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K. www.bindingsite.co.uk
Vertrieb in Deutschland und Österreich durch: The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A, D-68723 Schwetzingen, Deutschland Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0 Fax: +49 (0) 6202 92 62 222
cobas® ist ein eingetragenens Warenzeichen von F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Schweiz
1 VERWENDUNGSZWECK
Zur quantitativen Bestimmung von Human IgG Subklassen im Serum mit der Roche cobas 6000 Serie Analysegeräten. Die Bestimmung dieser Immunglobuline dient der Unterstützung der Diagnose eines abnormalen Proteinmetabolismus und zur Erkennung des Unvermögens des Körpers auf infektiöse Erreger zu reagieren. Die Testergebnisse sollten in Verbindung mit dem klinischen Bild und anderen Laborbefunden verwendet werden.
2 EINLEITUNG
Bei gesunden Erwachsenen, stellt IgG 75% des Gesamt-Immunglobulins dar. Innerhalb der IgG-Klasse nimmt die Konzentration in der Reihenfolge IgG1>IgG2>IgG3>IgG4 ab, wobei der tatsächliche Gehalt individuell deutlich variieren kann. Die vier IgG Subklassen zeigen deutliche Unterschiede in ihren Eigenschaften, wie z.B. Fähigkeit zur Komplementbindung, Makrophagenbindung und Plazentadurchlässigkeit. Von der Norm abweichende Werte einer oder mehrerer Subklassen können mit verschiedenen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden, wie z.B. Anaphylaxie, Autoimmunerkrankungen, Darmerkrankungen, sowie Hypo- und Hypergammaglobulin-ämien (Ref. 1). Speziell bei Kindern kann sich eine verminderte IgG2-Produktion durch wiederkehrende Infektionen bemerkbar machen (Ref 2; Reviews 3, 4 und 5). Die turbidimetrischen Roche Analyser erlauben eine vollautomatische, schnelle und quantitative Bestimmung der Präzipitationsreaktion zur Proteinbestimmung. Die vier IgG Subklassen können gleichzeitig gemessen werden.
3 TESTPRINZIP
Die turbidimetrische Bestimmung der Konzentration löslicher Antigene beruht auf der Reaktion mit einem spezifischen Antiserum, wodurch unlösliche Komplexe gebildet werden. Wird Licht durch die gebildete Suspension gestrahlt, wird nur ein Teil des Lichts durchgelassen und mit Hilfe eines optischen Linsensystems auf eine Photodiode fokusiert. Die Intensität des durchgelassenen Lichts ist indirekt proportional zur spezifischen Proteinkonzentration in der zu testenden Probe. Die Antigenkonzentration von unbekannten Proben wird automatisch an Hand einer im Gerät gespeicherten Kalibrationskurve berechnet.
Latex-verstärkte Antikörper: Bei einigen Antigen-Antikörper Reaktionen werden nicht genügend große Immunkomplexe gebildet um turbidimetrisch bestimmt werden zu können. Wird der Antikörper jedoch an einen Latexpartikel mit geeigneter Größe gekoppelt, ist der so geformte Immunkomplex in der Lage ausreichend zu Licht streuen und kann turbidimetrisch bestimmt werden.
4 REAGENZIEN
4.1 Human IgG1/IgG2 Antiserum. Diese Antiseren sind monopsezifisch für die
jeweilige Subklasse und liegen als stabilisierte Flüssigkeiten vor. Sie enthalten 0,5% BSA, 0,099% Natriumazid, 0,1% E-amino-N-capronsäure (EACA) und 0,01% Benzamidin als Konservierungmittel.
4.2 Human IgG3/IgG4 Latexreagezien. Diese Latexreagenzien sind monospezifisch für die jeweile Subklasse und liegen als stabilisierte Flüssigkeiten vor. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid.
4.3 Kalibratoren und Kontrollen. Sie werden aus gepooltem Humanserum hergestellt und liegen als stabilisierte Flüssigkeiten vor. Enthaltenen Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid, 0,1% EACA und 0,01% Benzamidin. Die auf dem Fläschchen angebene IgG-Subklassen Konzentration wurde durch Vergleich mit dem internationalen Referenzmaterial DA470k ermittelt (Ref. 6).
4.4 Reaktionspuffer. Enthält als Konservierungsmittel 0,099% Natriumazid
5 WARNUINGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN
Jeder Spender des humanen Serums, das in diesem Kit enthalten ist, wurde gegen Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) und Antiköpern gegen Human-Immunschwäche-Virus (HIV 1 & 2) und Hepatitis-C-Virus getestet und als negativ befunden. Die hierfür verwendeten Tests sind entweder von der FDA (USA) zugelassen oder für den Gebrauch in der in vitro Diagnostik in der EU freigegeben (Directive 98/79/EC, Annex II). Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Auschluss dieser und anderer Infektionsträger. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen, insbesondere dem ständigen Tragen entsprechender Schutzkleidung. Der Test sollte nur von entsprechend geschultem Personal durchgeführt werden.
Warnung: Dieses Produkt enthält Natriumazid und muss mit den entsprechenden Vorsichts-maßnahmen behandelt werden. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut (speziell bei Rissen in der Haut und offenen Wunden) oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann bei anhaltendem Kontakt mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden.
Insert Code: SIN184, Version: 5th November 2010, Page 4 of 12
Dieser Test sollte nur für den angegebenen Verwendungszeck von entsprechend geschultem Laborpersonal durchgeführt werden. Eine genaue Einhaltung dieser Arbeitsanleitung ist zwingend notwendig. Bei Verwendung von abgeänderten Testparametern kann die Richtigkeit der Ergebnisse nicht garantiert werden.
Reagenzien unterschiedlicher Chargen dürfen NICHT untereinander gemischt oder gemeinsam verwendet werden. Bei großem Testdurchsatz muss darauf geachtet werden, dass alle Reagenzien der gleichen Charge entstammen.
6 LAGERUNG UND STABILITÄT
Der ungeöffnete Kit ist bei 2-8°C bis zum auf der Packung angegebenen Verfallsdatum haltbar. NICHT EINFRIEREN! Das Reagenz und der Reaktionspuffer können nach dem Öffnen bis zu 1 Monat in dem C-pack im Analyser aufbewahrt werden. Der Kalibrator und die Kontrollen sind bei Lagerung bei 2-8°C bis zu 3 Monaten stabil, vorausgesetzt diese werden so gelagert, dass keine Verdunstung oder Verunreinigung stattfinden kann.
7 PROBENENTNAHME UND - VORBEREITUNG
Immer frisches oder tiefgefrorenes Serum verwenden. Blutproben über Venenpunktur
gewinnen und auf natürliche Weise gerinnen lassen. Serum so schnell wie möglich vom Gerinnsel trennen, um eine Hämolyse zu vermeiden. Die Seren können bei 2-8°C bis zu 8 Tagen gelagert werden. Für eine längere Lagerung wird empfohlen, die Proben unverdünnt bei mindestens -20°C einzufrieren. Wiederholtes Einfrieren und Auftauen vermeiden. Keine mikrobiell oder mit Partikeln verunreinigte Proben, oder hämolytisches oder lipämisches Serum verwenden.
8.1.1 1 x Human Antiserum for C6000 (IgG1 und IgG2) or Human Latex Reagent for C6000 (IgG3 und IgG4) (Antiserum oder Latexreagenz entsprechend der jeweiligen Subklasse)
8.1.2 1 x Antisera Reaction Buffer for C6000 (IgG1 und IgG2) or Latex Reaction Buffer for C6000 (IgG3 und IgG4) (Reaktionspuffer)
8.1.3 1 x 1.5mL Human IgG1/2/3/4 Subclass Calibrator for C6000 (Kalibrator) 8.1.4 2 x 1mL Human IgG Subclass Low Control for C6000 (Kontrolle, Low Level) 8.1.5 2 x 1mL Human IgG Subclass Control for C6000 (Kontrolle, High Level)
8.2 Benötigte, nicht im Kit enthaltene Materialien
8.2.1 Laborausstattung zum Sammeln und Vorbereiten der Proben (Probenröhrchen, Zentrifuge, usw.)
8.2.2 Ein voll ausgastatteter und funktionsfähiger cobas 6000 Analyser 8.2.3 Cobas c pack MULTI Reagenzkassette (Ident. Nr.: 04593138 190, erhältlich über
Roche). 8.2.4 Cobas c pack MULTI –Deckelöffner (erhältlich über Roche)
8.3 Laden der Reagenzien an der cobas 6000 Serie
Überführen der R1- und R2 Reagenzien in die c pack MULTI Kassette (siehe Abbildung 1)
8.3.1 Sobald Sie frisches Reagenz einsetzen, verwenden Sie ausschließlich neue cobas c Pack MULTI Reagenzkartuschen.
8.3.2 Unkorrektes Befüllen der cobas c pack MULTI Reagenz-Kartuschen kann dazu führen, dass die Reagenzkartusche vom Gerät nicht akzeptiert wird oder eine geringere Anzahl von Tests angenommen wird.
8.3.3 Das Antiserum/Latexreagenz (R2) in Kammer B (siehe Abbildung) füllen und den Deckel sorgfältig verschließen (blauen Deckelöffner von Roche verwenden).
8.3.4 Den Reaktionspuffer (R1) in Kammer A (in der Mitte) füllen und den Deckel sorgfältig verschließen (blauen Deckelöffner von Roche verwenden).
8.3.5 Kammer C bleibt leer.
Abb. 1: Überführen der R1- und R2 Reagenzien in die c pack MULTI Kassette
8.4 Die vollständigen Kit Anwederinstruktionen für die cobas c Serie sind verfügbar. Für weitere Informationen kontaktieren Sie Ihre Binding Site Geschäftsstelle.
8.5 Reagenzienzuordnung bei Applikationen im offenen Kanal
(Folgende Schritte können erst nach der Eingabe der Parameter im offenen Kanal durchgeführt werden – siehe Anhang).
8.5.1 Wählen Sie in dem Bildschirmmenü zuerst Reagenz, danach Übersicht und anschließend die Option open channel aus.
8.5.2 Wählen Sie den entsprechenden Test aus. 8.5.3 Bestätigen Sie durch Anwählen von Reservieren und OK die Auswahl, und
schließen das Bildschirm-Fenster. 8.5.4 Stellen Sie ein mit Reagenz befülltes c pack MULTI in das Gerät um es dem
ausgewählten Test zuzuordnen.
8.6 TESTDURCHFÜHRUNG
8.6.1 Chemische Parameter für die cobas 6000 Serie finden Sie im Anhang.
9 ERGEBNISSE
Ergebnisse werden automatisch in mg/L ausgegeben. Weitere Berechnungen sind nicht notwendig. Mit LIM.L und LIM.H versehene Resultate dürfen nicht verwendet werden. In diesen Fällen, die Ergebnisse der Wiederholungsmessung verwenden. Ergebnisse unterhalb der Test- sensitivität sollten nicht verwendet werden (bitte die unten aufgeführten Sensitivitätsgrenzen beachten)
Qualitätskontrolle: Die Konzentration der Kontrollen ist auf dem beiliegenden QC-Zertifikat angegeben (SIN 184.QC). Ergebnisse sollten nur akzeptiert werden, wenn die Kontrollen nicht mehr als
15% von den angegebenen Zielwerten abweichen.
10 GRENZEN DES TESTS
10.1 Turbidimetrische Tests sind nicht für die Bestimmung von stark lipämischen oder
hämolytischen Proben oder Proben, die zirkulierende Immunkomplexe (CICs) oder Rheumafaktoren enthalten, geeignet, da diese Proben einen nicht vorhersagbaren Anteil an Streulicht erzeugen können. Ungewöhnliche Ergebnisse sollten mit einer alternativen Methode überprüft werden, z.B. Radiale Immundiffusion.
Proben die Paraproteine enthalten, sind nicht geeignet mit diesem Test untersucht zu werden. Auf Grund der hohen Varibilität von monoklonalen Proteinen könnte hier eine Antigenüberschuss-Situation auftreten.
10.2 IgG-Subklassen-Ergebnisse sollten nicht zur Beurteilung von Atopien
allergischer Patienten herangezogen werden. 10.3 Die Diagnose und die Einleitung einer Therapie dürfen nicht ausschließlich auf
der Bestimmung von IgG Subklassen basieren. Das klinische Bild und weitere serologische Befunde müssen ebenfalls berücksichtigt werden.
10.4 Es wird dringend empfohlen, dass beide Kontrollen bei jedem Testansatz mitgeführt werden. Wird eine gespeicherte Kalibrationskurve verwendet und liegt das Kontrollergebnis außerhalb des Vertrauensbereichs, sollte der Test neu kalibriert werden. Liegt die Kontrolle direkt nach der Kalibration außerhalb des Vertrauensbereichs, sollten die Testparameter und das Gerät überprüft werden, bevor der Test wiederholt wird. Bleibt das Problem bestehen, wenden Sie sich bitte an Ihre Lieferfirma.
Die unten aufgeführten Normalbereiche basieren auf der Untersuchung eines Blutspendekollektivs aus Großbritannien und dienen nur zur Orientierung. Es wird empfohlen eigene Normalbereiche zu bestimmen.
11.1 Erwachsene
Die unten aufgeführten IgG-Subklassen Normalbereiche wurden durch Testung von normalen Blutspender-Seren, die von dem Blood Transfusion Service in Birmingham/England zur Verfügung gestellt wurden, erhalten.
Protein Anzahl
(n) Mittelwert
(mg/L) Median (mg/L)
95 Perzentile Bereich (mg/L)
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
30 30 30 30
6330 4528 790,7 280,0
6085 4541 706,4 215,3
3824 2418
218,2 39,2
- - - -
9286 7003 1761 864
11.2 Kinder
Die Werte für Gesamt IgG und IgG Subklassen wurden mittels Radialer Immundiffusion unter Verwendung von Binding Site Radiale Immundiffusion Produkten ermittelt. Die Seren der Kinder wurden in einem Krankenhaus in Birmingham (England) gesammelt. Alle Angaben sind in mg/L.
0-2 Jahre N Mittelwert 95%ile Bereich
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
39 39 39 39 39
5248 838 445 129
6640
1940 – 8420 225 – 3000 186 – 853
5 – 784 3270 – 12700
2-4 Jahre
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
36 36 36 36 36
5495 1146 396 171
7770
3150 – 9450 360 – 2250 173 – 676 10 – 537
4680 – 12500
4-6 Jahre
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
49 49 49 49 49
6149 1496 531 329
9280
3060 – 9450 605 – 3450 99 – 1221 18 – 1125
5320 - 13400
6-8 Jahre
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
43 43 43 43 43
5758 1754 437 331
8860
2880 – 9180 440 – 3750 155 – 853 4 – 992
4540 – 13600
8-10 Jahre
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
32 32 32 32 32
6345 2126 521 349
9700
4320 – 10200 720 – 4300 127 – 853 19 – 932
5680 - 13600
10-12 Jahre
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
46 46 46 46 46
6421 1980 620 323
10200
4230 – 10600 760 – 3550 173 – 1730 16 – 1150
5680 - 14900
12-14 Jahre
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
54 54 54 54 54
6581 2486 583 409
10500
3420 – 11500 1000 – 4550 283 – 1250 37 – 1360
6640 – 14900
14-18 Jahre
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Total IgG
48 48 48 48 48
6057 2614 708 521
10100
3150 – 8550 640 – 4950 230 –1960 110 – 1570
5500 – 14400
Insert Code: SIN184, Version: 5th November 2010, Page 5 of 12
12 LEISTUNGSDATEN
Die nachfolgend aufgeführten Daten wurden unter Verwendung eines Roche cobas 6000 erzielt.
12.1 Intra-Assay-Präzision Die Studie wurde unter Berücksichtigung von CLSI Evaluation of Precision Performance of Clinical Quantitative Measurement Methods; Approved Guideline (CLSI Document EP5-A2) durchgeführt. Die Studie lief 21 Werktage, mit zwei Messläufen pro Tag. Drei verschiedene Proben wurden mit drei verschiedenen Reagenzienchargen von einem Anwender auf einem Gerät gemessen. Für die getesteten Proben ergaben sich folgende Werte:
Die Linearität dieser Tests wurde bestätigt unter Verwendung seriell verdünnter Serumproben, mit folgender Regressionsgleichung:
IgG1 y=1,033x – 12,05 (mg/L), R2= 0,9991
(y=
gemessene IgG1 Konzentration, x=theoretische Konzentration) im Bereich von
425-19425 mg/L
IgG2 y=1,015x – 30,56 (mg/L), R2= 0,9991
(y=
gemessene IgG2 Konzentration, x=theoretische Konzentration) im Bereich von
62,4–8916mg/L
IgG3 y=1,007x –9,03 (mg/L), R2= 0,9989
(y=
gemessene IgG3 Konzentration, x=theoretische Konzentration) im Bereich von
23,5–1175mg/L
IgG4 y=1,01x –2,25 (mg/L), R2= 0,9994
(y=
gemessene IgG4 Konzentration, x=theoretische Konzentration) im Bereich von
79,1 –777mg/L
12.3 Interferierende Substanzen
Keine signifikanten Interferenzen wurden bei einer Konzentration von 200mg/L Bilirubin, 5g/L Hämoglobin (Hb) und 1540 FTU Chylus mit diesem Test festgestellt. Verwendet wurde ein IgG Subklassen Kontrollserum. Die Messungen wurden bei der minimalen Probenverdünnung durchgeführt.
Laut den CLSI document EP17-A - Protocols for Determination of Limit of Detection and Limit of Quantitation; Approved Guideline wurden folgende Nachweisgrenzen ermittelt:
12.5 Methodenvergleich Eine Vergleichsstudie wurde unter Verwendung dieses Tests am cobas 6000 und Modular P für IgG1-4 durchgeführt. Die Studie ergab folgende Übereinstimmungen in der Regressionsgleichung nach Passing & Bablock.
IgG1 y = 0,97x + 57,27mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P) Korrelationskoeffizient r = 0,984 (Kalkulation durch lineare Regression) n=91 (30 normale Seren und 61 klinische Seren)
IgG2 y = 0,99x + 43,68 mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P)
Korrelationskoeffizient r = 0,994 (Kalkulation durch lineare Regression) n=104 (30 normale Seren und 74 klinische Seren)
IgG3 y = 0,95x + 12,44 mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P)
Korrelationskoeffizient r = 0,988 (Kalkulation durch lineare Regression) n=108 (30 normale Seren und 78 klinische Seren) IgG4 y = 1,00x + 9,78 mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P)
Korrelationskoeffizient r = 0,993 (Kalkulation durch lineare Regression) n=91 (30 normale Seren und 61 klinische Seren)
12.6 Antigenüberschuss Diese Tests wurden mit den in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Konzentrationen überprüft. Bei diesen Konzentrationen wurde kein Antigenüberschuss nachgewiesen.
Spezifität Konzentration (g/L)
IgG1 55,77
IgG2 21,0
IgG3 4,82
IgG4 2,76
13 BIBLIOGRAFIE
1. Shakib, F & Stanworth, D R (1980). Human IgG subclasses in health and
disease (Part II). La Ricerca Clin. Lab. 10, 561-580. 2. Shackleford, P G, Polmar, S H et al. (1986). Spectrum of IgG2 subclass
deficiency in children with recurrent infections: Prospective study. J. Pediatr. 108, 647-653.
3. Hamilton, R H (1987). Human IgG subclass measurements in the clinical laboratory. Clin. Chem. 33, 1707 – 1725.
4. Schur, P H (1987). IgG subclasses – a review. Annals of Allergy, 58, 89-99. 5. Vlug, A & Van Remortel, P (1989). The structure and function of human IgG
Produits fabriqués en Angleterre par la société : The Binding Site Group Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
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cobas® est une marque depose de F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland
1 INDICATIONS
Ce coffret est destiné à la détermination quantitative in vitro des sous-classes d’IgG humaines dans le sérum sur le c501 module de Roche cobas 6000 turbidimetre. La mesure de ces immunoglobulines apporte une aide au diagnostic du métabolisme anormal des protéines et des défauts de l’organisme à resister à des agents infectieux. Cette mesure doit être ustilisée en conjonction avec d’autres informations cliniques.
2 RESUME ET EXPLICATIONS
Chez les sujets adultes en bonne santé, l’IgG représente environ 75% de la concentration en Immunoglobulines sériques totales. Dans la classe des IgG, les concentrations de chaque sous-classe sont généralement dans l’ordre IgG1>IgG2>IgG3>IgG4, bien que la concentration effective de chaque sous classe puisse varier considérablement selon les individus. Les quatre sous-classes d’IgG présentent des différences considérables dans leurs propriétés, incluant la capacité de fixation du complément, de se lier aux macrophages et de passer la barrière placentaire. Des taux inusuels d’une ou plusieurs sous-classe(s) peuvent être associés à certaines pathologies comme l’anaphylaxie, les maladies auto-immunes, digestives, les hypo et hypergammaglobulinémies (réf. 1). En particulier, une diminution de synthèse de l’IgG2 chez l’enfant peut être associée à des infections récurrentes (réf. 2). Cet aspect a été bien étudié (réf 3, 4 et 5). Les turbidimètres Roche permettent une mesure rapide, quantitative et entièrement automatique des réactions de précipitation pour la détermination des protéines. Ils peuvent doser simultanément les sous-classes d’IgG (IgG1 à 4).
3 PRINCIPE
La détermination de la concentration en antigène soluble en turbidimétrie implique la réaction avec l’antisérum spécifique pour former des complexes insolubles. Lorsque la lumière passe à travers la suspension formée, une partie de la lumière est transmise et se dirige sur une photodiode par un système de lentilles optiques. La quantité de lumière transmise est indirectement proportionnelle à la concentration en protéines spécifiques de l’échantillon. Les concentrations sont automatiquement calculées en référence à une courbe de calibration stockée dans l’appareil.
Réactif latex : Au cours de certaines réactions antigènes-anticorps, les complexes formés ne sont pas suffisamment gros pour être détectés en turbidimètrie. Si l’anticorps est fixé sur des particules de latex de taille suffisante, la capacité de diffraction des complexes immuns formés avec l’antigène est alors suffisamment augmentée pour permettre la détecton turbidimètrique.
4 REACTIFS
4.1 Antisérums anti-IgG1/IgG2. Ils sont mono-spécifiques pour la sous-classe correspondante et sont fournis sous une forme stable liquide. Ils contiennent 0,5% BSA, 0,099% d’azide de sodium, 0.1% d’acide E-amino-N-caproϊque (EACA) et 0,01% de benzamidine comme conservateurs.
4.2 Réactif latex anti-IgG3/IgG4. Ils sont mono-spécifiques pour la sous-classe correspondante et sont fournis sous une forme liquide stable. Ils contiennent 0,099% d’azide de sodium comme conservateur.
4.3 Calibrateurs et contrôles. Ils sont constitués de sérums humains sains mélangés. Ils sont fournis sous forme liquide stable. Ils contiennent 0,099% d’azide de sodium, 0,1% d’EACA et 0,01% de benzamidine comme conservateurs. La concentration en sous-classes d’IgG indiquée sur les étiquettes des flacons ont été obtenues par comparaison avec la référence internationale DA470k (réf. 6).
4.4 Tampon de réaction. Il contient 0,099% d’azide de sodium comme conservateur.
5 PRECAUTIONS
Tous les sérums humains fournis dans ce coffret ont été testés et trouvés négatifs pour l’antigène de surface de l’hépatite B (Ag HBs), pour le virus de l’hépatite C et pour les anticorps anti-virus de l’immunodéficience acquise humaine (HIV1 and HIV2). Les tests utilisés ont soit été approuvés par la FDA (USA) ou acceptés pour un usage en diagnostic in-vitro par l’union européenne (Directive 98/79/EC, Annexe II); néanmoins ces tests ne peuvent garantir l’absence d’agents infectieux. Tous les échantillons doivent donc être manipulés et éliminés comme des produits potentiellement infectieux. Seul un personnel utlisant des équipements de protection personnelle qualifié dans la manipulation d’échantillons potentiellement infectieux est autorisé à utiliser ce coffret.
ATTENTION : Ce produit contient de l’azide de sodium et doit être manipulé avec précaution; des gants appropriés et d’autres vêtements de protection doivent être portés
lors de toute manipulation. Ne pas ingérer ou avoir de contact avec la peau (spécialement sur les zones blessées) ou des muqueuses. S’il y a contact, laver abondamment avec de l’eau et demander un avis médical. Des azides de métaux explosifs peuvent se former par contact prolongé entre de l’azide de sodium et les tuyauteries en plomb et cuivre; pour éliminer les réactifs, rincer avec un large volume d’eau pour prévenir tout dégât.
Ce produit ne doit être utilisé que par du personnel entrainé. Le suivi de ces instructions est essentiel. Les résultats seront considérés comme invalides si d’autres paramètres autres que ceux ci sont utilisés.
Les réactifs de différents lots NE SONT PAS interchangeables. Si un nombre important de
tests est réalisé, des précautions doivent être prises pour s’assurer que les réactifs utilisés sont issus du même lot.
6 STOCKAGE ET STABILITE
Les coffrets non ouverts peuvent être conservés entre 2 et 8°C et peuvent être utilisés jusqu’à la date de péremption indiquée sur l’étiquette de la boîte. NE PAS CONGELER. Après ouverture, les antisérums, le réactif latex, et le tampon peuvent rester à l’intérieur de la cassette C-pack chargée à bord de l’automate cobas 6000 jusqu’à un mois. Après ouverture, les calibrateurs et les contrôles sont stables 3 mois à 2-8°C dans la mesure où toute évaporation et tout risque de contamination sont écartés.
7 PREPARATION ET COLLECTE DES ECHANTILLONS
Utiliser des sérums fraîchement prélevés ou congelés. Les prélèvements sanguins doivent être collectés par ponction veineuse, le caillot doit se former naturellement et le sérum doit être récupéré le plus rapidement possible pour éviter l’hémolyse. Le sérum peut être stocké 8 jours à 2-8°C avant le test ou à -20°C ou à une température inférieure pour un stockage prolongé du sérum non dilué. Les congélations et décongélations successives peuvent altérer le sérum. Les sérums lipidiques, hémolysés, contaminés par des bactéries ou contenant des particules de matière ne doivent pas être utilisés.
8.1.1 1 x Human Antiserum for C6000 (IgG1 et IgG2) ou Human Latex Reagent for C6000 (IgG3 et IgG4) (Antisérum Humain (IgG1 et IgG2) ou Réactif Latex Humain (IgG3 et IgG4) selon la sous-classe appropriée)
8.1.2 1 x Antisera Reaction Buffer for C6000 (IgG1 et IgG2) ou Latex Reaction Buffer for C6000 (IgG3 et IgG4) (Tampon de Réaction Antisérum (IgG1 et IgG2) ou Tampon de Réactif Latex (IgG3 et IgG4) pour la sous-classe appropriée)
8.1.3 1 x 1,5mL Human IgG1/2/3/4 Subclass Calibrator for C6000 (Calibrateurs IgG1/2/3/4)
8.1.4 2 x 1mL Human IgG Subclass Low Control for C6000 (Contrôle sous classes d’IgG Bas)
8.1.5 2 x 1mL Human IgG Subclass Control for C6000 (Contrôle sous classes d’IgG Haut)
8.2 Matériel nécessaire et non fourni
8.2.1 Equipement pour la collecte et la préparation des échantillons : tubes, centrifugeuse, etc.
8.2.2 Un cobas 6000 équipé et entièrement fonctionnel. 8.2.3 Cassettes pack MULTI (Cat no. 04593138 190, disponibles chez Roche). 8.2.4 Un outil d’ouverture des cassettes c pack MULTI (disponibles chez Roche)
8.3 Chargement des réactifs pour les automates cobas 6000
Transfert de R1 et R2 dans la cassette c pack MULTI (voir Image 1)
8.3.1 Toujours utiliser une nouvelle cassette c pack MULTI lors de la preparation de nouveaux réactifs.
8.3.2 Le mauvais remplissage des cassettes c pack MULTI peut amener à la realisation d’un moins grand nombre de tests ou d’un refus d’acceptation de la cassette par l’automate.
8.3.3 Transférer l’antisérum/le réactif latex (R2) dans la position B et fermer le compartiment de la cassette en utilisant l’outil d’ouverture/fermeture de Roche
8.3.4 Transférer le tampon de réaction (R1) dans la position A et fermer le compartiement de la cassette en utilisant l’outil d’ouverture/fermeture de Roche
8.3.5 Laisser le compartiment C vide.
Image 1 : Transfert des réactifs dans la cassette c pack MULTI
8.4 Les instructions complètes d’installation des coffrets sur les instruments cobas c
sont disponibles. Veuillez contacter Binding Site pour plus d’informations.
8.5 Assignement des réactifs dans les applications des canaux ouverts
(Doit être fait une fois que tous les paramètres du test ont été saisis dans un canal ouvert (voir annexe jointe)).
8.5.1 Sélectionner un canal ouvert sur l’écran de saisie des réactifs (Reagent > Settings)
8.5.2 Sélectionner le test approprié. 8.5.3 Sélectionner Reserve puis OK pour fermer la fenêtre.
8.5.4 Charger la cassette C pack MULTI sur l’automate pour l’assigner au test sélectionné.
8.6 Procedure
8.6.1 Les Paramètres d’analyse pour une utilisation sur automates cobas 6000 sont fournis dans l’annexe jointe.
Insert Code: SIN184, Version: 5th November 2010, Page 7 of 12
9 RESULTATS
Les résultats sont automatiquement imprimés avec des concentrations en mg/L. Aucun autre calcul n’est nécessaire. Tous les résultats avec des commentaires LIM.L ou LIM.H ne doivent pas être utilisés. Les résultats des échantillons relancés par l’automate seront toutefois corrects.Les résultats inférieurs à la limite de sensibilité du test ne doivent pas être utilisés (cf. ci-dessous pour une sensibilité approximative). Contrôle de Qualité :
Les valeurs obtenues pour le contrôle fourni doivent être dans les 15% de la concentration indiquée sur le certificat de contrôle qualité (SIN184.QC.). Si des résultats de contrôles en dehors de cette gamme sont obtenus, vérifier l’instrument et les paramètres et répéter le test.
10 LIMITES
10.1 Les tests en turbidimétire ne permettent pas la mesure d’échantillons lipidiques,
hémolysés, contenant des complexes immuns circulants ou des facteurs rhumatoïdes dû l’imprévisibilité de déviation non spécifique de la lumière que ces échantilons peuvent générer. Des résultats inattendus doivent être confirmés en utilisant une autre méthode, par ex, l’immunodiffusion radiale.
Les échantillons contenant des paraprotéines ne doivent pas être mesurés avec ce test dû à leur nature hautement variable pouvant résulter en un excès d’antigène.
10.2 Les résultats du dosage des sous-classes d’IgG ne doivent pas être utilisés chez les sujets allergiques lors de maladies atopiques.
10.3 Le diagnostic et le traitement ne peuvent pas être uniquement basés sur le dosage des sous-classes d’IgG. La clinique et les autres résultats du laboratoire doivent être pris en compte.
10.4 Il est fortement recommandé d’utiliser les 2 contrôles avec chaque série d’échantillons testés. Si un contrôle est en dehors de la gamme lorsqu’il est testé à partir d’une courbe de calibration enregistrée, le test doit être recalibré. S’il est à nouveau en dehors de la gamme même avec la nouvelle courbe, l’appareil et les paramètres entrés doivent être vérifiés avant de répéter le test. Si un problème persiste, se référer au fournisseur.
10.5 Les gammes de mesure des coffrets sont les suivantes :
Spécificité Gamme de mesure approximative
(mg/L) Sensibilité Approximative
(mg/L)
IgG1 1000 – 20000 333,3
IgG2 600 – 10000 60
IgG3 70 – 1312,5 14
IgG4 67,5 – 810 9
11 VALEURS ATTENDUES
Les gammes fournies ci-dessous ont été obtenues à partir d’un nombre limité d’échantillons anglais et ne sont fournies qu’à titre indicatif. Il est fortement recommandé de générer ses propres gammes.
11.1 Gammes adultes normales
Ces gammes ont été obtenues en mesurant le contenu en sous-classes d’IgG de sérums fournis par le centre de transfusion sanguine de Birmingham à partir de donneurs adultes sains.
Protéine Nombre
(n) Moyenne
(mg/L) Médiane (mg/L)
Gamme 95 percentile (mg/L)
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
30 30 30 30
6330 4528 790.7 280.0
6085 4541 706.4 215.3
3824 2418
218.2 39,2
- - - -
9286 7003 1761 864
11.2 Gammes Pédiatriques
Ces gammes ont été obtenues en mesurant en immunodiffusion radiale le contenu en sous-classes d’IgG et en IgG totales de serums pédiatriques provenant de l’hôpital de Birmingham. Toutes les concentrations sont en mg/L.
0-2 ans N Moyenne Gamme 95%ile
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG totales
39 39 39 39 39
5248 838 445 129
6640
1940 – 8420 225 – 3000 186 – 853 5 – 784
3270 – 12700
2-4 ans
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG totales
36 36 36 36 36
5495 1146 396 171
7770
3150 – 9450 360 – 2250 173 – 676 10 – 537
4680 – 12500
4-6 ans
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG totales
49 49 49 49 49
6149 1496 531 329
9280
3060 – 9450 605 – 3450 99 – 1221 18 – 1125
5320 - 13400
6-8 ans
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG totales
43 43 43 43 43
5758 1754 437 331
8860
2880 – 9180 440 – 3750 155 – 853 4 – 992
4540 – 13600
8-10 ans
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG totales
32 32 32 32 32
6345 2126 521 349
9700
4320 – 10200 720 – 4300 127 – 853 19 – 932
5680 - 13600
10-12 ans
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG totales
46 46 46 46 46
6421 1980 620 323
10200
4230 – 10600 760 – 3550 173 – 1730 16 – 1150
5680 - 14900
12-14 ans N Moyenne Gamme 95%ile
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG totales
54 54 54 54 54
6581 2486 583 409
10500
3420 – 11500 1000 – 4550 283 – 1250 37 – 1360
6640 – 14900
14-18 ans
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG totales
48 48 48 48 48
6057 2614 708 521
10100
3150 – 8550 640 – 4950 230 –1960 110 – 1570
5500 – 14400
12 PERFORMANCES
Les résultats suivant ont été obtenus en utilisant un automate Roche cobas 6000.
12.1 Précision intra-essai Une étude a été réalisée en suivant les recommandations du « CLSI Evaluation of Precision Performance of Clinical Quantitative Measurement Methods » (CLSI Document EP5-A2). L’étude a porté sur 21 jours, avec deux séries de tests par jour. L’utilisateur a utilisé trois échantillons différents avec trois lots de produits différents sur un seul automate.
12.2 Linéarité La linéarité de ces tests a été confirmée en utilisant des sérums dilués en série, donnant ainsi les équations de regression suivantes :
IgG1 y=1,033x – 12,05 (mg/L), R2 =0,9991
(y = concentration mesurée IgG1 x= concentration théorique) sur une gamme de 425- 19425mg/L.
IgG2 y=1,015x – 30,56 (mg/L), R2 =0,9991
(y = concentration mesurée IgG2, x = concentration théorique) sur une gamme de 62,4 – 8916mg/L
IgG3 y=1,007x – 9,03 (mg/L), R2 =0,9989
(y = concentration mesurée IgG3, x = concentration théorique) sur une gamme de 23,5 – 1175mg/L.
IgG4 y=1,01x – 2,25 (mg/L), R2 =0,9994
(y = concentration mesurée IgG4, x = concentration théorique) sur une gamme de 79,1 – 777mg/L.
12.3 Interférence
Aucune interference a été observée avec la bilirubine à 200mg/L, l’hémoglobine à 5g/L, le chyle à 1540 unités de turbidité formazine (FTU’s). Tous les tests ont été réalisés à la dilution échantillon minimale.
12.5 Limite de Détection et Limite de la Quantitation Basé sur le document EP17-A du CLSI -“ Protocols for Determination of Limit of Detection and Limit of Quantitation; Approved Guideline”.
Spécificité Limite de la détection (mg/L) Limite de la quantitation (mg/L)
IgG1 80,77 991,75
IgG2 14,98 560,54
IgG3 5,39 69,4
IgG4 2,73 70,5
12.5 Comparaison Une étude de correlation a été faite en utilisant ce coffret sur un cobas 6000 pour l’IgG1-4. Cette étude a montré une bonne corrélation avec les équations de Passing & Bablok suivantes :
IgG1 y = 0,97x + 57,27mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P) coefficient de correlation r = 0,984 (calculé par regression linéaire) n= 91 (30 sérums normaux et 61 sérums cliniques)
IgG2 y = 0,99x + 43,68mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P) coefficient de correlation r = 0,994 (calculé par regression linéaire) n= 104 (30 sérums normaux et 74 sérums cliniques)
IgG3 y = 0,95x + 12,44mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P)
coefficient de correlation r = 0,988 (calculé par regression linéaire) n= 108 (30 sérums normaux et 78 sérums cliniques)
IgG4 y = 1,00x + 9,78mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P)
coefficient de correlation r = 0,993 (calculé par regression linéaire) n= 91 (30 sérums normaux et 61 sérums cliniques)
Insert Code: SIN184, Version: 5th November 2010, Page 8 of 12
12.6 Excès d’antigène Ces tests ont été testés aux concentrations du tableau ci-dessous. Aucun excès d’antigène à été observé à ces concentrations.
Spécificité Concentration (g/L)
IgG1 55,77
IgG2 21,0
IgG3 4,82
IgG4 2,76
13 BIBLIOGRAPHIE
1. Shakib, F & Stanworth, D R (1980). Human IgG subclasses in health and
disease (Part II). La Ricerca Clin. Lab. 10, 561-580.
2. Shackleford, P G, Polmar, S H et al. (1986). Spectrum of IgG2 subclass deficiency in children with recurrent infections: Prospective study. J. Pediatr. 108,
647-653. 3. Hamilton, R H (1987). Human IgG subclass measurements in the clinical
laboratory. Clin. Chem. 33, 1707 – 1725. 4. Schur, P H (1987). IgG subclasses – a review. Annals of Allergy, 58, 89-99.
5. Vlug, A & Van Remortel, P (1989). The structure and function of human IgG subclasses. Eur. Clin. Lab. 8 (5), 26-35.
6. Williams, D.R., Wilson, C.T., Carr-Smith, H.D. (2009). Assignment of IgG Subclass Values to the Protein Reference Preparation DA470k. Clin. Chem. Vol. 55, No. S6, PS C-90.
KITS PARA SUBCLASES IgG HUMANA para uso en los analizadores Roche cobas® 6000
Para diagnóstico in-vitro únicamente
Códigos de producto: NK006.CB, NK007.CB, LK008.CB, LK009.CB.
Fabricado por: The Binding Site Group Ltd., PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK. www.bindingsite.co.uk
The Binding Site Spain S.L.U C/ Balmes 243 4º 3ª, 08006 Barcelona Teléfono 902027750 Fax: 902027752 e-mail: [email protected] web: www.bindingsite.es
cobas® es una marca registrada de F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Suiza
1 UTILIZACIÓN
La finalidad de este kit es el diagnóstico in vitro mediante la cuantificación de subclases IgG humanas en suero en los analizadores turbidimétricos cobas 6000 series de Roche. El análisis de estas inmunoglobulinas es de gran ayuda en el diagnóstico del metabolismo anormal de las proteínas y la incapacidad del organismo para hacer frente a agentes infecciosos, y se debe usar junto con datos clínicos adicionales.
2 RESUMEN Y EXPLICACIÓN
La IgG en adultos normales supone aproximadamente el 75% de las inmunoglobulinas séricas totales. Dentro de la clase IgG, el orden habitual de concentración de las 4 subclases es IgG1>IgG2>IgG3>IgG4, aunque la concentración real puede variar mucho entre individuos. Las 4 subclases IgG muestran propiedades considerablemente distintas, incluyendo la capacidad de fijación del complemento, unión a macrófagos y paso a través de la placenta. Niveles anormales de una o más subclases pueden estar asociados con ciertas condiciones, incluyendo anafilaxis, enfermedades autoinmunes e intestinales así como hipo- o hiper-gammaglobulinemia (ref. 1). Concretamente, una producción disminuida de IgG2 en niños puede estar asociada con infecciones recurrentes (ref. 2). Este tema ha sido revisado (refs. 3, 4 y 5). Los analizadores turbidimétricos de Roche permiten una automatización completa, la cuantificación rápida de reacciones de precipitación para la determinación de proteínas y pueden ensayar IgG e IgG1-4 al mismo tiempo.
3 PRINCIPIO
La determinación de la concentración de antígenos solubles por métodos turbidimétricos supone la reacción con un antisuero específico, con lo que se forman complejos insolubles. Cuando la luz pasa a través de la suspensión una parte de la luz se transmite y enfoca a un fotodiodo por medio de un sistema de lentes ópticas. La cantidad de luz transmitida es indirectamente proporcional a la concentración de la proteína específica en la muestra. Las concentraciones se calculan automáticamente en referencia a una curva de calibración almacenada en el instrumento.
Anticuerpos mejorados con látex. Algunas reacciones antígeno-anticuerpo no forman complejos inmunes suficientemente grandes para ser detectados por turbidimetría. Si el anticuerpo se une a partículas de látex de un tamaño adecuado, la capacidad del complejo inmune formado para dispersar la luz queda incrementada de modo que permite su detección turbidimétrica.
4 REACTIVOS
4.1 Antisueros IgG1/IgG2 humana. Son monoespecíficos para la subclase correspondiente y se suministra en forma líquida estabilizada. Contienen: BSA 0,5%, azida sódica 0,099%, ácido E-amino-N-caproico (EACA) 0,1% y benzamidina 0,01% como conservantes.
4.2 Reactivo látex IgG3/IgG4 humana. Son monoespecíficos para la subclase correspondiente y se suministra en forma líquida estabilizada. Contienen azida sódica 0.099% como conservante.
4.3 Calibradores y controles. Preparados a partir de una mezcla estabilizada de material humano, se suministran en forma líquida estabilizada. Conservantes: azida sódica 0,099%, EACA 0,1% y benzaminida 0,01%. La concentración de las subclases IgG indicada en la etiqueta se ha obtenido por comparación con el material de referencia DA470k (ref. 6).
4.4 Tampón de reacción. Conservante: azida sódica 0,099%.
5 PRECAUCIONES
Los sueros humanos suministrados en el kit han sido sometidos a screening para donantes, resultando negativos a la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B y a la presencia de los anticuerpos de la ante los virus HIV1, HIV2 y HCV. Las técnicas usadas están aprobadas por la FDA (USA) o para el diagnóstico in vitro por la UE (Directiva 98/79/EC, Anexo II). Sin embargo los sobredichos ensayos no garantizan la ausencia de agentes infecciosos. Por lo tanto, deben tratarse los reactivos como potencialmente infecciosos. Tanto la manipulación como los métodos de eliminación de desechos deberán realizarse conforme a la normativa de materiales infecciosos y solo personal adecuadamente instruido deberá efectuar el test.
AVISO: Este kit contiene azida sódica debe manipularse con precaución; use guantes y
vestuario protector adecuado en todo momento al manipular este producto. No trague ni permita el contacto con la piel o las mucosas (especialmente si hay heridas). En caso de contacto, lave con abundante agua y consulte a un médico. Con el plomo y el cobre pueden formarse azidas metálicas explosivas. Cuando se elimine el reactivo, lave con mucha agua los recipientes para evitar la acumulación de azida.
El presente producto debe ser utilizado por personal especializado. Se recomienda observar estrictamente el procedimiento indicado. No se garantizan resultados válidos obtenidos utilizando parámetros diferentes que los indicados.
Los reactivos de diferentes lotes NO son intercambiables. En caso de realizar un número
elevado de tests, averigue que todos los reactivos sean del mismo lote.
Insert Code: SIN184, Version: 5th November 2010, Page 9 of 12
6 ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
El kit debe conservarse a 2-8ºC, y puede utilizarse hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. NO CONGELAR. EL reactivo y el tampón de reacción pueden conservarse hasta un mes, después de abrirlos, en el analizador cobas 6000. El reactivo estándar y los controles pueden conservarse a 2-8ºC durante tres meses después de abrirlos, siempre que se tomen precauciones para prevenir su evaporación y contaminación.
7 OBTENCIÓN Y PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Utilice muestras de suero frescas o ultra congeladas. Las muestras de sangre se han
de obtener por punción en vena, dejar que coagule de modo natural y separar el suero lo antes posible para prevenir la hemólisis. El suero se conserva a 2-8ºC hasta 8 días, o se congela sin diluir a -20ºC para periodos más largos. Evitar la congelación repetida de las muestras. No deben utilizarse muestras hemolizadas, lipémicas, con contaminación microbiana o muestras que contengan partículas.
8 METODOLOGÍA
8.1 Material suministrado
Código: NK006.CB, NK007.CB, LK008.CB, LK009.CB
8.1.1 1 x Human Antiserum for C6000 (IgG1 e IgG2) o Human Latex Reagent for C6000 (IgG3 y IgG4) (Antisuero humano (IgG1 e IgG2) o Reactivo látex humano (IgG3 e IgG4) de la subclase correspondiente)
8.1.2 1 x Antisera Reaction Buffer for C6000 o Latex Reaction Buffer for C6000 (Antisuero tampón de reacción (IgG1 e IgG2) o Tampón de reacción Látex Reaction Buffer (IgG3 e IgG4) de la subclase correspondiente)
8.1.3 1 x 1,5mL Human IgG1/2/3/4 Subclass Calibrator for C6000 (Calibrador humano subclases IgG1/2/3/4)
8.1.4 2 x 1mL Human IgG Subclass Low Control for C6000 (Control bajo Subclases IgG)
8.1.5 2 x 1mL Human IgG Subclass Control for C6000 (Control Subclases IgG) 8.2 Materiales necesarios pero no suministrados
8.2.1 Materiales necesarios para la preparación de las muestras, como tubos para la recolección de la sangre, pipetas, centrífuga, etc.
8.2.2 Un analizador cobas 6000 funcional y equipado. 8.2.3 c pack MULTI cobas (Nº Cat. 04593138 190, disponible desde Roche). 8.2.4 Herramienta de apertura y cierre para c pack MULTI (disponible desde Roche). 8.3 Carga de reactivos para el cobas 6000 series
Transferencia de R1 y R2 en el c pack MULTI (ver Figura 1)
8.3.1 Utilice siempre un c pack MULTI cobas nuevo al preparar reactivo fresco. 8.3.2 Llenar incorrectamente los viales del c pack MULTI cobas puede tener como
resultado una reducción en el número de tests o que el instrumento rechace el the C pack MULTI cobas.
8.3.3 Transfiera el antisuero/reactivo látex (R2) a la posición B y tape firmemente utilizando el utensilio de apertura azul Roche.
8.3.4 Transfiera el tampón de reacción (R1) a la posición A (centro) y tape firmemente utilizando el utensilio de apertura azul Roche.
8.3.5 Deje la posición C libre.
Figura 1: Transferencia de reactivos al c pack MULTI 8.4 Se dispone de las instrucciones completas para la puesta en marcha del kit en
los analizadores cobas c. Por favor contacte con su distribuidor local Binding Site para más información.
8.5 Asignación de reactivos a las aplicaciones Open Channel (Para llevar a cabo una vez se han introducido los parámetros en el open channel (ver apéndice)). 8.5.1 Seleccione Open Channel en la pantalla Reagent > settings. 8.5.2 Seleccione el test adecuado. 8.5.3 Seleccione Reserve y OK para cerrar la ventana. 8.5.4 Cargue un C pack MULTI lleno en el instumento para asignarlo al test
seleccionado. 8.6 Procedimiento de test 8.6.1 En el apéndice adjunto están los Chemistry Parameters para cobas 6000 series.
9 RESULTADOS
Los resultados se imprimen automáticamente en concentraciones en mg/L. No se necesitan cálculos adicionales. No se deben usar los resultados con comentarios LIM.L o LIM.H. Sin embargo los resultados de la repetición serán correctos. No se deben usar los resultados que den un valor inferior a la sensibilidad del ensayo (ver más abajo la sensibilidad aproximada). Control de calidad: Los valores obtenidos para el control suministrado deben estar dentro del ±15% del valor de concentración indicado en certificado de control de calidad (SIN184.QC). Si se obtienen resultados de control fuera de este rango, hay que comprobar el instrumento y los parámetros y repetir el ensayo.
10 LIMITACIONES
10.1 Los ensayos turbidimétricos no son adecuados para la medida de muestras
fuertemente lipémicas o con niveles elevados de complejos inmuno circulantes (CIC’s) o factor reumatoide debido al impredecible grado de dispersión inespecífica que pueden generar estas muestras. Resultados inesperados deben confirmarse mediante un método alternativo, por ejemplo inmunodifusión radial.
Las muestras que contengan paraproteínas no son adecuadas para este ensayo debido a su naturaleza altamente variable, que podría dar como resultado exceso antigénico.
10.2 Los resultados obtenidos de la cuantificación de subclases IgG no se deben usar en la evaluación de la atopía en pacientes con alergias.
10.3 El diagnóstico y el comienzo de una terapia no deben basarse única y exclusivamente en la determinación de subclases IgG. Además se debe tener en cuenta tanto el cuadro clínico como otros análisis.
10.4 Se recomienda a los clientes que ensayen ambos controles con cada lote de muestras ensayadas. Si un valor de control queda fuera de rango cuando se ensaya frente a una curva almacenada, se recomienda recalibrar el ensayo. Si quedan fuera de los límites aceptables frente a la nueva curva de calibración, se ha de comprobar el instrumento y los parámetros introducidos antes de repetir el ensayo. Si los problemas continúan, póngase en contacto con su proveedor.
10.5 Los rangos de medición del kit son los siguientes:
Especificidad Rango de medición aproximado (mg/L)
Sensibilidad aproximada (mg/L)
IgG1 1000 – 20000 333,3
IgG2 600 – 10000 60
IgG3 70 – 1312.5 14
IgG4 67,5 – 810 9
11 VALORES ESPERADOS
Los valores indicados a continuación se obtuvieron a partir de un número limitado de muestras inglesas y se ofrecen únicamente como una guía. Es muy recomendable que cada laboratorio establezca sus propios rangos de normalidad. 11.1 Rangos normales, adultos Estos rangos se obtuvieron midiendo las subclases en sueros proporcionados por el Birmingham Blood Transfusion Service, de donantes adultos sanos
Proteína Número
(n) Conc. Media
(mg/L) Conc. Mediana
(mg/L) Rango percentile
95 (mg/L)
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
30 30 30 30
6330 4528 790,7 280,0
6085 4541 706.4 215,3
3824 2418
218.2 39,2
- - - -
9286 7003 1761 864
11.3 Rangos pediátricos
Estos rangos se obtuvieron midiendo la IgG total y las subclases en muestras de suero pediátricas del Birmingham Hospital, utilizando productos de inmunodifusión radial de Binding Site. Las concentraciones se expresan en mg/L.
0-2 años N Conc. media Rango percentil 95
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG total
39 39 39 39 39
5248 838 445 129
6640
1940 – 8420 225 – 3000 186 – 853 5 – 784
3270 – 12700
2-4 años
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG total
36 36 36 36 36
5495 1146 396 171
7770
3150 – 9450 360 – 2250 173 – 676 10 – 537
4680 – 12500
4-6 años
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG total
49 49 49 49 49
6149 1496 531 329
9280
3060 – 9450 605 – 3450 99 – 1221 18 – 1125
5320 - 13400
6-8 años
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG total
43 43 43 43 43
5758 1754 437 331
8860
2880 – 9180 440 – 3750 155 – 853 4 – 992
4540 – 13600
8-10 años
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG total
32 32 32 32 32
6345 2126 521 349
9700
4320 – 10200 720 – 4300 127 – 853 19 – 932
5680 - 13600
10-12 años
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG total
46 46 46 46 46
6421 1980 620 323
10200
4230 – 10600 760 – 3550 173 – 1730 16 – 1150
5680 - 14900
12-14 años
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG total
54 54 54 54 54
6581 2486 583 409
10500
3420 – 11500 1000 – 4550 283 – 1250 37 – 1360
6640 – 14900
14-18 años
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
IgG total
48 48 48 48 48
6057 2614 708 521
10100
3150 – 8550 640 – 4950 230 –1960 110 – 1570
5500 – 14400
Insert Code: SIN184, Version: 5th November 2010, Page 10 of 12
12 CARACTERÍSTICAS DEL MÉTODO
Los siguientes datos se obtuvieron usando un cobas 6000 de Roche. 12.1 Precisión intra-ensayo Se ha llevado a cabo un estudio de precisión siguiendo las pautas Evaluation of Precision Performance of Clinical Quantitative Measurement Methods; Approved Guideline de la NCCLS (Documento NCCLS EP5-A2). El estudio se llevó a cabo durante 21 días, con dos series al día. Un usuario midió los resultados de tres muestras diferentes usando tres lotes de reactivos diferentes en un analizador.
La linearidad de los análisis se confirmó analizando una serie de diluciones de un suero, dando las siguientes rectas de regresión:
IgG1 y=1,033x – 12,05 (mg/L), R2 =0.9991
(y = concentración medida de IgG1, x= concentración teórica) sobre un rango de medición de 425 - 19425mg/L.
IgG2 y=1,015x – 30,56 (mg/L), R2 =0,9991
(y = concentración medida de IgG2, x = concentración teórica) sobre un rango de medición de 62,4 – 8916mg/L.
IgG3 y=1,007x – 9,03 (mg/L), R2 =0,9989
(y = concentración medida de IgG3, x = concentración teórica) sobre un rango de medición de 23,5 – 1175mg/L.
IgG4 y=1,01x – 2,25 (mg/L), R2 =0,9994
(y = concentración medida de IgG4, x = concentración teórica) sobre un rango de medición de 79,1 – 777mg/L.
12.3 Sustancias interferentes
Se observó una interferencia mínima con 200mg/L de bilirrubina, 5g/L de hemoglobina (Hb) y 1540 FTU de quilo en la adición al suero de control subclases IgG. Todos los análisis se llevaron a cabo a la dilución mínima de muestra.
12.4 Límite de detección y límite de cuantificación
Se calcula en base al Documento NCCLS EP17-A - Protocols for Determination of Limit of Detection and Limit of Quantitation; Approved Guideline.
Especificidad Límite de detección (mg/L) Límite de cuantificación (mg/L)
IgG1 80.77 991.75
IgG2 14.98 560.54
IgG3 5.39 69.4
IgG4 2.73 70.5
12.5 Estudio comparativo Se llevó a cabo un estudio de correlación usando este kit para IgG1-4 en el cobas 6000. El estudio demostró una buena concordancia dando los siguientes ajustes Passing Bablok:
IgG1 y = 0,97x + 57,27mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P)
Coeficiente de correlación r = 0,984 (calculado por regresión lineal) n= 91 (30 sueros normales y 61 sueros clínicos)
IgG2 y = 0,99x + 43,68mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P) Coeficiente de correlación r = 0,994 (calculado por regresión lineal) n= 104 (30 sueros normales y 74 sueros clínicos)
IgG3 y = 0,95x + 12,44mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P)
Coeficiente de correlación r = 0,988 (calculado por regresión lineal) n= 108 (30 sueros normales y 78 sueros clínicos)
IgG4 y = 1,00x + 9,78mg/L (y = cobas 6000; x = Modular P)
Coeficiente de correlación r = 0,993 (calculado por regresión lineal) n= 91 (30 sueros normales y 61 sueros clínicos)
12.6 Exceso de antígeno Los ensayos se llevaron a cabo en los niveles que aparecen en la tabla a continuación. No se observó exceso de antígeno a estas concentraciones.
Especificidad Concentración (g/L)
IgG1 55,77
IgG2 21,0
IgG3 4,82
IgG4 2,76
13 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Shakib, F & Stanworth, D R (1980). Human IgG subclasses in health and
disease (Part II). La Ricerca Clin. Lab. 10, 561-580. 2. Shackleford, P G, Polmar, S H et al. (1986). Spectrum of IgG2 subclass
deficiency in children with recurrent infections: Prospective study. J. Pediatr. 108, 647-653.
3. Hamilton, R H (1987). Human IgG subclass measurements in the clinical laboratory. Clin. Chem. 33, 1707 – 1725.
4. Schur, P H (1987). IgG subclasses – a review. Annals of Allergy, 58, 89-99. 5. Vlug, A & Van Remortel, P (1989). The structure and function of human IgG
[ 6 ] [ ++++ ] [] Range 1 [ ] Range 2 [ ] Range 3[ ] Application - Others
Standard: (1) (2) (3) (4) (5) (6) Calib. Code: [501 ]d [ 981 ]e [ 981 ] e [ 981 ] e [ 981 ] e [ 981 ] e Concentration (% of Cal value): 0%f 25% f 50% f 100% f 200% f 500% f
[ 6 ] [ ++++ ] [] Range 1 [ ] Range 2 [ ] Range 3[ ] Application - Others
Standard: (1) (2) (3) (4) (5) (6) Calib. Code: [501 ]d [ 981 ]e [ 981 ] e [ 981 ] e [ 981 ] e [ 981 ] e Concentration (% of Cal value): 0%f 20% f 50% f 100% f 200% f 375% f
[ 6 ] [ ++++ ] [] Range 1 [ ] Range 2 [ ] Range 3[ ] Application - Others
Standard: (1) (2) (3) (4) (5) (6) Calib. Code: [501 ]d [ 981 ]e [ 981 ] e [ 981 ] e [ 981 ] e [ 981 ] e Concentration (% of Cal value): 0%f 18.75% f 60% f 120% f 176.5% f 225% f
