Human Reproduction Vol.19, No.1 pp. 3040, 2004DOI:
10.1093/humrep/deh032Ekspresi nitric oxide synthase dan pengaruh
substrat manipulasi oksida nitrat dalam jalur folikel ovarium
tikus
Leila M.Mitchell1, C.Richard Kennedy dan Geraldine
M.Hartshorne2Departemen Ilmu Biologi, University of Warwick,
Coventry CV4 7AL, UK1Present address: Bourn Hall, Bourn, Cambridge
CB3 7TR, UK2To whom correspondence should be addressed. E-mail:
[email protected] BELAKANG: oksida nitrat
(NO) adalah penyampai pesan sel dengan beberapa cara dalam sistem
biologis yang berbeda, diimplikasikan dalam kontrol folikel dan
fungsi oosit. NO dibentuk dari L-arginine oleh isoform nitric oxide
synthase (NOS) melalui NG-hidroksi-L-arginine, dengan L-citrulline
sebagai produk sampingan. Penelitian ini bertujuan untuk
menunjukkan bagaimana modulasi NO dengan memanipulasi substrat NOS
akan mempengaruhi pertumbuhan folikel mouse dan ovulasi in vitro,
dimana efek vaskuler NO dilemahkan. METODE: Imunohistokimia
[endotel (eNOS) dan diinduksi (iNOS)] dan hibridisasi in situ
(iNOS) yang diterapkan pada ovarium tikus. Folikel yang dikultur
juga terwarnai untuk iNOS dengan imunohistokimia. Untuk folikel
yang dikultur dengan ada atau tidaknya L-arginin, kemampuan
L-citrulline atau NG-hidroksi-L-arginin untuk menggantikan
L-arginine dinilai dalam hal pertumbuhan folikel dan ovulasi.
HASIL: iNOS dan eNOS ditemukan pada oosit dan teka, dengan beberapa
pengecatan di granulosa. iNOS mRNA terjadi terutama di granulosa
dan oosit. Kelalaian dari L-arginin secara signifikan mengurangi
kelangsungan hidup folikel dan ovulasi. Kompensasi parsial untuk
penarikan L-arginine dicapai dengan L-citrulline dan arginin
NG-hidroksi-L. Kelainan spesifik pertumbuhan folikel dicatat.
KESIMPULAN: NOS hadir dalam folikel tikus, dan aksinya diperlukan
di tingkat lokal untuk perkembangan folikel normal in vitro.
Pertumbuhan yang terhambat, membran dasar yang persisten dan
berkurangnya ovulasi dikaitkan dengan gangguan NO in vitro.Key
words: folikel tikus/oksida nitrat/nitric oxide
synthase/oosit/ovulasi SHAPE \* MERGEFORMAT
Pendahuluan
Produk bioaktif terkecil yang dikenal sel mamalia adalah oksida
nitrat (NO), yaitu gas radikal bebas dengan paruh waktu 30 menit
dengan 0,5 volume 10 mol / l amonium asetat (BDH) dan 2,5 volume
100% etanol. RNA ditemukan oleh sentrifugasi pada 3000 g selama 20
menit pada 4oC, dicuci dalam 100 ul 70% etanol dan disentrifugasi
lagi selama 5 menit. Etanol ini kemudian dihapus dengan hati-hati
dan pelet disuspensikan dalam 20 ul dH2O dan ditempatkan di atas
es. Salah satu mikroliter persiapan RNA dijalankan pada 1 % gel
agarosa (Gibco), bersama-sama dengan jumlah yang telah diketahui
DNA dan difoto di bawah sinar UV . Probe RNA disimpan pada 70oC
sampai dibutuhkanHybridization and detection of probeBagian
dideparafinisasi di xylene dan terhidrasi dalam seri etanol ,
ditempatkan dalam PBS dan ke 2xsaline natrium sitrat (SSC). Bagian
yang dicerna dengan 10 ug/ml proteinase K (Sigma) dalam air suling
dengan 0,1 mol/l Tris HCl (BDH, pH 8) dan 50 mmol/l EDTA selama 5,
10, dan 30 menit pada 37oC (Inderdeo et al, 1996;. Berruti et al ,
1998). Bagian diperlakukan dengan 0,25 % (v/v) anhidrida asetat
(Sigma) dalam 0.1 mol/l triethanolamide (BDH) selama 10 menit dan
didehidrasi dalam seri etanol. Bagian kemudian diprehibridisasi
dalam buffer hibridisasi selama 60 menit pada 40oC. Buffer
hibridisasi terdiri 5 ml 50 % formamida, 100 ul 1 mol/l Tris HCl pH
8, 20 ul 0,5 mol/l EDTA, 200 ul solusi 50xDenhart, 500 ul 10 ug/ml
tRNA (Sigma), 4.18 ml dH2O. Sulfat dekstran (0,5 g; Sigma)
ditambahkan ke 5 ml buffer hibridisasi, lalu 5 ng/ul probe
ditambahkan ke volume hibridisasi penyangga menghasilkan 20 ul
solusi probe/slide. Campuran ini dipanaskan sampai 80oC,
didinginkan di atas es dan diterapkan pada bagian. Sebuah penutup
parafilm digunakan dan slide dipanaskan sampai 80oC selama 10 menit
dan kemudian diinkubasi selama 16 jam pada 40oC dalam kotak
kelembaban. Bagian dicuci di 2xSSC pada suhu kamar selama 30 menit
dan kemudian diobati dengan 100 ug/ml RNase A (Boehringer) di 2xSSC
selama 60 menit pada 37oC. Bagian akhirnya dicuci di 0.5xSSC selama
30 menit pada 50oC. Bagian dibilas dalam saline Tris - buffered
(TBS) dan solusi penghalang ditambahkan [8 ml TBS, 0,3 g bovine
serum albumin, 10 ul Triton X-100 (BDH), dan 2 ml serum domba
normal (Sigma) ] selama 30 menit pada suhu kamar. Bagian dibilas di
TBS, lalu 1/500 pengenceran anti-DIG alkaline phosphatase conjugate
(Boehringer) di TBS ditambahkan pada setiap bagian dan diinkubasi
selama 3 jam pada suhu kamar. Slide dibilas dua kali di TBS dan
kemudian disetimbangkan di penyangga substrat (18 ml air suling, 2
ml Tris pH 9, 0.22 g MgCl2 dan 0,12 g NaCl) selama 5 menit pada
suhu kamar. Alkaline fosfatase substrat (Boehringer, 10 ml substrat
penyangga, 80 ug/ml tetrazolium nitro-biru dan 175 ug/ml
5-bromo-4-chloro-3-indolyl-fosfat) diaplikasikan pada bagian,
ditutupi dengan parafilm dan dibiarkan selama 3 hari dalam gelap.
Slide dibilas di bawah air mengalir selama 15 menit, didehidrasi
dalam seri etanol, dibersihkan dalam xylene dan dipasang dengan
DPX.
Bagian kontrol diinkubasi tanpa probe atau dengan sense probe.
Selain itu, bagian dari paru-paru dari tikus KO iNOS diinkubasi
dengan anti -sense probe.Modulation jalur NODalam rangka memodulasi
jalur NO, berbagai konsentrasi substrat NOS diterapkan secara in
vitro. Folikel dikultur dalam L-arg bebas MEM (special order,
Gibco) dengan suplemen kultur lainnya tidak berubah dan menggunakan
kultur dan analisis teknik standar yang sebelumnya sudah divalidasi
untuk sistem ini (Mitchell et al., 2002). Setiap percobaan diulang
minimal enam kali dengan > 30 folikel per eksperimen dan hasil
eksperimen disusun untuk menghasilkan hasil tabel. Tingkat
kelangsungan hidup folikel dan ovulasi dibandingkan dengan kultur
yang di MEM lengkap (L-arg konsentrasi 600 umol/l) atau media bebas
L-arg dengan L-arg (Sigma) ditambahkan kembali pada 600 umol/l.
Pengaruh apo-transferin (10 ug/ml) pada perkembangan folikel
dinilai dengan ada tidaknya L-arg.
Untuk menentukan efek relatif intermediet yang berbeda dari
jalur NO, L-cit (0, 6, 60, 600 umol/l ; Sigma) atau
NG-hidroksi-Larg (Sigma, 0, 6, 60, 600 umol/l) ditambahkan sebagai
suplemen untuk L-arg bebas MEM. Ovulasi dan kelangsungan hidup in
vitro dibandingkan dengan folikel yang dikultur dengan atau tanpa L
- arg. Sebelum digunakan, L-cit dan NG-hidroksi-L-arg dibuat
sebagai x100 stok konsentrasi di media tanpa L-arg dan FCS. Reagen
stok tersebut ditambahkan dalam volume 1% pada media kultur yang
diuji. Hal ini menghindarkan kemungkinan L-arg yang terbawa
mempengaruhi hasil. Percobaan modulasi jalur NO dilakukan tanpa
adanya apo-transferin .StatistikTingkat kelangsungan hidup dan
ovulasi dinilai dengan 2x2 tabel kontingensi, dengan x2 -test . P
< 0,05 dianggap signifikan.HasilDeteksi iNOS
Pada potongan ovarium, antibodi anti-iNOS PA3-030 menghasilkan
pewarnaan positif pada teka dan ooplasma dengan pewarnaan lemah
pada granulosa folikel semua ukuran preantral-antral. Kedua
anti-iNOS antibodi (N52920) menunjukkan distribusi yang sama dengan
pewarnaan yang lebih intens (Gambar 1a). Bagian kontrol negatif
tanpa antibodi primer tetap tidak terwarna (Gambar 1b). Bagian dari
iNOS tikus yang diinkubasi sesuai dengan protokol penuh tidak
menunjukkan pewarnaan. Folikel tikus tertanam setelah kultur 10
hari mengalami penipisan, sehingga hanya sel-sel granulosa dan
kadang oosit ada pada bagian horisontal. Antibodi PA3-030 terhadap
iNOS mewarnai oosit dan beberapa sel folikel luar (Gambar 1c, d).
Kontrol negatif tanpa antibodi primer tetap tidak terwarna.
Pembagian dan
Figure 1. Lokalisasi iNOS, iNOS mRNA and eNOS pada ovarium
tikus. Ovarium tikus 4 minggu diwarna dengan (a) anti-iNOS antibody
(N52920, 1/400) mendeteksi iNOS (coklat) di oosit dan sel teka dan
faint staining pada sel granulosa. Nukleus vesikel germinal,
terlihat di satu oosit berarti negative iNOS. (b) Kontrol negatif.
(c dan d) Potongan folikel tikus kultur 10 hari. Anti-iNOS antibody
(PA3- 030, 1/400) menunjukkan pewarnaan coklat positif di oosit dan
sel granulosa luar. Beberapa sel granulosa dalam juga positif
terhadap iNOS. Ovarium tikus 4 minggu dengan hibridisasi in situ
iNOS mRNA. (e) Anti-sense probe menunjukkan sinyal positif (ungu)
pada oosit dan sel granulosa sekitarnya. (f) Anti-sense probe
mewarnai positif pada oosit dan sel granulosa dan lemah pada sel
teka. Nukleus dalam oosit tidak terwarna. (g) kontrol negatif,
hanya buffer. (h)Kontrol negatif, sense iNOS mRNA probe. Ovarium
tikus 4 minggu terwarna dengan (i) anti-eNOS antibody (1/300)
mendeteksi eNOS (coklat) pada oocyte, sel teka dan sel granulosa
beberapa folikel. Pembuluh darah juga terwarna. (j) kontrol
negatif. Bar = 100 m.
Figure 2. Efek L-arginine pada survival folikel tikus dan
ovulasi in vitro. Folikel di kultur pada medium tanpa L-arginine
(Arg-) memiliki (P < 0.001) survival rate lebih rendah dari yang
dikultur pada medium standar (Arg+), atau Arg- yang ditambahkan
kembali 600 mol/l L-arg. Laju ovulasi mirip dengan Arg+ and medium
yang ditambah kembali L-arg; keduanya lebih besar dari Arg- (P <
0.001).penanganan spesimen ini sulit dan sangat terbatas data yang
dapat diperoleh .Deteksi iNOS mRNA
Sinyal positif iNOS mRNA terdeteksi pada sel granulosa dan oosit
(Gambar 1e). Sel granulosa dan oosit dalam folikel berbagai ukuran
dari preantral ke antral terwarna. Terlihat pewarnaan lemah dan
ireguler pada sel teka (Gambar 1f). Tidak ada sinyal yang
diproduksi pada kontrol negative ; penyangga hibridisasi saja
(tanpa penyelidikan, Gambar 1g) , iNOS sense probe ( Gambar 1 h )
atau menggunakan anti-sense probe pada bagian hati dari tikus
(tidak terlihat) .
Deteksi eNOS
Pewarnaan positif untuk eNOS terdeteksi pada pembuluh darah,
seperti yang diharapkan, dan juga dalam oosit dan sel teka.
Pewarnaan juga terlihat di sel-sel granulosa dari folikel dari
berbagai ukuran dari preantral ke antrum , seperti yang ditunjukkan
pada Gambar 1i. Sedikit pewarnaan non spesifik terjadi di bagian
kontrol negatif tertahan tanpa antibodi primer ( Gambar 1j )
.Kultur folikelPengaruh adanya L arg
Gambar 2 menunjukkan bahwa kelalaian L-arg mengurangi
kelangsungan hidup folikel dan ovulasi. Folikel dikultur di MEM
standar memiliki tingkat kelangsungan hidup 77 % dengan 71 %
ovulasi dan tanpa adanya L - arg, 36 % selamat, 15 % ovulasi (P
< Gambar 3 Folikel dikultur dengan dan tanpa L - arginine (
semua pembesaran asli x100 ) . (a) Hari 3 , Arg + . Oosit sentral,
sel teka melekat pada dish, sel-sel folikel sehat dan membran basal
utuh . Folikel ini ovulasi normal karena hCG pada hari 11 ,
menunjukkan statusnya sehat . (b) Hari 3 , Arg . Tidak ada
perbedaan yang jelas dari a. Folikel ini membentuk antrum pada hari
ke 5 dengan membran basal yang tersisa utuh sampai akhir. Tidak ada
ovulasi walau dengan hCG . (c) Hari 5 , Arg + . Sel telah melewati
membran basal dan bermigrasi , oosit pusat dan sel-sel folikel
tampak sehat . Folikel ini membentuk antrum pada hari ke 6 tapi
terlambat berovulasi (> 16 jam setelah hCG). (d) Hari 5 , Arg- .
Sel teka melekat pada piring , sel-sel granulosa sehat dan rongga
antral telah dimulai. Folikel ini tampaknya berkembang secara
normal namun membran basal masih utuh. Folikel ini tetap sebuah
membran basal utuh sampai akhir dan tidak merespon hCG. (e) Hari 8
, Arg + . Rongga antral terlihat dengan oosit dikelilingi oleh
sel-sel kumulus. Folikel ini berovulasi secara normal karena hCG.
(f) Hari 8 , Arg- . Rongga antral dengan membran basal yang tersisa
utuh sampai akhir. Sel granulosa menjadi gelap dan tidak ada respon
terhadap hCG . ( g ) Hari 8 , Arg-. Sel folikel yang melekat pada
dish tapi tampak degenerasi dan gelap, oosit oval , tidak merespon
hCG. (h) Hari 8 , Arg-. Rilis prematur dari oosit telanjang oleh
hari ke-8 Bar = 100 um .0,001) . Ketika 600 umol /l L - arg
ditambahkan kembali ke medium L - arg bebas, tingkat kelangsungan
hidup 88 % lebih besar dari pada dalam medium lengkap (P < 0,05)
dan medium tanpa L - arg (P < 0,001). Dalam media yang
ditambahkan L-arg kembali, 75 % dari folikel ovulasi tidak berbeda
dengan MEM standar, tapi lebih besar dari pada tidak adanya L - arg
(P < 0,001). 85% persen folikel yang ovulasi normal, dengan L
arg ini, oosit dirilis dengan sel cumulus terpasang, dibandingkan
dengan 47 % dari mereka dalam medium bebas L arg (P < 0,00)
SHAPE \* MERGEFORMAT
Table I. Perbandingan pertumbuhan folikel dan ovulasi pada
kondisi dimana L-arginin (600 mikromol/l)dan/atau apo-transferrin
(10 g/ml) tersediaCulture conditions
L-Arginine++
Apo-transferrin++
Total no. of follicles cultured
282198220 194
Surviving (%) Total ovulation rate (%)7b1455b99086a 84 75a
Timely ovulation rate (
