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UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARIA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS, BIOQUIMICAS Y
BIOTECNOLOGICAS
PROGRAMA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA
“DETERMINACIÓN DEL EFECTO DE Allium sativum L. AJO
SOBRE LOS NIVELES DE PLOMO EN SANGRE Y ÓRGANOS DE
ANIMALES CON TOXICIDAD AGUDA EXPERIMENTAL.
AREQUIPA 2012”
Tesis presentada por os bachilleres:
Choquenaira Quispe, Celia
Gonzales Condori, Ever Renzo
Para optar el título profesional de:
QUIMICO FARMACEUTICO
Asesor: Dr. José A. Villanueva Salas, PhD.
AREQUIPA – PERÚ
2013
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AGRADECIMIENTOS
Dios tu eres el principal actor de esta obra tan maravillosa todo te lo debemos a ti.
El presente trabajo de tesis es un esfuerzo en el cual, directa o indirectamente,
participaron varias personas leyendo, opinando, corrigiendo, teniéndonos paciencia,
dándonos ánimos, acompañándonos en los momentos de crisis y en los momentos de
felicidad.
A la Universidad Católica de Santa María porque nos dio la oportunidad de formarnos
como profesionales de la salud.
A nuestros padres que a pesar de la distancia siempre nos han apoyado en nuestras
decisiones y estuvieron atentos al desarrollo del presente trabajo.
Agradecemos al Doctor PhD. José Antonio Villanueva Salas por haber confiados en
nosotros, por la paciencia y por el asesoramiento.
A los Mgter. Julitza L. Paredes Fuentes y Stanber Revilla Ramirez por formar parte del
desarrollo del proceso de esta investigación.
A nuestros hermanos Abel, Elvis, Katy y Bianca porque siempre nos han apoyado
incondicionalmente demostrándonos que nos quieren.
Gracias también a nuestros amigos quienes nos apoyaron y nos permitieron entrar en
sus vidas y sobre todo por brindarnos su amistad. Daniela, Karla, Idris, Alejandro,
Eleana con E, Paola, Melody y al señor Justito.
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INDICE
Pág.
CONTENIDO
RESUMEN ............................................................................................................... 1
SUMMARY ............................................................................................................. 3
CAPITULO I
Pág.
INTRODUCCION .................................................................................................. 5
OBJETIVOS ............................................................................................................ 7
HIPOTESIS ............................................................................................................. 8
MARCO TEORICO ............................................................................................... 9
1. AJO (Allium sativum L.) ................................................................................. 9
1.1. Características botánicas ........................................................................ 9
1.1.1. Descripción morfológica de la especie ....................................... 9
1.2. Hábitat ..................................................................................................... 10
1.3. Clasificación taxonómica de la especie ................................................... 10
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1.4. Composición química .............................................................................. 10
1.5. Principales constituyentes activos del ajo ............................................... 12
a) Aliina ................................................................................................. 12
b) 2- propentiolsulfinato de alilo ........................................................... 14
c) Ajoeno ............................................................................................... 17
d) Disulfuro de dialilo (DADS) .................................................................... 19
1.6. Propiedades medicinales del Allium sativum L. (Ajo) ............................. 21
2. LIOFILIZACION .......................................................................................... 24
2.1. Principios físicos de la liofilización ........................................................ 25
2.2. Ventajas de la liofilización ...................................................................... 26
2.3. Desventajas de la liofilización ................................................................ 26
3. METALES PESADOS ................................................................................... 27
4. PLOMO ........................................................................................................... 28
4.1. Etiología .................................................................................................. 28
4.2. Fuentes de intoxicación ........................................................................... 29
4.3. Formas etiológicas .................................................................................. 30
4.4. Intoxicación profesional .......................................................................... 30
4.5. Intoxicación extra profesional ................................................................. 32
4.6. Dosis tóxica ............................................................................................. 34
4.7. Fisiopatología .......................................................................................... 35
4.7.1. Toxicocinética ............................................................................ 35
4.7.2. Mecanismo de acción ................................................................. 39
4.7.3. Efectos biológicos del plomo ..................................................... 40
4.7.4. Cuadro clínico ............................................................................ 46
Page 5
4.7.5. Diagnóstico ................................................................................. 47
4.7.6. Tratamiento ................................................................................ 48
4.8. Problemática del plomo en el Perú .......................................................... 50
5. ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA – VISIBLE ................................. 50
5.1. Instrumentación ...................................................................................... 50
5.2. Absorción de luz: ley de Beer – Lambert ................................................ 52
5.3. Desviación de la ley de Beer ................................................................... 52
6. VOLTAMPEROMETRIA Y POLAROGRAFIA ...................................... 53
6.1. Introducción ................................................................................................. 53
6.2. Instrumentación ............................................................................................ 54
6.3. Principio de la voltamperometría ................................................................. 55
6.4. Métodos voltamétricos ................................................................................. 56
6.5. Preparación de muestras para análisis de metales ........................................ 60
6.6. Métodos de digestión ................................................................................... 61
CAPITULO II
Pág.
1. MUESTRA ..................................................................................................... 66
2. LUGAR DE EXPERIMENTACIÓN ........................................................... 67
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS .............................................. 67
4. METODOS ..................................................................................................... 70
Page 6
4.1. Métodos analíticos ...................................................................................... 70
4.2. Métodos estadísticos ................................................................................... 88
CAPITULO III
Pág.
RESULTADOS Y DISCUSIONES ........................................................................ 92
CONCLUSIONES ................................................................................................... 128
SUGERENCIAS ...................................................................................................... 129
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS .................................................................. 130
ANEXOS .................................................................................................................. 146
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RESUMEN
El objetivo de este estudio fue investigar el efecto de la solución acuosa de ajo en
Rattus norvegicus inducidas experimentalmente a un cuadro de toxicidad aguda con
100 ppm de acetato de plomo en solución acuosa vía oral, el trabajo se llevó a cabo
en el laboratorio H-202 y el Bioterio de la Universidad Católica de Santa María,
durante los meses de setiembre a noviembre del año 2012.
El tratamiento de las ratas intoxicadas se hizo mediante la administración de solución
acuosa de ajo liofilizado vía oral para la cual, se determinó en forma indirecta la
concentración de alicina (2-propentiosulfinato de alilo) del ajo (procedente de la
empresa ONMIAGRO S.A.), adquirido del laboratorio “LPM” de la UCSM, por
espectrofotometría empleando el método de Schwimmer con la finalidad de
establecer la cantidad de ajo liofilizado equivalente a 1000 µg de alicina
correspondiente a la dosis. Una vez hallada la concentración de alicina por gramo de
ajo, los 24 animales de experimentación, Rattus norvegicus variedad Wistar, fueron
sometidos a un proceso de adaptación que consistió en estandarizar las condiciones
ambientales y alimenticias (quince días). Posteriormente todos los animales fueron
distribuidas al azar en cuatro grupos de 6 ratas cada uno y se les determinó la
concentración basal de plomo en sangre antes de cualquier tratamiento: al grupo 1
(Control Negativo) se le administró 1 ml agua destilada, al grupo 2 (Control
Positivo) se le administró 100 ppm de acetato de plomo, al grupo experimental 3
(Pre-post tratamiento) se le administró 1000 µg/kg/día de alicina en solución acuosa
de ajo liofilizado 7 días antes y durante cinco semanas después del día de la
intoxicación, al grupo experimental 4 (Post tratamiento) se le administró 1000
µg/kg/día de alicina en solución acuosa de ajo liofilizado durante 5 semanas después
del día de la intoxicación. La intoxicación y el tratamiento fueron administrados en
ayunas en soluciones acuosas vía oral. Culminada las 6 semanas de experimentación
se sacrificó a todos los animales por contusión cervical y se les extrajeron el hígado,
bazo y riñón para su posterior análisis. La concentración de plomo tanto en sangre
como en órganos fueron determinados por Voltamperometría de redisolución
anódica, es así que para los análisis de sangre se tomaron 0.5 ml de muestra del plexo
venoso retro orbital de todos los animales de experimentación cada 5 días durante
todo el periodo de tratamiento y fueron sometidos a un proceso de digestión UV con
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2
100 µL ácido nítrico, 20 µL peróxido de hidrógeno y 5 mL de agua ultrapura por
una hora. Para el análisis de los órganos (hígado, bazo y riñón), se trituraron y
pesaron por separado 100 mg de muestra y fueron sometidos a un proceso de
digestión en dos etapas, una primera fase de pre-digestión con 1.5 mL de ácido
nítrico por 3 horas y una segunda fase de digestión a presión en el horno microondas
en dos ciclos. Los resultados de las concentraciones de plomo en sangre muestran
que el ajo disminuye las concentraciones de plomo en dicho fluido biológico en un
85 % para el caso del grupo 3 y en un 78 % para el caso del grupo 4, además, los
análisis estadísticos al 95 % (p > 0.005) sugieren que no existe diferencia
significativa entre los tratamientos del grupo 3 (Pre-post tratamiento) y el grupo 4
(Post tratamiento). Así mismo los resultados de las concentraciones de plomo en los
diferentes órganos muestran que el ajo disminuye en un 83 % la concentración de
plomo en hígado y en un 50 % la concentración de plomo en bazo. Además se puede
afirmar que el ajo no disminuye la concentración de plomo en el riñón.
Se concluye que el ajo podría ser recomendado como tratamiento para reducir los
niveles de plomo en sangre y algunos órganos.
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3
SUMMARY
The aim of this study was to investigate the effect of the watery solution of garlic in
Rattus norvegicus induced experimentally to acute intoxication with 100 ppm of lead
acetate in watery solution by oral administration, the work was carried out in the
laboratory H-202 and the Bioterio of the Catholic University of Santa María, during
the months of September to November of 2012.
The treatment of rats was made by the administration of watery solution of garlic
liofilizado by oral administration for the one which, it was determined in form
insinuation the allicin concentration (2-propentiosulfinato of alilo) of the garlic
(coming from the company ONMIAGRO CORP.), acquired of the laboratory "LPM"
of the UCSM, for espectrofotometry using the method of Schwimmer with the
purpose of establishing the quantity from garlic equivalent liofilizado to 1000 µg of
allicin corresponding to the dose. Once pick up the allicin concentration for gram of
garlic, the 24 experimentation animals, Rattus norvegicus variety Wistar, was
subjected to a process of adaptation that consisted on standardizing the
environmental and nutritious conditions (fifteen days). Later on all the animals were
distributed at random in four groups of six rats each one and they were determined
the basal concentration of lead in blood before any treatment: to the group 1
(Negative Control) it was administered 1 ml of distilled water, to the group 2
(Positive Control) it was administered 100 ppm of lead acetate, to the experimental
group 3 (Pre-post treatment) it was administered 1000 µg/kg/day of allicin in watery
solution of garlic liofilizado seven days before and five weeks after the day of the
intoxication, to the experimental group 4 (Post treatment) it was administered 1000
µg/kg/day of allicin in watery solution of garlic liofilizado 5 weeks after the
intoxication. The intoxication and the treatment were administered in in watery
solutions by oral administration. Culminated the six weeks of experimentation it was
sacrificed all the animals by cervical bruise and they were extracted the liver, spleen
and kidney for their later analysis. The lead concentration as much in blood as in
organs was determined by anodic stripping voltammetry, it is so for the analyses of
blood they took 0.5 ml of sample of the plexus veined orbital retro of all the
experimentation animals every 5 days during the whole period of treatment and they
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4
were subjected to a digestion process UV with 100 µL nitric acid, 20 µL peroxide of
hydrogen and 5 mL of water ultrapure for one hour. For the analysis of the organs
(liver, spleen and kidney), they were crushed and they weighed for separate 100
sample mg and they were subjected to a digestion process in two stages, a first pre-
digestion phase with 1.5 mL of nitric acid for 3 hours and a second digestion phase to
pressure in the oven microwaves in two cycles. The results of the lead concentrations
in blood show that the garlic diminishes the lead concentrations in this biological
fluid in 85% for the case of the group 3 and in 78% for the case of the group 4, also,
the statistical analyses to 95% (p < 0.005) they suggest that significant difference
doesn't exist among the treatments of the group 3 (Pre-post treatment) and the group
4 (Post treatment). Likewise the results of the lead concentrations in the different
organs show that the garlic diminishes in 83% the lead concentration in liver and in
50% the lead concentration in spleen. One can also affirm that the garlic doesn't
diminish the lead concentration in the kidney.
Consequently, the garlic could be recommended as treatment to reduces the lead
levels in blood and some organs.
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5
INTRODUCCIÓN
El uso de plantas medicinales ha sido siempre parte de la cultura humana. La
Organización Mundial de la Salud estima que el 80 % de la población mundial confía
en el sistema de medicina tradicional para algún aspecto de cuidado de salud
primario. (30,81,109)
El interés en la planta medicinal como alternativa para el cuidado de la salud ha ido
resurgiendo y junto con ella el interés de investigar nuevas propiedades medicinales,
entre estos estudios llevados a cabo se encuentra el ajo “Allium sativum L.”; del cual
se ha informado la presencia de compuestos antioxidantes (flavonoides) y el
contenido de compuestos azufrados (23,109)
(disulfuro de dialilo, 2-propentiosulfinato
de alilo, etc.). Es probable que estos compuestos jueguen un papel importante en los
efectos biológicos ampliamente demostrados del ajo que le atribuyen propiedades
como: hipoglicemiante, (72)
antihipertensivo (2,120)
hipocolesterolémico, (72,120)
hipolipémico, (1,4,7,18,42,43,51,59,65,67,74,101,120)
antiagregante plaquetario,
antitrombogénico, (16,43,44,80,103,119 )
antiinflamatorio, (72)
antitumoral, (9,12,31,45,46,96)
antiviral (49,70)
antifúngico (7,13,62,107)
y antibacteriano (7,25,45,46,69,85,106,107,113)
. Además
algunas páginas de fitoterapia indican que el ajo podría reducir los niveles de plomo
en sangre (8,37,76,82,100,8,38,73,98)
sin especificar o mencionar el mecanismo por el cual
actúa.
Durante décadas, la intoxicación con plomo ha sido conocida como un desorden
importante que afecta a los individuos ya sea a través de una exposición aguda,
subaguda o crónica debido a que en el medio ambiente y escenas ocupacionales se
encuentran fuentes comunes de intoxicación para plomo como lo son las industrias
de fabricación de baterías para automóviles, la fabricación de cerámica, la
fabricación de plástico y cristalería, etc. (73,82,100)
. Exposiciones a concentraciones
bajas de plomo pueden dar lugar a problemas en la salud relacionadas al sistema
nervioso, hematopoyético, reproductor, etc.; (100)
es más, las concentraciones para la
producción de manifestaciones clínicas difieren extensamente ya que depende en
gran medida de la ubicación geográfica y sobre todo de variaciones individuales.
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6
La prevención a una re exposición es crítica durante el tratamiento de intoxicación
por plomo. Antídotos, como el Edetato disodico cálcico (EDTA), 2,3
Dimercaptopropanol (BAL), acido 2,3–Dimercaptosuccinico (DMSA) también
llamado Succímero, (50,100,121)
han sido usados ampliamente para tratar la intoxicación
por plomo durante las últimas seis décadas, estos agentes pueden acomplejar y
facilitar la excreción de plomo del cuerpo. Sin embargo, los efectos colaterales, altos
costos y algunas desventajas en el uso de estos antídotos indican que deben buscarse
otras alternativas para el tratamiento de la intoxicación. (121)
Es así que el presente trabajo de investigación se llevó a cabo para determinar el
efecto de la solución acuosa de ajos liofilizados sobre los niveles de plomo en sangre
y órganos de animales de experimentación sometidos a un cuadro de toxicidad aguda
con acetato de plomo vía oral.
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7
OBJETIVOS
Los objetivos del presente trabajo son los siguientes:
1. Determinar cuantitativamente el contenido de alicina en ajo liofilizado
mediante espectrofotometría.
2. Optimizar el método para la determinación de plomo en sangre y órganos por
Voltamperometría de redisolución anódica.
3. Determinar experimentalmente el efecto de la solución acuosa de ajo Allium
sativum L. sobre los niveles de plomo en sangre de animales con toxicidad
aguda experimental.
4. Determinar experimentalmente el efecto de la solución acuosa de ajo Allium
sativum L. sobre los niveles de plomo en hígado, bazo y riñón.
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HIPOTESIS
“Dado que la literatura refiere que los principios activos del ajo son azufrados, es
probable que, disminuyan los niveles de plomo en sangre y órganos de animales con
toxicidad aguda experimental.”
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CAPITULO I
MARCO TEORICO
1. AJO Allium sativum L.
1.1. Características botánicas
1.1.1. Descripción morfológica de la especie
El ajo pertenece a la familia de las liliaceaes y su nombre sistemático es
Allium sativum L. siendo el término “allium” probablemente procedente del
céltico “all” que significa picante. (37)
Es una planta común y ampliamente
distribuida, usada en muchas partes del mundo como condimento y alimento;
se cultiva en la mayoría de países, siendo Arequipa una de las regiones en las
que más se cultiva en el Perú. (117)
El ajo presenta un bulbo redondo, ligeramente piriforme, constituido por
numerosos gajos llamados dientes o bulbillos dispuestos en torno. Cada
bulbillo presenta dos caras laterales planas, el dorso es convexo y los
extremos puntiagudos, cubiertos por una membrana transparente
generalmente de color rojizo.
El conjunto de dientes está envuelto por varias túnicas delgadas, blanquizcas
y quebradizas, cuando se secan.
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10
Su tallo es herbáceo, formado por una parte aérea y una parte subterránea que
forma los bulbos.
Sus hojas son simples, ensiformes, estrechas y enteras, se envuelven unas a
otras formando lo que se llama inapropiadamente tallo.
Su inflorescencia es bulbífera en umbela y presenta muchas flores
hermafroditas trímeras.
Su raíz es fibrosa y/o fasciculada.(10)
1.2. Hábitat
El ajo es originario de Kirgiz, Siberia y domesticado en Asia Central a partir
de A. lingicupis Regel. Diseminado por las tribus nómadas al este y oeste de
donde se ha cultivado y usado ampliamente en casi todas las culturas (Roma,
Grecia, Egipto, China, India) desde hace más de 5000 años. Llegó a América
a través de Europa en el s. XV. Es cultivado en varias regiones del mundo.
En el Perú es cultivado en la mayor parte del país, particularmente Arequipa
es la zona de mayor cultivo. (10)
1.3. Clasificación taxonómica de la especie
El ajo tiene la siguiente clasificación taxonómica: (21)
o Reino : Vegetal
o Subreino : Embriofitas
o División : Espermatofitas
o Subdivisión : Angiosperma
o Clase : Monocotiledóneas
o Orden : Lilifloras
o Familia : Liliáceae
o Subfamilia : Lilioidea
o Género : Allium
o Especie : Allium sativum
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11
1.4. Composición química
En cuanto a la composición química del ajo, esta puede variar de acuerdo a la
variedad y características ecológicas. Estudios en este sentido han sido ecos
en muchas variedades, incluyendo la variedad Allium sativum “Napurí”,
propia de nuestra región y que es la que utilizaremos en el presente estudio.
En 1951, flores analizó varias especies de Allium (117)
dando la siguiente
composición para el ajo “Napurí”.
Tabla N°1: Composición del ajo según flores.(117)
Proteínas 3.14 - 3.17 %
Grasas 0.95 - 1.25 %
Azucares totales 3.94 - 4.26 %
Cenizas 0.722 - 0.782 %
Cenizas ácidos – sensibles 0.476 - 0.518 %
Agua 78.79 - 79.04 %
Minerales
Sodio y potasio
Hierro
Calcio
Fosforo
Azufre
Zinc
0.1008 - 1.1565 %
0.00033 - 0.00047 %
0.02235 - 0.4800 %
0.0592 - 0.0616 %
0.0560 - 0.615 %
0.0001 - 0.0032 %
Vitaminas: por 100 g. de ajo fresco
Tiamina y riboflavina
Niacina
Biotina
A
C
32 µg.
395 mg.
2.2 mg.
284 UI.
0.0291 - 0.4810 mg.
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Según el instituto de Nutrición y Servicio Cooperativo Peruano –
Norteamericano de Salud Pública. La composición de 100 g. de ajo Napurí es
la siguiente.
Tabla N°2: Composición del ajo según el instituto de Nutrición y Servicio
Cooperativo Peruano – Norteamericano de Salud Pública.(117)
Proteínas 5.60 g.
Grasas 0.80 g.
Carbohidratos 30.30 g.
Fibra 0.90 g.
Agua 61.40 g.
Minerales
Calcio
Fosforo
Hierro
94.0 mg.
180.0 mg.
1.7 mg.
Vitaminas
Tiamina
Riboflavina
Niacina
C
0.14 mg.
0.07 mg.
0.42 mg.
9.10 mg.
Además, Bolton y col. Reportan trazas de cobre, aluminio, germanio y
selenio; a estos 2 últimos elementos los consideran coadyuvantes de la
alicina, en las propiedades antitumorales del ajo.
1.5. Principales constituyentes activos del Ajo
a) Aliina
Este aminoácido conocido también como (+)-S-alil-L-cisteinil-sulfóxido. Se
encuentra en el citoplasma de las células del bulbo de ajo y está
constituyendo el “pool” de aminoácidos no proteicos, representa
aproximadamente el 0.24% en peso de un bulbo típico de ajo. (117)
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13
Propiedades físicas y químicas
Tiene un P.M. de 167.26, una fórmula global como C6H11O3NS y su fórmula
estructural es la siguiente:
CH2
S+
COOH
NH2O
-
Esquema N°1: Fórmula desarrollada de la aliina.(21)
Funde con descomposición y burbujeo entre 163° y 165 °C, es ópticamente
activa. Es bastante soluble en agua pero su solubilidad decrece con el
incremento de la concentración de alcohol siendo completamente insoluble
en alcohol absoluto, siendo también insoluble en cloroformo, acetona, éter
etílico y benceno.
La solución acuosa de aliína es estable aun en altas temperaturas, y tiene
reacción ácida a un pH 4.9.
La aliina por la acción de la aliinasa produce alicina, ácido pirúvico y
amoniaco, estos dos últimos componentes están presentes en cantidades
equimoleculares como se puede observar en la Figura N°2. (117)
Aliinasa
La enzima aliinasa es una glicoproteína homodimérica que pertenece a la
familia de enzimas dependientes de piridoxal 5-fosfato, contiene un factor de
crecimiento dérmico desconocido que la hace única entre todas estas enzimas.
(59)
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14
Propiedades
Es capaz de destruir los enlaces carbono – azufre; puede ser extraída con agua
de bulbos de ajo finamente cortados constituyendo el mayor componente de
dichos bulbos. (59)
Tiene un punto isoeléctrico de 4.0, es además muy inestable, aún a 3°C pierde
su actividad antes de los 14 días, también se inactiva por contacto con
solventes orgánicos, tales como el etanol y el éter etílico. (59)
La actividad de la aliinasa y la concentración de la alicina pueden ser
determinados por la cantidad de amoniaco o acido pirúvico producidos
enzimáticamente (Esquema N°3).
Se ha demostrado que la reacción con la aliina tiene lugar exactamente rápido
hecho que está de acuerdo con la aparición instantánea del olor típico en los
ajos cortados. (59)
b) 2-propentiolsulfinato de alilo
Alicina o tiol sulfinato de dialilo es el principio activo del extracto acuoso de
ajo recientemente preparado y mantenido a temperaturas bajas. (117)
Propiedades físicas y químicas
Es un líquido incoloro, químicamente inestable al que se le debe el olor del
ajo, mucho más que el disulfuro de dialilo.
Tiene un P.M. de 162.27, su fórmula global es C6H10S2O y su fórmula
desarrollada es:
CH2S
S+
CH2
O-
Esquema N°2: Fórmula desarrollada de la alicina.(21)
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CH
2
S+
NH
3+
O-
H CO
O-
+H
22
2C
H2
S+
NH
3+
O-
H
H+
O-
O
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1)
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16
En base a sus investigaciones químicas Cavallito y col. Propusieron dos
fórmulas desarrolladas para la alicina:
CH2S
OS
CH2
Esquema N°4: Fórmula desarrollada de la alicina A.(117)
CH2S
SCH2
:O
Esquema N°5: Fórmula desarrollada de la alicina B.(21)
Su solubilidad en agua es de 2.5 g en 100 ml de agua según Buck y Suter y el
propio Cavallito. La alicina es inestable con las variaciones de temperatura y
pH, confirmado por Barone y Tansey en 1977, trabajando con el extracto
acuoso de ajo encontraron que su actividad disminuía en un 95 % a las 72
horas de haber sido colocado en una incubadora a 37 °C.
Además comprobaron que la alicina es inestable en medios básicos.
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17
CH2S
SCH2
:O
CH2 S-Na
+
+
CH2 SO
-
O
CH2 S-Na
+ CH2 SS
CH2
Esquema N°6: Reacción de la formación del disulfuro de dialilo.(21)
La alicina es convertida rápidamente a disulfuro de dialilo (DADS) debido a
su inestabilidad (Esquema N°6). (117)
Propiedades medicinales
Los estudios sugieren que la alicina es una sustancia importante para las
propiedades medicinales del ajo.
Se le atribuyen propiedades antimicrobianas, antifúngicas, (10, 72, 101,117)
antivirales, (52)
hipolipemiantes, (70,123)
antihipertensivas, (2)
y como
antiagregante plaquetario. (18)
Presenta alta permeabilidad para atravesar membranas (81)
y una respuesta
vasodilatadora en isquemia pulmonar en ratas. (55,58)
c) Ajoeno
Es un compuesto órgano-sulfurado denominado 9-óxido de 4, 5 ,9-
tritiododeca-1, 6, 11-trieno. (117)
Page 24
18
Propiedades físicas y químicas
Tiene una fórmula global: C9H14S30 y presenta dos isómeros Esquema N°7 y
Esquema N°8.
CH2
S+
SS
CH2
O-
Esquema N°7: Configuración trans.(117)
CH2
S+
SS
CH2
O-
Esquema N°8: Configuración cis.(117)
El ajoeno se obtiene a partir de la alicina (Esquema N°9), cuando se somete
una solución de alicina en acetona o en metanol diluidos a temperaturas
ambientales por 4 días. (117)
Propiedades medicinales
Se le atribuyen propiedades antibacterianas, (83)
antifúngicas, (64,83)
antivirales,
(86) antiprotozoarios
(65,86), potente antiagregante plaquetario
(86) y
hepatoprotector. (46)
Actualmente se le conoce como una droga experimental antileucémico con
gran actividad antitumoral. (30,66)
Page 25
19
Es un agente quimio preventivo en carcinomas gastrointestinales provocados
por AINES (29)
y un inhibidor del crecimiento de células cancerígenas in vivo
e in vitro en ratones. (66)
d) Disulfuro de dialilo (DADS)
Es el principal componente del aceite esencial de ajo y se le conoce también
como disulfuro de di (2-propenil). (117)
Propiedades físicas y químicas
Tiene un P.M. de 146.27 como fórmula global C6H10S2 y fórmula estructural
en la Esquema N°10.
CH2S
SCH2
Esquema N°10: Disulfuro de dialilo.(21)
El disulfuro de dialilo en el ajo de forma a partir de la alicina en función del
tiempo y de la temperatura, tal como lo reportaron Brodnitz y col. (112)
La alicina se descompone completamente a 20 °C en 20 horas rindiendo
DADS (66 %), sulfuro de dialilo (DAS) (14 %), trisulfuro de dialilo
(DASTS), además de cierta cantidad de dióxido de azufre. (117)
Propiedades medicinales
Se le atribuyen propiedades como: antimicrobiano, (112)
antioxidante, (37)
hepatoprotector, (25)
antihipercolesterolemico. (68,69)
Ejerce una actividad quimiopreventiva potente contra el cáncer de colon,
pulmón y piel en ratas, (62, 122)
Induce la actividad antitumorígena producida por AINES en animales de
experimentación. (15)
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20
CH
2
SS
CH
2
:O
2
AL
ICIN
A
CH
2
SS
+
:O
S
CH
2
CH
2
H
CH
2
SO
H
CH
2
SO
H
SH
+
S
CH
2
CH
2
S+
S
CH
2
CH
2
S OH
CH
2
+
H+
S S
S
CH
2
CH
2
:O+
S S
SC
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CH
3
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cina
. (1
12
)
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21
El DADS y otros compuestos órgano-sulfurados del ajo como: dipropil disulfuro,
sulfuro de dialilo, alil metil sulfuro, alil mercaptano, cisteína y cistina reducen la
formación de aminas aromáticas heterocíclicas en frituras de alimentos en base
de carne. (25)
Es un prometedor agente anticancerígeno en el cáncer de seno dependiente e
interdependiente de hormonas (86)
y un potente antimicótico contra lesiones
neoplásicas de colon in vivo y crecimiento in vitro de células en cáncer de colon.
(99)
1.6. Propiedades medicinales del Allium sativum L. (Ajo)
Actualmente son de interés y ampliamente estudiadas alrededor del mundo
principalmente sus propiedades: antibacterianas, antifúngicas, antivirales,
hipoglicemiantes, hipolipémicas, antihipertensivas, anticancerígenas,
hepatoprotectores, antiinflamatorias y antiagregante plaquetario.
Algunas páginas de fitoterapia le atribuyen al ajo la propiedad de disminuir los
niveles de plomo en sangre (8,40,79,85,104)
sin especificar o mencionar el mecanismo
por el cual actúa.
Propiedad antibacteriana
Estudios recientes confirman la actividad antibacterial “in vitro” del ajo contra
Streptococcus neumoniae y Klebsiella pneumoniae causantes de la neumonía,
(75,118) Helicobacter pylori
(49, 88,107) reconocido actualmente como el agente causal
de gastritis crónica, ulceras gástricas y duodenales.
También contra Staphylococcus aureus resistente a Metilcilina, (112)
bacterias
entéricas humanas, Enterobacter aerogenes dependiendo del tiempo y dosis del
contenido de tiosulfinato.
Y además contra Bactarias G (+) : S. aureus y B. subtilis y Bacterias G (-) : P.
aeuriginosa y E. coli. (7,111)
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22
Propiedad antifúngica
Contra cepas de Aspergillus, Candida y B. capitatus (7,112)
es eficaz en el
tratamiento de Tinea pedís comparado con Terbinafina. (65)
Se comprobó la sensibilidad in vitro contra los dermatofitos comunes como: T.
rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis y E. floccosum y en el
tratamiento de pacientes con Tinea crucis y corporis causadas por estos hongos.
(13)
Propiedad antiviral
El principio activo alicina puede prevenir un ataque por el virus del resfrío
común. (52)
El ajo fue más efectivo y menos tóxico comparado con dos drogas antivirales
usadas contra enterovirus. (73)
Propiedad hipoglicemiante
Estudios recientes revelaron que los niveles de glucosa y glucógeno decrecieron
significativamente después de la alimentación con ajo y cebolla. (75)
Propiedad hipolipemiante
Previene la hipercolesterolemia y las alteraciones vasculares inducidas por la
dieta, así mismo, mejoran los factores de riesgo de enfermedades
cardiovasculares en animales de experimentación y humanos. (
1,4,7,18,45,46,54,62,68,70,77,105,125)
Inhibición de la síntesis de triglicéridos y ácidos grasos. (69)
Propiedad antihipertensiva
Reduce la presión diastólica sanguínea en hipertensión media y moderada, (2)
tiene propiedad es antihipertensiva en nulíparas en el tercer trimestre de
gestación, pero no previene la preeclampsia. (125)
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23
Propiedad anticancerígena
Como preventivo en el cáncer de estómago, colorectal y de seno en
animales de experimentación. (12,33)
Antitumoral en el intestino delgado de ratas por daño inducido por
drogas. (48)
Reduce los riesgos de cáncer gástrico inducido por H. pylori. (49)
Es un agente quimiopreventivo y quimioterápico en tumores implantados
en la cavidad peritoneal en ratones. (100)
Ejerce su efecto antitumoral por inducción de apoptosis en carcinoma de
la cavidad bucal en animales. (9)
En útil en la prevención de carcinoma gastrointestinal inducido por
AINES. (29)
Prometedor agente anticancerígeno del cáncer de seno. (86)
Propiedad hepatoprotectora
El ajo exhibe un efecto hepatoprotector contra daños inducidos por
acetominofeno en ratones. (44,109)
Como profiláctico contra daños en los tejidos gástricos y hepáticos en ratas
inyectadas con veneno de cobra. (95)
Propiedad antiinflamatoria y antiagregante plaquetario
Modula la producción de leucocitos y la producción in vitro de citoquinas
relacionadas con la enfermedad inflamatoria intestinal. (46,47)
Ejerce una actividad inhibitoria selectiva sobre la agregación y adhesión en las
funciones plaquetarias en humanos. (16,83,108,124)
Otras
Inhibe la formación de aminas aromáticas heterocíclicas producidas en la
fritura de preparados en base de carne. (25)
Page 30
24
Aumenta la circulación en la enfermedad isquémica coronaria y
pulmonar. (11)
Mejora la microcirculación y propiedades reológicas sanguíneas. (82)
Efecto antioxidante, el ajo ha mostrado proteger al organismo contra
enfermedades inducidas por oxidantes. (14,121)
Podría reducir los niveles de plomo en sangre. (103)
Efecto inhibitorio contra cuatro cepas de Leishmania. (64)
Actividad moduladora inmunológica in vitro e in vivo. (23)
Efecto protector contra la nefrotoxicidad producida por gentamicina. (92)
2. LIOFILIZACION
El procedimiento llamado criodeshidratación, criodesecación o liofilización,
consiste en congelar el producto para luego deshidratarlo al vacío, aprovechando
la propiedad de sublimación que posee el hielo, es decir, la propiedad que le
permite pasar de una fase sólida a la fase gaseosa sin fundirse. Mediante este
proceso se elimina a muy baja temperatura, el agua de un producto que se
mantiene congelado y rígido mientras esta húmedo. En esas condiciones el
producto no sufre el calor por la presencia de agua y se deshidrata conservando
su forma y volumen original. (10)
2.1. Principios físicos de la liofilización
La liofilización es un proceso en el que se congela el producto y posteriormente
se introduce en una cámara de vacío para realizar la separación del agua por
sublimación. De esta manera se elimina el agua desde el estado sólido al gaseoso
del ambiente sin pasar por el estado líquido. Para acelerar el proceso se utilizan
ciclos de congelación-sublimación con los que se consigue eliminar
prácticamente la totalidad del agua libre contenida en el producto original, pero
preservando la estructura molecular de la sustancia liofilizada
Page 31
25
En el diagrama de fases la frontera entre
gas y líquido va desde el punto triple hasta
el punto crítico. La liofilización (flecha
azul) lleva el sistema alrededor del punto
triple, evitando así la transición directa de
líquido a gas de un secado tradicional
(Flecha verde).
Para llevar a cabo el proceso de liofilización se necesita determinar los siguientes
parámetros.
Punto eutéctico del producto
Presión
Temperatura
En el caso del ajo la temperatura de congelación es de - 30 °C. y la operación
dura 45 minutos. El vacío utilizado en el túnel está dado por la temperatura del
ajo congelado, correspondiéndole a – 30°C. un vacío de 0.4 torr.
La reducción de la presión existente en la cámara, con temperatura y presión por
debajo de la correspondiente al punto triple, hace que inmediatamente se inicie la
evaporación de la húmeda. La fase de sublimación concluye cuando ya no hay
hielo para retirar del producto. (30,48,123)
El producto seco liofilizado tiene una estructura porosa, debido a que las
moléculas de agua han abandonado sus sitios dejándolos así, por tanto estos
poros tienden a llenarse con aire atmosférico, el cual es muy dañino por contener
oxigeno que da lugar al oxidamiento y ranciamiento, es por esto que se busca un
gas inerte o aire seco para evitar estos fenómenos, una vez secado el producto, va
a un tambor de producto terminado, posteriormente se realiza la molienda y el
tamizado. (123)
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26
2.2. Ventajas de la liofilización
La liofilización ofrece múltiples ventajas: (10)
a) Calidad superior del producto final.
b) Longevidad del producto procesado, manteniendo sus propiedades.
c) En efecto, la baja presión del proceso y la débil conductividad de los productos
liofilizados (debido a la textura porosa) afectan de manera significativa y
negativa la transferencia de calor y de masa y por consecuencia la duración de la
operación de deshidratación.
d) Se reduce considerablemente la desnaturalización proteica, de modo que los
tejidos se conservan en estado viable. Debido en parte, a las bajas temperaturas
empleadas y también a la ausencia de migración de sales y otros solutos, el
producto final tiene exactamente el mismo grado de uniformidad que el material
primitivo.
e) La pérdida de constituyentes volátiles, tales como aceites esenciales, es
generalmente menor que en otros métodos de desecación.
f) La desecación es uniforme y rara vez observa un endurecimiento superficial.
g) En las condiciones de baja temperatura en que se realiza la desecación no se
produce ningún crecimiento bacteriológico, ni cambio enzimático.
h) En virtud del elevado vacío empleado, en comparación en el empleado en la
evaporación ordinaria, la cantidad de oxigeno presente es tan pequeña que
resultan protegidos, incluso, los componentes fácilmente oxidables.
i) Los productos liofilizados pueden almacenarse por largo tiempo completamente
secos, bajo condiciones adecuadas de temperatura y humedad.
2.3. Desventajas de la liofilización
a) Elevado costo debido a que el proceso es relativamente largo y complejo.
b) El producto debe conservarse en condiciones adecuadas de temperatura y
humedad ya que es fácilmente reconstituible.
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27
c) En el caso del polvo liofilizado, este es muy higroscópico si está expuesto al
ambiente sin ningún tipo de cuidado. (10)
3. METALES PESADOS
Se considera metal pesado a aquel elemento que tiene una densidad igual o
superior a 5 g/cm3 cuando está en forma elemental, o cuyo número atómico es
superior a 20 (excluyendo a los metales alcalinos y alcalino - térreos). Su
presencia en la corteza terrestre es inferior al 0.1 %. Junto a estos metales
pesados hay otros elementos químicos que aunque son metales ligeros o no
metales se suelen englobar con ellos por presentar orígenes y comportamientos
asociados; es este caso del As, B, Ba, y Se. (50)
Dentro de los metales pesados hay dos grupos:
a) Oligoelementos o micronutrientes, que son los requeridos en pequeñas
cantidades traza por plantas y animales, y son necesarios para que los organismos
completen su ciclo vital. Pasando cierto umbral se vuelven tóxicos. Dentro de
este grupo están: As, B, Co, Cr, Mo, Mn, Ni, Se y Zn.
b) Metales pesados sin función biológica conocida, cuya presencia en determinadas
cantidades en seres vivos lleva a disfunciones en el normal funcionamiento de
los organismos. Resultan altamente tóxicos y presentan la propiedad de
acumularse en los organismos vivos. Son principalmente: Cd, Hg, Pb, Cu, Ni,
Sb, Bi.
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28
4. PLOMO
4.1. Etiología
El plomo (Pb) es un metal pesado de color grisáceo que presenta un aspecto de
color brillante, pero que se oxida rápidamente y toma un aspecto mate. Es muy
dúctil y maleable. Funde a 327 °C y hierve a 1.525 °C. Al fundir, emite humos
que al oxidarse se transforman en polvos finos de óxidos de plomo. Se encuentra
ampliamente distribuido en la naturaleza, siendo el sulfuro de plomo o galena su
forma más frecuente de presentación.
Es un metal resistente a la acción del ácido sulfúrico, pero se disuelve con
facilidad en ácido nítrico y en ácidos orgánicos (cítrico, acético), dando lugar a
sales solubles.
El empleo industrial del plomo, así como de sus aleaciones con el antimonio y
estaño, se remonta a los tiempos más antiguos: (20)
se calcula que la polución
atmosférica era muy alta en el hemisferio norte entre la V centuria a.C. y la III
d.C. como consecuencia del alto consumo de plomo en la metalurgia.
Cabe resaltar que el plomo es un metal pesado que no juega ningún papel en la
fisiología humana, por lo que el nivel plasmático ideal debería ser cero. En la
actualidad es prácticamente imposible encontrar alguna persona en la que no se
detecte niveles de plomo en sangre. (50)
Hoy día, las intoxicaciones por el plomo son en su mayoría de origen profesional
y tiene un evidente interés por las siguientes razones:
a) La intoxicación se puede presentar en muy diversas circunstancias obedeciendo a
una etiología oculta, de carácter profesional, alimenticio, hídrico o ambiental.
b) El plomo es el primer agente responsable de enfermedad profesional de origen
tóxico. Unos 15.000 obreros están expuestos a este compuesto, muchos de ellos
en pequeñas empresas no sometidas a controles de higiene industrial.
c) El plomo es un contaminante de las drogas de abuso. Tanto en la heroína como
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29
en la cocaína (en mayor proporción) se detectan cantidades significativas de
plomo.
d) El plomo es un contaminante ambiental importante que por diversos
mecanismos, llega a contaminar el aire, el agua y la cadena alimenticia, hasta
llegar al hombre. Los 4 millones de toneladas de plomo que anualmente se
manejan en el mundo lo hace muy peligroso, ya que este metal se recicla
íntegramente y no sufre proceso alguno de biodegradación.
4.2. Fuentes de intoxicación
Se distinguen tres posibles fuentes de intoxicación:
Plomo metal
Sólo es tóxico cuando se funde a temperaturas próximas a los 500 °C. Los
vapores que emite son tóxicos, y si penetran en las vías respiratorias alcanzan
fácilmente los alveolos. Los vapores se oxidan rápidamente, haciéndose poco
solubles. Según su peso y contenido en agua, quedarán más o menos tiempo en
suspensión en el aire para, finalmente, caer al suelo. Ésta es la forma fundamental
de contaminación ambiental.
Derivados inorgánicos
Constituyen un grupo muy numeroso y por lo general son poco solubles, de lo
que se deriva una toxicidad relativamente escasa. Entre ellos destacan:
Óxidos: minio (Pb204) u óxido de plomo rojo, base de las pinturas
anticorrosivas; el litargirio (PbO) o protóxido de plomo, y el bióxido de
plomo (PbO2).
Cromato de plomo, que es un magnífico colorante amarillo.
Arstmiato de plomo, base de numerosos insecticidas.
Carbonato de plomo o cerusita, pigmento blanco tóxico.
Otras sales: sulfato de plomo, o blanco de Mulhouse, y antimoniato de
Page 36
30
plomo, o amarillo do Nápoles.
Derivados orgánicos
Son muy empleados en la industria y destacan entre ellos:
Acetato de plomo o sal de Saturno: es muy soluble y es el único que produce
intoxicaciones agudas por vía digestiva. Se ha empleado como abortivo.
Tetraetilo de plomo: antidetonante que se ha venido adicionando a la
gasolina para aumentar su capacidad de compresión, elevando así su
rendimiento. Por razones ecológicas, hoy día está muy generalizado el uso de
la gasolina «sin plomo».
Estearato de plomo: se usa para dar estabilidad y consistencia al plástico.
Naftenato de plomo: es componente de numerosas grasas y aceites de uso
industrial.
4.3. Formas etiológicas
Pueden distinguirse dos formas de desigual importancia:
Intoxicaciones voluntarias. Tanto la intoxicación criminal como la suicida
son hoy excepcionales. En otra época se utilizó el acetato de plomo con fines
abortivos.
Intoxicaciones accidentales. Son las más frecuentes. Dan lugar tanto a
accidentes agudos como a la intoxicación crónica, denominada clásicamente
saturnismo.
4.4. Intoxicación profesional
Fundición de plomo y zinc.
Fabricación y manipulación de arseniato de plomo para pulverizaciones.
Fabricación de óxidos de plomo.
Producción de compuestos de plomo (incluyendo la producción de
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31
compuestos alquílicos que conlleve una exposición al plomo metálico y sus
compuestos iónicos).
Fabricación y utilización de pinturas, esmaltes, masillas y colorantes que
contienen plomo.
Artesanía de estaño y plomo.
Fabricación de plomo para soldaduras.
Fabricación de munición de plomo.
Utilización de municiones de plomo en locales cerrados.
Industrias de cristalería, cerámica y alfarería artesanal.
Industria de plástico que utilice aditivos a base de plomo.
Trabajos de imprenta en las que se utilice plomo.
Trabajos de demolición, especialmente raspado, quemado y oxicorte de
materiales recubiertos con pinturas de plomo, así como demolición de
instalaciones en los que de alguna manera, esté presente el plomo.
Soldadura con plomo en locales cerrados.
Construcción y reparación de automóviles que impliquen utilización o
presencia de plomo.
Fabricación y templado de aceros con plomo.
Revestimiento con plomo.
Recuperación de plomo y de residuos metálicos que lo contengan.
En España, la máxima siniestralidad está en las industrias del vidrio, cerámica y
arcilla, donde se producen el 50 % de las enfermedades profesionales por el
plomo, con una tendencia alcista. Habrá que prestar una especial atención a todas
aquellas empresas en las que se funde plomo, como las fábricas de perdigones, o
en las que el riesgo queda oculto: recuperación de chatarras, obtención y
fundiciones de estaño, zinc, etc. (126)
Page 38
32
4.5. Intoxicación extra profesional
a) De origen hídrico. La concentración máxima de plomo admitida por la OMS en
el agua de bebida es de 50 µg/L. A veces se producen contaminaciones de las
aguas de bebida por diversas razones: tuberías de plomo, vasijas de barro
esmaltadas o pintadas con compuestos de plomo, etc.
b) De origen alimenticia. Se estima que la cantidad de plomo que ingresa en el
organismo a causa de la contaminación de alimentos oscila entre 100 y 400
µg/día. El origen de este plomo es ambiental, siguiendo las vías del Esquema
N°11. .No obstante, hay cuadros de saturnismo que obedecen a causas muy
concretas como:
Consumo habitual de bebidas ácidas (jugos de frutas), envasadas en latas y
cerradas con soldaduras que contienen plomo.
Vinos almacenados en vasijas de barro.
Harinas contaminadas por insecticidas que contienen plomo o por las ruedas
del molino cuando han sido reparadas con plomo.
Siempre existirá riesgo si se almacenan productos que lleven en su
composición ácidos (vinagre) en vasijas que se vitrifiquen con galena; el
plomo puede irse solubilizando lentamente.
Page 39
33
Esquema N°11: Vías de contaminación de los alimentos por el plomo. (126)
c) Infantiles. Clásicamente se conocen las intoxicaciones infantiles por culpa de los
juguetes fabricados con plomo o pintados con compuestos de plomo, pero fue la
aparición de una encefalopatía grave en niños americanos entre 1 y 6 años lo que
ha alertado sobre un nuevo problema ligado al plomo. Los primeros casos fueron
señalados en Australia por GIBSON. en 1892; entonces no se aclaró la etiología,
pero se estableció su carácter doméstico y estacional. En 1902 ya se demostró
que el origen se encontraba en la habitación y que las manos-boca
desempeñaban un papel importante. En 1924, RUDDOK llamó la atención sobre
el papel de la «pica» en la intoxicación por el plomo en la infancia. A partir de
esta época se publican muchos casos de encefalopatías infantiles ligadas al
plomo lo que los lleva o decir a LEVISON Y HARRISON, en 1936, que ante toda
encefalopatía infantil debería plantearse la posible etiología por el plomo. En
1971, el nivel tóxico se fijó en 40 µg/dl, en 1978 era reducido a 30 ug, en 1985
a 25 µg /dL y más recientemente, en 1991, a 10 µg %. En el 2000, el informe de
Page 40
34
LANPHEAR y COX. (57)
sugiere que el plomo puede ejercer efectos tóxicos
sobre el cerebro en concentraciones inferiores a 5 µg %. Esta conclusión se basa
en un análisis de más de 4.800 niños de 6 a 15 años que han participado en el
tercer examen nacional de vigilancia de la salud.
d) Contaminación ambiental. El interés creciente por la toxicología del plomo se
debe a que la sociedad mundial ha tomado conciencia del papel que este metal
desempeña como contaminante ambiental. Dos son las fuentes de
contaminación: las empresas que funden plomo y vierten sus humos a la
atmósfera, y los automóviles que consumen gasolina con plomo. BERNKERT
estima que un vehículo que utilice este tipo de gasolina vierte a la atmósfera
alrededor de 2,5 kg de Pb/año.
e) Drogadicción. Hasta ahora, era conocido que una de las causas frecuentes de la
encefalopatía por el plomo era la ingestión de whisky ilícito llamado moon-
shíne, pero hoy se añaden nuevos aspectos al problema. La heroína contiene
plomo como contaminante en cantidades no despreciables; para un drogadicto
que se inyecte diariamente representa el paso directo a la sangre de importantes
cantidades de plomo. Pero recientemente se ha publicado que la cocaína está
igualmente adulterada por plomo. Su origen se encuentra en la gasolina con
plomo que se utiliza para la preparación de la droga, en lugar de otros disolven-
tes más caros y difíciles de obtener. (126)
4.6. Dosis tóxica
Es difícil establecer una dosis tóxica única para el plomo. Al igual que sucede
con otros tóxicos, son numerosos los factores que influyen en la toxicidad de este
metal. Factores como características individuales, tipo de producto, vía de
absorción, etc., van a tener una influencia decisiva. A mero título informativo, y
como muestra de ello, se puede señalar que en el adulto l g de acetato de plomo
Page 41
35
puede producir la muerte y 2-4 g de carbonato de plomo pueden dar lugar a una
intoxicación grave. Para otras sales pueden ser necesarias dosis de 20-40 g a fin
de producir un cuadro tóxico grave. (126)
Tabla N°3: Interpretación de la dosificación del plomo. (126)
Matriz biológica Valor normal Valor patológico
Sangre ≤ 10 ug/dl > 20-45 ug/dl
Orina < 50 ug/dl de creatinina Superior a 150 ug/dl
4.7. Fisiopatología
4.7.1. Toxicocinética
a) Absorción
El plomo puede penetrar en el organismo por tres vías: respiratoria, digestiva y
cutánea.
Vía respiratoria. Es la más importante en el medio laboral; por ella se inhalan
humos, vapores y polvos. Las partículas inhaladas suelen ser microscópicas, de
ahí que penetren fácilmente hasta el alveolo y sean retenidas. Se calcula que el
50 % de las partículas inhaladas son retenidas y de éstas se absorberá el 90 %. (56)
Vía digestiva. Por esta vía se producen las intoxicaciones agudas en casos de
suicidio, contaminaciones alimenticias, etc., aunque ello resulta excepcional en
nuestros días. La ingestión de plomo tiene dos orígenes:
La ingestión de alimentos contaminados en la cadena de polución por comer
o fumar con las manos sucias como resultado de una mala higiene personal,
o por el caso ya referido de la «pica» en niños que chupan paredes u objetos
pintados con colorantes plúmbicos.
Page 42
36
La deglución del plomo inhalado y que quedó retenido en el moco de la
nasofaringe y bronquios. Este plomo que penetra por vía digestiva (a excep-
ción del acetato de plomo) es insoluble, de ahí que la absorción sea muy
escasa, se estima que puede oscilar entre un 5 y 10 % del ingerido. En casos
especiales (niños enfermos del aparato digestivo o dietas especiales que
alteran la solubilidad del plomo) podría aumentar la absorción hasta el 25
%.
En sujetos normales la cantidad de plomo eliminado por las heces y orina
puede alcanzar hasta el 95 % del total ingerido, lo que representa un 200-500
ug/día. Cifras superiores a 500 ug/día supondrían una ingesta excesiva de
plomo.
Vía cutánea. Los derivados inorgánicos de plomo no se absorben por la piel
íntegra. Sin embargo los derivados orgánicos, que son muy liposolubles, pueden
absorberse esta vía, sobre todo el tetraetilo y el tetrametilo de plomo. El
naftenato presente en ciertas grasas y aceites industriales puede absorberse por
esta vía.
b) Distribución y metabolismo
De todos los esquemas propuestos para explicar la distribución del plomo en el
organismo, quizá sea el de RABINOWITZ (94)
el más exacto y didáctico
(Esquema N°12). Para este autor la distribución se hace siguiendo tres
compartimentos: sangre, tejidos blandos y esqueleto.
Una vez absorbido, el plomo pasa a la sangre. El 90 % del plomo circulante está
ligado a los hematíes. Su vida media es de unos 35 días. Este compartimento
central está en contacto directo con las vías de absorción y excreción renales, y
con los otros compartimentos, con los que mantiene una situación de equilibrio.
Además de este plomo ligado al hematíe, (57)
hay otra fracción sérica ligada a las
proteínas ricas en azufre.
Page 43
37
El segundo compartimento lo forman los tejidos blandos, principalmente el riñón
y el hígado; (71,80)
en él se contienen 0,3 a 0,9 mg de plomo. Su vida media
biológica es de 40 días.
El tercer compartimento lo constituye el hueso, que contiene el 90 % del plomo
almacenado en el organismo.
El plomo sigue los movimientos del calcio en lo que a su depósito y
movilización se refiero. Se fija en el hueso y resulta muy difícil su movilización
al formar compuestos muy estables. Las zonas óseas donde el plomo se deposita
con preferencia son las más activas metabólicamente, como las metáfisis y las
epífisis. Estudios más recientes, llevados a cabo determinaron la concentración
de plomo en diferentes tipos de huesos (tibia y calcáneo) usando fluorescencia de
rayos X (109 cd KXRF), demuestran que el esquema no es tan simple y que
influye el tipo de hueso, la edad de la persona - mayor o menor de 40 años - y el
nivel do exposición.
Este almacenamiento óseo es importante porque, en situaciones patológicas de
acidosis, descalcificación, dieta, etc., puede movilizarse calcio del hueso, y
entonces el plomo se movilizará con él produciéndose cuadros agudos de
intoxicación. Este proceso puede ser particularmente importante en la mujer
gestante que contenga una gran cantidad de plomo almacenado en el hueso, ya
que se estima que el hueso puede aportar hasta un 50 % de la concentración de
plomo circulante, que atravesaría la placenta y podría lesionar el cerebro del feto
en formación.
Tras ser absorbido, el plomo en el organismo sigue un modelo tricompartimental:
a) El sanguíneo (el 2 % del contenido total, cuya vida media es de 36 ± 5 días)
b) El de los tejidos blandos (cuya vida media es algo más prolongada , 40 ± 5 días )
c) El óseo (que representa el 90 % del contenido total con una vida media entre 10
y 28 años) (50)
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38
Esquema N°12: Distribución del plomo en el organismo. (94)
c) Excreción
El plomo se excreta fundamentalmente por orina (80 %) y de forma secundaria
por heces, sudor, saliva y faneras. En una persona no expuesta profesionalmente,
el balance - absorción/excreción - debe ser «cero» o ligeramente positivo
(alrededor de 10 µg /día). En personas expuestas al plomo se irá acumulando en
el hueso de modo progresivo; ello tendrá una repercusión directa sobre la
plumbemia y la plumburia, que estarán aumentadas con relación a la población
no expuesta. Estos hechos pueden sufrir modificaciones importantes, sobre todo
por el plomo que penetra por vía digestiva, ya que del 5 al 10 %, que es la
proporción que se absorbe normalmente, se puede pasar al 50 % en caso de niños
cuando la dieta es baja en calcio, hierro o zinc.
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39
La leche, que se venía administrando de forma empírica a los obreros para
impedir la absorción de plomo, se ha comprobado que produce efectos contrarios
y favorece la absorción.(126)
4.7.2. Mecanismo de acción
El plomo tiene gran afinidad por los grupos sulfhidrilo, en especial por las
enzimas dependientes de zinc. El mecanismo de acción es complejo; en primer
lugar parece ser que el plomo interfiere con el metabolismo del calcio.
El plomo altera el calcio de las siguientes formas:
Reemplaza al calcio y se comporta como un segundo mensajero
intracelular, alterando la distribución del calcio en los compartimentos
dentro de la célula.
Activa la proteinquinasa C, una enzima que depende del calcio y que
interviene en múltiples procesos intracelulares.
Se une a la calmodulina más ávidamente que el calcio, ésta es una
proteína reguladora importante.
Inhibe la bomba de Na-K-ATPasa, lo que aumenta el calcio intracelular.
Finalmente esta alteración a nivel del calcio traería consecuencias en la
neurotransmisión y en el tono vascular lo que explicaría en parte la hipertensión
y la neurotoxicidad. Por otro lado, el plomo es tóxico para las enzimas
dependientes del zinc, los órganos más sensibles a la toxicidad son el sistema
hematopoyético, el sistema nervioso central y el riñón. Interfiere con la síntesis
del hem, ya que se une a los grupos sulfhidrilos de las metaloenzimas como son
la d- aminolevulínico deshidratasa, coproporfirinógeno oxidasa y la
ferroquelatasa, siendo el resultado final, el aumento de las protoprofirinas como
la zinc-protoporfirina (ZPP) y la anemia.
A nivel renal interfiere en la conversión de la vitamina D a su forma activa,
produce una tubulopatía, que en estadios más avanzados llega a atrofia tubular y
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40
fibrosis sin compromiso glomerular, caracterizándose por una proteinuria
selectiva. En niños se puede ver un síndrome semejante al de Fanconi, con
aminoaciduria, glucosuria, e hipofosfatemia, sobre todo en aquellos con
plumbemias altas. Varias funciones del sistema nervioso central están
comprometidas, principalmente porque el plomo altera en muchos pasos el
metabolismo y función del calcio como explicamos previamente. El plomo se
acumula en el espacio endoneural de los nervios periféricos causando edema,
aumento de la presión en dicho espacio y finalmente daño axonal. El plomo
depositado en el hueso es importante por tres razones:
En el hueso se realiza la medición más significativa de exposición
acumulada al plomo. Actualmente en E.E.U.U. y México se usa los rayos
X fluorescentes que permiten la medición de plomo en el hueso (tibia),
como un indicador de exposición y acumulación.
El hueso es reservorio del plomo (95% del plomo corporal total está en el
tejido óseo) y puede aumentar en sangre cuando existan procesos
fisiológicos o patológicos que provoquen resorción ósea como embarazo,
lactancia, hipertiroidismo, etc.
También es órgano blanco, ya que el plomo altera el desarrollo óseo.
4.7.3. Efectos biológicos del plomo
Acción sobre el tejido hematopoyético
El plomo se fija sobre la médula ósea en una concentración muy superior a la
que existe en sangre circulante; de ahí se derivan las siguientes consecuencias:
Alteraciones en la síntesis de la hemoglobina
El plomo inhibe en el eritroblasto tres enzimas clave que intervienen en la
síntesis del hem. (97)
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41
∂-ALA-deshidratasa.
coproporfirínógiino III-descarboxilasa, o coproporfirinógeno III-oxidasa
(coprogenasa).
hem - sintetasa o ferroquelatasa.
Esquema N°13: Síntesis del hem y sus alteraciones debidas al plomo. (94)
Como se aprecia en la figura, la síntesis de la hemoglobina se realiza en la
mitocondria de los eritroblastos donde se encuentran todas las enzimas
necesarias. La acción del plomo está ligada, por tanto, a las alteraciones que
produce en la mitocondria y en los ribosomas.
A la alteración de la síntesis del hem se añade un trastorno en la síntesis de la
globina. Estudios in vitro han demostrado que el plomo inhibe la síntesis de la
globina.
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42
El descenso de los niveles de Hb es más precoz que el número de hematíes.
(17,57,87,97)
Alteraciones de los precursores de los glóbulos rojos
El plomo produce ciertas alteraciones morfológicas sobre los precursores de los
glóbulos rojos que pueden ponerse en evidencia en el examen de punciones de
médula esternal. Es frecuente encontrar megaloblastos, eritroblastos con
punteados basófilos. La naturaleza de este punteado basófilo, conocido desde
hace muchos años, no está aún esclarecido por completo. (126)
Acción sobre los hematíes circulantes
Es clásica la anemia saturnina. Es una anemia moderada, normo o hipercroma
que aparece cuando el sujeto se expone a niveles altos de plomo (superiores a 80
µg %).
Esta anemia tiene diversos orígenes. De una parte, se origina una acción directa
del plomo sobre los órganos eritropoyéticos, que produce un déficit en lo
producción de hematíes. En segundo lugar, se produce también una hemolisis.
(17,126)
Acción sobre los riñones
Según MORGAN (1977), aproximadamente el 20 % del plomo absorbido se
localiza en el riñón: ello indica que en las intoxicaciones agudas se alcanzarán
altas concentraciones de metal en esto órgano. Dos tercios del plomo absorbido
se excreta por el riñón, siguiendo una curva bifásica: en la primera semana se
excreta el 50 % del plomo absorbido y el resto a continuación, de modo mucho
más lento. La eliminación del plomo por el riñón se realiza por un mecanismo
doble de filtración glomerular y excreción tubular; se produce así mismo una
cierta reabsorción tubular. (3)
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43
El hueso como tejido blando del plomo
Las evidencias experimentales que permiten proponer algunos mecanismos
fisiopatológicos probables para el establecimiento de una lesión ósea son: (30)
a) Alteración del cristal de hidroxiapatita y, por consiguiente, alteración de la
adhesión de la célula ósea a la matriz mineralizada.
b) Competencia entre el plomo y el calcio en sus sitios de unión, con alteración de
la homeostasis del calcio.
c) Daño a la capacidad de las células óseas para sintetizar y/o excretar componentes
de la matriz (colágeno, sialoproteínas).
d) Inhibición de la producción de osteocalcina por parte de los osteoblastos.
e) Alteración en el acople funcional de osteoblastos y osteoclastos.(30,50)
Plomo en huesos como fuente de exposición
Aunque desde hace muchos años se ha reconocido que el plomo se acumula en
el hueso, se tenía la idea de que se trataba de un secuestro, de un depósito con
una sola vía, en el cual se iba acumulando el plomo removido de la circulación y
de los tejidos blandos.
Se trata de un concepto totalmente incorrecto, ya que el depósito y la remoción
del plomo en huesos sigue exactamente la activa fisiología del calcio, que está
sometida a los efectos de factores generales, tales como la nutrición, el ejercicio,
y los factores específicos como las influencias hormonales y metabólicas
esquematizadas en la Esquema N°14, entre los elementos que modifican la
fisiología del plomo están los factores de crecimiento, las proteínas derivadas del
hueso y otras señales fisiológicas como el 1,2,5 – hidroxicalciferol, los
estrógenos, la hormona paratiroidea, la calcitonina, la hormona del crecimiento,
la prolactina, la tirotropina y nutrientes como el calcio, el zinc y el fosforo.
La fisiología del hueso, es compleja y por ello diferentes tipos de hueso tienen
diferentes tasas de crecimiento y mineralización, así como diferente densidad
final.(50)
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44
Esquema N°14: Modelo biológico del plomo en huesos
Fuente: Sanin, Helena y cols. Acumulación de plomo en huesos y sus efectos
para la salud. Salud Pública Mex 1998; 40:359-368).
Por otra parte hay evidencia de que el plomo óseo puede regresar a la sangre en
proporciones sustanciales (45 a 70 % del total de plomo en sangre completa),
después de disminuir la exposición exógena o en circunstancias patológicas o
fisiológicas que implican mayor resorción ósea, los niveles sanguíneos pueden
mantenerse altos o iguales a partir de los depósitos óseos, aun después de retirar
la exposición aguda a plomo. (33)
El embarazo implica una mayor demanda de calcio, tanto de la dieta como de los
almacenamientos fisiológicos en tejido óseo. Estas demandas surgen de los
requerimientos fetales para osificación y crecimiento, los cuales tienen su acmé
durante el tercer trimestre de embarazo.
El hueso materno sirve de fuente de calcio en esa etapa. Se observa cambios en la
tasa de formación y resorción, especialmente en mujeres embarazadas con dietas
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45
deficientes en calcio. Esta movilización ósea estimula en gran medida la
liberación de plomo, el cual atraviesa libremente la barrera placentaria, de tal
forma que el plomo de hueso se convierte no solo en fuente endógena para la
madre sino también para el feto en desarrollo.
Datos experimentales confirman que tanto el plomo depositado en hueso materno
como el proveniente de la dieta son transferidos al feto con avidez y el plomo en
hueso puede ser removido particularmente durante la lactancia. (37)
Thompson
informo en 1985 acerca de la existencia de manifestaciones clínicas de
intoxicación aguda por plomo en una mujer embarazada y su bebe, como
consecuencia de la movilización del plomo almacenado en huesos. (50,126)
Acciones sobre el sistema nervioso
No existe duda alguna de que, en el curso de intoxicaciones agudas con altas
concentraciones de plomo en sangre (> 80 µg %), se produce una clara
encefalopatía, demostrable tanto en la clínica como por el electroencefalograma.
En lo morfológico, los efectos del plomo sobre el sistema nervioso central no son
específicos. Se observa edema, multiplicación de las células endoteliales,
proliferación glial, degeneración neuronal y focos de necrosis. Es decir, hay una
combinación de mecanismos vasculares (anoxia) y lesiones directas. (6, 19, 36, 90,
110, 120)
El plomo afecta también al sistema nervioso periférico con producción de una
neuropatía de predominio motor, más frecuente en los adultos que en los niños, y
en el varón que en la mujer, que afecta los miembros superiores.
Interacciones con otros metales
CASSARET refiere la interrelación del plomo con otros métalos que pueden
condicionar la toxicidad de aquél. Así, una deficiencia en calcio, hierro y zinc en
la dieta aumenta la toxicidad del plomo. En los animales con bajos regímenes de
Calcio se produce una retención de plomo al disminuir la excreción renal.
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46
En el niño los niveles altos de plomo en sangre se asocian a niveles bajos de 25-
hidroxivitamina D (sintetizada en el hígado) y 1-25-hidraxivitamina D
(sintetizada en el riñón). Los animales que tienen en su dieta bajas
concentraciones de Zn acumulan mayor cantidad de plomo en los huesos. (126)
4.7.4. Cuadro clínico
Intoxicación aguda
Esta forma de intoxicación puede aparecer tras la ingestión de una sal soluble
(acetato de plomo) o de una cantidad importante de un alimento contaminado, o
como consecuencia de la «pica» en niños. Produce tres tipos de síndromes:
a) Síndrome digestivo. Dolores epigástricos y abdominales violentos, estreñimiento
o diarrea, al comienzo, y luego estreñimiento.
b) Síndrome hepatorenal. hepatomegalia y subictericia. Más importantes son las
lesiones renales con oliguria, uremia, albuminuria, aminoaciduria y cilindruria.
(22,28,71,80,119)
c) Encefalopatía. En los adultos suele ser tardía y los síntomas predominantes son
los correspondientes a un edema cerebral: cefaleas intensas, obnubilación.
convulsiones y evolución al coma.
Intoxicación crónica
Se distinguen tres fases en la intoxicación crónica por el plomo. (126)
a) Fase de presaturnismo o de impregnación
Este estadio clínico se alcanza cuando se presenta una plumbemia de 60-70
ug/100ml. Subjetivamente se presenta cansancio, dispepsia, dolores abdominales
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47
y musculares, artralgias, insomnio y alteraciones del carácter, pérdida de fuerza y
adelgazamiento. El diagnóstico en este momento es difícil, y el paciente puede
ser etiquetado de enfermo reumático.
b) Fase de intoxicación franca
Se acrecientan los síntomas ya señalados en la fase de pre-saturnismo: anorexia,
adelgazamiento, dolores musculares y cansancio.
c) Fase de impregnación antigua
Esta fase, señalada por LAUWERYS, (63)
sería la consecuencia de una
exposición prolongada al plomo. Trabajadores que han estado expuestos durante
muchos años a cifras de 60 ug %, que podrían ser bien toleradas clínicamente,
pueden presentar cuadros de hipertensión permanente y nefritis.
4.7.5. Diagnóstico
Es necesario considerar el plomo ante: cuadros de abdomen agudo repetidos que
asemejan una pancreatitis, cuadros de polineuritis de miembros superiores,
cuadros reumáticos, anemias y encefalitis en los niños. (53)
Investigación toxicológica
Recuento de hematíes con granulocitos basófilos.
Dosificación de plomo en sangre.
Dosificación del plomo urinario.
4.7.6. Tratamiento
En general, el tratamiento dependerá del tipo de exposición (aguda, crónica), de
la magnitud del compromiso del paciente y del nivel del plumbemia.
Tanto en la intoxicación aguda como en la crónica el tratamiento de basa en las
siguientes medidas principales: (53)
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48
Medidas de soporte vital.
Alejar al paciente de la fuente de exposición.
Tratamiento de los cuadros clínicos acompañantes (cólicos saturnino,
encefalopatía, insuficiencia renal, etc.).
Tratamiento quelante.
Intoxicación aguda
a) Medidas de soporte vital
b) Medidas de descontaminación:
Exposición oral: medidas de descontaminación digestiva (vaciado gástrico,
carbón activado, etc.)
Exposición respiratoria: alejar al paciente de la fuente de exposición,
administración de oxigeno si es necesario.
Exposición cutánea: lavado con abundante agua y jabón.
c) Tratamiento quelante: se inicia en los casos de intoxicación aguda o en las
agudizaciones de las intoxicaciones crónicas, en las que el paciente presenta
signos de intoxicación o con plumbemias superiores a 60 µg/dl.
d) Tratamiento sintomático:
En el cólico saturnino: antiespasmódicos.
En la encefalopatía saturnina: tratamiento de HTA, tratamiento de las
convulsiones (barbitúricos).
Combatir el shock. (53)
Intoxicación crónica
Tratamiento quelante con
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49
a) Edetato disodico cálcico (EDTA): es el quelante de elección en pacientes
sintomáticos y con plumbemias superiores a 60 µg/dl.
Dosis: 30 – 50 mg/kg/día diluido en dextrosa al 5 %, infundir por goteo EV en 6
a 8 horas, por 5 días consecutivos. Por lo tanto el tratamiento requiere la
hospitalización del paciente.
b) Dimercaprol o 2,3 dimercaptopropanol (BAL): se asocia al EDTA en casos de
encefalopatía o plumbemia mayor a 100 ug/dl en adultos, o mayor de 60 ug/dl en
niños.
Dosis (adulto y niños): 3 a 5 mg/kg/dosis vía IM, 4 horas antes de iniciar la
infusión de EDTA.; el primer y el segundo día cada 12 horas.
c) D-Penicilamina: está indicada en intoxicaciones crónicas con plumbemias por
debajo de 50 ug/dl, sin embargo, no es un antídoto de primera línea para casos
graves, pues su capacidad quelante es inferior al de otros antídotos.
d) Acido 2,3-dimercaptosuccinico o succimero (DMSA): es un derivado del
dimercaprol, de uso oral, quelante del plomo, arsénico y mercurio. Está indicada
en niños con plumbemia entre 45 y 70 ug/dl, en ausencia de manifestaciones
sugestivas de encefalopatía. (53)
4.8. La problemática del plomo en el Perú
En el Perú, la calidad ambiental es un factor que afecta de manera considerable el
estado general de salud
Como se sabe los niveles máximos permisibles para el plomo en aire el Perú es
de 1,5 μg/m3 según los Estándares Nacionales de Calidad de Aire, D.S. N.° 074-
2001-PCM. (50)
EL Perú es un país eminentemente minero, es el cuarto productor de plomo en el
mundo, por lo que está expuesto a la contaminación ambiental producida por la
Page 56
50
explotación minera formal e informal, así como a los relaves productos de esta
actividad. (51)
se han realizados diferentes estudios en zonas mineras como La
Oroya (91,96)
o en lugares donde es depositado el plomo antes de su exportación
como el Callao (31, 115,116)
donde se ha encontrado altos niveles de plomo en
sangre en la población que vive en estas zonas.
Las poblaciones aledañas a relaves mineros, también presentan altos niveles de
contaminación por plomo; situación similar a lo observado en otros lugares del
mundo en zonas de relaves o con minas abandonadas, (50)
por lo que no es
recomendable que en estas zonas habiten poblaciones por los riegos para la salud
que ello implican y que las mineras realicen estrategias para evitar las
consecuencias ambientales de los productos en su actividad. (50)
5. ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA – VISIBLE
5.1. Instrumentación
La espectroscopia ultravioleta-visible es una extensión de la colorimetría ya que
permite determinar la absorción de luz en una muestra, en el intervalo de
longitudes de onda comprendido entre 190 y 700 nm. (21)
Esquema N°15: Instrumentación del UV-VIS.(21)
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51
Fuente de luz
Debe tener alta intensidad, baja área superficial, extenso rango espectral, y
salida estable en el tiempo. (21)
Monocromador
Es un detector de longitudes de onda que seleccione una cierta porción de
radiación continua es decir tras pasar por varios espejos (seleccionan la luz
visible o ultravioleta) y lentes (concentran la luz) el haz de luz policromada
(compuesto por muchas longitudes de ondas) es en primer lugar colimado
(transformado en luz monocromada de una sola longitud de onda) por el
monocromador. (21)
Debe cumplir:
Absorción mínima de luz
Alta precisión al seleccionar la longitud de onda
Alta pureza espectral en un rango amplio de longitudes de onda
Puede tratarse de un prisma, una red de difracción o ambos a la vez.
Cubetas o cámara de muestra
Estas son de volumen variable, normalmente 3 – 5 ml. Puede ser de material de
vidrio, plástico o cuarzo (UV). (21)
Detector
Es aquel que convierte la energía luminosa en una corriente eléctrica.(21)
5.2. Absorción de luz: ley de Beer – Lamber
La relación entre la absorción de luz por una solución diluida o por un gas y la
concentración de la fase absorbente viene dada por la ley de Beer. La relación
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52
entre la absorción de la luz y el camino recorrido por esta (o sea, el espesor de la
cubeta) viene dada por la ley de Lambert. Es conveniente considerar ambas
leyes conjuntamente.
La ley de Lambert – Beer permite determinar la concentración de una sustancia
a partir de la absorbancia. (21, 98)
5.3. Desviación de la ley de Beer
Los factores más comunes que originan estas desviaciones son cinco
Empleo de luz no monocromática
La luz verdaderamente monocromática solo puede obtenerse en un alto grado
con fuentes de emisión muy especializadas. Todos los monocromadores
cualquiera que sea su calidad y tamaño tienen un poder de resolución finito y,
por consiguiente un paso de banda instrumental mínimo. Sin embargo, si la
absorbancia es esencialmente constante en la amplitud del paso de la banda
instrumental, la ley de Beer concuerda con límites bastante precisos. De esta
forma si la constante de absorbancia no es constante en el intervalo de
longitudes de onda usado, la ley de Beer produce errores. (21)
Asociación o disociación de las especies absorbentes de luz
Ocurre a veces que la concentración de las moléculas que realmente absorben
luz no es igual a la concentración total de la sustancia que se desea determinar.
En tales casos puede suceder que la concentración de la sustancia absorbente no
aumente o disminuya proporcionalmente a la concentración total. (21)
Adición insuficiente del reactivo cromógeno
Muchas determinaciones analíticas se realizan adicionando un reactivo que
forma un producto coloreado con el elemento a determinar. El reactivo debe ser
agregado suficientemente.
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53
Fluorescencia y turbidez
Una ligera turbidez en la muestra a analizar puede pasar desapercibida y sin
embrago origina un aumento considerable de la absorción de luz, especialmente
a pequeñas longitudes de onda.
6. VOLTAMPEROMETRIA Y POLAROGRAFIA
6.1. Introducción
La voltamperometría y polarografía comprende un grupo de técnicas
electroquímicas que se basan en la respuesta corriente-potencial de un electrodo
durante un proceso electroquímico. Un diagrama de la corriente en función del
potencial aplicado se llama un voltamograma y es el equivalente electroquímico
de un espectro en espectroscopia, proporcionando la información cuantitativa y
cualitativa sobre la especie implicada en la reacción de oxidación o de reducción.
El fundador de estos métodos, Jaroslav Heyrosky (1890-1967 premio Nobel en
Química en 1959) introdujo el electrodo de gota de mercurio como electrodo de
trabajo. El electrodo consiste en un capilar de vidrio de paredes gruesas del cual
las gotas de mercurio caen en la solución de la muestra bajo la presión de una
columna de mercurio, además introdujo el término de polarografía. El termino
voltamperometría resulta de volt-am (perios)-metry y no debe ser confundido
con voltametría (con una sola m) el cual es descrito como una valoración
potenciométrica con corriente controlada.
Los términos polarografía y voltamperometría son frecuentemente usados
inadecuadamente. De acuerdo a la IUPAC, el término polarografía debe ser
usado cuando la curva de la corriente en función del potencial es graficada
empleando un electrodo de trabajo con un líquido, del cual la superficie puede
ser renovada periódica o continuamente (ej. Gotas). Esto incluye el clásico
electrodo de goteo de mercurio (DME) y el subsecuente electrodo de gota de
mercurio estática (SMDE). La voltamperometría incluye todos los métodos en el
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54
cual la medición de potencial de la corriente esta hechos en un electrodo fijo y
estacionario.
Esto incluye el electrodo de gota colgante de mercurio (HMDE), el electrodo de
capa fina de mercurio (TMFE), electrodo de glassy carbón (GCE) y electrodos de
pasta de carbón (CPE). Los electrodos de trabajo hechos de metales nobles (oro,
platino) son usados menos frecuentemente. Varios métodos son atribuidos a los
términos de polarografía y voltamperometría; estos difieren en la técnica de
medición y el tipo de potencial eléctrico de excitación usado en el proceso de la
determinación (39, 42, 89).
6.2. Instrumentación
Consiste en: (5)
Fuente de voltaje
Porta electrodos (con electrodos)
Celda electroquímica
Unidad de registro de corriente
Aunque los primeros métodos Voltamétricos hacían uso de solo dos electrodos,
la voltamperometría moderna hace uso de tres electrodos sumergidos en una
solución que contiene analito y un exceso de un electrolito de soporte (42)
.
El electrodo de trabajo (WE), el más importante del sistema electroquímico, su
potencial varía de manera lineal con el tiempo. Existen dos tipos el MME
(electrodo multimodo) que incluye todos los tipos de electrodos de mercurio
(DME, SMDE, HMDE) y el RDE para aplicaciones especiales.
El electrodo de referencia (RE): que ofrece un potencial estable. Los
potenciales en el WE se aplican con respecto al potencial de referencia
constante. Hoy en día se utiliza principalmente sistemas de Ag/AgCl.
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55
El tercer electrodo es el electrodo auxiliar (AE): la corriente fluye entre el
trabajo y electrodo auxiliar. Existen dos tipos disponibles: platino (Pt) y carbón
vítreo (GC) (5, 42)
.
En voltametría se han empleado mucho los electrodos de mercurio, por varias
razones: una de ellas es por el potencial negativo relativamente grande que se
puede lograr con el mercurio, debido al alto sobrevoltaje del hidrogeno sobre el
mercurio. Éste sobrevoltaje permite la determinación de metales que se reducen
con potenciales negativos, hasta amalgamas en la superficie de un electrodo de
mercurio. Además, se forma rápidamente una superficie metálica fresca con una
nueva gota de mercurio (42)
.
6.3. Principio de la voltametría
La voltamperometría se basa en el Esquema N°16- en donde la aplicación de
una rampa de voltaje (a), al alcanzarse el potencial de reducción del metal este se
reduce se disuelve en el mercurio del electrodo (b), esta reacción produce una
corriente, que es medida(c).
La corriente fluye cuando la sustancia es oxidada o reducida en el electrodo. Sin
reacción electroquímica no existe corriente (5)
.
Esquema N°16: Principio de la voltamperometría(50)
Page 62
56
6.4. Métodos voltamétricos
Voltametría de Barrido Lineal (VBL)
El potencial aplicado (un barrido linear) varía rápidamente (20-200mV/seg) y
toda la corriente es monitorizada directamente. La sensibilidad no es
extremadamente alta y algunas distorsiones en el resultado de las ondas pueden
ser dificultades para el análisis cuantitativo. (5)
Voltametría Directa Simple (DC)
La voltametría DC es la clásica, es la medición voltamétrica más simple con una
limitada sensibilidad. Es principalmente utilizado para la investigación de
sistemas reversibles redox. (5)
Voltametría de Onda Cuadrada (SqW)
La voltametría de onda cuadrada es principalmente adecuada para procesos
reversibles. Es usada particularmente para voltametría de stripping sensitiva en el
modo HMDE o RDE. (5)
Voltametría Cíclica (CV)
La voltametría cíclica es principalmente usada para investigar la reversibilidad
del proceso del electrodo y para estudios cinéticos (5)
.
Voltametría de Pulso Diferencial (PD)
La voltametría de pulso diferencial, es una de las técnicas electroanalíticas que
alcanzó una gran popularidad a partir de 1970. Es el modo de medición universal
y más frecuentemente usado, es apropiado para sistemas reversibles e
irreversibles y ofrece una alta sensibilidad. Para la voltametría PD, la corriente i
es medida en función del voltaje U inmediatamente antes del pulso t (i1) y al
final del pulso t (i2), Esquema N°17.
De las diferencias entre las dos mediciones de corriente, los picos de la curva
obtenidos son evaluados usando base lineal, polinomial o exponencial (42)
.
Page 63
57
Esquema de Voltametría Pulso Diferencial.(50)
Esquema N°17: Esquema de Voltametría Pulso Diferencial.(50)
Voltamperometría de redisolución
Una de las más importantes técnicas de voltamperometría cuantitativa es la
voltamperometría de redisolución ya que proporciona los límites de detección
más bajos para los metales (10-9
-10-12
). Es decir, detecta iones metálicos con una
exactitud razonable, en pocos minutos y en un margen de concentración como el
antes expresado. Los métodos de redisolución están basados en el siguiente
Tiempo de
Voltaje de Paso
Tiempo de Pulso
Amplitud
de Pulso
Voltaje
de Paso
t
E
t (i1) t (i2) t (i1) t (i2)
Altura
de Pico I=i2-i1
E
i
Voltaje de pico
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58
concepto: la sustancia a determinar se pre-concentra en el electrodo y
posteriormente es devuelta a la disolución por un proceso inverso (39, 5, 42)
.
Gracias a la voltamperometría de redisolución se ha conseguido:
Pre-concentrar sustancias que antes no era posible al ser consideradas no
electroactivas.
Desarrollar métodos impulsionales, de onda cuadrada, voltamperometría de
corriente alterna, las cuales permiten aumentar la sensibilidad de las
determinaciones, pudiéndose llegar en algunos casos a determinar
concentraciones de orden µg/L e incluso pg/mL.
Se compone de tres técnicas relacionadas: anódica, catódica y voltamperometría
de adsorción. Ya que la voltamperometría de redisolución anódica ha encontrado
la aplicación más amplia, la hemos considerado con mayor detalle (39, 5, 42)
.
a) Etapa de pre-concentración:
Objetivo: traspasar el analito de la disolución asia la gota de mercurio (electrodo
de trabajo).
Pb2+
+ Hg0 → Pb
0 (Hg)
Pre-concentración mediante electrolisis
Distintos aspectos influyen en esta primera etapa:
La sustancia, el analito, puede llegar al electrodo de tres maneras distintas: por
migración (debido a atracciones electrostáticas), por difusión (debido al gradiente
de concentración) y por convección (fuerzas mecánicas de agitación). La
temperatura, debe estar controlada, ya que, el coeficiente de difusión depende de
ella. El tiempo, a medida que aumentamos el tiempo, la cantidad de analito
depositado en el electrodo aumenta. Por otro lado la intensidad de corriente
disminuye con el tiempo. Para que el proceso mantenga su intensidad
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59
prácticamente constante tendremos que utilizar volúmenes grandes de disolución,
superficies pequeñas de electrodo y tiempos de electrodeposición cortos (39, 5, 32)
.
b) Etapa de reposo:
En el proceso de reposo se detiene la agitación y se mantiene el potencial
aplicado. Necesitamos que el analito y el electrodo se homogenicen.
c) Etapa de medida:
Objetivo: Obtener desde el punto de vista analítico información acerca del
depósito que tenemos.
Existen distintas técnicas y la más común es:
Barrido lineal de potencial con respecto al tiempo: Consiste en aplicar al
electrodo un potencial cuya variación es una función lineal en el tiempo. En
redisolución anódica el barrido lineal consistiría en que el potencial de electrodo
se hace variar linealmente hacia potenciales más positivos, registrando la
intensidad de la corriente.
En redisolución anódica, a medida que aumenta el potencial se produce un
aumento de la intensidad, ya que, aumenta la velocidad de reacción.
En redisolución catódica ocurre lo contrario el potencial varia hacia valores más
negativos. A partir de un determinado valor de potencial, la intensidad disminuye
al igual que la concentración de sustancia electroactiva (39, 5, 42)
.
6.5. Preparación de muestras para análisis de metales
Los metales en muestras son determinados por una gran variedad de métodos
analíticos. Sin embrago, estos metales presentes en las muestras pueden
encontrarse en pequeñas cantidades hecho que hace necesario un pre tratamiento
de la muestra. La preparación del material para la determinación del metal tiene
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60
varios propósitos, los cuales varían de acuerdo al tipo de muestra y la demanda
particular del análisis.
Algunas funciones de la preparación de la muestra son:
Degradar y solubilizar la matriz para la liberación de los metales para su
determinación.
Extraer los metales de la matriz en un solvente más apropiado para el método
analítico a usar.
Concentrar los metales presentes en las muestras.
Separar un analito de un grupo de analitos de otras especies que puedan estar
interfiriendo en el análisis (106)
.
Los métodos de digestión deben ser seleccionados de acuerdo al tipo de muestra,
el metal a ser determinado y finalmente al método analítico, los más comunes
son: digestión húmeda en soluciones ácidas, digestión seca y extracción del
analito de la muestra sin destrucciones total de la matriz. La calcinación seca es
útil para muchas muestras como alimentos o muestras botánicas, debido a la
rápida y fácil destrucción de grandes cantidades de materia orgánica húmeda; sin
embargo si el analito (metal) está presente en forma volátil por ejemplo el
metilmercurio la calcinación en seco puede causar la pérdida del analito. Muchas
matrices de muestras tanto orgánicas como inorgánicas pueden ser disueltas.
Muchas matrices de muestras tanto orgánicas como inorgánicas pueden ser
disueltas por calentamiento en una solución oxidante acida. Otras muestras
pueden ser tratadas por extracción de los metales de la matriz. Este método es
frecuentemente usado para muestras de aguas, donde un agente quelante puede
ser usado para acomplejar el metal de interés, establecido su fácil separación de
la matriz acuosa (106)
.
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61
6.6. Métodos de digestión
Para muestras que contienen mucha materia orgánica, las cuales son analizadas
para metales no volátiles, la calcinación seca es un método relativamente simple
para la remoción de materia orgánica, que puede ser usado para muestras
relativamente grandes y que requieren de cortos tiempos de análisis.
En el método de envase cerrado, la muestra es colocada en un crisol y es
calcinada en una mufla. El crisol usado para la calcinación usualmente es de
sílica, porcelana, platino o vidrio pírex. El mayor inconveniente de este método
es la posible pérdida de algunos elementos por volatilización, contaminación de
la muestra por polvo en el aire, ya que debe permanecer abierto a la atmosfera, y
la adsorción irreversible de analito en las paredes del recipiente (106)
.
El grado de perdida por volatilización depende de la temperatura aplicada, la
forma en la cual el analito está presente en la muestra, y el entorno químico en la
calcinación. Existen agentes químicos que pueden ayudar a prevenir la
volatilización del analito y que además aceleran el proceso de calcinación, los
más comunes son el nitrato, magnesio y el óxido de magnesio de alta pureza. Las
temperaturas típicas de calcinación se encuentran entre 450 y 550 ºC a presión
atmosférica, y los residuos son disueltos en un ácido apropiado (74)
.
La calcinación seca es utilizada para elementos nutricionales que están presentes
en alimentos; como Fe, K, Ca Mg y Mn los cuales está en cantidades sustanciales
y son estables a temperaturas altas(74)
.
Entre los tipos de calcinación en seco se encuentran: Extracción orgánica de
metales, Extracción con fluidos supercríticos, preparación de muestras por
ultrasonido.
Métodos de digestión húmeda
Los métodos comunes usados para disolver muestras para análisis de metales son
la digestión en envase cerrado, digestión en envase sellado y presurizado, y
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62
descomposición asistida con microondas. Los solventes más comunes usados se
encuentran en el Tabla N°4.
Tabla N°4: Reactivos comúnmente usados en la digestión/disolución de
muestras.
Reactivo Tipo de muestra
Agua Sales solubles
Ácidos diluidos Residuos de cenizas secas, metales
y aleaciones fácilmente oxidables,
sales.
Ácidos concentrados (ejem:.HNO3) Metales y aleaciones menos
fácilmente oxidables, acero, óxidos
de metales.
Ácidos concentrados con adición de
agentes oxidantes.
Metales, aleaciones, suelos,
partículas del aire, minerales
refractarios, materia vegetal.
Ácido hidrofluorico Silicatos u otras muestras de rocas.
Fuente: “Sample preparation techniques in analytical chemistry” John Wiley &
Sons, Inc., publication, vol. Nº 162, Pag.230.
Las muestras a ser analizadas para la determinación de metales son preparadas
por digestión de la matriz en ácidos fuertes.
En el caso de matrices orgánicas, se usa una mezcla de oxidantes para destruir la
matriz orgánica entera y solubilizar la muestra. Comúnmente es usado el ácido
nítrico, debido a que no hay posibilidad de formar sales insolubles como puede
suceder con el HCl o H2SO4. El peróxido de hidrogeno puede ser añadido para
incrementar el poder oxidante de la solución digestora. Sin embargo el método
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63
no es generalmente recomendado para metales, los cuales tienden a ser perdidos
por volatilización (106)
.
a) Digestión ácida
El método más simple para la digestión es llevada en un contenedor abierto. Las
muestras son secadas, pesadas, y colocadas en una vaso de precipitado, el agente
digestor es añadido, el beaker es cubierto con una luna de reloj y colocada en una
base caliente, se calienta suavemente para prevenir las salpicaduras. El peróxido
de hidrogeno puede ser añadido durante la digestión para ayudar en la oxidación
de la materia orgánica: cuando la muestra ha sido digerida completamente, esta
se evapora a sequedad y luego es diluida con un ácido para su análisis (106)
.
b) Digestión asistida por microondas
Este es un método usado especialmente para muestras pequeñas. Se debe tener
extra cuidado en el uso de vasos cerrados a presión. La aplicabilidad de esta
técnica es estrictamente dependiente del tipo de la muestra, los carbohidratos son
fácilmente mineralizados con ácido nítrico a 180º C, mientras que las grasas,
proteínas y aminoácidos presentan digestiones incompletas debido al relativo
bajo potencial de oxidación del ácido nítrico a 200 ºC, estos materiales requieren
la adición de ácido sulfúrico o perclórico con todos los problemas relacionados a
sus altas temperaturas y presiones. (74)
La digestión de una muestra en un recipiente cerrado en un horno de microondas
tiene varias ventajas sobre los métodos de envase abierto. Los contenedores están
fabricados con polímeros resistentes a altas temperaturas a menudo
policarbonatos o PTFE (politetrafluoroetilo, teflón), y que hace menos probable
que contengan contaminantes metálicos que los de vidrio, de cerámica o que los
crisoles. El envase sellado elimina la posibilidad de contaminación por polvo en
el aire, reducen la evaporación a presión, por lo que es necesario menos solución
acida de digestión. El envase sellado también elimina las pérdidas de las
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64
especies metálicas volátiles, que puede ser un problema en la descomposición de
la muestra en un contenedor abierto, especialmente en calcinación seca. Una de
las limitaciones es el tiempo requerido para el enfriamiento antes de que el
envase pueda ser abierto, lo cual puede tomar horas dependiendo del tipo de
equipamiento usado. Existen dos diferentes sistemas disponibles para digestión
asistida por microondas; sistema de vaso cerrado a presión y sistema abierto fijo,
que funcionan bajo presión atmosférica (74)
.
El sistema de digestión asistida por microondas se compone de un horno
microondas un carrusel giratorio con una o varias bombas de digestión de la
muestra, y un sistema de ventilación de estos de manera controlada (106)
.
c) Digestión UV
El proceso de oxidación fotoquímica UV representa una mejora prometedora
para la descomposición de materia orgánica y, en cierta medida, también la
materia inorgánica (ejem. polifosfatos) antes del análisis (8)
. Se utiliza para la
preparación de muestras para espectroscopia, polarografía, voltamperometría y
cromatografía de iones para eliminar la matriz orgánica (26)
. El instrumento ha
sido diseñado para la digestión de muestras liquidas que contengan de bajas a
moderadas concentraciones de material orgánico. La ventaja de la fotolisis UV es
que solo una cantidad pequeña de peróxido de hidrogeno es necesaria y
consecuentemente los valores de blanco se mantienen muy bajos (26)
.
La radiación UV disuelve los componentes de la matriz por la formación de
especies oxidantes altamente reactivas (H2O2, radicales hidroxilos, radicales
halógenos), los cuales aceleran la descomposición de las sustancias interferentes;
el peróxido de hidrogeno es usado como iniciador de la reacción y la energía
radiante de la lámpara de mercurio es convertida en calor, la cual acelera la
digestión (26, 35)
.
El sistema consta de una unidad de control con temporizador integrado y una
parte separada con lámpara UV, equipo de refrigeración y racks de 12 tubos de
digestión de la muestra con volumen de muestra de máx. 12 ml cada uno (26)
.
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65
CAPITULO II
MATERIALES Y METODOS
1. MUESTRA
1.1. Muestra de estudio
Integrada por 24 ratas albinas Wistar del Bioterio de la Universidad Católica de
Santa María, las cuales fueron intencionalmente intoxicadas con 100 ppm de
acetato de plomo vía oral (toxicidad aguda) para posteriormente ser tratadas con
solución acuosa de ajo liofilizado (1000 µg/kg/día de alicina).
1.2. Características de las muestras en estudio
Se eligieron ratas albinas Wistar con las siguientes características:
Especie : “Rattus norvegicus”.
Edad : 7 - 9 meses.
Sexo : Machos.
Peso : 275 ± 8 gramos.
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1.3. Muestra biológica
Allium sativum L. (ajo liofilizado)
Cantidad : 500 gramos.
Forma : Polvo.
Procedencia : Empresa ONMIAGRO S.A.
Lugar de obtención : Laboratorio de investigación Proyecto Mercurio
de la UCSM.
La muestra fue conservada en un frasco de vidrio ámbar, herméticamente cerrado
para protegerlo del aire atmosférico y teniendo la precaución de guardarlo en un
ambiente ausente de humedad y luz.
2. LUGAR DE EXPERIMENTACIÓN
Para el desarrollo del presente trabajo de investigación, se albergó a los animales
de experimentación en el Bioterio de la Universidad Católica de Santa María,
lugar donde se administró el tratamiento y posteriormente se extrajeron las
muestras biológicas; al mismo tiempo se utilizaron los ambientes del laboratorio
de investigación “LPM” ubicado en el pabellón H – 202, donde se realizaron los
análisis correspondientes.
3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS
3.1. Material de vidrio
Embudo de vidrio.
Espátula.
Fiolas de 100, 10 y 5 ml.
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67
Micropipetas de 100, 25 y 10 µl.
Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml.
Placas petri.
Probetas 100 y 10 ml.
Termómetro.
Tubos de cuarzo.
Tubos de ensayo.
Beakers de 1000 y 50 ml.
3.2. Otros materiales
Agua de mesa.
Algodón.
Barbijos.
Bolsa de polietileno.
Capilares heparinizados.
Eppendorf.
Espátula.
Equipo de disección.
Guantes quirúrgicos.
Jaulas de 60 x 40 x 30 cm.
Trípode y malla de asbesto.
Selladora de plásticos.
3.3. Reactivos
Ácido Nítrico 65 % Suprapur. Merck.
Ácido Acético Glacial. P.A. Merck.
Ácido tricloroácetico al 40 %.Merck.
2,4-Dinitrofenilhidrazina (DNPH) 0.0125 %.
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Agua calidad ultrapura (18.2 MΩ).
Cloruro de potasio P.A.
Estándar de Cadmio (1000 ppm) Merck.
Estándar de Plomo (1000 ppm) Merck.
Hidróxido de sodio 0.6 N P.A. Merck.
Nitrógeno UHP (99.9999%).
Peróxido de hidrogeno 30 % P.A. Merck.
Piruvato de sodio 0.1 µM.
3.4. Equipos
Balanza analítica Ohaus Pioneer Tm.
Bomba de digestión Microondas Parr.
Equipo Barnstead Easy Pure II (agua 18.2 MΩ ).
Equipo de Ultrasonido Brandson 2510-E.
Espectrofotómetro UV-VIS (Model 160ª Shimadzu Serial 28K00690).
Estación Voltamétrica (757 VA Computrace). Metrohm.
Horno microondas Electrolux EMZ172M1PW.
Mechero de Bunsen.
Microcentrífuga.
Refrigeradora.
Sistema de digestión UV - 705 UV Digester Metrohm.
Vaso de tapa PTFE y O-ring Parr.
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69
4. METODOS
4.1. METODOS ANALITICOS
4.1.1. Valoración del principio activo “alicina del ajo”
Método de Schwimmer modificado, para determinar 2-propentiosulfato de
alilo (alicina)
Fundamento
La aliina presente en el ajo es degradada a ácido sulfénico, piruvato y amonio por
la acción de la enzima aliinasa cuando el ajo es dañado (Esquema N°18). La
condensación de dos moles de ácido sulfénico da como resultado 2-
propentiosulfinato de alilo: alicina.
Este método valora la alicina indirectamente a través de la determinación de
piruvato que es proporcional a la concentración de alicina, ya que por dos
moléculas de piruvato se forma una molécula de alicina.
CH2
S+
COOH
O-
NH2
2+ OH2
ALINASA
CH2S
S+
CH2
O-
+ 2CH3
COOH
O
ALIINA
ALICINAPIRUVATO
+ 2 NH4
+
Esquema N°18: Reacción de formación de alicina mediada por la enzima
alinasa.(21)
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70
El piruvato se dosa mediante el uso de una sustancia cromógena como la 2,4-
dinitrofenilhidrazina (2,4 DNPH) (Esquema N°19) formando la fenilhidrazona
del ácido pirúvico de color amarillo-pardoso proporcional a su concentración, por
lo que es posible su medición en el espectrofotómetro.
CH3COOH
O
+
NO2
NO2
NH N C
COOH
CH3NH NH2
NO2
NO2
Esquema N°19: Reacción del piruvato con la 2,4 DNPH.(21)
Preparación de la curva de calibración
Procedimiento:
Se procedió a transferir con una micropipeta 200, 400, 600, 800 y 1000 µl de la
solución patrón de piruvato de sodio 0.8µM a sendos tubos de ensayo, se añadió
a cada tubo 1 ml de la solución de DNPH al 0.0125 %. Se dejó en reposo durante
10 minutos a 38°C y se continuó como se describe bajo el título de “Desarrollo
de color”. Para obtener la curva de calibración se procedió a leer en el
espectrofotómetro.
Muestra problema
Procedimiento:
Se pesó y colocó 0.050 g de ajo liofilizado en una fiola de 10 ml, se añadió 5 ml
de agua ultrapura y dejó en reposo por 15 minutos a 30 °C.
Se enfrió y añadió 500 µl de ácido tricloroácetico al 40 %, posteriormente se
enrazó y dejó en reposo durante 20 minutos; finalmente se tomó 1.5 ml de la
solución para centrifugarla por 10 minutos a 5000 rpm. Con una micropipeta se
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71
extrajo 500 µl del sobrenadante claro para depositarlo en un tubo de ensayo y
rotularlo como “Problema”.
Muestra control
Procedimiento:
Se pesó y colocó 0.050 g de ajo liofilizado en un beaker de 80 ml el cual fue
colocado a baño maría e inmediatamente se añadió 5 ml de agua ultrapura a
ebullición y se dejó hervir por 5 minutos. Se enfrió y transfirió cuantitativamente
el contenido a una fiola de 10 ml al cual se le añadió 500 µl de ácido
tricloroacético al 40 % y enrazó con agua ultrapura. Se tomó 1.5 ml de la
solución y se centrifugó a 5000 rpm por 10 minutos. Con una micropipeta se
transfirió 500 µl del sobrenadante claro a un tubo de ensayo y se rotuló como
“Control”.
Desarrollo del color
Procedimiento:
Se procedió a pipetear alícuotas de 0.5 ml de las soluciones Problema y Control
a sendos tubos de ensayo, se añadió 3.5 ml de agua ultrapura, 1 ml de la solución
de DNPH al 0.0125 % y se mantuvo a 38 °C en baño maría durante 10 minutos,
posteriormente se enfrió. Se añadió 5 ml de la solución de hidróxido de sodio 0.6
N a uno de los tubos de ensayo y 2 minutos después se hizo la misma operación
con el segundo tubo. Se dejó ambos en reposo durante no menos de 8 minutos ni
más de 10 minutos y se midió de inmediato la absorbancia a 445 nm.
4.1.2. Validación del equipo (voltámetro – manual metrohm)
La validación del equipo se efectúo en 2 partes expresas, una validación
electrónica y una validación química (10)
.
Para la validación electrónica se procedió de la siguiente manera:
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72
a) Test de la linealidad
Se unió los cables del electrodo del VA Computrace en los conectores de la
celda estándar incluida en la estación Voltamétrica.
Cable del electrodo auxiliar AE al Conector AE.
Cable del electrodo de referencia RE al Conector RE.
Cable del electrodo de trabajo WE al Conector WE-L.
Se cargó el método, Test 757_L del directorio de métodos y se inició el
método.
Se registró una línea diagonal.
b) Test de desempeño del pico
Se unió los cables del electrodo del VA Computrace en los conectores de la
celda estándar incluida en la estación Voltamétrica.
Cable del electrodo auxiliar AE al Conector AE.
Cable del electrodo de referencia RE al Conector RE.
Cable del electrodo de trabajo WE al Conector WE-D.
Se cargó el método, Test 757_L del directorio de métodos y se inició el
método.
Se registró una curva y se analizó.
Para la validación química se procedió de la siguiente manera:
Se añadió 20 mL de agua ultrapura en la celda electroquímica.
Se añadió 0.5 mL del electrolito KCl (3M) en la celda electroquímica.
Se añadió 100 µL de la solución estándar de ion Pb (1000 ppm) en la
celda de medición.
Parámetros de medición:
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73
o Se cargó el método “Test Pb in ion standard solution. mth” desde el
directorio métodos.
o Se inició el método.
o La solución es desgasificada y el polarograma es registrado tres
veces.
o Se añadió 100 µL de la solución estándar de Pb (1 g/L) en la celda
de medición y se presionó “OK”.
o El polarograma de la primera adición estándar es registrado tres
veces.
o Se añadió 100 µL de la solución estándar de Pb (1 g/L) en la celda
de medición y se presionó “OK”.
o El polarograma de la segunda adición estándar es registrado tres
veces.
o El reporte final y los voltamogramas fueron impresos y analizados.
4.1.3. Validación del método para muestras biológicas
Para el análisis de las muestras biológicas se hizo uso de métodos bibliográficos
validados por el laboratorio. Con la finalidad de obtener mejores resultados se
optó por validar algunos parámetros importantes como son: Linealidad,
Precisión, Límite de detección y cuantificación.
Linealidad
Establecida como la capacidad del método para proporcionar resultados que son
directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro
de un rango establecido. Es necesario determinar la linealidad debido a que el
método de calibración que se usará es el de adición estándar.
Se procedió a colocar en la celda electroquímica 10 mL de buffer acetato 0.1 M
pH 4.6, se programó el software para adicionar 6 veces 25 µL de solución
estándar de plomo a una concentración conocida por triplicado, de modo que se
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74
cumpla con la recomendación de examinar al menos 5 niveles de
concentraciones. Se elaboró un cuadro relacionando las concentraciones y sus
respuestas. La relación entre ambas variables se expresó matemáticamente como
una recta de regresión de tipo lineal:
Si la recta no pasa cerca del origen de las coordenadas, significa que el método a
evaluar está afectado por un error sistemático por defecto o por exceso en el
intervalo estudiado. El estudio de la linealidad no solo implica una
representación gráfica sino que es necesaria una comprobación estadística. Para
realizar esta evaluación las fórmulas aplicadas fueron las siguientes:
∑
∑ ∑
∑
(∑ )
∑ ∑
Siendo a y b estimadores de la ordenada al origen y pendiente respectivamente, n
el número de mediciones, X, la concentración y Y, el valor medido en el ensayo.
∑
∑ ∑
√(∑
(∑ )
) (∑
(∑ )
)
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75
El coeficiente de la correlación (r) nos indica el grado de relación entre la
variable X y la variable Y. su valor máximo es 1. Si es cercano a la unidad
significa que existe la correlación con una probabilidad elevada. En la práctica, r
es generalmente mayor de 0,99 y los valores menores de 0,90 son raros. Sin
embargo, el mejor indicador del modelo lineal no es r sino un test estadístico, en
el cual se calcula un valor de t con n-2 grados de libertad y se compara con el
valor t tabulado para el nivel de confianza requerido. (50)
[ ]√( )
√
Si el valor observado de t es mayor que ttabla, la correlación es lineal. (50)
Precisión
La precisión expresa el grado de concordancia entre una serie de medidas de
tomas múltiples a partir de una misma muestra homogénea en las condiciones
prescritas.
El objetivo del estudio es conocer la variabilidad o el mas-menos del método de
ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo método
de ensayo. Los factores a influir sobre los resultados de un ensayo no pueden ser
siempre controlados (analista, equipo instrumental, reactivos, etc.) de aquí la
importancia del estudio de la precisión.
Repetibilidad: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de
análisis sobre la misma muestra en la mismas condiciones operativas de
análisis (por un mismo analista, mismos aparatos y reactivos, etc.) en un
mismo laboratorio en un periodo de tiempo corto.
Precisión intermedia: Estudia la variabilidad del método efectuando una
serie de análisis sobre la misma muestra pero en condiciones operativas
diferentes (diferentes analistas, aparatos, días, etc.) en un mismo laboratorio.
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76
Reproducibilidad: Estudia la variabilidad del método bajo condiciones
operativas diferentes y en distintos laboratorios.
Para evaluar estos parámetros se realizaron:
o 3 mediciones en el voltámetro en las mismas condiciones operativas en
un día cumpliendo con los requisitos para determinar la repetibilidad.
o Para evaluar la precisión intermedia se efectuó 4 mediciones en las que
se modificaron condiciones operativas como analista, reactivos y día de
análisis.
o El parámetro de reproducibilidad no fue abarcado al no contar con otro
laboratorio que tuviera un voltamperometro, por otro lado este
parámetro no resulta obligatorio ya que solo es necesario en el caso de
que se quiera transferir el método a otros laboratorios.
La precisión de un método se expresa generalmente como el coeficiente de
variación (CV) de una serie de medidas y se calcula matemáticamente de la
siguiente manera:
( ) ⁄
Dónde:
S: Desviación estándar.
X: Media aritmética.
Además se recomienda introducir los intervalos de confianza en el estudio de la
precisión. Estos intervalos deben determinarse para cada nivel de concentración
estudiada.
Los intervalos de confianza se calculan a partir de:
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77
Dónde:
x: Media de una serie de resultados obtenidos en un mismo nivel de
concentración.
t: Valor de la t de Student de tablas para n-1 grados de libertad y .
s: Desviación estándar.
La precisión estudia la variabilidad que existe entre los diferentes resultados,
pero sin tener en cuenta su proximidad al valor real. En la Tabla Nº5 se
encuentran los valores aceptables de CV.
Tabla Nº5: Valores aceptables de CV según la AOAC.
Fuente: AOAC Guidelines for Single Laboratory. (47)
Límite de cuantificación y detección LC, LD
Se entiende por límite de cuantificación a la mínima cantidad de analito presente
en la muestra que se puede cuantificar con una adecuada precisión y exactitud, y
por límite de detección a la mínima cantidad de analito en la muestra que se
puede detectar aunque no necesariamente cumple con precisión y exactitud.
Para su evaluación fue necesario:
Concentración Coeficiente de
variacion (CV)
100% 1 %
10% 1.5 %
1% 2 %
0.1% 3 %
0.01% 4 %
10 µg/g (ppm) 6 %
1 µg/g 8 %
10µg/kg (ppb) 15 %
Page 84
78
Determinar la pendiente de la curva de calibración ya examinada para el
parámetro de la linealidad que fue la que se extrapola.
La ecuación de la recta se extrapoló a concentración cero, obteniéndose
como señal ruido correspondiente al término independiente, es decir Ybl.
Se construyó otra recta tomando como eje de ordenadas las desviaciones
estándar de las respuestas y como eje de abscisas las concentraciones
estudiadas, considerándose que la desviación estándar de las respuestas Sbl
correspondierá al valor de la ordenada de origen de esta recta.
Se calculó el límite de detección y límite de cuantificación aplicando las
siguientes fórmulas:
Límite de detección (LD):
√
Límite de cuantificación (LC):
√
4.1.4. Métodos para la determinación de los niveles de plomo en sangre y órganos
a) Intoxicación y tratamiento de los animales de experimentación
Antes de iniciar cualquier tipo de tratamiento, se determinó las concentraciones
basales de plomo en sangre de todos los animales de experimentación.
La intoxicación aguda de los animales de experimentación se realizó mediante la
administración de una solución acuosa de acetato de plomo a 100 ppm vía oral.
(38,61,78,97,102,113). Para el tratamiento se administró durante seis semanas, una
solución acuosa de ajo liofilizado equivalente a 1000 µg de alicina /kg de peso
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79
vía oral. (8,40,41,76,79,85,102,104)
. La intoxicación, el tratamiento y la designación de
los grupos de estudio de las 24 ratas fueron de la siguiente manera:
GRUPOS
DE
ESTUDIO
DESIGNACIÓN TRATAMIENTO DÍAS DE
INTOXICACION /
TRATAMIENTO
Grupo 1 Control negativo Agua destilada (1 mL). Seis semanas.
Grupo 2 Control positivo Solución acuosa de acetato
de plomo (100 mg/kg).
Un día de intoxicación.
Grupo 3 Pre-post
tratamiento
Soluciones acuosas de ajo
liofilizado (1000 µg de
alicina/kg/día) y acetato de
plomo (100 mg/kg).
Una semana de
tratamiento previo al
día de la intoxicación y
cinco semanas de
tratamiento después del
día de la intoxicación.
Grupo4 Post tratamiento Solución acuosa de ajo
liofilizado (1000 µg de
alicina/kg/día).
Cinco semanas de
tratamiento.
Fuente: Elaboración propia.
Paralelo a la determinación de alicina se inició con la selección y preparación de
los animales, es así que, quince días antes de iniciar el estudio, todas las ratas a
utilizar (24) fueron sometidas a un proceso de adaptación que consistió en
estandarizar las condiciones ambientales y alimenticias.
Los animales fueron albergados en el Bioterio de la Universidad Católica de
Santa María en jaulas de 60 cm x 40 cm x 30 cm en grupos de 3 animales por
jaula y recibieron una alimentación a base de arroz y agua los cuales se dejaron
en cantidades suficientes para que el animal pueda alimentarse a voluntad.
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80
Los 24 animales fueron subdivididos al azar en 4 grupos y se determinó las
concentraciones basales de plomo en sangre, posteriormente fueron tratados
como se describe en el cuadro anterior.
A los animales que conformaron el grupo uno (Control Negativo) se les
administraron 1 mL de agua destilada durante todo el periodo de investigación;
los que conformaron el grupo dos (Control Positivo) se les administraron
solución acuosa de acetato de plomo (100 ppm) por única vez; los animales que
conformaron el grupo tres (Pre-post tratamiento) inicialmente se les
administraron solución acuosa de ajo liofilizado (1000 µg/kg/día) en volúmenes
equivalentes al peso de cada rata durante una semana, posteriormente se les
administró 100 ppm de solución acuosa de acetato de plomo (por única vez) para
luego continuar con el tratamiento de ajo hasta culminar el tratamiento (cinco
semanas); finalmente a los animales que conformaron el grupo cuatro (Post
tratamiento) se les administró 100 ppm de solución acuosa de acetato de plomo
(por única vez) y posteriormente la solución acuosa de ajo liofilizado (1000
µg/kg/día) hasta culminar el tratamiento (cinco semanas).
Los volúmenes de administración tanto para la intoxicación así como para el
tratamiento se calculó de acuerdo al peso de cada rata; teniendo en cuenta que el
volumen máximo de ingesta consideradas para las ratas es de 2 mL. (Anexo 2)
Para la preparación y administración de la solución acuosa de acetato de plomo,
se realizaron los siguientes cálculos:
Datos
Dosis de acetato de plomo: 100 ppm
Peso promedio del animal: 270 gramos
Page 87
81
Preparación de la solución de acetato de plomo = 100 mg en 5 mL de
agua destilada.
Entonces 1.35 mL se la solución acuosa de acetato de plomo será el volumen a
administrar a una rata cuyo peso promedio es de 270 gramos.
Para la administración del tratamiento con solución acuosa de ajo liofilizado se
procedió de la siguiente manera.
Datos:
Dosis de ajo (alicina): 1000 µg alicina/alicina/kg de peso.
Peso promedio del animal: 270 gramos
Preparación de la solución acuosa de ajo liofilizado
b) Preparación de reactivos
Preparación de buffer acetato 0.1 M pH 4.6
Para la determinación voltamperométrica del plomo fue requerido como
electrolito de soporte el buffer acetato (ácido acético / acetato de sodio).
Page 88
82
Los cálculos en los que fue necesario el uso de la ecuación de Henderson-
Hasselbalch son mostrados a continuación:
Cálculos:
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
[ ]
Acido acético:
Acetato de sodio:
Hidróxido de sodio:
Acido acético:
Page 89
83
Para preparar 1 L de buffer acetato, se pesó 1.96 g de NaOH, se agregó 2.94 mL
de ácido acético y se determina el pH con una estación potenciométrica
TITRANDO 808 (Metrohm).
Preparación del estándar de plomo 1 mg/L
Se utilizó la ecuación de dilución:
( )( ) ( )( )
Se pipeteo y transfirió 10 µL de una solución estándar de 1000 ppm de plomo a
una fiola de 10 mL y se enrazó con agua ultrapura.
c) Muestras sanguíneas
Extracción de la muestra
La extracción de la muestra sanguínea (0.5 mL) se realizó cada cinco días del
plexo venoso retro orbital (Anexo 1) haciendo uso de capilares con
anticoagulante, las muestras fueron recolectadas y rotuladas en envases de
polietileno con cierre seguro hermético (Eppendorf) que contenían
anticoagulante EDTA.
Preparación de la muestra
Culminada la extracción sanguínea se transportó las muestras al laboratorio para
su respectivo análisis. Para ello se tomó 100 µL de sangre de cada muestra y se
depositó en tubos de cuarzo, posteriormente se les agregó 20 µL de peróxido de
hidrogeno, 100 µL de ácido nítrico y 5 mL de agua ultrapura para continuar con
la digestión como se describe a continuación.
Page 90
84
Digestión de la muestra
Se colocó la batería de tubos en el sistema de digestión UV, el temporizador se
programó para 1 hora de digestión, tiempo en el cual, se controló la temperatura
para no sobrepasar los 90 ºC.
Concluida la digestión de las muestras el contenido de cada tubo se traspasó a
fiolas de 10 mL y enrazó con agua ultrapura para su posterior medición en el
voltamperómetro.
Figura N°1: Digestión UV.
Determinación voltamperométrica de plomo en sangre
Antes de iniciar la lectura de las muestras, se ingresó los parámetros
voltamperométricos del método: tiempo de purga 300 s; potencial de deposición:
-0.9 V; tiempo de deposición: 60 s; velocidad de barrido: 20mV/s; amplitud de
pulso: 0.05 V; tiempo de pulso 0.04 s; potencial inicial: -0.74 V; potencial final: -
0.32 V. Todas las medidas voltamperométricas fueron realizadas por voltametría
de redisolución anódica y se usó como solución estándar 1 ppm de plomo.
Una vez ingresado los parámetros, se transfirió a la celda electroquímica 2 mL de
muestra problema y 10 mL de buffer acetato para la lectura.
Page 91
85
Muestras de sangre:
Extracción de muestras de sangre.
↓
Digestión:
- 100 µL de muestra en tubo de
cuarzo.
- 100 µL de HNO3, 20 µL y 5
mL de agua ultrapura.
↓
Pasar el contenido a una fiola de 10
mL y enrazar.
↓
Lectura en la estación
voltamperométrica.
d) Muestras de órganos
Extracción de la muestra
Culminado el periodo de tratamiento se sacrificó a todos los animales de
experimentación por contusión cervical para posteriormente extraerles el bazo,
hígado y riñón. (3,22,28,71,80,119)
Preparación de la muestra
En un mortero se trituró cada órgano, se pesó y colocó 100 mg de muestra
homogénea en el vaso de digestión a presión, se agregó 1.5 mL de ácido nítrico y
se procedió con la pre digestión.
Digestión de la muestra
La digestión de los órganos se realizó en dos etapas (pre-digestión y digestión a
presión).
Page 92
86
Pre digestión; la muestra y el ácido nítrico contenidas en el vaso de digestión
fueron dejados en reposo por un periodo de tres horas. Pasada las tres horas se
procedió con la digestión propiamente dicha.
Digestión a presión; se colocó cada vaso de digestión herméticamente cerrados
en un horno microondas a presión media por 2 minutos, lo que corresponde a un
ciclo. Las muestras fueron digeridas en dos ciclos, posteriormente, el contenido
fue transferido a una fiola de 10 mL y enrazado con agua ultrapura para su
posterior análisis voltamperométrico.
Figura N°2: Digestión a presión.
Determinación voltamperométrica de plomo en órganos
La determinación voltamperométrica fue similar al de la sangre con la diferencia
del volumen de muestra para la lectura, que para el caso de los órganos fue de 1
mL y el potencial final fue de 0.27 V.
Page 93
87
Muestras de órganos:
Obtención de muestras de órganos.
↓
Digestión a presión:
- 0.100 g de muestra en vasos
de digestión a presión.
- 1.5 mL de HNO3 y 5 mL de
agua ultrapura.
↓
- Pasar el contenido a una fiola
de 10 mL.
↓
Lectura en la estación
voltamperométrica.
4.2. Métodos estadísticos
4.2.1. Parámetros de distribución central
Promedio:
Valor que representa un conjunto de datos. Señala el centro de los valores, que es
la suma de todas las medidas divididas por el número de medidas.
∑
Dónde:
Σx: Sumatoria del conjunto de datos.
n: Número de datos.
Page 94
88
4.2.2. Parámetros de dispersión
Desviación Estándar (S):
Se considera como la raíz cuadrada de la varianza.
√ ( )
Dónde:
x: Sumatoria del conjunto de datos.
X: Sumatoria del conjunto de datos.
n: Número de datos.
Coeficiente de variación (CV):
Es una medida de variabilidad extensamente utilizada, también conocido como la
desviación estándar relativa (DER):
Dónde:
S: Desviación estándar.
X: Promedio.
El CV cuyas unidas se expresan en tanto por ciento, es un ejemplo de error
relativo, es decir una estimación del error dividida por una estimación de valor
absoluto de la cantidad medida. Los errores relativos se utilizan con frecuencia al
comparar las precisiones de los resultados que tienen diferentes unidades o
magnitudes.
Page 95
89
4.2.3. Pruebas de significancia
El análisis de varianza (ANOVA) es una técnica estadística muy potente que se
utiliza para separar y estimar las diferentes causas de variación. Un ANOVA de
un factor contrasta la existencia de diferencias significativas entre medias cuando
están presentes más de dos muestras.
Las fórmulas son:
Tabla N°6: Fórmulas para ANOVA.(50)
Fuente de
variación
Grados de
libertad
Suma de
cuadrados
Cuadrados
medios
Estadístico F
Entre
grupos
K-1 SCE
Dentro de
grupos
N-K SCD
Total N-1 SCT
Dónde:
N: nº de datos.
K: nº de grupos experimentales.
Para probar la significación en la relación F se recurre a tablas. Se analiza si el
valor calculado para F es menor o mayor que el que se indica en tablas de
acuerdo a los grados de libertad. En el primer caso, se concluirá que todos los
grupos son iguales, en caso contrario se concluirá que no todos los grupos son
iguales, entre algunos o todos existe una diferencia estadística significativa.
Prueba de Especificidad: HSD de Turkey (Honest Significative Difference)
Esta prueba de especificidad, también llamada diferencia honestamente
significativa de Turkey, se aplica una vez obtenidos los resultados del análisis
Page 96
90
ANOVA, es decir, si al análisis de varianza los resultados obtenidos fueran
significativos a los diferentes tratamientos, se procederá a averiguar
estadísticamente cuál de ellos fue más eficiente o más específico, de no hallarse
significancia en la prueba de ANOVA no será necesario realizar ninguna prueba
de especificidad. Esta prueba se calcula con un p = 0.05 y se aplica a cualquier
número de tratamientos, se usa la siguiente fórmula:
( )√
Dónde:
q: Valor tabulado en tablas para p = 0.05.
n: Tamaño de la muestra de cada grupo.
K: Es él número de grupos.
M: Son los grados de libertad.
MC (en): Media de cuadrados.
Page 97
91
CAPITULO III
RESULTADOS Y DISCUSION
El presente trabajo de investigación busca evaluar el efecto del ajo Allium sativum L.
sobre los niveles de plomo en sangre y órganos en animales de experimentación con
toxicidad aguda experimental, para ello se inició con la búsqueda, análisis y selección
bibliográfica donde se halló reportes de investigación que utilizaron el ajo en dosis
equivalentes a 1000 µg de alicina/kg/VO como tratamiento de animales de
experimentación inducidas con: hiperglicemia (72)
, hiperlipidemia (1, 4, 7, 18, 42)
y
hepatopatías (41, 104)
; por los resultados satisfactorios reportados en tales investigaciones,
dicha dosis también fue considerada para el desarrollo del presente trabajo.
Para conocer la concentración de alicina de nuestra muestra de ajo liofilizado, ésta se
determinó espectrofotométricamente como se describe en el capítulo anterior.
Los resultados de concentración de alicina se muestran a continuación:
1. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE ALICINA
El contenido de alicina por gramo de ajo se determinó usando el método de
Schwimmer tal como se describe en el capítulo anterior.
Page 98
92
Durante la preparación de la curva de calibración se obtuvieron los siguientes
resultados.
Cuadro Nº1: Concentraciones y absorbancias promedio de la curva de
calibración.
Muestra CC1
piruvato
CC2
alicina
Abs1 Abs2 Abs3 X Abs
1 0.002 0.001 0.036 0.035 0.032 0.034
2 0.004 0.002 0.076 0.068 0.070 0.072
3 0.006 0.003 0.114 0.106 0.106 0.109
4 0.008 0.004 0.146 0.145 0.140 0.143
5 0.010 0.005 0.184 0.189 0.173 0.182
Fuente: Elaboración propia
Con los datos del Cuadro N°1 se obtiene la siguiente curva de calibración
Grafica Nº1: Curva de calibración para la valoración de alicina.
Fuente: Elaboración propia
y = 18.355x - 0.0022
0.000
0.020
0.040
0.060
0.080
0.100
0.120
0.140
0.160
0.180
0.200
0 0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006
Ab
sorv
anci
a (n
m)
Concentración de Alicina (µmol/ml)
Page 99
93
Del gráfico anterior se obtiene los valores de a, b y r:
a b r
0.0022 18.355 0.999
El valor del coeficiente de correlación “r” nos indica que nuestra ecuación es una
recta, indicando que la concentración de alicina está en relación directa con la
absorbancia.
Ecuación de la recta:
Reemplazando los valores a y b tenemos:
Dónde:
y: Absorbancia de la muestra problema.
x: Concentración de alicina.
Una vez elaborada la curva de calibración se procedió a la preparación y lectura
de la muestra de ajo para determinar la concentración de alicina. El cuadro
inferior muestra los datos promedio de tres lecturas realizadas.
Muestra Peso (g) CC. Alicina (x) Absorbancia
(y)
Problema 0.05 xp 0.4289
Control 0.05 xc 0.0523
Si:
Page 100
94
Reemplazando:
Concentración de la muestra problema Concentración de la muestra control
Concentración neta de alicina:
Cantidad de alicina por gramo de ajo:
Por la ecuación de dilución:
Reemplazando:
( )( ) ( )
Por lo tanto:
Se pesó: 0.05 g de ajo liofilizado:
Page 101
95
Por el peso molecular de alicina:
( ) (
)
Transformando a miligramos:
( ) (
)
Concentración de alicina en la muestra de ajo liofilizado
Muestra mg de alicina / g de ajo
Ajo liofilizado 2.73
Teniendo en cuenta que los valores normales establecidos para la concentración
de alicina en un gramo de ajo es de 7 – 9 mg. (10,101,117)
Entonces la concentración de 2.73 mg de alicina hallada es muy baja, esto se
puede deber a que la muestra ha sido almacenada por un periodo de tiempo
relativamente largo (2 años), tiempo en el cual a pesar de que la muestra fue
almacena protegida de la luz, humedad y temperatura eleva, la alcina fue
degradándose.
Sin embargo para el propósito del presente trabajo estos valores son aceptables
ya que la dosis de alicina requerida para el tratamiento es de 1 mg de alicina/ g de
ajo liofilizado.
Entonces 1 mg está contenida en 0.3663 g de ajo.
Conocido el valor de la concentración de alicina por gramo de ajo liofilizado, se
preparó la solución acuosa para lo cual se pesó 0.3663 g de ajo y se disolvió en 5
mL de agua destilada. La preparación de la solución para el tratamiento se hizo
todos los días al igual que la administración hasta culminar el tratamiento.
Antes de determinar la concentración de plomo en sangre, se procedió a validar el
equipo y el método voltamperométrico como se describe a continuación.
Page 102
96
2. VALIDACION DEL EQUIPO
Para validar el instrumento VA Computrace de Metrohm, se utilizó una celda
estándar incorporada en el equipo. La validación se efectúo en dos partes, una
validación electrónica y una validación química, como se describe en el capítulo
anterior.
En la validación electrónica se reportó 2 resultados, uno del test de linealidad y
otro del test de desempeño del pico, los 2 resultados se dan entre la Intensidad
(A) versus el Voltaje (V). Una figura representativa es mostrada a continuación.
Figura Nº3: Validación electrónica lineal.
En la Figura Nº3, se observa una línea recta, la cual es obtenida de la corriente
mínima (- 2 A) y la corriente máxima (2 A) frente a la rampa de voltaje
mínimo (- 200 mV) y la rampa de voltaje máximo (+200mV), la tolerancia para
Test 757 VA Computrace with dummy cellDummy Cell WE-L
-0.20 -0.10 0.00 0.10 0.20
U (V)
-2.00u
-1.00u
0
1.00u
2.00u
I (A
)
Page 103
97
la corriente mínima es de (- 1.6 A… - 2.4 A) y para la corriente máxima es de
(1.6 A… 2.4 A), según parámetros descritos por Metrohm, con estas
características obtenidas se confirma la linealidad para la validación electrónica,
es decir que el desempeño de la rampa de voltaje fue óptima para la utilización
del equipo.
Figura Nº4: Validación electrónica del pico.
En la Figura Nº4, se muestra un pico simétrico, el cual fue obtenido del voltaje
máximo (- 497 mV) y la corriente máxima (- 2.35 A), la tolerancia para el
voltaje es de (- 450 mV…- 550 mV) y para la corriente es de (- 2 A… - 4 A),
según parámetros descritos por Metrohm, al producirse un cambio de intensidad
por el equipo se evidencia la simetría del pico y la fiabilidad del equipo para la
determinación de plomo.
Test 757 VA Computrace with dummy cellDummy Cell WE-D
-0.20 -0.30 -0.40 -0.50 -0.60 -0.70 -0.80
U (V)
0
-500n
-1.00u
-1.50u
-2.00u
-2.50u
I (A
)
No.1
Page 104
98
Culminada la validación electrónica se procedió con la validación química, la
cual se efectuó para ver la precisión y exactitud con la que cuenta el instrumento
para reportar los resultados de las muestras. Una gráfica representativa es
mostrada a continuación.
Figura Nº5: Validación química.
En la Figura Nº5, observamos la validación química que se efectuó usando una
solución estándar de plomo (1 g/L) después de 2 adiciones de estándar de 100 µL
en modo DME, se muestra un aumento en el pico de dicho metal y la
concentración final es de 1.049 g/L de plomo, la tolerancia para la concentración
final es de (0.95…1.05g/L), dicha concentración final depende enormemente del
cuidado tomado en la preparación de la solución de análisis y en la distribución
de las soluciones de adición estándar, al estar la concentración de plomo dentro
del rango establecido, se concluye con la validación química dado el
cumplimiento de los parámetros descritos por Metrohm.
Page 105
99
3. VALIDACION DEL METODO
Linealidad
Para determinar la linealidad se estudiaron 6 niveles de concentración (0.025,
0.050, 0.075, 0.1, 0.125, 0.150 mg/L) y se analizaron por triplicado, obteniéndose
los siguientes resultados representados en el Cuadro Nº2.
Cuadro Nº2: Datos para la linealidad del método.
Pb en
celda
(ppm)
Intensidad
I (nA)
Intensidad
II (nA)
Intensidad
III (nA)
X
Intensidad
(nA)
Desviación
estándar
0.002 2.985 2.854 2.790 2.876 0.099
0.005 6.048 5.878 5.710 5.879 0.169
0.007 8.671 8.799 9.093 8.854 0.216
0.010 11.991 11.499 11.958 11.816 0.275
0.012 14.650 14.183 14.503 14.445 0.239
0.015 17.497 16.989 17.205 17.230 0.255
Fuente: Elaboración propia.
Con estos datos se construyó la curva para la linealidad representada en la
Gráfico Nº2.
Independientemente a la apariencia de la recta, fue necesario evaluar el
coeficiente de regresión lineal (r) que fue igual a 0.9996, valor cercano a la
unidad, por lo que se afirma que existe una buena correlación entre las
variaciones de la concentración del analito y su respuesta.
Page 106
100
Gráfico Nº2: Linealidad del método voltamperométrico.
Fuente: Elaboración propia.
Precisión
Estudia la variabilidad que existe entre los diferentes resultados, pero sin tener en
cuenta su proximidad al valor real. Para determinar la precisión, en un primer
ensayo de repetibilidad se realizó el análisis sobre la misma muestra en las
mismas condiciones operativas, en un mismo laboratorio, el mismo día, los datos
son mostrados en el Cuadro Nº3.
Según la Tabla Nº5 del capítulo anterior para un nivel de concentración próximo
a 1 ppm el valor de coeficiente de variación máximo aceptable es 8 %, por lo
tanto los resultados mostrados al ser menores de 8 % cumplen con las
especificaciones.
y = 1168x + 0.072
0.000
2.000
4.000
6.000
8.000
10.000
12.000
14.000
16.000
18.000
20.000
0.000 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010 0.012 0.014 0.016
Inte
sid
ad (
nA
)
Concentración Pb (ppm)
Page 107
101
Cuadro Nº3: Datos para la repetibilidad del método.
Intensidad
I (nA)
Intensidad
II (nA)
Intensida
d III (nA)
Intensidad
Promedio
(nA)
DS CV
%
Int. Confianza
2.985 2.85 2.79
2.88 0.10 3.46 2.62 3.13
6.048 5.88 5.71
5.88 0.17 2.87 5.44 6.31
8.671 8.80 9.09
8.85 0.22 2.44 8.30 9.41
11.991 11.50 11.96
11.82 0.28 2.33 11.11 12.52
14.65 14.18 14.50
14.45 0.24 1.65 13.83 15.06
17.4965 16.99 17.21
17.23 0.25 1.48 16.58 17.89
Fuente: Elaboración propia.
La repetibilidad del método depende generalmente del proceso de preparación de
la muestra, es decir, cuanto mayor sea la manipulación de la muestra más
probable es que la variabilidad de método aumente.
Para la precisión intermedia se evaluaron factores como día de ensayo (I), equipo
(II) y analista (III) representados a continuación.
Cuadro Nº4: Datos para la precisión intermedia.
Intensidad
I (nA)
Intensidad
II (nA)
Intensidad
III (nA)
Promedio
Intensidad
(nA)
DS CV Int. Confianza
3.30 3.62 3.82 3.58 0.26 7.37 2.90 4.26
6.24 6.45 6.59 6.42 0.17 2.70 5.98 6.87
8.76 9.26 9.64 9.22 0.44 4.78 8.09 10.36
11.85 11.73 12.71 12.10 0.53 4.39 10.73 13.46
14.25 14.22 15.05 14.51 0.47 3.22 13.30 15.71
16.96 16.99 17.43 17.13 0.26 1.53 16.45 17.80
Fuente: Elaboración propia.
Page 108
102
Para la precisión intermedia generalmente se acepta valores inferiores al doble
del coeficiente de variación de la repetibilidad del método, de tal modo que los
datos mostrados en el Cuadro Nº4, cumplen con las especificaciones dadas. Los
límites de confianza representan el intervalo en torno al valor estimado que
contiene el valor real con una probabilidad del 95 %.
Límite de cuantificación y detección LC, LD
Los LC y LD fueron calculados con los datos obtenidos de los análisis realizados
por triplicado en el Cuadro Nº2. Una figura representativa es mostrada a
continuación:
Figura Nº6: Para la determinación del LC y LD.
Se determinó la pendiente de la curva de calibración para los datos, de donde se
pudo extrapolar a concentración cero la ecuación de la recta (Grafica Nº3),
obteniéndose como señal ruido la correspondiente al termino independiente, es
decir Ybl.
Page 109
103
Gráfico Nº3: Concentración versus Intensidad (nA.).
Fuente: Elaboración propia.
Se construyó otra recta tomando como eje de ordenadas las desviaciones estándar
de las respuestas y como eje de abscisas las concentraciones estudiadas,
considerándose que la desviación estándar de las respuestas Sbl corresponderá al
valor de la ordenada de origen de esta recta.
Con los datos necesarios se calculó el límite de detección y límite de
cuantificación aplicando las siguientes fórmulas:
Límite de detección (LD):
√
Valor LD: 0.000134 ppm ó 0.13 ppb
Límite de cuantificación (LC):
y = 1168x + 0.072
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0.00 0.01 0.01 0.02 0.02
Inte
nsi
dad
nA
Concentracion de Plomo (ppm)
Intensidad vs. Concentración
Page 110
104
√
Valor de LC: 0.001433 ppm ó 1.43 ppb
Dónde:
De modo que se puede determinar que el método es capaz de detectar 1.4 ppb de
plomo en sangre y órganos con una buena precisión y exactitud.
Gráfico Nº4: Desviación estándar versus Intensidad (nA).
Fuente: Elaboración propia.
4. RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN
DE PLOMO EN SANGRE Y ÓRGANOS DE ANIMALES DE
EXPERIMENTACIÓN
Se muestran los resultados en cuadros y gráficos del efecto de la solución acuosa
de ajo liofilizado en Rattus norvegicus variedad Wistar con toxicada aguda
experimental y que fueron tratados por cinco (grupo 4) y seis semanas (grupo 3).
y = 12.18x + 0.103
0.0000
0.0500
0.1000
0.1500
0.2000
0.2500
0.3000
0.000 0.005 0.010 0.015 0.020
Co
nce
ntr
acio
n d
e P
lom
o (
pp
m)
Desviación Estándar
Page 111
105
Grupos de estudio Designación
Grupo 1 Control Positivo
Grupo 2 Control Negativo
Grupo 3 Pre-post tratamiento
Grupo 4 Post tratamiento
Efecto de la solución acuosa de ajo liofilizado sobre las concentraciones de
plomo en sangre.
Con la finalidad de monitorizar las concentraciones de plomo en muestras
sanguíneas de los cuatro grupos en estudio durante todo el periodo de
investigación, se procedió tal y como se describe en el capítulo; así mismo se
llevó un control semanal de los pesos de todos los animales de experimentación
(Anexo 3) los cuales no variaron significativamente.
A continuación se muestran los resultados hallados antes, durante y después de la
intoxicación de los cuatro grupos de estudio, (Anexo 7).
Antes de la intoxicación; con la finalidad de determinar las
concentraciones basales de plomo sanguíneo. Los resultados se muestran
en la Cuadro N°5 y Grafica N°5.
Cuadro N°5: Concentraciones basales de plomo en sangre (mg/L).
Días C. Negativo C. Positivo Pre-post
tratamiento
Post
tratamiento
1 0.936 ± 0.080 0.855 ± 0.085 0.936 ± 0.080 0.911 ± 0.065
Fuente: Elaboración propia.
Page 112
106
En el Cuadro N°5 y Gráfica N°5 se observa que todos los animales de
experimentación presentan concentraciones basales de plomo en sangre alrededor
de 1 ppm. Al iniciar el trabajo de investigación, como sería natural, no se
esperaba encontrar niveles de plomo en sangre. Esto puede deberse a que la
alimentación (maíz humedecido en agua) y bebida de las ratas del Bioterio de la
UCSM, son a base de agua subterránea en donde es normal encontrar metales
pesados como el plomo.(50)
Gráfico N°5: Concentraciones basales de plomo en sangre (ppm).
Fuente: Elaboración propia.
Una vez determinado las concentraciones basales de plomo sanguíneo, al grupo 3
(Pre-post tratamiento) se le administró ajo liofilizado (1000 µg de alicina/kg/día)
en solución acuosa como tratamiento durante siete días obteniéndose los
siguientes resultados que se muestran en el Cuadro N°6 y Gráfico N°6.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
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C. Negativo C. Positivo Pre-post tto Post tto
Co
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n d
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o
pp
m
Grupos de estudio
Page 113
107
Cuadro N°6: Concentraciones de plomo sanguíneo (mg/L) tras siete días de
tratamiento del grupo 3.
Días C. Negativo C. Positivo Pre-post
tratamiento
Post
tratamiento
8 0.908 ± 0.066 0.855 ± 0.085 0.277 ± 0.039 0.911 ± 0.065
Fuente: Elaboración propia.
Gráfico N°6: Concentraciones de plomo sanguíneo (ppm) tras siete días de
tratamiento del grupo 3.
Fuente: Elaboración propia.
En el Cuadro N°6 y Gráfico N°6 se observa que después de siete días de
tratamiento con ajo del grupo 3 (Pre-post tratamiento), la concentración de plomo
disminuye en un 70.41% en valores que fueron desde 0.936 mg/L a 0.277 mg/L.
Durante (24 horas después de la intoxicación); con la finalidad de
determinar las nuevas concentraciones de plomo sanguíneo. Se
obtuvieron los siguientes resultados.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
C. Negativo C. Positivo Pre-post tto Post tto
Co
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lom
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pp
m
Grupos de estudio
Page 114
108
Cuadro N°7: Concentraciones de plomo sanguíneo (mg/L) 24 horas después de
la intoxicación con acetato de plomo.
Días C. Negativo C. Positivo Pre-post
tratamiento
Post
tratamiento
10 0.901 ± 0.048 2.737 ± 0.594 3.496 ± 0.904 2.661 ± 0.381
Fuente: Elaboración propia.
En el Cuadro N°7 y Gráfico N°7 se observa un incremento de las
concentraciones de plomo en sangre de los grupos 2,3 y 4, los cuales fueron
sometidos a un cuadro de intoxicación aguda con 100 ppm de acetato de plomo
vía oral, lo que nos indica que los animales efectivamente fueron intoxicados.
Gráfico N°7: Concentraciones de plomo sanguíneo (ppm) 24 horas después de
la intoxicación con acetato de plomo.
Fuente: Elaboración propia.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
C. Negativo C. Positivo Pre-post tto Post tto
Co
nce
ntr
ació
n d
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lom
o
pp
m
Grupos de estudio
Page 115
109
(Después de la intoxicación) cada cinco días durante el tratamiento
continuo; cuya finalidad fue determinar si las concentraciones de plomo
sanguíneo disminuían o se mantenían constantes, los datos se muestran en
el Cuadro N°8 y Gráficos N°8, 9, 10 y11.
Cuadro N°8: Concentraciones promedio de plomo sanguíneo (mg/L).
CONCENTRACION (ppm)
Día
s
Control
Negativo
Control
Positivo
Pre-post
tratamiento
Post
tratamiento
Basa
l
1 0.936 ± 0.080 0.855 ± 0.085 0.936 ± 0.080 0.911 ± 0.065
8 0.908 ± 0.066 0.855 ± 0.085 0.277 ± 0.039 0.911 ± 0.065
Tra
tam
ien
to
10 0.901 ± 0.048 2.737 ± 0.594 3.496 ± 0.904 2.661 ± 0.381
15 0.912 ± 0.054 2.288 ± 0.651 1.023 ± 0.165 1.045 ± 0.173
20 0.908 ± 0.049 1.819 ± 0.335 0.650 ± 0.153 0.624 ± 0.181
25 0.888 ± 0.079 1.608 ± 0.231 0.442 ± 0.084 0.452 ± 0.133
30 0.891 ± 0.057 1.433 ± 0.202 0.276 ± 0.038 0.383 ± 0.111
35 0.871 ± 0.085 1.340 ± 0.182 0.156 ± 0.050 0.309 ± 0.074
40 0.884 ± 0.122 1.281 ± 0.148 0.192 ± 0.043 0.285 ± 0.058
Fuente: Elaboración propia.
Siete días después de tratamiento con solución acuosa de ajo liofilizado.
24 horas después del día de la intoxicación
Con los datos del Cuadro N°8, se realizaron los Gráficos N°8, 9, 10,11 y 12, en
donde se muestran concentraciones promedio de plomo en sangre (ppm) y las
desviaciones estándar de todo el periodo de tratamiento de todos los grupos en
estudio: (Control Negativo, Control Positivo, Pre-post tratamiento y Post
tratamiento).
Page 116
110
Gráfico N°8: Grupo control negativo.
Fuente: Elaboración propia.
Gráfico N°9: Grupo control positivo.
Fuente: Elaboración propia.
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
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pp
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Días de evaluación
C. Negativo
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0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
0 10 20 30 40 50
Co
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ació
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o
pp
m
Días de evaluación
C. Positivo
Page 117
111
Gráfico N°10: Grupo pre-post tratamiento.
Fuente: Elaboración propia.
Gráfico N°11: Grupo post tratamiento.
Fuente: Elaboración propia
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
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0 10 20 30 40 50
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Días de evaluación
Pre-post tratamiento
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
4.50
5.00
0 10 20 30 40 50
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Días de evaluación
Post tratamiento
Page 118
11
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Gra
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20
25
30
35
40
45
Concentración de Plomo ppm
Día
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alu
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n
Page 119
113
Tomando en cuenta los valores de los gráficos anteriores, numéricamente se
puede determinar que la solución acuosa ajo “Allium sativum L.” administrada
como tratamiento a los grupos 3 (Pre-post tratamiento) y grupo 4 (Post
tratamiento), parece disminuir los niveles de plomo en sangre en relación al
grupo control positivo. Para corroborar dicha suposición se analizó
estadísticamente todos los valores y se aplicó un Análisis de Varianza (ANOVA)
(p<0.05) para establecer si existe o no diferencia significativa entre las
concentraciones promedio de plomo en sangre de todos los grupos de estudio.
Cuadro N°9: Análisis de varianza aplicada a las concentraciones de plomo de
los cuatro grupos de estudio (mg/L).
Día Valor F Valor crítico
para F
Probabilidad Significancia
Basal 1 1.44969766
3.09839121
0.25824086 No
Pre-post
tratamiento
8 131.617442 2.4539E-13 Si
Intoxicación 10 21.9676251 1.5373E-06 Si
Tratamiento
15 20.9618072 2.1874E-06 Si
20 44.2326911 5.1599E-09 Si
25 85.2931463 1.4339E-11 Si
30 117.452858 7.2116E-13 Si
35 146.676092 8.7481E-14 Si
40 151.720643 6.3333E-14 Si
Fuente: Elaboración propia.
Dónde:
Sí; si existe diferencia estadísticamente significativa.
No; no existe diferencia estadísticamente significativa.
Page 120
114
De los gráficos anteriores y del análisis de varianza se puede determinar que no
se encontró diferencia significativa (p>0.05) entre las concentraciones basales de
plomo en sangre de los cuatro grupos de estudio, así mismo, los valores
promedio de las concentraciones de plomo en sangre del grupo control negativo,
al cual se le administró 1 mL de agua destilada, se mantuvieron constantes
durante todo el periodo de evaluación, por lo que podemos establecer que no
existe ningún factor externo que esté influyendo significativamente en las
concentraciones de plomo durante el periodo de investigación.
En relación al gráfico y análisis de varianza del grupo control positivo, se
encontró diferencia significativa (p<0.05) en los niveles de plomo en sangre
respecto a los otros tres grupos de estudio, así mismo los valores promedio de las
concentraciones de plomo de dicho grupo, no se mantuvieron constantes los 30
primeros días, esto se debe a que el propio organismo de los animales, una vez
inducidas a un cuadro de toxicidad aguada con 100 mg/kg de acetato de plomo,
trata de eliminar por diferente medios el exceso de plomo como mecanismo de
defensa lo cual es catalogado como “eliminación fisiológica” en las
investigaciones realizadas por (Senapati SK et al., 2001; Awivedi SK et al.,
2001). Sin embargo los días posteriores al día 30, las concentraciones de plomo
parecen hacerse constantes, lo que nos indica que la fisiología del animal de
experimentación llega a un punto en el que no puede eliminar más el exceso de
plomo en sangre debido a que por el tiempo podría estarse presentando el
equilibrio tricompartimental característico del plomo que se describe en las
investigaciones realizadas por (Sina K et al., 2012; Vega j et al., 2003; Payton M
et al., 1998; Lamphear Ret al., 2000).
A pesar de que después de la intoxicación aguda las concentraciones de plomo
disminuyen fisiológicamente, estadísticamente (p<0.05) los valores hallados para
el grupo control positivo difieren significativamente del resto de grupos. Frente a
estos datos se puede afirmar que efectivamente estamos frente a un cuadro de
intoxicación aguda y por lo tanto se debe administrar algún tipo de tratamiento
Page 121
115
que revierta las concentraciones elevadas de plomo tal y como se realizó en
presente trabajo y cuyos resultados de exponen a continuación.
Los resultados de los animales que conformaron el grupo 3 (Pre-post
tratamiento); a los cuales luego de determinar sus concentraciones basales, se les
administró un tratamiento de siete días con solución acuosa de ajo liofilizado
(1000 µg/kg/día de alicina), el día ocho se les intoxicó con solución acuosa de
acetato de plomo (100 mg/kg) y posteriormente se continuo con el tratamiento;
los resultados se muestran en los Cuadros N°8, 9 y Gráfico N°10 y se analizan
en tres momentos:
Primero; luego de siete días de tratamiento con ajo liofilizado, en donde se
observa una disminución del 70.41% de la concentración basal de plomo; así
mismo los resultados estadísticos del Cuadro N°8, indican que existe diferencia
significativa (p<0.05) del grupo 3 (Pre-post tratamiento) respecto al resto de
grupos. Por lo que podemos establecer que la solución acuosa de ajo liofilizado
disminuye los niveles basales de plomo en sangre.
Segundo; el día diez cuyos datos pertenecen al momento de la intoxicación
aguda, muestran un mayor aumento de la concentración de plomo en sangre
respecto al resto de grupos (Gráfico N°10), esta mayor absorción de plomo se
debería probablemente a que luego de los siete días de tratamiento el equilibrio
tricompartimental característico del plomo se vio alterado y entonces el día de la
intoxicación no sólo se registra la concentración de plomo administrado
intencionalmente, sino que probablemente a esto también se sumaría el plomo
que se encuentra depositado en órganos y huesos y que se estarían removiendo
para lograr nuevamente el equilibrio tricompartimental.
Tercero; las cinco semanas de tratamiento posteriores al día de la intoxicación,
muestran un mayor descenso de los niveles de plomo los cinco primeros días,
esto se debería a la sumatoria de la eliminación fisiológica de plomo más la
eliminación relacionado a la administración de ajo. Los días posteriores de
tratamiento, la reducción de los niveles de plomo en sangre continúan siendo
Page 122
116
evidentes llegando incluso a disminuir por debajo de las concentraciones basales.
Por lo tanto se puede establecer que la administración acuosa de ajo liofilizado
administrado antes y después de la intoxicación con acetato de plomo, reduce los
niveles de plomo en sangre. Estos resultados coinciden con lo reportado por
(Badiei K et al., 2006; Massadeh AM et al., 2007).
En relación a los datos correspondientes al grupo 4 (Post tratamiento), estos
muestran una disminución paulatina de la concentraciones de plomo después del
día de la intoxicación, así mismo se puede observar que dichas concentraciones
disminuyen incluso por debajo de las concentraciones basales, lo que podría
indicarnos que el tratamiento con solución acuosa de ajo liofilizado no solo
disminuye las concentraciones de plomo administradas intencionalmente, sino
que también disminuye las concentraciones basales de plomo determinadas al
inicio del tratamiento.
Por otro lado tanto el grupo 3 (Pre-post tratamiento) como el grupo 4 (Post
tratamiento), según el análisis de varianza (Cuadro N°9), difieren
significativamente (p>0.05.
Tomando en cuenta los resultados anteriores, los valores de los grupos de estudio
3 y 4 demuestran que ambos tratamientos disminuyen la concentración de plomo
sanguíneo; para determinar el mejor tratamiento para el efecto de la solución
acuosa de ajo liofilizado en Rattus norvegicus variedad Wistar, se empleó el
Test de Turkey (p<0.05) como prueba de significancia que permite múltiples
comparaciones entre todos los pares de medias y cuyos resultados son mostrados
a continuación.
Page 123
11
7
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Page 124
118
Los resultados del test de Turkey (Cuadro N°10), muestran que en el día 1 los
valores obtenidos fueron estadísticamente no significativos (p>0.05) por lo que
se considera que las medias de los cuatro grupos de investigación son iguales ya
que corresponden a las concentraciones basales de plomo en sangre. Los datos
del día 8, muestra que los valores del grupo 3 son estadísticamente significativos
y diferentes al resto de grupos (p<0.05), por lo que se establece que el
tratamiento por siete días con solución acuosa de ajo liofilizado disminuyó los
niveles de plomo en sangre. Los datos del día diez, correspondiente a una día
después de la intoxicación con 100 ppm de acetato de plomo y muestran una
diferencia significativa del grupo control negativo en relación a los otros grupos,
esto debido a que dicho grupo de estudio no fue sometido a un cuadro de
toxicidad aguda. Así mismo los datos de los días 15 y 20, muestran diferencias
estadísticas (p<0.05) entre el grupo control positivo y el resto de grupos, por lo
que se puede determinar que a partir del día 15 los tratamientos empleados en el
grupo 3 y 4, hacen efecto, ya que los valores de ambos grupos no se diferencias
significativamente del grupo control negativo (p>0.05). Los valores de los cuatro
grupos de estudio correspondientes a los días 25, 30, 35 y 40 evidencian una
clara diferencia significativa (p<0.05) del grupo 1 (Control Negativo) en relación
a los grupos 2, 3, 4 y del grupo 2 (Control Positivo) en relación a los grupos 1, 3,
4; por lo que se puede establecer que los tratamientos empleados en los grupos 3
y 4, efectivamente disminuyen los niveles de plomo en sangre de los animales de
experimentación, además, se puede afirmar que no existe diferencia
estadísticamente significativa (p>0.05) entre administrar un tratamiento Pre-post
intoxicación y un tratamiento post intoxicación.
Efecto de la solución acuosa de ajo liofilizado sobre las concentraciones de
plomo en órganos (hígado, bazo y riñón).
Con la finalidad de determinar si la solución acuosa de ajo liofilizado tiene algún
efecto sobre las concentraciones de plomo en órganos, se procedió a sacrificar
Page 125
119
por contusión cervical a todos los animales de experimentación al finalizar el
periodo de tratamiento y se les extrajeron el bazo, hígado y riñón, los cuales
fueron colocados en bolsas de polietileno debidamente rotuladas (Anexo 8) para
luego pesarlos y continuar con los análisis tal como se describe en el capítulo
anterior.
A continuación se muestran cuadros y gráficos con los resultados de los estudios,
además la interpretación de los datos se hizo considerando como concentraciones
basales los valores del grupo control negativo (Grupo 1) al cual, como se
mencionó anteriormente, no se le administró ningún tipo de tratamiento.
Cuadro N°11: Concentraciones promedio de plomo en los diferentes órganos
(µg/g).
Hígado Bazo Riñón
C. negativo 0.455 ± 0.743 0.763 ± 0.356 0.891 ± 0.867
C. positivo 5.030 ± 0.943 1.983 ± 1.105 2.232 ± 1.817
Pre-post tratamiento 0.809 ± 0.857 1.017 ± 0.759 2.345 ± 1.271
Post tratamiento 0.898 ± 1.085 0.956 ± 0.463 2.579 ± 1.342
Fuente: Elaboración propia.
Page 126
120
Grafico N°13: Concentraciones promedio de plomo en hígado (µg/g).
Fuente: Elaboración propia.
En el Cuadro N°11 y Grafico N°13 se observa que la concentración basal de
plomo en hígado es de 0.455 ± 0.743 µg/g, por otro lado la concentración
promedio del grupo 2 (C. Positivo) que fue intoxicado con 100 ppm de acetato de
plomo y que no recibió ningún tipo de tratamiento es de 5.030 ± 0.943 µg/g; los
otros dos grupos a los que se les administró solución acuosa de ajo liofilizado
como tratamiento, muestras valores de 0.809 ± 0.857 µg/g y 0.898 ± 1.085 µg/g
respectivamente. Por lo que podemos establecer que el tratamiento con ajo
disminuye alrededor de un 83% las concentraciones de plomo en hígado en
ambos grupos tratados. Estos resultados coinciden con estudios relacionados
reportados por (Wu CC et al., 2002; Rahmy TR et al., 2001; Massadeh AM et al.,
2007).
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1.00
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Grupos de estudio
Hígado
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121
Grafico N°14: Concentraciones promedio de plomo en bazo (µg/g).
Fuente: Elaboración propia.
Los valores del Cuadro N°11 y Grafico N°14 muestran que la concentración
basal de plomo en bazo es de 0.763 ± 0.356 µg/g, por otro lado la concentración
promedio del grupo Control Positivo que fue intoxicado con 100 ppm de acetato
de plomo y que no recibió ningún tipo de tratamiento es de 1.983 ± 1.105 µg/g;
los otros dos grupos a los que se les administró solución acuosa de ajo liofilizado
como tratamiento, muestras valores de 1.017 ± 0.759 µg/g y 0.956 ± 0.463 µg/g
respectivamente. Por lo que se puede establecer que el tratamiento con ajo
disminuye alrededor de un 50 % las concentraciones de plomo en bazo en ambos
grupos tratados.
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
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C. Negativo C. Positivo Pre.posttratamiento
Posttratamiento
Co
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o
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Grupos de estudio
Bazo
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Grafico N°15: Concentraciones promedio de plomo en riñón (µg/g).
Fuente: Elaboración propia.
Los valores del Cuadro N°11 y Grafico N°15 muestran que la concentración
basal de plomo en riñón es de 0.891 ± 0.867 µg/g, por otro lado la concentración
promedio del grupo Control Positivo que fue intoxicado con 100 ppm de acetato
de plomo y que no recibió ningún tipo de tratamiento es de 2.232 ± 1.817 µg/g;
los otros dos grupos a los que se les administró solución acuosa de ajo liofilizado
como tratamiento, muestras valores de 2.345 ± 1.271 µg/g y 2.579 ± 1.342 µg/g
respectivamente. Por lo que podemos establecer que el tratamiento con ajo no
disminuye las concentraciones de plomo en riñón en ninguno de los dos grupos
que fueron tratados con ajo liofilizado.
0.00
1.00
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C. Negativo C. Positivo Pre.posttratamiento
Post tratamiento
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Grupos de estudio
Riñón
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Baz
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124
Tomando en cuenta los valores de los cuadros y gráficos anteriores,
numéricamente se puede determinar que la solución acuosa ajo “Allium sativum
L.” administrada como tratamiento a los grupos 3 (Pre-post tratamiento) y 4
(Post tratamiento), disminuye los niveles de plomo en hígado y bazo en relación
al grupo control positivo, sin embargo, esta reducción de la concentración de
plomo no se evidencia en el riñón de ninguno de los dos grupos de tratamiento,
mas por el contrario, se observa un pequeño incremento de los valores de plomo
en dicho órgano. Esto se puede deber a que una de las principales funciones del
riñón es la eliminación de desechos y sustancias extrañas del organismo mediante
la orina, en consecuencia es muy probable que el plomo al estar siendo eliminado
por esta vía se halle en mayor concentración. Estos resultados coinciden con
estudios relacionados reportados por (Senapati S et al., 2001; Sina K et al.,
2012).
Mediante un análisis estadístico de Varianza (ANOVA) (p<0.05), se determinó si
entre las concentraciones de las muestras biológicas de los grupos de estudio
existe diferencia estadísticamente significativa.
Cuadro N°12: Análisis de varianza aplicada a las concentraciones de plomo en
los órganos de los grupos de estudio (µg/g).
Órgano Valor F Valor crítico
para F
Probabilidad Significancia
Bazo 3.35105977
3.09839121
0.03953124 Si
Hígado 33.4915672 5.4203E-08 Si
Riñón 1.86128905 0.16869799 No
Fuente: Elaboración propia.
Dónde:
Sí; si existe diferencia estadísticamente significativa.
No; no existe diferencia estadísticamente significativa.
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125
Tomando en cuenta los resultados anteriores, los valores de los grupos de estudio
3 y 4 demuestran que ambos tratamientos disminuyen las concentraciones de
plomo en hígado y bazo, mas no en el riñón.
Para determinar el mejor tratamiento para el efecto de la solución acuosa de ajo
liofilizado sobre los niveles de plomo en hígado y bazo en Rattus norvegicus
variedad Wistar, se empleó el Test de Turkey (p<0.05) como prueba de
significancia que permite múltiples comparaciones entre todos los pares de
medias y cuyos resultados son mostrados a continuación.
Cuadro N°13: Análisis estadístico de las concentraciones de plomo en bazo e
hígado empleando el test de Turkey (µg/g).
Bazo Hígado
GRUPOS DE ESTUDIO Prom. Sign.
(p<0.05)
Prom. Signif.
(p<0.05)
G 1 Control negativo 0.763 B 0.455 B
G 2 Control positivo 1.983 A 5.030 A
G 3 Pre-post
tratamiento
1.017 AB 0.809 B
G 4 Post tratamiento 0.956 AB 0.898 B
Prom. : Promedio
Signif. : Significancia
Fuente: Elaboración propia.
Los resultados del test de Turkey (Cuadros N°13); muestran que los valores del
grupo 2 (Control positivo) muestran una diferencia estadísticamente significativa
(p<0.05) en relación a los tres grupos restantes, además, los valores de los grupos
1, 3 y 4, no muestran una diferencia estadísticamente significativa entre ellos. Por
lo que se puede determinar que los tratamientos con solución acuosa de ajo
liofilizado empleados a los grupos 3 y 4, efectivamente disminuye los niveles de
Page 132
126
plomo en hígado y bazo de los animales de experimentación , además, se puede
afirmar que no existe diferencia estadísticamente significativa entre administrar
un tratamiento Pre-post intoxicación y un tratamiento post intoxicación.
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127
CONCLUSIONES
Basados en los resultados de este estudio, se puede concluir lo siguiente:
1. El contenido de alicina en el Allium sativum L. (ajo) variedad arequipeño
empleado en nuestra investigación es de 2.73 mg/g, lo que corresponde al 0.27
g/%.
2. La validación del equipo, la linealidad, precisión y el límite de detección y
cuantificación obtenidas en el presente estudio, demuestran que la voltametría es
una técnica efectiva para determinar plomo en muestras sanguíneas y en órganos.
3. La administración de solución acuosa de ajo liofilizado como tratamiento en la
intoxicación aguda con plomo, demostró reducir los niveles de plomo en
muestras sanguíneas.
4. La administración de solución acuosa de ajo liofilizado como tratamiento en la
intoxicación aguda con plomo, demostró reducir los niveles de plomo en hígado
y bazo.
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128
SUGERENCIAS
1. Proporcionar información a la población en general sobre la intoxicación con
plomo, ya que están expuestos a una gran cantidad de vehículos en el parque
automotor, industrias, mineras y demás fuentes de intoxicación que contaminan
el suelo, agua y aire con este tóxico. Poner énfasis acerca de los signos y
síntomas que puede ocasionar la exposición a este metal y sobre todo enfatizar en
la prevención.
2. Promocionar el consumo de ajo como parte de la dieta diaria.
3. Determinar si el ajo “Allium sativum L.” disminuye los niveles de otros metales
pesados en muestras biológicas.
4. Llevar a cabo trabajos de investigación de las propiedades desintoxicantes de
otras plantas medicinales.
5. Aprovechar al máximo la Voltamperometría por demostrar ser una técnica
altamente sensible.
Page 135
129
BIBLIOGRAFIA
1. ACKERMANN RT; MULROW CD; RAMIREZ G; GARDNER CD;
MORBIDONI L; LAWRENCE VA (2001); Garlic shows promise for improving
some cardiovascular risk factors. Arch Intern Med; 161 (6):813 – 24.
2. ADRIANO IV; FOMCHENKOV IV; OREKHOV AN (2002); Hypotensive
effect of long-acting garlic tablets allicor (a double-blind placebo. controlled
trial). Ter Arkh; 74(3):76-8.
3. AHMED E; ABDEL M; MOHAMED S; SALEH A. The protective effects of
flaxseed oil on lead acetate – induces renal toxicity in rats. Journal of Hazardous
Materials. 2011; 194: 250 – 255. Disponible en internet
www.elsevier.com/locate/jhamat
4. AMAGASE H; PETESCH BL; MATSUURA H; KASUGA S; ITAKURA Y
(2001) Intake of garlic and its bioactive components. Nutr: 131(3s):955S-62S.
5. An Introduction in Theory, Metrohm Ltd. CH-9100, Herisau Switzerland,
Voltammetry.
6. ASILBERGED EK. Mechanisms of lead neurotoxicity, or looking beyond the
lamppost. FASEB J. 1992; 6: 3201 – 6.
7. AVATO P; TURSIL E; VITALI C; MICCOLIS V; CANDIDO V (2000); Ally
sulfide constituents of garlic volatile oil as antimicrobial; agents. Phytomedicine;
7(3):239-43.
8. BADIEI K; MOSTAGHNI A; TABATABAEI N. Ameliorated effects of Allium
sativum on subclinical lead toxicity in goats. Department of clinical studies,
School of Veterinary Medicine, Islamic Azad University, Kazeroun, iran.
Pakistan Vet. J., 2006, 26(4): 184 – 186.
Page 136
130
9. BALASENTHIL S; RAO KS; NAGINI S (2002). Garlic induces apoptosis
during 7, 12-dimethylbenz[a]anthracene-induced hamster buccal pouch
carcinogenesis. Oral Oncol; 38(5):431-6.
10. BALDARRAGO SILVA GINA. 1991. Actividad Antifúngica “in vitro” del
Allium sativum L. (ajo) frente a los dermatofitos Microsporum, Trichophyton.
Universidad Católica de Santa María – Arequipa.
11. BATIREL HF; NAKA Y; KAYANO K; OKADA K; VURAL K; PINSKY DL;
OZ MC (2002). Intravenous allicin improves pulmonary blood flow after
ischemia-reperfusion injury in rats. J Cardiovasc Surg (Torino); 43(2):175-9.
12. BIANCHINI F; VAINIO H (2001). Allium vegetables and organosulfur
compounds: do they help prevent cancer? .Environ Health Perspect; 109(9):893-
902.
13. BONIFAZ, ALEXANDRO; MUÑOZ AYALA, MARIA DE JESUS; MONGE,
BERNAL (1990). Estudio de la actividad in vitro de la alicina (principio activo
del ajo) en el tratamiento de tiñas del cuerpo e inguigal; Dermatol. Rev. Mex:
34(3):199-204.
14. BOREK C (2001). Antioxidant health effect of aged garlic extract. J Nutr; 131
(3s):1010S-5S.
15. BOTTONE FG; BAEK SJ; NIXON JB; ELING TE (2002). Diallyl disulfide
(DADS) induces the antitumorigenic NSAID-activated gene (NAG-1) by a p53-
dependent mechanism in human colorectal HCT 116 cells. J Nutr; 132(4):773-8.
16. BRIGGS WH; XIAO H; PARKIN KL; SHEN C; GOLDMAN IL Differential
inhibition of human platelet aggregation by selected Allium thiosulfinates. J
Agric Food Chem; 48(11):5731-5, 2000.
Page 137
131
17. CALDERON S; QUINTANAR E; GONZALEZM; HERNANDEZ L. Lead and
calcium transport in human erythrocyte. Human and Experimental Toxicology.
1999, 18, 327 – 332.
18. CAMPBELL JH; EFENDY JL; SMITH NJ; CAMPBELL GH (2001). Molecular
basis by which garlic suppresses atherosclerosis. J Nutr; 131(3s):1006S-9S.
19. CANFIELD RL; HENDERSON JR; CORY- SLECHTA DA; COX C; LUSKO
TA;LAMPHEAR B. Intellectual impairment in children with blood lead
concentration below 10 micrograms per deciliter. New Engl J Med. 2003; 348:
1517 – 26.
20. CAPASSO. L.: Archaelogical documentation of the atmospheric pollution in
antiquity. Med. Secoli, 7 (3), 435-444, 1995.
21. Catherine L; Aidée C; “Efecto antifúngico del talco a base de Allium sativum L.
(Ajo) sobre los dermatofitos causantes de tinea pedis (pie de atleta)”.
Universidad Católica de Santa María.
22. CHAURASIA SS; PAUDE S; KARA. Withania sinbufera root extractin the
regulation of lead induced oxidative damage in male mouse. Pharmacol Res.
2000; 41 (6): 663 – 6.
23. COLIC M; VUCEVIC D; KILIBARDA V; RADICEVIC N; SAVIC M (2002).
Modulatory effects of garlic extracts on proliferation of T- lymphocytes in vitro
stimulated with concanavalin A. Phytomedicine; 9(2):117-24.
24. DASILVA E; HOAREAU L. Medicinal plants: are emerging health aid.
Electron. J. Biotech.1999; 15: 56 – 70.
25. DHIN IS; RODHERS WJ; GOMAA EA; STRASBURG GM; GRAY JI (2002).
Inhibition of heterocyclic aromatic amine formation in fried ground beef patties
by garlic and selected garlic-related sulfur compounds. J Food Prot; 65(11):1766-
70.
Page 138
132
26. Digester UV 705 (220 V, 60 Hz), Sample preparation in VA, disponible:
http://products.metrohm.com/polarograph/va-sample-preparation/prod-
27050016.aspx.
27. DIKASSO D; LEMMA H; URGA K; DEBELLA A; ADDIS G; TADELE A.
YIRSAW K (2002). Investigation on the antibacterial properties of garlic
(Allium sativum) on pneumonia causing bacteria. Ethiop Med J; 40(3):241-9.
28. DING Y; GONICK HC; VAZIRI ND; LIANG K; WEI L. Lead induced
hypertension, III: increased hydroxyl radical production. Am J Hypertension.
2001; 14: 169 – 73.
29. DIRSCH V.M.; VOLLMAR A.M (2001). Ajoene, a natural product with non-
steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) - like properties? Biochem
Pharmacol; 61(5):587-93.
30. DIRSCH VM; ANTLSPERGER DS; HENTZE H; VOLLMAR A.M (2002).
Ajoene, an experimental anti-leukemic drug: mechanism of cell death.
Leukemia: 16(1):74-83.
31. ESPINOZA R; HERNANDEZ A; NARCISO J; GASTAÑAGA C; MOSCOSO
S; ORTIZ G.Determinants of blood . lead levels in children in callao and Lima
metropolitan area. Salud Pública Mex. 2003; 45 (spol 2): s209 – 19.
32. FANSWORTH NR; AKERELE OO; BINGEL AS; SOEJARTA DD; ENO Z.
Medicinal plants in therapy. Bulletin Worl Health Organization. 1985; 63: 965 –
981.
33. FLEISCHAUER AT; POOLE C; ARAB L (2000). Garlic consumption and
cancer prevention: meta-analyses of colorectal and stomach cancers. Am J Clin
Nutr; 72(4):1047-52.
Page 139
133
34. FLORES T, HAROLDO A.; ESTEVES G. JUDITH P. Efecto del extracto
hidroalcoholico del Allium sativum L. sobre la disfunción endotelial en ratas.
Universidad Católica de Santa María –Arequipa.
35. Florian D; Knapp G; Anal Ch; 2001,73 (7) ,1515 - 1520, disponible en:
http://www.s-prep.com/B83IE29A_Microwave-assissted_UV_Digestion.pdf.
36. GOYER RA. Lead toxicity: current concerns. Environ Health Perspect. 1993;
100: 177 – 87.
37. GRUDZINSKI IP; FRANKIEWICZ-JOZKO A; BANY J (2001). Diallyl sulfide
- - a flavor component from garlic (Allium sativum) attenuates lipid peroxidation
in mice infected with Trichinella spiralis. Phytomedicine; 8(3):174-7.
38. GUADALUPE G; VISTOR R; ISRAELA B; JIMENA S; MARTHA L;
CAMILO R; FEDERICO B. Cognitive déficits in adult rats by lead intoxication
are related with regional specific inhibition of cNOS. Science Direct. 2004; 149:
49 – 59.
39. GUNTER HENZE, “Introduction to polarography and voltammetry”, Methrom
Ltd.CH-9101 Herisau.
40. HAIYAN Z; YINGNAN J; ZHENYAN H; MI M. Cadmium accumulation and
oxidative burst in garlic (Allium sativum). Journal of Plant Physiology.2005;
163: 977 – 984.Disponible en internet: www.elsevier.de/jplph .
41. HANAFY M; SHALABY M; ELFONLY M; ADBEL A; SOLIMAN O. Effects
of garlic on lead contents in chicken tissue. Dtsch. Tierarztl. Wochenschr. 1994,
101: 157 – 158.
42. HARVEY, D. DePauw University. “Modern Analytical Chemistry”, McGraw-
Hill Higher Education.2000, Pág. 508-520.SomenathMitra Department of
Chemistry and Environmental Science New Jersey institute of Technology,
Page 140
134
“Sample preparation techniques in analytical chemistry” John Wiley &
Sons,Inc.,publication,Vol.N°162,Pag:227-245.
43. HARVEY, D. DePauw University. Modern Analytical Chemistry. 2000.
44. HATTORI A; YAMADA N; NICHIKAWA T; FUKUDA H; FUJINO T (2002).
Protective effect of ajoene on acetaminophen-induced hepatic injury in mice.
Biosci biotechnol Biochem; 65(11).2555-7.
45. HECK AM; DEWITT BA; LUKES AL (2000). Potential interactions between
alternative therapies and warfarin. Am J Health Syst Pharm; 57(13):1221-7; quiz
1228-30.
46. HODGE G; HODGE S; HAN P (2002). Allium sativum (garlic) suppresses
leukocyte inflammatory cytokine production in vitro: potential therapeutic use in
the treatment of inflammatory bowel disease. Cytometry; 48(4):209-15.
47. HOFBAUER R; FRASS M; GMEINER B; KAYE AD; FROST EA (2001).
Effect of garlic extract (Allium sativum) on neutrophil migration at the cellular
level. Heath Dis; 3(1):14-7.
48. HORIE T; AWAZU S; ITAKURA Y; FUWA T (2001). Alleviation by garlic of
antitumor drug-induced damage to the intestine. J Nutr; 131(3s):1071S-4S.
49. IIMURO M; SHIBATA H; KAWAMORI T; MATSUMOTO T; ARAKAWA T;
SUGIMURA T; WAKABAYASHI K (2002). Suppressive effects of garlic
extract on Helicobacter pylori. Induced gastritis in Mongolian gerbils. Cancer
Lett; 187(1-2):61-8.
50. JANETH M; JUAN Q. Determinación de los niveles de plomo (II) en leche de
vacuno por Voltamperometría. Universidad Católica de Santa María. 2011
51. JONH A; WALTER C; MARIA DEL CARMEN C; MARTA L; ISELLE S;
TANIA O; JESSIE P; FELIX R. Intoxicación por plomo y otros problemas de
Page 141
135
salud en niños de poblaciones aledañas a relaves mineros. Rev. Perú Med Exp
Salud Publica.2009; 26(1): 15-19.
52. JOSLING P (2001). Preventing the common cold with a garlic supplement: a
double-blind, placebo-controlled survey. Adv. Ther; 18(4):189-93.
53. JUAN C, Alvarado. “Apuntes de Toxicología”,1º edición 2011
54. KANNAR D; WATTANAPENPAIBOON N; SAVIGE GS; WAHLQVIST ML
(2001). Hypocholesterolemic effect of an entericoated garlic supplement. J Am
Coll Nutr; 20(3):225-31.
55. KAYE AD; DE WITT BJ; ANWAR M; SMITH DE; FENG CJ; KADOWITZ
PJ; NOSSAMAN BD (2000). Analysis of responses of garlic derivatives in the
pulmonary vascular bed of the rat. J Appl Physiol; 89(1):353-8.
56. KEHOL, R. A.: The metabolism of lead in man in health and disease; lecture II.
Soc. R. Inst. Publ. Health High. 24, 120, 1961.
57. KOLLER K; SPURGEON A; LEVY L. Recent developments in low – level lead
exposure and intellectual impairment in children. 2004, 112, 987 – 994.
58. KU DD; ABDEL-RAZEK TT; SAI J; KIM.PARK S; FALLON MB; ABRAMS
GA (2002). Garlic and its active metabolite allicin produce endothelium and
nitric oxide-dependent relaxation in rat pulmonary arteries. Clin Exp Pharmacol
Physiol; 29(1-2):84-91.
59. KUETTNER EB; HILGENFELD R; WEIAA MS (2002). The active principle of
garlic at atomic resolution. J. Biol Chem; 277(48)46402-7.
60. LANPHEAR, B. P.; DIETRICH, K.; ANINGER, P.; Y COX, C.: Cognitive
deficits associated with blood lead concentrations < 10 nanograms % in U.S.
children and adolescents. Public Health Rep., 115, 521 – 529, 2000.
Page 142
136
61. LASLEY SM; GREEN MC; GILBERT ME. Rat hippocampal NMDA receptor
binding as a function of chronic lead exposure level. Neurotoxicol teratol. 2001;
23: 185 – 9.
62. LAU BH (2001). Suppression of DLD oxidation by garlic. J Nutr; 131(3s):985S-
8S.
63. LAUWERYS, R.: Toxicology Industrially et Intoxications Professionals, 2°. Ed.
Masson, Paris, 1982.
64. LEDEZMA E; JORQUERA A; BENDEZU H; VIVAS J; PEREZ G (2002).
Antiproliferative and leishmanicidal effect of ajoene on various Leishmania
species: ultrastructural study. Parasitol Res; 88(8):748-53.
65. LEDEZMA E; MARCANO K; JORQUERA A; DE SAUSA L; PADILLA M;
PULGAR M; APITZ-CASTRO R (2000). Efficacy of ajoene en the treatment of
Tinea pedís: a double-bild and comparative study with terbinafine. J Am Acad
Dermatol; 43(5Pt 1):829-32.
66. LI M; CIU JR; YE Y: MIN JM; ZHANG LH; WANG K; GARES M; CROS J;
WRIGHT M; LEUNG-TACK J (2002). Antitumoractivity of Z-ajoene, a natural
compound purifiel from garlic antimitotic and microtubule-interaction properties.
Carcinogenesis; 23(4)573-9.
67. LI M; MIN JM; CUI JR; ZHANG LH; WANG K; VALETTE A; DAVRINCHE
C; WRIGHT M; LEUNG-TACK J (2002). Z-ajoene induces apoptosis of HL-60
cells: involment of Bcl-2 cleavage; Nutr Cancer; 42(2):241-7.
68. LIU L; YEH YY (2000). Inhibition of cholesterol biosynthesis by organosulfur
compounds derived from garlic. Lipids; 35(2):197-203.
69. LIU L; YEH YY (2001). Water-soluble organosulfur compounds of garlic inhibit
fatty acid and triglyceride syntheses in cultured rat hepatocytes. Lipid;
36(4):395-400.
Page 143
137
70. LIU L; YEH YY (2002). S-alk (en) yl cysteines of garlic inhibit cholesterol
synthesis by deactivating HMG-CoA reductase in cultured rat hepatocytes J
Nutr; 132(6): 1129-34.
71. LOCKITCH G. Perspectives on lead toxicity. Clin Biochem. 1993; 26: 371 – 81.
72. LOPEZ, JORGE; LAZARTE, CESAR (1997). Tratamiento dietético con alicina
en la gastritis crónica por Helicobacter pylori en el Hospital IPSS Tacna Rev.
Med. Inst. Perú. Segur. Soc; 6(3/4):20-4.
73. LUO R; DONG Y; FANG F (2001). The experimental study of the anti-
enterovirus effects of drug in vitro. Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du
Xue Za Zhi; 15(2):135-8.
74. M.GRAC, A. DE KORN, E. SANTOS DA BOA, D.C.MUNIZ,
J.TEIXEIRA,J.PEREIRA, A. PAIXA, A. PIRES, B.WELZ, W. P. CARVALHO,
E. BATISTA Y M. KORN; “Sample Preparation for the Determination of Metals
in Food Samples Using Spectroanalytical Methods - A Review”; Applied
Spectroscopy Reviews, vol:43,Nº2, pag.67-92,2008. Disponible en internet:
http://libra.msra.cn/Publication/26978070/sample-preparation-for-the-
determination-of-metals-in-food-samples-using-spectroanalytical-methods
75. MANTAWY MM; MAHMOUD AH (2002). Effect of Allium cepa and Allium
sativum feeding on glucose, glycogen, protein bands profile and phenol oxidase
activity in Biomphalaria alexandriba. J Egypt Soc Parasitol; 32(1):271-83.
76. MASSADEH AM; AL-SAFI; MAMONI IF; ALOMARY AA; JARADAT QM;
ALKOFAHI AS. Garlic (Allium sativum L.) as a potential antidote for cadmium
and lead intoxication: cadmium and lead distribution and analysis in different
mice organs. Biol Trace Elem Res. 2007; 120: 227 – 34.
77. MATSUURA H (2001). Saponins in garlic and modifiers of the risk of
cardiovascular disease. J Nutr; 131(3s):1000S-5S.
Page 144
138
78. MERCE C; ANTONI F; ROIG N; CARLOS M. Motro behavior and brain
enzymatic changes after acute lead intoxication on different strains of mice.
Science Direct. 2003; 74:2009 – 2021.
79. MICHALAK E; WIERZBICLA M.Differences in lead tolerance between Allium
sativum cepa plants developing from seeds and bulbs. Plant Soil. 1998; 1999:
251 – 60.
80. MOERIRA GE; ROSA GJ; BARROS SB; VASSILIEFF VS; VASSILIEFF I.
Antioxidant defense in rat brain regions after developmental knead exposure.
Toxicology. 2001; 169 (2): 145 – 51.
81. MORAN B.; NORMA J.; Álvarez B. SANDRA M. 1991. Actividad
antibacteriana in vitro del 2-propentiosulfinato de alilo del Allium sativum L.
(extracto acuoso en cepas de Salmonellas: tiphy, paratiphy A y paratiphy B.)
82. MORIGUCHI T; TAKASUGI N; ITAKURA Y (2001). The effects of aged
garlic extract on lipid peroxidation and the deformability of erythrocytes. J Nutr;
131(3s): 1016S-9S.
83. NAGANAWA RIE, NAMI IWATA. KEIKO ISHIKAWA. HIROYUKI
FUKUDA, TSUCHIYOSHI FUJINO and ATSUSHI SUZUKI. 1996 Inhibition
of Microbial growth by ajoeno, a sulfur containing compound derived from
garlic. Applies and Environmental Microbiology. Nov. 1996. P. 4238-4242.
American Society for Microbiology.
84. NAIK G; PRIYADARSINIK; SATAV J; BANAVALIKAR M; SOHANI D;
BIYANI M; MOHAN H. Comparative antioxidant of individual herbal
components used in ayurvedic medicine. Phytochemistry. 2003; 63: 97 – 104.
Page 145
139
85. NAJAR – NEZHAD V; ASLANI MR; BALALI – MOOD M. Evaluation of
allicin for the treatment of experimentally induced subacute lead poisoning in
sheep. Biol Trace Elem Res. 2008; 126: 141 – 7.
86. NAKAGAWA H; TSUTA K; KIUCHI K; SENZAKI H; TANAKA K; HIOKI
K; TSUBURA A (2001). Growth inhibitory effects of diallyl disulfide on human
breast cancer cell lines. Carcinogenesis; 22(6):891-7.
87. NEEDLEMAN H. Lead poisoning. Annual Review of biochemistry. 2004, 55.
209 – 222.
88. O´GARA E.A., D.J. HILL and D.J. MASLIN. 2000. Activities of garlic oil,
garlic powder ant their diallyl constituents against Helicobacter pylori. Appl.
Environ. Microbiol. 66: 2269-2273. American Society for Microbiology.
89. ORTIZ, R. MARTINEZ, Y.; Laboratorio de Análisis Instrumental. Universidad
de los Andes. Facultad de ciencias. Departamento de Química. Prácticas de
Electroanalítica. Disponible en Internet:
http://webdelprofesor.ula.ve/ciencias/ymartin/index_archivos/Guia%20de%20ins
trumental.pdf
90. PAYTON M; RIGGS K; SPIRO A; WEISS S; HU H. Relations of bone and
blood lead to cognitive function: the VA normative aging sturdy. Neurotoxicol
Teratol. 1998; 20: 19 – 27.
91. PEBE G; VILLA H; ESCATE L; CERVANTES G. Niveles de plomo sanguíneo
en recién nacidos de la Oroya, 2004 – 2005. Rev. Perú Med Exp Salud Pública.
2008; 25(4): 355 – 60.
92. PEDRAZA-CHAVERRI J; MALDONADO PD; MEDIN-CAMPOS ON;
OLIVARES.CORICHI IM; GRANADOS.SILVESTRE M; HERNANDEZ-
PRADO R; IBARRA-RUBIO ME (2000). Garlic ameliorates gentamicin
Page 146
140
nephrotoxicity: relation to antioxidant enzymes. Free Radic Biol Med;
29(7):602-11.
93. PINTO JT; RIVLIN RS (2001). Antiproliferative effects of allium derivatives
from garlic. J Nutr; 131(3s):1058s-60s.
94. RABINOWITZ, M. B.; WERTHERILL, G. V., Y KOPPLE, J. M.: Kinetic
analysis of lead metabolism in healthy humans. J. Clin, Invest., 58, 260, 1976.
95. RAHMY TR; HEMMAID KZ (2001). Prophylactic action of garlic on the
histological and histochemical patterns of hepatic and gastric tissues in rats
injected with a snake venom. J Nat Toxins; 10(2)137-65.
96. RAMIREZ AV; CAM J; MEDINA JM. Plomo sanguíneo en los habitantes de
cuatro localidades peruanas. Rev. Panamá Salud Pública. 1997; 1(5): 344 – 48.
97. RENDON R; CERBON S; MALDONADO V; QUINTANAR E; CALDERON
S. Vitamin – E reduces the oxidative damage on ∂ – aminolevulinic dehydratase
induced by lead intoxication in rat erythrocytes.ScienceDirect – Toxicology in
vitro. 2007, 1121 – 1126.
98. Richard W. Equilibrio y Análisis Químico. Ed. México.140-141.
99. ROBERT V; MOUILLE B; MAYEUR C; MICHAUD M; BLACHIER F (2001).
Effects of the garlic compound diallyl disulfide on the metabolism, adherence
and cell cycle of HT-29 colon carcinoma cells: evidence of sensitive and
resistant sub-populations. Carcinogenesis; 22(8):1155-61.
100. ROSS Z., E.A. O´GARA, D,J, HILL, H.V. SLEIGHTHOLME, and D.J.
MASLIN. 2000. Antimicrobial Properties of garlic oil against human enteric
bacteria: evaluation of Methodologies and comparisons with garlic oil sulfides
and garlic power. Applied and Environmental Microbiology. Jan. 2001. p. 475-
480. American Society for Microbiology.
Page 147
141
101. SALINAS MENESES DELSY SANDRA. 1989. Efecto antifungico del
Allium sativum L. (ajo). Universidad Católica de Santa María –Arequipa.
102. SENAPATI S; DEY S; DWIVEDI S; SWARUP D. Effects of garlic
(Allium sativum L.) extract on tissue lead level in rats J. ethnopharmacol. 2001.
76: 229 – 232.
103. SENAPATI SK; DEY S; AWIVEDI SK: SWARUP D (2001). Effect of
garlic (Allium sativum L.) extract on tissue lead level in rats. J Ethnopharmacol;
76(2)229-32.
104. SINA K; MAHDI B; SEYED R; VALIOLLAH M; MAHMOUND S;
BITA D; OMID R; MOHAMMAD T. Comparison of therapeutic effect of garlic
and D-Penicillamine in patients with chronic occupational lead poisoning. Basic
& Clinical & toxicology. 2012, 110, 476 – 481.
105. SLOWING K; GANADO P; SANZ M; RUIZ E; TEJERINA T (2001).
Study of garlic extracts and fractions on cholesterol plasma levels and vascular
reactivity in cholesterol-fed rats. Nutr; 131(3s):994S-9S.
106. Somenath M. Department of Chemistry and Environmental Science New
Jersey institute of Technology, “Sample preparation techniques in analytical
chemistry” John Wiley & Sons,Inc.,publication,Vol.N°162,Pag:227-245.
107. SOVOVA M; SOVA P; MRAZOVA A (2002). Pharmaceutical
importance of Allium sativum L. 3. Antibacterial effects on Helicobacter pylori.
Ceska Slov Farm; 51(4):168.
108. STEINER M; LI W (2001). Aged garlic extract, a modulator of
cardiovascular risk factors: a dose-finding study on the effects of AGE on
platelet functions. J Nurt; 131(3s):980S-4S.
Page 148
142
109. SUMIOKA I; MATSURA T; YAMADA K (2001). Therapeutic effect of
S-allylmercaptocysteine on acetaminophen-induced liver injury in mice. Eur J
Pharmacol; 433(2-3):177-85.
110. TOSACANO CD; GUILLARTE TR. Lead neurotoxicity: from exposure
to molecular effects. Brain res brain. 2005; 49: 529 – 54.
111. TSAO S; YIN M (2001). In vitro activity of garlic oil and four diallyl
sulphides against antibiotic-resistant Pseudomonas aeruginosa and Klebsiella
pneumonia. J Antimicrobial Chemother; 47(5):665-70.
112. TSAO SM; YIN MC (2001). In-vitro antimicrobial activity of four diallyl
sulphides occurring naturally in garlic and Chinese leek oils. J Med Microbiol;
50(7):646-9.
113. UKWUEMEKA R; MAGDALENE I; IMARIA A; JOSHUA O;
DAMIAN C; BUKOLA O; DANIEL U; MOSES O. Comparative analysis on the
effect of licopersicon esculentum (tomato) in reducing cadmium, mercury and
lead accumulation in liver. Food and Chemical Toxicology. 2012; 50: 2070 –
2073. Disponible en internet www.com/locate/foodchemtox .
114. VEENA S; ARTI S; LEENA K. The effect or oral administration of
Allium sativum extracts on lead nitrate induced toxicity in male mice. Food and
Chemical Toxicology. 2010; 48: 928 - 936. Disponible en internet
www.com/locate/foodchemtox.
115. VEGA D; SALINAS P; GUTIERREZ C; PONCE C. Lead level and
cognitive abilities in Peruvian children. Rev Bras Psiquiatr. 2006; 28 (1): 33 –
39.
116. VEGA J; DE COLL J; KATEKARU D; LERMO J; ESCOBAR J; DIAZ
M. Intoxicación plúmbica crónica y alteraciones del crecimiento y desarrollo
cognitivo – emocional en niños. An Fac Med (Lima). 2003; 64 (2): 94 – 100.
Page 149
143
117. VILLANUEVA SALAS JOSE A. 1989. Principios activos, propiedades
medicinales y factibilidad de uso del Allium sativum L. (ajo) como agente
terapéutico. Universidad Católica de Santa María-Arequipa.
118. VILLANUEVA, J., PACHECO L. 1988. Valoración química y
determination de la actividad antibacteriana “in vitro” del 2-propentiosulfinato de
alilo: ALICINA del Allium sativum L. (ajo) frente a bacterias aisladas de
infecciones urinarias en paciente ambulatorios- Hospital central del Sur – Área I.
Universidad Católica de Santa María-Arequipa.
119. VILLEDA H; BARROSO R; MENDEZ M; NAVA C; HUERTA R;
RIOS C. Enhanced barín regional lipid peroxidation in developing rats exposed
to low level lead acetate. Brain Res Bull. 2011: 55 (2): 247 – 51.
120. WILSON MA; JOHNSTON MV, GOLDSTEIN GW; BLUE M. Neonatal
lead exposure impairs development of rodent barrel field cortex. Proc Natl Acad
Sci USA. 2000; 97: 5540 – 5.
121. WU CC; SHEEN LY; CHEN HW; KUO WW; TSAI SJ; LII CK (2002).
Differential effects of garlic oil and its major organosulfur component on the
hepatic detoxification system in rats. Agric Food Chem; 50(2):378-83.
122. YANG CS; CHHABRA SK; HONG JY; SMITH TJ (2001). Mechanisms
of inhibition of chemical toxicity and carcinogenesis by diallyl sulfide (DAS)
and related compound from garlic. J Nutr; 131(3s):1041S-5S.
123. YEH YY; LIU L (2001).Cholesterol-lowering effect of garlic extracts and
organosulfur compounds: human and animal studies. J Nutr; 131(3s):989S-93S.
124. ZHANG XH; LOWE D; GILES P; FELL S; CONNOCK MJ; MASLIN
DJ(2001). Gender may affect the action of garlic oil on plasma cholesterol and
glucose levels of normal subjects. J Nutr; 131(5):1471-8.
Page 150
144
125. ZIAEI S; HANTOSHZADEH S; REZASOLTANI P; LAMYIAN M
(2001). The effect of garlic tablet on plasma lipids and platelet aggregation in
nulliparous pregnants at high risk of preeclampsia. Eur J Obstet Gynecologic
reprod Biol; 99(2):201-6.
126. Z ZGISBERT CALABUIG, Juan Antonio; E. VILLANUEVA Cañadas.
Medicina Legal y Toxicología. Sexta edición. España: 2001: p. 835 – 850.
Page 152
ANEXOS
Anexo 1: Extracción de muestras sanguíneas.
Anexo 2: Administración vía oral.
Page 153
An
exo 3
: P
esos
de
los
an
imale
s d
e ex
peri
men
taci
ón
.
AM
BIE
NT
AC
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T
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TA
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NT
O
GR
UP
OS
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ES
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DIO
MA
RC
A
Sem
an
a 1
Sem
an
a 2
Sem
an
a 3
Sem
an
a 4
Sem
an
a 5
Sem
an
a 6
Sem
an
a 7
Sem
an
a 8
CONTROL
NEGATIVO
CA
273.5
281.0
277.0
273.5
275.0
2
74
.5
27
6.0
2
75
.0
PA
I 270.5
273.5
272.5
273.5
275.5
2
71
.5
26
9.5
2
73
.5
PA
D-P
AI
281.5
284.0
279.0
275.0
273.5
2
76
.0
27
4.5
2
75
.0
PP
D
279.0
280.0
282.0
280.0
281.0
2
79
.0
28
3.5
2
82
.5
PP
I 270.5
278.0
275.5
274.0
276.5
2
73
.5
27
1.5
2
74
.5
PP
D-P
PI
271.5
279.0
281.0
277.0
276.0
2
75
.5
27
4.5
2
75
.5
CONTROL
POSITIVO
CA
273.5
269.0
273.0
276.0
271.5
2
73
.5
27
1.5
2
72
.0
LO
279.0
276.5
278.0
279.0
270.0
2
75
.0
27
4.0
2
76
.0
CO
273.0
273.0
273.0
273.5
271.5
2
73
.0
27
3.0
2
79
.5
PA
D
273.5
279.0
275.5
270.0
268.5
2
73
.0
27
5.0
2
74
.0
PA
I 273.5
279.0
273.0
273.0
262.5
2
75
.0
27
1.5
2
73
.0
PA
D-P
AI
279.0
275.0
273.0
276.0
264.5
2
73
.0
27
4.0
2
75
.0
PREVENTIVO
CA
- L
O
279.0
282.0
279.0
270.0
271.5
2
72
.0
27
1.5
2
65
.0
CA
-LO
-CO
271.0
279.5
277.0
269.5
270.0
2
69
.0
26
7.0
2
64
.5
LO
270.5
278.0
274.5
270.0
270.0
2
71
.5
27
0.0
2
60
.5
CO
-PA
I 270.0
273.5
276.0
268.0
271.5
2
72
.0
27
0.5
2
67
.0
PP
I 272.5
279.0
274.5
267.0
269.0
2
68
.0
26
6.5
2
66
.5
PP
I-P
PD
269.0
273.0
275.0
269.5
267.0
2
68
.5
26
6.0
2
60
.0
CURATIVO
CA
273.5
278.0
276.0
273.0
270.0
2
69
.0
27
0.5
2
65
.5
CA
-CO
278.0
273.5
279.5
273.5
269.5
2
68
.0
27
0.0
2
68
.0
LO
273.0
279.0
273.0
270.0
271.5
2
72
.0
26
8.0
2
62
.0
CO
275.0
276.0
279.5
269.0
272.0
2
73
.5
26
9.0
2
66
.5
PP
D
279.5
271.5
273.0
271.5
273.0
2
72
.0
26
8.5
2
63
.0
PP
I 273.0
276.0
278.0
276.0
276.5
2
78
.0
27
6.0
2
69
.5
Page 154
Anexo 4: Rack de tubos de cuarzo y digestor UV.
a) b)
c)
Cambios en la muestra durante el proceso de digestión UV; a) muestra más
agua; b) muestra con peróxido de hidrógeno y ácido nítrico y c) muestras
sanguíneas 1ra
hora de después de la digestión.
Page 155
Anexo 5: Rack de vaso del digestor a presión y horno microondas.
a)
b)
c)
a) Proceso de pre digestión; b) bombas de digestión; c) horno microondas
Page 156
Anexo 6: Parámetros voltamétricos para la determinación de sangre y órganos.
Page 157
An
exo 7
: C
on
cen
tra
cio
nes
fin
ale
s d
e p
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n m
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tras
san
gu
ínea
s.
DÍA
1
DÍA
5
DÍA
10
D
ÍA 1
5
DÍA
20
D
ÍA 2
5
DÍA
30
D
ÍA 3
5
DÍA
40
GR
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MA
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A
CF
mg
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DS
±
CF
mg
/L
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±
CF
mg/L
DS
±
CF
mg/L
DS
±
CF
mg/L
DS
±
CF
mg/L
DS
±
CF
mg/L
DS
±
CF
mg/L
DS
±
CF
mg/L
DS
±
CONTROL NEGATIVO
CA
0
.84
7
0.0
35
0
.808
0.0
30
0.8
59
0.0
40
0.9
07
0.0
32
0.8
35
0.0
21
0.8
23
0.0
50
0.8
29
0.0
24
0.7
69
0.0
17
0.7
48
0.0
23
PA
I 1
.01
7
0.0
27
0
.937
0.0
43
0.9
37
0.0
20
0.9
53
0.0
26
0.9
51
0.0
70
0.9
22
0.0
20
0.9
50
0.0
16
0.9
45
0.0
28
0.9
89
0.0
40
PA
D-P
AI
1.0
35
0
.04
5
0.9
84
0.0
26
0.9
74
0.0
52
0.9
42
0.0
26
0.9
57
0.0
48
1.0
09
0.0
27
0.9
61
0.0
46
0.9
52
0.0
26
1.0
59
0.0
18
PP
D
0.9
08
0
.03
2
0.9
37
0.0
71
0.8
78
0.0
29
0.9
50
0.0
18
0.8
94
0.0
26
0.7
97
0.0
09
0.8
34
0.0
30
0.7
86
0.0
28
0.7
69
0.0
21
PP
I 0
.95
4
0.0
28
0
.937
0.0
32
0.9
03
0.0
32
0.9
10
0.0
18
0.9
41
0.0
21
0.9
29
0.0
18
0.9
04
0.0
34
0.9
41
0.0
21
0.8
85
0.0
21
PP
D-P
PI
0.8
56
0
.04
1
0.8
48
0.0
14
0.8
52
0.0
18
0.8
08
0.0
43
0.8
75
0.0
28
0.8
51
0.0
30
0.8
69
0.0
53
0.8
35
0.0
26
0.8
56
0.0
41
pro
med
io
0.9
36
0
.03
5
0.9
08
0.0
36
0.9
01
0.0
32
0.9
12
0.0
27
0.9
08
0.0
35
0.8
88
0.0
26
0.8
91
0.0
34
0.8
71
0.0
24
0.8
84
0.0
27
PR
OM
. -
DS
0
.93
6
0.0
80
0
.908
0.0
66
0.9
01
0.0
48
0.9
12
0.0
54
0.9
08
0.0
49
0.8
88
0.0
79
0.8
91
0.0
57
0.8
71
0.0
85
0.8
84
0.1
22
CONTROL POSITIVO
CA
0
.75
7
0.0
22
0
.757
0.0
22
2.1
07
0.1
18
1.6
50
0.0
78
1.3
56
0.1
65
1.2
77
0.0
60
1.1
41
0.0
48
1.1
33
0.0
97
1.1
46
0.0
42
LO
0
.77
4
0.0
27
0
.774
0.0
27
3.8
70
0.1
27
3.5
24
0.1
91
2.3
66
0.3
52
1.8
22
0.0
41
1.7
69
0.0
48
1.6
26
0.0
23
1.5
17
0.0
29
CO
0
.96
9
0.0
26
0
.969
0.0
26
2.6
62
0.0
88
1.9
12
0.0
77
1.6
12
0.1
91
1.5
62
0.0
43
1.4
50
0.0
22
1.3
49
0.0
26
1.1
71
0.0
32
PA
D
0.9
31
0
.02
1
0.9
31
0.0
21
2.4
78
0.0
99
2.3
50
0.0
71
1.8
60
0.2
35
1.7
43
0.0
80
1.4
61
0.0
66
1.4
25
0.0
14
1.3
50
0.0
39
PA
I 0
.87
0
0.0
32
0
.870
0.0
32
2.6
39
0.1
01
2.1
62
0.0
67
1.8
61
0.2
16
1.8
37
0.0
48
1.4
09
0.0
58
1.1
58
0.0
18
1.1
60
0.0
45
PA
D-P
AI
0.8
29
0
.02
2
0.8
29
0.0
22
2.6
65
0.1
04
2.1
33
0.0
62
1.8
61
0.2
13
1.4
09
0.0
55
1.3
70
0.0
28
1.3
50
0.0
29
1.3
42
0.0
42
pro
med
io
0.8
55
0
.02
5
0.8
55
0.0
25
2.7
37
0.1
06
2.2
88
0.0
91
1.8
19
0.2
29
1.6
08
0.0
54
1.4
33
0.0
45
1.3
40
0.0
34
1.2
81
0.0
38
PR
OM
. -
DS
0
.85
5
0.0
85
0
.855
0.0
85
2.7
37
0.5
94
2.2
88
0.6
51
1.8
19
0.3
35
1.6
08
0.2
31
1.4
33
0.2
02
1.3
40
0.1
82
1.2
81
0.1
48
PREVENTIVO
CA
-LO
1
.01
2
0.0
41
0
.263
0.0
27
3.6
08
0.1
36
1.1
00
0.0
63
0.5
81
0.0
20
0.4
26
0.0
22
0.3
22
0.0
12
0.2
00
0.0
10
0.2
30
0.0
17
CA
-LO
-CO
1
.04
6
0.0
28
0
.335
0.0
26
3.4
71
0.1
36
1.1
98
0.0
46
0.5
16
0.0
29
0.4
43
0.0
19
0.2
64
0.0
21
0.1
02
0.0
29
0.2
14
0.0
30
LO
0
.85
7
0.0
21
0
.266
0.0
16
4.0
18
0.0
81
1.0
72
0.0
35
0.6
56
0.0
24
0.5
40
0.0
19
0.2
31
0.0
11
0.1
16
0.0
19
0.1
57
0.0
30
CO
-PA
I 0
.95
0
0.0
32
0
.223
0.0
20
2.4
14
0.1
22
1.1
35
0.0
57
0.8
69
0.0
47
0.4
21
0.0
21
0.2
52
0.0
19
0.2
24
0.0
14
0.2
10
0.0
10
PP
I 0
.89
1
0.0
28
0
.268
0.0
16
2.6
09
0.1
67
0.8
08
0.0
53
0.4
88
0.0
21
0.3
04
0.0
19
0.2
63
0.0
09
0.1
72
0.0
30
0.2
19
0.0
15
PP
I-P
PD
0
.86
2
0.0
36
0
.305
0.0
19
4.8
55
0.0
71
0.8
29
0.0
37
0.7
92
0.0
45
0.5
19
0.0
50
0.3
22
0.0
18
0.1
23
0.0
28
0.1
21
0.0
18
pro
med
io
0.9
36
0
.03
1
0.2
77
0.0
21
3.4
96
0.1
19
1.0
23
0.0
48
0.6
50
0.0
31
0.4
42
0.0
25
0.2
76
0.0
15
0.1
56
0.0
22
0.1
92
0.0
20
PR
OM
. -
DS
0
.93
6
0.0
80
0
.277
0.0
39
3.4
96
0.9
04
1.0
23
0.1
65
0.6
50
0.1
53
0.4
42
0.0
84
0.2
76
0.0
38
0.1
56
0.0
50
0.1
92
0.0
43
CURATIVO
CA
0
.97
9
0.0
59
0
.979
0.0
59
2.2
25
0.0
83
1.1
53
0.0
63
0.9
79
0.0
26
0.6
69
0.0
40
0.5
81
0.0
30
0.3
99
0.0
17
0.3
57
0.0
20
CA
-CO
0
.86
1
0.0
49
0
.861
0.0
49
3.1
87
0.2
01
1.2
11
0.0
48
0.5
59
0.0
26
0.4
65
0.0
30
0.4
13
0.0
22
0.3
44
0.0
12
0.3
07
0.0
19
LO
0
.87
3
0.0
22
0
.873
0.0
22
2.6
97
0.0
68
1.2
30
0.0
42
0.5
55
0.0
39
0.3
90
0.0
18
0.3
33
0.0
24
0.3
16
0.0
18
0.3
01
0.0
20
CO
0
.95
1
0.0
29
0
.951
0.0
29
2.6
55
0.1
56
0.8
36
0.0
32
0.4
68
0.0
21
0.3
63
0.0
31
0.3
39
0.0
16
0.1
89
0.0
15
0.1
87
0.0
31
PP
D
0.9
74
0
.02
6
0.9
74
0.0
26
2.2
45
0.1
82
0.8
98
0.0
56
0.5
63
0.0
19
0.5
29
0.0
29
0.3
77
0.0
28
0.3
44
0.0
15
0.3
04
0.0
26
PP
I 0
.82
6
0.0
26
0
.826
0.0
26
2.9
54
0.1
02
0.9
43
0.0
35
0.6
19
0.0
29
0.3
00
0.0
14
0.2
53
0.0
19
0.2
62
0.0
19
0.2
55
0.0
26
pro
med
io
0.9
11
0
.03
5
0.9
11
0.0
35
2.6
61
0.1
32
1.0
45
0.0
46
0.6
24
0.0
27
0.4
52
0.0
27
0.3
83
0.0
23
0.3
09
0.0
16
0.2
85
0.0
24
PR
OM
. -
DS
0
.91
1
0.0
65
0
.911
0.0
65
2.6
61
0.3
81
1.0
45
0.1
73
0.6
24
0.1
81
0.4
52
0.1
33
0.3
83
0.1
11
0.3
09
0.0
74
0.2
85
0.0
58
Page 158
An
exo 8
: E
xtr
acci
ón
y a
lmacen
am
ien
to d
e órg
an
os.
Page 159
Anexo 9: Peso en gramos de los órganos después de la extracción.
GRUPOS
DE
ESTUDIO
ORGANOS
Hígado Bazo Riñón
CO
NT
RO
L
PO
SIT
IVO
CA 7.874 0.441 1.700
LO 5.624 0.300 1.313
CO 7.462 0.398 1.791
PAD 7.520 0.395 1.656
PAI 6.222 0.347 1.315
PAD-I 6.704 0.396 1.357
PROM 6.901 0.380 1.522
DS 0.869 0.049 0.217
CO
NT
RO
L
NE
GA
TIV
O CA 4.851 0.345 1.3499
PAI 4.730 0.3556 1.2205
PAD-I 6.024 0.3728 1.6155
PPD 6.920 0.5082 1.9755
PPI 6.436 0.3384 1.7437
PPD-I 8.777 0.4665 2.024
PROM 6.290 0.398 1.655
DS 1.495 0.072 0.326
PR
EV
EN
TIV
O CA-LO 5.278 0.401 1.401
CA-LO-CO 7.449 0.459 1.921
LO 5.951 0.305 1.492
CO-PAI 8.423 0.516 2.222
PPI 5.558 0.446 1.420
PPD-I 5.684 0.383 1.328
PROM 6.390 0.418 1.631
DS 1.255 0.073 0.359
CU
RA
TIV
O CA 6.951 0.503 1.635
CA-CO 6.783 0.377 1.593
LOMO 6.997 0.523 1.423
COLA 6.439 0.405 1.684
PPD 6.535 0.481 1.497
PPI 4.610 0.290 1.230
PROM 6.386 0.430 1.510
DS 0.898 0.089 0.167
Page 160
An
exo 1
0:
Con
cen
tra
cion
es f
inale
s d
e p
lom
o e
n h
ígad
o b
azo
y r
iñón
.
OR
GA
NO
S
GR
UP
OS
D
E
ES
TU
DIO
MA
RC
A
BA
ZO
R
IÑÓ
N
HIG
AD
O
CF
µg/g
D
SF
±
CF
µg/g
D
SF
±
CF
µg/g
D
SF
±
CONTROL
NEGATIVO
CA
0.9
07
0.0
91
1.5
35
0.0
76
1.7
80
0.0
75
PA
I 0.5
46
0.0
74
1.3
44
0.1
90
0.0
09
0.0
03
PA
D-P
AI
0.6
55
0.0
67
0.0
10
0.0
03
0.9
11
0.1
54
PP
D
1.3
63
0.1
37
0.3
93
0.1
92
0.0
08
0.0
02
PP
I 0.7
80
0.1
84
0.0
12
0.0
04
0.0
09
0.0
03
PP
D-P
PI
0.3
25
0.0
98
2.0
51
0.2
67
0.0
11
0.0
03
CONTROL
POSITIVO
CA
3.9
59
0.1
82
2.2
73
0.0
88
5.1
60
0.2
83
LO
1.4
31
0.2
01
2.1
83
0.1
30
3.9
21
0.1
23
CO
2.1
95
0.0
85
5.4
40
0.1
81
5.2
85
0.6
00
PA
D
1.4
26
0.1
43
0.7
33
0.0
74
6.3
64
0.3
72
PA
I 2.1
36
0.1
25
0.2
60
0.1
54
3.9
59
0.0
74
PA
D-P
AI
0.7
52
0.0
60
2.5
02
0.1
38
5.4
92
0.1
17
PREVENTIVO
CA
- L
O
2.5
06
0.1
09
2.2
39
0.0
99
0.9
25
0.0
63
CA
-LO
-CO
0.6
62
0.0
86
2.2
93
0.0
84
0.6
37
0.1
02
LO
0.8
68
0.0
65
0.0
10
0.0
03
0.0
13
0.0
04
CO
-PA
I 1.0
09
0.0
68
2.9
80
0.1
60
0.0
11
0.0
03
PP
I 0.3
96
0.0
86
3.7
64
0.3
33
2.3
39
0.1
45
PP
I-P
PD
0.6
61
0.0
56
2.7
84
0.1
14
0.9
26
0.0
58
CURATIVO
CA
0.7
13
0.0
51
2.9
05
0.1
38
0.0
08
0.0
02
CA
-CO
0.8
62
0.0
86
3.0
37
0.0
83
2.3
29
0.0
88
LO
0.6
30
0.1
15
0.0
09
0.0
03
0.9
12
0.0
66
CO
0.6
14
0.0
53
2.3
70
0.1
04
2.1
15
0.0
74
PP
D
1.8
31
0.1
59
3.4
17
0.1
36
0.0
13
0.0
04
PP
I 1.0
90
0.0
73
3.7
38
0.2
88
0.0
12
0.0
03
