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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA

CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA

OBTENCIÓN DE XILANASA CON MICELIOS DE Penicillium corylophilum Y Aspergillus

terreus FERMENTADOS EN DESECHOS DE PIÑA Y MARACUYÁ.

TRABAJO DE GRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO

AUTOR: IAN ALBERTO CORTEZ CEVALLOS

TUTORA: ING. LORENA ELIZABETH VILLARREAL VILLOTA, M.Sc.

QUITO

2015

ii

APROBACIÓN DEL TUTOR

Certifico que el trabajo de grado titulado “OBTENCIÓN DE XILANASA CON MICELIOS DE

Penicillium corylophilum Y Aspergillus terreus FERMENTADOS EN DESECHOS DE PIÑA Y

MARACUYÁ.”, es original y ha sido desarrollada por el señor Ian Alberto Cortez Cevallos, bajo

mi dirección y conforme a todas las observaciones realizadas.

En la ciudad de Quito, a los veinte días del mes de Enero de 2015.

Ing. Lorena Elizabeth Villarreal Villota, M.Sc.

Tutor

iii

AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL

Yo, IAN ALBERTO CORTEZ CEVALLOS, en calidad de autor del trabajo de grado realizado

sobre OBTENCIÓN DE XILANASA CON MICELIOS DE Penicillium corylophilum Y

Aspergillus terreus FERMENTADOS EN DESECHOS DE PIÑA Y MARACUYÁ, por la

presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los

contenidos que me pertenecen o de parte de los que contiene esta obra, con fines estrictamente

académicos o de investigación.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización,

seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y

demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.

Quito, 20 de Enero de 2015.

_________________________

Ian Alberto Cortez Cevallos

CI: 171721854-7

[email protected]

mailto:[email protected]

iv

A mi familia, amigos y

profesores.

A todos quienes me brindaron

su cariño y apoyo durante

la realización de este trabajo.

Con humildad, mucho cariño

y respeto.

v

AGRADECIMIENTOS

A los profesores de la Facultad de Ingeniería Química, Ing. Lorena Villarreal y Dr. Ullrich

Stahl.

A los señores, André Gortaire, Ing. Pablo Londoño Larrea, Dr. Paul Gamboa, Ing. Carlos

Guepud y Bioq. Darwin Roldan por su apoyo en la realización del presente trabajo.

A la Universidad Central del Ecuador, la Facultad de Ingeniería Química y al Laboratorio de

Micología Aplicada.

vi

CONTENIDO

Pág.

LISTA DE TABLAS.................................................................................................................... x

LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. xi

LISTA DE GRÁFICOS ............................................................................................................. xii

LISTA DE ANEXOS ................................................................................................................ xiv

LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS .......................................................................... xv

RESUMEN ............................................................................................................................... xvi

ABSTRACT ............................................................................................................................. xvii

INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 1

1. MARCO TEÓRICO ................................................................................................................ 3

1.1. Enzimas. ............................................................................................................................... 3

1.1.1. Definición. ......................................................................................................................... 3

1.1.2. Clasificación de las enzimas.. ............................................................................................ 4

1.1.3. Enzimas Hidrolíticas o hidrolasas . .................................................................................. 4

1.2. Hemicelulosa ........................................................................................................................ 5

1.2.1. Conversión de la hemicelulosa........................................................................................... 6

1.2.2. Xilano. ................................................................................................................................ 7

1.3. Enzima hidrolítica xilanasa. .................................................................................................. 9

1.3.1. Clasificación de las xilanasas. ........................................................................................... 9

1.3.2. Funcionamiento de la xilanasa. ....................................................................................... 10

1.3.3. Microorganismos productores de xilanasa ...................................................................... 13

vii

1.3.3.1. Hongos productores de xilanasa. .................................................................................. 13

1.3.3.2. Bacterias productoras de xilanasa. ............................................................................... 15

1.3.4. Mecanismos de producción de xilanasa. .......................................................................... 15

1.3.4.1. Fermentación.. .............................................................................................................. 15

1.4. Aplicación de la xilanasa: Blanqueamiento de papel. ......................................................... 17

1.4.1. Proceso de blanqueo. ....................................................................................................... 17

1.4.1.1. Compuestos Organoclorados. ....................................................................................... 18

1.4.2. Alternativas menos contaminantes. .................................................................................. 18

1.4.2.1. En fases previa del blanqueo. ........................................................................................ 18

1.4.2.2. Alternativas a los métodos de blanqueo con cloro ........................................................ 19

1.4.3. Blanqueamiento con enzimas. .......................................................................................... 19

1.5. Selección del sustrato sólido y de la cepa en el Ecuador. ................................................... 20

1.5.1. Selección de la piña como sustrato sólido. ....................................................................... 20

1.5.2. Selección de la maracuyá como sustrato sólido. .............................................................. 22

1.5.3. Selección de cepa Aspergillus terreus y Penicillium corylophilum. ................................. 23

2. MARCO EXPERIMENTAL ................................................................................................. 24

2.1. Materiales y equipos ........................................................................................................... 24

2.2. Sustancias y reactivos ......................................................................................................... 25

2.3. Microorganismos. ............................................................................................................... 25

2.4. Diseño Experimental .......................................................................................................... 26

2.4.1. Codificación. .................................................................................................................... 26

2.4.2. Diagrama de flujo. ........................................................................................................... 28

2.5. Procedimiento. .................................................................................................................... 29

2.5.1. Acondicionamiento de sustratos sólidos........................................................................... 29

2.5.2. Preparación del inóculo. .................................................................................................. 29

2.5.3. Producción de la enzima xilanasa. ................................................................................... 30

2.5.4. Obtención del extracto crudo de enzimas. ........................................................................ 30

2.5.5. Determinación de la actividad enzimática de xilanasa. ................................................... 31

viii

2.5.5.1. Construcción de la curva de calibración. ..................................................................... 31

2.5.5.2. Protocolo ensayo actividad enzimática de xilanasa. ..................................................... 32

3. DATOS EXPERIMENTALES ............................................................................................. 34

3.1. Curva de calibración. ........................................................................................................... 34

3.2. Absorbancias obtenidas para cada ensayo. .......................................................................... 35

3.2.1. Ensayos combinación Penicillium corylophilum/Piña...................................................... 35

3.2.2. Ensayos combinación Apergillus terreus/Piña ................................................................. 36

3.2.3. Ensayos combinación Penicillium corylophilum/ Maracuyá ............................................ 36

3.2.4. Ensayos combinación Aspergillus terreus/ Maracuyá ...................................................... 37

3.3. Potencial de Blanqueamiento. ............................................................................................. 37

4. CÁLCULOS ......................................................................................................................... 38

4.1. Cálculos para la actividad enzimática de xilanasa. ............................................................. 38

4.1.1. Reordenamiento de ecuación de la curva y cálculo de la concentración de xilosa. ......... 38

4.1.2. Cálculo de unidades de actividad enzimática de xilanasa por gramo de sustrato. .......... 38

4.2. Cálculos para las pruebas estadísticas de análisis de varianza ANOVA, obtenida

mediante el programa SPSS ....................................................................................................... 39

4.2.2. Cálculo de los grados de libertad para el intergrupo e intragrupo o error de los

componentes. .............................................................................................................................. 40

4.2.3. Cálculo del cuadrado medio para el intergrupo e intragrupo o error de los

componentes. .............................................................................................................................. 40

5. RESULTADOS..................................................................................................................... 42

5.1. Resultados de la actividad enzimática de xilanasa de los ensayos de la combinación

Penicillium corylophylum/Piña. ................................................................................................. 42


Aspergillus terreus/Piña. ............................................................................................................ 45


Penicillium corylophilum/ Maracuyá. ........................................................................................ 49

ix


Aspergillus terreus/Maracuyá. ................................................................................................... 52

5.5. Rendimiento acumulado de la producción total de enzima. ................................................. 55

5.6. Resultados de las pruebas estadísticas de análisis de varianza ANOVA, obtenida

mediante el programa SPSS. ...................................................................................................... 55

5.6.1. Resultados de los análisis estadísticos de varianza y significación según cepa

seleccionada. .............................................................................................................................. 55

5.6.2. Resultado del análisis estadístico de varianza y significación según sustrato

seleccionado. .............................................................................................................................. 56

5.6.3. Resultado del análisis estadístico de varianza y significación según combinación

cepa/sustrato. .............................................................................................................................. 57

6. DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 60

7. CONCLUSIONES ................................................................................................................ 63

8. RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 65

CITAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................................................... 66

BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................................... 68

ANEXOS ................................................................................................................................... 69

x

LISTA DE TABLAS

Pág.

Tabla 1. Clasificación de las enzimas según el mecanismo de reacción. ...................................... 4

Tabla 2. Ejemplos de enzimas hidrolizantes de polisacáridos. ..................................................... 5

Tabla 3. Ventajas y desventajas entre fermentación en sustrato sólido y

fermentación sumergida ............................................................................................................. 17

Tabla 4. Producción Nacional de piña n el Ecuador ................................................................... 21

Tabla 5. Composición química de la piña en base seca .............................................................. 21

Tabla 6. Composición química de la maracuyá en base seca. ..................................................... 23

Tabla 7. Codificación para combinación Penicillium corylophilum/Piña ................................... 26

Tabla 8. Codificación para combinación Aspergillus terreus/Piña ............................................. 26

Tabla 9. Codificación para combinación Penicillium corylophilum/Maracuyá .......................... 27

Tabla 10. Codificación para combinación Aspergillus terreus/Maracuyá .................................. 27

Tabla 11. Preparación curva de calibración xilanasa. ................................................................. 31

Tabla 12. Curva de calibración para el ensayo de la actividad de la xilanasa. ............................ 34

Tabla 13. Absorbancias obtenidas en combinación Penicillium corylophilum/Piña ................... 35

Tabla 14. Absorbancias obtenidas en combinación Aspergillus terreus/Piña ............................. 36

Tabla 15. Absorbancias obtenidas en combinación Penicillium corylophilum/ Maracuyá ......... 36

Tabla 16. Absorbancias obtenidas en combinación Aspergillus terreus/ Maracuyá ................... 37

Tabla 17. Actividad enzimática de xilanasa de los ensayos de la combinación

Penicillium corylophilum/Piña ................................................................................................... 42


Aspergillus terreus/Piña ............................................................................................................. 46


Penicillium corylophilum/ Maracuyá ......................................................................................... 49


Aspergillus terreus/Maracuyá .................................................................................................... 52

Tabla 21. Análisis estadístico de varianza y significación según cepa seleccionada .................. 56

Tabla 22. Análisis de varianza y significación según sustrato seleccionado. .............................. 57

Tabla 23. Análisis de varianza y significación según combinación cepa-sustrato ...................... 58

Tabla 24. Resultados del potencial de blanqueamiento .............................................................. 59

xi

LISTA DE FIGURAS

Pág.

Figura 1. Mecanismo de reacción enzimática ............................................................................... 3

Figura 2. Estructura general de la pared celular de biomasa de origen vegetal. ............................ 6

Figura 3. Tratamiento químico para remoción de hemicelulosa de la biomasa. ........................... 6

Figura 4. Representación esquemática de molécula de xilano. ..................................................... 8

Figura 5. Estructura tridimensional glicosil hidrolasas. .............................................................. 10

Figura 6. Hidrólisis enzimática del xilano. ................................................................................. 11

Figura 7. Mecanismo de acción xilanasa. ................................................................................... 12

Figura 8. Hifas de hongo filamentoso ........................................................................................ 13

Figura 9. Partes de un hongo filamentoso .................................................................................. 14

Figura 10. Representación esquemática de proceso del blanqueamiento de pasta de

papel con xilanasa. ..................................................................................................................... 20

Figura 11. Micrografía a residuos de piña. [SPP] Sección de pared primaria indicando

la presencia de red de micro fibrillas de celulosa, una matriz de hemicelulosa que se disponen

en esta red. [HLP] Fibras largas ricas en lignina y otras en celulosa. ......................................... 22

Figura 12. Estructura pared celular de cascara de maracuyá. ..................................................... 23

Figura 13. Diagrama de flujo. .................................................................................................... 28

xii

LISTA DE GRÁFICOS

Pág.

Gráfico 1. Curva de calibración ensayo xilanasa. ...................................................................... 34

Gráfico 2. Actividad enzimática de xilanasa en función del tiempo de ensayo 1






Gráfico 5. Actividad enzimática de xilanasa en función del tiempo de ensayos

(Promedio) Penicillium corylophilum/Piña ................................................................................ 45




Aspergillus terreus/Piña. ............................................................................................................ 47




(Promedio) Aspergillus terreus/Piña .......................................................................................... 48


Penicillium corylophilum/ Maracuyá. ........................................................................................ 50


Penicillium corylophilum/Maracuyá. ......................................................................................... 50







xiii







Gráfico 18. Rendimiento acumulado de la producción de la enzima xilanasa

en función de los 19 días de experimentación. ........................................................................... 55

xiv

LISTA DE ANEXOS

Pág.

ANEXO A. Ficha técnica de endo-1,4-β Xilanasa (comercial) .................................................. 70

ANEXO B. Materiales y equipos utilizados para el acondicionamiento del sustrato ................. 71

ANEXO C. Materiales y equipos utilizados para construcción de curva calibración. ................ 73

ANEXO D. Materiales y equipos utilizados siembra, reproducción y activación de las cepas. .. 74

ANEXO E. Materiales y equipos utilizados en el ensayo de actividad enzimática. .................... 77

ANEXO F. Materiales, equipos y resultados de Blanqueamiento de papel. ............................... 79

xv

LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS

Abs Absorbancia.

x Concentración de xilosa [mg/mL].

y Absorbancia a 546 nm.

UI /g Unidades Internacionales por gramo de sustrato seco.

Cxp Concentración de xilosa producida.

Ven Volumen de ensayo

Fd Factor de disolución.

Vez Volumen de extracto crudo enzimático.

Fe Factor de extracción.

Te Tiempo de ensayo

t Niveles presentes en la experimentación

e Error

N Número de variables a analizarse estadísticamente

nn Número de muestras

G Grados de libertad

s Desviación estándar

s2 Varianza

SS Sumatoria de cuadrados

S Significación

T’ Cuadrado medio para el intergrupo o referido a los factores

E Cuadrado medio para el intragrupo o referido a los errores

H0 Hipótesis inicial o nula

Ha Hipótesis alternativa

Pe

Penicillium corylophylum

As Aspergillius terreus

Pi Piña

Ma Maracuyá

PP Combinación Penicillium corylophilum/Piña

AP Combinación Aspergillus terreus/Piña

PM Combinación Penicillium corylophilum/Maracuyá

AM Combinación Aspergillus terreus/Maracuyá

xvi

OBTENCIÓN DE XILANASA CON MICELIOS DE Penicillium corylophilum Y

Aspergillus terreus FERMENTADOS EN DESECHOS DE PIÑA Y MARACUYÁ.

RESUMEN

Estimación de la potencialidad como sustrato de la torta de desechos agroindustriales de piña y

de maracuyá para la obtención de xilanasa, mediante fermentación en estado sólido usando los

hongos Penicillium corylophilum y Aspergillus terreus.

Se inició la experimentación adecuando los desechos de piña y maracuyá mediante secado,

trituración, ajuste de humedad y adición de nutrientes necesarios para el crecimiento de los

hongos; luego se prepararon las cepas de los dos hongos para su posterior siembra en los

sustratos; se inocularon cada una de las cepas en las muestras de piña y maracuyá en forma

separada formando diferentes combinaciones de cepa/sustrato. Se obtuvo la enzima xilanasa y se

determinó su actividad enzimática en forma indirecta con un método colorimétrico. La enzima

presentó mejores resultados en el blanqueamiento de papel que el Hipoclorito de sodio pero no

que el Peróxido de hidrógeno.

Se concluye que el hongo Penicillium corylophilum y los desechos de piña corresponden a la

cepa y sustrato más efectivos, mientras que la combinación Penicillium corylophilum/piña

presenta el mejor rendimiento acumulado a los 19 días de experimentación. El análisis

estadístico ANOVA determinó que existen diferencias significativas en la eficiencia de las

combinaciones cepa/sustrato.

PALABRAS CLAVES: / XILANASA / PENICILLIUM CORYLOPHILUM / ASPERGILLUS

TERREUS / PIÑA / MARACUYÁ / FERMENTACIÓN EN ESTADO SÓLIDO / HONGOS/

RESIDUOS AGRÍCOLAS /

xvii

OBTAINING OF XYLANASE WITH Penicillium corylophylum AND Aspergillus terreus

FUNGI MYCELIUMS WHICH HAVE BEEN FERMENTED IN WASTES OF

PINEAPPLE AND PASSION FRUIT.

ABSTRACT

Estimation of the potentiality as substrate in pineapple and passion fruit cakes that were made

with agro industrial wastes to obtain xylanase by fermentation in solid state, using fungus

Penicillium corylophilum and Aspergillus terreus.

The experimenting began adapting the pineapple and passion fruit waste by drying, crushing,

humidity adjustment and adding nutrients that are required for growth of fungi; then the two

fungal strains were prepared for subsequent plating in the substrates; each of the strains were

inoculated in pineapple and passion fruit samples separately, which formed different

combinations of strain/substrate. The xylanase enzyme was obtained and its enzymatic was

indirectly determined by a colorimetric method. The enzyme showed better results in the paper

bleaching with the hypochlorite of sodium, than with the peroxide of hydrogen.

In conclusion, the Penicillium corylophilum fungus and pineapple wastes correspond to a strain

and substrate combination which show more effectiveness, while the combination Penicillium

corylophilum/pineapple shows a better accumulated performance on 19 days of experimentation.

ANOVA statistical analysis determined that there are significant differences in the efficiency of

the strain/substrate combinations.

KEYWORDS: / XYLANASE / PENICILLIUM CORYLOPHILUM / ASPERGILLUS

TERREUS / PINEAPPLE / PASSION FRUIT / SOLID STATE FERMENTATION / FUNGI /

AGRICULTURAL WASTE /

1

INTRODUCCIÓN

Los subproductos y residuos de origen agroindustrial que contienen cantidades importantes de

celulosa, hemicelulosa, lignina y pectina, son sustratos atractivos para la producción de enzimas

de uso industrial. Principalmente aquellas que son inducibles, entre las que destacan: las

celulasas, las xilanasas, las hemicelulasas y pectinasas, las cuales marcaron una época en la

historia de la Biotecnología.

Estudios a nivel internacional muestran interés sobre la identificación de nuevas técnicas de

producción de enzimas útiles en la industria, con una especial fijación en el uso de cepas de

hongos como agentes fermentadores; es por esto que se considera relevante que se analicen

procesos donde sea posible una producción rentable y a la vez amigable con el ambiente.

Una alternativa para la producción de enzimas de uso industrial es la utilización de cepas de

hongos filamentosos, los cuales han sido identificados como los mejores generadores

enzimáticos, en conjunto con la técnica de Fermentación en sustrato sólido (FES) con sustratos

ricos en hemicelulosa, que ofrecen relativos ahorros económicos y es amigable con el ambiente.

La Fermentación en sustrato solido (FES) actualmente se usa con gran éxito en la producción a

gran escala de antibióticos, micotoxinas, surfactantes y lo más relevante para este trabajo la

producción de enzimas.

En el presente trabajo se evaluó el desempeño de dos cepas distintas de hongos filamentosos

cada una en combinación de dos distintos sustratos en la producción de enzimas Xilanasas.

También se analizó el potencial de las enzimas obtenidas en el proceso de blanqueamiento de

pulpa de papel. El trabajo se desarrolló con la utilización de Penicillium corylophilum y

Aspergillus terreus como las cepas de hongos filamentosos seleccionadas y de desechos de piña

y maracuyá como los sustratos, además se constataron las condiciones ideales para el

crecimiento de las cepas y la producción de la enzima deseada. En las fases de la

experimentación se utilizó el método de Miller o de DNS para la identificación de azúcares

reductores, permitiendo cuantificar la cantidad de enzima xilanasa obtenida, y a la vez, comparar

la eficiencia de las diferentes combinaciones de cepa/sustrato.

2

Los datos y sus respectivos resultados determinados fueron: absorbancia, concentración de

xilosa y actividad enzimática de xilanasa en UI por gramo de sustrato seco. Esto con el fin de

contar con información suficiente para evidenciar si existe primero la producción de la enzima

xilanasa y segundo cual fue la mejor combinación cepa/sustrato.

Después de dar un tratamiento estadístico a los resultados obtenidos, se concluyó que bajo las

condiciones de experimentación analizadas si existen diferencias significativas entre la cantidad

de enzima xilanasa producida dependiendo de la combinación cepa/sustrato, resultando ser

mejor la combinación de Penicillium corylophilum/piña.

3

1. MARCO TEÓRICO

1.1. Enzimas.

1.1.1. Definición. Enzimas son moléculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones

químicas energéticamente posibles, pero que transcurren a una velocidad muy baja. La enzima

hace que la reacción transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la misma.

En estas reacciones, las enzimas actúan sobre unas moléculas denominadas sustratos, las cuales

se convierten en moléculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en

las células necesitan enzimas para que ocurran en las cantidades necesarias. A las reacciones

mediadas por enzimas se las denomina reacciones enzimáticas (Véase figura 1).

Figura 1. Mecanismo de reacción enzimática

Fuente. Genomasur. Estructura de las enzimas. Febrero del 2014. [En línea]. [Consultado 26

Noviembre 2014]. Disponible: http://www.genomasur.com/BCH/BCH_libro/capitulo_02.htm.

A diferencia de un catalizador inorgánico que interviene en numerosas reacciones, las enzimas

producidas por los organismos vivos habitualmente sólo catalizan un tipo de reacción o solo una

reacción determinada. La especificidad de las enzimas es tan marcada que en general actúan

exclusivamente sobre sustancias que tienen una configuración precisa. Por ejemplo, si solo

http://es.wikipedia.org/wiki/Mol%C3%A9cula

http://es.wikipedia.org/wiki/Sustrato_(bioqu%C3%ADmica)

http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula

http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_bioqu%C3%ADmica

4

atacan a los aminoácidos que tienen su carbono asimétrico con estructura L-, no muestran la

menor actividad sobre formas idénticas de dichos aminoácidos, pero que sean del tipo D-. [1]

1.1.2. Clasificación de las enzimas. Las enzimas se clasifican en seis grandes grupos principales

según su mecanismo de acción sobre su sustrato.

Estos seis grandes grupos son:

Tabla 1. Clasificación de las enzimas según el mecanismo de reacción.

Grupo Acción Ejemplo

Oxidoreductasas Catalizan reacciones de oxidorreducción. Tras la acción

catalítica quedan modificados en su grado de oxidación

por lo que deben ser transformados antes de volver a

actuar de nuevo.

Dehidrogenasas

Aminooxidasa

Deaminasas

Catalasas

Transferasas Transfieren grupos activos (obtenidos de la ruptura de

ciertas moléculas) a otras sustancias receptoras. Suelen

actuar en procesos de interconversiones de azúcares, de

aminoácidos, etc.

Transaldolasas

Transcetolasas

Transaminasas

Hidrolasas Verifican reacciones de hidrólisis con la consiguiente

obtención de monómeros a partir de polímeros. Suele

ser de tipo digestivo, por lo que normalmente actúan en

primer lugar antes que cualquier otra.

Glucosidasas

Lipasas

Peptidasas

Esterasas

Fosfatasas

Isomerasas Actúan sobre determinadas moléculas obteniendo de

ellas sus isómeros de función o de posición. Suelen

actuar en procesos de interconversión.

Isomerasas de

azúcar

Epimerasas

Mutasas

Liasas Realizan la degradación o síntesis (entonces se llaman

sintetasas) de los enlaces denominados fuertes sin ir

acoplados a sustancias de alto valor energético.

Aldolasas

Decarboxilasas

Ligasas Realizan la degradación o síntesis de los enlaces fuertes

mediante el acoplamiento a sustancias ricas en energía

como los nucleosidos del ATP.

Carboxilasas

Peptidosintetasas

1.1.3. Enzimas Hidrolíticas o hidrolasas. Las enzimas hidrolíticas o hidrolasas son aquellas

que aceleran las reacciones en las que una sustancia compleja es descompuesta en componentes

más simples por reacción con moléculas de agua. [2]

http://www.monografias.com/trabajos15/todorov/todorov.shtml#INTRO

http://www.monografias.com/trabajos11/contabm/contabm.shtml

http://www.monografias.com/trabajos14/nuevmicro/nuevmicro.shtml

5

Tabla 2. Ejemplos de enzimas hidrolizantes de polisacáridos.

Tipo de sustrato y enzima Sustrato específico

α-Glucosidasa Glucogeno

α-Fucosidasa Fucosa de la membrana

β-Galactosidasa Galactosidos

α-Manosidasa Manósidos

β-Glucuronidasa Glucuronidos

Hialurononidasa Ácido hialuronico

Ansulfatasa Sulfatos orgánicos

Lisozima Paredes celulares

bacterianas

1.2. Hemicelulosa

La hemicelulosa es el segundo polímero más abundante presente en los tejidos vegetales,

representando un 20 al 35% de la biomasa. Además se encuentra ligada a polímeros como la

lignina y la celulosa que en conjunto contribuyen a la flexibilidad o rigidez de la pared celular

(Véase figura 2).

La estructura química de la hemicelulosa consiste de cadenas largas con una gran variedad de

pentosas (xilosas y arabinosas), hexosas (manosa, galactosa y glucosa), y sus correspondientes

ácidos urónicos.

La hemicelulosa se encuentra en frutas, tallos de plantas, y las cáscaras de granos. La variación

depende siempre del tipo de especie vegetal, estado de desarrollo y tipo de tejido que se analice.

Las hemicelulosas, compuestas principalmente por hidrocoloides, se clasifican en base a varias

propiedades que estas presentan, como son su capacidad para almacenar materiales, retención de

agua y su capacidad para proporcionar energía extracelular. [3]

6

Figura 2. Estructura general de la pared celular de biomasa de origen vegetal.

1.2.1. Conversión de la hemicelulosa. La hemicelulosa puede ser convertida a varios productos

por medio de procesos químicos o biológicos, sin embargo para eso es necesaria una hidrólisis

previa de los polisacáridos a sus unidades básicas (Véase figura 3).

Generalmente la hidrólisis de la hemicelulosa es más fácil que la hidrólisis de la celulosa, debido

a diferentes factores como la heterogeneidad estructural, la composición química, bajo grado de

polimerización y baja cristalinidad. En algunos casos la hemicelulosa es removida durante el

inicio del proceso de tratamiento de la biomasa, con el fin de reducir las limitaciones

estructurales que interfieren en la hidrólisis de la celulosa.

Figura 3. Tratamiento químico para remoción de hemicelulosa de la biomasa.

Fuente. FERNADEZ ISLAS, Federico. Producción de Xilanasas por cepas de Aspergillus niger

en cultivo sólido de salvado de avena y salvado de trigo. Trabajo de grado. Maestro en Ciencias

y Tecnologia de Alimentos. Queretaro. 2012. p. 2.

7

La conversión microbiana se ha sugerido como una alternativa renovable y amigable con el

ambiente. Para esto los microorganismos producen enzimas que actúan en forma específica

sobre los polisacáridos que pertenecen a la estructura de la hemicelulosa. Sin embargo los

polisacáridos estructurales como la celulosa y la hemicelulosa forman una estructura altamente

empaquetada y organizada ya que contienen diferentes tipo de azucares residuales que se

ramifican en una gran variedad de estructuras.

Para poder realizar una degradación eficiente de estos polisacáridos, algunos microorganismos

como bacterias y hongos, producen enzimas que actúan específicamente sobre estos polímeros,

denominadas por su forma genérica como lignocelulasas y hemicelulasas.

Estos microorganismos en general se pueden clasificar de acuerdo a la forma de hidrólisis de la

hemicelulosa, la cual se puede dar de las siguientes formas:

a) Mediante hidrólisis enzimática con varias hemicelulasas libres y producidas por excreción y

cuyos productos de hidrólisis son monosacáridos y disacáridos.

b) Por hidrólisis parcial extracelular mediante hemicelulasas asociadas a la membrana o

hemicelulasas internas, que pueden generar productos más pequeños como oligosacaridos.

c) Mediante hidrólisis por complejos enzimático extracelulares y asociados a la pared celular

llamados celulosomas, los cuales pueden presentar varias actividades enzimáticas que

degraden a la celulosa y hemicelulosa.

La conversión de la hemicelulosa tiene un gran valor en procesos de obtención de sustancias

químicas con valor agregado como las xilanasas, utilizadas en la industria del papel para lograr

la eliminación del complejo lignina-carbohidrato generado durante el proceso de Kraft, debido a

que dicho complejo representa una barrera física que impide la entrada de sustancias que

blanquean las fibras o la pulpa del papel, lo cual aumenta el rendimiento del blanqueado y ayuda

en la disminución del uso de sustancias cloradas las cuales generan subproductos tóxicos y que

representan un riesgo para la salud. [4]

1.2.2. Xilano. El xilano es un polisacárido constituido por una cadena lineal de xilosa y diversas

ramificaciones, a la vez es el principal carbohidrato encontrado en la hemicelulosa de los tejidos

vegetales y constituye la tercera parte de todo el carbón orgánico renovable sobre la tierra.

Los xilanos existentes en algunos materiales vegetales se presentan en forma de

heteropolisacaridos, con una base estructural de xilosas unidas por uniones β – 1,4 y formando

8

una estructura de cadena. Además de la xilosa, los xilanos pueden estar compuestos de

arabinosa, ácido glucarónico, galactosa, ácido ferúlico y acetilo como se muestra en la figura 4.

Se conoce que ciertos materiales de la naturaleza como por ejemplo las maderas rígidas

contienen un gran porcentaje de xilano, mientras que materiales más suaves están compuestos en

su gran mayoría por glucomananos. Además se ha registrado que el porcentaje de xilano

presente en tejidos de cereales puede llegar hasta un 50%.

Los xilanos en los cereales son conocidos como arabinoxilanos debido a que contienen gran

cantidad de L-arabinosa, mientras que en las maderas duras debido a la existencia de grandes

cantidades de ácido D-glucoronico unido a la estructura base del xilano se lo conoce como

glucoronoxilanos.

Por último hoy en día a los xilanos se les ha categorizado de la siguiente manera: homoxilanos,

arabinoxilanos, glucoronoxilanos y los glucoronoarabinoxilanos. [5]

Figura 4. Representación esquemática de molécula de xilano.

Xilosa

Ácido glucarónico

Arabinosa

Galactosa

Ácido ferúlico

Acetilo

9

1.2.3. Hidrólisis enzimática del xilano. Dependiendo de su origen la estructura base del xilano

puede estar altamente sustituida por grupos de residuos acetilo, arabinosa y ácidos glucoronicos,

ferulico y cumarinico los cuales entrecruzan a la hemicelulosa y la lignina. Estos grupos

sustituyentes son un factor limitante que impide una hidrólisis enzimática eficiente del sustrato.

Por otra parte para una hidrólisis completa del xilano es necesaria la acción de un número de

enzimas xianolíticas que tienen la capacidad de cortar la cadena principal en varios sitios de la

misma.

Las enzimas que actúan sobre la cadena principal del xilano son la endo-β-1,4-xilanasas que

causan un grado de decremento en la polimerización del sustrato, la β-xilosidasas que hidrolizan

xilooligosacaridos y exoxilanasas. Además dependiendo de la fuente de xilanos, las enzimas

requeridas para atacar a los grupos laterales serían las α-L-arabinosidasas, α-D-glucuronidasas y

esterasas capaces de liberar grupos acetil, feryloil y cumaroil. [6]

1.3. Enzima hidrolítica Xilanasa.

Las xilanasas son enzimas hidrolíticas que actúan como biocatalizadores en la degradación de

xilano, el cual es un polisacárido que se encuentra de forma abundante en la pared celular

vegetal como antes se mencionó.

La xilanasa es producida por una amplia variedad de microorganismos, entre ellos están

bacterias, hongos y algas, con lo que se pueden distinguir Xilanasas de distintos tamaños y pesos

moleculares.

La generación de la xilanasa es inducida cuando el microorganismo crece en medios con

presencia de xilosa y xilobiosa. El principal inductor es la xilosa que juega un doble papel en la

regulación de la expresión de la Xilanasa en función de su concentración: a bajas

concentraciones actúa como inductor y a altas concentraciones reprime la expresión de los genes

xinolíticos. [7]

1.3.1. Clasificación de las xilanasas. Hoy en día las xilanasas se clasifican de acuerdo a su

información genética y análisis estructural.

10

Las xilanasas están generalmente clasificadas en las familias 10 y 11 de las glicosil hidrolasas y

tienen una relación inversa entre su punto isoeléctrico (pI) y su peso molecular.

La estructura de la familia de xilanasas pertenecientes a la familia 10 es descrita como un barril

de 8 plegamientos en conformación β/α, el sitio activo tiene una estructura en hendidura abierta

y el sitio catalítico está conformado por un par de glutamatos. Estas enzimas pueden presentar un

peso molecular relativamente alto y un punto isoeléctrico ácido, presentan arreglos

conformacionales en estructuras cuaternarias de mayor peso molecular o que pueden presentar

más de una subunidad en su estructura proteica que las hacen más complejas que las xilanasas de

la familia 11. Una característica adicional es la formación de oligosacáridos con un bajo grado

de polimerización.

La familia 11 está conformada por un único dominio elipsoidal que comprende una

conformación de dos láminas β y solo tres α- hélices. Las xilanasas pertenecientes a esta familia

tienen pesos moleculares más bajos en comparación a los de la familia 10 y no presentan un sitio

de unión al sustrato. Esta clase de enzimas tienen mayor especificidad por el xilano y producir

oligosacáridos de cadena larga. [8]

Figura 5. Estructura tridimensional familias glicosil hidrolasas.

1.3.2. Funcionamiento de la xilanasa. “Las endoxilanasas o xilanasas (endo-β-1,4-xilanasa) son

las enzimas que actúan sobre la cadena principal de xilano hidrolizando los enlaces internos β

(1=>4) a moléculas de xilosa, dando una mezcla de xiooligosacaridos de distintos tamaños.

11

También pueden hidrolizar xilooligómeros, siendo más efectivas cuando el grado de

polimerización de estos es mayor. Sin embargo no hidrolizan xilobiosa, lo que permite

distinguirlas claramente de las xilosidasas (Véase Figura 6).

Figura 6. Hidrólisis enzimática del xilano.

Fuente. MONTECINOS, Catalina. Estudio del efecto de la adición de extremos hidrofóbicos en

la expresión y purificación por HIC de xilanasas recombinables. Trabajo de grado. Ingeniera

Quimica. Santiago de Chile. 2009. p. 2.

Debido a la gran complejidad que presenta el xilano y a la necesidad de degradar varias partes de

este, se encuentra entre los microorganismos xianolíticos (que degradan xilano), una gran

multiplicidad de xilanasas que difieren en su especificidad con respecto al xilano.

Debido a que el xilano es un polímero de elevado grado de polimerización, este no puede ser

transportado al interior del microorganismo para ser degradado, por lo que las xilanasas deben

ser secretadas al medio extracelular.

Como se mencionó anteriormente, debido a que las Xilanasas pueden ser clasificadas en las

familias 10 y 11 de las glicosil hidrolasas, su mecanismo catabólico corresponde al de estas

mismas enzimas. Así el mecanismo para hidrólisis del sustrato corresponde a un doble

desplazamiento con retención anomérica como se muestra en la figura 7.

12

Figura 7. Mecanismo de acción xilanasa.

Fuente. MONTECINOS, Catalina. Estudio del efecto de la adición de extremos hidrofóbicos en

la expresión y purificación por HIC de xilanasas recombinables. Trabajo de grado. Ingeniera


En la hidrólisis del enlace glucosídico por este mecanismo intervienen 2 residuos glutamato

conservados del centro activo de la Xilanasa, actuando uno de ellos como catalizador acido/base

y el otro como residuo nucleofílico. Una vez que el esqueleto de xilosas ha sido posicionado

correctamente entre los dos ácidos glutámicos catalíticos, el que actúa como catalizador

ácido/base realiza un ataque nucleofílico sobre el carbono anomérico del enlace (Véase figura 7).

De este primer paso se libera uno de los productos de reacción y se forma un intermedio α-

glicosilo-enzima. Luego, el glutamato ácido/base actúa como base y capta un protón de una

molécula de agua, lo que permite que esta ataque el enlace entre glutamato nucleofilo y el

carbono anomérico (Véase figura 7B), produciendo su hidrólisis, dando como resultado un

producto cuyo carbono anomérico vuelve a la misma configuración que en el sustrato,

liberándose la enzima de su unión al sustrato para empezar un nuevo proceso de catálisis (Véase

figura 7C).” [9]

13

1.3.3. Microorganismos productores de xilanasa.

1.3.3.1. Hongos productores de xilanasa. Un hongo es un ser viviente que no es ni un animal ni

un vegetal, sino que forma parte de su propio reino biológico. Los hongos pueden estar formados

por una célula, como las levaduras, o bien estar formados por varias células que forman una

estructura concreta, como los champiñones. Muchos hongos viven en simbiosis con otros seres

vivos. Por ejemplo, los líquenes son una simbiosis entre un alga y un hongo; las trufas viven en

simbiosis con árboles como castaños, nogales, encinas y robles.

Los hongos se presentan bajo dos formas principales: hongos filamentosos (antiguamente

llamados “mohos”) y hongos levaduriformes. El cuerpo de un hongo filamentoso tiene dos

porciones, una reproductiva y otra vegetativa. La parte vegetativa, que es haploide y

generalmente no presenta coloración, está compuesta por filamentos llamados hifas (usualmente

microscópicas) que son elementos filamentosos cilíndricos encargados de secretar enzimas

digestivas que degradan los compuestos orgánicos (Véase figura 8); un conjunto de hifas

conforma el micelio (usualmente visible). A menudo las hifas están divididas por tabiques

llamados septos. [10]

Figura 8. Hifas de hongo filamentoso

Fuente. TAMBE, Y. Imagen microscópica de Penicillium sp. Marzo 2005. [En línea].

[Consultado 26 Noviembre 2014]. Disponible: http://es.wikipedia.org/wiki/Hifa.

http://es.vikidia.org/wiki/Ser_vivo

http://es.vikidia.org/wiki/Animal

http://es.vikidia.org/wiki/Vegetal

http://es.vikidia.org/wiki/Reino_biol%C3%B3gico

http://es.vikidia.org/wiki/C%C3%A9lula

http://es.vikidia.org/wiki/Levadura

http://es.vikidia.org/wiki/Champi%C3%B1%C3%B3n

http://es.vikidia.org/wiki/Simbiosis

http://es.vikidia.org/wiki/Liquen

http://es.vikidia.org/wiki/Alga

http://es.vikidia.org/wiki/Trufa

http://es.vikidia.org/w/index.php?title=Casta%C3%B1o&action=edit&redlink=1

http://es.vikidia.org/w/index.php?title=Nogal&action=edit&redlink=1

http://es.vikidia.org/wiki/Encina

http://es.vikidia.org/w/index.php?title=Roble&action=edit&redlink=1

14

Figura 9. Partes de un hongo filamentoso

Fuente. Cajón de ciencias. Partes de un hongo. 2011. [En línea]. [Consultado 26 Noviembre

2014]. Disponible: http://www.cajondeciencias.com/biobotanica.html.

Los hongos filamentosos son considerados los mejores organismos para la producción de

xilanasas debido a sus altos valores de actividad enzimática. Además los hongos se pueden

desarrollar sobre sustratos sólidos por medio de un crecimiento en hifas, lo cual promueve un

crecimiento estable y buena tolerancia a valores bajos de actividad de agua, así como resistencia

a bajas presiones osmóticas. De esta forma los hongos filamentosos son excelentes candidatos

para producción de xilanasas en sustratos sólidos. El modelo de crecimiento en hifas permite una

ventaja competitiva de los hongos sobre el desarrollo unicelular de otros microorganismos, ya

que este tipo de desarrollo permite colonizar de una manera más eficiente el soporte sólido y un

mejor aprovechamiento de los nutrientes disponibles. El crecimiento en hifas permite un mejor

contacto del hongo con el medio sólido, además la secreción de enzimas de las hifas permite una

acción más eficiente de las enzimas permitiendo un incremento de la invasión del

microorganismo y por tanto aumenta la accesibilidad a los nutrientes necesarios.

El micelio del hongo sintetiza y excreta altas cantidades de exoenzimas hidrolíticas, resultando

en una catálisis eficiente y los productos de la hidrólisis que corresponden a nutrientes simples

en contacto con el micelio, atraviesan la membrana celular y promueven la biosíntesis y la

actividad metabólica del hongo filamentoso.

15

Las enzimas xianolíticas de origen fúngico han recibido gran atención en los últimos años ya que

se ha reportado que diferentes especies de hongos como Aspergillus, Penicillium, Trichoderma,

etc., son grandes productoras de xilanasa. [11]

1.3.3.2. Bacterias productoras de xilanasa. Las bacterias y levaduras pueden crecer sobre

sustratos sólidos o mediante formas de cultivo sumergido. Muchos son los estudios realizados

sobre géneros bacterianos capaces de producir xilanasas, aisladas a partir de condiciones

ambientales extremas determinadas por su naturaleza silvestre, se ha visto que confieren

propiedades extras a sus enzimas, tales como resistencia a grandes concentraciones de álcali,

resistencia a altas temperaturas y grandes concentraciones de sales.

Entre las xilanasas bacterianas mas estudiadas se encuentran las generas por las especies

Streptomyces sp y Bacillus sp. [12]

1.3.4. Mecanismos de producción de xilanasa. Como se mencionó antes, la producción de

xilanasas en el hongo son inducidas por la presencia de xilano en alta pureza, el cual hace

altamente costoso el proceso de producción. Por ello el uso de subproductos agrícolas, que

resultan ser abundantes y de bajo costo como sustratos en los procesos de fermentación para la

producción de xilanasas es una alternativa sustentable para reducir los costos de producción.

Entre las tecnologías existentes para la producción industrial de las xilanasas se encuentra la

fermentación.

1.3.4.1. Fermentación. La fermentación es un proceso catabólico de oxidación incompleta, que

no requiere oxígeno, y el producto final es un compuesto orgánico. La sustancia que se va a

digerir es el nutrimento, el cual es descompuesto por la actividad enzimática (complejo enzima-

sustrato). El fin de la fermentación es proporcionar energía al organismo que la está realizando.

La fermentación la realizan más que principalmente las bacterias y hongos. Es el proceso

energético más primitivo de los seres vivos. [13]

A continuación se menciona el tipo de fermentación más utilizado industrialmente:

16

Fermentación en sustrato solido (SSF). La fermentación en sustrato sólido es una técnica

conocida desde hace siglos y se define como el proceso fermentativo en el cual el

microorganismo crece sobre una matriz sólida en ausencia de agua libre. El sustrato debe

contener solamente la humedad necesaria para favorecer el crecimiento y la actividad

metabólica del microorganismo. Estos sustratos no deben ser solubles en agua ni en

polímeros en la naturaleza y son fuente de carbono, vitaminas y minerales que favorecen el

crecimiento microbiano.

En la actualidad la fermentación en sustrato sólido se está utilizando con éxito para la

producción de antibióticos, micotoxinas, surfactantes, ácidos orgánicos, compuestos

aromáticos, pesticidas, enzimas entre otros.

Los sustratos utilizados en este tipo de fermentación son muy variados, destacándose los

desechos de cereales como por ejemplo el trigo, centeno, arroz y maíz y subproductos

agroindustriales como la torta de canola. También se usan desechos de la agroindustria, los

cuales son considerados los mejores sustratos para SSF ya que proporcionan los nutrientes

necesarios para el crecimiento microbiano. Ejemplo de estos son los residuos de manzana,

plátano, uva, cítricos, caña de azúcar y pomaza cramberry entre otros.

El principal criterio para la selección de un material lignocelulósico como sustrato es su

composición química, destacando su contenido de lignina, celulosa y hemicelulosa. De esta

última es importante conocer la cantidad de xiloglucanos, glucomananos y galactomananos.

De acuerdo a la relación en la que se encuentran formando parte del tejido vegetal, se podrá

hacer una aproximación del rendimiento de xilanasa al emplear materiales lignocelulósicos

destinados al cultivo sólido. [14]

17

Ventajas y desventajas de fermentación en sustrato sólido y fermentación sumergida

Tabla 3. Ventajas y desventajas entre fermentación en sustrato sólido y fermentación

sumergida

FACTOR

FERMENTACION

SUMERGIDA

FERMENTACION EN

SUSTRATO SOLIDO

Sustratos Sólidos solubles como los

azúcares.

Polímeros insolubles:

materiales lignocelulosicos,

almidón, celulosa, pectina y

lignina.

Agua Consumo de agua. Limitado consumo de agua,

bajas actividades de agua.

Calefacción metabólica Fácil control de temperatura. Baja capacidad de

transferencia de calor.

Control de pH Fácil control de pH. Sustrato solido amortiguado.

Escalado Equipos industriales

disponibles.

Requiere de nuevo diseño de

ingeniería.

Consideraciones energéticas Consumo de mucha energía. Consumo de poca energía.

Agitación mecánica Buena homogenización. Preferible estado estático.

Aireación Limitada solubilidad del

oxígeno.

Gran superficie de

intercambio de aire.

1.4. Aplicación de la xilanasa: Blanqueamiento de papel.

1.4.1. Proceso de blanqueo. En un proceso químico típico de kraft (proceso más comúnmente

utilizado a nivel mundial), la madera sin corteza y troceada se introduce en el digestor, donde se

cuece con sosa caustica, sulfato sódico y carbonato cálcico a 200 ᵒC y alta presión para reducir

los trozos a una pulpa. Después de la cocción, se separan los gases sulfúricos para ser tratados

(generalmente son incinerados), y el resto de la mezcla es filtrada por diferentes mecanismos

para retirar los trozos que no se han degradado durante la cocción. La pulpa es enjuagada con

agua para arrastrar los líquidos de cocción y recuperar los compuestos químicos utilizados. La

pasta es filtrada y espesada al quitarle el agua.

Después es conducida a la unidad de blanqueo, cuyo objetivo es aumentar el brillo y la

resistencia de la pulpa. Esto se consigue retirando al máximo la lignina y abrillantando las fibras

de madera tratadas.

18

Tradicionalmente se utiliza gas cloro, por su eficacia en separar la lignina selectivamente

conservando las fibras de celulosa prácticamente intacta. No obstante, su elevada reactividad

favorece la generación de miles de compuestos organoclorados al reaccionar con estructuras de

carbono presentes en la madera. Aproximadamente el 10% del cloro se convierte en compuestos

organoclorados adsorbibles (el 0,5% se queda en la pasta y el 90% se transforma en iones

cloruro).

Otros compuestos que se han utilizado para sustituir el cloro han sido dióxido de cloro e

hipoclorito sódico, pero estos no eliminan el problema de los compuestos organoclorados. [15]

1.4.1.1. Compuestos Organoclorados. La mayoría de los compuestos organoclorados son muy

estables, permaneciendo algunos en el medio durante cientos de años. Estos compuestos son

liposolubles, es decir, tienen tendencia a depositarse en los tejidos grasos de los seres vivos a lo

largo de su vida. Los efectos bioacumulativos de estos compuestos se manifiestan al

incrementarse su concentración al ascender en la cadena trófica.

Estas sustancias organocloradas son ajenas al medio, por lo que los seres vivos no han

desarrollado los mecanismos para asimilar o eliminar estos compuestos de sus organismos. Se

han identificado más de 1000 compuestos organoclorados en los vertidos de una papelera que

utiliza cloro, de los cuales se conoce poco aun sobre sus efectos a medio y largo plazo.

La familia de compuestos organoclorados más conocida, son las dioxinas. Estas sustancias son

cancerígenas y causan efectos sobre el sistema inmunológico, reproductivo y nervioso, además

de muchas otras afecciones. [16]

1.4.2. Alternativas menos contaminantes.

1.4.2.1. En fases previa del blanqueo.

Ampliar las actividades para retirar la lignina antes de la fase del blanqueo: alargando el

tiempo de cocción y la presión, siempre y procurando no dañar las fibras de madera.

Cocción Continua Modificada (MCC): este proceso consiste en alterar la fase de cocción,

alternando vapor a alta y baja presión invirtiendo el sentido de la corriente de cocción a mitad

de la fase. Los resultados son una menor concentración de lignina adherida a la celulosa y

19

una mayor viscosidad que facilita la separación del resto de la lignina durante una fase de

oxigenación. [17]

1.4.2.2. Alternativas a los métodos de blanqueo con cloro

Oxigenación: Este es un proceso de aplicación previo al blanqueo para reducir

significativamente la lignina.

Ozono: El ozono es un agente blanqueador eficaz, pero no muy estable, al tender a

degradarse a oxígeno. Este sistema se basa en un circuito cerrado para recuperar el oxígeno y

generar ozono.

Peróxido: El peróxido de hidrogeno sirve únicamente para incrementar el brillo de la pulpa, y

no para separar la lignina adicional. Esto representa un beneficio al mejorar la calidad de la

pulpa y reducir los costes del blanqueo.

Enzimas: Se están investigando diferentes enzimas que ayudan a la descomposición de la

madera. Las xilanasas tienden a degradar los enlaces químicos que unen la lignina a la

madera. [18]

1.4.3. Blanqueamiento con enzimas. Una tecnología que está avanzando rápidamente es el

blanqueo biológico que consiste en emplear enzimas especializadas como parte de un pre

tratamiento en un proceso de blanqueo tradicional. Estas enzimas especializadas empleadas en el

blanqueo de pasta de madera son xilanasas que degradan los grupos xilanos (grupos que forman

parte de las hemicelulosas en fibras celulósicas). Esta acción provoca la desaparición de la unión

existente entre la celulosa y la lignina. La liberación de la lignina mediante enzimas hace más

fácil su eliminación mediante productos químicos en las etapas posteriores de blanqueo (Véase

figura 12). [19]

20

Figura 10. Representación esquemática de proceso del blanqueamiento de pasta de papel

con xilanasa.

Fuente. LOPEZ LUENGO, Gloria y ANGELES, Banares. Blanqueando el papel con una

proteina. Noticias. Madrid. 2010. p.2.

1.5. Selección del sustrato sólido y de la cepa en el Ecuador.

1.5.1. Selección de la piña como sustrato sólido. Para el presente trabajo se seleccionó los

desechos de piña como son la cascara y el corazón, debido que es un producto relativamente

abundante en nuestro país, ya que el cultivo de piña en el Ecuador esta favorecido debido a las

características geográficas adecuadas que presenta el país para el desarrollo. Según datos

proporcionados por el III Censo Agropecuario Nacional del año 2000, en el país existían

alrededor de 5750 hectáreas de superficie sembrada de piña. [20]

La producción de piña en el Ecuador ha evolucionado favorablemente en la última década

gracias a las excelentes condiciones para el cultivo de esta fruta, en el período de 2005 a 2010 se

registró un incremento del 6.40% en la superficie cosechada, mientras que la producción de la

fruta fresca medida en toneladas métricas ha tenido un crecimiento del 4.09%.

En la siguiente tabla se encuentran datos proporcionados por el Ministerio de Agricultura,

Ganadería, Acuacultura y Pesa referentes a la producción de piña a nivel nacional:

21

Tabla 4. Producción Nacional de piña n el Ecuador

Año Superficie cosechada

(Ha)

Producción en fruta fresca

(Tm)

2005 5809 103511

2006 7016 118663

2007 6648 115931

2008 7132 119442

2009 7675 124423

2010 7922 126454

Las principales plantaciones de piña se encuentran en las provincias de la Costa por ser una fruta

tropical, las zonas más importantes son Los Ríos y Santo Domingo de los Tsáchilas, seguido del

Guayas, El Oro, Esmeraldas y Manabí. Las tres primeras provincias indicadas son las que poseen

mejores condiciones para la producción de piña. [21]

Otro factor importante para la selección de los desechos de piña es el alto contenido de material

lignocelulósico presente en su composición química.

A continuación se presenta la tabla de la composición química de la piña, datos proporcionados

por el Ministerio de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y Pesca:

Tabla 5. Composición química de la piña en base seca

Variable % en base seca

Humedad 7,46

Cenizas 4,25

Solubilidad en agua fría 29,32

Solubilidad en agua caliente 30,93

Lignina 9,05

α-Celulosa 41,19

Holocelulosa 65,61

Xilano 28,40 g/L

22

Figura 11. Micrografía a residuos de piña. [SPP] Sección de pared primaria indicando la

presencia de red de micro fibrillas de celulosa, una matriz de hemicelulosa que se disponen

en esta red. [HLP] Fibras largas ricas en lignina y otras en celulosa.

Fuente. MARIN, Marco. Obtención de enzimas hidrolasas en micelio de Pleurotus djamor

fermentado en desechos agroindustriales de piña. Revista Latinoamericana el Ambiente y la

Ciencia. Puebla, México. p.13.

1.5.2. Selección de la maracuyá como sustrato sólido. En cuanto a los desechos de maracuyá,

estos fueron seleccionados debido a que el Ecuador es el principal productor de maracuyá en

Sudamérica, así como el principal exportador de pulpa de maracuyá congelada. [22]

En Ecuador existen 28.747 hectáreas sembradas de maracuyá según el Ministerio de Agricultura

y Ganaderia, con rendimiento promedio de alrededor de 10-12 toneladas métricas por hectárea.

Las principales zonas de cultivo de esta fruta están ubicadas en las provincias de Manabí,

Esmeraldas, Guayas, El Oro y en algunas zonas de Santo Domingo de los Tsáchilas. Las zonas

de producción de maracuyá están dividas en los siguientes cantones: Chone, San Isidro, San

Vicente, Bahía, Quinindé, Santo Domingo, Quevedo, El Empalme, Vinces, Babahoyo, Milagro,

La Troncal, Naranjal, EL Guabo, Pasaje, Piñas y Portovelo. [23]

La cantidad de material lignocelulósico en los desechos de esta fruta no es tan abundante en

comparación al material lignocelulósico presente en la piña.

A continuación se presentan tablas de la composición química de los desechos de maracuyá:

23

Tabla 6. Composición química de la maracuyá en base seca.

Variable % en base seca

Humedad 6,32

Cenizas 8,08

Lignina 0,3

α-Celulosa 26,72

Hemicelulosa 9,11

Fuente: DUCHI, N. Y PAZMIÑO, J.- Proyecto IQ - CV- 024, PROMSA-ESPOCH,

Chimborazo, Ecuador 2003. p. 10.

Figura 12. Estructura pared celular de cascara de maracuyá.

Fuente. BELTRÁN, Xavier. Extracción y caracterización de pectinas. Nuevo Chimbote. Octubre

2011. p. 4.

1.5.3. Selección de cepa Aspergillus terreus y Penicillium corylophilum. Para la selección de

las dos diferentes cepas se tuvo en consideración que ambas sean hongos filamentosos, debido a

que como se menciona en párrafos anteriores, este tipo de hongos son los mejores productores de

enzimas.

Las cepas de estos tipos de hongos pueden ser obtenidas siendo aisladas a escala de laboratorio

de muestras de alimentos en descomposición o de muestras de suelos, ya que estos tipos de

hongos crecen con gran facilidad en el medio ambiente.

En el Ecuador solo se realiza la producción a escala industrial de hongos de tipo comestibles,

como son los champiñones, hongo shiitake, hongo ostra, etc.

24

2. MARCO EXPERIMENTAL

2.1. Materiales y equipos

Vasos de precipitación (R: 0-250 mL) (A±100mL), (R: 0-600 mL) (A±250mL), (R: 0-1000

mL) (A±500mL).

Probeta (R: 0-500 mL) (A±1mL).

Matraz Erlenmeyer (R: 0-250 mL) (A±50mL).

Balones aforados (R: 0-100 mL) (A±100mL), (R: 0-250 mL) (A±250mL), (R: 0-500 mL)

(A±500mL).

Frascos ámbar de vidrio (R: 0-250 mL) (A±50mL), (R: 0-500 mL) (A±100mL).

Porta objetos

Cajas Petri (R: 0-40mL)

Micropipeta automática (R: 0-100uL) (A±1uL).

Balanza analítica Ohauss (R: 0-300 g) (A± 0.001g).

Termómetro (R: 0-300 °C) (A±0.1°C).

Analizador Químico Semi-automatico, Rayto Company

Cámara de flujo laminar

Cámara Neubauer

Microscopio (A: 4X, 10X, 40X, 100x), Leica Co DM750.

Estufa (R: 0- 270 ᵒC), Memmert GmbH+Corp.

Centrífuga (R: 0-4000rpm), Model 802S.

Agitador magnético (R: 0-500rpm), J.P. Selecta Sa.

Reverbero

Autoclave (T: 0-134 ᵒC) (P: 0-2,8 bar), Tattnauer 3870 M.

Medidor de pH, Hanna Instruments HI221.

Tubos de ensayo.

Tubos con rosca.

Jeringuillas 1,3,5 mL.

Fundas autoclavables, Polyfan Especial, Indupetra.

25

2.2. Sustancias y reactivos

Agua destilada,

Tritón ® X-100, Molecular,

Sulfato de Amonio,

Hidróxido de sodio, NaOH

Birchwood xilano, SIGMA-ALDRICH.

Acido 3,5 dinitrosalicilico 98%,

Acido cítrico monohidratado,

Citrato de sodio dihidratado,

D(+)-Xilosa,

Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado,

Hipoclorito de sodio, , solución al 15%

Peróxido de hidrógeno,

D(+) – Glucosa,

Peptona, Baker.

Extracto de Levadura, Bacton Dickinson and Company.

Medio de cultivo PDA, Criterion.

Desechos secos de piña (corazón, cáscara).

Desechos secos de maracuyá (cáscara).

2.3. Microorganismos.

Penicillium coryllophillum

Aspergillus terreus

26

2.4. Diseño Experimental

2.4.1. Codificación. Las tablas que se presentan a continuación muestran una codificación

utilizada para facilitar la interpretación de los datos experimentales obtenidos.

Tabla 7. Codificación para combinación Penicillium corylophilum/Piña

Combinación Ensayo Muestra Codificación

Penicillium

corylophilum/Piña

1

1 A1

2 B1

3 C1

2

1 D1

2 E1

3 F1

3

1 G1

2 H1

3 I1

Tabla 8. Codificación para combinación Aspergillus terreus/Piña


Aspergillius

terreus/Piña

1

1 A2

2 B2

3 C2

2

1 D2

2 E2

3 F2

3

1 G2

2 H2

3 I2

27

Tabla 9. Codificación para combinación Penicillium corylophilum/Maracuyá


Penicillium

corylophilum/

Maracuyá

1

1 A3

2 B3

3 C3

2

1 D3

2 E3

3 F3

3

1 G3

2 H3

3 I3

Tabla 10. Codificación para combinación Aspergillus terreus/Maracuyá


Aspergillius

terreus/

Maracuyá

1

1 A4

2 B4

3 C4

2

1 D4

2 E4

3 F4

3

1 G4

2 H4

3 I4

28

2.4.2. Diagrama de flujo.

Figura 13. Diagrama de flujo.

Ensayo 1, A1-C1

Fijar: pH optimo hongo, %inoculo, T

optima hongo

Fijar: pH optimo hongo, %inoculo, T

optima hongo

Ensayo 1, A3-C3

Ensayo 2, D1-F1

Ensayo 1, A4-C4 Ensayo 1, A2-C2

Ensayo 2, D2-F2

Ensayo 3, G3-I3 Ensayo 3, G1-I1 Ensayo 3, G2-I2

Ensayo 2, D4-F4 Ensayo 2, D3-F3

Ensayo 3, G4-I4

Análisis: Actividad xilanasa

Cultivo solido en

restos de piña

Cultivo solido en

restos de

maracuyá Cultivo solido en

restos de piña

Cultivo solido en

restos de

maracuyá

Cepas de Penicillium

corylophilum

conservadas en medio

PDA

Restos de Piña

Cepas de Aspergillus

terreus conservadas en

medio PDA

Restos de

Maracuyá

Molienda Control de desarrollo de cepas

conservadas en medio PDA

Selección de cepas productoras de

xilanasas

29

2.5. Procedimiento.

2.5.1. Acondicionamiento de sustratos sólidos. El sustrato sólido debe poseer las condiciones

adecuadas para que se lleve a cabo el crecimiento de los microorganismos seleccionados.

El procedimiento para la correcta adecuación del sustrato sólido se detalla a continuación:

a) Se trituran los desechos frescos de piña y de maracuyá.

b) Se procede a secar los desechos frescos triturados dejándolos al sol por 4 días.

c) Se trituran nuevamente en un molino centrífugo con luz de malla 4 (4,75mm).

d) Se pesan 6 muestras de piña seca de 100 gramos y 6 muestras de maracuyá seca de 150

gramos.

e) Se ajusta la humedad de cada muestra hasta un 70 % aproximadamente.

Para el ajuste de humedad de la piña se deja remojando cada muestra en agua destilada por

24 horas, luego se retira el exceso de agua y se deja la piña extendida en una superficie

plana para que se evapore el agua hasta llegar al 70 % de humedad.

Para el ajuste de humedad de la maracuyá se mezcla cada muestra con 180 mL de agua

peptonada.

f) Se coloca en cada muestra Sulfato de Amonio como fuente de nitrógeno para los

microorganismos en proporción de 1:20 en relación a la masa del sustrato sólido seco.

g) Se coloca cada una de las muestras en fundas autoclavables y se las esteriliza en un

autoclave por 45 min

h) Se deja enfriar cada muestra debidamente sellada.

2.5.2. Preparación del inóculo. Este procedimiento tiene por objeto la obtención de una

disolución de stock de las esporas de los dos tipos de cepas que se utilizaron para este trabajo en

un medio de cultivo líquido para que puedan ser sembrados en los sustratos sólidos ya

acondicionados.

El procedimiento se explica a continuación:

a) Se suspenden colonias del hongo desde una placa de agar papa dextrosa con 3 mL de una

solución estéril de Tritón X-100 al 1%.

b) Se toman alícuotas de 1.5 mL de la suspensión (5.05 *10^5 esporas de Penicillium/mL y

4.95*10^6 esporas de Aspergillus/mL) y se inoculan respectivamente en dos matraces

30

Erlenmeyer que contienen medio de cultivo líquido de glucosa, peptona y extracto de

levadura (250 mL para cada tipo de hongo).

c) Se incuban a 25 ᵒC durante 24 horas con agitación constante con ayuda del agitador

magnético a 100 rpm.

*La concentración de la suspensión de esporas para cada cepa seleccionada, se determina

mediante el conteo de esporas utilizando una cámara Neubauer y el microscopio.

2.5.3. Producción de la enzima xilanasa. En esta parte experimental se busca la producción a

escala de laboratorio de la enzima por medio de la fermentación en sustrato sólido de los hongos

seleccionados.

Al momento de realizar el muestreo se procura obtener una muestra homogénea y representativa

antes de ser sometida al análisis. El procedimiento en detalle se explica a continuación:

a) Se toman alícuotas de las esporas brotadas en relación al 10% del peso de cada muestra (10

mL de suspensión de esporas para el caso de cada muestra de piña y 12 mL de suspensión

de esporas para el caso de cada muestra de maracuyá).

b) Dentro de la cámara de flujo laminar, se deposita cada alícuota de los respectivos hongos

en las distintas muestras de piña y de maracuyá; tres muestras de piña y tres de maracuyá

para Penicillium coryllophilum y tres muestras de piña y tres de maracuyá para Aspergillus

terreus. (Véase diagrama de flujo)

c) Se deja incubar cada muestra en una estufa a 25 ᵒC durante 30 días.

d) Se toman pasando un día tres muestras de aproximadamente 2 gramos, cada una de cada

sustrato de piña y maracuyá respectivamente a partir del día 6 en caso del Penicillium

coryllophilum y a partir del día 10 en caso del Aspergillus terreus.

e) Se coloca cada muestra en una caja petri y se las conserva a 4 ᵒC.

2.5.4. Obtención del extracto crudo de enzimas. La obtención del extracto crudo de enzimas es

necesario para poder realizar la identificación de la enzima sin mayor interferencia de algún

desecho sobrenadante.

El detalle del procedimiento se especifica a continuación:

a) Se saca la muestra de la caja petri y se la coloca en un tubo de ensayo.

31

b) Se adiciona solución estéril de Tritón X-100 al 1% a razón de 5:1 con respecto del peso de

la muestra.

c) Se agita durante 5 minutos para realizar un lavado del sustrato sólido formando una

suspensión turbia donde está contenida la enzima.

d) Se deja que sedimenten los desechos sólidos grandes y con ayuda de la jeringuilla de 5 mL

se extrae la suspensión sobrenadante y luego se lo coloca en un tubo con rosca.

e) Se centrifugan las muestras a 3500 rpm durante 30 minutos, obteniendo así los extractos

crudos que se utilizan en los diferentes ensayos de actividad enzimática.

f) Se extrae 1mL de la solución sobrenadante obtenida después de la centrifugación y se la

diluye en 9 mL de una solución estéril de Tritón X-100 al 1%.

2.5.5. Determinación de la actividad enzimática de xilanasa. Para determinar la actividad de la

xilanasa se usó el método colorimétrico de Miller (1959), el cual hace uso del reactivo DNS

(acido 3,5 dinitrosalicílico) de color amarillo, que reacciona con azúcares reductores tales como

glucosa, xilosa, fructosa, maltosa, lactosa, entre otros, para generar ácido 3-amino-5-nitro-

salicílico de color rojo y cuya absorbancia se mide a 546nm.

2.5.5.1. Construcción de la curva de calibración. Las muestras para la elaboración de la curva

de calibración fueron preparadas de acuerdo a lo descrito en la tabla 11.

Tabla 11. Preparación curva de calibración xilanasa.

No Tubo Xilosa (mg/mL) Volumen (mL)

Xilosa (1mg/mL)

Volumen (mL)

Agua destilada

Blanco 0 0 1,5

1 0,1 0,15 1,35

2 0,2 0,3 1,2

3 0,3 0,45 1,05

4 0,5 0,75 0,75

5 0,75 1,13 0,37

a) Después de agregar cada uno de los reactivos descritos en la tabla se procede a agregar 1,5

mL de DNS.

b) Se hierven las muestras a baño maría durante 5 minutos, luego se deja enfriar en baño de

agua helada durante aproximadamente 10 min.

c) Se mide la absorbancia a una longitud de onda de 546 nm y con los datos obtenidos se

construye la curva de calibración.

32

2.5.5.2. Protocolo ensayo actividad enzimática de xilanasa. El detalle del procedimiento para

cada muestra de extracto crudo correctamente diluido es el siguiente:

a) En un tubo con rosca se agrega 1 mL de solución de Birchwood xilano al 0,5% p/v en

buffer de citrato 0,05 M y pH de 5,3.

b) Se agrega 0,5 mL de extracto enzimático crudo correctamente diluido.

c) Se incuba la muestra a 50 ᵒC por un tiempo de 10 minutos para que se forme xilosa.

d) Después del tiempo de incubación se agrega 1,5 mL de DNS.

e) Se hierven las muestras en baño maría por 5 minutos, luego se dejan enfriar en baño de

agua helada por aproximadamente 45 minutos.

f) Se mide la absorbancia a una longitud de onda de 546 nm y se registran los valores

obtenidos.

g) Con los valores de absorbancia obtenidos y con ayuda de la curva de calibración se calcula

la concentración de enzima.

2.5.6. Evaluación cualitativa del potencial blanqueador de la xilanasa. La finalidad de esta

parte experimental es de comprobar de forma cualitativa el potencial blanqueador de la enzima

obtenida experimentalmente. Para eso fue necesaria la elaboración de una pequeña muestra de

pulpa de papel a partir de corteza de árbol.

Para completar esta parte del trabajo se comparan los resultados obtenidos con la enzima con

resultados obtenidos con muestras de pulpa de papel tratadas con Hipoclorito de sodio y

Peróxido de hidrógeno.

A continuación se detalla el procedimiento utilizado:

2.5.6.1. Elaboración de pulpa de papel.

a) Se sumerge la corteza de árbol seca en una baño de solución de hidróxido de sodio al 10%

v/v por aproximadamente 20 minutos con agitación.

b) Se licúa la muestra hasta obtener una pasta de la corteza de árbol.

c) Se separa el líquido sobrante y se lava la pasta obtenida con abundante agua.

d) Se deja secar la pasta de papel obtenida por 24 horas.

33

2.5.6.2. Ensayo de blanqueamiento de pasta de papel.

a) Se pesan 9 muestras de 0,5 gramos de pasta de papel seca y se las coloca en tubos de ensayo.

b) En los tres primeros tubos se realizan las pruebas con peróxido de hidrogeno a distintas

concentraciones. En el primer tubo se colocan 10 mL de solución al 4% p/v, al segundo tubo

10 mL de solución al 4,5% p/v y al tercer tubo 10 mL de solución al 5% p/v.

c) En los segundos tres tubos se realizan las pruebas con la xilanasa obtenida

experimentalmente a distintas proporciones. En el primer tubo se coloca 1mL de solución de

0,4 UI/g sustrato seco, en el segundo tubo se coloca 1,5 mL de la misma solución y en el

tercer tubo se colocan 2 mL de la misma solución. En cada tubo se completa 10 mL de

solución aumentando buffer de citrato de pH de 5,3.

d) En los últimos tres tubos se realizan las pruebas con Hipoclorito de sodio a distintas

concentraciones. En el primer tubo se colocan 10 mL de solución al 4% v/v, en el segundo

tubo se colocan 10 mL de solución al 5%v/v y en el tercer tubo se colocan 10 mL de

solución al 5%v/v.

e) Se sella adecuadamente cada uno de los tubos y se somete a calentamiento a 50 ᵒC por 10

minutos.

f) Se deja secar las muestras después de cada tratamiento y con ayuda de un escáner se obtiene

una imagen de las mismas.

g) Con la imagen obtenida en escala de grises, se compara la claridad de cada muestra con la

escala de Munsell y así se determina el porcentaje de blancura obtenido.

34

3. DATOS EXPERIMENTALES

3.1. Curva de calibración.

A continuación se presenta la tabla con los datos de absorbancias obtenidos a partir de

soluciones de xilosa de distintas concentraciones, necesarios para la construcción de la curva de

calibración para el ensayo de actividad xilanasa.

Tabla 12. Curva de calibración para el ensayo de la actividad de la xilanasa.

Xilosa

(mg/mL)

Abs 546

0 0,05

0,1 0,078

0,2 0,114

0,3 0,222

0,5 0,363

0,75 0,531

1 0,674

Gráfico 1. Curva de calibración ensayo xilanasa.

y = 0,661x + 0,0211 R² = 0,9918

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

Ab

s 54

6

Xilosa (mg/mL)

Curva de calibración Xilosa

rayto

Lineal (rayto)

35

3.2. Absorbancias obtenidas para cada ensayo.

En las siguientes tablas se encuentran tabulados los valores de absorbancia obtenidos en cada

muestra de cada uno de los ensayos realizados de las diferentes combinaciones de cepa-sustrato.

Valor máximo

Valor mínimo

3.2.1. Ensayos combinación Penicillium corylophilum/Piña

Tabla 13. Absorbancias obtenidas en combinación Penicillium corylophilum/Piña

Absorbancia 546 (nm)

Tiempo

(días) A1 B1 C1 D1 E1 F1 G1 H1 I1

1 0,889 0,894 1,554 1,036 1,06 0,418 0,402 0,507 0,599

3 1,121 0,855 0,55 0,934 0,768 0,633 0,785 0,463 0,321

5 0,655 0,515 0,579 0,452 0,322 0,568 0,378 0,455 0,378

7 0,525 0,541 0,655 0,374 0,429 0,505 0,243 0,389 0,17

9 0,771 0,878 0,8 0,619 0,437 0,508 0,611 0,643 0,63

11 1,103 0,963 0,925 0,697 0,858 0,729 0,93 0,761 0,607

13 0,97 0,893 0,813 0,606 0,437 0,612 0,482 0,633 0,653

15 2,442 2,283 1,648 2,51 2,187 2,154 1,563 1,159 1,682

17 1,647 1,7 1,623 1,404 1,298 1,754 1,305 1,372 1,421

19 2,195 1,293 1,36 2,387 2,494 2,157 2,13 1,292 1,272

36

3.2.2. Ensayos combinación Apergillus terreus/Piña

Tabla 14. Absorbancias obtenidas en combinación Aspergillus terreus/Piña


Tiempo

(días) A2 B2 C2 D2 E2 F2 G2 H2 I2

1 0,55 0,393 0,361 0,607 0,291 0,3 0,312 0,283 0,259

3 0,272 0,275 0,222 0,632 0,263 0,267 0,232 0,267 0,239

5 0,41 0,274 0,363 0,227 0,187 0,179 0,23 0,264 0,194

7 0,48 0,499 0,447 0,241 0,231 0,254 0,257 0,23 0,254

9 0,556 0,438 0,459 0,255 0,29 0,222 0,228 0,234 0,222

11 2,05 2,082 1,211 0,718 0,632 1,31 1,39 0,796 1,685

13 1,255 1,714 1,637 1,307 0,361 1,267 0,699 0,629 0,627

15 2,09 1,529 1,434 0,589 0,594 0,51 1,4 1,092 0,927

17 1,283 1,143 0,9 0,329 0,34 0,334 0,352 0,404 0,444

19 0,978 0,898 0,955 0,344 0,321 0,412 0,47 0,398 0,378

3.2.3. Ensayos combinación Penicillium corylophilum/ Maracuyá

Tabla 15. Absorbancias obtenidas en combinación Penicillium corylophilum/ Maracuyá


Tiempo

(días) A3 B3 C3 D3 E3 F3 G3 H3 I3

1 0,261 0,251 0,271 0,306 0,308 0,387 0,277 0,315 0,258

3 0,357 0,173 0,149 0,246 0,4 0,331 0,416 0,243 0,346

5 0,266 0,318 0,235 0,232 0,214 0,267 0,267 0,292 0,268

7 0,298 0,314 0,317 0,271 0,305 0,301 0,287 0,463 0,466

9 0,87 0,91 1,232 1,62 1,156 1,427 1,343 1,538 1,116

11 1,481 1,117 0,399 1,343 0,819 1,09 1,234 0,961 1,881

13 0,829 0,595 0,584 0,629 0,448 0,718 1,19 1,029 0,566

15 0,392 0,555 0,309 0,222 0,279 0,244 0,283 0,281 0,308

17 0,509 0,53 0,313 0,286 0,258 0,432 0,436 0,321 0,35

19 0,467 0,423 0,388 0,233 0,211 0,375 0,47 0,398 0,378

37

3.2.4. Ensayos combinación Aspergillus terreus/ Maracuyá

Tabla 16. Absorbancias obtenidas en combinación Aspergillus terreus/ Maracuyá


Tiempo

(días) A4 B4 C4 D4 E4 F4 G4 H4 I4

1 0,357 0,514 0,26 0,415 0,915 0,604 0,384 0,38 0,227

3 0,237 0,212 0,178 0,236 0,355 0,172 0,277 0,291 0,175

5 0,426 0,24 0,213 0,325 0,322 0,21 0,256 0,305 0,249

7 0,296 0,279 0,181 0,263 0,242 0,265 0,258 0,28 0,21

9 0,628 1,298 0,834 0,473 1,488 2,569 0,331 0,653 0,82

11 0,449 0,646 1,166 0,786 0,825 1,331 0,468 0,5 1,215

13 0,418 0,291 1,293 1,468 0,558 0,936 0,471 0,343 0,939

15 0,33 0,297 0,247 0,375 0,347 0,276 0,327 0,29 0,604

17 0,406 0,291 0,233 0,434 0,339 0,2885 0,409 0,271 0,236

19 0,367 0,332 0,214 0,39 0,304 0,252 0,383 0,251 0,198

3.3. Potencial de Blanqueamiento.

Los datos obtenidos en el análisis de potencial de blanqueamiento se pueden observar en el

Anexo F 4 y F 5.

38

4. CÁLCULOS

4.1. Cálculos para la actividad enzimática de xilanasa.

4.1.1. Reordenamiento de ecuación de la curva y cálculo de la concentración de xilosa. En

este punto se realiza el reordenamiento de la ecuación obtenida en la construcción de la curva de

calibración, esta ecuación reordenada será utilizada para realizar el cálculo de la concentración

de xilosa producida por la enzima al descomponer el xilano.

En base a la ecuación (1)

(2)

Cálculo modelo A1 en t = 1dia:

[

]

Siendo:

x: concentración de xilosa [mg/mL]

y: Absorbancia a 546 nm

4.1.2. Cálculo de unidades de actividad enzimática de xilanasa por gramo de sustrato. En el

presente punto se realiza el cálculo de las unidades de actividad enzimática de xilanasa por

gramo de sustrato seco. Para esto es necesario el uso de la concentración de xilosa calculada en

el punto anterior la cual es transformada a las unidades requeridas con la ayuda de distintos

valores numéricos los cuales se muestran en el cálculo modelo.

(3)

39

Cálculo modelo:

[

] [ ]

[ ] [

]

Siendo:

UI/g: Unidades de actividad xilanasa por gramo de sustrato sólido.

Cxp: Concentración de xilosa producida.

Ven: Volumen de ensayo

Fd: Factor de dilución.

Vez: Volumen de extracto crudo enzimático.

Fe: Factor de extracción.

Te: Tiempo de ensayo.

4.2. Cálculos para las pruebas estadísticas de análisis de varianza ANOVA, obtenida

mediante el programa SPSS

A continuación se detallan los cálculos estadísticos efectuados para analizar las diferencias en la

varianza de los valores de actividad enzimática para cada uno de los ensayos realizados (cepa,

sustrato y combinación cepa/sustrato). Se evalúan el estadístico F y la significación S para cada

análisis de varianza ANOVA con el fin de concluir si los valores obtenidos son significativos

dentro de una confiabilidad del 95%.

4.2.1. Cálculo de la suma de los cuadrados de los factores (intergrupo) y suma de los

cuadrados de los errores de la variación en cada factor (intragrupo o error).

∑

(4)

∑

(5)

40

Siendo:

SSFactores: Sumatoria de los cuadrados de los factores

Factor i del total de los factores

SSerrores: Sumatoria de los cuadrados de los errores

Error i del total de los errores

: Número de muestras

4.2.2. Cálculo de los grados de libertad para el intergrupo e intragrupo o error de los

componentes.

(6)

(7)

Siendo:

: Grados de libertad del intergrupo o referidos a los factores

: Grados de libertad del intragrupo o referidos a los errores

t: Niveles presentes en el experimento

N: Número total de valores de la variable medida

4.2.3. Cálculo del cuadrado medio para el intergrupo e intragrupo o error de los componentes.

(8)

(9)

Siendo:

T’: Cuadrado medio para el intergrupo o referido a los factores

E: Cuadrado medio para el intragrupo o referido a los errores

41

4.2.4. Cálculo del estadístico Fs e interpretación de la significación S para una confiabilidad

del 95 %

(10)

(11)

(12)

Siendo:

Fs: Estadístico para la distribución F

: Varianza para la variable a

: Varianza para la variable b

H0: Hipótesis nula (producción de enzima significativamente semejante para los distintos

experimentos)

Ha: Hipótesis alternativa (producción de enzima no es significativamente semejante para los

distintos experimentos)

S: Significación del análisis de varianza.

42

5. RESULTADOS


Penicillium corylophylum/Piña.

En las siguientes tablas se muestran los valores de la concentración de xilosa y de la actividad

enzimática de xilanasa en UI/g de sustrato seco obtenidos en los ensayos realizados utilizando la

combinación Penicillium corylophilum/Piña


Penicillium corylophilum/Piña

A1 B1 C1 D1 E1

Tiempo

(días)

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

1 1,3130 0,1970 1,3206 0,1981 2,3191 0,3479 1,5354 0,2303 1,5717 0,2358

3 1,6640 0,2496 1,2616 0,1892 0,8002 0,1200 1,3811 0,2072 1,1300 0,1695

5 0,9590 0,1439 0,7472 0,1121 0,8440 0,1266 0,6519 0,0978 0,4552 0,0683

7 0,7623 0,1143 0,7865 0,1180 0,9590 0,1439 0,5339 0,0801 0,6171 0,0926

9 1,1345 0,1702 1,2964 0,1945 1,1784 0,1768 0,9045 0,1357 0,6292 0,0944

11 1,6368 0,2455 1,4250 0,2137 1,3675 0,2051 1,0225 0,1534 1,2661 0,1899

13 1,4356 0,2153 1,3191 0,1979 1,1980 0,1797 0,8849 0,1327 0,6292 0,0944

15 3,6625 0,5494 3,4219 0,5133 2,4613 0,3692 3,7654 0,5648 3,2767 0,4915

17 2,4598 0,3690 2,5399 0,3810 2,4234 0,3635 2,0921 0,3138 1,9318 0,2898

19 3,2888 0,4933 1,9242 0,2886 2,0256 0,3038 3,5793 0,5369 3,7411 0,5612

43

Continuación tabla 17

F1 G1 H1 I1

Tiempo

(días)

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

1 0,6005 0,0901 0,5762 0,0864 0,7351 0,1103 0,8743 0,1311

3 0,9257 0,1389 1,1557 0,1734 0,6685 0,1003 0,4537 0,0681

5 0,8274 0,1241 0,5399 0,0810 0,6564 0,0985 0,5399 0,0810

7 0,7321 0,1098 0,3357 0,0504 0,5566 0,0835 0,2253 0,0338

9 0,7366 0,1105 0,8924 0,1339 0,9408 0,1411 0,9212 0,1382

11 1,0710 0,1606 1,3750 0,2063 1,1194 0,1679 0,8864 0,1330

13 0,8939 0,1341 0,6973 0,1046 0,9257 0,1389 0,9560 0,1434

15 3,2268 0,4840 2,3327 0,3499 1,7215 0,2582 2,5127 0,3769

17 2,6216 0,3932 1,9424 0,2914 2,0437 0,3066 2,1179 0,3177

19 3,2313 0,4847 3,1905 0,4786 1,9227 0,2884 1,8924 0,2839

En el gráfico 2 se representa la variación de la producción de la enzima xilanasa en función del

tiempo para el ensayo 1 de la combinación Penicillium corylophilum/Piña.


Penicillium corylophilum/Piña

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)

UI=f(Tiempo) Ensayo 1 Penicillium corylophilum/Piña

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

44


tiempo para el ensayo 2 de la combinación Penicillium corylophilum/Piña.

Gráfico 3. Actividad enzimática de xilanasa en función del tiempo de

ensayo 2 Penicillium corylophilum/Piña


tiempo para las diferentes muestras obtenidas en el ensayo 3 de la combinación Penicillium

corylophilum/Piña.


ensayo 3 Penicillium corylophilum/Piña

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)

UI=f(Tiempo) Ensayo 2 Penicillium corylophilum/Piña

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)

UI=f(tiempo) Ensayo 3 Penicillium corylophilum/Piña

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

45


tiempo para el promedio de cada ensayo de la combinación Penicillium corylophilum/Piña.


(Promedio) Penicillium corylophilum/Piña


Aspergillus terreus/Piña.

En las siguientes tablas se muestran los valores de concentración de xilosa y de actividad


combinación Aspergillus terreus/Piña.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)

UI=f(Tiempo) Ensayos (Promedio) Penicillium corylophilum/Piña

Ensayo 1 PP

Ensayo 2PP

Ensayo 3 PP

46


Aspergillus terreus/Piña

A2 B2 C2 D2 E2

Tiempo

(días)

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

1 0,8002 0,1200 0,5626 0,0844 0,5142 0,0771 0,8864 0,1330 0,4083 0,0612

3 0,3796 0,0569 0,3841 0,0576 0,3039 0,0456 0,9242 0,1386 0,3660 0,0549

5 0,5884 0,0883 0,3826 0,0574 0,5172 0,0776 0,3115 0,0467 0,2510 0,0376

7 0,6943 0,1041 0,7230 0,1084 0,6443 0,0966 0,3327 0,0499 0,3175 0,0476

9 0,8092 0,1214 0,6307 0,0946 0,6625 0,0994 0,3539 0,0531 0,4068 0,0610

11 3,0694 0,4604 3,1179 0,4677 1,8002 0,2700 1,0543 0,1581 0,9242 0,1386

13 1,8667 0,2800 2,5611 0,3842 2,4446 0,3667 1,9454 0,2918 0,5142 0,0771

15 3,1300 0,4695 2,2812 0,3422 2,1375 0,3206 0,8592 0,1289 0,8667 0,1300

17 1,9091 0,2864 1,6973 0,2546 1,3297 0,1994 0,4658 0,0699 0,4825 0,0724

19 1,4477 0,2171 1,3266 0,1990 1,4129 0,2119 0,4885 0,0733 0,4537 0,0681


F2 G2 H2 I2

Tiempo

(días)

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

1 0,4219 0,0633 0,4401 0,0660 0,3962 0,0594 0,3599 0,0540

3 0,3720 0,0558 0,3191 0,0479 0,3720 0,0558 0,3297 0,0494

5 0,2389 0,0358 0,3160 0,0474 0,3675 0,0551 0,2616 0,0392

7 0,3523 0,0529 0,3569 0,0535 0,3160 0,0474 0,3523 0,0529

9 0,3039 0,0456 0,3130 0,0470 0,3221 0,0483 0,3039 0,0456

11 1,9499 0,2925 2,0710 0,3106 1,1723 0,1758 2,5172 0,3776

13 1,8849 0,2827 1,0256 0,1538 0,9197 0,1380 0,9166 0,1375

15 0,7396 0,1109 2,0861 0,3129 1,6201 0,2430 1,3705 0,2056

17 0,4734 0,0710 0,5006 0,0751 0,5793 0,0869 0,6398 0,0960

19 0,5914 0,0887 0,6791 0,1019 0,5702 0,0855 0,5399 0,0810

47


tiempo de cada muestra obtenida en el ensayo 1 de la combinación Aspergillus terreus/Piña.


ensayo 1 Aspergillus terreus/Piña




Aspergillus terreus/Piña.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)

UI=f(Tiempo) Ensayo 1 Aspergillus terreus/Piña

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)


Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

48




ensayo 3 Aspergillus terreus/Piña


tiempo para el promedio de cada ensayo de la combinación Aspergillus terreus/Piña.


ensayos (Promedio) Aspergillus terreus/Piña.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 5 10 15 20

UI/

g

Tíiempo (dias)


Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo(dias)

UI=f(Tiempo) Ensayos (Promedio) Aspergillus terreus/Piña

Ensayo 1 AP

Ensayo 2 AP

Ensayo 3 AP

49


Penicillium corylophilum/ Maracuyá.



combinación Penicillium corylophilum/Maracuyá.


Penicillium corylophilum/ Maracuyá

A3 B3 C3 D3 E3

Tiempo

(días)

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

1 0,3629 0,0544 0,3478 0,0522 0,3781 0,0567 0,4310 0,0647 0,4340 0,0651

3 0,5082 0,0762 0,2298 0,0345 0,1935 0,0290 0,3402 0,0510 0,5732 0,0860

5 0,3705 0,0556 0,4492 0,0674 0,3236 0,0485 0,3191 0,0479 0,2918 0,0438

7 0,4189 0,0628 0,4431 0,0665 0,4477 0,0671 0,3781 0,0567 0,4295 0,0644

9 1,2843 0,1926 1,3448 0,2017 1,8319 0,2748 2,4189 0,3628 1,7169 0,2575

11 2,2086 0,3313 1,6579 0,2487 0,5717 0,0858 1,9998 0,3000 1,2071 0,1811

13 1,2222 0,1833 0,8682 0,1302 0,8516 0,1277 0,9197 0,1380 0,6458 0,0969

15 0,5611 0,0842 0,8077 0,1212 0,4356 0,0653 0,3039 0,0456 0,3902 0,0585

17 0,7381 0,1107 0,7699 0,1155 0,4416 0,0662 0,4008 0,0601 0,3584 0,0538

19 0,6746 0,1012 0,6080 0,0912 0,5551 0,0833 0,3206 0,0481 0,2873 0,0431


F3 G3 H3 I3

Tiempo

(días)

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

1 0,5536 0,0830 0,3871 0,0581 0,4446 0,0667 0,3584 0,0538

3 0,4688 0,0703 0,5974 0,0896 0,3357 0,0504 0,4915 0,0737

5 0,3720 0,0558 0,3720 0,0558 0,4098 0,0615 0,3735 0,0560

7 0,4234 0,0635 0,4023 0,0603 0,6685 0,1003 0,6731 0,1010

9 2,1269 0,3190 1,9998 0,3000 2,2949 0,3442 1,6564 0,2485

11 1,6171 0,2426 1,8349 0,2752 1,4219 0,2133 2,8138 0,4221

13 1,0543 0,1581 1,7684 0,2653 1,5248 0,2287 0,8244 0,1237

15 0,3372 0,0506 0,3962 0,0594 0,3932 0,0590 0,4340 0,0651

17 0,6216 0,0932 0,6277 0,0942 0,4537 0,0681 0,4976 0,0746

19 0,5354 0,0803 0,6791 0,1019 0,5702 0,0855 0,5399 0,0810

50


tiempo de cada muestra obtenida en el ensayo 1 de la combinación Penicillium

corylophilum/Maracuyá.


ensayo 1 Penicillium corylophilum/ Maracuyá.



coryllophilum/Maracuyá.

Gráfico 11. Actividad enzimática de xilanasa en función del tiempo de ensayo

2 Penicillium corylophilum/Maracuyá.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)

UI=f(Tiempo) Ensayo 1 Penicillium corylophilum/Maracuyá

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)

UI=f(Tiempo) Ensayo 2 Penicillium corylophilum/Maracuyá.

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

51



corylophilum/Maracuyá.


ensayo 3 Penicillium corylophilum/Maracuyá.

En la gráfica 13 se representa la variación de la producción de la enzima xilanasa en función del

tiempo para el promedio de cada ensayo de la combinación Penicillium corylophilum/Maracuyá.


Penicillium corylophilum/Maracuyá.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)

UI=f(Tiempo) Ensayo 3 Penicillium corylophilum/Maracuyá.

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)

UI=f(Tiempo) Ensayos (Promedio) Penicillium corylophilum/Maracuyá

Ensayo 1 PM

Ensayo 2 PM

Ensayo 3 PM

52


Aspergillus terreus/Maracuyá.



combinación Aspergillus terreus/Maracuyá.


Aspergillus terreus/Maracuyá

A4 B4 C4 D4 E4

Tiempo

(días)

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

1 0,5082 0,0762 0,7457 0,1119 0,3614 0,0542 0,5959 0,0894 1,3523 0,2029

3 0,3266 0,0490 0,2888 0,0433 0,2374 0,0356 0,3251 0,0488 0,5051 0,0758

5 0,6126 0,0919 0,3312 0,0497 0,2903 0,0435 0,4598 0,0690 0,4552 0,0683

7 0,4159 0,0624 0,3902 0,0585 0,2419 0,0363 0,3660 0,0549 0,3342 0,0501

9 0,9182 0,1377 1,9318 0,2898 1,2298 0,1845 0,6837 0,1025 2,2192 0,3329

11 0,6474 0,0971 0,9454 0,1418 1,7321 0,2598 1,1572 0,1736 1,2162 0,1824

13 0,6005 0,0901 0,4083 0,0612 1,9242 0,2886 2,1890 0,3283 0,8123 0,1218

15 0,4673 0,0701 0,4174 0,0626 0,3418 0,0513 0,5354 0,0803 0,4930 0,0740

17 0,5823 0,0873 0,4083 0,0612 0,3206 0,0481 0,6247 0,0937 0,4809 0,0721

19 0,5233 0,0785 0,4703 0,0706 0,2918 0,0438 0,5581 0,0837 0,4280 0,0642


F4 G4 H4 I4

Tiempo

(días)

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

Conc

(mg/mL) UI/g

1 0,8818 0,1323 0,5490 0,0824 0,5430 0,0814 0,3115 0,0467

3 0,2283 0,0342 0,3871 0,0581 0,4083 0,0612 0,2328 0,0349

5 0,2858 0,0429 0,3554 0,0533 0,4295 0,0644 0,3448 0,0517

7 0,3690 0,0553 0,3584 0,0538 0,3917 0,0588 0,2858 0,0429

9 3,8546 0,5782 0,4688 0,0703 0,9560 0,1434 1,2086 0,1813

11 1,9817 0,2973 0,6761 0,1014 0,7245 0,1087 1,8062 0,2709

13 1,3841 0,2076 0,6806 0,1021 0,4870 0,0730 1,3887 0,2083

15 0,3856 0,0578 0,4628 0,0694 0,4068 0,0610 0,8818 0,1323

17 0,4045 0,0607 0,5868 0,0880 0,3781 0,0567 0,3251 0,0488

19 0,3493 0,0524 0,5475 0,0821 0,3478 0,0522 0,2676 0,0401

53


tiempo de cada muestra obtenida en el ensayo de la combinación Aspergillus terreus/Maracuyá.


ensayo 1 Aspergillus terreus/Maracuyá.


tiempo de cada muestra obtenida en el ensayo 2 de la combinación Aspergillus terreus-

Maracuyá.


ensayo 2 Aspergillus terreus/Maracuyá.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)

UI=f(Tiempo) Ensayo 1 Aspergillus terreus/Maracuyá

Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)


Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

54


tiempo de cada muestra obtenida en el ensayo 3 de la combinación Aspergillus

terreus/Maracuyá.


ensayo 3 Aspergillus terreus/Maracuyá


tiempo para el promedio de cada ensayo de la combinación Aspergillus terreus/Maracuyá.


ensayos Aspergillus terreus/Maracuyá.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)


Muestra 1

Muestra 2

Muestra 3

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 5 10 15 20

UI/

g

Tiempo (dias)

UI=f(Tiempo) Ensayos (Promedio) Aspergillus terreus/Maracuyá

Ensayo 1 AM

Ensayo 2 AM

Ensayo 3 AM

55

5.5. Rendimiento acumulado de la producción total de enzima.

En el grafico 18 se representa una comparación del rendimiento acumulado de la producción de

la enzima xilanasa a los 19 días de experimentación de todos los ensayos.

Gráfico 18. Rendimiento acumulado de la producción de la enzima xilanasa en

función de los 19 días de experimentación.

5.6. Resultados de las pruebas estadísticas de análisis de varianza ANOVA, obtenida

mediante el programa SPSS.

5.6.1. Resultados de los análisis estadísticos de varianza y significación según cepa

seleccionada. En la tabla 21 se muestran los resultados de la varianza y significación según la

cepa seleccionada, obtenidos mediante el programa SPSS, necesarios para determinar cuál de las

dos cepas utilizadas en este trabajo presenta una mayor producción de la enzima xilanasa.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Enzi

ma

Pro

du

cid

a(U

I to

tal/

g)

Tiempo (19 dias de producción)

Rendimiento acumulado

Ensayo 1 PP

Ensayo 2 PP

Ensayo 3 PP

Ensayo 1 AP

Ensayo 2 AP

Ensayo 3 AP

Ensayo 1 PM

Ensayo 2 PM

Ensayo 3 PM

Ensayo 1 AM

Ensayo 2 AM

Ensayo 3 AM

56

Tabla 21. Análisis estadístico de varianza y significación según cepa seleccionada

ANOVA Pe As Total

N 180 180 360

Media 0,168781 0,120357 0,144569

Desviación estándar 0,126361 0,101374 0,1169325

Error estándar 0,009418 0,007556 0,0061629

95% Intervalo de

confianza

Bajo 0,150196 0,105447 0,132449

Alto 0,187366 0,135268 0,156689

Mínimo 0,029 0,0342 0,029

Máximo 0,5648 0,5782 0,5782

Significación

SS G

Cuadrado

medio Fs S *

Intergrupo 0,211 1 0,211

16,083 0 Intragrupo 4,698 358 0,013

Total 4,909 359

*El valor promedio de producción para ambos casos es significativamente diferente, dando el

mejor resultado Penicillium corylophilum.

5.6.2. Resultado del análisis estadístico de varianza y significación según sustrato

seleccionado. En la tabla 22 se muestran los resultados de la varianza y significación según el

sustrato seleccionado, obtenidos mediante el programa SPSS, necesarios para determinar cuál de

los dos sustratos utilizados en este trabajo presenta una mayor producción de la enzima xilanasa.

57

Tabla 22. Análisis de varianza y significación según sustrato seleccionado.

ANOVA Pi Ma Total

N 180 180 360

Media 0,178761 0,110378 0,144569

Desviación estándar 0,131248 0,088575 0,116932

Error estándar 0,0097827 0,006602 0,006162

95% Intervalo de

confianza

Bajo 0,159457 0,09735 0,132449

Alto 0,198065 0,123405 0,156289

Mínimo 0,0338 0,0290 0,029

Máximo 0,5648 0,5782 0,5782

Significación

SS G

Cuadrado

medio Fs S *


33,573 0 Intragrupo 4,488 358 0,013

Total 4,909 359

* El valor promedio de producción para ambos casos es significativamente diferente, dando el

mejor resultado el sustrato de Piña.

5.6.3. Resultado del análisis estadístico de varianza y significación según combinación

cepa/sustrato. En la tabla 23 se muestran los resultados de la varianza y significación según la

combinación cepa/sustrato, obtenidos mediante el programa SPSS, necesarios para determinar

cuál combinación utilizada en este trabajo presenta una mayor producción de la enzima xilanasa.

58

Tabla 23. Análisis de varianza y significación según combinación cepa-sustrato

ANOVA PP PM AP AM Total

N 90 90 90 90 360

Media 0,220182 0,11738 0,13734 0,103375 0,144569

Desviación estándar 0,136648 0,089985 0,1118165 0,08707 0,116932

Error estándar 0,014404 0,009485 0,0117865 0,009178 0,006162

95% Intervalo de Bajo 0,191561 0,098533 0,11392 0,08513 0,132449

confianza Alto 0,248802 0,136227 0,160759 0,121613 0,156688

Mínimo 0,0338 0,0358 0,0358 0,0342 0,029

Máximo 0,5648 0,469 0,4695 0,5782 0,5782

Significación

SS G

Cuadrado

medio Fs S *


21,015 0

Intragrupo 4,17 356 0,012

Total 4,909 359

*El valor promedio de producción para los cuatro casos es significativamente diferente, dando el

mejor resultado la combinación Penicillium corylophilum/Piña.

5.7. Resultados del ensayo del potencial de blanqueamiento.

La tabla 24 presenta el grado de blanqueamiento que presentaron las distintas muestras de pasta

de papel en presencia de los diferentes compuestos blanqueadores a diferentes concentraciones.

Todas las muestras fueron incubadas a la misma temperatura por el mismo periodo de tiempo.

59

Tabla 24. Resultados del potencial de blanqueamiento

Sustancia Muestra (g) Volumen (ml) Concentración

Grado de

blanqueamiento %

(*)

Muestra

Cruda 0,5 - - 0

Peróxido de

hidrogeno

0,5 10 4 % p/v 30

0,5 10 4,5% p/v 20

0,5 10 5% p/v 20

Xilanasa

Experimental

0,5 1 + 9ml H2O 0,4 U/g 50

0,5 1,5+8,5mL H2O 0,4 U/g 40

0,5 2+8mL H2O 0,4 U/g 30

Hipoclorito

de sodio

0,5 10 4 % p/v 60

0,5 10 4,5% p/v 50

0,5 10 5%p/v 40

*El grado de blanqueamiento está basado en una comparación entre las imágenes escaneadas y

transformadas a escala de grises de las muestras con la escala de Munsell como se puede

observar en el Anexo F 5.

60

6. DISCUSIÓN

Actividad Enzimática

Los valores de la actividad enzimática de la xilanasa en cada uno de los ensayos de la

combinación Penicillium corylophilum/Piña, presentan una tendencia similar con un

incremento significativo en el día 15 de incubación (Véase gráfico 5), con excepción de las

muestras obtenidas en el ensayo 3, ya que estas presentan un incremento en el mismo día

pero no tan considerable como los ensayos 1 y 2. Esta variación pudo ser producida por una

alteración en el acondicionamiento del sustrato con una pérdida considerable de humedad y

limitando el crecimiento del microorganismo y por ende la producción de la enzima.

En los ensayos realizados con la combinación Aspergillus terreus/Piña se logra observar

que la mayor producción de la enzima xilanasa se presentó en el periodo comprendido entre

el día 11 y el día 15 (Véase gráfico 9), presentando un punto de decrecimiento en todas las

muestras en el día 13, el cual pudo ser ocasionado por una momentánea inactividad de una

parte de los micelios productores de enzima muy posiblemente en el día 12.

Observando los resultados obtenidos en los ensayos de la combinación Penicillium

corylophilum/Maracuyá se logra identificar que los puntos de mayor producción enzimática

se presentan en los días 9 y 11, presentando una tendencia similar para cada ensayo (Véase

gráfico 13). Sin embargo los valores de UI/g son menores que los valores obtenidos en la

combinación Penicillium corylophilum/Piña debido a los bajos valores de hemicelulosa

presentes en los desechos de maracuyá.

Para la última combinación Aspergillus terreus/Maracuyá, observando el gráfico 17 se

puede apreciar que el punto más alto de la producción enzimática para la mayor parte de las

muestras se presentó en el día 9. Sin embargo las muestras obtenidas en el ensayo 3 no

presentan mayor variación y tampoco un incremento considerable en la producción en

ningún día. Esto pudo haber sido causado por un pobre crecimiento de los micelios

observado en este ensayo. Otro punto a discutir es, que los valores de UI/g obtenidos con

esta combinación son menores a los obtenidos con la combinación Aspegillus terreus/Piña

61

debido al bajo contenido de hemicelulosa en el sustrato como se mencionó en el anterior

punto.

En el rendimiento acumulado (Véase gráfico 18), se considera la suma de cada ensayo

efectuado para las diferentes combinaciones en los 19 días de experimentación, por lo que

pueden existir errores en base a esta cuantificación, ya que las mediciones se hicieron

independientemente con muestras de aproximadamente 2 gramos para cada tiempo y no

como un total de 20 gramos de sustrato. Sin embargo la combinación Penicillium

corylophilum/Piña igual presentó un mayor rendimiento frente a las demás combinaciones.

Blanqueamiento de papel

Como se puede observar en la tabla 24, los resultados obtenidos son cualitativos y se

refieren a un diseño comparativo creado arbitrariamente durante el desarrollo experimental

con el fin de comparar de manera superficial las diferencias entre el proceso de

blanqueamiento efectuado con reactivos convencionales (Hipoclorito de sodio y Peróxido

de hidrógeno) y la enzima obtenida experimentalmente (xilanasa);por lo explicado

anteriormente, los resultados se restringen a la apreciación del observador y no a una

cuantificación exacta.

Los valores obtenidos para el blanqueamiento de la pulpa de papel mediante el hipoclorito

de sodio a diferentes concentraciones fueron los menos satisfactorios. Esto pudo deberse a

que el reactivo utilizado era de carácter comercial y de concentración muy baja. También

las posibles impurezas que pudo tener este reactivo no permitieron alcanzar un mayor grado

de blanqueamiento. En contraste, el peróxido de hidrogeno utilizado y la enzima obtenida

experimentalmente estaban presentes en un mayor grado de pureza, y fueron los que

presentaron mejores resultados en el blanqueamiento de la pulpa de papel.

Análisis de impacto económico.

En promedio el 95 % del papel kraft (variedad de papel mayoritariamente utilizado) se

blanquea con cloro, utilizando ClO2, Cl2, ClO-, entre otros. En la Unión Europea se emiten

en promedio 0,15 kg de compuestos organoclorados (COC) por cada tonelada de pulpa de

papel tratado, tomando en como referencia un Octoclorurodibenzo p-dioxina como el

compuesto más estudiado y a la vez más contaminante de los organoclorados provenientes

del blanqueamiento del papel. El desperdicio anteriormente mencionado es equivalente a

62

0,093 de ión cloro en los COC por cada tonelada de pulpa tratada. El 90% del cloro

dosificado para la etapa de blanqueamiento se concentra en los efluentes como ion cloro

constituyendo 0,83 kg ión cloro por cada tonelada de pulpa sometida al blanqueamiento. En

base en todas las cifras anteriores se tiene un consumo total de 0,93 kg de ión cloro por

cada tonelada de pulpa de papel, comúnmente proveniente de Hipoclorito de calcio

(Ca(ClO)2) al 65 %, lo que equivale a 115,2 USD por cada tonelada considerando el costo

de la materia prima 40 USD por cada kg de Ca(ClO)2 al 65 %.

En base a la prueba cualitativa efectuada y asumiendo que la xilanasa puede sustituir por

completo al cloro en el proceso de blanqueamiento con una concentración de 8000 U por

cada tonelada de pulpa, se analiza que el precio comercial de 8000 U de Xilanasa es de 300

USD con lo que esta sustitución resultaría económicamente poco conveniente; sin embargo

se debe considerar que en el proceso propuesto en este trabajo, el precio de la xilanasa

puede ser disminuido además de que se propone el uso de la enzima como un pre

tratamiento para disminuir el consumo de cloro en los tratamientos convencionales.

Haciendo todas estas últimas consideraciones y un estudio económico más detallado se

puede justificar el uso de la xilanasa en el proceso de blanqueamiento de papel.

El análisis del impacto económico se efectuó considerando primero la sustitución total del

cloro en el blanqueamiento y segundo el precio comercial de la enzima. En este análisis se

encuentran errores debido a que es necesario un estudio posterior para conocer el porcentaje

de sustitución del cloro que puede tener efecto, así como también considerar que el precio

de la enzima puede ser menor si se la obtiene mediante el proceso propuesto en este trabajo.

63

7. CONCLUSIONES

Actividad enzimática.

El día de producción máxima de la enzima xilanasa con la combinación Penicillium

corylophilum/Piña es aproximadamente el día 15.

Los resultados obtenidos en la combinación Aspergillus terreus/Piña indican que a

diferencia de los otros ensayos de las otras combinaciones cepas/sustrato, en este caso

existen dos puntos máximos de producción, los cuales se dan en el día 11 y 15.

La combinación Penicillium corylophilum/Maracuyá presenta su máxima producción

enzimática el día 11.

La producción enzimática máxima de la combinación Aspergillus terreus/Maracuyá se

alcanza de forma más rápida con respecto a las otras combinaciones, ya que esta se presenta

en el día 9 de incubación.

La combinación Penicillium corylophilum/Piña presenta el mejor rendimiento acumulado

(20 gramos) en los 19 días de experimentación.

Gracias a lo observado en los diferentes ensayos de las diferentes combinaciones, se

concluye que la cantidad de enzima producida no depende de la concentración de sustrato,

sino que depende de la concentración de micelio presente.

Análisis Estadístico.

En base a las pruebas del análisis de varianza (confiabilidad del 95%) se concluyó que el

promedio de los valores de producción de la enzima xilanasa para el caso de la cepa de

Penicillium corylophilum es mayor que el promedio presentado por la cepa de Aspergillus

terreus en la experiencia en general.

64

Al observar las pruebas de análisis de varianza (confiabilidad del 95%) realizadas

comparando los dos sustratos seleccionados para este trabajo, se concluye que el valor

promedio de producción maracuyá, por lo cual la piña es un mejor sustrato en combinación

con las dos cepas seleccionadas.

En base a los resultados obtenidos en el análisis de varianza (confiabilidad del 95%) que se

realizo comparando las cuatro combinaciones de cepa/sustrato, se puede concluir que la

combinación Penicillium corylophilum/Piña presenta un mayor promedio de producción de

la enzima xilanasa, frente a las tres combinaciones restantes.

En base a toda la información obtenida se concluyó que la mejor producción de la enzima

xilanasa se obtuvo con la cepa de Penicillium corylophilum fermentado en piña seca en el

día 15 de incubación.

Blanqueamiento de papel.

La enzima xilanasa obtenida experimentalmente dosificada en concentraciones de 0,4 UI/g

y volúmenes de 1 a 2 mL sobre una muestra de celulosa cruda de 0,5 g, tuvo un mejor

resultado de blanqueamiento que el Hipoclorito de sodio y más bajo que el Peróxido de

hidrogeno.

Análisis de impacto económico.

Se concluye que la xilanasa no puede reemplazar por completo a los compuestos clorados

en el proceso de blanqueamiento. Sin embargo puede utilizarse en un proceso de pre

tratamiento para disminuir la cantidad de compuestos clorados usados en procesos

posteriores.

65

8. RECOMENDACIONES

Para futuros trabajos de investigación sobre la obtención de xilanasa con micelios de

hongos fermentados en sustrato sólido se recomienda la utilización de la cepa de

Aspergillus terreus en combinación con sustratos y condiciones de crecimiento diferentes a

las utilizados en el presente trabajo, ya que esta especie de hongo presenta valores mayores

de producción enzimática en la bibliografía consultada y experiencias realizadas en otros

laboratorios.

Se recomienda realizar una investigación más amplia sobre la enzima obtenida, buscar

nuevas cepas y sustratos que generen un porcentaje mayor de producción. También se

recomienda poner énfasis en métodos de separación de esta enzima y posibles

modificaciones que se pueden aplicar a ésta para mejorar su resistencia al pH y a altas

temperaturas para que logren un mejor desempeño en el blanqueamiento de pulpa de papel.

66

CITAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] PEÑA, Antonio. Bioquimica. Segunda edición. Limusa, S.A., Mexico D.F., 2004. pp. 180-

188.

[2] Ibid., p.186.

[3] FERNADEZ ISLAS, Federico. Producción de Xilanasas por cepas de Aspergillus niger en

cultivo sólido de salvado de avena y salvado de trigo. Trabajo de grado. Maestro en

Ciencias y Tecnologia de Alimentos. Queretaro. 2012. p. 2.

[4] Ibid., p.3.

[5] LOERA CORRAL, Octavio. Las xilanasas microbianas y sus aplicaciones. BioTecnologi.,

vol. 7, no. 2. 2002. pp. 25-37.

[6] FERNANDEZ ISLAS, Op. Cit., p.7.

[7] HOFRICHER, Martin. The mycota. Segunda edición. vol. x., Springer, Zittau. 2010. p. 311.

[8] FERNANDEZ ISLAS, Op. Cit., p.9.

[9] MONTECINOS, Catalina. Estudio del efecto de la adición de extremos hidrofóbicos en la

expresión y purificación por HIC de xilanasas recombinables. Trabajo de grado. Ingeniera


[10] HERRERA, Teofilo y ULLOA, Miguel. El reino de los hongos. Segunda edición.

CFE;UNAM, Mexico D.F., 1998. p. 36.

[11] FERNANDEZ ISLAS, Federico. Producción de Xilanasas por cepas de Aspergillus niger en

cultivo sólido de salvado de avena y salvado de trigo. Trabajo de grado. Maestro en

Ciencias y Tecnologia de Alimentos. Queretaro. 2012, pp. 14-15.

[12] Ibid., p.16.

[13] WIKIPEDIA, [En linea]. [Consultado 24 Noviembre 2014]. Disponible:

http://es.wikipedia.org/wiki/Fermentaci%C3%B3n.

[14] TORRES MONTES, Marcelo. Obtención de enzimas hidrolíticas a partir de una cepa del

hongo Aspergillus ficuum mediante fermentación en medio sólido. Trabajo de grado.

Licenciado en Bioquimica. Valdivia, 2009. p. 3.

[15] BLOUNT MARTIN, Estefania. Daphnia. [En linea]. [Consultado 26 Noviembre 2014].

Disponible: http://www.daphnia.es.

67

[16] Loc. Cit.

[17] Loc. Cit.

[18] Loc. Cit.

[19]

[20]

LOPEZ LUENGO, Gloria y ANGELES, Banares. Blanqueando el papel con una proteina.

Noticias. Madrid. 2010. p.2.

BOLIVAR, Maximo. El cultivo de la piña y el clima en el Ecuador. Revista El Agro, no.

222, 2012.

[21] PRO ECUADOR, Instituto de Promoción de Exportaciones e Inversiones. Perfil de piña

ecuatoriana, Octubre 2011, p. 23.

[22] El Telegrafo. 29 Septiembre 2014. [En linea]. [Consultado 24 Noviembre 2014].

Disponible: http://www.telegrafo.com.ec.

[23] PRO ECUADOR, Instituto de Promoción de Exportaciones e Inversiones. Análisis

sectorial de frutas no tradicionales, Marzo 2012, p. 3.

68

BIBLIOGRAFÍA

DEACON, Jim. Fungal Biology. Blackwell Publishing, Edinburgo, 2006. 338 p.

HOFRICHTER, Martin. The Mycota: Industrial Applications. Springer, Heidelberg,

Alemania, 2010. 324 p.

KAVANAGH, Kevin. Fungi: Biology and Applications. John Wiley & Sons, Ltd.,

Maynooth, 2011. 179 p.

MILES, Philip y CHANG, Shu-Ting. Mushroom Biology: Concise Basics and Current

Developments.World Scientific Publishing Co, Lexington. 2014. 7 p.

MUELLER, Gregory; GERALD y FOSTER. Biodiversity of Fungi. Elsevier Academy

Press, London, 2004. 777 p.

SUMBALI, Geeta. The Fungi. Alpha Science International, Jammu, India, Segunda Edicion,

2010.356 p.

69

ANEXOS

70

ANEXO A. Ficha técnica de endo-1,4-β Xilanasa (comercial)

Figura A 1. Ficha técnica de endo-1,4-β Xilanasa (comercial).

71

ANEXO B. Materiales y equipos utilizados para el acondicionamiento del sustrato

Figura B 1. Molino ultracentrífugo.

Figura B 2. Remojo del sustrato.

72

Figura B 3. Secado de sustrato hasta un 70 % de humedad.

Figura B 4. Sustrato acondicionado.

73

ANEXO C. Materiales y equipos utilizados para construcción de curva calibración.

Figura C 1. Muestras de solución de xilosa a distintas concentraciones con reactivo DNS

Figura C 2. Espectrofotómetro.

74

ANEXO D. Materiales y equipos utilizados siembra, reproducción y activación de las

cepas.

Figura D 1. Autoclave.

Figura D 2. Siembra de cepas

75

Figura D 3. Incubadora

Figura D 4. Cámara de flujo laminar

76

Figura D 5. Medio de cultivo líquido.

Figura D 6. Cepas activadas.

77

ANEXO E. Materiales y equipos utilizados en el ensayo de actividad enzimática.

Figura E 1. Combinación cepa/ sustrato

Figura E 2. Balanza analítica.

78

Figura E 3. Centrifuga.

Figura E 4. Extracto enzimático crudo

79

ANEXO F. Materiales, equipos y resultados de Blanqueamiento de papel.

Figura F 1. Muestra de celulosa sin procesar.

Figura F 2. Muestra de celulosa procesada.

80

Figura F 3. Muestras de celulosa con reactivo

Figura F4. Muestras después de proceso de blanqueamiento de papel.

81

Figura F5. Comparación muestras escaneadas vs Escala de Munsell

Xilanasa 2mL

Xilanasa 1,5mL

Xilanasa 1mL Peróxido de

hidrógeno 4%

Peróxido de

hidrógeno 5%

Peróxido de

hidrógeno 4,5%

Hipoclorito de

sodio 4,5%

Hipoclorito de

sodio 5%

Hipoclorito de

sodio 4%

Muestra sin

tratamiento

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