UNIVERSIDAD DE CHILEFACULTAD DE CIENCIAS FISICAS Y MATEMATICASDEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA Y BIOTECNOLOGIA

COMPARACION TEORICA DE LAS CAPACIDADES METABOLICAS DE

Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris PARA LA PRODUCCION DE SOD

MEMORIA PARA OPTAR AL TITULO DE INGENIERO CIVIL EN BIOTECNOLOGIA

ORNELLA CECILIA COMINETTI ALLENDE

PROFESOR GUIA:JUAN ASENJO DE LEUZE

MIEMBROS DE LA COMISION:ALEJANDRO MAASS SEPULVEDA

BARBARA ANDREWS FARROWZIOMARA GERDTZEN HAKIM

SANTIAGO DE CHILESEPTIEMBRE 2007

Resumen

La presente memoria tiene como objetivo comparar teoricamente las capacidades me-tabolicas de dos tipos de levadura: Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris, como sistemas deexpresion de la enzima Superoxido Dismutasa humana (hSOD).

Para ello se determinaron las redes metabolicas de ambos organismos produciendo hSOD,se estudiaron las propiedades topologicas basicas de ambos modelos, se calcularon sus modos ele-mentales y los rendimientos maximos de hSOD y biomasa versus glucosa, glicerol y metanol entrelos modos elementales, para distintas condiciones.

Entre las propiedades topologicas basicas se compararon los histogramas de conectivi-dad, los que indicaron que ambas redes presentaban la mayorıa de los metabolitos asociados aescasas reacciones (menos de 4) y las diferencias radicaban en el metabolismo de metanol solopresente en el modelo de P. pastoris.

Al comparar los modos elementales de ambos modelos se observo que la red de P. pas-toris presenta un mayor numero de modos debido a la presencia del catabolismo de metanol, elcual no realiza S. cerevisiae. La degradacion de glucosa se presenta en el 78 % y 88 % de los mo-dos elementales para S. cerevisiae y P. pastoris respectivamente, siendo este el sustrato con mayorparticipacion en los modos.

Con respecto a los rendimientos relativos maximos de biomasa y hSOD versus glucosa,glicerol, estos resultan identicos para ambos modelos, lo cual indica que los modos en los que seencuentran aquellos rendimientos maximos se encuentran en ambos modelos, aunque no son nece-sariamente los mismos modos, y que los modos elementales que incluyen consumo de metanol noentregan –dada la estequiometrıa de las reacciones involucradas– mejores rendimientos relativos.

Los resultados sugieren que una fuente de carbono adicional y la mayor cantidad de mo-dos elementales asociada, que se refleja en mayores posibles combinaciones de vıas metabolicasactivas da cuenta de la mayor eficiencia mostrada por P. pastoris como productor de proteınas re-combinantes o simplemente, que las vıas o factores que entregan mayor productividad a P. pastorisno fueron consideradas.

Se logro realizar el modelo metabolico de mayor extension conocido hasta la fecha paraPichia pastoris, abriendo camino para que futuros investigadores realicen mayores analisis y des-arrollos al modelo.

P. pastoris presenta la ventaja de poseer un promotor (del gen que codifica a la primeraenzima de la vıa catabolica de metanol) fuertemente regulado, por lo que serıa de gran interes elconsiderar regulacion genica al presente modelo y continuar el estudio, para ası dilucidar si lasdiferencias en eficiencia –como productor de proteınas heterologas– entre P. pastoris frente a S.cerevisiae, radica en la regulacion.

1

Dedicatoria

A mis padres Myriam y Paolo

A mis Nonnos Cecilia y Geronimo

A mis hermanas Fiorella y Rossana

A toda la familia Cominetti Cotti-Cometti,

en especial a sus nuevos integrantes;

Gustavo

Pascuala

Clarita

.............

2

Agradecimientos

A quienes me han aconsejado y ayudado siempre, en especial durante mi carrera: Gracias

por ensenarme y apoyarme a tomar decisiones, por todo vuestro carino y por ser mi gran ejemplo.

Papa y Mama Nonna y Nonno

Roberto y Cecilia Keka y Tone

Sandy y Randy Franca, Rossella y Silvana

A quienes han sido un modelo a seguir en la ingenierıa y/o academia, por su calidad pro-

fesional y humana.

Papa, Paolo Cominetti Roberto Cominetti

Geronimo y Silvana Cominetti Prof. Leandro Herrera

A quienes me han brindado grandes oportunidades y han sido un importante apoyo duran-

te mi carrera, en particular en el desarrollo de esta memoria: Muchas Gracias por tanta confianza.

Prof. Barbara Andrews Prof. Juan Asenjo

Prof. Ziomara Gerdtzen Prof. Alejandro Maass

Pablo Moreno y LBMG Prof. Jaime San Martın

A mis hermanas, a mis amigos y a mis companeros por su amistad, humor y paciencia.

Un agradecimiento especial al Centro de Modelamiento Matematico de la Facultad de

Ciencias Fısicas y Matematicas de la Universidad de Chile por haber financiado esta memoria.

3

Indice general

1. Introduccion 9

1.1. Proposito . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.2. Contenido de la memoria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.3. Antecedentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.3.1. Modelos Estequiometricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.3.2. Marco de trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.3.3. Fenomeno Modelado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.3.4. Hipotesis de Trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.4. Objetivo Principal y Actividades Realizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2. Problema y Marco Teorico 18

2.1. Metabolismo de Levaduras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

2.1.1. Catabolismo de Azucar en Levaduras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

2.1.2. Diferencias entre Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . 21

2.2. Levadura como sistema de expresion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

2.2.1. Levaduras metilotroficas como sistemas de expresion . . . . . . . . . . . . 24

2.3. Superoxido Dismutasa humana (hSOD) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.4. Redes Metabolicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.4.1. Reconstruccion de Redes Metabolicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.4.2. Representacion Matematica Modelos Estequiometricos . . . . . . . . . . . 28

2.5. Analisis de Modelos Estequiometricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.5.1. Modos Elementales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

4

2.5.2. Rendimientos Relativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

3. Metodologıa 34

3.1. Modelos Metabolicos Estacionarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.1.1. Desarrollo Modelo Metabolico Pichia pastoris . . . . . . . . . . . . . . . 34

3.1.2. Analisis Modelos Metabolicos P. pastoris y S. cerevisiae . . . . . . . . . . 35

3.1.3. Modelo Estequiometrico Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . 36

3.2. Analisis Modelos Metabolicos Estacionarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.3. Tratamiento Informatico del Problema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.3.1. Codificacion de los Modelos Metabolicos en formato SBML . . . . . . . . 37

3.3.2. Representacion Grafica de Resultados: Lenguage GLE . . . . . . . . . . . 38

3.3.3. Software CELLNETANALYZER . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

4. Resultados y Discusiones 39

4.1. Modelo Estequiometrico de S. cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

4.2. Modelo Estequiometrico de P. pastoris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

4.3. Modelo Estequiometrico de P. pastoris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

4.4. De los Modelos Estequiometricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

4.4.1. Potenciales Mejoras a los Modelos Estequiometricos . . . . . . . . . . . . 42

4.5. Analisis Modelos Estequiometricos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.5.1. Propiedades Topologicas Basicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.5.2. Conectividad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

4.5.3. Modos Elementales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.5.4. Rendimientos Relativos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

5. Conclusiones 56

5.1. De los Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

5.1.1. De la Productividad de P. pastoris versus S. cerevisiae . . . . . . . . . . . 57

5.2. Conclusiones Generales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

5.3. Aporte al Campo o a la Disciplina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

Apendice 68

5

A. Modelos Metabolicos 69

A.1. Modelo Estequiometrico de Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . . . . . . . . 69

A.1.1. Vıas Metabolicas del Modelo de Saccharomyces cerevisiae . . . . . . . . 69

A.2. Modelo Estequiometrico de Pichia pastoris . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

A.2.1. Vıas Metabolicas del Modelo de Pichia pastoris . . . . . . . . . . . . . . 76

B. Nomenclatura y Abreviaciones 82

B.1. General . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

B.2. Metabolitos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82

B.3. Flujos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84

C. Material Suplementario 87

C.1. Algoritmo Calculo Modos Elementales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

C.1.1. Descomposicion de Distribuciones de Flujo . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

C.1.2. Implementacion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

C.2. Archivos de los Modelos Estequiometricos en formato SBML . . . . . . . . . . . 90

C.3. Representacion Modelos Metabolicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

C.4. Modos Elementales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

Indice Alfabetico 92

Glosario 96

6

Indice de figuras

2.1. Ejemplo Simple de Red metabolica, Modos Elementales (EM) y Vıas Extremas (EP) 32

4.1. Modelo Metabolico del Metabolismo Central de Pichia pastoris. . . . . . . . . . . 43

4.2. Histograma de Conectividad Modelos Estequiometricos S. cerevisiae y P. pastoris. 45

4.3. Modos Elementales con Maximos Rendimientos Ybiomasaglucosa

y Y SODglucosa

Modelo S. cere-

visiae. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

4.4. Modos Elementales con Maximos Rendimientos Ybiomasametanol

y Y SODmetanol

Modelo P. pastoris. 52

4.5. Rendimientos Biomasa y SOD v/s Glucosa y Glicerol Modos S. cerevisiae. . . . . 53

4.6. Rendimientos Biomasa y SOD v/s Glucosa, Glicerol y Metanol Modos P. pastoris. . 54

A.1. Modelo Metabolico del Metabolismo Central de Saccharomyces cerevisiae . . . . 75

7

Indice de tablas

4.1. Referencias utilizadas en la construccion del modelo estequiometrico de S. cerevi-

siae. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

4.2. Referencias utilizadas en la construccion del modelo estequiometrico de P. pastoris. 41

4.3. Propiedades Topologicas Basicas de las Redes Metabolicas de S.cerevisiae y P.

pastoris. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.4. Cantidad y Distribucion de los Modos Elementales del Modelo de S. cerevisiae. . . 46

4.5. Cantidad y Distribucion de los Modos Elementales del Modelo de P. pastoris. . . . 46

4.6. Rendimientos Relativos Maximos de Modos Elementales de S. cerevisiae y P. pas-

toris. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

4.7. Rendimientos Relativos Maximos de Modos Elementales de S. cerevisiae y P. pas-

toris. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

4.8. Rendimientos Relativos Experimentales de las levaduras S. cerevisiae y P. pastoris. 48

8

Capıtulo 1

Introduccion

1.1. Proposito

La presente memoria tiene como proposito estudiar, a traves de un analisis de vıas me-

tabolicas de los modelos estequiometricos de Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae , las di-

ferencias teoricas de sus capacidades metabolicas para producir la proteına heterologa Superoxido

Dismutasa humana (hSOD).

1.2. Contenido de la memoria

Esta memoria se desarrolla en los siguientes capıtulos:

Introduccion. Indica el proposito de la presente memoria junto con resumir su contenido. Ademas

contiene antecedentes de las levaduras Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae, de mo-

delos metabolicos y su analisis, en particular el analisis de modos elementales. Ademas se

explica el marco de trabajo, el fenomeno a modelar, el objetivo principal y las actividades

realizadas.

Problema y Marco Teorico. Explica el contexto, en relacion a la biotecnologıa y bioinformatica

en el que se enmarca el problema planteado. Se divide en los subcapıtulos siguientes: meta-

bolismo de levaduras, levadura como sistema de expresion, Superoxido Dismutasa humana,

9

redes metabolicas y analisis de modelos estequiometricos.

Metodologıa. Describe el procedimiento llevado a cabo para cumplir los objetivos planteados en

un comienzo, en particular para desarrollar el modelo metabolico de Pichia pastoris y para

comparar tal modelo con el modelo metabolico de Saccharomyces cerevisiae. Adicional-

mente abarca analisis de modelos metabolicos y tratamiento informatico del problema.

Resultados y Discusiones. Muestra el modelo metabolico desarrollado para P. pastoris, las fuen-

tes bibliograficas utilizadas para desarrollar ambos modelos, las diferencias entre las redes

y los resultados obtenidos tras aplicar el metodo de analisis de modos elementales y ren-

dimientos relativos sobre los dos modelos estequiometricos. Adicionalmente se presentan

discusiones respecto del trabajo realizado y de los resultados obtenidos.

Conclusiones. Indica las conclusiones generales y especıficas que se lograron inferir a partir de

los resultados obtenidos, respondiendo a los objetivos planteados en un comienzo. En parti-

cular contiene conclusiones en relacion a la productividad de P. pastoris versus S. cerevisiae.

Finalmente se senalan aportes al campo o a la disciplina.

Apendices. Incluye los modelos estequiometricos en detalle (listas de reacciones), el diagrama del

modelo de S. cerevisiae, y los enlaces a direcciones web en donde se encuentran disponibles

los archivos SBML1 de ambos modelos, los codigos en GLE2 para su representacion y los

modos elementales calculados para cada modelo. Para facilitar la comprension de los mode-

los, se incluye nomenclatura, abreviaciones y explicaciones de los nombres de los flujos.

1.3. Antecedentes

A pesar de que la levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido un sistema de expresion

muy exitoso para sintetizar diversas proteınas recombinantes, esta ha presentado algunas dificul-

tades como lo son: baja productividad, sobre-glicosilacion de proteınas, perdidas del plasmidio

1SYSTEMS BIOLOGY MARKUP LANGUAGE [1]2GRAPHICS LAYOUT ENGINE PROFESSIONAL [3]

10

al escalar los cultivos, que las proteınas a ser excretadas queden restringidas en el espacio peri-

plasmatico, entre otros. Es por esto que han surgido levaduras alternativas como sistemas de expre-

sion, entre las que cabe mencionar Kluyveromyces lactis, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia

lipolytica, Hansenula polymorpha y Pichia pastoris, la cual se ha destacado por su elevada produc-

tividad al expresar proteınas recombinantes3 [75].

P. pastoris presenta numerosas ventajas como sistema de expresion con respecto a S.

cerevisiae. A diferencia de S. cerevisiae, en P. pastoris la expresion de proteınas humanas no se

encuentra asociada al crecimiento; puede crecer a altas densidades celulares, aumentando la pro-

ductividad y el rendimiento de la proteına heterologa; tiene un promotor muy eficiente, inducible

por metanol, el que puede ser usado como unica fuente de carbono y energıa. Ademas, las modi-

ficaciones post-traduccionales —glicosilaciones— en P. pastoris son mas parecidas a las celulas

humanas que las de S. cerevisiae. Otra ventaja corresponde a la facilidad de integracion de ADN

heterologo en el ADN huesped [10] y a que P. pastoris no secreta cantidades considerables de

proteınas endogenas (como S. cerevisiae) lo que simplifica la purificacion de la proteına expresada

[13].

A pesar del gran impacto biotecnologico de Pichia pastoris, la informacion genetica y

metabolica de este organismo es aun escasa. La secuencia de su genoma no se ha publicado4, y

menos de 100 secuencias completas de genes de Pichia pastoris han sido depositadas en GenBank

al 12 de marzo de 2007 [2].

Es por esto que modelar su metabolismo no es una tarea sencilla, y se debe basar en la

informacion de enzimas aisladas o de estudios de flujos medidos con tecnicas como C13 y experi-

mentos de hibridizacion cruzada con microarrays de distintos organismos, entre otros. [68].

3Una lista actualizada de proteınas que han logrado ser expresadas en P. pastoris se encuentra en

http://faculty.kgi.edu/cregg/Pichia2004.htm4La empresa Integrated Genomics Inc. (IG) ha secuenciado el genoma de Pichia pastoris, pero aun no lo hace

publico.

11

Los modelos realizados para P. pastoris hasta la fecha estan basados en modelos este-

quiometricos que describen la variacion de la biomasa y ciertos sustratos y productos [67, 77, 76].

El primero de estos modelos [67] es muy reducido (por ejemplo, utiliza solo 8 reacciones para

describir el metabolismo del organismo cuando crece en glicerol), el segundo de estos [77] no con-

templa el consumo de metanol y el tercero [76], a pesar de incluir el metabolismo del metanol, no

incorpora las reacciones de sıntesis de proteınas, etanol, carbohidratos, ARN y lıpidos.

Entre los genes conocidos de P. pastoris, se han identificado secuencias de alta similitud

al compararlos con los correspondientes a S. cerevisiae (puntaje superior a 75 % sobre un largo de

al menos 250 pares de bases). La mayorıa de los genes secuenciados pertenecen al metabolismo

del carbono y energıa, o contribuyen a la sıntesis de aminoacidos o proteınas. Otro grupo de genes

de Pichia pastoris de secuencia conocida pertenece a vıas especıficas de levaduras metilotroficas.

Para tales genes no hay homologos presentes en el genoma de Saccharomyces cerevisiae [68].

1.3.1. Modelos Estequiometricos

Para analizar, interpretar y predecir el comportamiento celular, se debe obtener informa-

cion de cada reaccion en una red bioquımica, y en el caso de una red metabolica, se debe conocer

la enzima que la cataliza (de ser catalizada enzimaticamente), la estequiometrıa de esta y las cons-

tantes cineticas. Sin embargo, en ausencia de informacion cinetica, aun es posible determinar las

capacidades teoricas metabolicas de un organismo, y examinar potenciales distribuciones de flujo

bajo el supuesto de estado estacionario [23].

Esta representacion in silico del metabolismo se realiza utilizando informacion de lite-

ratura, genomica y de bases de datos metabolicas, entre otros.

Actualmente existen al menos doce bases de datos metabolicas; BioCasta, BioCyc, Bio-

Silico, BRITE, BSD, KEGG, Kiotho, LIGAND, Metacyc, Metagrowth, PathDB y UM-BBD.

12

Los modelos metabolicos han tenido un rol protagonico en la biologıa de sistemas (sys-

tems biology);

“estudio de un organismo, visto como una red integrada e interactuante de genes, pro-

teınas y reacciones bioquımicas que dan origen a la vida. En vez de analizar compo-

nentes individuales o aspectos del organismo, tales como ciertas vıas o componentes

celulares, la biologıa de sistemas se preocupa de todos los componentes y las interac-

ciones entre ellos, todo como parte de un sistema. Tales interacciones son las respon-

sables, en ultima instancia de la forma e interacciones del organismo5. ” [4]

Entre los distintos tipos de modelos metabolicos es posible distinguir modelos basados

en restricciones (CBM, Constrain Based Models) y modelos no basados en restricciones, donde la

principal diferencia radica, tal como es posible inferir de la clasificacion, en la presencia/ausencia

de restricciones, en la conectividad (estequiometrıa de las reacciones), la capacidad (flujos me-

tabolicos maximos), las tasas (de regulacion, cineticas, etc.), otros (presion enzimatica, electro-

neutralidad, etc.) [64].

Los modelos estacionarios basados en restricciones, estudiados en la presente memoria,

no incluyen informacion cinetica, que es difıcil de obtener y que puede variar entre e intra especies.

Para analizar modelos estequiometricos y lograr obtener informacion adicional del sis-

tema a la obtenida por simple inspeccion, existen distintas herramientas y metodos que permiten

caracterizar al espacio solucion (distribuciones de flujo permitidas dadas las restricciones impues-

tas). Entre los metodos mas utilizados es posible mencionar; Analisis de Flujos Metabolico (MFA),

Analisis de Balances de Flujos (FBA) [69], Analisis Regulatorio de Balances de Flujos (rFBA)

[58], Analisis de Planos de Fases de Fenotipos (PhPA) [58], Analisis de Minimizacion de Ajustes

Metabolicos (MOMA) [58], Analisis de Balances de Energıa (EBA) [59], Analisis de Robustez

[58], Analisis de Control Metabolico (MCA) [58], Teorıa Bioquımica de Sistemas (BST) [58],

Modelo Cibernetico y Analisis de Vıas Metabolicas (MPA) [9] que incluye al Analisis de Vıas

5Tales interacciones permiten identificar propiedades emergentes del sistema.

13

Extremas (EPA) [86] y Analisis de Modos Elementales (EMA) [9], entre otros.

Del listado anterior los dos ultimos metodos requieren solo la estequiometrıa de la red

metabolica, y permiten determinar propiedades topologicas de la red estequiometrica (conectivi-

dad de metabolitos por ejemplo), identificar potenciales blancos (targets) terapeuticos, estudiar

secuencias huerfanas, etc. La identificacion de targets terapeuticos consiste en identificar reaccio-

nes esenciales para forzar o bloquear cierta funcion metabolica. Por ejemplo, si se ha identificado

que una reaccion esta presente en todos los modos elementales asociados con tal funcion, al blo-

quear la reaccion, el sistema ya no serıa capaz de realizar tal funcion, es decir, tal reaccion es un

blanco terapeutico potencial [9].

Cornish-Bowden y Cardenas en el artıculo “From genome to cellular phenotype–a role

for metabolic flux analysis?” del ano 2000 compararon los modos elementales de T. palladium con

los modos de E. coli y lograron determinar la existencia de la enzima transaldolasa, a pesar de que

su secuencia no habıa sido identificada en el genoma. Al identificar enzimas que estaban presentes

en T. palladium y que todos los modos elementales en que participaban requerıan la presencia de

transaldolasa, se concluyo que tal enzima tambien debıa existir en T. palladium, por lo que debıa

estar codificada entre las secuencias huerfanas a las que previamente no se logro asignar una fun-

cion [14].

Las vıas extremas corresponden al mınimo conjunto de vıas capaces de describir todas

las distribuciones de flujo posibles en estado estacionario y son linealmente independientes, mien-

tras que los modos elementales representan las sub-redes mas pequenas que le permiten al sistema

metabolico operar en estado estacionario, desde un punto de vista funcional [47].

Los modos elementales son un subconjunto de las vıas extremas. Para un sistema con

todas sus reacciones irreversibles, ambos conjuntos de vıas son equivalentes [60].

14

1.3.2. Marco de trabajo

Se escogio utilizar el formato SBML [41] como el formato a utilizar, debido a su estruc-

tura logica y a la gran difusion y penetracion que tiene en los cırculos academicos del area. De tal

modo, se facilita compartir, validar y simular los modelos.

En vez de haber programado los metodos de analisis, se opto por utilizar el software

libre CELLNETANALYZER [47] debido a que cuenta con una gran variedad de metodos de analisis

de modelos estequiometricos bien implementados, esta basado en MATLAB, pudiendo modificarse

los codigos fuentes y debido a que posee una grafica adecuada.

1.3.3. Fenomeno Modelado

El fenomeno modelado corresponde al metabolismo central en estado estacionario de

S.cerevisiae y P. pastoris, incluyendo vıas de sıntesis de aminoacidos, de lıpidos, de carbohidratos,

de etanol, de ARN, de proteınas, y en particular de la proteına heterologa SOD, y las vıas de con-

sumo de glucosa, glicerol, y metanol, esta ultima solo en el caso de P. pastoris, ya que S. cerevisiae

no es capaz de degradarlo.

Los modelos consisten en listas de reacciones bioquımicas y de transporte presentes en

los sistemas e informacion relacionada a los metabolitos; compartimentalizaciones al interior de la

celula (mitocondria, peroxisoma y citosol), concentraciones maximas, entre otros.

Se utilizo como base el modelo de Saccharomyces cerevisiae recombinante realizado

por Ramon Gonzalez [35], modelo que fue revisado y mejorado.

Dado que no se encuentra publicado el genoma de P. pastoris , se realizo su modelo

estequiometrico como sistema de expresion para la proteına recombinante Superoxido Dismutasa

humana (hSOD), basandose en el modelo para S. cerevisiae a modo de alcanzar un grado de

15

complejidad similar a este modelo. En el caso de Pichia pastoris se incluyeron adicionalmente las

reacciones que explican el metabolismo del metanol, dado que este es un organismo metilotrofico.

1.3.4. Hipotesis de Trabajo

A partir de la busqueda bibliografica se postulo la siguiente hipotesis:

Pichia pastoris es mas eficiente frente a Saccharomyces cerevisiae como sistema de

expresion para la proteına SOD y tal eficiencia (medida como rendimiento de producto

versus sustrato) se puede determinar a partir de su red metabolica.

1.4. Objetivo Principal y Actividades Realizadas

El objetivo principal de la presente memoria fue:

1. Realizar un estudio teorico comparativo de las capacidades metabolicas de Pichia pastoris y

Saccharomyces cerevisiae como sistemas de expresion de la enzima Superoxido Dismutasa

humana (hSOD) en base al modelo del metabolismo central de Saccharomyces cerevisiae

produciendo hSOD, realizado por Ramon Gonzalez en el marco de su tesis para optar al

grado de Doctor en Ciencias de la Ingenierıa, mencion Quımica de la Facultad de Ciencias

Fısicas y Matematicas de la Universidad de Chile.

Las actividades realizadas fueron:

1. Se identificaron los elementos que componen la red metabolica de Pichia pastoris produ-

ciendo la enzima Superoxido Dismutasa humana (hSOD) y como se interrelacionan.

a) Se realizo una busqueda bibliografica acabada del metabolismo, genoma y enzimas de

Pichia pastoris.

16

b) Se codifico el modelo metabolico de Pichia pastoris en formato SBML.

c) Se represento graficamente el modelo metabolico de Pichia pastoris.

2. Se codifico el modelo metabolico de Saccharomyces cerevisiae en formato SBML.

3. Se represento graficamente el modelo metabolico de Saccharomyces cerevisiae.

4. Se aplico el metodo de Analisis de Vıas Metabolicas: Analisis de Modos Elementales a

ambos modelos metabolicos.

5. Se compararon los modos elementales previamente obtenidos.

6. Se determinaron los rendimientos maximos de biomasa y SOD con respecto a glucosa, gli-

cerol y metanol de los modos elementales de ambos modelos y se compararon con datos de

rendimientos experimentales reportados en la literatura para ambas levaduras produciendo

SOD.

17

Capıtulo 2

Problema y Marco Teorico

2.1. Metabolismo de Levaduras

El metabolismo, conjunto de reacciones y procesos fısico-quımicos que ocurren en una

celula, da cuenta tanto de la asimilacion bioquımica (en vıas anabolicas) como de la desasimila-

cion (en vıas catabolicas) de nutrientes. En levadura, ası como en otros organismos, estos procesos

estan mediados por reacciones enzimaticas. Entre las vıas anabolicas se encuentran procesos re-

ductivos que llevan a la produccion de material celular nuevo, mientras que las vıas catabolicas

son procesos oxidativos que remueven electrones desde sustratos o intermediarios utilizados para

generar energıa. En general, estos procesos utilizan NADP o NAD (respectivamente) como cofac-

tores [26, 83].

Aunque todas las levaduras son microorganismos que derivan su energıa quımica en la

forma de ATP, a partir de la ruptura de compuestos organicos, existe diversidad metabolica en

como estos organismos generan y consumen energıa desde tales sustratos [26].

Esta bien establecido que la mayorıa de las levaduras emplean azucares como su princi-

pal fuente de carbono, pero ciertas levaduras pueden utilizar fuentes de carbono no convencionales.

Con respecto al metabolismo de nitrogeno, la mayorıa de las levaduras son capaces de asimilar

fuentes de nitrogeno simples para biosintetizar aminoacidos y proteınas. Aspectos del metabolis-

mo de azufre y fosforo, como tambien el metabolismo de otros compuestos inorganicos han sido

18

estudiado en cierto detalle, predominantemente en Saccharomyces cerevisiae [26, 83].

2.1.1. Catabolismo de Azucar en Levaduras

La principal fuente de produccion de energıa en levadura (en Saccharomyces cerevisiae)

es la glucosa, y la glicolisis es la vıa general para la conversion de glucosa a piruvato, mientras que

la produccion de energıa en forma de ATP se encuentra acoplada a la generacion de intermediarios

y poder reductor en forma de NADH [57].

Se pueden observar dos formas principales para el uso de piruvato en la posterior produc-

cion de energıa, respiracion y fermentacion. En la presencia de oxıgeno y la ausencia de represion,

el piruvato ingresa a la matriz mitocondrial donde es descarboxilado oxidativamente hacia Acetil-

CoA por el complejo multienzimatico piruvato deshidrogenasa. Esta reaccion une la glicolisis con

el ciclo del acido cıtrico, en el cual AcetilCoA es completamente oxidado para dar dos moleculas

de CO2 y equivalentes reductivos en la forma de NADH y FADH2. Sin embargo, el ciclo del aci-

do cıtrico es una vıa ambibolica, dado que combina funciones tanto catabolicas como anabolicas

[26]. Los compuestos necesarios para impulsar el ciclo de acido cıtrico, como el oxaloacetato y

α-cetoglutarato son recuperados a traves de [26, 83];

(i) la fijacion de CO2 hasta piruvato por la accion de las enzimas piruvato carboxilasa (depen-

diente de ATP) y fosfoenolpiruvato carboxiquinasa,

(ii) el ciclo del glioxilato (un atajo a traves del ciclo del acido cıtrico), el que es relevante cuando

las levaduras crecen en dos fuentes de carbono, como acetato y etanol.

Durante la fermentacion alcoholica de azucares, las levaduras re-oxidan NADH a NAD

en una reaccion de dos pasos desde piruvato, el cual es primero descarboxilado por la enzima pi-

ruvato descarboxilasa seguido por la reduccion de acetaldehıdo, catalizado por la enzima alcohol

deshidrogenasa. Al mismo tiempo se genera glicerol desdehidroacetona fosfato [26].

Una forma alternativa de oxidacion de glucosa es la vıa de las pentosas fosfato, que pro-

vee a las celulas con azucares pentosas y NADPH citosolico para la biosıntesis de acidos grasos,

19

aminoacidos y alcohol azucares. El primer paso en esta vıa es la deshidrogenacion de glucosa-6-

fosfato a 6-fosfogluconolactona y la generacion de 1 mol de NADPH por glucosa-6-fosfato deshi-

drogenasa. A continuacion, el 6-fosfogluconato es descarboxilado por la accion de fosfoglucanato

deshidrogenasa para dar ribulosa-5-fosfato y un segundo mol de NADPH [26].

Los transportadores redox, NAD y FAD, que se reducen durante la ruptura de azucares a

NADH y FADH2, respectivamente, son reoxidados en la cadena respiratoria (transporte de electro-

nes) ubicada en la membrana interior de la mitocondria. La energıa liberada durante la transferencia

de electrones esta acoplada al proceso de fosforilacion oxidativa (tambien ubicada en la membrana

mitocondrial interna), que esta disenado para sintetizar ATP desde ADP y fosfato inorganico [26].

Muchos tipos de levadura pueden crecer en glicerol como unica fuente de carbono bajo

condiciones aerobicas, siendo tambien una fuente de carbono no fermentable para varias levaduras,

incluyendo Saccharomyces cerevisiae . Para servir como fuente de carbono, tras ser internalizado

el glicerol, debe ser convertido por glicerol quinasa a glicerol-3-fosfato, el que es luego transfor-

mado hacia DAH fosfato (sustrato en gluconeogenesis) por glicerol-3-fosfato deshidrogenasa [26].

El control de la produccion de proteınas, en levaduras, es dependiente del control del

ciclo celular. Se ha visto que en la fase exponencial la sıntesis de proteınas se incrementa exponen-

cialmente y una vez que la celula ingresa a la fase estacionaria la sıntesis de proteınas disminuye

mas del 90 % [82, 63].

En el caso de P. pastoris se ha reportado que la adicion de metanol al medio de cultivo

de glicerol durante el crecimiento, genera un aumento en la biomasa pero no una mayor actividad

de proteınas recombinantes, por lo que se sugirio que no genero un aumento de produccion de

proteınas recombinantes [13, 63].

Muchos autores han estudiado como afecta la variacion en la concentracion de metanol

en la expresion de proteınas heterologas [39, 88]. La induccion del promotor AOX esta fuertemen-

te influenciada por el sustrato para el crecimiento; en celulas crecidas en glicerol, xilosa, ribosa o

20

sorbitol la actividad especıfica de AOX1 es cercana al 60 % de la observada en metanol. Por otro

lado, la glucosa y el etanol son represores efectivos; en cultivos con glicerol la actividad AOX no

se detecta, sin embargo esta fuente de carbono no reprime el sistema. Ademas se ha demostrado

que los efectos represor e inductor compiten [63].

2.1.2. Diferencias entre Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae

Una de las diferencias principales entre Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae

corresponde al modo de respiracion. Mientras que S. cerevisiae es un organismo que realiza respi-

racion aerobica facultativa, Pichia pastoris realiza respiracion anaerobica. Este segundo organismo

es capaz de metabolizar metanol, formando formaldehıdo a traves de la accion de una oxidasa de-

pendiente de O2, y luego conviertiendolo en dihidroxiacetona (DAH) por una DAH sintasa. DHA

y gliceraldehıdo-3-fosfato (GAP) pueden utilizarse para sintetizar fructosa-6-fosfato (FRUC 6P)

[26, 75].

P. pastoris tiene un promotor fuertemente inducible por metanol (AOX1) el que permite

tener un control fuerte sobre la degradacion de metanol y produccion de proteınas heterologas.

Ademas de esto, P. pastoris realiza glicosilacion de manera similar a las celulas humanas, produ-

ciendo proteınas de menor antigenicidad que S. cerevisiae1 [17].

P. pastoris presenta baja secrecion de proteınas endogenas, lo cual facilita la purificacion

de las proteınas heterologas secretadas. Mientras que en el caso de S. cerevisiae muchas de las

proteınas secretadas no se encuentran libres en el medio, sino que en el espacio periplasmatico, lo

cual dificulta la purificacion y hace diminuir el rendimiento de producto.

P. pastoris puede crecer a densidades celulares mayores que S. cerevisiae (100 g/litro

aproximadamente), lo cual se asocia a una mayor produccion de proteınas secretadas. Por ejem-

1En la Sub-Seccion 2.2.1 se discutira en mayor detalle la diferencia en glicosilacion de ambas levaduras

21

plo, entre los mayores rendimientos de P. pastoris se encuentra el de la proteına heterologa (S)-

Hidroxinitrilo liasa (Hnl) con un rendimiento de 22 g/litro, mientras que para S. cerevisiae se

encuentra la produccion de α-amilasa de bacteria, con un rendimiento de 2.5 g/litro [38, 29].

Fierobe comparo P. pastoris y S. cerevisiae como sistemas de expresion de glucoamila-

sa proveniente de Aspergillus niger, importante almidon-hidrolasa utilizada en la industria. Como

resultado se obtuvo glucoamilasa con mayor termoestabilidad por P. pastoris que la producida por

S. cerevisiae [27].

Por otro lado, se ha demostrado que P. pastoris presenta un mayor rendimiento al produ-

cir proteınas heterologas que S. cerevisiae. Tal es el caso de (S)-Hidroxinitrilo liasa (Hnl) de Hevea

brasiliensis [38], α-amilasa pPAM de raton [43], insulina [46], monoamida oxidasa A de hıgado

humano [51], carboxilesterasa de hıgado de conejo [55], lisozima H5 de huevo de gallina [53],

penicilina G amidasa de Providencia rettgeri [73], nucleoproteına del virus de sarampion [74],

dalcoquinasa de Dalbergia cochinchinensis Pierre [79], lactoferrina porcina (rPLF) [84], precur-

sor de insulina de cerdo (PIP) [85] y antıgeno del parasito de la malaria Pfs25 [89], entre muchas

otras.

Sin embargo, en la literatura tambien se ha reportado la situacion opuesta, en que S. ce-

revisiae se presenta como una mejor alternativa que P. pastoris como sistema de expresion. Por

ejemplo, Laffitte expreso el antıgeno bullous pemphigoid 230 (BP230) en ambas levaduras y obtu-

vo como resultado un mayor rendimiento en S. cerevisiae que en P. pastoris [50], lo cual tambien

ocurrio al expresar caseinomacropeptido humano [44].

Mas aun, Parekh senala que la diferencia entre especies de levaduras en cuanto a su

capacidad para secrecion de proteınas heterologas podrıa ser eliminada si se logra que S. cere-

visiae realice un uso eficiente de sus capacidades secretorias disponibles, y que la capacidad de

productividad maxima proteica esta determinada por la capacidad del retıculo endoplasmatico de

enrollamiento proteico [61].

22

2.2. Levadura como sistema de expresion

Los sistemas de expresion procariontes son de gran utilidad para producir proteınas he-

terologas (recombinantes) a partir de cDNA de origen eucarionte. Sin embargo, en muchos casos

las proteınas eucariontes sintetizadas por bacterias son inestables o carecen de actividad biologi-

ca. Al purificar las proteınas recombinantes, estas se pueden ver contaminadas por compuestos

bacterianos toxicos o que causen un aumento de temperatura corporal en humanos y animales

(pirogenicos), en el caso de aplicaciones terapeuticas. Con el objetivo de evitar estos problemas,

se han desarrollado sistemas de expresion eucariontes para la produccion de proteınas de uso te-

rapeutico (humanos o animales), que en general deber ser identicas a las producidas de forma

nativa, a modo de mantener intactas sus propiedades bioquımicas, fısicas y funcionales. La inca-

pacidad de los organismos procariontes de producir versiones identicas se debe princialmente a la

ausencia de mecanismos apropiados para realizar modificaciones post-traduccionales [48, 78].

Tales modificaciones pueden ser [24, 34]:

1. Correcta formacion de puentes disulfuro, catalizada por la enzima disulfuro isomerasa.

2. Cortes proteolıticos de la forma precursora, para lograr una proteına funcional.

3. Glicosilacion; modificacion que le proporciona estabilidad a la proteına. Las glicosilacio-

nes proteicas mas comunes consisten en la adicion de residuos de azucares especıficos a

aminoacidos serina, treonina (glicosilacion unida a O ) o a asparagina (unida a N).

4. Adicion a aminoacidos; fosforilaciones, acetilaciones, carboxilaciones, entre otras.

La expresion de proteınas recombinantes en Saccharomyces cerevisiae ha sido exitosa

en numerosos casos, presentandose ciertas limitaciones en algunos de ellos, debido principalmente

a [22, 21]:

La perdida del plasmidio.

Sobre-glicosilacion de proteınas heterologas.

23

Proteınas a ser excretadas se quedaban retenidas en el espacio periplasmatico.

Debido a tales limitaciones ha sido necesario estudiar otras especies de levadura como

sistemas de expresion. Entre tales especies es posible mencionar Kluyveromyces lactis , Saccha-

romyces pombe, Yarrowia lipolyctica , Hansenula polymorpha y Pichia pastoris [78].

2.2.1. Levaduras metilotroficas como sistemas de expresion

Al igual que en el caso de Saccharomyces cerevisiae , las levaduras metilotroficas com-

binan las ventajas de muchos microorganismos (es decir, cultivo simple en medios de cultivo de

bajo costo, tecnicas geneticas bien establecidas y una amplia experiencia en cultivos industriales

y escalamiento) junto a la habilidad de realizar el procesamiento tıpico de eucariontes y otras mo-

dificaciones post-transcripcionales, como la glicosilacion. Para proteınas con fines farmaceuticos

existen muchas otras ventajas; los productos se encuentran libres de exotoxinas y tambien libres

de ADN viral oncogenico. Gracias a su amplio uso en la industria alimentaria, algunas levaduras

poseen el estatus de GRAS (Generally Regarded As Safe) [11].

La importancia industrial de levaduras metilotroficas ha continuado aumentando debi-

do a caracterısticas tecnologicas relevantes. En contraste con S. cerevisiae que pertenece al grupo

de levaduras Crabtree negativas, la produccion de etanol ocurre a bajos niveles en condiciones

aerobicas. Esto permite que estas levaduras crezcan a elevadas densidades celulares en cultivos en

biorreactores y ası resultando en elevados rendimientos de productos [78].

Ademas, las levaduras metilotroficas como Pichia pastoris y Hansenula polymorpha ,

tienen la caracterıstica de presentar una elevada tasa de secrecion proteica, mientras que en Sac-

charomyces cerevisiae existe retencion de proteınas en el espacio periplasmatico, incluso para

peptidos de bajo peso molecular [49].

Esta elevada capacidad de secrecion de levaduras metilotroficas, en combinacion con

24

tecnicas de fermentacion de alta densidad, ha permitido obtener niveles de varios gramos de pro-

teına heterologa secretada por litro de cultivo [17, 78].

A pesar de que la sobre-manosilacion ocurre menos frecuentemente en levaduras meti-

lotroficas que en S. cerevisiae , la mayor diferencia con respecto a la glicosilacion es la ausencia

de terminales hıper-inmunogenicos α-1,3-unidos a manosas en glicanos asociados a terminales N

en proteınas producidas por P. pastoris y H. polymorpha . En el caso de expresion de proteınas

humanas se ha logrado modificar geneticamente estas cepas para lograr un patron de glicosilacion

similar a las proteınas en cuestion, aumentando ostensiblemente el uso de levaduras metilotroficas

como organismos huespedes [76, 19].

El exito de las levaduras metilotroficas en la produccion de proteınas recombinantes

esta asociado a sus promotores fuertes y altamente regulados de algunos genes del metabolismo

del metanol. Se destaca el promotor del gen que codifica a la primera enzima de la vıa de uso de

metanol en P. pastoris , alcohol oxidasa I (AOX1). Los promotores fuertemente regulados equiva-

lentes en otras levaduras metilotroficas, se utilizan muy a menudo en la produccion de proteınas

recombinantes [75, 81].

2.3. Superoxido Dismutasa humana (hSOD)

Superoxido dismutasa (E.C. 1.15.1.1) humana (hSOD) corresponde a una metaloenzima

que posee cobre y zinc en el sitio activo y su funcion es “eliminar” o “capturar” radicales de oxıge-

no libres [18].

HSOD es util para prevenir el dano tisular asociado a cambios bruscos de oxigenacion

(transplantes, infartos, procedimientos quirurgicos –by pass–, etc.) y en el tratamiento de la artritis

reumatoidea (la inflamacion y destruccion de las articulaciones parecieran estar relacionadas con

los radicales libres del O2) [5].

25

Se han realizado diversos estudios teoricos y experimentales del metabolismo de Saccha-

romyces cerevisiae produciendo hSOD, determinandose ciertas capacidades metabolicas y propie-

dades estructurales de su red metabolica [6, 35, 7].

En experimentos de laboratorio se ha logrado sobre-expresar la proteına heterologa SOD

proveniente de S. cerevisiae en P. pastoris , obteniendose SOD enzimatica y biologicamente activa

con alta pureza y elevada actividad especıfica [87]. Ademas, se ha logrado expresar SOD manga-

neso humana (hMnSOD) en P. pastoris, en el vector de expresion pPIC9K inducible por metanol,

logrando un rendimiento del 32 % del total de proteınas en el sobrenadante [52]. Finalmente, en

el ano 2006 se logro por primera vez expresar Superoxido Dismutasa humana extracelular en P.

pastoris [12], lograndose una elevada productividad. Ademas de ello se observo que las celulas

transformantes eran resistentes al estres oxidativo y al shock termico, pudiendo crecer en ambien-

tes altamente oxidativos y aumentando aun mas su capacidad para crecer en elevadas densidades

celulares [12].

2.4. Redes Metabolicas

2.4.1. Reconstruccion de Redes Metabolicas

Se entiende por reconstruccion de redes metabolicas al proceso de ensamblar una lista

de reacciones especıficas de un organismo dado. Este proceso actualmente no se encuentra auto-

matizado, es iterativo y se basa en realizar decisiones relacionadas a si existen pruebas para incluir

o eliminar ciertas reacciones metabolicas desde una lista generica de reacciones [66].

Luego de tener las redes metabolicas reconstruıdas, se procede a su analisis. Aplican-

do metodos matematicos como analisis convexo y programacion lineal, se pueden estudiar sus

propiedades estructurales, como la conectividad, y luego simular el comportamiento celular bajo

distintas condiciones fisiologicas [64]. De tales resultados es posible desarrollar estrategias de in-

genierıa genetica para la construccion de cepas con nuevas propiedades. Ademas se pueden evaluar

26

ciertas propiedades estructurales de la red para la produccion de aminoacidos, entre muchas otras

aplicaciones [15, 56].

Durante el proceso de reconstruccion, se realizan diversas decisiones con respecto a ca-

da reaccion, comenzando por ¿se encuentra presente alguna enzima o complejo enzimatico que

catalice tal reaccion?, ¿cual es la estequiometrıa de esa reaccion?, ¿existen cofactores asociados

a esa reaccion?, si agrego/elimino tal reaccion, ¿genero metabolitos que luego no se consumen o

dejo metabolitos sin ser consumidos?, ¿es reversible o irreversible la reaccion?, ¿donde ocurre tal

reaccion?. Para el modelamiento, se requerira informacion adicional relacionada a la composicion

de la biomasa y requerimientos de ATP en distintas condiciones de crecimiento [20].

Para poder responder tales preguntas sobre cada reaccion se debera realizar una amplia

busqueda bibliografica, llegando a conocer el actual estado del arte de reacciones metabolicas. Para

ello existen bases de datos de vıas en lınea, libros de bioquımica, secuencias genomicas anotadas,

y experimentos metabolicos en revistas y publicaciones cientıficas.

El proceso de reconstruccion produce un conjunto de reacciones bioquımicas que pue-

den ser utilizadas para construir modelos estequiometricos usando balance de metabolitos [23, 16].

Estos modelos se basan en balances de masa de intermediarios metabolicos suponiendo un estado

estacionario. Junto con la informacion obtenida desde la estequiometrıa se requiere la localiza-

cion, reversibilidad y conocimiento de composicion de biomasa para determinar el “drenaje” de

precursores o bloques de construccion hacia la produccion de biomasa. Aunque la composicion de

biomasa cambia bajo distintas condiciones fisiologicas, puede suponerse constante, puesto que se

ha observado in-silico que cambios en la composicion de biomasa tienen impactos muy leves en

los resultados de simulaciones [80].

27

2.4.2. Representacion Matematica Modelos Estequiometricos

El conjunto de reacciones escogidas para representar el metabolismo de un sistema se

puede resumir en una matriz, llamada matriz estequiometrica, donde los componenetes son los

coeficientes estequiometricos de las reacciones.

Por ejemplo, las siguientes reacciones se representaran en una matriz estequiometrica

como se muestra a continuacion:

aA+ cC −→ eE, (2.1)

bB+ e′E −→ gG+a′A, (2.2)

N =

(1) (2)

A −a a′

B 0 −b

C −c 0

E e −e′

G 0 g

.

Considerando la estructura anterior, es posible escribir las ecuaciones de balances de

flujos metabolicos como:

m

∑j=1

N ji ·Vj = ri ,∀i. (2.3)

donde:

N: Matriz Estequiometrica (filas ⇔ metabolitos, columnas ⇔ reacciones)

V : Vector de Flujos

28

N ji: Coeficiente estequiometrico del metabolito i en la reaccion j. N ji

≥ 0, i producto

≤ 0, i sustrato

Vj: Flujo de la reaccion j

ri: Tasa neta de produccion del metabolito i

m: Numero total de reacciones

Ahora bien, en el caso de los metabolitos internos no acumulables, ri es nulo (condicion

de estado estacionario), lo cual se expresa de la siguiente manera:

NT ·V =

r

0

.

2.5. Analisis de Modelos Estequiometricos

El analisis de vıas metabolicas comenzo en los 80’ con el desarrollo de SNA (Stoichio-

metric Network Analysis), realizado por Bruce Clarke. Tal teorıa fue desarrollada para estudiar la

inestabilidad de redes quımicas inorganicas. Tal fue el primer intento de realizar analisis convexo

a redes de reacciones, pero no se extendio a seres vivos [71].

Este estudio fue continuado por algoritmos de inteligencia artificial para buscar a traves

de las redes de reacciones siguiendo la teorıa de grafos. Luego Mavro le agrego restricciones este-

quiometricas. Ambos analisis carecıan de bases teoricas solidas, por lo que en el ano 1994 Schuster

aplico Programacion lineal al estudio de redes metabolicas determinando grupos de modos ele-

mentales. Esta nueva forma de analizar redes metabolicas fue aplicada por Liao para optimizar el

diseno de cepas bacterianas en la produccion de aminoacidos aromaticos [71].

Un ejemplo de analisis de redes de gran tamano es Feist, Palsson et al. 2007. Este intento

toma el desafıo de descomposicion, pero aun se encuentra en sus primeros pasos. [25].

29

2.5.1. Modos Elementales

Modos Elementales: Definicion Biologica/Metabolica

Un modo elemental es un set mınimo de enzimas que puede operar en estado estacionario

con todas las reacciones irreversibles procediendo en la direccion apropiada [60].

Para obtener un modo elemental, bloquear alguna enzima de la red metabolica en estudio

y determinar si aun hay flujo a traves del sistema. Bloquear una segunda enzima, y repetir

sucesivamente. Un modo elemental se obtiene cuando el bloqueo de una enzima adicional,

aun activa, lleva a la perdida de cualquier flujo en estado estacionario en el sistema [60].

Modos Elementales: Definicion Matematica

Sean las siguientes condiciones:

(C1) Condicion de Estado Estacionario ⇐⇒ N ·V = 0 para metabolitos internos.

(C2) Restriccion de los Signos ⇐⇒ V ∗ contiene un subvector V ∗irr que cumple la inequacion

V ∗irr ≥ 0, donde los componentes de V ∗

irr corresponden a las reacciones irreversibles.

Un modo elemental es un vector V ∗, tal que [60]:

@ vector V ∗∗ (6= al vector nulo) que cumpla las siguientes propiedades:

(i) V ∗∗ cumple las condiciones (C1) y (C2),

(ii) V ∗∗ contiene componentes zero donde V ∗ los contiene y en al menos una posicion adicional,

S(V ∗)⊂ S(V ∗∗). (2.4)

En definitiva, un modo elemental se puede representar por un vector de flujos que no

puede descomponerse en dos vectores de flujos que tengan un componente cero adicional [54].

30

Determinacion de Modos Elementales

Como se ha senalado, un modo elemental corresponde al mınimo conjunto de enzimas

que pueden operar en estado estacionario. En redes complejas o de alta densidad, la dificultad

de calcular tales modos radica en que el problema es NP-completo, es decir hay una explosion

combinatorial. A pesar de ello, el analisis de modos elementales ha sido aplicado exitosamente en

genomica funcional, bioingenierıa y medicina [60].

El algoritmo utilizado por el software escogido2 para calcular los modos elementales

corresponde al que realiza METATOOL y que fue desarrollado por Pfeiffer en el ano 1999 [62].

Como es difıcil interpretar un gran numero de modos elementales, en general es conve-

niente descomponer tales redes metabolicas en subsistemas mas pequenos. Tal subdivision puede

ser realizada por intuicion, de acuerdo a metabolismos particulares (metabolismo de azucar, de

lıpidos, del carbono), entre otros [69, 8].

Modos Elementales versus Vıas Extremas

Una alternativa al Analisis de Modos Elementales corresponde al Analisis de Vıas Ex-

tremas, que son un conjunto de vectores derivados de la matriz estequiometrica que forman una

base [70], es decir, consisten en los vertices del cono del polihedro convexo que representa a cada

modelo, donde los ejes corresponden a los distintos metabolitos [60].

Las vıas extremas tienen las siguientes propiedades [60]:

(I) Existe un unico conjunto de vıas extremas para una red dada.

(II) Cada vıa extrema esta compuesta por un numero mınimo de reacciones que necesita para

existir como una unidad funcional.

2CELLNETANALYZER

31

(III) Las vıas extremas son subconjuntos sistematicamente independientes de los modos elemen-

tales; es decir, ninguna vıa extrema puede ser representada como una combinacion lineal

no-negativa de otras vıas extremas.

Las propiedades I y II las comparten tanto los modos elementales como las vıas extre-

mas. En la Figura 2.1 se muestran las vıas extremas y los modos elementales de un sistema simple.

Se observa que las vıas extremas son un subconjunto de los modos elementales (tal como lo indica

la propiedad III) [60].

(a) Red Metabolica (b) EM 1 (c) EM 2 (d) EM 3

(e) EM 4 (f) EP 1 (g) EP 2 (h) EP 3

Figura 2.1: Ejemplo Simple de Red metabolica, Modos Elementales (EM) y Vıas Extremas (EP)

La red esta compuesta por tres metabolitos, tres reacciones internas y tres reacciones de intercam-

bio (a), luego se presentan sus cuatro modos elementales EM 1 (b) EM 2 (c) EM 3 (d) y EM 4 (e) y

sus tres vıas extremas EP 1 (f) EP 2 (g) y EP 3 (h). La diferencia entre los conjuntos de vıas radica

en el uso del flujo de intercambio reversible para el metabolito A. El modo elemental EM 4 es una

combinacion lineal no-negativa de las vıas extremas EP 1 y EP 2, ya que el flujo de intercambio

reversible para el metabolito A puede cancelarse. [60]

32

2.5.2. Rendimientos Relativos

Como medida de productividad para comparar y validar los modelos estequiometricos

se escogio determinar los rendimientos relativos de los productos biomasa y SOD con respecto a

los sustratos glucosa, glicerol y metanol.

El rendimiento relativo de un producto X sobre un sustrato S corresponde al cuociente

entre la diferencia de biomasa celular y la diferencia de sustrato (en general fuente de carbono)

medido en gramos/gramos o en moles/moles, es decir corresponde a las unidades de biomasa o

producto producidas por unidad de sustrato consumido [75];

YX/S =∆X∆S

=Xtiempo final−Xtiempo inicial

Stiempo inicial−Stiempo final. (2.5)

Los rendimientos relativos varıan con las distintas fuentes de carbono, con las condicio-

nes de operacion, con el tiempo, entre otros [75].

Para convertir los rendimientos relativos medidos en gramos/gramos a mol/mol se utili-

zaron los pesos moleculares: PMglucosa = 180 grgr-mol , PMglicerol = 92,1 gr

gr-mol y PMmetanol = 32,04

grgr-mol , donde;

YX/S = Y ′X/S ·PMS

PMX. (2.6)

Se utilizo como aproximacion para el peso molecular de las levaduras P. pastoris y S.

cerevisiae 26,62 grgr-mol , obtenido a partir de la composicion elemental de celulas de P. pastoris

CH1,89N0,189S0,002O0,626 determinada experimentalmente en Sola 2004 [75].

33

Capıtulo 3

Metodologıa

A continuacion se detalla la metodologıa utilizada durante el presente estudio:

3.1. Modelos Metabolicos Estacionarios

3.1.1. Desarrollo Modelo Metabolico Pichia pastoris

El procedimiento utilizado para determinar el conjunto de reacciones presentes en la red

metabolica de Pichia pastoris fue el siguiente:

1. Se realizo una busqueda bibliografica acuciosa relativa al metabolismo de levadura y en

particular de Pichia pastoris; enzimas aisladas, enzimas predichas desde su genoma, enzimas

o funciones enzimaticas identificadas a partir de experimentos, etc.

2. Se integro la informacion metabolica obtenida en una red metabolica que incluyera al menos

las vıas del metabolismo central del organismo.

3. Se realizaron los supuestos necesarios para completar la red metabolica.

34

3.1.2. Analisis Modelos Metabolicos P. pastoris y S. cerevisiae

Para analizar los modelos metabolicos de Pichia pastoris y Saccharomyces cerevisiae

[65] se siguieron los siguientes pasos:

1. Se llevaron las reacciones de los modelos metabolicos al formato SBML.

En esta etapa se tomo como base el SBML del modelo de S. cerevisiae a partir de la

reconstruccion a nivel genomico realizado por Forster, Famili, Fu, Nielsen y Palsson

en el ano 2003 [31]. Luego de haber estudiado la reconstruccion y el formato, se proce-

dio a eliminar y agregar reacciones, compartimientos, eventos, condiciones, entre otros

elementos del formato.

2. Se creo un proyecto en CELLNETANALYZER para cada modelo y luego se cargaron los

modelos en SBML en sus proyectos respectivos.

A continuacion se indican las dificultades encontradas y los pasos seguidos para superarlas.

En un comienzo no se logro encontrar una solucion factible al modelo. Para ello se uti-

lizo la herramienta Basic Topological Properties del Programa CELLNETANALYZER

la cual entrega un reporte en la ventana de MATLAB indicando la existencia de reaccio-

nes bloqueadas, de metabolitos que se acumulan al interior del sistema o metabolitos

que se utilizan pero no se generan ni ingresan a este, entre otras propiedades.

Con la informacion previamente obtenida se identificaron las reacciones problema y se

corrigen, ya sea creando reacciones de transporte de metabolitos o bien transformando

metabolitos de internos a externos, i.e., que su concentracion no sea constante.

La etapa en la curacion de los modelos que mayor dificultad tenıa asociada fue la iden-

tificacion de errores en reversibilidades de reacciones, lo que puede llevar incluso a la

perdida de factibilidad del sistema global. Es por esto que se debio revisar en detalle la

reversibilidad de cada reaccion en cada modelo.

3. Se ejecuto el metodo de modos elementales.

35

Al momento de ejecutar el metodo de calculo de modos elementales se reviso que no

existiesen reacciones bloqueadas y se ejecuto de modo tal que se respetaran las reversi-

bilidades de las reacciones en el sistema, ya que de no respetarlas el numero de modos

elementales aumentarıa considerablemente y muchos de ellos no serıan biologicamente

factibles.

4. Se escogieron sustratos y productos finales de interes y se calcularon rendimientos relativos

para los distintos modos elementales y ambos modelos.

Se determino que biomasa y SOD eran los productos relevantes, y que los sustratos

glucosa, glicerol y metanol serıan estudiados.

5. Se compararon los resultados obtenidos entre los metodos y las especies.

6. Se analizaron los modelos y resultados y se concluyo al respecto.

7. Se propusieron mejoras al modelo y se sugirieron desafıos futuros en el tema estudiado.

3.1.3. Modelo Estequiometrico Saccharomyces cerevisiae

Se utilizo el modelo metabolico realizado por Ramon Gonzalez [36, 35], para S. cere-

visiae expresando Superoxido Dismutasa humana, previa verificacion de sus supuestos y algunas

modificaciones que permitieran generalizar el modo tal que tuviera una extension y complejidad

adecuada para obtener resultados relacionados con las capacidades metabolicas generales de los

organismos en estudio.

Entre las mejoras al modelo se encuentran el haber incluido el metabolito DHAP y mas

reacciones que permitieron representar en mayor detalle a la vıa de degradacion de glicerol.

36

3.2. Analisis Modelos Metabolicos Estacionarios

El programa utilizado (CELLNETANALYZER [47]) realiza diversos tipos de analisis de

modelos estequiometricos, entre los que se encuentran Analisis de Modos Elementales, Analisis de

Vıas Extremas, Analisis de Balances de Flujos, Analisis de Sensibilidad, Analisis de Robustez, etc.

El algoritmo utilizado para calcular Modos Elementales corresponde al desarrollado por

Schuster y Hilgetag en el ano 1994, luego por Pfeiffer en el ano 1999 y completado por Schuster

en el ano 2000. Tal algoritmo tambien es el utilizado por METATOOL [62].1

3.3. Tratamiento Informatico del Problema

3.3.1. Codificacion de los Modelos Metabolicos en formato SBML

El formato SBML, SYSTEMS BIOLOGY MARKUP LANGUAGE, corresponde a un for-

mato de codigo libre (open source) basado en XML para representar redes de reacciones bioquımi-

cas [28].

Fue desarrollado durante el ano 2000 por Michael Hucka, Andrew Finney, Herbert Sau-

ro y Hamid Bolouri a peticion de Hiroaki Kitano y John C. Doyle con el financiamiento de Japan

Science and Technology Corporation (JST) [40]. Actualmente se encuentra disponible la version

3 de SBML Nivel 2, la cual se ha obtenido gracias a la colaboracion de cientos de personas que

han participado en la revision y mejora del lenguage [1].

La estructura del lenguage SBML Nivel 2, version 3, consiste basicamente en una lista

que contiene los siguientes componentes; definicion de funcion, definicion de unidad, tipo de com-

partimiento, tipo de especie, compartimiento, especie, parametro, valor inicial, regla, restriccion,

1Ver Anexos, Capıtulo C Material Suplementario, Seccion C.1 para mas detalles.

37

reaccion y evento (cambio discontinuo de alguna variable) [1].

Gracias a su versatilidad permite el intercambio de informacion y modelos entre diver-

sos sistemas de softwares, asegurando que los modelos mantengan su vigencia mas alla que los

softwares utilizados en el desarrollo de tales modelos [45, 41].

3.3.2. Representacion Grafica de Resultados: Lenguage GLE

Para representar ambos modelos metabolicos se utilizo el lenguaje grafico abierto GLE

(GRAPHICS LAYOUT ENGINE) [3], a traves del cual es posible producir imagenes de tipo Post-

Script, EPS, PDF, PNG o JPG desde un simple documento de texto.

Se escogio tal lenguaje debido a la alta calidad de las imagenes producidas y a su natural

integracion con el procesador de textos LATEX que se utilizo para editar esta memoria.

GLE ha sido desarrollado por los programadores Laurence Abbott, Christoph Brendes,

A. S. Budden, Bryn Jeffries, Vincent LaBella, Jan Struyf y Steve Wilkinson con el patrocinio de

Imagix Corp. [3].

3.3.3. Software CELLNETANALYZER

Se utilizo el software CNA o CELLNETANALYZER (FLUXANALYZER) Version 6.2 para

realizar los analisis de los modelos metabolicos. CNA esta programado en MATLAB bajo el siste-

ma operativo LINUX, con interfaces graficas para el usuario (GUI).2

Este software fue desarrollado por Steffen Klamt en el grupo de Systems Biology lide-

rado por E. Gilles en Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems [47].

2Se utilizo el sistema operativo de LINUX Fedora Core 6 en el desarrollo de los modelos estequiometricos y su

analisis posterior.

38

Capıtulo 4

Resultados y Discusiones

4.1. Modelo Estequiometrico de S. cerevisiae

El modelo estequiometrico (reacciones y esquema) de S. cerevisiae utilizado se baso en

el modelo realizado por Ramon Gonzalez en el marco de su tesis para optar al grado de Doctor en

Ciencias de la Ingenierıa, mencion Quımica de la Facultad de Ciencias Fısicas y Matematicas de

la Universidad de Chile [35]1.

Una de las modificaciones realizadas a tal modelo corresponde a la incorporacion del

metabolito dihidroxiacetona fosfato (DHAP), el cual es un intermediario en la vıa de asimilacion

del glicerol.

La reaccion escogida por Gonzalez para representar el catabolismo de glicerol es la si-

guiente;

GAP+NADH ⇐⇒ GLIC+NAD (4.1)

Se decidio incorporar DHAP a traves de las siguientes ecuaciones, para mantener una

mayor similitud con el modelo de Pichia pastoris, y debido a que diversos autores sugieren rele-

vante incluir DHAP dentro de un modelo metabolico de Saccharomyces cerevisiae [42, 21];1Las reacciones bioquımicas y esquema de la red se muestran en el Apendice, Capıtulo A, Seccion A.1.

39

GAP+DHAP =⇒ FRUC 6P (4.2)

FRUC 6P =⇒ DHAP (4.3)

DHAP ⇐⇒ GAP (4.4)

GLIC+NAD =⇒ DHAP+NADH (4.5)

Tambien se considero la ecuacion alternativa para la reaccion ISOCIT – AKG [21, 83];

ISOCIT+NADP =⇒ AKG+NADPH+CO2 (4.6)

Al igual que Gonzalez, no se considero el ciclo del glioxilato en presencia de glucosa,

ya que se sabe que este ciclo se encuentra inactivo durante el crecimiento en esa fuente de carbono

[35]. A continuacion se muestran las referencias utilizadas por Gonzalez [35] para construir el

modelo estequiometrico de S. cerevisiae;

Tabla 4.1: Referencias utilizadas en la construccion del modelo estequiometrico de S. cerevisiae.En negrita se muestran las fuentes bibligraficas nuevas.

Vıa o Reacciones Referencias

Glicolisis Stryer, 1995; van Gulik y Heijmen, 1995

Ruta de las Pentosas Fosfato Nissen et al., 1997; van Gulik y Heijmen, 1995

Ciclo de los Acidos Tricarboxılicos Stryer, 1995; van Gulik y Heijmen, 1995; Walker, 1997 [83]

Reacciones Anapleroticas Stephanopoulos et al., 1998; van Gulik y Heijmen, 1995

Rutas Fermentativas Gancedo y Serrano, 1989; van Gulik y Heijmen, 1995;

Jahic, 2003 [42]

Sıntesis de Aminoacidos Stryer, 1995; van Gulik y Heijmen, 1995

Sıntesis de Nucleotidos Nissen et al., 1997; Stryer, 1995

Sıntesis de Lıpidos Nissen et al., 1997; Stryer, 1995

Sıntesis de Carbohidratos Stryer, 1995; van Gulik y Heijmen, 1995

40

4.2. Modelo Estequiometrico de P. pastoris

Este modelo se construyo tomando como base el modelo de S. cerevisiae desarrollado

por Ramon Gonzalez [35] y considerando las diferencias en el metabolismo descritas en la litera-

tura. A continuacion se presenta una lista de las referencias utilizadas para construir el modelo de

P. pastoris2.

Tabla 4.2: Referencias utilizadas en la construccion del modelo estequiometrico de P. pastoris.La bibliografıa utilizada por Gonzalez para las distintas reacciones se encuentran en la Tabla 4.1.

Vıa o Reacciones Referencias

Glicolisis Gonzalez, 2001 [35]; Sola 2004 [75]; Walker, 1997 [83]

Ruta de las Pentosas Fosfato Gonzalez, 2001 [35]; Sola, 2004 [75]; Walker, 1997[83]

Ciclo de los Acidos Tricarboxılicos Gonzalez, 2001 [35]; Sola, 2004 [75]; Walker, 1997 [83]

Reacciones Anapleroticas Gonzalez, 2001 [35]; Sola 2004 [75];

Rutas Fermentativas Gonzalez, 2001 [35]; Jahic, 2003; Sola, 2004 [75];

Walker, 1997 [83]

Sıntesis de Aminoacidos Gonzalez, 2001 [35]; Sola, 2004 [75]; Walker, 1997 [83];

Sola y Maaheimo, 2004 [77]

Sıntesis de Nucleotidos Gonzalez, 2001 [35]; Sola, 2004 [75]; Sauer at al., 2004 [68]

Sıntesis de Lıpidos Gonzalez, 2001 [35]; Sola, 2004 [75]

Sıntesis de Carbohidratos Gonzalez, 2001 [35]; Sola, 2004 [75]

Metabolismo del Metanol Jahic, 2003 [42]; Sola, 2004 [75]; Sauer et al., 2004 [68];

Walker, 1997 [83]; Hartner y Glieder, 2006 [37]

En este modelo no se considero el ciclo del glioxilato dado que se ha visto en la literatura

la ausencia de las enzimas que realizan tal funcion y la falta de actividad enzimatica necesaria para

acelerar la reaccion ISOCIT – MAL [75].

2Las reacciones del modelo estequiometrico de P. pastoris se muestran en detalle en el Apendice, Capıtulo A,

Seccion A.2.

41

4.3. Modelo Estequiometrico de P. pastoris

En la Figura 4.1 se muestra un esquema del modelo de Pichia pastoris, donde se distingue

la vıa del metabolismo del metanol y las similitudes y diferencias con el modelo de S. cerevisiae

(Figura A.1).

4.4. De los Modelos Estequiometricos

Al comparar los modelos estequiometricos de ambas levaduras (Figuras 4.1 y A.1), se

observa que presentan las siguientes diferencias;

1. Reversibilidad de la reaccion Succinato – Fumarato en modelo de P. pastoris.

2. Reversibilidad de la reaccion Fumarato – Malato en modelo de P. pastoris.

3. Ausencia de reaccion anaplerotica PEP – OAC en modelo de P. pastoris.

4. Ausencia de la reaccion MAL – PIR en modelo de S. cerevisiae.

5. Presencia de la vıa de asimilacion del metanol unicamente en el modelo de P. pastoris.

4.4.1. Potenciales Mejoras a los Modelos Estequiometricos

Para mejorar la representatividad de los modelos estequiometricos se podrıan agregar

reacciones de transporte de algunos metabolitos, como oxaloacetato hacia y desde la mitocondria,

extender la red incorporando reacciones no consideradas y considerar a los metabolitos ATP, ADP

NAD, NADP, NADH y NADPH como metabolitos internos.

Para mejorar ambos modelos se podrıa incorporar regulacion genica, lo cual es muy re-

levante dada la existencia del fuerte promotor AOX1 en P. pastoris , ausente en S. cerevisiae.

42

v1

v2 v83

v4

v79

v3

v5

v6

v7

v29v9

v25

v10

v11

v13

v14

v15

v16

v17 v12

v77

v69

v78

v76

v10

v74v18

v21

vRIB5Pv19

v72-nuRIB5P

v70-aaRIB5P

v71-aaRIB5P

v70-aaE4PvE4P

v71-aaE4P

v20

v22

v23

v31

v87 v86

v85

v84

v89

v80

v81

v82

v88

vG3P

vPEP

vPIR v70-aaPIR

v71-aaPIR

v71-aaPEP

v70-aaPEP

v71-aaG3P

v70-aaG3P

v72-nuG3P

v73-GAP

vAKG v70-aaAKG

v71-aaAKG

v72-nuOAC

v71-aaOAC

v70-aaOAC

v73-AcCoA

v27 v26

v75

v30

v28

vAcCoAcitv70-aaAcCoA

v71-aaAcCoA vOAC

Figura 4.1: Modelo Metabolico del Metabolismo Central de Pichia pastoris.

43

4.5. Analisis Modelos Estequiometricos

4.5.1. Propiedades Topologicas Basicas

Tabla 4.3: Propiedades Topologicas Basicas de las Redes Metabolicas de S.cerevisiae y P. pastoris.

Propiedad Modelo S. cerevisiae Modelo P. pastoris

Numero de Reacciones 76 84

Numero de Metabolitos Internos 60 66

Numero de Metabolitos Externos 23 25

Metabolitos de Consumo Glucosa Glucosa

Glicerol Glicerol

Metanol

Reacciones Reversibles 20 22

Rango Matriz Estequiometrica 59 65

Grados de Libertad 18 19

Red comprimida 12 metabolitos 10 metabolitos

30 reacciones 29 reacciones

En la Tabla 4.3 se contrastan las propiedades topologicas de ambos modelos estequiometri-

cos. En ella se pueden apreciar, en relacion al numero de reacciones, que el modelo de Pichia pas-

toris tiene 8 reacciones extras, las que pertenecen al metabolismo del metanol. A pesar de tener

tales reacciones nuevas y diferir en una reaccion anaplerotica, y en reversibilidades de reacciones

del ciclo de los acidos tricarboxılicos, se observa que al comprimir la red se logra obtener una

red mas reducida que la que se obtiene con el modelo de S. cerevisiae . Es decir, a pesar de tener

mas metabolitos y reacciones, estas reacciones, y aquellas modificadas (quizas las reacciones que

son reversibles solo en P. pastoris) permiten de alguna manera simplificar la estructura de la red

metabolica.

44

El rango de la matriz estequiometrica, que representa el numero mınimo de reacciones

necesario para describir cambios en la concentracion, tambien difiere entre ambos modelos. En el

caso de P. pastoris, el rango de su matriz supera en 6 unidades al rango de la matriz estequiometrica

del modelo de S. cerevisiae. Por otro lado, el modelo de P. pastoris tiene un grado de libertad mas

que el modelo de S. cerevisiae, es decir, que se requiere una medicion de flujo mas para definir el

sistema, i.e., para conocer todos los flujos metabolicos en un momento dado.

4.5.2. Conectividad

Figura 4.2: Histograma de Conectividad Modelos Estequiometricos S. cerevisiae y P. pastoris.

(Conectividad: Numero de Reacciones en las que un metabolito participa).

En la Figura 4.2 se compara la conectividad de ambos modelos, donde por conectividad

se entiende el numero de reacciones en las que un metabolito participa. Se observa que para ambos

modelos la gran mayorıa de los metabolitos estan presentes en menos de 4 reacciones, mientras que

pocos metabolitos (glucosa en particular) tienen una elevada conectividad (i.e., estan presentes en

muchas reacciones). En el histograma de conectividad no se consideran algunos de los metabolitos

mas conectados por ser metabolitos externos, como lo es el ATP.

45

La diferencia entre las conectividades de ambos modelos se debe a la presencia de las

reacciones del metabolismo del metanol y su interaccion con otros metabolitos presentes en ambos

modelos.

4.5.3. Modos Elementales

Tabla 4.4: Cantidad y Distribucion de los Modos Elementales del Modelo de S. cerevisiae.

Total Glucosa Glicerol Metanol Etanol SOD Proteınas Lıpidos ARN

429 336 215 — 8 132 132 123 9

100 % 78,3 % 50,1 % — 1,9 % 30,8 % 30,8 % 28,7 % 2,1 %

Tabla 4.5: Cantidad y Distribucion de los Modos Elementales del Modelo de P. pastoris.

Total Glucosa Glicerol Metanol Etanol SOD Proteınas Lıpidos ARN

467 413 142 108 8 144 144 131 16

100 % 88,4 % 30,4 % 23,1 % 1,7 % 30,8 % 30,8 % 28,1 % 3,4 %

En las Tablas 4.4 y 4.5 se observa que la glucosa (mas precisamente la reaccion inicial

de degradacion de glucosa) esta presente en la gran mayorıa de los modos elementales (78 % y

88 % para los modelos de S. cerevisiae y P. pastoris respectivamente), lo cual sugiere que ambos

organismos “prefieran” glucosa como fuente de carbono, ya que entre muchas de las distintas mo-

dalidades de crecimiento mınimo, el consumo de glucosa esta presente. Ademas, el estar presente

en tantos modos es un signo de robustez de la red, ya que de eliminar un modo al bloquear una

reaccion, este sustrato aun podra ser consumido en alguno de los modos elementales restantes.

46

Los porcentajes de participacion de SOD y proteınas son identicos entre sı y para ambos

modelos (Figuras 4.4 y 4.5) debido a que requieren la sıntesis de casi todos los mismos aminoaci-

dos (SOD esta compuesto por todos los aminoacidos proteinogenicos a excepcion de metionina y

tirosina), por lo que comparte las vıas asociadas a la sıntesis de aminoacidos.

La diferencia entre los porcentajes de participacion de glicerol en los modos de ambas

especies radica en la presencia del sustrato metanol en el modelo de P. pastoris. Con respecto al

etanol se observa el mismo porcentaje de participacion en los modos de ambos modelos.

Es importante hacer notar que no todos los modos elementales calculados son factibles,

ya que existen mecanismo de represion y otro tipo de factores no considerados en el modelo, mu-

chos de los cuales no estan relacionados con el metabolismo.

Por ejemplo la glucosa y el etanol son represores efectivos del promotor AOX1, impi-

diendo que se metabolice metanol en su presencia. Es por esto, que los modos elementales que

incluyan consumo de metanol y produccion de etanol no son factibles. Y los modos elementales

que incluyan consumo de metanol y consumo de glucosa son solo factibles si la glucosa se esta ali-

mentando a medida que se consume sin acumularse en el medio de cultivo. Ademas, dado que

en P. pastoris la produccion de proteınas recombinantes esta asociada al crecimiento, los modos

elementales en que se produzca SOD y no biomasa, no serıan viables.

4.5.4. Rendimientos Relativos

En las Tablas 4.6, 4.7 y 4.8 se observa la menor productividad de biomasa y SOD al

crecer en metanol que al crecer en glucosa. A su vez, el glicerol da rendimientos menores que

el metanol, y que los rendimientos maximos Ybiomasaglucosa

, Ybiomasaglicerol

, Y SODglucosa

y Y SODglicerol

coinciden en ambos

modelos.

47

Tabla 4.6: Rendimientos Relativos Maximos de Modos Elementales de S. cerevisiae y P. pastoris.

Modelo S. cerevisiae Modelo P. pastoris

P± Ybiomasaglucosa

Ybiomasaglicerol

Y SODglucosa

Y SODglicerol

Ybiomasaglucosa

Ybiomasaglicerol

Ybiomasametanol

Y SODglucosa

Y SODglicerol

Y SODmetanol

P+ 1,83 0,25 10,99 0,92 1,83 0,25 0,50 10,99 0,92 1,84

P− 2,87 0,61 — — 2,87 0,61 1,23 — — —P−P+ 1,57 2,44 — — 1,57 2,44 2,46 — — —

Tabla 4.7: Rendimientos Relativos Maximos de Modos Elementales de S. cerevisiae y P. pastoris.

(Las condiciones representan: B = produccion de biomasa, M = consumo de metanol).

Modelo S. cerevisiae Modelo P. pastoris

Condicion Y SODglucosa

Y SODglicerol

Y SODglucosa

Y SODglicerol

Y SODmetanol

B 3,97 0,54 3,97 0,54 1,09

M — — 1,50 0,00 1,84

B y M — — 0,82 0,00 1,09

Tabla 4.8: Rendimientos Relativos Experimentales de las levaduras S. cerevisiae y P. pastoris.

S. cerevisiae [35] P. pastoris [75]

P± Ybiomasaglucosa

Ybiomasaglicerol

Ybiomasaglucosa

Ybiomasaglicerol

Ybiomasametanol

P+ 0,75 — 3,59 1,90 0,10

P− 1,12 — — — 0,08P−P+ 1,49 — — — 0,80

48

De la Tabla 4.6 se desprende que entre los modos elementales de P. pastoris es posible

obtener el doble de moles de biomasa por mol de metanol que por mol de glicerol.

Los valores expresados en las Tablas 4.6 y 4.7 indican situaciones optimas (rendimientos

maximos) que son difıciles o imposibles de alcanzar y que requieren que toda la celula este enfo-

cada a producir solo tal producto. Es decir, en el caso del rendimiento maximo de biomasa versus

glucosa o glicerol, este se obtiene cuando no se esta produciendo SOD, y viceversa. Sin embargo,

de la literatura se sabe la relacion entre el crecimiento en biomasa y la produccion de proteınas

heterologas, en particular en P. pastoris, por lo que el rendimiento de Ybiomasaglucosa

=10,99 molmol es una

situacion muy lejana a la realidad. Por ello se determinaron los rendimientos relativos maximos de

la celula produciendo tanto SOD como biomasa, mostrados en la Figura 4.7.

Por otro lado, al comparar las Tablas 4.6 y 4.8 se puede observar que la no produccion de

SOD por S. cerevisiae bajo las condiciones estudiadas, genera un 49 % de mejora de rendimiento,

y en el caso del modelo, este indica que al comparar los rendimientos maximos, la no produccion

de SOD genera un 57 % de mejora de rendimiento.

En la Tabla 4.7 se observa que la condicion de crecimiento (o produccion de biomasa)

lleva asociados valores superiores en Y SODglucosa

con respecto a las condiciones que consideran consu-

mo de metanol. Ello coincide con el hecho que SOD en P. pastoris se exprese de manera asociada

al crecimiento.

El rendimiento Y SODmetanol

, por su parte, presenta un maximo en la condicion de consumo de

metanol sin produccion de biomasa. Esto coincide con el hecho que la productividad de P. pastoris

al sintetizar proteınas heterologas disminuye notablemente al dejar de producir biomasa.

Se observa ademas que no existen modos elementales que produzcan SOD a partir de

glicerol cuando esta presente metanol (valores nulos para Y SODglicerol

bajo condiciones con consumo de

metanol) —Ver Tabla 4.7—.

49

De las Tablas 4.6 y 4.8 se observa que el “estres” que genera la produccion de SOD

produce una disminucion en los rendimientos relativos, a excepcion del rendimiento Ybiomasametanol

ex-

perimental. En el caso del resultado experimental obtenido por Sola en el ano 2004, hay un leve

aumento en la productividad biomasa versus metanol al producir SOD en el organismo recombi-

nante. Ello se puede deber a errores en las mediciones, a factores de error asociado a estos, que

estas mediciones se hayan realizado bajo condiciones ligeramente distintas o a distintos tiempos o

bien que represente en un resultado circunstancial debido a la dinamica celular, ya que en rigor, la

produccion de una proteına heterologa genera una disminucion de energıa y metabolitos disponi-

bles para la produccion de biomasa.

Los rendimientos Ybiomasaglucosa

y Ybiomasaglicerol

experimentales (3,59 molmol y 1,90 mol

mol respectivamente)

son mayores que los rendimientos maximo teoricos correspondientes (1,83 molmol y 0,25 mol

mol respec-

tivamente) para P. pastoris produciendo una proteına heterologa. Esta diferencia podrıa radicar en

el hecho que los resultados experimentales para P. pastoris corresponden a la produccion de la

proteına heterologa lipasa de Rhizopus oryzae (ROL) y no SOD.3

En relacion a los modos elementales que presentan rendimientos maximos biomasa ver-

sus glucosa (Ybiomasaglucosa

) y SOD versus glucosa Y SODglucosa

), como se puede observar en la Figura 4.3,

ambos modos incluyen el consumo de glicerol. Esto ultimo podrıa justificarse con el hecho que

el glicerol ingresa directamente a la formacion de triosas fosfatos como gliceraldehıdo 3-fosfato

(GAP) y fosfato de di-hidroxiacetona (DHAP), lo que representa un menor consumo de energıa

en los pasos de fosforilacion de la aldohexosa. Ello ocurre tanto para S. cerevisiae como para P.

pastoris -Figura no mostrada-.

3A la fecha no se han publicado rendimientos correspondientes a P. pastoris produciendo SOD, sino solo des-

cripciones cualitativas que indican su elevada productividad —a traves de la tecnica Western Blot— y estudios de

actividad de la enzima.

50

En el caso del modo elemental con maximo rendimiento Ybiomasaglucosa

, este no incluye la pro-

duccion de SOD (ver Figura 4.3(a)), y a su vez, el modo elemental con maximo rendimiento Y SODglucosa

no presenta produccion de biomasa (Figura 4.3(b)). Ello se debe a que para presentar maximo ren-

dimiento no se deben utilizar moles de sustrato (en este caso glucosa) en producir otro compuesto

o biomasa. En la naturaleza, sin embargo, P. pastoris requiere crecer para poder producir SOD, por

lo que tales modos elementales deben actuar en conjunto para representar el metabolismo de este

organismo en un momento dado.

(a) Modo Elemental con Maximo Rendimiento Ybiomasaglucosa

(1,83 molmol ). (b) Modo Elemental con Maximo Rendimiento Y SOD

glucosa(10,99 mol

mol ).

Figura 4.3: Modos Elementales con Maximos Rendimientos Ybiomasaglucosa

y Y SODglucosa

Modelo S. cerevisiae.

51

v1

v2 v83

v4

v79

v3

v5

v6

v7

v29v9

v25

v10

v11

v13

v14

v15

v16

v17 v12

v77

v69

v78

v76

v10

v74v18

v21

vRIB5Pv19

v72-nuRIB5P

v70-aaRIB5P

v71-aaRIB5P

v70-aaE4PvE4P

v71-aaE4P

v20

v22

v23

v31

v87 v86

v85

v84

v89

v80

v81

v82

v88

vG3P

vPEP

vPIR v70-aaPIR

v71-aaPIR

v71-aaPEP

v70-aaPEP

v71-aaG3P

v70-aaG3P

v72-nuG3P

v73-GAP

vAKG v70-aaAKG

v71-aaAKG

v72-nuOAC

v71-aaOAC

v70-aaOAC

v73-AcCoA

v27 v26

v75

v30

v28

vAcCoAcitv70-aaAcCoA

v71-aaAcCoA vOAC

(a) Modo Elemental con Maximo Rendimiento Ybiomasametanol

(1,23 molmol ).

v1

v2 v83

v4

v79

v3

v5

v6

v7

v29v9

v25

v10

v11

v13

v14

v15

v16

v17 v12

v77

v69

v78

v76

v10

v74v18

v21

vRIB5Pv19

v72-nuRIB5P

v70-aaRIB5P

v71-aaRIB5P

v70-aaE4PvE4P

v71-aaE4P

v20

v22

v23

v31

v87 v86

v85

v84

v89

v80

v81

v82

v88

vG3P

vPEP

vPIR v70-aaPIR

v71-aaPIR

v71-aaPEP

v70-aaPEP

v71-aaG3P

v70-aaG3P

v72-nuG3P

v73-GAP

vAKG v70-aaAKG

v71-aaAKG

v72-nuOAC

v71-aaOAC

v70-aaOAC

v73-AcCoA

v27 v26

v75

v30

v28

vAcCoAcitv70-aaAcCoA

v71-aaAcCoA vOAC

(b) Modo Elemental con Maximo Rendimiento Y SODmetanol

(1,84 molmol ).

Figura 4.4: Modos Elementales con Maximos Rendimientos Ybiomasametanol

y Y SODmetanol

Modelo P. pastoris.

En la Figura 4.4 se muestran los modos elementales que presentan rendimientos maxi-

mos biomasa versus metanol (Ybiomasametanol

) y SOD versus metanol (Y SODmetanol

). A diferencia de los modos

mostrados en la Figura 4.3, al comparar las Figuras 4.4(a) con 4.3(a) y 4.4(b) con 4.3(b) se observa

la ausencia de la reaccion GLUC 6P – FRUC 6P, lo cual pueda deberse a la presencia de las vıas

de asimilacion del metanol.

52

(a) Ybiomasaglucosa

v/s Modos Elementales Modelo S. cerevisiae. (b) Y SODglucosa

v/s Modos Elementales Modelo S. cerevisiae.

(c) Ybiomasaglicerol

v/s Modos Elementales Modelo S. cerevisiae. (d) Y SODglicerol

v/s Modos Elementales Modelo S. cerevisiae.

Figura 4.5: Rendimientos Biomasa y SOD v/s Glucosa y Glicerol Modos S. cerevisiae.

En las Figuras 4.5 y 4.6 se muestran graficos de biomasa y SOD versus glucosa y gli-

cerol (y metanol en el caso de la Figura 4.6) para los modos elementales (ordenados en manera

creciente) del modelo estequiometrico de S. cerevisiae y P. pastoris respectivamente.

La distribucion de los rendimientos Ybiomasaglucosa

, Ybiomasaglicerol

, Y SODglucosa

y Y SODglicerol

es muy similar en

ambos modelos. Al comparar las Figuras 4.5(a) con 4.6(a), 4.5(b) con 4.6(b), 4.5(c) con 4.6(c) y

4.5(d) con 4.6(d), se observan patrones muy similares entre los modos elementales de ambas espe-

cies.

53

(a) Ybiomasaglucosa

v/s Modos Elementales Modelo P. pastoris. (b) Y SODglucosa

v/s Modos Elementales Modelo P. pastoris.

(c) Ybiomasaglicerol

v/s Modos Elementales Modelo P. pastoris. (d) Y SODglicerol

v/s Modos Elementales Modelo P. pastoris.

(e) Ybiomasametanol

v/s Modos Elementales Modelo P. pastoris. (f) Y SODmetanol

v/s Modos Elementales Modelo P. pastoris.

Figura 4.6: Rendimientos Biomasa y SOD v/s Glucosa, Glicerol y Metanol Modos P. pastoris.

54

Esta similitud en los patrones de rendimientos entre ambas especies se debe a que mu-

chos de los modos elementales son identicos, dado que ambas redes comparten aproximadamente

el 87 % de reacciones (73 de las 84 reacciones del modelo de P. pastoris estan presentes en el mo-

delo de S. cerevisiae) y aquellos modos elementales unicos para P. pastoris, e.g., aquellos donde se

consume metanol presentan los mismos rendimientos que otros modos elementales de P. pastoris

y de S. cerevisiae. Esto ultimo se verifica al sobreponer tales graficos y notar que en los graficos

asociados a modos elementales de P. pastoris no existen puntos ubicados a “alturas” (rendimientos)

en los que no exista al menos algun modo elemental de S. cerevisiae.

Al comparar las Sub-Figuras 4.5(a) y 4.5(c) se observa que en muchos modos elemen-

tales el rendimiento Ybiomasaglucosa

es mayor que el rendimiento Ybiomasaglicerol

. Esto mismo ocurre en el caso de

SOD (Sub-Figuras 4.5(b) y 4.5(d)) y en el caso de P. pastoris (Sub-Figuras 4.6(a) con 4.6(c) y

4.6(b) con 4.6(d)).

55

Capıtulo 5

Conclusiones

5.1. De los Resultados

Se logro realizar un modelo metabolico de P. pastoris que incorpora vıas de asimilacion

de la glucosa, glicerol y metanol. El modelo presentado corresponde al modelo metabolico de es-

te organismo mas detallado realizado hasta la fecha. El modelo de mayor tamano conocido para

P. pastoris fue publicado en enero del presente ano por Sola [76], pero carece de las ecuaciones

bioquımicas necesarias para sintetizar proteınas, ARN, lıpidos y etanol, las que se requieren para

realizar estudios de capacidades metabolicas generales. El modelo realizado incorpora ademas la

sıntesis de una proteına heterologa (SOD), lo cual no se habıa realizado antes para este organismo.

Como los modelos metabolicos son solo una representacion de las capacidades metaboli-

cas reales, y dependen directamente del tamano de la red y de las condiciones de crecimiento de

los organismos, es recomendable contar con informacion experimental que valide las capacidades

metabolicas principales indicadas en el modelo y que sugiera reacciones adicionales y relevantes

en estos. La informacion experimental encontrada en la literatura permitio observar un cuociente

similar de rendimientos biomasa versus glucosa entre S. cerevisiae recombinante y no recombi-

nante para el modelo teorico y el organismo real.

Al comparar los rendimientos relativos entre ambos organismos se observo que para los

56

sustratos glucosa y glicerol, los modos elementales que arrojaban los rendimientos maximos coin-

cidıan entre ambos organismos y que para el metanol, entre los modos elementales que lo incluıan,

el rendimiento relativo maximo era el doble que en el caso del rendimiento de biomasa versus

glicerol.

Debido a lo anterior, se cree que las redes metabolicas contaban con pocas diferencias

para obtener mayores resultados a partir del estudio de sus modos elementales y los rendimientos

relativos asociados.

Ahora bien, en cuanto al metabolismo de metanol, presente en P. pastoris y ausente en

S. cerevisiae, este esta asociado a modos elementales que no presentan mayores rendimientos re-

lativos para hSOD y biomasa, por lo que la eficiencia indicada en la literatura debe estar radicada

en otros factores tales como la regulacion genica, y no necesariamente en la estructura de la red

metabolica, o bien son producto de la dinamica y no del estado estacionario.

Serıa interesante estudiar cuales modos elementales estan activos en determinadas condi-

ciones de cultivo y en distintas etapas de crecimiento. Ello podrıa realizarse a traves de mediciones

de flujos o de estudios de perfiles de expresion genica (“microarrys”) que permitieran filtrar los

modos elementales hasta obtener los mas representativos en determinadas condiciones.

5.1.1. De la Productividad de P. pastoris versus S. cerevisiae

El nivel de expresion de proteınas recombinantes se ve afectado por una gran variedad

de factores geneticos o ambientales, como el huesped, el promotor, genes foraneos, condiciones

de cultivo (en especial la temperatura), entre muchos otros. El presente estudio solo abarco el me-

tabolismo, desde el punto de vista de la estructura de la red estequiometrica. En el caso de casei-

nomacropeptido humano y el antıgeno bullous pemphigoid 230 (BP230) P. pastoris demostro ser

menos productiva que S. cerevisiae, pero son excepciones. La gran mayorıa de las comparaciones

reportadas indican que P. pastoris presenta mayor productividad al sintetizar proteınas heterologas

que S. cerevisiae. Ello podrıa deberse a una baja eficiencia intrınseca de P. pastoris para producir

57

ciertas proteınas recombinantes, que se utilizaron factores de transcripcion mejores en algunos ex-

perimentos, o bien que las cepas utilizadas durante los experimentos no fueron optimas.

Ahora bien, la mayor productividad de P. pastoris al compararla con S. cerevisiae, como

sistemas de expresion de proteınas recombinantes, reportada en numerosos casos podrıa deberse

a muchos factores. Ademas del metabolismo y su estructura, la mejor productividad podrıa ser

justificada por diversas razones, entre las que cabe mencionar;

Al ser un organismo preferentemente respiratorio, P. pastoris evita la generacion de pro-

ductos no deseados asociados a procesos fermentativos, como el etanol. Esta es una de las

razones por las que puede llegar a crecer a elevadas densidades celulares, lo cual es relevante

al sintetizar proteınas cuya expresion va asociada al crecimiento celular, como ocurre en este

organismo.

La vıa intracelular “respuesta a proteınas no plegadas” o UPR (acronimo de Unfolded Protein

Response), cuya funcion es eliminar del retıculo endoplasmatico a las proteınas mal plega-

das, esta regulada de manera distinta en ambos organismos. En P. pastoris se ha observado

que el plegamiento proteico y ensamblaje de heterodımeros en el retıculo endoplasmatico

son etapas limitantes en la secrecion de algunas proteınas heterologas [32]. Los genes rela-

cionados con la respuesta UPR en P. pastoris estan regulados diferencialmente a los de S.

cerevisiae [33]. Ello podrıa influir en el nivel de secrecion de las proteınas, y con ello en la

productividad como huesped.

5.2. Conclusiones Generales

Se realizo un estudio comparativo de las capacidades metabolicas de Pichia pastoris y

Saccharomyces cerevisiae como sistemas de expresion de la enzima Superoxido Dismutasa huma-

na en base al modelo del metabolismo central de S. cerevisiae realizado por Ramon Gonzalez.

Se identificaron los elementos de la red estequiometrica de P. pastoris, se completo la red

de S. cerevisiae, se comparo su conectividad, sus propiedades topologicas y se realizo un analisis

58

de modos elementales y un estudio de los rendimientos relativos maximos para los modos elemen-

tales calculados para ambos modelos.

En el caso de P. pastoris, las capacidades metabolicas consideradas son similares a las

de S. cerevisiae, lo cual se observa en los modos elementales, la mayorıa de los que se pueden ob-

tener en ambos modelos, y en los rendimientos relativos y su distribucion en los modos de ambos

modelos.

A traves de los modelos se verifico que SOD presenta mayores rendimientos cuando

esta asociada al crecimiento en P. pastoris, con glucosa y glicerol como fuente de carbono y que

la produccion de SOD genera un estres metabolico que se traduce en una perdida de rendimiento

para biomasa versus fuente de carbono.

Los resultados sugieren que una fuente de carbono adicional —metanol— y la mayor

cantidad de modos elementales asociada, que se refleja en mayores posibles combinaciones de

vıas metabolicas activas da cuenta de la mayor eficiencia mostrada por P. pastoris como productor

de proteınas recombinantes o simplemente, que las vıas o factores que entregan mayor productivi-

dad a P. pastoris no fueron consideradas.

Se logro realizar el modelo metabolico de mayor extension conocido hasta la fecha para

Pichia pastoris, abriendo camino para que futuros investigadores realicen mayores analisis y des-

arrollos al modelo. Con respecto a la hipotesis de trabajo no fue posible rechazarla ni confirmarla,

por lo que se deberan realizar mayores estudios al respecto. Cabe senalar que el estudio del me-

tabolismo de organismos es una tarea compleja y que requiere tomar en consideracion no solo la

estructura de la red metabolica, sino tambien la regulacion genica, consideraciones termodinami-

cas, mecanismos de utilizacion de energıa, modulacion enzimatica, entre muchos otros factores.

Se concluye entonces que el trabajo realizado permitio el desarrollo de modelos me-

tabolicos que hicieron posible corroborar resultados empıricos y que son la base para continuar

con la busqueda en el metabolismo de diferencias en la productividad de ambas levaduras.

59

5.3. Aporte al Campo o a la Disciplina

Entre los aportes al campo o disciplina es posible senalar el haber realizado el modelo

estequiometrico de Pichia pastoris de mayor extension conocido hasta la fecha, y que incluye al

metabolismo central, la sıntesis de aminoacidos, el ciclo de los acidos tricarboxılicos, la vıa de las

pentosas fosfatos y el metabolismo del metanol, principalmente.

Este modelo permitio verificar caracterısticas metabolicas de este organismo previamen-

te descritas en la literatura.

Ademas, este corresponde al primer estudio comparativo entre ambas especies a partir

de los modos elementales de sus modelos estequiometricos, entregando mayores antecedentes a la

comparacion de ambas especies, en particular en sus capacidades metabolicas.

Como desafıo futuro se sugiere completar el modelo estequiometrico de P. pastoris hasta

lograr una mejor representacion de su metabolismo, agregar restricciones de regulacion genica y

de incluir mas tipos de levaduras en el estudio.

Una vez hecho publico el genoma de P. pastoris sera de gran interes obtener un modelo

estacionario a partir de la anotacion automatica, posterior curacion manual y asignacion de vıas

metabolicas con softwares especializados (Pathways por ejemplo). Este modelo podra ser com-

parado con el modelo presentado en esta memoria y estudiar la validez de las vıas por medio de

estudios de expresion genica (arrays) y de regulacion.

Este ultimo punto es de especial interes debido al fuerte promotor AOX1, el cual se men-

ciono como ventaja al comparar S. cerevisiae de P. pastoris en su funcion de huespedes.

60

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68

Apendice A

Modelos Metabolicos

A.1. Modelo Estequiometrico de Saccharomyces cerevisiae

El Modelo Estequiometrico de Saccharomyces cerevisiae mostrado a continuacion fue

desarrollado por el Dr. Gonzalez y modificado por la autora de la presente memoria [35].

A.1.1. Vıas Metabolicas del Modelo de Saccharomyces cerevisiae

Glicolisis y Gluconeogenesis

(GLUC::G6P) GLUC+ATP =⇒ GLUC 6P+ADP (A.1)

(G6P::F6P) GLUC 6P ⇐⇒ FRUC 6P (A.2)

(F6P::GAP) FRUC 6P+ATP =⇒ 2GAP+ADP (A.3)

(GAP::F6P) GAP+DHAP =⇒ FRUC 6P (A.4)

(F6P::DHAP) FRUC 6P =⇒ DHAP (A.5)

(DHAP::GAP) DHAP ⇐⇒ GAP (A.6)

(GAP::G3P) GAP+NAD+ADP ⇐⇒ G3P+ATP+NADH (A.7)

(PEP::PYR) PEP+ADP =⇒ PIR+ATP (A.8)

(OxA::PEP) OAC+ATP =⇒ PEP+ADP+CO2 (A.9)

69

Ciclo de Acidos Tricarboxılicos

(Pyr::AcCoAmit) PIR+NAD =⇒ AcCoAmit +NADH+CO2 (A.10)

(AcCoAmit::ICit) AcCoAmit +OAC =⇒ ISOCIT+CoA (A.11)

(ICit::alKG) ISOCIT+NAD =⇒ AKG+NADH+CO2 (A.12)

(ICit::alKGb) ISOCIT+NADP =⇒ AKG+NADPH+CO2 (A.13)

(alKG::SuccCoA) AKG+CoA+NAD =⇒ SUCCoA+NADH+CO2 (A.14)

(SuccCoA::Succ) SUCCoA+ADP =⇒ SUC+ATP+CoA (A.15)

(Succ::Fum) SUC+FAD =⇒ FUM+FADH2 (A.16)

(Fum::Mal) FUM+H2O =⇒ MAL (A.17)

(Mal::OxA) MAL+NAD =⇒ OAC+NADH (A.18)

Vıa de las Pentosas Fosfato

(G6P::RI5P) GLUC 6P+2NADP =⇒ RIBU 5P+2NADPH+CO2 (A.19)

(RI5P::R5P) RIBU 5P ⇐⇒ RIB 5P (A.20)

(RI5P::X5P) RIBU 5P ⇐⇒ XIL 5P (A.21)

(S7P::F6P) SED 7P+GAP ⇐⇒ FRUC 6P+E4P (A.22)

(X5P::F6P) XIL 5P+E4P ⇐⇒ FRUC 6P+GAP (A.23)

Reacciones Anapleroticas

Ciclo del Glioxilato

(ICit::Succ) ISOCIT =⇒ SUC+GLX (A.24)

(AcCoAmit::Mal) AcCoAmit +GLX =⇒ MAL (A.25)

(Mal::Pyr) MAL =⇒ PIR+CO2 +NADPH (A.26)

(Mal::Pyr) MAL =⇒ PIR+CO2 +NADH (A.27)

Carboxilacion de piruvato, enzima piruvato quinasa

(Pyr::OxA) PIR+ATP+CO2 =⇒ OAC+ADP (A.28)

70

Sıntesis de AcCoA en el citoplasma, enzimas citrato liasa y malato deshidrogenasa

(Cit::AcCoAcit) CIT+CoA+NADH+NADP+ATP =⇒ AcCoAcit +2NADPH+CO2 (A.29)

Vıas Fermentativas

(Pyr::Adh) PIR =⇒ ACET+CO2 (A.30)

(Adh::Eth) ACET+NADH ⇐⇒ ETOH+NAD (A.31)

(Adh::Ac) ACET+NAD ⇐⇒ AC+NADH (A.32)

(Ac::AcCoAcit) AC+2ATP+CoA =⇒ AcCoAcit +2ADP (A.33)

(DHAP::GAP) GAP ⇐⇒ DHAP (A.34)

(Glyc::DHAP) GLIC+NAD =⇒ DHAP+NADH (A.35)

(A.36)

Fosforilacion Oxidativa: P/O=1.09

(Razon P/O: Estequiometrıa de la fosforilacion oxidativa.)

(NADH::POADP) 2NADH+O2 +2PO ADP =⇒ 2NAD+2PO ATP (A.37)

(FADH2::POATP) 2FADH2 +O2 +2PO ADP =⇒ 2FAD+2PO ATP (A.38)

Transporte Intracelular

(AcCoAmit Synth) AcCoAcit =⇒ AcCoAmit (A.39)

71

Sıntesis de Aminoacidos

(Glu synth) AKG+NH4 +NADPH ⇐⇒ GLUT+NADP (A.40)

(Gln Synth) GLUT+NH4 +ATP =⇒ GLUM+ADP (A.41)

(Pro Synth) GLUT+ATP+2NADPH =⇒ PRO+ADP+2NADP (A.42)

(CARP Synth) NH4 +ATP+CO2 =⇒ CARP+ADP (A.43)

(Arg Synth) 2GLUT+AcCoAcit +4ATP+ =⇒ ARG+CoA+AKG+AC+ (A.44)

NADPH+CARP+ASP 4ADP+FUM+NADP

(Lys Synth) 2GLUT+AcCoAcit +3ATP+ =⇒ LIS+CoA+AKG+CO2 + (A.45)

2NADPH+2NAD 3ADP+2NADP+2NADH

(Ser Synth) G3P+GLUT+NAD =⇒ SER+AKG+NADH (A.46)

(Gly Synth) SER+THF ⇐⇒ GLI+METHF (A.47)

(Cys Synth) SER+AcCoAcit +4NADPH+ =⇒ CIS+AC+CoA+4NADP+ (A.48)

ATP 4ADP

(Asp synth) OAC+GLUT ⇐⇒ ASP+AKG (A.49)

(Asn Synth 1) ASP+NH4 +2ATP =⇒ ASN+2ADP (A.50)

(HSer Synth) ASP+ATP+2NADPH =⇒ HOM+ADP+2NADP (A.51)

(Thr Synth) HOM+ATP =⇒ THR+ADP (A.52)

(Met Synth) HOM+SUCCoA+CIS+ =⇒ MET+CoA+SUC+PIR+ (A.53)

MYTHF+ATP NH4 +ADP+THF

(Ile Synth) THR+PIR+NADPH+GLUT =⇒ ILEU+NH4 +NADP+ (A.54)

CO2 +AKG

(Ala Synth) PIR+GLUT ⇐⇒ ALA+AKG (A.55)

(AKI Synth) 2PIR+NADPH =⇒ AKI+NADP+CO2 (A.56)

(Val Synth) AKI+GLUT ⇐⇒ VAL+AKG (A.57)

(Leu Synth) AKI+AcCoAcit +GLUT+ =⇒ LEU+AKG+CoA+ (A.58)

NAD+ATP CO2 +NADH+ADP

(Chor Synth) PEP+E4P+NADPH+ATP =⇒ CHO+ADP+NADP (A.59)

72

(Phe Synth) CHO+GLUT =⇒ PHEN+AKG+CO2 (A.60)

(Tyr Synth) CHO+GLUT+NAD =⇒ TIR+AKG+CO2 (A.61)

(Trp Synth) CHO+GLUT+PRPP+SER =⇒ TRIP+CO2 +GAP+GLUT+PIR (A.62)

(PRPP Synth) RIB 5P+2ATP =⇒ PRPP+2ADP (A.63)

(His Synth) PRPP+3ATP+NH4 +GLUM+ =⇒ HIS+3ADP+2NADH+ (A.64)

NAD+2NADPH+CO2 NADP+AKG

Sıntesis de Nucleotidos

(IMP Synth) PRPP+2GLUM+GLI+ADP+ =⇒ IMP+4ADP+2GLUT+ (A.65)

ASP+2FTHF+CO2 2THF+FUM

(AMP Synth) IMP+ASP+ATP =⇒ AMP+ADP+FUM (A.66)

(GMP Synth) IMP+NAD+2ATP+GLUM =⇒ GMP+2ADP+GLUT+NADH (A.67)

(UMP Synth) GLUM+PRPPP+2ATP+ASP+NAD =⇒ UMP+2ADP+GLUT+NADH (A.68)

(UTP Synth) UMP+2ATP ⇐⇒ UTP+2ADP (A.69)

(CTP Synth) UTP+GLUM+ATP =⇒ CTP+ADP+GLUT (A.70)

(CMP Synth) CTP+2ADP ⇐⇒ CMP+2ATP (A.71)

Sıntesis de Compuestos de 1-carbono

(FTHF Synth) THF+NADH+ATP+CO2 ⇐⇒ FTHF+NAD+ADP (A.72)

(MYTHF Synth) THF+3NADH+CO2 ⇐⇒ MYTHF+3NAD (A.73)

(METHF Synth) THF+2NADH+CO2 ⇐⇒ METHF+2NAD (A.74)

Consumo de ATP para Transporte y Mantencion

(ADP Synth) ATP =⇒ ADP (A.75)

73

Sıntesis de Proteınas no Recombinantes: 3.2 mol ATPmol aminoacido de proteına

(PROTSynth) 0,1246ALA+0,0437ARG+0,0277ASN+0,0806ASP+0,0091CYS+

0,0285GLUM+0,082GLUT+0,0787GLY+0,0179HIS+0,0524ILEU+

0,0802LEU+0,0776LYS+0,0138MET+0,0364PHEN+0,0448PRO+

0,0502SER+0,0518THR+0,0076TRYP+0,0277TYR+0,0719VAL+3,2ATP =⇒ PROT (A.76)

Sıntesis de Proteınas Recombinantes (Superoxido Dismutasa humana): 4.3 mol ATPmol aminoacido de proteına

(SODSynth) 0,065ALA+0,026ARG+0,046ASN+0,072ASP+0,026CYS+0,02GLUM+

0,065GLUT+0,163GLY+0,052HIS+0,059ILEU+0,059LEU+0,072LYS+

0,026PHEN+0,033PRO+0,065SER+0,052THR+0,0065TRYP+0,092VAL+4,3ATP =⇒ SOD (A.77)

Sıntesis de ARN: 2.4 mol ATPmol nucleotido de ARN

(RNASynth) 0,233AMP+0,233GMP+0,306UMP+0,2283CMP+2,4ATP =⇒ ARN (A.78)

Sıntesis de Lıpidos

(LipSynth) 21,6AcCoAcit +0,404GAP+27,2NADPH+

1,02O2 +1,02NADH+0,278SER =⇒ LIP+3,48CO2 (A.79)

Sıntesis de Carbohidratos: Poliglucosa (1 mol ATPmol GLUC 6P de CARB )

(CARBSynth) GLUC 6P+ATP =⇒ CARB (A.80)

74

Figura A.1: Modelo Metabolico del Metabolismo Central de Saccharomyces cerevisiae

75

A.2. Modelo Estequiometrico de Pichia pastoris

El Modelo Estequiometrico de Pichia pastoris mostrado a continuacion se baso en el

modelo de S. cerevisiae desarrollado por el Dr. Gonzalez [35] [37] [76] [42].

A.2.1. Vıas Metabolicas del Modelo de Pichia pastoris

Glicolisis y Gluconeogenesis

(GLUC::G6P) GLUC+ATP =⇒ GLUC 6P+ADP (A.81)

(G6P::F6P) GLUC 6P ⇐⇒ FRUC 6P (A.82)

(F6P::GAP) FRUC 6P+ATP =⇒ 2GAP+ADP (A.83)

(GAP::F6P) 2GAP =⇒ FRUC 6P (A.84)

(F6P::DHAP) FRUC 6P =⇒ DHAP (A.85)

(DHAP::GAP) DHAP ⇐⇒ GAP (A.86)

(GAP::G3P) GAP+NAD+ADP ⇐⇒ G3P+ATP+NADH (A.87)

(PEP::PYR) PEP+ADP =⇒ PIR+ATP (A.88)

(Mal::Pyr) MAL =⇒ PIR (A.89)

Ciclo de Acidos Tricarboxılicos

(Pyr::AcCoAmit) PIR+NAD =⇒ AcCoAmit +NADH+CO2 (A.90)

(AcCoAmit::ICit) AcCoAmit +OAC =⇒ ISOCIT+CoA (A.91)

(ICit::alKG) ISOCIT+NAD =⇒ AKG+NADH+CO2 (A.92)

(ICit::alKGb) ISOCIT+NADP =⇒ AKG+NADPH+CO2 (A.93)

(alKG::SuccCoA) AKG+CoA+NAD =⇒ SUCCoA+NADH+CO2 (A.94)

(SuccCoA::Succ) SUCCoA+ADP =⇒ SUC+ATP+CoA (A.95)

(Succ::Fum) SUC+FAD ⇐⇒ FUM+FADH2 (A.96)

(Fum::Mal) FUM+H2O ⇐⇒ MAL (A.97)

(Mal::OxA) MAL+NAD =⇒ OAC+NADH (A.98)

76

Vıa de las Pentosas Fosfato

(G6P::RI5P) GLUC 6P+2NADP =⇒ RIBU 5P+2NADPH+CO2 (A.99)

(RI5P::R5P) RIBU 5P ⇐⇒ RIB 5P (A.100)

(RI5P::X5P) RIBU 5P ⇐⇒ XIL 5P (A.101)

(S7P::F6P) SED 7P+GAP ⇐⇒ FRUC 6P+E4P (A.102)

(X5P::F6P) XIL 5P+E4P ⇐⇒ FRUC 6P+GAP (A.103)

Metabolismo de Metanol

(METANOL::FORMper) METANOL+O2 =⇒ FORMper +H2O2 (A.104)

(FORMper::FORM) FORMper =⇒ FORM (A.105)

(FORM::FORMOH) FORM+14

O2 +12

H2O =⇒ FORMOH (A.106)

(FORMOH::CO2) FORMOH+2NAD =⇒ CO2 +2NADH (A.107)

(FORMper::DHAper) FORMper +XIL 5P =⇒ DHAper +GAPper (A.108)

(GAPper::GAP) GAPper =⇒ GAP (A.109)

(DHAper::DHA) DHAper =⇒ DHA (A.110)

(DHA::DHAP) DHA+ATP =⇒ DHAP+ADP (A.111)

Reacciones Anapleroticas

Carboxilacion de piruvato, enzima piruvato quinasa

(Pyr::OxA) PIR+ATP+CO2 =⇒ OAC+ADP (A.112)

Sıntesis de AcCoA en el citoplasma, enzimas citrato liasa y malato deshidrogenasa

(Cit::AcCoAcit) CIT+CoA+NADH+NADP+ATP =⇒ AcCoAcit +2NADPH+CO2(A.113)

77

Vıas Fermentativas

(Pyr::Adh) PIR =⇒ ACET+CO2 (A.114)

(Adh::Eth) ACET+NADH ⇐⇒ ETOH+NAD (A.115)

(Adh::Ac) ACET+NAD ⇐⇒ AC+NADH (A.116)

(Ac::AcCoAcit) AC+2ATP+CoA =⇒ AcCoAcit +2ADP (A.117)

(DHAP::GAP) GAP ⇐⇒ DHAP (A.118)

(Glyc::DHAP) GLIC+NAD =⇒ DHAP+NADH (A.119)

(A.120)

Fosforilacion Oxidativa: P/O=1.09

(Razon P/O: Estequiometrıa de la fosforilacion oxidativa.)

(NADH::POADP) 2NADH+O2 +2PO ADP =⇒ 2NAD+2PO ATP (A.121)

(FADH2::POATP) 2FADH2 +O2 +2PO ADP =⇒ 2FAD+2PO ATP (A.122)

Sıntesis de Aminoacidos

(Glu synth) AKG+NH4 +NADPH ⇐⇒ GLUT+NADP (A.123)

(Gln Synth) GLUT+NH4 +ATP =⇒ GLUM+ADP (A.124)

(Pro Synth) GLUT+ATP+2NADPH =⇒ PRO+ADP+2NADP (A.125)

(CARP Synth) NH4 +ATP+CO2 =⇒ CARP+ADP (A.126)

(Arg Synth) 2GLUT+AcCoAcit +4ATP+ =⇒ ARG+CoA+AKG+AC+ (A.127)

NADPH+CARP+ASP 4ADP+FUM+NADP

(Lys Synth) 2GLUT+AcCoAcit +3ATP+ =⇒ LIS+CoA+AKG+CO2 + (A.128)

2NADPH+2NAD 3ADP+2NADP+2NADH

(Ser Synth) G3P+GLUT+NAD =⇒ SER+AKG+NADH (A.129)

78

(Gly Synth) SER+THF ⇐⇒ GLI+METHF (A.130)

(Cys Synth) SER+AcCoAcit +4NADPH+ =⇒ CIS+AC+CoA+4NADP+ (A.131)

ATP 4ADP

(Asp synth) OAC+GLUT ⇐⇒ ASP+AKG (A.132)

(Asn Synth 1) ASP+NH4 +2ATP =⇒ ASN+2ADP (A.133)

(HSer Synth) ASP+ATP+2NADPH =⇒ HOM+ADP+2NADP (A.134)

(Thr Synth) HOM+ATP =⇒ THR+ADP (A.135)

(Met Synth) HOM+SUCCoA+CIS+ =⇒ MET+CoA+SUC+PIR+ (A.136)

MYTHF+ATP NH4 +ADP+THF

(Ile Synth) THR+PIR+NADPH+GLUT =⇒ ILEU+NH4 +NADP+ (A.137)

CO2 +AKG

(Ala Synth) PIR+GLUT ⇐⇒ ALA+AKG (A.138)

(AKI Synth) 2PIR+NADPH =⇒ AKI+NADP+CO2 (A.139)

(Val Synth) AKI+GLUT ⇐⇒ VAL+AKG (A.140)

(Leu Synth) AKI+AcCoAcit +GLUT+ =⇒ LEU+AKG+CoA+ (A.141)

NAD+ATP CO2 +NADH+ADP

(Chor Synth) PEP+E4P+NADPH+ATP =⇒ CHO+ADP+NADP (A.142)

(Phe Synth) CHO+GLUT =⇒ PHEN+AKG+CO2 (A.143)

(Tyr Synth) CHO+GLUT+NAD =⇒ TIR+AKG+CO2 (A.144)

(Trp Synth) CHO+GLUT+PRPP+SER =⇒ TRIP+CO2 +GAP+GLUT+PIR (A.145)

(PRPP Synth) RIB 5P+2ATP =⇒ PRPP+2ADP (A.146)

(His Synth) PRPP+3ATP+NH4 +GLUM+ =⇒ HIS+3ADP+2NADH+ (A.147)

NAD+2NADPH+CO2 NADP+AKG

79

Sıntesis de Nucleotidos

(IMP Synth) PRPP+2GLUM+GLI+ADP+ =⇒ IMP+4ADP+2GLUT+ (A.148)

ASP+2FTHF+CO2 2THF+FUM

(AMP Synth) IMP+ASP+ATP =⇒ AMP+ADP+FUM (A.149)

(GMP Synth) IMP+NAD+2ATP+GLUM =⇒ GMP+2ADP+GLUT+NADH (A.150)

(UMP Synth) GLUM+PRPPP+2ATP+ASP+NAD =⇒ UMP+2ADP+GLUT+NADH (A.151)

(UTP Synth) UMP+2ATP ⇐⇒ UTP+2ADP (A.152)

(CTP Synth) UTP+GLUM+ATP =⇒ CTP+ADP+GLUT (A.153)

(CMP Synth) CTP+2ADP ⇐⇒ CMP+2ATP (A.154)

Sıntesis de Compuestos de 1-carbono

(FTHF Synth) THF+NADH+ATP+CO2 ⇐⇒ FTHF+NAD+ADP (A.155)

(MYTHF Synth) THF+3NADH+CO2 ⇐⇒ MYTHF+3NAD (A.156)

(METHF Synth) THF+2NADH+CO2 ⇐⇒ METHF+2NAD (A.157)

Consumo de ATP para Transporte y Mantencion

(ADP Synth) ATP =⇒ ADP (A.158)

Sıntesis de Proteınas no Recombinantes: 3.2 mol ATPmol aminoacido de proteına

(PROTSynth) 0,1246ALA+0,0437ARG+0,0277ASN+0,0806ASP+0,0091CYS+

0,0285GLUM+0,082GLUT+0,0787GLY+0,0179HIS+0,0524ILEU+

0,0802LEU+0,0776LYS+0,0138MET+0,0364PHEN+0,0448PRO+

0,0502SER+0,0518THR+0,0076TRYP+0,0277TYR+0,0719VAL+3,2ATP =⇒ PROT (A.159)

80

Sıntesis de Proteınas Recombinantes (Superoxido Dismutasa humana): 4.3 mol ATPmol aminoacido de proteına

(SODSynth) 0,065ALA+0,026ARG+0,046ASN+0,072ASP+0,026CYS+0,02GLUM+

0,065GLUT+0,163GLY+0,052HIS+0,059ILEU+0,059LEU+0,072LYS+

0,026PHEN+0,033PRO+0,065SER+0,052THR+0,0065TRYP+0,092VAL+4,3ATP =⇒ SOD(A.160)

Sıntesis de ARN: 2.4 mol ATPmol nucleotido de ARN

(RNASynth) 0,233AMP+0,233GMP+0,306UMP+0,2283CMP+2,4ATP =⇒ ARN (A.161)

Sıntesis de Lıpidos

(LipSynth) 21,6AcCoAcit +0,404GAP+27,2NADPH+

1,02O2 +1,02NADH+0,278SER =⇒ LIP+3,48CO2 (A.162)

Sıntesis de Carbohidratos: Poliglucosa (1 mol ATPmol GLUC 6P de CARB )

(CARBSynth) GLUC 6P+ATP =⇒ CARB (A.163)

Transporte Intracelular

(AcCoAmit Synth) AcCoAcit =⇒ AcCoAmit (A.164)

81

Apendice B

Nomenclatura y Abreviaciones

B.1. General

Y ′X/S = gramos de producto/litrogramos de sustrato/litro donde sustrato = {glucosa, glicerol, metanol} y producto = {biomasa, SOD}

YX/S = moles de productomoles de sustrato

P+ = Organismo produciendo proteına heterologa

P− = Organismo no produciendo proteına heterologa

B.2. Metabolitos

1. aa Aminoacidos2. AC Acetato3. AcCoAcit Acetil coenzima A

citoplasmatica4. AcCoAmit Acetil coenzima A

mitocondrial5. ACET Acetaldehıdo6. ADP Adenosina-5’-difosfato7. AKG α-cetoglutarato8. AKI α-cetoisovalerato9. ALA Alanina

10. AMP Adenosina-5’-monofosfato11. ARG Arginina12. ASN Asparagina

13. ASP Aspartato14. ATP Adenosina-5’-trifosfato15. CARB Carbohidratos16. CARP Carbamil fosfato17. CHO Corismato18. CMP Citidina-5’-monofosfato19. CO2 Diodido carbono intracelular20. COE

2 Dioxido carbono extracelular21. CoA Coenzima A22. CTP Citidina-5’-trifosfato23. CYS Cisteına24. DHA Glicerona25. DHAper Glicerona peroxisomal26. DHAP Dihidroxiacetona fosfato

82

27. E4P Eritrosa-4-fosfato28. ETOH Etanol29. FAD Flavin adenin dinucleotido30. FADH2 Flavin adenin dinucleotido

reducido31. FORM Formato32. FORMper Formato peroxisomal33. FORMOH Hidroxido de formato34. FTHF Formil-tetrahidrofolato35. FRUC 6P Fructosa-6-fosfato36. FUM Fumarato37. G3P 3-Fosfoglicerato38. GAP Gliceraldehıdo-3-fosfato39. GAPper Gliceraldehıdo-3-fosfato

peroxisomal40. GLUC 6P Glucosa-6-fosfato41. GLUC Glucosa42. GLUM Glutamina43. GLUT Glutamato44. GLY Glicina45. GLIC Glicerol46. GMP Guanosina-5’-monofosfato47. HIS Histidina48. HOM Homoserina49. ILEU Isoleucina50. IMP Inosinae-5’-monofosfato51. ISOCIT Isocitrato52. LEU Leucina53. LIPID Lıpidos54. LYS Lisina55. MAL Malato56. MET Metionina57. METANOL Metanol58. METHF Metilen tetrahidrofolato59. MYTHF Metil tetrahidrofolato60. NAD Nicotinamida adenin

dinucleotido

61. NADH Nicotinamida adenindinucleotido reducida

62. NADP Nicotinamida adenindinucleotido fosfato

63. NADPH Nicotinamida adenindinucleotido fosfato reducida

64. NHE4 Amonio intracelular

65. NH4 Amonio extracelular66. nu Nucleotidos67. O2 Oxıgeno intracelular68. OE

2 Oxıgeno extracelular69. OAC Oxaloacetato70. PEP Fosfoenolpiruvato71. PHEN Fenilalanina72. PRO Prolina73. PROT Proteına no recombinante74. PRPP 5-fosforibosil-1-pirofosfato75. PIR Piruvato76. RIB 5P Ribosa-5-fosfato77. RIBU 5P Ribulosa-5-fosfato78. ARN Acido ribonucleico79. SOD Proteına recombinante

Superoxido Dismutasahumana

80. SED 7P Sedoheptulosa-7-fosfato81. SER Serina82. SUC Succinato83. SUCCoA Succinil coenzima A84. THF Tetrahidrofolato85. THR Treonina86. TRYP Triptofano87. TYR Tirosina88. UMP Uridina-5’-monofosfato89. UTP Uridina-5’-trifosfato90. VAL Valina91. XIL 5P Xilulosa-5-fosfato

83

B.3. Flujos

v1 Velocidad de consumo de GLUCOSA para la sıntesis de GLUC 6P.

v2 Velocidad de consumo de GLUC 6P para la sıntesis de FRUC 6P.

v3 Velocidad de consumo de FRUC 6P para la sıntesis de GAP.

v4 Velocidad de consumo de GAP y DHAP para la sıntesis de FRUC 6P.

v5 Velocidad de interconversion entre GAP y 3PG.

v6 Velocidad de interconversion entre 3PG y PEP.

v7 Velocidad de consumo de PEP para la sıntesis de PIR.

v8 Velocidad de consumo de OAC para la sıntesis de PEP.

v9 Velocidad de consumo de PIR para la sıntesis de AcCoAmit.

v10 Velocidad de consumo de AcCoAmit y OAC para la sıntesis de ISOCIT.

v11 Velocidad de consumo de ICOCIT para la sıntesis de AKG y NADH.

v12 Velocidad de consumo de ISOCIT para la sıntesis de AKG y NADPH.

v13 Velocidad de consumo de AKG para la sıntesis de SUCCoA.

v14 Velocidad de consumo de SUCCoA para la sıntesis de SUC.

v15 Velocidad de consumo de SUC para la sıntesis de FUM.

v16 Velocidad de consumo de FUM para la sıntesis de MAL.

v17 Velocidad de consumo de MAL para la sıntesis de OAC.

v18 Velocidad de consumo de GLUC 6P para la sıntesis de RIBU 5P.

v19 Velocidad de consumo de RIBU 5P para la sıntesis de RIB 5P.

v20 Velocidad de consumo de RIBU 5P para la sıntesis de XIL 5P.

v21 Velocidad de consumo de RIB 5P y XIL 5P para la sıntesis de SED 7P y GAP.

v22 Velocidad de consumo de GAP y SED 7P para la sıntesis de E4P y FRUC 6P.

v23 Velocidad de consumo de GAP y XIL 5P para la sıntesis de FRUC 6P y GAP.

v24 Velocidad de consumo de ISOCIT y AcCoAcit para la sıntesis de MAL.

v25 Velocidad de consumo de PIR para la sıntesis de OAC.

v26 Velocidad de consumo de PIR para la sıntesis de ACET.

v27 Velocidad de consumo de ACET para la sıntesis de ETOH.

84

v28 Velocidad de consumo de ACET para la sıntesis de AC.

v29 Velocidad de consumo de MAL para la sıntesis de PIR.

v30 Velocidad de consumo de AC para la sıntesis de AcCoAcit.

v31 Velocidad de interconversion entre DHAP y GAP.

v69 Velocidad de consumo de ATP para la sıntesis de ADP.

v70 Velocidad de sıntesis de PROT.

v71 Velocidad de sıntesis de SOD.

v72 Velocidad de sıntesis de ARN.

v73 Velocidad de sıntesis de LIP.

v74 Velocidad de consumo de GLUC 6P para la sıntesis de CARB.

v75 Velocidad de interconversion entre AcCoAmit y AcCoAcit.

v76 Velocidad de transporte de CO2 hacia el exterior (COE2 ).

v77 Velocidad de transporte de O2 desde el exterior (OE2 ).

v78 Velocidad de transporte de NH4 desde el exterior (NHE4 ).

v79 Velocidad de consumo de FRUC 6P para la sıntesis de DHAP.

v80 Velocidad de transporte de FORM hacia el exterior del peroxisoma.

v81 Velocidad de consumo de FORM para la sıntesis de FORMOH.

v82 Velocidad de consumo de FORMOH para la sıntesis de CO2.

v83 Velocidad de consumo de XIL 5P para la sıntesis de DHAper y GAPper.

v84 Velocidad de sıntesis de DHAper y GAPper.

v85 Velocidad de transporte de DHA hacia el exterior del peroxisoma.

v86 Velocidad de transporte de GAP hacia el exterior del peroxisoma.

v87 Velocidad de consumo de DHA para la sıntesis de DHAP.

v88 Velocidad de consumo de GLIC para la sıntesis de DHAP.

v89 Velocidad de consumo de METANOL para la sıntesis de FORMper.

v90 Velocidad de consumo de ISOCIT para la sıntesis de SUC.

vAcCoAcit Velocidad de consumo de AcCoAcit para la sıntesis de aa y LIP.

v70−aaAcCoA Velocidad de consumo de aa obtenidos desde AcCoAcit para la sıntesis de PROT.

v71−aaAcCoA Velocidad de consumo de aa obtenidos desde AcCoAcit para la sıntesis de SOD.

85

v73−AcCoA Velocidad de consumo de AcCoAcit para la sıntesis de LIP.

vE4P Velocidad de consumo de E4P para la sıntesis de aa.

v70−aaE4P Velocidad de consumo de aa obtenidos desde E4P para la sıntesis de PROT.

v71−aaE4P Velocidad de consumo de aa obtenidos desde E4P para la sıntesis de SOD.

vOAC Velocidad de consumo de OAC para la sıntesis de aa y nu.

v70−aaOAC Velocidad de consumo de aa obtenidos desde OAC para la sıntesis de PROT.

v71−aaOAC Velocidad de consumo de aa obtenidos desde OAC para la sıntesis de SOD.

v72−nuOAC Velocidad de consumo de nu obtenidos desde OAC para la sıntesis de ARN.

v70−aaRIB5P Velocidad de consumo de aa obtenidos desde RIB 5P para la sıntesis de PROT.

v71−aaRIB5P Velocidad de consumo de aa obtenidos desde RIB 5P para la sıntesis de SOD.

v72−nuRIB5P Velocidad de consumo de nu obtenidos desde RIB 5P para la sıntesis de ARN.

v73−GAP Velocidad de consumo de GAP para la sıntesis de LIP.

vG3P Velocidad de consumo de G3P para la sıntesis de aa y nu.

v70−aa3PG Velocidad de consumo de aa obtenidos desde 3PG para la sıntesis de PROT.

v71−aa3PG Velocidad de consumo de aa obtenidos desde 3PG para la sıntesis de SOD.

v72−nu3PG Velocidad de consumo de nu obtenidos desde 3PG para la sıntesis de ARN.

vPEP Velocidad de consumo de PEP para la sıntesis de aa.

v70−aaPEP Velocidad de consumo de aa obtenidos desde PEP para la sıntesis de POT.

v71−aaPEP Velocidad de consumo de aa obtenidos desde PEP para la sıntesis de SOD.

vPIR Velocidad de consumo de PIR para la sıntesis de aa.

v70−aaPIR Velocidad de consumo de aa obtenidos desde PIR para la sıntesis de PROT.

v71−aaPIR Velocidad de consumo de aa obtenidos desde PIR para la sıntesis de SOD.

vAKG Velocidad de consumo de AKG para la sıntesis de aa.

v70−aaAKG Velocidad de consumo de aa obtenidos desde AKG para la sıntesis de PROT.

v71−aaAKG Velocidad de consumo de aa obtenidos desde AKG para la sıntesis de SOD.

86

Apendice C

Material Suplementario

C.1. Algoritmo Calculo Modos Elementales

A continuacion se muestra el algoritmo para el calculo de modo elementales desarrollado

inicialmente por Schuster y Hilgetag en el ano 1994, luego por Pfeiffer en el ano 1999 y completado

finalmente por Schuster en el ano 2000 [72] [62].

C.1.1. Descomposicion de Distribuciones de Flujo

Se considera una red metabolica con m modos elementales y n reacciones. Los modos

elementales se representan por vectores E1, E2, ... Em, cada uno de largo n. Ası, una distribucion

de flujos en este sistema se representa por un vector v de largo n. Una descomposicion de tal

distribucion de flujos en un conjunto de modos elementales se define por un vector w de largo m

tal que:

v =m

∑j=1

w jE j (C.1)

Dado que los elementos de E j son adimensionales, aquellos de w tendran dimensiones

de flujo, llamandolos flujos de modos elementales.

87

Si todas las reacciones que componen un modo elemental dado, E j, son reversibles,

entonces tal modo elemental es reversible, y su flujo w j puede ser positivo o negativo. Si al menos

una reaccion de E j es irreversible, el modo elemental es un modo irreversible, y w j sera positivo:

w j ≥ 0 si E j es irreversible (C.2)

En general, hay mas modos elementales que reacciones en un sistema, y las condiciones

(C.1) y (C.2) no definen una unica solucion, sino que un espacio convexo continuo de posibles

soluciones.

Ası, se introduce una tercera condicion restringiendo el sistema a una unica solucion;

m

∑j=1

w2j es mınimo (C.3)

En conjunto, las relaciones (C.1), (C.2) y (C.3) definen un problema de optimizacion no

lineal.

Los modos elementales son un grupo de factores de escalamiento, y la ecuacion no-lineal

(C.3) hace a la solucion dependiente de la regla utilizada para el escalamiento de modos elementa-

les.

C.1.2. Implementacion

La implementacion utilizada para resolver un problema de programacion cuadratico se

basa en el algoritmo tradicional de “conjunto activo”, el que usa un proceso iterativo. En cada itera-

cion se escoge un conjunto de restricciones (inecuaciones) y se fijan. Se busca el correcto conjunto

de restricciones activas.

88

Los principales pasos del algoritmo se describen a continuacion. Una descripcion y de-

mostracion matematica detallada del algoritmo de “conjunto activo” se pueden encontrar en [30].

1. El algoritmo se inicializa con una solucion factible, es decir, un vector w(0) que cumpla

con las restricciones (C.1) y (C.2) pero no es, en general, la solucion optima. Este paso

es equivalente a un problema de programacion lineal, y se resuelve utilizando el metodo

Simplex. La solucion obtenida w(0) se utiliza como el primer punto factible en el paso 2,

junto con un conjunto activo vacıo.

2. En caso de ocurrir una solucion factible donde los valores de v no verifiquen estrictamente

la conservacion de flujo.

Esto se puede deber a aproximaciones en los calculos numericos de los valores de flujo. Para

balancear las distribuciones de flujo inconsistentes se siguien los siguientes pasos;

a) el espacio nulo de los sistemas se calcula por una diagonalizacion de la matriz de modos

elementales,

b) el espacio nulo se multiplica por el vector de flujos para verificar la conservacion de

flujos,

c) si los flujos no se encuentran estrictamente conservados, se selecciona un subconjunto de

flujos independientes y los flujos restantes se ajustan para re-establecer la conservacion

de flujo exacta.

Las operaciones previamente mencionadas permiten reducir la dimension del problema de

programacion. En los pasos siguientes, solo se mantiene el ultimo subconjunto de restric-

ciones independientes. Este proceso permite que no exista degeneracion en el conjunto de

restricciones impuestas, y tambien lleva a una reduccion en el tiempo de calculo.

3. El problema sujeto a restricciones se resuelve utilizando un cambio de origen a wk y aplican-

do el metodo de multiplicadores de Lagrange. Una correccion δ(k) se obtiene como resultado.

89

4. Si δ(k) = 0, los multiplicadores de Lagrande se calculan para las restricciones activas. Si

todo ellos son positivos, entonces w(k) es la solucion final y el algoritmo finaliza. Si no,

la restriccion correspondiente al menor multiplicador de Lagrange se elimina del conjunto

activo, y el algoritmo se repire desde el paso anterior.

5. Si δ(k) es factible, la siguiente iteracion comienza con w(k+1) = w(k) + δ(k) y el algoritmo

se repite desde el paso 3. Si no se realiza una busqueda en la direccion de δ(k) hasta que la

primera restriccion inactiva se vuelve activa. Las primeras restricciones inactivas se hacen

activas. Se anade la restriccion al conjunto activo, y se repite el algoritmo desde el paso 3.

C.2. Archivos de los Modelos Estequiometricos en formato SBML

Modelo Estequiometrico Pichia pastoris

El archivo del modelo de Pichia pastoris en formato SBML se encuentra disponible en:

http://www.dim.uchile.cl/∼ocominet/pp sbml

Modelo Estequiometrico Saccharomyces cerevisiae

El archivo del modelo de Saccharomyces cerevisiae en formato SBML se encuentra en:

http://www.dim.uchile.cl/∼ocominet/sc sbml

C.3. Representacion Modelos Metabolicos

Codigo GLE Red Metabolica Pichia pastoris

El archivo del codigo para representar graficamente el modelo de la red metabolica de

Pichia pastoris se encuentra disponible en:

http://www.dim.uchile.cl/∼ocominet/pp.gle

90

Codigo GLE Red Metabolica Saccharomyces cerevisiae

El archivo del codigo para representar graficamente el modelo de la red metabolica de

Saccharomyces cerevisiae se encuentra disponible en:

http://www.dim.uchile.cl/∼ocominet/sc.gle

C.4. Modos Elementales

Modos Elementales Modelo Estequiometrico S. cerevisiae y P. pastoris

El listado de los modos elementales de los modelos estequiometricos de Saccharomyces

cerevisiae y P. pastoris se encuentra disponible en:

http://www.dim.uchile.cl/∼ocominet/modos elementales.pdf

91

Indice alfabetico

AutoresAbbott, 38Bolouri, 37Brendes, 38Budden, 38Cardenas, 14Clarke, 29Cornish-Bowden, 14Doyle, 37Forster, 35Famili, 35Feist, 29Finney, 37Fu, 35Gancedo, 40Gilles, 38Gliede, 41Gonzalez, 15, 16, 36, 40, 41, 69, 76Hartner, 41Heijmen, 40Hilgetag, 37, 87Hucka, 37Jahic, 40, 41Jeffries, 38Kitano, 37Klamt, 38LaBella, 38Mavro, 29Nielsen, 35Nissen, 40Palsson, 29, 35

Pfeiffer, 37, 87Sauer, 41Sauro, 37Schuster, 29, 37, 87Serrano, 40Sola, 41, 56Struyf, 38Stryer, 40van Gulik, 40Walker, 40, 41Wilkinson, 38

Bases de DatosBioCasta, 12BioCyc, 12BioSilico, 12BRITE, 12BSD, 12GenBank, 11KEGG, 12Kiotho, 12LIGAND, 12Metacyc, 12Metagrowth, 12PathDB, 12UM-BBD, 12

biologıa de sistemas, 13blancos terapeuticos, 14

coeficientes estequiometricos, 28conjunto activo, 88Constrain Based Models, 13

92

distribuciones de flujo, 12

Enzimasα-amilasa pPAM, 22α-amilasa, 22alcohol deshidrogenasa, 19alcohol oxidasa, 25carboxilesterasa, 22DAH sintasa, 21dalcoquinasa, 22disulfuro isomerasa, 23fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, 19fosfogluconato deshidrogenasa, 20glicerol quinasa, 20glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, 20glucoamilasa, 22glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, 20Hidroxinitrilo liasa, 22monoamida oxidasa A, 22piruvato carboxilasa, 19piruvato descarboxilasa, 19piruvato deshidrogenasa, 19SOD manganeso humana, 26Superoxido Dismutasa humana, 15, 16, 25,

36lipasa de Rhizopus oryzae, 50penicilina G amidasa, 22

espacio solucion, 13estado estacionario, 12, 29estequiometrıa, 12

flujos metabolicos, 13

genoma, 34

Hormonasinsulina, 22

LenguagesLATEX, 38

XML, 37GLE, 38SBML, 15, 17, 35, 37

levadura, 19

MetodosStoichiometric Network Analysis, 29Analisis de Balances de Energıa (EBA), 13Analisis de Balances de Flujos (FBA), 13Analisis de Control Metabolico (MCA), 13Analisis de Flujos Metabolico (MFA), 13Analisis de Minimizacion de Ajustes Me-

tabolicos (MOMA), 13Analisis de Modos Elementales (EMA), 14Analisis de Planos de Fases de Fenotipos

(PhPA), 13Analisis de Robustez, 13Analisis de Vıas Extremas (EPA), 14Analisis de Vıas Metabolicas, 17Analisis de Vıas Metabolicas (MPA), 13Analisis Regulatorio de Balances de Flujos,

13Modelo Cibernetico, 13Teorıa Bioquımica de Sistemas (BST), 13

matriz estequiometrica, 28membrana interior de la mitocondria, 20Metabolitos

α-cetoglutarato, 196-fosfogluconato, 206-fosfogluconolactona, 20acetaldehıdo, 19acetato, 19AcetilCoA, 19ADP, 20aminoacidos, 20ATP, 18–20CO2, 19DAH fosfato, 20

93

DHA, 21dihidroxiacetona, 21etanol, 19FADH2, 19, 20formaldehıdo, 21fosfato inorganico, 20fructosa-6-fosfato , 21GAP, 21glicerol, 20glicerol desdedihidroacetona fosfato, 19glicerol-3-fosfato, 20glucosa, 19glucosa-6-fosfato, 20NAD, 18NADH, 19NADP, 18NADPH, 19, 20oxaloacetato, 19piruvato, 19ribulosa-5-fosfato, 20

metabolitos internos, 29Modelos

Modelo Pichia pastoris, 90Modelo Saccharomyces cerevisiae, 90Modelo Estequiometrico de Saccharomyces

cerevisiae, 69modelo metabolico, 10Modelo Metabolico Pichia pastoris, 34modelos metabolicos, 38

modo elemental, 30modos elementales, 88

OrganismosPichia pastoris, 41Escherichia coli, 14Hansenula polymorpha, 24, 25Kluyveromyces lactis, 24

Pichia pastoris, 11, 15, 17, 20, 22, 24–26,34, 35, 42, 44, 49, 51, 53, 55, 57, 58,60, 76, 90, 91

Rhizopus oryzae, 50Saccharomyces cerevisiae, 9, 10, 12, 16, 19–

22, 24–26, 35, 36, 39, 41, 44, 56, 60, 69,90, 91

Yarrowia lipolyctica, 24

Productosacidos grasos, 19alcohol azucares, 20ARN, 74, 81biomasa, 27, 51carbohidratos, 74, 81etanol, 19lıpidos, 74, 81nucleotidos, 80proteınas no recombinantes, 74, 80proteınas recombinantes, 74, 81

ProgramasCELLNETANALYZER, 15, 31, 35, 37, 38FLUXANALYZER, 38MATLAB, 15, 35, 38METATOOL, 31, 37Pathways, 60

promotor AOX1, 60propiedades “emergentes”, 13proteına recombinante, 15

Reacciones Anapleroticas, 77reacciones bioquımicas, 37rendimiento relativo, 57retıculo endoplasmatico, 58robustez, 46

secuencias huerfanas, 14sistemas de expresion, 23Sustratos

94

azufre y fosforo, 18compuestos inorganicos, 18fuentes de carbono, 18glicerol, 39glucosa, 19, 40metanol, 42

transporte de electrones, 20

UPR respuesta a proteınas no plegadas, 58

Vıasvıas anabolicas, 18vıas catabolicas, 18cadena respiratoria, 20Carboxilacion de piruvato, 70, 77Ciclo de los Acidos Tricarboxılicos, 60, 70,

76Ciclo de los Acidos Tricarboxılicos , 40, 41Ciclo del Acido Cıtrico, 19Ciclo del Glioxilato, 19, 40, 70fermentacion alcoholica de azucares, 19fosforilacion oxidativa, 20, 71, 78glicolisis, 19, 69, 76Glucolisis, 40, 41gluconeogenesis, 20, 69, 76metabolismo del carbono, 12metabolismo del metanol, 41, 44, 60, 77Reacciones Anapleroticas, 40, 41, 70Ruta de las Pentosas Fosfato, 40, 41, 70, 77Rutas Fermentativas, 40, 41Sıntesis de Aminoacidos, 40, 41, 72, 78Sıntesis de ARN, 74, 81Sıntesis de Carbohidratos, 40, 41, 74, 81Sıntesis de Compuestos de 1-carbono, 73,

80Sıntesis de Lıpidos, 40, 41, 74, 81Sıntesis de Nucleotidos, 40, 41, 73, 80

Sıntesis de Proteınas no Recombinantes, 74,80

Sıntesis de Proteınas Recombinantes, 74, 81Transporte celular, 71Transporte Intracelular, 81vıa ambibolica, 19vıa de asimilacion de la glucosa, 56vıa de asimilacion del glicerol, 39, 56vıa de asimilacion del metanol, 56vıa de las pentosas fosfato, 19, 60, 70, 77vıas catabolicas, 18vıas extremas, 31Vıas Fermentativas, 71, 78

vector de flujos, 28

95

Glosario

bioinformatica aplicacion de herrmientas computacionales y

metodos informaticos en el analisis de datos ex-

perimentales y simulacion de sistemas biologi-

cos, 9

biotecnologıa toda aplicacion tecnologica que utilice sistemas

biologicos y organismos vivos o sus derivados

para la creacion o modificacion de productos o

procesos para usos especıficos, 9

genoma todo el material genetico contenido en las celulas

de un organismo en particular, 11

metabolismo central conjunto de rutas metaboolicas que proveen pre-

cursores a las otras vıas; glicolisis, pentosas fos-

fato y Entner Doudoroff, 34

organismo metilotrofico organismos que utilizan metano como fuente de

carbono y energıa y otros compuestos reducidos

de un atomo de carbono bajo condiciones aerobi-

cas, 15

96

propiedades emergentes propiedad de nivel superior de un sistema que no

puede deducirse o ser explicado a partir de las

propiedades de entidades inferiores, 13

respiracion aerobica facultativa bajo condiciones anaerobias ocurre fermentacion

alcoholica; en presencia de oxıgeno continua con

el proceso aerobio, es decir, producir energıa,

CO2 y H2O, 21

respiracion anaerobica oxidacion de moleculas en ausencia de oxıgeno,

21

Superoxido Dismutasa humana enzima humana cuya funcion principal es elimi-

nar radicales libres, 9

transportadores redox moleculas que pueden actuar como aceptor de

electrones y luego como dador de electrones, 20

vıa ambibolica vıa catabolica y anabolica a la vez, 19

vıas anabolicas vıas biosintetizadoras y divergentes y necesitan

de energıa para su metabolismo, 95

vıas catabolicas vıas degradativas y convergentes se presentan

con liberacion de energıa y son espontaneas, 95

XML eXtensible Markup Language es un metalen-

guaje extensible de etiquetas desarrollado por el

World Wide Web Consortium, 93

97