UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA
CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE Candida albicans AISLADAS DE LA CAVIDAD ORAL DE PACIENTES PORTADORES DE VIH Y SANOS
TESIS
que para obtener el grado de: Doctor en Ciencias Médicas
Presenta: M. en C. Florencio Rueda Gordillo.
Asesores de Tesis: Básico: Dr. Iván Delgado Enciso.
Clínico: Dra. María del Refugio González Losa.
Colima, Colima, junio de 2008.
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RECONOCIMIENTOS
Este trabajo se realizó en el Departamento de Investigación de Microbiología y Biología
Molecular de la Facultad de Odontología de la Universidad Autónoma de Yucatán (UADY),
haciendo uso de sus instalaciones, material y equipo.
Este trabajo se realizó con el apoyo económico del Programa de Impulso y Orientación a la
Investigación (PRIORI) de la UADY, con número de registro PRIORI-UADY-001.
El M. en C. Florencio Rueda Gordillo, recibió la Beca para Estudios de Posgrado de Alta
Calidad del Programa de Mejoramiento del Profesorado (PROMEP) con número de folio
UADY-145.
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DEDICATORIAS
A Sandra, mi esposa, por estar a mi lado, por ser parte de mi vida y por ser mi compañera
en lo personal y en lo profesional. Por su compresión y apoyo incondicional. Te amo.
A mis hijos: Alex, Dani y Flory, por ser la razón de mi existencia y por lo mucho que
significan en mi vida. Sé que ustedes les debo el tiempo empleado en la realización de este
trabajo. Los amo.
A mis padres: Por inculcarme la superación y el buscar siempre la cima. A mi mamá por su
infinito apoyo y amor. Y a ti papá, porque estoy seguro que donde estés sentirás este
logro como algo tuyo. A ustedes con mucho amor.
A mis hermanos: Paco, Nena, Emilio y Triny, por su amor y por compartir conmigo la
familia que somos.
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AGRADECIMIENTOS
A mis asesores: Dr. Iván Delgado Enciso y Dra. María del Refugio González Losa, por su
apoyo, dirección, enseñanzas y por el tiempo dedicado para el logro del objetivo trazado.
Sin su asesoría y colaboración habría sido imposible llevar a cabo este trabajo. Muchas
gracias
A los Dres. Xóchitl Trujillo Trujillo, Miguel Huerta Viera, Sergio Montero Cruz, Oscar
Newton Sánchez, por el tiempo empleado para la revisión de este trabajo, por sus
excelentes y atinadas aportaciones para la mejora de este documento. A todos, gracias.
A mi amigo y Director de la Facultad de Odontología José Luis Villamil Urzaiz, por su
apoyo, aliento y motivación para la conclusión de este trabajo.
A la Administración Central de la Universidad Autónoma de Yucatán por las facilidades
otorgadas para la realización de mis estudios de Doctorado y por el apoyo otorgado a
través de la beca PROMEP.
A mis amigos y compañeros de trabajo que de una u otra manera, estuvieron pendientes
para que llegara a la meta. Gracias a todos.
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PRESENTACIONES EN FOROS ACADÉMICOS
Del presente trabajo se han derivado las presentaciones en los siguientes congresos:
Título de la presentación: Caracterización por resistotipificación de C. albicans aislada de
portadores sanos. XXXV Congreso Nacional de Microbiología. 2006. Oaxtepec, Morelos
Confirmación por el método de PCR de cepa presuntivas de C. albicans aisladas en la
cavidad oral. V Congreso de Estudiantes del Verano de la Investigación. PRIORI. 2006.
Mérida, Yucatán.
Caracterización por resistotipificación de C. albicans oral de pacientes con y sin VIH. XVII
Congreso Nacional e Internacional de Posgrado e Investigación en Odontología. 2006.
Acapulco, Guerrero.
Del trabajo derivaran al menos dos artículos actualmente en preparación para su
publicación en revistas de reconocida calidad.
ÍNDICES
Página
RESUMEN .................................................................................................................................... 1
ABSTRACT ................................................................................................................................... 2
INTRODUCCIÓN .......................................................................................................................... 3
ANTECEDENTES .......................................................................................................................... 5
JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................... 14
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ......................................................................................... 15
HIPÓTESIS ................................................................................................................................. 15
OBJETIVOS ................................................................................................................................ 15
MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................................ 17
RESULTADOS ............................................................................................................................ 28
DISCUSIÓN ................................................................................................................................ 38
CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 46
APORTACIONES Y PERSPECTIVAS ........................................................................................... 47
REFERENCIAS ........................................................................................................................... 48
ANEXOS ..................................................................................................................................... 58
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Código de identificación de los reactivos y concentraciones de lectura utilizadas en
la técnica de resistotipificación. .............................................................................................. 23
Tabla 2. Distribución de especies en cultivos positivos de Candida aisladas de sujetos con
VIH y sanos. ............................................................................................................................... 28
Tabla 3. Distribución de especies de Candida, según grupo de paciente. ............................. 29
Tabla 4. Distribución de las clonas de C. albicans aisladas de pacientes con VIH, según
resistotipo. ................................................................................................................................ 31
Tabla 5. Distribución de las clonas de C. albicans aisladas de pacientes sanos, según
resistotipo. ................................................................................................................................ 31
Tabla 6. Distribución del perfil de resistencia a 6 antifúngicos de 184 clonas de C. albicans,
110 de sujetos con VIH y 74 de sujetos sanos. ......................................................................... 33
Tabla 7. Criterios para selección de clonas para análisis genotípicos. ................................... 35
Tabla 8. Frecuencia y porcentaje de cariotipos según el perfil y grupo de pacientes. ......... 36
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Determinación del resistotipo de cepas de C. albicans aisladas de pacientes con
VIH, en ADS con cetrimida, se observa un crecimiento confluente de todas las cepas. ...... 32
Figura 2. Determinación del resistotipo de cepas de C. albicans aisladas de pacientes sanos,
en ADS con selenito de sodio, se observa un crecimiento confluente e inhibición de las
clonas. ....................................................................................................................................... 32
Figura 3. Electroforesis representativa de la Identificación de especies de Candida por PCR
múltiple, MPM (Marcador de Peso Molecular 100bp), CNeg (Control Negativo), CaR (C.
albicans de Referencia), CdR (Candida dubliniensis de Referencia), líneas 1-7 clonas de C.
albicans y línea 8 C. dubliniensis ............................................................................................... 35
Figura 4. Electroforesis representativa de Cariotipificación de C. albicans provenientes de
pacientes con VIH. 1 Marcador de Peso Molecular S. cerevisiae. 2-6,8-15 C. albicans, 7
Control Negativo. ..................................................................................................................... 37
1
RESUMEN
Candida albicans, es el principal patógeno del género Candida que afecta al humano, el cual
ha sido asociado principalmente a la Candidiasis Orofaríngea en pacientes infectados con
VIH y SIDA. El objetivo del presente estudio, fue determinar la diferencia fenotípica y a
nivel molecular de cepas de C. albicans aisladas de la cavidad oral, de un grupo de
pacientes con y sin VIH. Se realizó la identificación de C. albicans por métodos tradicionales
y por PCR, y se determinaron los perfiles de resistencia a fluconazol, cariotipos y
resistotipos. Se encontró 52.9% y 32.5% de portadores de Candida en pacientes con VIH y
sanos, respectivamente (p=0.008). C. dubliniensis se aisló en el 0.8% de los pacientes con
VIH, siendo el primer reporte de esta especie en México. Se encontró mayor diversidad de
clonas por cariotipos y resistotipos en los pacientes con VIH, por lo que se concluye que
existen variaciones entre las cepas aisladas entre ambos grupos de estudio.
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ABSTRACT
Candida albicans, is the main pathogen of the genus Candida which affects humans, which
has been associated mainly to oropharingeal candidiasis in patients infected with HIV and
AIDS. The aim of this study was to determine the phenotypic difference and the molecular
profiles of C. albicans strains isolated from the oral cavity, of a group of patients with and
without HIV. We performed the identification of C. albicans by traditional methods and by
PCR, and identify the profiles of resistance to fluconazole, karyotyping and resistotyping.
Was found 52.9% and 32.5 of carriers of C. albicans in patients with HIV and healthy,
respectively (p=0.008). C. dubliniensis was isolated in 0.8% of patients with HIV, being the
first report of this specie in Mexico. There was greater diversity of clones by karyotype
and resistotype in patients with HIV, concluding that there exist variations among strains
between the two groups of study.
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INTRODUCCIÓN
La prevalencia de portadores de levaduras en cavidad oral, varía dependiendo del lugar
del estudio, la edad de los pacientes y el sitio de la muestra, con valores del 20% al 75% sin
ninguna sintomatología (Al-Abeid et al., 2004). Entre todas las especies de Candida, C.
albicans es la más frecuente en todas las formas clínicas de candidiasis, representando
entre el 70 y 80% de todas las cepas de levadura (Fanello et al., 2006). A pesar de que las
especies de Candida pueden encontrarse como comensales de la cavidad oral en sujetos
sanos, diversos factores, pueden predisponer a estas personas para la Candidiasis
Orofaríngea (CO) (Pongsiriwet et al., 2004).
En un estudio realizado en diferentes países en desarrollo incluyendo a México, para
determinar la naturaleza y la prevalencia de lesiones bucales en grupos de pacientes
adultos y pediátricos infectados con VIH sin definir el estado de la enfermedad, los
autores encontraron que la CO fue la lesión oral más frecuente, con intervalos de
frecuencia desde 12% en Tanzania hasta el 94% en Zaire (Ranganathan y Hemalatha, 2006).
Las especies del género Candida tienen principalmente un origen endógeno, pero puede
ocurrir contaminación exógena, por ejemplo, en la transmisión de paciente a paciente o
de personal del área de la salud a pacientes, entre otros (Fanello et al., 2006).
En los últimos años, los métodos de tipificación molecular se han convertido en los más
utilizados para llevar a cabo estudios epidemiológicos, en lugar de los métodos
fenotípicos, como la resistotipificación, biotipificación, serotipificación o
morfotipificación. Estos métodos modernos de genotipificación incluyen la Amplificación
al Azar de Fragmentos Polimórficos de ADN (RAPD, por sus siglas en inglés; Random
Amplified Polymorphic DNA), Polimorfismos en la Longitud de los Fragmentos de
Restricción (RFLP, del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism), Southern Blot,
Reacción en Cadena de la Polimerasa Múltiple (PCR Multiplex, Polymerase Chain
Reaction), la Tipificación de Secuencias Multilocus (MLST, Multilocus Sequence Typing) y
la Electroforesis en Gel de Campos Pulsantes (PFGE, Pulsed-Field Gel Electrophoresis)
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(Marol y Yucesoy, 2008). Estos métodos son usados frecuentemente y contribuyen al
análisis de la relación de cepas microbianas con el fin de identificar las rutas de
transmisión, decidir sobre prácticas de profilaxis y establecer la biodiversidad de una
población microbiana. Por más de dos décadas, el método de cariotipificación por
Electroforesis de Campos Pulsantes ha sido ampliamente usado a nivel mundial para la
tipificación de microorganismos, por presentar alta capacidad de discriminación y
reproducibilidad, entre los cuales, la diversidad del género Candida ha sido estudiado con
este método (Muller et al., 1999; Martínez et al., 2002; Chen et al., 2005; Giammanco et al.,
2005; Jang et al., 2005).
Aunque existen trabajos enfocados al estudio de la caracterización de C. albicans, todavía
no es claro si el mismo tipo de cepas de C. albicans que afecta a los pacientes infectados
con VIH, afecta a los portadores sanos (Boerlin et al., 1996). Por otro lado, Lupetti et al.
(1995), menciona que existen diferencias entre cepas aisladas de sujetos infectados con
VIH y sin infección, por lo que se ha sugerido, que las cepas comensales pueden ser
reemplazadas al inicio de la infección por VIH o una vez que las manifestaciones del SIDA
están presentes (Lupetti et al., 1995; Nakamura et al., 1998). Por lo que es necesario llevar
a cabo estudios que permitan seguir adquiriendo conocimientos sobre la patogénesis,
epidemiología, genética y efecto de las infecciones causadas por C. albicans (Boriollo et al.,
2005) y sobre todo, conocer si el mismo tipo de cepas que afecta a los pacientes con VIH,
afecta a los portadores sanos (Boerlin et al., 1996).
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ANTECEDENTES
Desde principios de la década de los 80’s, los hongos son una de las principales causas de
enfermedades humanas, especialmente entre los grupos de pacientes
inmunocomprometidos y hospitalizados con graves enfermedades subyacentes (Pfaller y
Diekema, 2007). La candidiasis es una infección aguda o crónica producida por los hongos
del género Candida, generalmente limitado a la piel y membranas de las mucosas, aunque
también pueden darse casos de infecciones sistémicas (Brito-Gamboa et al., 2006).
Las especies del género Candida se encuentran como parte de la microbiota comensal y
ubicua en las cavidades humanas (rectal, oral, vaginal, uretral, nasal y auditiva) y piel. Las
razones de su existencia como parte de la microbiota de las personas sanas son todavía
desconocidas (Boriollo et al., 2005). Sin embargo, numerosos factores como pueden ser
disfunciones metabólicas, interacciones con la microbiota bacteriana, SIDA, cáncer,
diabetes, leucemia, extremos de la edad (niños y ancianos), utilización de antibióticos de
amplio espectro, quimioterapias citotóxicas, terapias en cuidados intensivos y trasplantes
de órganos, han contribuido al incremento de las infecciones por este microorganismo a
nivel mundial. Esto a su vez ha facilitado la conversión de Candida de la forma comensal a
parásita (Boriollo et al., 2005; Patel et al., 2006; Pfaller y Diekema, 2007), y causante de la
enfermedad conocida como CO (Pongsiriwet et al., 2004). En cavidad oral, la incidencia de
C. albicans ha sido reportada entre el 45-65% de niños sanos, 30-45% en adultos sanos, 50-
65% en personas con prótesis dentales, 90% en pacientes con leucemia bajo tratamiento
de quimioterapia y 95% en pacientes con HIV (Al-Abeid et al., 2004).
Candidiasis Orofaríngea (CO)
Las lesiones orales que se asocian con la infección del VIH han tomado mayor importancia,
debido a que afectan la calidad de vida de los pacientes y sobre todo que se consideran
como marcadores auxiliares de la progresión del SIDA y estado de la inmunosupresión
(Ranganathan y Hemalatha, 2006).
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La CO es a menudo uno de los primeros signos clínicos asociados a la infección por VIH, la
cual se puede presentarse entre el 50 y 95% de todos los pacientes seropositvos a VIH en
algún momento de su progresión hacia SIDA (Fidel, 2006). En el mismo sentido Lupetti et
al. (1995) mencionan que la candidiasis oral sintomática ha sido reportada en frecuencias
del 7 al 48% de personas seropositivas a VIH y la frecuencia en individuos con
inmunodeficiencia progresiva y SIDA es del 43 al 93% (Lupetti et al. 1995). Ranganathan y
Hemalatha (2006), mencionan que en los países desarrollados ha sido bien documentada
la prevalencia de lesiones por CO en los pacientes con VIH, en comparación con los países
en vías de desarrollo, (como México), donde los estudios son pocos.
La CO es una enfermedad infecciosa ocasionada por el crecimiento de las colonias de las
levaduras del género Candida y la penetración de las mismas en los tejidos orales cuando
las barreras físicas y las defensas del huésped se encuentran debilitadas. Esta infección se
desarrolla sobre el paladar duro y blando, lengua, mucosa bucal y piso de la boca. Es
considerada la infección oportunista por hongos más común en individuos infectados con
el VIH y se ha estimado que hasta el 95% de este grupo de pacientes desarrolla esta
infección en algún momento de la progresión de su enfermedad. Aunque la incidencia de
la CO en la infección por el VIH se ha reducido significativamente desde la introducción de
la terapia antirretroviral de gran eficacia (HAART, del inglés Highly Active Antiretroviral
Therapy), sigue siendo una infección oportunista en pacientes infectados por este virus,
debido a que este tratamiento no está disponible a nivel mundial, aunado a la presencia
de aislamientos de C. albicans que han presentado resistencia a los antifúngicos (de
Repentigny et al., 2004; Sanchez-Vargas et al., 2005a; Fidel, 2006).
Clínicamente la CO en los pacientes infectados con el VIH ha sido clasificada como
candidiasis pseudomembranosa, candidiasis eritematosa y sus variantes, o queilitis
angular (Capoluongo et al., 2000; de Repentigny et al., 2004; Reznik, 2005). Tanto la
presencia de cándida y la candidiasis oral pueden ser responsables de una micosis
sistémica en un individuo debilitado, que pueden llevar a consecuencias fatales (Zollner y
Jorge, 2003).
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La queilitis angular se presenta como eritema o fisura en las esquinas de la boca, la cual
puede presentarse sola o en conjunto con los otros dos tipos de candidiasis. La infección
puede persistir por períodos de tiempo largo si no se administra tratamiento, el cual
consiste en el uso de crema antifúngica de manera tópica (Reznik, 2005).
La candidiasis eritematosa es la principal manifestación oral asociada al VIH, la cual
frecuentemente es sub o mal diagnosticada. Se presenta como una lesión roja, plana y
ligera sobre la superficie dorsal de la lengua o sobre el paladar duro o suave. Este proceso
infeccioso, tiende a ser sintomático, con ardor oral, con mayor frecuencia cuando se
comen alimentos salados o picantes y/o se toman líquidos ácidos. El diagnóstico clínico se
basa en la apariencia, así como en los antecedentes virológicos y médicos del paciente
(Reznik, 2005).
Por último, la candidiasis pseudomembranosa o también conocida como muguet, son
lesiones con apariencia cremosa, de color blanco, sobre la mucosa de la boca, lengua y
otras superficies de la mucosa oral, que al eliminarse dejan una lesión rojiza o sangrante
sobre la superficie adyacente. El organismo más frecuentemente asociado a este tipo de
lesión es C. albicans, sin embargo, hay cada vez más reportes sobre la participación de
otras especies no-albicans (Reznik, 2005).
Ranganathan y Henalatha (2006), realizaron un estudio sobre los reportes de lesiones
orales en pacientes con VIH de tres regiones del mundo: Asia, África y América Latina, con
una revisión de todas las publicaciones realizadas entre el período establecido de 1990 a
2004, haciendo un análisis de las prevalencias tanto para casos pediátricos como para
adultos. Encontraron que la prevalencia más baja fue reportada por Matee et al. (2000) en
Tanzania con un 12% y la más alta de 94% en Zaire reportada por Tukutuku et al. (1990),
ambos países de África; en cuanto a América Latina encontraron los siguientes datos:
Argentina, 40%; Chile, 47% y México, 51%, reportados por Gillespie y Marino (1993). Santos
et al., en 2001, reportaron el 23% para Brasil; en México, Ramírez-Amador et al., han
reportado prevalencias de 39% en 1998 y 32% en 2003, por lo que se concluye que la
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prevalencia en los países Latinos es de alrededor del 40% (Ranganathan y Henalatha,
2006).
Características del género Candida
El género Candida comprende más de 150 especies diferentes, pero C. albicans es la más
frecuentemente reportada como agente etiológico de la candidiasis bucal (Negroni, 1999;
Liébana-Ureña, 2002).
Hoy en día, son varias las especies de Candida que se consideran de importancia médico-
odontológica, tales como: C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis, C.
guilliermondii, C. krusei, C. kefyr y C. dubliniensis (Negroni, 1999; Liébana-Ureña, 2002;
Zollner y Jorge, 2003; Patel et al., 2006). Tales microorganismos pueden presentarse como
comensales en diversos nichos ecológicos del cuerpo humano y las cuales son usualmente
transmitidas de persona a persona (Zollner y Jorge, 2003).
El género Candida pertenece a la familia Cryptococcaceae, dentro de los Deuteromicetos,
son células ovoides o ligeramente alargadas que miden entre 3 y 5 x por 6 a 12 micras, se
reproducen por blastoconidios, una forma que es observable al microscopio, la otra es en
forma de levadura, los primeros, son producidos una vez en un plazo aproximado de 20
minutos. Se caracterizan por formar pseudohifas tanto en vivo, como in vitro (Negroni,
1999; Liébana-Ureña, 2002).
Candida se desarrolla con gran facilidad en medios artificiales de cultivo (Negroni, 1999).
Aunque puede haber pequeñas diferencias entre la morfología colonial de las diferentes
especies de Candida, por lo regular es similar. Se desarrollan en el medio de Agar
Sabouraud como colonias cremosas lisas o rugosas en un tiempo promedio de 24 a 48
horas, a temperaturas de 24 a 37ºC, con un olor característico a levadura de pan o cerveza
(Liébana-Ureña, 2002).
Existen otros medios como el cromogénico CHROMagar Candida, que permite la
diferenciación de las especies debido a la coloración que adquieren al crecer sobre el
9
medio de cultivo. C. albicans crece formando colonias lisas de color verde, C. tropicalis las
origina lisas azules y C. krusei rugosas y rosadas (Liébana-Ureña, 2002; Hospenthal et al.,
2006). La identificación de C. albicans se efectúa habitualmente mediante la realización de
la prueba de filamentación en suero (prueba de tubo germinativo), si esta prueba no
produce tubo germinativo, probablemente pertenece a una especie diferente de C.
albicans y tendrán que realizarse pruebas de fermentación y asimilación de hidratos de
carbono para la identificación del microorganismo correspondiente (Liébana-Ureña,
2002).
Los métodos convencionales para la identificación de las especies de Candida están
basados en la asimilación y fermentación de carbohidratos y su morfología (Cirak et al.,
2003). Sin embargo, la identificación de Candida a nivel de especie usando los protocolos
de asimilación de carbohidratos puede ser problemática, aunque si se utiliza para el
aislamiento primario CHROMagar Candida para una identificación rápida se contará con
razonable especificidad (Guiver et al., 2001).
Por lo tanto, la rápida y correcta identificación a nivel de especie de los aislamientos de
Candida, son fundamentales para garantizar la adecuada prescripción específica, tanto en
dosificación como duración, que permita una pronta y eficaz terapia antifúngica (Guiver et
al., 2001; Alcoba-Florez et al., 2005).
En 1995, en Dublín, Irlanda, se aisló por primera vez una especie de Candida asociada
principalmente a los pacientes infectados con el VIH, a la que se le denominó Candida
dubliniensis (Chavasco et al., 2006), también se ha encontrado en portadores orales el
microorganismo en un pequeño porcentaje de individuos sanos y más recientemente, ha
sido implicado como un agente de colonización y enfermedad oral en otros grupos
inmunocomprometidos, como los pacientes diabéticos y con cáncer (Al Mosaid et al.,
2005). Esta nueva especie comparte muchas características fenotípicas y bioquímicas con
C. albicans, como son tubo germinativo positivo y producción de clamidosporas (Ahmad et
al., 2004), lo cual dificulta su diferenciación por lo métodos tradicionales usados de
manera rutinaria en los laboratorios clínicos, lo que ha contribuido a la identificación de
10
algunos aislamientos de C. dubliniensis como C. albicans. Se han descrito pruebas que
permiten la diferenciación de ambas especies como son la falta de asimilación de xilosa y
ausencia de crecimiento a 42°C para C. dubliniensis, formación de clamidosporas, patrón
de asimilación de carbohidratos, actividad de la β-D-glucosidasa, el color de las colonias
sobre diversos medios, entre otras (Kantarcioglu y Yucel, 2002; Silva et al., 2003; Khan et
al., 2004; Chavasco et al., 2006).
La prueba API ID 32C de BioMérieux es un kit comercial disponible para la identificación de
levaduras, que permite identificar la especie de C. dubliniensis, debido a que se ha
adicionado a la base de datos de la prueba los perfiles de asimilación de carbohidratos de
este microorganismo (Polacheck et al., 2000), sin embargo, para su confirmación ha sido
necesario usar técnicas moleculares de tipificación genética (Giammanco et al., 2000; Silva
et al., 2003).
Por las grandes limitaciones de los métodos de fenotipificación, se han hecho uso de
metodologías de biología molecular como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR),
que ha servido para la identificación molecular de las especies de Candida y facilitado el
desarrollo de sistemas de identificación a nivel de especie (Cirak et al., 2003).
Candida albicans y su relación con el VIH
C. albicans, el principal patógeno humano del género Candida, es una levadura comensal
de la mucosa oral, gastrointestinal y vaginal de individuos sanos y parece tener una
distribución casi mundial. Entre los diversos factores predisponentes para incrementar el
riesgo de una infección fúngica oportunista, se encuentran la infección por VIH (Al-Abeid
et al., 2004).
C. albicans, es la especie más frecuentemente aislada, aunque otras especies tienen
importancia médica como son: C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis, C. dubliniensis, C.
guilliermondii, C. kefyr y C. parapsilosis (Gugnani et al., 2003; Zollner y Jorge, 2003; Lyon et
al., 2006; Patel et al., 2006). La presencia de estas levaduras en la cavidad oral no
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necesariamente da lugar a enfermedades a menos que existan factores predisponentes
para el desarrollo de la candidiasis (Lyon et al., 2006).
Diversos estudios a nivel mundial se han realizado para conocer el porcentaje de la
población infectada con el VIH que son portadores de especies de Candida, con especial
énfasis en C. albicans. Algunos de ellos, se presentan a continuación: Campisi et al. (2002)
reportaron un estudio realizado con dos grupos de sujetos italianos sin signos clínicos de
candidiasis, donde el porcentaje de portadores de Candida fue de 61.9% (26/42) y 29.3%
(12/41) para los sujetos positivos a VIH y sanos, respectivamente; donde C. albicans fue la
más frecuentemente aislada con 73.1% (19/26). Estos mismos autores reportaron que no
encontraron a paciente alguno con presencia de C. dubliniensis (Campisi et al., 2002).
En México, Sánchez-Vargas et al. (2005a) reportaron que al estudiar a 51 pacientes adultos
infectados con VIH tuvieron un porcentaje de aislamiento de Candida de 68.6% (35/51), de
los cuales todos presentaban infección por candidiasis, siendo C. albicans la más frecuente
del género Candida con 91.4% (32/35). En este mismo reporte, se estudiaron 109 adultos no
infectados con VIH, en los cuales se encontró un porcentaje de aislamiento de 61.5%
(67/109), que al dividirlos en dos grupos, uno clasificado como colonizados y los otros con
candidiasis, se encontró que C. albicans fue la más frecuente de todas las especies aisladas
con 66.7 (12/18) y 47.4% (27/57), respectivamente. No se reportó aislamiento de C
dubliniensis y C. krusei (Sanchez-Vargas et al., 2005a).
Caracterización de Candida albicans
Nobuko Maeda, menciona que con base en estudios epidemiológicos utilizando métodos
moleculares para la tipificación y subtipificación de especies de Candida, se ha demostrado
diversidad genética y geográfica de C. albicans (Coogan et al., 2006).
Las cepas de C. albicans aisladas de pacientes VIH positivos presentan características
especiales, como su patrón de sensibilidad frente a los antifúngicos, rasgo fenotípico que
es producto de una variación genómica dentro de la especie, de ahí la importancia de
estudiarla y caracterizarla genotípicamente. Se han caracterizado cepas de C. albicans de
12
pacientes VIH positivos, y se ha observado que existen variables más virulentas, aunque
fenotípicamente iguales y genéticamente distintas; lo que ha mostrado que la mayoría de
los pacientes con SIDA presentan un mismo clon del microorganismo. Asimismo, se ha
descrito que existe variabilidad genómica entre diferentes cepas aisladas, lo que
demuestra que no hay una única cepa de C. albicans que esté asociada a candidiasis oral en
los pacientes VIH positivos (González et al., 2006).
Ha habido gran interés en adquirir una mejor comprensión de la patogénesis, la
epidemiología y la genética de las infecciones causadas por C. albicans. Esto ha dado
origen al desarrollo de una gran variedad de investigaciones con diversos métodos entre
los cuales se encuentra cariotipificación electroforética a través de electroforesis de
campos pulsantes (Boriollo et al., 2005).
La Cariotipificación por electroforesis, es un método bien establecido para tipificar
especies de Candida, el cual permite la subdivisión de C. albicans en varios cariotipos y que
entre otros usos, ha permitido distinguir a esta especie de las especies fenotípicamente
muy similares, como C. dubliniensis. Esta metodología se ha utilizado para caracterizar
cepas de C. albicans asociadas a CO recurrente y en investigaciones epidemiológicas para
identificar el origen de infecciones adquiridas intrahospitalariamente por este
microorganismo. De la misma manera, la sustitución, diferencias o estabilidad de cepas,
pueden ser demostradas por este método (Giammanco et al., 2005). Esto si se considera
que en los pacientes infectados por VIH puede ser portadores de una o múltiples cepas de
C. albicans (Redding et al., 1999).
En adición, autores como Xu et al. (2000), sugieren, que en baja frecuencia, pueden existir
mutaciones en cepas de C. albicans que se encuentran como miembros comensales de la
cavidad oral, ya sea de personas con o sin infección con el VIH. Estas mutaciones pueden
conferir resistencia a diversos antifúngicos. Las cepas resistentes pueden ser transmitidas
a partir de otro individuo o del medio ambiente por medio de fomites, ya que estos
autores, encontraron cepas de C. albicans resistentes a fluconazol que pertenecían a
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pacientes con y sin VIH que nunca habían recibido terapia previa con este antifúngico (Xu
et al., 2000).
Por otro lado, la biotipificación por resistotipos de cepas de C. albicans también ha sido
esencial para determinar el origen y la diseminación de las infecciones por Candida. Se han
reportado diferentes biotipos de cepas orales de C. albicans aisladas de pacientes
infectados con el VIH con candidiasis oral recurrente (Nakamura et al., 1998).
Sin embargo, la frecuencia y cronología de portadores de C. albicans son sólo parcialmente
conocidos y gran parte de la biología de C. albicans en la etapa de comensales aún no ha
sido bien entendida. Estudios de epidemiología molecular han demostrado que los sujetos
sanos pueden ser colonizados de manera simultánea o secuencial por diferentes cepas de
C. albicans, lo que indica que ser portador es un proceso dinámico (Bougnoux et al., 2006).
Aunque existen estudios enfocados al estudio de la caracterización de C. albicans, todavía
no es claro si el mismo biotipo de cepas que afecta a los pacientes con VIH, afecta a los
portadores sanos (Boerlin et al., 1996).
14
JUSTIFICACIÓN
Es conocido que C. albicans se encuentra frecuentemente en la cavidad oral de pacientes
con VIH y que las infecciones graves producidas por este microorganismo han tenido un
aumento importante en los últimos años. En el año de 2006 en México se habían
reportado más de 110,000 casos de pacientes con SIDA y Yucatán se ubica en el
decimocuarto lugar a nivel nacional por el número de personas portadoras del VIH
acumuladas hasta el 31 de diciembre de 2006. Lo anterior mencionado son razones
suficientes para llevar a cabo estudios sobre el comportamiento de este microorganismo
en un grupo de pacientes de la población yucateca (con y sin VIH). Esto permitirá conocer
el comportamiento de las cepas de C albicans, con el fin de establecer medidas futuras
para el tratamiento y seguimiento de la candidiasis en pacientes portadores del VIH. Este
estudio, también contribuirá a determinar el comportamiento de C. albicans al comparar
pacientes portadores de VIH y sin presencia del virus, debido a que todavía existen
controversias a nivel mundial sobre este tema.
Desde el punto de vista académico, el presente trabajo permitirá fortalecer el desarrollo
de las Líneas de Generación y Aplicación del Conocimiento del Cuerpo Académico de
Microbiología y Biología Molecular de Infecciones Orales de la Facultad de Odontología de
la UADY.
Con base en lo anterior, se justifica la realización del presente trabajo con el fin de
contribuir al conocimiento epidemiológico de este microorganismo en la región además
de su aportación académica relevante en la UADY.
15
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
¿Existen diferencias fenotípicas y/o genotípicas entre las cepas de C. albicans aisladas de
pacientes con y sin VIH?
HIPÓTESIS
Con base en la revisión de la literatura, en el presente estudio, se establece la siguiente
hipótesis de investigación:
Hi: Existen diferencias fenotípicas y genotípicas entre las cepas de C. albicans aisladas de
pacientes con y sin VIH.
Y como hipótesis nula:
Ho: No Existen diferencias fenotípicas y genotípicas entre las cepas de C. albicans aisladas
de pacientes con y sin VIH.
OBJETIVOS
General
Comparar las características fenotípicas y genotípicas de cepas de C. albicans aisladas de la
cavidad oral, en un grupo de pacientes con y otro sin VIH.
Específicos
1. Determinar y comparar la frecuencia de portadores de C. albicans aisladas de
pacientes con y sin VIH
2. Determinar y comparar el perfil de resistotipificación de las cepas de C. albicans
aisladas de pacientes con y sin VIH
3. Determinar y comparar el perfil de resistencia a los antifúngicos de las cepas
aisladas de pacientes con y sin VIH
16
4. Establecer y comparar el patrón del cariotipo por tipificación molecular con el
método de electroforesis de campos pulsantes de las cepas aisladas de pacientes
con y sin VIH.
17
MATERIAL Y MÉTODOS
Tipo y diseño de estudio
El presente estudio es de tipo descriptivo según la clasificación de Hernández et al. (2004),
ya que en este tipo de estudios la variables que se seleccionan se mide cada una de ellas
independientemente, para describir lo que se investiga, considerando también, que el
objetivo no es indicar cómo se relacionan, con un diseño trasversal y descriptivo
(Hernández-Sampieri et al., 2004).
Variables
En el presente estudio se realizará un análisis univariado que consiste en el análisis de cada
una de las variables estudiadas por separado, es decir, el análisis está basado en una sola
variable. Utilizando la técnica de análisis de distribución de frecuencias para una tabla
univariada. La distribución de frecuencias de la variable requiere de ver cómo están
distribuidas las categorías de la variable, pudiendo presentarse en función del número de
casos o en términos porcentuales (Ávila-Baray, 2006).
Las variables del presente estudio se consideran variables dependientes y se clasifican de
la siguiente manera según los criterios de Regueira (2004).
Característica fenotípica: tipo de variable cualitativa con una escala de medición nominal.
Establecida a través del método de resistotipificación y perfil de resistencia a los
antifúngicos, ambos con clasificaciones policotómicas.
Característica genotípica: tipo de variable cualitativa con una escala de medición nominal.
Establecida a través del método de cariotipificación, con clasificación policotómica.
Unidades de análisis: Aislamientos de C. albicans
18
Selección de pacientes
Con el fin de obtener las cepas de C. albicans necesarias para llevar a cabo el presente
estudio, se reclutaron dos grupos de pacientes durante el período de comprendido entre
octubre de 2004 a julio de 2006. Estos grupos se encontraban divididos con base en la
infección con el VIH. El primer grupo se integró de toda la población de sujetos infectados
con el VIH, que asistieron a consulta de control al Hospital General O´Horán de la Ciudad
de Mérida, Yucatán en el período de tiempo mencionado previamente. Los pacientes
fueron referidos al Centro de Investigaciones Regionales “Dr. Hideyo Noguchi” de la
Universidad Autónoma de Yucatán, en donde se determinó si cumplían con los criterios de
inclusión y exclusión descritos posteriormente y sin presencia clínica de SIDA, según los
criterios establecidos a partir de 1993 por los Centros para el Control y la Prevención de
Enfermedades, CDC por sus siglas en inglés (Centers.for Disease Control and Prevention,
1992) .
El otro grupo consistió en sujetos provenientes del mismo hospital, no infectados con el
VIH, los cuáles habían sido sometidos a pruebas prenupciales y quienes dieron resultados
negativos a la prueba de VIH. La selección de estos pacientes se realizó a través de un
muestreo de sujetos voluntarios, que según Hernández-Sampieri et al., (2004), éste tipo
de muestra se usa en estudios de laboratorio donde se procura que los sujetos sean
homogéneos en variables tales como edad y el género, de manera que los resultados o
efectos no obedezcan a diferencias individuales (Hernández-Sampieri et al., 2004). Los
sujetos de este grupo participantes en el estudio tuvieron los mismos criterios de inclusión
y exclusión que los pacientes con VIH, con la única diferencia de ser negativos a la prueba
de VIH.
De todos los pacientes se obtuvieron datos clínicos y generales. Todos los participantes
participaron de manera voluntaria, previa explicación del objetivo del estudio y riesgos
implícitos a su participación a la firma de la carta de consentimiento informado (Anexo A).
El protocolo fue aprobado por el Comité Asesor de Investigación de la Facultad de
Odontología con número de oficio FOCAI 04/02, el cual a su vez fue requerido como
19
requisito previo para ser sometido al proceso de concurso para financiamiento por el
Programa de Impulso y Orientación a la Investigación (PRIORI) (Anexo B).
Criterios para la selección de pacientes seropositivos a VIH.
Criterios de Inclusión:
1. Pacientes adultos con edades entre 18 y 50 años.
2. Pacientes sin presentar clínicamente CO.
3. Ser pacientes seropositivos a VIH, sin manifestaciones clínicas de SIDA.
4. No haber recibido tratamiento antifúngico por lo menos 6 meses antes de la toma
de muestras.
5. Que aceptaron participar en el estudio.
Criterios de Exclusión:
1. Pacientes que no tenían los datos generales completos en la historia clínica.
2. Pacientes que no fueron atendidos regularmente en el Hospital General O’Horán.
3. Pacientes que no aceptaron participar en el estudio.
Criterios para la selección de pacientes seronegativos a VIH.
Criterios de Inclusión:
1. Pacientes adultos con edades entre 18 y 50 años.
2. Pacientes sin presentar clínicamente CO.
3. Ser pacientes seronegativos a VIH.
4. No haber recibido tratamiento antifúngico por lo menos 6 meses antes de la toma
de muestras.
5. Que aceptaron participar en el estudio.
20
Criterios de Exclusión:
1. Pacientes que no proporcionaron datos generales completos.
2. Pacientes que no aceptaron participar en el estudio.
Clasificación de riesgo del estudio
Según el Reglamento de la Ley General de Salud en materia de Investigación para la Salud,
el presente trabajo se encuentra clasificado según el artículo 17, como Investigación con
riesgo mínimo, considerando que se procedió a la obtención de muestras de la cavidad
oral con saliva.
Estudio Microbiológico
Recolección de muestra:
Las muestras microbiológicas se tomaron de la mucosa oral del paciente, tomando como
base el dorso de la lengua, dientes, la mucosa de los carrillos y gingiva con ayuda de un
hisopo estéril que se frotó rotatoriamente sobre las superficies señaladas por un tiempo
mínimo de 2 minutos, como ha sido reportado previamente (Nakamura et al., 1998). Las
muestras se colectaron y colocaron en el medio de transporte Stuart (BBL, Becton,
Dickinson and Company) y fueron transportadas dentro de un contenedor con
refrigerantes al Departamento de Investigación de Microbiología y Biología Molecular de
la Facultad de Odontología de la Universidad Autónoma de Yucatán en un tiempo máximo
de dos horas, para su cultivo y análisis.
Aislamiento e identificación:
Las muestras microbiológicas, fueron inoculadas en el medio de cultivo diferencial
CHROMagar Candida (BBL, Becton, Dickinson and Company), el cual es un medio para el
aislamiento e identificación presuntiva de levaduras de importancia médica. En 24 a 48
21
horas y con base en los colores fuertemente contrastantes de las colonias se logró
discriminar a diferentes cepas. C. albicans, es identificada debido a la coloración verde
claro, característica de esta especie sobre la superficie del agar. Los cultivos se incubaron
en condiciones aeróbicas a 37º C, durante 48 horas. Una vez, transcurrido el tiempo y el
desarrollo de colonias, se seleccionan aquellas que presentaron la coloración y morfología
características sobre el medio CHROMagar Candida siguiendo la interpretación de
publicaciones previas (Jabra-Rizk et al., 2001; Linares y Solís, 2001) e instrucciones del
fabricante.
Para la identificación de C. albicans, se realizó la prueba de tubo germinativo según el
procedimiento anteriormente publicado (Linares y Solís, 2001; Alcoba-Florez et al., 2005) y
para diferenciarlas de C. dubliniensis se utilizó la prueba de crecimiento a 45°C sobre Agar
Dextrosa Sabouraud (BBL) (Pinjon et al., 1998).
Asimismo, se utilizó el perfil de utilización de sustratos por medio del kit comercial para
identificación de levaduras AUXACOLOR (Sanofi Diagnostics Pasteur, Paris, Francia)
siguiendo las instrucciones del fabricante y publicaciones previas (Campbell et al., 1999;
Linares y Solís, 2001).
Conservación de las cepas aisladas
Se conservaron al menos tres Unidades Formadoras de Colonia (UFC) de cada uno de los
aislamientos sugestivos de C. albicans por cada paciente seleccionado para el estudio.
Estas fueron conservadas a una temperatura de –70ºC en medio de agar BHI (Infusión
Cerebro Corazón) (BBL, Becton, Dickinson and Company), adicionado con 10% de glicerol,
para su conservación para las pruebas posteriores y técnicas de biología molecular
(Vazquez et al., 1991; Tortorano et al., 1998).
Determinación del perfil de resistotipificación
La tipificación por resistograma de las cepas de C. albicans aisladas se realizó según el
método desarrollado por McCreight y Warnock y modificado por Nakamura et al.
22
(Nakamura et al., 1998). Los reactivos químicos usados fueron de la marca Sigma y las
concentraciones usadas para tipificar el resistograma fueron: ácido bórico 1.15, 1.3, 1.45, 1.6
mg/ml; cetrimida 0.06, 0.08, 0.1, 0.12 mg/ml; nitrato de plata 0.0075, 0.01, 0.0125, 0.015
mg/ml; periodato de sodio 0.01, 0.02, 0.03, 0.04 mg/ml y selenito de sodio 0.1, 0.2, 0.3, 0.4
mg/ml. Para preparar las soluciones madre, todos los productos químicos, excepto el
nitrato de plata, se prepararon a una concentración de 20 mg/ml, mientras que el nitrato
de plata a una concentración de 2 mg/ml. Alícuotas de las soluciones madre se añadieron
al Agar Dextrosa Sabouraud a una temperatura no mayor de 55°C para obtener las
concentraciones finales anteriormente mencionadas, finalmente se vaciaron en cajas petri
desechables estériles de 100 x 15 mm, con un volumen aproximado de 20 ml (Nakamura et
al., 1998).
Las UFC de C. albicans, fueron incubadas durante 24 horas a 37°C, y posteriormente
suspendidas en agua destilada estéril, ajustándose a una densidad óptica de 0.45 a 540
nm. Se inocularon 5 μl de las suspensiones en las placas de agar con el reactivo químico y
sin reactivo como control y se incubaron 40 horas a 37°C para después observar el
crecimiento (Nakamura et al., 1998). Todas las pruebas fueron elaboradas por triplicado y
de manera separada para obtener resultados más confiables.
De las cuatro diferentes concentraciones se escogió para la lectura de los resultados
aquélla que mostró una clara diferenciación entre las cepas estudiadas, siendo estas: 0.3
mg/ml para el selenito de sodio, 1.6 para el ácido bórico, 0.6 para cetrimida, 0.03 para
periodato de sodio y 0.015 para el nitrato de plata. Para describir el resistograma, el
selenito de sodio, ácido bórico, cetrimida, periodato de sodio y nitrato de plata fueron
nombrados respectivamente de la letra A a la E, según la codificación de la Tabla 1.
Los patrones de crecimiento de las clonas se obtuvieron realizando una modificación de lo
publicado por Nakamura et al. y considerando los criterios de interpretación
implementados por Khan et al., se siguieron los siguientes criterios: Crecimiento
confluente con la letra mayúscula que identifica al reactivo al cual fue resistente, y el no
23
confluente con la letra minúscula y la ausencia de éste, es decir, susceptible al químico,
con un guión (-) (Nakamura et al., 1998; Khan et al., 2003).
Tabla 1. Código de identificación de los reactivos y concentraciones de lectura utilizadas en
la técnica de resistotipificación.
Reactivos Clave Concentración de
corte (mg/ml)
Selenito de sodio A 0.3
Ácido bórico B 1.6
Cetrimida C 0.06
Periodato de sodio D 0.03
Nitrato de plata E 0.015
Perfil de susceptibilidad a los antifúngicos
Para determinar la sensibilidad de las clonas de C. albicans a los antifúngicos, se utilizó el
kit comercial FUNGITEST (Sanofi-Pasteur, Marnes la Coquette, Francia), que determina la
susceptibilidad de 6 agentes antifúngicos: 5-fluorocitosina (5FC), anfotericina B (AMB),
miconazol (MCZ), ketoconazol (KTZ), itraconazol (ITZ) y fluconazol (FCZ). Cada
antifúngico cuenta con dos concentraciones diferentes en la microplaca, para FCZ, 8 y 64
µg/ml, 2 y 32 µg/ml para 5FC, 0.5 y 8 µg/ml para AMB y MCZ, 0.5 y 4 µg/ml PARA KTZ e ITZ,
todos en el medio buffer RPMI 1640 modificado y en la presencia de un indicador redox.
La interpretación de la sensibilidad o resistencia, se observó basándose en la reducción del
indicador, y según la siguiente clasificación: Inhibidas (sensibles) si no presentaron
crecimiento en las dos concentraciones del antifúngico, Intermedias si solo se
desarrollaban en la concentración baja del antifúngico y No inhibidas (resistentes) si
presentaron crecimiento en las dos concentraciones del antifúngico. La prueba de
Fungitest se realizó con base en las indicaciones del fabricante y artículos anteriormente
publicados (Witthuhn et al., 1999; Sanchez-Vargas et al., 2005b).
24
Extracción del DNA para el análisis molecular
La extracción del DNA de las cepas a estudiar se realizó con un método de extracción
rápida, el cual ha demostrado su eficacia en diversos estudios. El método se basó en un
proceso simple de ebullición y congelación. Este se realizó tomando una UFC de la
levadura desarrollada sobre ADS (BBL) durante 48 horas a 37°C, posteriormente fue
suspendida en 500 µl de agua destilada estéril y sometida a calentamiento durante 15 min
a 95° C, inmediatamente después de terminar el tiempo se sometió a congelación a -70°C
por al menos 15 min. Antes de añadir el extracto de DNA a la mezcla de PCR, la mezcla
lisada se descongeló a temperatura ambiente y se procedió a la separación de los
desechos celulares presentes en el extracto a través de centrifugación durante 5 min a
16,000 X g. El sobrenadante se colocó en un tubo Eppendorf estéril para su conservación
(Polacheck et al., 2000; De Baere et al., 2002).
El sobrenadante conteniendo el DNA obtenido se almacenó a -20 ºC, haciendo alícuotas
para evitar congelamientos y descongelamientos repetidos, cuando se utilizó al instante,
este se conservó a 4 ºC.
Identificación de Candida albicans por la técnica de (PCR)
Para la confirmación de la identificación de C. albicans y lograr su diferenciación de C.
dubliniensis, se llevó a cabo el método de PCR múltiple según el procedimiento utilizado
por Yang et al. (2003). Tres pares de oligonucleótidos fueron utilizados simultáneamente
en cada PCR. El primer par utilizado es específico para C. dubliniensis y amplifican un
fragmento de 288 pb del gen ACT1: DUBF (5’-GTATTTGTCGTTCCCCTTTC-3’) y DUBR (5’-
GTGTTGTGTGCACTAACGTC-3’); el segundo par, son específicos para C. albicans
amplificando un fragmento de 175 pb del gen 25S rRNA, denominados: CAL5 (5’-
TGTTGCTCTCTCGGGGGCGGCCG-3’) y NL4CAL (5’-AAGATCATTATGCCAACATCCTAGGTA/
TAA-3’) y por último, el tercer par correspondió a oligos que amplifican un fragmento de
610 pb del gen 25S rRNA de todas las especies del género Candida, correspondiendo a las
siguientes secuencias que sirvieron como control positivo: RNAF (5’-
25
GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’) y RNAR (5’-GGTCCGTGTTTCAAGACG-3’) (Yang et al.,
2003).
En un tubo Eppendorf, se prepararon 25 µl de la mezcla de PCR conteniendo 20 pmol de
cada uno de los “primers”, 2.5 mM de MgCl2, Buffer PCR (10 mM de Tris-HCl, 10 mM de
KCl), 0.2 mM de la mezcla de dNTPs, 2.5 U de Taq DNA polimerasa, 10 ng de DNA en
estudio y agua destilada cuanto baste para 25 µl (Yang et al., 2003). La reacción de
amplificación se llevó a cabo con un ciclo inicial a 95ºC durante 6 min, seguido de 30 ciclos
de 30 s a 94ºC, 30 s a 58ºC y 30 s a 72ºC, con una incubación final de 10 min a 72ºC
(Polacheck et al., 2000; Yang et al., 2003).
Todos los productos del PCR, fueron analizados por medio de electroforesis, utilizando
buffer de corrimiento TBE a 75 V durante 1 hora en geles de agarosa al 1%. Los geles fueron
teñidos con 0.5 mg/ml de bromuro de etidio durante 15 min (Brito-Gamboa et al., 2006;
Chavasco et al., 2006). Posteriormente, las bandas fueron visualizadas en un
transiluminador de luz UV, fotografiadas y analizadas con el programa de cómputo Kodak
1D Image Analysis (Rochester, NY) del equipo de fotodocumentación Edas 290 (Kodak).
Determinación de cariotipos
El DNA de C. albicans para la determinación de cariotipos se realizó con el kit comercial
CHEF Yeast Genomic DNA Plug Kit de la marca Biorad (Hercules, Calif), siguiendo las
indicaciones del fabricante. Los bloques obtenidos con el DNA de C. albicans fueron
almacenados a 4°C hasta su uso en las pruebas de electroforesis.
El procedimiento de Electroforesis de Campos Pulsantes se realizó con modificaciones a lo
anteriormente publicado (Gee et al., 2002; Giammanco et al., 2005) y en las indicaciones
propuestas por el fabricante del kit. El gel se realizó al 0.8% utilizando Agarosa Certificada
para Campos Pulsantes (Biorad Laboratories) en buffer de TBE 1X (Tris-borato-EDTA). La
electroforesis se realizó en el sistema CHEF-DR II (Biorad Laboratories, Hercules, CA), el
cual fue programado en dos bloques, el primero se programó a un tiempo de cambio de
26
120 s y tiempo de 24 horas, para el bloque dos se utilizó un tiempo de cambio de 240 s
durante 36 horas, y un gradiente de voltaje de 3.5 V/cm, manteniendo el buffer de
corrimiento a una temperatura de 14°C usando los equipos de recirculación de buffer y
enfriamiento (Mini chiller Modelo 1000, Biorad Laboratories, Hercules CA).
Un bloque de Saccharomyces cerevisiae cepa YNN295 (Biorad Laboratories) fue utilizada
como marcador de peso molecular en cada una de las pruebas realizadas. Los geles fueron
teñidos con 0.5 µl/ml de bromuro de etidio durante 15 min. Posteriormente, las bandas
fueron visualizadas en un transiluminador de luz UV y fotografiadas con el programa de
cómputo Kodak 1D Image Analysis (Rochester, NY) del equipo de fotodocumentación
Edas 290 (Kodak).
Las interpretación de las bandas se hizo de manera visual y siguiendo los criterios
publicados por King et al. (1995). Las diferencias mínimas de una o más bandas entre los
aislamientos se utilizó como criterio suficiente para designar clonas diferentes (King et al.,
1995).
Análisis estadístico
Los resultados obtenidos se presentan por medio de tablas porcentuales. La comparación
de los resultados de ambos grupos, se hacen al comparar las frecuencias por el método
estadístico de Ji cuadrada, con el fin de comprobar o rechazar las hipótesis planteadas.
El análisis estadístico se realizó con el programa estadístico Statgraphics Plus 5.1 para
windows, con un nivel de confianza de 95%.
Aspectos éticos
Todos los pacientes portadores de VIH y controles, fueron invitados a participar de
manera voluntaria en el estudio, previa explicación del objetivo del estudio y de la
explicación correspondiente a la toma de muestras. Aquellos pacientes que decidieron
participar en el estudio firmaron una carta de consentimiento informado (Anexo A); los
27
datos obtenidos fueron conservados confidencialmente. Una vez obtenidos los resultados
del estudio, a cada paciente portador de VIH, le fueron entregados estos a través del
médico asignado para su atención. El protocolo fue aprobado por el Comité Asesor de
Investigación de la Facultad de Odontología con número de oficio FOCAI 04/02 (Anexo B).
28
RESULTADOS
Se estudiaron un total de 246 sujetos, distribuidos de la siguiente manera: 121 (49.2%)
correspondieron a pacientes portadores del VIH y 125 (50.8%) a personas clínicamente
sanas, es decir no portadores del VIH.
Se estudiaron un total de 121 pacientes portadores del VIH de los cuales, 98 (81.0%)
correspondieron al género masculino y 23 (19.0%) al femenino, con un promedio de edad
de 34.2 años (ds= 8.4). De los 121 pacientes, 64 (52.9%) tuvieron cultivos positivos al
género Candida y 57 (47.1%) tuvieron cultivos negativos. De los 64 cultivos positivos, C.
albicans fue la más frecuente con 85.9% (55/64), y la menos frecuente fue C. dubliniensis
con 1.6% (1/64). Con relación a los pacientes sanos, 81 (64.8%) fueron del género masculino
y 44 (35.2%) del femenino, con un promedio de edad de 32.8 años (ds= 9.6). De los 125
pacientes sanos, 44 (35.2%) dieron cultivos positivos a Candida y 81 (64.8%) fueron
negativos. De estos, la especie más frecuentemente aislada fue C. albicans con 84.1%
(37/44) y no se aisló C. dubliniensis (Tabla 2).
Tabla 2. Distribución de especies en cultivos positivos de Candida aisladas de sujetos con
VIH y sanos.
Especie Cultivos positivos de sujetos
con VIH (n= 64) Cultivos positivos de sujetos
sanos (n= 44)
Frecuencia Porcentaje** Frecuencia Porcentaje**
C. albicans 55 85.9 37 84.1
C. dubliniensis* 1 1.6 0 0.0
C. tropicalis 11 17.2 6 13.6
C. glabrata 10 15.6 4 9.1
C. krusei 7 10.9 4 9.1 *Nota: Confirmada por PCR. **La suma de los porcentajes es mayor al 100% debido a la presencia de cultivos mixtos.
De los 64 cultivos positivos obtenidos de los pacientes con VIH, 48 (75.0%) fueron cultivos
puros y 16 (25.0%) fueron cultivos mixtos con dos o más especies, siendo la combinación
29
más frecuente de dos especies donde predominó C. albicans con C. tropicalis y C. albicans
con C. glabrata con 4 cultivos cada una, en este grupo de pacientes se encontraron dos
cultivos con 3 especies y uno con 4; porcentajes inversos se obtuvieron con los sujetos
sanos, pues de los 44 cultivos positivos a Candida, 37 (84.1%) fueron cultivos puros y 7
(15.9%) fueron cultivos mixtos, en el 100% de estos cultivos, se aislaron como máximo dos
especies (Tabla 3) .
Tabla 3. Distribución de especies de Candida, según grupo de paciente.
Especies Sujetos con VIH Sujetos sanos
Frecuencia Porcentaje Frecuencia Porcentaje
C. albicans 42 65.6 32 72.9
C. dubliniensis 1 1.6 0 0.0
C. tropicalis 2 3.1 2 4.5
C. glabrata 2 3.1 2 4.5
C. krusei 1 1.6 1 2.3
C. albicans + C. tropicalis 4 6.2 2 4.5
C. albicans + C. glabrata 4 6.2 2 4.5
C. albicans + C. krusei 2 3.1 1 2.3
C. tropicalis + C. glabrata 2 3.1 0 0.0
C. tropicalis + C. krusei 1 1.6 2 4.5
C. albicans + C. tropicalis + C. krusei 1 1.6 0 0.0
C. albicans + C. glabrata + C. krusei 1 1.6 0 0.0
C. albicans + C. tropicalis + C. glabrata +
C. krusei 1
1.6 0
0.0
Total 64 100.0 44 100.0
Al comparar las frecuencias de cultivos positivos a Candida entre ambos grupos de
pacientes, se obtuvo un valor de X2 = 7.11 con un valor de p = 0.008, por lo que se concluye
que si existe una asociación entre la frecuencia de aislamientos y la presencia de la
30
infección por el VIH, es decir, la infección por VIH, está asociado al aumento de la
frecuencia de cultivos positivos por Candida.
Por otro lado, al comparar específicamente los pacientes portadores de la especie C.
albicans, también se encontró una diferencia estadísticamente significativa al comparar
ambos grupos, con un valor de X2 = 6.58 y un valor de p = 0.01. Por lo que también se
concluye que la infección por VIH, está asociado al aumento de portadores de C. albicans.
Resistotipificación
Con el fin de empezar a establecer comparaciones entre las cepas de C. albicans aisladas
de ambos grupos, se inició la determinación del perfil de resistotipificación de C. albicans.
De los pacientes infectados con VIH, se obtuvieron 149 clonas, provenientes de 55
pacientes con C. albicans, teniendo un promedio aproximado de 3 colonias por cultivo
positivo. De todas las clonas estudiadas, se encontraron 12 perfiles diferentes de
resistotipos, siendo el perfil ABCDE el de mayor frecuencia con 47.0%, seguido de A-CDE
con 37 clonas correspondiendo al 24.9%, las combinaciones a-CDE y --C-E, las de menor
frecuencia con porcentajes de 0.7 para cada una, es decir una sola clona con el perfil
(Tabla 4).
En cuanto a los pacientes sanos, se obtuvieron 74 clonas, provenientes de 37 cultivos
positivos a C. albicans, se obtuvo 2 clonas por cepa aislada.
Se encontró que el perfil de mayor frecuencia fue la combinación --CDE con 48 (64.8%)
clonas, seguida en porcentajes muy por debajo de este, el perfil –bCDE con 8 (10.8%), ---DE
con 8.1% y en menor número la combinación a-CDe y –bcDe, con 4.1 y 1.4 %,
respectivamente (Tabla 5).
31
Tabla 4. Distribución de las clonas de C. albicans aisladas de pacientes con VIH, según
resistotipo.
Resistotipo Frecuencia Porcentaje
ABCDE 70 47.0
A-CDE 37 24.9
--CDE 14 9.4
-BCDE 13 8.7
aBCDE 5 3.4
AB-DE 2 1.3
abCDE 2 1.3
-BC-- 2 1.3
--C-- 2 1.3
a-CDE 1 0.7
--C-E 1 0.7
Total 149 100.0
Tabla 5. Distribución de las clonas de C. albicans aisladas de pacientes sanos, según
resistotipo.
Resistotipo Frecuencia Porcentaje
--CDE 48 64.8
-bCDE 8 10.8
---DE 6 8.1
-b-d- 4 5.4
--cDE 4 5.4
a-CDe 3 4.1
-bcDe 1 1.4
Total 74 100.0
32
Con este ensayo, se logró determinar que 20 pacientes con VIH y uno sin VIH tuvieron
clonas con dos perfiles de resistotipo diferentes. El resto de los pacientes presentaron
clonas con un mismo resistotipo (Figuras 1 y 2).
Figura 1. Determinación del resistotipo de cepas de C. albicans aisladas de pacientes con VIH, en ADS con cetrimida, se observa un crecimiento confluente de todas las cepas.
Figura 2. Determinación del resistotipo de cepas de C. albicans aisladas de pacientes sanos, en ADS con selenito de sodio, se observa un crecimiento confluente e inhibición de las clonas.
33
Perfil de resistencia a los antifúngicos
Se seleccionaron 2 clonas de C. albicans por paciente, por lo que se estudiaron 110 clonas
de pacientes seropositivos al VIH y 74 de los sujetos sanos.
De las 110 clonas analizadas correspondientes a los pacientes seropositivos al VIH,
solamente 1 (0.9%) fue resistente al FLU, con una CMI ≥ 64 µg/ml. Las otras 109 (99.1%)
cepas fueron sensibles a FLU, con una CMI ≤ 8 µg/ml. El antifúngico itraconazol presentó
el mayor porcentaje de resistencia con 1.8% y sensibilidad intermedia con 9.9% para las
clonas aisladas de sujetos con VIH y 8.1% para las clonas aisladas de sujetos sanos (Tabla
6).
Tabla 6. Distribución del perfil de resistencia a 6 antifúngicos de 184 clonas de C. albicans,
110 de sujetos con VIH y 74 de sujetos sanos.
Antifúngico Pacientes Perfil de sensibilidad
Sensible Intermedia Resistente
Fluconazol Con VIH 109 (99.1%) 0 (0.0%) 1 (0.9%)
Sanos 74 (100.0%) 0 (0.0%) 0 (0.0%)
5-Fluorocitocina Con VIH 109 (99.1%) 1 (0.9%) 0 (0.0%)
Sanos 73 (98.6%) 0 (0.0%) 1 (1.4%)
Anfotericina B Con VIH 109 (99.1%) 0 (0.0%) 1 (0.9%)
Sanos 74 (100.0%) 0 (0.0%) 0 (0.0%)
Ketoconazol Con VIH 106 (96.4%) 3 (2.7%) 1 (0.9%)
Sanos 74 (100.0%) 0 (0.0%) 0 (0.0%)
Itraconazol Con VIH 97 (88.3%) 11 (9.9%) 2 (1.8%)
Sanos 68 (91.9%) 6 (8.1%) 0 (0.0%)
Miconazol Con VIH 109 (99.1%) 1 (0.9%) 0 (0.0%)
Sanos 74 (100.0%) 0 (0.0%) 0 (0.0%)
34
Con respecto a las clonas de pacientes sanos, según su historia médica, ninguno padecía
diabetes o enfermedad que afectara el sistema inmunológico; los pacientes presentaban
un buen estado de salud, además de que ninguno había recibido terapia con fluconazol. El
análisis de las cepas pertenecientes a estos pacientes dio un índice de sensibilidad al
fluconazol del 100.0%, con una CMI ≤ 8 µg/ml. Cabe hacer mención que la clona resistente
a fluconazol, también presentó resistencia a itraconazol y sensibilidad intermedia a
ketoconazol. 5 clonas presentaron resistencia dos antifúngicos, llamando la atención una
con resistencia a itraconazol y anfotericina B y otra con resistencia a itraconazol y
ketoconazol.
Pruebas genotípicas
Selección de clonas
Una vez obtenidos los resistotipos de las clonas de C. albicans como una manera de
establecer diferencias fenotípicas que permitieran identificar clonas diferentes dentro de
un mismo paciente, se procedió a la selección de clonas para el análisis de PFGE y por lo
tanto, comprobación de especie por el método de PCR. Se tomó una clona en aquellos
pacientes que tuvieron el mismo perfil de resistotipo y más de una clona, en aquellos
pacientes que hayan presentado resistotipos diferentes.
Al realizar el perfil de resistotipos, se encontró que de los 55 pacientes con VIH, positivos a
C. albicans, 20 presentaron más de un resistotipo, por lo cual, se seleccionaron 75 clonas
para realizar las siguiente pruebas genotípicas (Tabla 7).
En el caso de los pacientes sanos, de los 37 positivos a C. albicans, un solo paciente
presentó mezcla de dos clonas diferentes, por lo que se decidió seleccionar a 38 clonas,
con base en los mismos criterios utilizados para los pacientes portadores de VIH (Tabla 7).
35
Tabla 7. Criterios para selección de clonas para análisis genotípicos.
Pacientes Frecuencia de
C. albicans Cultivos con
resistotipos diferentes Número de clonas
seleccionadas
Con VIH 55 20 75
Sin VIH (Sanos) 37 1 38
Total 92 21 113
Resultados de PCR
De las 113 cepas seleccionadas, se encontró que 100%, fueron confirmadas como C.
albicans. Cabe mencionar que una cepa previamente identificada como C. dubliniensis por
métodos tradicionales, fue confirmada por PCR.
En la figura 3, se presenta un gel de corrimiento, donde se puede observar la presencia de
una banda de 610 pb, específica para el género Candida, asimismo, se puede observar la
presencia de una banda de 175 pb específica para la especie de C. albicans y una de 288 pb
para C. dubliniensis.
Figura 3. Electroforesis representativa de la Identificación de especies de Candida por PCR múltiple, MPM (Marcador de Peso Molecular 100bp), CNeg (Control Negativo), CaR (C. albicans de
36
Referencia), CdR (Candida dubliniensis de Referencia), líneas 1-7 clonas de C. albicans y línea 8 C.
dubliniensis
Cariotipos por PFGE
Para la determinación de cariotipos se seleccionaron las cepas descritas en la Tabla 7.
Se encontró en el presente estudio, que el grupo de pacientes con VIH, presentó 7
cariotipos diferentes, en comparación con el grupo de pacientes sanos, donde se
encontraron 4. El cariotipo A se encontró en el 79.6% (90/113) de las clonas estudiadas,
siendo este cariotipo el más frecuente, con 78.7 y 81.5%, para los pacientes con VIH y
sanos, respectivamente (Tabla 8) (Figura 4).
Tabla 8. Frecuencia y porcentaje de cariotipos según el perfil y grupo de pacientes.
Cariotipo
Pacientes
Con VIH Sin VIH (Sano)
Frecuencia % Frecuencia %
A 59 78.7 31 81.5
B 0 0.0 3 7.9
C 3 4.0 0 0.0
D 2 2.7 2 5.3
E 1 1.3 0 0.0
F 4 5.3 2 5.3
G 1 1.3 0 0.0
H 5 6.7 0 0.0
Total 75 100.0 38 100.0
Al realizar el análisis de la diversidad de clonas en un mismo paciente, se encontró
solamente este fenómeno en 4 de los 20 (20.0%) pacientes con VIH que habían presentado
37
diferente perfil de resistograma. No se comprobó la diversidad genotípica en el único
paciente sano que habían presentado más de una clona diferente según el método de
tipificación por resistotipos.
Figura 4. Electroforesis representativa de Cariotipificación de C. albicans provenientes de pacientes con VIH. 1 Marcador de Peso Molecular S. cerevisiae. 2-6,8-15 C. albicans, 7 Control Negativo.
38
DISCUSIÓN
El presente trabajo, representa el primer estudio realizado en la región sureste de México
sobre el estudio de la epidemiología de Candida en pacientes con VIH y su comparación
con sujetos sanos.
C. albicans y sus especies asociadas se han encontrado como miembros comensales de la
microbiota oral en una relativamente gran proporción de la población sana, pero en
pacientes inmunológicamente comprometidos entre los que se incluyen a los sujetos
portadores del VIH, se han identificado por ser más susceptibles no solo a la colonización
por Candida, sino también a la infección (Campisi et al., 2002).
Los resultados encontrados son en el presente estudio ponen en evidencia la mayor
frecuencia de Candida en pacientes infectados con VIH en comparación con sujetos sanos,
52.9% y 35.2%, respectivamente. Estos datos, son similares a los reportados por otros
autores, como Campisi et al., (2002); quien al estudiar sujetos Italianos, se encontró un
porcentaje de portadores del género Candida mayor en los sujetos infectados con VIH en
comparación con sujetos sanos con 61.9% y 29.3%, respectivamente, con una p=0.003
(Campisi et al., 2002). La diferencia entre ambos grupos también ha sido reportado con un
porcentaje mayor de colonización de Candida en pacientes infectados con VIH, tal y como
lo ha reportado Patel et al. en Sudáfrica con 81.3% para pacientes con VIH y 63% para el
grupo de pacientes sanos (Patel et al., 2006). Diversos factores podrían estar relacionados
con estas diferencias entre los estudios analizados, que pudieran deberse entre otros a las
características genéticas de la población, la dieta si sobre todo se toma en cuenta que
estudios recientes han presentado que poblaciones de Nigeria presentar una mayor
colonización de Candida en comparación con poblaciones de similares en los Estados
Unidos (Patel et al., 2006). Asimismo, los métodos de aislamiento e identificación de los
microorganismos aislados pudieran influir en estas diferencias, considerando que en este
estudio se llevó a cabo la confirmación del género Candida por medio de PCR, que aunque
39
es más sensible y específico para la identificación de las levaduras, este no está disponible
para todos los laboratorios y sobre todo si estos son utilizados para pruebas rutinarias.
En México (Sanchez-Vargas et al., 2005a; Sanchez-Vargas et al., 2005b), se ha reportado
68.6 y 61.5% de portadores de Candida para pacientes infectados con VIH y con cuadro
clínico de candidiasis y en sujetos seronegativos a VIH, pero que pueden o no presentar
candidasis, respectivamente. Estos datos son mayores a los encontrados en nuestro
estudio, a pesar de que las características de los pacientes estudiados son muy similares,
estos autores, con base en los porcentajes de aislamiento en ambos grupos se puede
establecer que la localización geográfica del estudio, influye en los resultados obtenidos,
lo que al parecer demuestra que en la población sujeto de estudio de Yucatán son menos
propensos a ser colonizados por hongos del género Candida, lo que explicaría esta
diferencia entre ambos estudios.
Con relación a la frecuencia de portadores de C. albicans, diversos estudios a nivel mundial
han demostrado la presencia de portadores asintomáticos de C. albicans en pacientes
infectados con el VIH (Campisi et al., 2002; Gugnani et al., 2003). El porcentaje de C.
albicans aisladas de este grupo de pacientes del estado de Yucatán fue de 85.9%. Este
resultado se encuentra entre los valores reportados en otras partes del mundo; pero es
menor si se compara con el 93.0% de Italia (Barchiesi et al., 2002), y mayor al compararse
con el 78.6% de Sudáfrica (Patel et al., 2006) y el 73.1% en pacientes Italianos (Campisi et al.,
2002). En México, C. albicans ha sido reportada como la especie más frecuentemente en
sujetos infectados con VIH y con presencia de candidiasis con el 84.2% y el 66.7% de los
pacientes sin VIH son colonizados con C. albicans (Sanchez-Vargas et al., 2005a; Sanchez-
Vargas et al., 2005b). Estos resultados, ponen en evidencia al igual que en la mayoría de
los estudios, que C. albicans es el principal colonizados de la cavidad oral, por lo tanto,
esto se ve reflejado al momento que existen una baja en las defensas de los sujetos
portadores al convertirse en el microorganismo responsable de la CO, por lo que, los
procesos infecciosos en pacientes con VIH y SIDA, seguirán siendo primordialmente por
levaduras del género Candida, que a pesar de la diversidad geográfica, la constante de ser
40
la principal especie aislada tendrá que seguir considerándose el principal agente etiológico
de la CO.
En cuanto a la frecuencia de portadores de C. albicans en sujetos sanos, se encontró un
porcentaje de 72.9%, muy similar al 70.3% de los cultivos positivos a levaduras en pacientes
Sudafricanos sin infección por VIH (Patel et al., 2006). Aunque estos valores resultan altos
en términos de frecuencia de aislamiento, se debe aclarar que la colonización de especies
de Candida, no necesariamente desarrollaran algún proceso de Candidiasis, pero si existe
una mayor probabilidad de presentarla sobre todo si las condiciones del huésped resultan
benéficas no solo para la colonización del microorganismo sino también para su
conversión de comensal a patógeno.
Con respecto a C. dubliniensis, este es el primer reporte del aislamiento de esta especie en
México, al encontrarse una prevalencia de 0.8% en pacientes portadores de VIH, que al
igual que otros estudios, esta especie se encuentra principalmente asociada a pacientes
con VIH. En pacientes Italianos se encontró ausencia de esta especie (Campisi et al., 2002),
en Sudafricanos se encontró un porcentaje de 1.5% y 9.1% para sujetos infectados con VIH
negros y blancos, respectivamente (Blignaut et al., 2003); En Sudáfrica, Blignaut et al.
(2003), reportaron un porcentaje de portadores de C. dubliniensis en sujetos sanos
blancos de 16.4%, muy diferente a lo encontrado en nuestro estudio esta diferencia
pudiera deberse principalmente a diferencias raciales o ser el resultado de diferencias
culturales como pueden ser la dieta y el hábitat (Blignaut et al., 2003). En el mismo país,
otro estudio reportó frecuencias de aislamiento de C. dubliniensis de 6.3% para pacientes
con VIH y 4.7% para pacientes HIV negativos (Patel et al., 2006). En otro estudio de países
del Medio Oeste (Arabia Saudita, Egipto e Israel) al estudiar un grupo de pacientes con
VIH, no se encontró la presencia de C. dubliniensis (Al Mosaid et al., 2005), a diferencia de
los encontrado en nuestro trabajo.
Estudios realizados en México, no han reportado la presencia de C dubliniensis y C. krusei,
tanto para pacientes con y sin VIH, a diferencia del 0.8% de portadores de C. dubliniensis
41
encontrado en el grupo de pacientes Yucatecos portadores de VIH (Sanchez-Vargas et al.,
2005a; Sanchez-Vargas et al., 2005b)
El aislamiento de C. dubliniensis es una gran hallazgo para el presente estudio, si se
considera que han sido pocos los países Latinoamericanos que la han reportado, como en
Venezuela que se reportó por primera vez en 2006 (Brito-Gamboa et al., 2006).
Por otro lado, la única cepa de C. dubliniensis aislada, fue susceptible al fluconazol,
antifúngico que ha sido altamente asociado a la resistencia de esta especie principalmente
de aquellas aisladas de pacientes con VIH tratados con el medicamento (Polacheck et al.,
2000).
Se ha reportado que el mayor número de especies en un sujeto fue de 3, con la
combinación de C. albicans, C. glabrata y C. krusei (Campisi et al., 2002), pero un dato
importante que hay que destacar de los resultados, es el hallazgo de un paciente
seropositivo al VIH del género femenino colonizado por las cuatro especies del género
Candida. Según las bibliografías analizadas no existen reportes de tal grado de
colonización en pacientes con el VIH, pero se sugiere que las características del hospedero
juegan un papel fundamental en la determinación del estado de portador.
Esta variabilidad en la frecuencia de portadores a nivel mundial puede ser causada
principalmente por diferencias geográficas, tiempo de muestreo, pero principalmente a
las diferencias en las metodologías empleadas para el aislamiento del microorganismo
(Campisi et al., 2002).
Con relación a la presencia de resistencia a fluconazol en las cepas de C. albicans aisladas
en este grupo de pacientes, se encontró un porcentaje de resistencia de 0.9%, muy similar
a lo reportado en pacientes de Singapur con 1% (Yang et al., 2003); En Taiwan en un
estudio por tres años, se encontró una frecuencia de resistencia en C. albicans de 1.9%
(Hung et al., 2005). En nuestro país, al estudiar el porcentaje de resistencia a fluconazol de
cepas de C. albicans aisladas de pacientes con VIH, se reportó en 2005 (Sanchez-Vargas et
al., 2005a), que todas las cepas habían sido susceptibles al antifúngico, un resultado muy
42
similar a lo reportado en este trabajo con un porcentaje bajo de tan solo una cepa
resistente correspondiente al 0.9%.
Al utilizar la resistencia como marcador epidemiológico, no se pudo establecer una
diferencia entre ambos grupos de pacientes debido a la bajar proporción de cepas
resistentes al antifúngico, lo que concuerda con un estudio donde se hace una análisis de
esta característica en cepas de C. albicans, sugiriendo que la presencia de cepas resistentes
a fluconazol como parte de la microflora oral se puede observar tanto en pacientes
inmunocomprometidos y sujetos inmunocompetentes (Xu et al., 2000).
Por otro lado, la cepa resistente de C. albicans en nuestro estudio perteneció a un paciente
que no tenía historia médica de candidiasis, ni había recibido terapia antifúngica con
fluconazol, este hallazgo es similar al encontrado por Xu et al. (2000) quienes reportan
que las 2 cepas de C. albicans resistentes al fluconazol previnieron de pacientes que nunca
lo habían tomado: correspondiendo a un paciente infectado por el VIH y la otra de una
persona sana.
Por lo tanto, se concluye que la resistencia a fluconazol no representa un problema para el
tratamiento de la candidiasis en el grupo de pacientes estudiados infectados con el VIH,
asimismo, que para el estado de Yucatán, la resistencia al fluconazol no es todavía un
problema de salud. La baja frecuencia de resistencia puede deberse a que este antifúngico
no es utilizado como el de primera elección para el tratamiento de candidiasis, como se
hace en otras partes del mundo, debido principalmente a su alto costo en comparación
con el itraconazol, que es el antifúngico de primera elección utilizado comúnmente por lo
médicos de Yucatán.
Aunque Nakamura et al. (1998), al realizar el estudio de resistotipos entre cepas de C.
albicans aisladas de sujetos sanos, al hacer una comparación entre los aislamientos
provenientes de higienistas dentales y enfermeras, encontró que existieron diferencias
entre ambos grupos, no pudieron explicar este fenómeno. A diferencia del presente
estudio, Nakamura et al., lograron identificar 13 resistotipos diferentes al igual que
43
McCreight et al., que identificaron 16 diferentes, que son muy similares en número si se
comparan con los 15 resistotipos diferentes encontrados entre los dos grupos del
presente estudio. Asimismo, se encontró mayor diversidad de resistotipos en el grupo de
pacientes con VIH con 11, en comparación con el grupo sano, donde se encontraron 7
perfiles diferentes. Este hallazgo, pudiera deberse principalmente a la mayor diversidad de
cepas que pueden colonizar a los pacientes con VIH, que se encuentra en estado de
inmunodepresión y que como se ha demostrado en otros estudios como el de la
Universidad de Turín, que los cambios en los resistotipos de C. albicans aisladas de la
cavidad oral fueron significativamente recurrentes en los pacientes infectados con VIH
(Nakamura et al., 1998).
Las diferencias encontradas entre ambos grupos, pudien deberse a la presencia de
terapias antifúngicas en los pacientes con VIH. Esta diferencia se evidencia más si se
analiza que el grupo de pacientes con VIH presentó el resistotipo ABCDE en el 46.7%, que
se interpreta como resistente a todos las sustancias químicas en estudio, en comparación
con los sujetos sanos, donde no se encontró paciente alguno portador de cepas de C.
albicans con este resistotipo. Asimismo, diversos tratamientos a los que son sometidos los
pacientes con VIH pueden influir en la selección de clonas o el reemplazo de ciertos
biotipos (Nakamura et al., 1998).
Pfaller et al. (1994) al realizar un análisis de diversidad genética por medio de
electroforesis de campos pulsantes, encontraron que el 38% de los pacientes estaban
infectados con el mismo tipo genético de C. albicans, en comparación con el 62% (18 de 29
pacientes) quienes presentaron más de un tipo genético diferente, es decir, más de dos
clonas diferentes. En otro estudio, con cepas aisladas de 21 pacientes Chilenos portadores
de VIH, los autores encontraron que de los 8 pacientes con candidiasis multifocal en la
cavidad oral, 5 presentaron un mismo patrón molecular, 2 presentaron clones diferentes y
un paciente presente tres cariotipos distintos de C. albicans (González et al., 2006). En el
presente estudio, el 20% de pacientes portadores de C albicans (VIH+) presentaron 2
cariotipos distintos, siendo un porcentaje bajo con respecto a los estudios mencionados
44
anteriormente. Por otro lado, la mayor diversidad de cariotipos encontrados en los
pacientes con VIH de nuestro estudio, coincide con lo reportado por Lupetti et al. (1995).
Sin embargo, la comparación del cariotipo de mayor frecuencia encontrado en el presente
estudio, se encontró que no fue reportado dentro de la diversidad encontrada en el
estudio de Lupetti. Aunque en el presente estudio, se quiso comparar los perfiles de
cariotipos identificados con los reportados por otros autores, se llegó a la conclusión al
igual que Capoluongo et al. (2000), que al existir una compleja variabilidad genotípica es
difícil establecer patrones cariotípicos estándares, debido a la alta variabilidad de las
clonas en el mundo, por lo que son necesarios futuros estudios para llevar a cabo una
estandarización para la comparación de clonas aisladas en diversas regiones del mundo. A
pesar de esta alta variabilidad, el presente estudio logró determinar que a nivel regional,
pueden establecerse patrones cariotípicos estándares y que se comparten en diversas
poblaciones de una misma región, tal es el caso de los dos grupos de pacientes estudiados
(con y sin VIH), que compartieron el patrón “A” asignado en el presente estudio. Este
patrón “A” fue compartido entre ambos grupos con porcentajes de identificación de 78.7
y 81.5% del total de clonas estudiadas. Esta observación, sobre patrones que comparten
diferentes poblaciones de una misma región, ha sido reportada previamente en otro
estudio, al encontrar que tanto el cariotipo “b” y “c” en sujetos infectados con VIH, como
por sujetos sanos. También se ha reportado la mayor variabilidad cariotípica de sujetos
con VIH en comparación con sujetos sanos (Lupetti et al., 1995; Vargas y Joly, 2002). Solo
un estudio ha reportado que entre los pacientes con SIDA existe menor variabilidad
genética al compararse con sujetos sanos, considerando que fue utilizada una
metodología diferente a electroforesis de campos pulsantes (Schmid et al., 1992).
Por otro lado, de los 21 pacientes que se encontró con variabilidad en el perfil de
resistotipos, al ser analizados por electroforesis de campos pulsantes, se encontró que
4/21 (19.0%) presentaron clonas diferentes en un mismo paciente, lo que coincide con
otros estudios del género Candida, donde al analizar múltiples aislamiento del mismo
paciente solo el 24% presentaron diversidad genética al ser analizadas por el mismo
método (Lin et al., 2007).
45
Aunque la cariotipificación de C. albicans permitió establecer diferencias entre ambos
grupos de estudio, es necesario llevar a cabo estudios más profundos que permitan
establecer si estas diferencias tienen asociación entre la patogenicidad del
microorganismo y el estado de inmunosupresión del paciente, sobre todo, si como
sugieren algunos autores, existe el reemplazo de cepas en los pacientes infectados con
VIH (Lupetti et al., 1995; Samaranayake et al., 2003). Esto propiciaría un aumento en el
cambio (switching) fenotípico e incremento en los niveles de secresión de proteinasas que
ha sido reportada en mayor medida en los pacientes con candidiasis que en los
aislamientos comensales (Schmid et al, 1995), y también, a que estas mutantes pueden ser
altamente adaptables a las variaciones de las condiciones de los hospederos
(Samaranayake et al., 2003).
En el presente trabajo se encontraron diferencias entre ambos grupos al ser comparados
por resisto y cariotipificación, lo que contribuye a dilucidar la discrepancia entre diversos
grupos de estudio de C. albicans entre pacientes portadores de VIH y sanos, al considerar
similitud entre las clonas de ambos grupos (Schmid et al., 1992; Woldeamanuel y Abate,
1998; Lin et al., 2007) y la variabilidad reportada por otros autores (Lupetti et al., 1995;
Vargas y Joly, 2002).
Los hallazgos encontrados en el presente estudio, permitieron establecer diferencias
fenotípicas y genotípicas entre ambos grupos, pero no se logró demostrar una clara
asociación entre ellas que permitan establecer un resultado definitivo.
46
CONCLUSIONES
1. Se encontró una mayor frecuencia de portadores de C. albicans en pacientes con
VIH al compararlo con pacientes sanos.
2. Se reporta el primer aislamiento de C. dubliniensis en México, confirmado por PCR.
3. Se encontró mayor diversidad de clonas en pacientes con VIH al compararse con
los pacientes sanos, con 11 y 7 resistotipos diferentes, respectivamente.
4. Se encontró un porcentaje muy bajo de resistencia a fluconazol y más alto para
itraconazol.
5. Se encontró mayor diversidad genética por electroforesis de campos pulsantes
entre pacientes con VIH, al encontrar 7 y 4 perfiles cariotipicos para los pacientes
con VIH y sanos, respectivamente.
6. El grupo de pacientes con VIH, presentaron diversidad genética entre clonas
aisladas del mismo sujeto, en comparación con el grupo de pacientes sanos, que no
presentó clonas mixtas al ser caracterizadas por electroforesis de campos
pulsantes.
47
APORTACIONES Y PERSPECTIVAS
El presente trabajo representa los primeros datos sobre el porcentaje de colonización de
Candida en sujetos del estado de Yucatán, que en conjunto con el conocimiento del perfil
de resistencia a los antifúngicos permitirá establecer pautas clínicas para el tratamiento de
estos microorganismos.
También, permitió establecer a la técnica de PCR como un método de diagnóstico
disponible a la población en general para la identificación certera de las especies de
Candida y orientar al médico para su toma de decisiones.
Se visualiza como perspectivas de desarrollo estudios más amplios que busquen la posible
asociación entre los factores predisponentes del huésped y la conversión del hongo de
comensal a patógeno. Con los datos obtenidos, se conoce ya la diversidad fenotípica y
genotípica de C. albicans en nuestro medio, lo que en un futuro podría servir como base
para estudios que busquen la diseminación clonal del microorganismo en medios
hospitalarios o comunitarios de Yucatán. Estos proyectos podrían incorporarse como
trabajos de investigación dentro de las líneas de generación y aplicación del conocimiento
de la Facultad de Odontología y/o otras dependencias de la UADY.
48
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Anexo B. Carta de aprobación del Comité Asesor de Investigación.
