UNIVERSIDAD DE SALAMANCA - Repositorio Digital...

UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA

ÁREA DE GENÉTICA

TESIS DOCTORAL

Funciones fisiológicas de la detoxificación del óxido nítrico en

Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli:

El papel de las flavohemoglobinas

Eduardo Enrique Argotti Valencia

Salamanca, 2016

UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA

ÁREA DE GENÉTICA

Funciones fisiológicas de la detoxificación del óxido nítrico (NO)

en Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli:

El papel de las flavohemoglobinas

Tesis Doctoral

Programa de Doctorado: Agrobiotecnología

Órgano responsable del Programa de Doctorado:

Departamento de Microbiología y Genética


Salamanca, 2016

D. Luis Román Fernández Lago, Director del Departamento de Microbiología y Genética de la Facultad de Biología de la Universidad de Salamanca.

CERTIFICO: Que la presente Memoria titulada “Funciones fisiológicas de la detoxificación

del óxido nítrico en Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli: El papel de las

flavohemoglobinas”, ha sido realizada en el Área de Genética del Departamento

de Microbiología y Genética y en el Instituto Hispano-Luso de Investigaciones

Agrarias de la Universidad de Salamanca por D. Eduardo Enrique Argotti

Valencia, bajo la dirección de los doctores Prof. Dr. Ernesto Pérez Benito y Prof.

Dr. José María Díaz Mínguez y cumple las condiciones exigidas para optar al grado

de Doctor por la Universidad de Salamanca.

Para que así conste, firmo el presente certificado en Salamanca a 12 de abril de

2016.

Fdo: D. Luis Román Fernández Lago

Dr. D. Ernesto Pérez Benito y Dr. D. José María Díaz Mínguez, Profesores Titulares del Área de Genética del Departamento de Microbiología y Genética de la Universidad de Salamanca

CERTIFICAMOS: Que la presente Memoria titulada “Funciones fisiológicas de la detoxificación

del óxido nítrico en Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli: El papel de las

flavohemoglobinas”, ha sido realizada en el Área de Genética del Departamento

de Microbiología y Genética y en el Instituto Hispano-Luso de Investigaciones

Agrarias de la Universidad de Salamanca, bajo nuestra dirección, por D. Eduardo

Enrique Argotti Valencia, y cumple las condiciones exigidas para optar al grado

de Doctor por la Universidad de Salamanca.

Y para que así conste, extendemos el presente certificado en Salamanca a 12 de

abril de 2016.

Fdo: Dr. D. Ernesto Pérez Benito Fdo: Dr. D. José María Díaz Mínguez

Este trabajo se ha llevado a cabo en el Laboratorio 1 del Instituto Hispano-Luso de Investigaciones Agrarias (CIALE), Departamento de Microbiología y Genética, de la Universidad de Salamanca, bajo la dirección de los Profesores Dr. Ernesto Pérez Benito y Dr. José María Díaz Mínguez. Su ejecución ha sido posible gracias a la financiación de los proyectos AGL2012-39876-C02 y AGL2015-66131-C2-1-R (Ministerio de Economía y Competitividad). Durante el desarrollo de la Tesis, he disfrutado de una beca de la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación del Ecuador

(SENESCYT).

AGRADECIMIENTOS

La presente Tesis Doctoral ha requerido un gran esfuerzo y una intensa dedicación sin la

cual no hubiese sido posible su elaboración y la cooperación de todas y cada una de las

personas e instituciones que a continuación citaré y muchas de las cuales han sido un

soporte muy fuerte en los momentos más duros y difíciles.

En primer lugar quiero agradecer al Gobierno del Ecuador, a la Secretaria de Educación

Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación (SENESCYT), por concederme esta beca para

cursar estudios de Doctorado y hacer realidad este sueño que parecía inalcanzable.

A mis Tutores, Dr. Ernesto Pérez Benito y Dr. José María Díaz Mínguez, por haberme

aceptado en su grupo de investigación y haber confiado en mí, por brindarme su constante

apoyo y ayuda en los momentos que más he necesitado; sin su implicación, orientación y

supervisión en el día a día, así como en la redacción del presente manuscrito, esta

investigación no hubiese tenido lugar.

A todos los que son y han sido mis compañeros de laboratorio, con los que tantos días he

compartido: Walter Vargas, Vega Tello, Daniela Santander, Virginia Casado, Jonathan

Niño, José María Sanz, Raúl Martin y Wilson Acosta.

A mis suegros por su constante apoyo para que no desmaye durante estos cuatro años de

intenso trabajo y dedicación.

A mí madre por su constante apoyo a la distancia y siempre convencida de que tengo la

suficiente capacidad para llegar a donde yo quiera y vencer todos los obstáculos que se

presentan a diario.

A mí querida esposa, mi compañera, mi apoyo, mi fortaleza, cómplice de mis triunfos y que

jamás se ha opuesto a mis caprichos y objetivos que me he propuesto.

A mis hijos Kevin y Karen la razón de mi vida.


A mí Dios.

Por su infinito amor

ÍNDICES

Índice

I

ÍNDICE

ÍNDICES

3.5. ÍNDICE I

3.6. ÍNDICE DE FIGURAS IX

3.7. ÍNDICE DE TABLAS XV

3.8. SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS XVII

RESUMEN XIX

1 INTRODUCCIÓN 1

1.1 Hongos fitopatógenos. 1

1.2 El género Fusarium. 1

1.2.1 Morfología. 2

1.2.2 Taxonomía del género Fusarium.

2

1.2.3 Especies anamórficas y teleomórficas del género Fusarium.

4

1.3. 1.1.1.1.1 El complejo de especies Fusarium oxysporum.

5

1.3.1 Descripción y características taxonómicas.

5

1.3.1.1 Morfología. 7

1.3.1.2 Ciclo de vida. 7

1.3.1.3 Capacidad infectiva: la fusariosis vascular

8

1.3.1.4. Genes esenciales en patogenicidad y virulencia de

F. oxysporum.

10

1.4 Genómica de F. oxysporum: genoma nuclear y genoma adaptativo,

expansiones génicas.

13

1.5 F. oxysporum f. sp. phaseoli.

14

1.5.1 Sintomatología y clasificación.

15

1.5.2 La importancia del cultivo de la judía.

15

1.6 El óxido nítrico.

17

1.6.1 Descripción

17

1.6.2 Funciones fisiológicas del NO.

18

1.6.2.1 Síntesis de NO en animales, plantas y hongos.

19

1.6.2.2 Óxido nítrico en la interacción planta-patógeno.

21

1.6.3 Fuentes de nitrógeno utilizadas por los hongos.

22

1.6.4 La denitrificación del nitrato en procariotas. 24

Papel de las flavohemoglobinas en F. oxysporum

II

1.6.5 Desnitrificación y producción de NO en F. oxysporum.

25

1.7 Las flavohemoglobinas.

26

1.7.1 Origen de las flavohemoglobinas.

27

1.7.2 Estructura de las flavohemoglobinas 27

1.7.3 Funciones de las flavohemoglobinas.

28

1.7.3.1 Respuesta de las flavohemoglobinas al estrés

nitrosativo y oxidativo.

28

1.7.3.2 Papel de las flavohemoglobinas en patogenicidad. 31

1.7.3.3 Papel de las flavohemoglobinas en la regulación del

desarrollo.

32

OBJETIVOS 35

2 MATERIALES Y MÉTODOS 37

2.1 Organismos. 37

2.1.1 Plantas. 37

2.1.2 Hongos. 37

2.1.3 Bacterias. 38

2.2 Medios de cultivo. 39

2.2.1 Plantas. 39

2.2.2 Hongos. 39

2.2.2.1 Cultivo en medio sólido de F. oxysporum. 39

2.2.2.2 Cultivo en medio líquido de F. oxysporum. 40

2.2.2.3 Obtención de cultivos monospóricos. 40

2.2.3 Bacterias 41

2.2.3.1 Cultivo de E. coli DHα5. 41

2.2.3.2 Cultivo de A. tumefaciens cepa AGL-1. 41

2.3 Ensayos de germinación. 42

2.3.1 Obtención de microconidios de F. oxysporum. 42

2.3.2 Cultivo estático de F. oxysporum. 43

2.4 Ensayos de crecimiento saprofítico. 43

2.4.1 Ensayos de sensibilidad a estrés nitrosativo. 43

2.5 Ensayos de infección in planta. 44

2.5.1 Ensayos de infección en invernadero. 44

2.5.2 Ensayos de infección en medio de cultivo hidropónico. 45

2.6 Extracción de ácidos nucleicos. 45

Índice

III

2.6.1 ADN genómico de F. oxysporum. 45

2.6.1.1 1.1.1.1.1.1 Método “TENSP”. 46

2.6.1.2 1.1.1.1.1.2 Método CTAB. 47

2.6.1.3 Extracción de ADN genómico mediante método

rápido.

47

2.6.2 Extracción de ADN plasmídico. 48

2.6.2.1 Minipreparación de ADN plasmídico mediante lisis

alcalina.

48

2.6.2.2 Minipreparación de ADN plasmídico con el kit

comercial NucleoSpin®Plasmid.

48

2.6.2.3 Preparación de grandes cantidades de ADN de

plásmidos de reducido número de copia.

49

2.6.3 Tratamientos enzimáticos del ADN. 50

2.6.3.1 Tratamiento con RNAsa A. 50

2.6.3.2 Digestión con enzimas de restricción. 51

2.6.3.3 Ligaciones. 51

2.6.3.4 Defosforilación con fosfatasa alcalina (CIEF). 51

2.6.4 Obtención de ARN total de F. oxysporum. 52

2.6.4.1 Método Trizol. 52

2.6.4.2 Obtención de ARN con el kit comercial SV Total

RNA Isolation System (Promega).

53

2.6.4.3 Tratamiento de ARN con DNAasa. 54

2.6.4.4 Cuantificación de ácidos nucleicos. 54

2.7 Electroforesis de ácidos nucleicos. 54

2.7.1 Electroforesis de ADN. 54

2.7.2 Electroforesis de ARN. 55

2.7.3 Purificación de fragmentos de ADN de geles de agarosa. 55

2.8 Vectores de clonación. 56

2.8.1 Vector de clonación pGEM-T Easy. 56

2.8.2 Vector de clonación pRF-HU2. 56

2.8.3 Vector de clonación pEA-FU. 58

2.8.4 Vector de silenciamiento pVIR-RNAi. 59

2.9 Transformaciones. 60

2.9.1 Preparación de células competentes de E. coli. 60


IV

2.9.2 Digestión de los vectores de clonación PRF-HU2, pVIR-RNAi

y pEA-FU.

61

2.9.3 Ensayos de clonación con el sistema “USER Friendly Cloning”. 62

2.9.3.1 Diseño de oligonucleótidos con un adaptador de

uridina.

62

2.9.3.2 Amplificación de las regiones flanqueantes. 62

2.9.3.3 Reacción de ligación con USER Friendly Cloning. 63

2.9.4 Transformación de E. coli. 63

2.9.5 Transformación de A. tumefaciens. 63

2.9.5.1 Preparación de células competentes. 63

2.9.5.2 Electroporación de A. tumefaciens. 64

2.9.5.3 Transformación de F. oxysporum mediada por A.

tumefaciens (ATM).

64

2.9.5.4 Ensayo de cocultivo de A. tumefaciens con F.

oxysporum.

65

2.9.5.5 Identificación de transformantes. 65

2.10

.

Construcción de mutantes dobles. 66

2.10.1 Silenciamiento genético. 66

2.11

.

Complementación de genes. 66

2.12

.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 67

2.12.1 PCR estándar. 67

2.12.2 RT-PCR. 68

2.12.3 PCR en Tiempo Real. 68

2.12.4 Secuenciación. 69

2.12.5 Oligonucleótidos utilizados en este trabajo. 70

2.13

.

Hibridación de ácidos nucleicos. 72

2.13.1 Marcaje de sondas. 72

2.13.2 Hibridación Southern blot. 73

2.13.3 Hibridación Northern blot. 75

2.14

.

Microscopía. 76

2.14.3 Microscopía óptica. 76

2.15

.

Análisis de datos. 76

2.15.1 Diseño de oligonucleótidos. 76

2.15.2 Diseño de plásmidos. 76

Índice

V

2.15.3 Alineamiento de secuencias. 76

2.15.4 Búsqueda y comparación de secuencias. 77

2.15.5 Diseño de árboles filogenéticos. 77

2.15.6 Búsqueda de secuencias de F. oxysporum. 77

2.15.7 Cuantificación de ADN y ARN. 77

2.15.8 Edición de texto y tablas. 77

2.15.9 Análisis estadístico. 78

3 RESULTADOS 79

3.1 Identificación de los genes codificadores de enzimas tipo

flavohemoglobina de F. oxysporum f. sp. phaseoli.

79

3.1.1 Análisis de las bases de datos de secuencias de genomas de

Fusarium.

79

3.1.2 Detección mediante PCR de genes codificadores de enzimas

de tipo flavohemoglobina de F. oxysporum f. sp. phaseoli.

80

3.1.3 Caracterización del entorno genómico de los genes

codificadores de flavohemoglobinas de F. oxysporum f. sp.

phaseoli.

83

3.2 Análisis estructural de los genes codificadores de flavohemoglobinas

de F. oxysporum f. sp. phaseoli.

85

3.2.1 Secuencia de los genes FHG de F. oxysporum f. sp. phaseoli. 86

3.2.1.1 Gen FHG1 de FOP-SP1. 86




3.2.2 Análisis de la región codificante de los genes FHG 90

3.2.3 Análisis de las regiones promotora y terminadora de los genes

FHG.

91

3.3 Análisis de las proteínas deducidas codificadas por los genes FHG1,

FHG2, FHG3 y FHG4.

94

3.3.1 Dominios funcionales de las proteínas FHG. 94

3.3.2 Localización subcelular de las proteínas FHG. 99

3.4 Análisis filogenético de los genes codificadores de flavohemoglobinas. 101

3.5 Análisis de expresión de los genes FHG. 104

3.5.1 Condiciones para el análisis durante el crecimiento saprofítico

y en respuesta a NO.

104


VI

3.5.2 Análisis de expresión de los genes FHG durante el

crecimiento saprofítico y en respuesta a NO.

107

3.5.2.1 3.8.2.1. Expresión de FHG1. 108

3.5.2.2 3.8.2.2. Expresión de FHG2. 109

3.5.2.3 3.8.2.3. Expresión de FHG3. 110

3.5.2.4 3.8.2.4. Expresión de FHG4. 112

3.5.3 Análisis de expresión de los genes FHG en plantas de judía

infectadas con estirpes de F. oxysporum f. sp. phaseoli.

112

3.5.3.1 Análisis de expresión de los genes FHG en plantas

de judía infectadas con FOP-SP1.

114

3.5.3.2 Análisis de expresión de los genes FHG en plantas

de judía infectadas con FOP-SP4.

115

3.6 3.5. Análisis funcional de los genes tipo flavohemoglobina. 117

3.6.1 Construcción de los vectores de transformación. 117

3.6.2 3.5.2. Transformación de A. tumefaciens. 120

3.6.3 3.5.3. Transformación de F. oxysporum de f. sp. phaseoli mediada

por A. tumefaciens.

121

3.6.4 3.5.4. Identificación de mutantes por reemplazamiento génico de F.

oxysporum f. sp. phaseoli.

121

3.6.4.1 3.5.4.1. Identificación de transformantes del gen FHG1. 123




3.7 Análisis mediante hibridación Southern de los transformantes de F.


131

3.7.1 Análisis de los mutantes en el gen FHG1. 132




3.8 3.6. Caracterización fisiológica de los mutantes FHG. 138

3.8.1 Análisis de la capacidad de crecimiento saprofítico y de la

sensibilidad a estrés nitrosativo de los mutantes ∆FHG.

139

3.8.1.1 Análisis de mutantes ΔFHG de FOP-SP1. 140

3.8.1.2 Análisis de mutantes ΔFHG de FOP-SP4. 143

3.8.2 3.6.2. Análisis de germinación de microconidios de mutantes ΔFHG. 146

pRF-HU2-FHG1

Alelo WT FHG1

Alelo mutante

pRF-HU2-FHG1

Alelo WT FHG1

Índice

VII

3.8.2.1 3.6.2.1. Análisis de germinación de microconidios de

mutantes ΔFHG de FOP-SP1.

147

3.8.2.2 3.6.2.2. Análisis de germinación de microconidios de

mutantes ΔFHG de FOP-SP4.

150

3.8.3 3.6.3. Ensayos de infección in planta con los mutantes ΔFHG. 153

3.9 3.7. Ensayos de complementación de la mutación ΔFHG1. 155

3.9.1 Construcción del vector de complementación. 156


3.9.3 3.7.2.1. Transformación de mutantes ∆FHG1 de FOP-SP1 y FOP-

SP4.

157

3.9.4 Identificación de transformantes que han incorporado la

construcción de complementación.

157

3.9.5 Análisis fenotípico de los mutantes portadores de la

construcción de complementación de la mutación ΔFHG1.

160

3.10

.

3.8. Obtención y caracterización de dobles mutantes ΔFHG2-FHG1RNAi. 163

3.10.1 Construcción del vector de silenciamiento. 164


3.10.3 3.8.2.1. Transformación de mutantes ∆FHG2 con el vector de

silenciamiento pVIR-RNAi-FHG1.

165

3.8.2.2. 3.10.3.1 3.8.2.3. Identificación y selección de transformantes

ΔFHG2-FHG1RNAi.

166

3.8.2.4. 3.10.3.2 3.8.2.5. Análisis fenotípico de los dobles mutantes ΔFHG2-

FHG1RNAi.

169

3.8.2.6. 3.10.3.3 3.8.2.7. Ensayos de infección in planta con los dobles

mutantes ∆FHG2-FHG1RNAi.

174

4 DISCUSIÓN 177

4.1 Relaciones filogenéticas de los genes FHG de FOP. 177

4.2 Análisis de expresión y funcional de los genes de FHG. 179

4.3 3.9. Los genes FHG de FOP muestran patrones de expresión diferenciales. 180

4.4 Los genes FHG1 y FHG2 confieren resistencia a estrés nitrosativo. 185

4.5 3.9.2.1. El papel de FHG1 y FHG2 en la detoxificación de NO evidencia una

función del NO sobre germinación.

188

4.6 3.9.2.2. El papel del NO y de las flavohemoglobinas en diferenciación y

desarrollo.

190

4.7 El papel de los genes FHG durante la interacción con el huésped. 193

5 CONCLUSIONES 195

6 BIBLIOGRAFÍA 197


VIII

Índice

IX

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Ciclo de vida de F. oxysporum (Beckman, 1987).

8

Figura 2. Estructura tridimensional de la proteína flavohemoglobina de E.

coli.

28

Figura 3. Mapa circular del Plásmido pGEM-T easy.

56

Figura 4. Mapa circular del Plásmido PRF-HU2 y estrategia de clonación.

57

Figura 5. Mapa de construcción del plásmido pEA-FU utilizado para

complementación.

58

Figura 6. Mapa circular del plásmido pVIR-RNAi utilizado para

silenciamiento genético.

60

Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación

por PCR de secuencias derivadas de la región codificante de los

genes codificadores de proteínas de tipo flavohemoglobina

utilizando ADN genómico de F. oxysporun f. sp. phaseoli.

82

Figura 8. Análisis tipo Southern de los genes codificadores de enzimas

flavohemoglobina en las diferentes estirpes de F. oxysporum f. sp.

phaseoli.

84

Figura 9. Secuencia de nucleótidos del gen FHG1 y de la secuencia de

aminoácidos de la proteína deducida.

86



87

Figura 11 Secuencia de nucleótidos del gen FHG3 y de la secuencia de


88



89

Figura 13. Alineamiento de secuencias de las proteínas tipo

flavohemoglobina de FOP-SP1.

95

Figura 14. Dominios funcionales característicos de las proteínas de tipo

flavohemoglobina, y sus posiciones relativas, identificados en las

proteínas deducidas codificadas por los genes tipo

flavohemoglobina de FOP-SP1.

96


X

Figura 15. Dominios globina identificados en proteínas representativas con el

programa CCD semejantes al dominio globina presente en la

proteína codificada por el gen FHG1.

98

Figura 16. Dominios oxidoreductasa FAD (FAD_binding_ 6) identificados en

proteínas representativas con el programa CCD semejantes al

dominio oxidoreductasa FAD (FAD_binding_ 6) presente en la


98

Figura 17. Dominio oxidoreductasa NAD (NAD_binding_ 1) identificados en

proteínas representativas con el programa CCD semejantes al

dominio oxidoreductasa NAD (NAD_binding_ 1) presente en la


99

Figura 18. Árbol filogénetico de las proteínas de tipo flavohemoglobina.

102

Figura 19. Germinación de microconidios de FOP-SP1 en medio mínimo con

1% de glucosa (MMG) y MMG suplementado con 10 mM de

tartrato de amonio (MMG+A) o 10 mM de nitrato de sodio

(MMG+N).

105

Figura 20. Germinación de microconidios de FOP-SP4 en medio mínimo

suplementado con 1% de glucosa (MMG) o en MMG

suplementado con 10 mM de tartrato de amonio (MMG+A) o 10

mM de nitrato de sodio (MMG+N).

106

Figura 21. Análisis de expresión del gen FHG1 de las estirpes FOP-SP1 y

FOP-SP4.

108


FOP-SP4.

110


FOP-SP4.

111


FOP-SP4.

112

Figura 25. Análisis de expresión in planta mediante RT-qPCR de los genes

FHG de FOP-SP1.

115

Figura 26. Análisis de expresión in planta mediante RT-qPCR de los genes

FHG de FOP-SP4.

116

Figura 27. Productos de PCR obtenidos a partir de ADN genómico de FOP-

SP1 de las regiones flanqueantes 5´ y 3´ de los genes FHG.

119

Índice

XI

Figura 28. Mapa de restricción de los plásmidos construidos a partir del

plásmido PRF-HU2 para el reemplazamiento génico de los genes

FHG de FOP-SP1 y FOP-SP4.

120

Figura 29. Estrategia de reemplazamiento génico del gen FHG1 de FOP-SP1

y FOP-SP4.

123

Figura 30. Productos de PCR obtenidos en reacciones de PCR llevadas a

cabo con los oligonucleótidos FHG1-KN-FW y HphBC (5’) y RHG1-

KN-RV y HphAC (3’) utilizando como molde ADN genómico de los

transformantes obtenidos con el plásmido pRF-HU2-FHG1.

124


y FOP-SP4.

125





126


y FOP-SP4.

127





128


y FOP-SP4.

129


cabo con los oligonucleótidos FHG4-KN-FW y (5’) y RHG4-KN-RV

y HphAC (3’) utilizando como molde ADN genómico de los


130

Figura 37. Análisis mediante hibridación tipo Southern de los transformantes

en los que se ha determinado mediante PCR la ocurrencia de dos

eventos de recombinación homóloga en las regiones 5’ y 3’

flanqueantes del gen FHG1 en las estirpes FOP-SP1 y FOP-SP4.

133





134


XII





136





137

Figura 41. Crecimiento radial de las cepas mutantes de los genes FHG de

FOP-SP1 y de la misma cepa control FOP-SP1 evaluados a los 5

días de crecimiento saprofitico.

142

Figura 42. Porcentajes de reducción del diámetro de la colonia de las cepas

mutantes ∆FHG de FOP-SP1.

143

Figura 43. Crecimiento radial de las cepas mutantes de los genes FHG de

FOP-SP4 y de la cepa control FOP-SP4 evaluados a los 5 días de

crecimiento saprofitico.

145

Figura 44. Porcentajes de reducción del diámetro de la colonia de las cepas

mutantes ∆FHG de FOP-SP4.

146

Figura 45. Efecto de NO en la germinación de microconidios de los mutantes

de los genes de FHG de SP1 y de la propia cepa SP1, evaluadas

a las 10 horas de cultivo.

149

Figura 46. Porcentajes de reducción de la germinación de microconidios de

las cepas mutantes ∆FHG de FOP-SP1.

150

Figura 47. Efecto del NO en la germinación de microconidios de los mutantes

de los genes de FHG de SP4 y de la propia cepa SP4, evaluadas

a las 10 horas de cultivo.

151

Figura 48. Porcentajes de reducción de la germinación de microconidios de

las cepas mutantes ∆FHG de FOP-SP4.

152

Figura 49. Evaluación de la agresividad de los mutantes ∆FHG de FOP-SP1

y FOP-SP4.

155

Figura 50. Mapa de restricción del plásmido pEA-FU-FHG1 utilizado para la

complementación de la mutación ΔFHG1.

157

Índice

XIII

Figura 51. Identificación de los transformantes de las cepas SP1-ΔFHG1-131

y SP4-ΔFHG1-244 que han incorporado el gen FHG1 mediante

transformación con el plásmido pEA-FU-FHG1.

159

Figura 52. Evaluación de la sensibilidad a estrés nitrosativo de los mutantes

complementados SP1-ΔFHG1-131-C1 y SP4-ΔFHG1-244-C1

cultivados en MMG+A y MMG+N en ausencia y en presencia del

donador de NO SNP (500 µM).

161

Figura 53. Evaluación de la eficiencia de germinación de microconidios de los

mutantes complementados SP1-ΔFHG1-131-C1 y SP4-ΔFHG1-

244-C1 cultivados en MMG+A y MMG+N en ausencia y en

presencia del donador de NO DETA (250 µM) tomados a las 10

horas de cultivo.

162

Figura 54. Producto de PCR amplificado a partir de ADN genómico de FOP-

SP1 con los cebadores Sil-FHG1-FW y Sil-FHG1-RV.

164

Figura 55. Mapa de restricción del plásmido pVIR-RNAi-FHG1 utilizado para

silenciamiento del gen FHG1.

165

Figura 56. Expresión relativa del gen FHG1 en los transformantes

seleccionados obtenidos con el plásmido pVIR-RNAi-FHG1 sobre

fondo genético de los mutantes SP1-∆FHG2-51 y SP4-∆FHG2-

314.

167

Figura 57. Caracterización molecular de los transformantes SP1-ΔFHG2-51 y

SP4-ΔFHG2-314 seleccionados en los experimentos de

transformación llevados a cabo con el plásmido de silenciamiento

pVIR-RNAi-FHG1.

169

Figura 58. Evaluación del crecimiento saprofitico de mutantes ΔFHG2 en los

que se ha silenciado el gen FHG1.

174

Figura 59. Cuantificación de la germinación de microconidios de mutantes

ΔFHG2 en los que se ha silenciado el gen FHG1.

173

Figura 60. Ensayos de infección sobre la variedad de judía Blanca Riñón con

estirpes de F. oxysporum f. sp. phaseoli.

175


XIV

Índice

XV

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Grupo representativo de formas especiales del complejo de

especies de F. oxysporum.

6

Tabla 2. Genes de patogenicidad y virulencia identificados en F. oxysporum

(tomado de Michielse and Rep, 2009).

11

Tabla 3. Estirpes representativas de F. oxysporum f. sp. phaseoli aislados de

cultivos de judía de la comarca de “El Barco de Ávila”.

17

Tabla 4. Estirpes silvestres y transformantes de F. oxysporum utilizadas en

esta investigación.

37

Tabla 5. Medios de cultivo utilizados en la transformación de F. oxysporum

mediada por A. tumefaciens.

41

Tabla 6. Oligonucleótidos utilizados en este trabajo de investigación.

70

Tabla 7. Códigos de genes codificadores de proteínas tipo flavohemoglobina

del género Fusarium. Columna 1: F. oxysporum f. sp. lycopersici,

columna 2: F. verticillinoides; columna 3: F. graminearum.

80

Tabla 8. Códigos de los oligonucleótidos diseñados sobre los genes

codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina de F. oxysporum

f. sp. lycopersici y utilizados en reacciones de PCR para detectar los

genes ortólogos en F. oxysporum f. sp. phaseoli.

81

Tabla 9. Porcentajes de identidad entre las secuencias de nucleótidos de las

regiones codificantes de los genes FHG1, FHG2, FHG3 y FHG4.

90

Tabla 10. Ubicación de las hipotéticas cajas TATA y CAAT en la región

promotora y secuencias consenso señal de poliadenilación

reconocidos en los genes FHG1, FHG2, FHG3 y FHG4.

91

Tabla 11. Predicción de factores de transcripción que pueden unirse a la

región promotora del gen FHG1.

92



92



93


XVI



93

Tabla 15. Composición aminoacídica de las proteínas codificadas por los

genes FHG1, FHG2, FHG3 y FHG4.

94

Tabla 16. Porcentaje de semejanza de las secuencias aminoacídicas

deducidas de las proteínas codificadas por los genes FHG1, FHG2,

FHG3 y FHG4 de FOP-SP1.

95

Tabla 17. Dominios funcionales presentes en las proteínas FHG1, FHG2,

FHG3 y FHG4.

97

Tabla 18. Valores de probabilidad de localización subcelular de las proteínas

FHG estimados con el programa de predicción MultiLoc2.

99

Tabla 19 Valores de probabilidad de localización mitocondrial, estimada con

el programa de predicción TargetP, y de presencia de una

presecuencia mitocondrial, estimada con el programa MITOFATES,

de las proteínas FHG de FOP.

100

Tabla 20. Códigos de los oligonucleótidos derivados de los genes FHG

diseñados para la construcción de los vectores de reemplazamiento

génico y tamaños de los fragmentos amplificados por PCR.

118

Tabla 21. Códigos de los oligonucleótidos derivados de los genes FHG y del

gen hph utilizados para la identificación de transformantes candidato

y tamaños de los productos de PCR esperados en caso ocurrencia

de recombinación homóloga en la región correspondiente.

122

Tabla 22. Estirpes silvestres y cepas mutantes ΔFHG generadas en este

trabajo y seleccionadas para su análisis fisiológico.

139

Tabla 23. Valores de infección en plantas de judía variedad “Blanca Riñón”

con las cepas mutantes ΔFHG de FOP estimados con la escala

CIAT.

154

Tabla 24. Ensayos de infección en plantas de judía variedad “Blanca Riñón”

con los mutantes dobles. Evaluada con la escala CIAT.

174

Índice

XVII

SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS

ADN Ácido desoxirribonucleico

ADNasa Desoxirribonucleasa

ADNc ADN complementario

ARN Ácido ribonucleico

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide

CDP-Star (2-Cloro-5-(4-metoxipiro(1,2-dioxietano-3,2’- (5’cloro)triciclo[3.3.1.1.3.7]decan)-4il)-1-fenilfosfato disódico)

D.O. Densidad óptica

DEPC Dietilpirocarbonato

DETA Diethylenetriamine; N-(2-Aminoethyl)-1,2-ethanediamine; bis(2-Aminoethyl)amine

DIG Digoxigenina-11-desoxiuridina-5’-trifosfato

DMSO Dimetil sulfóxido

dNTPs Deoxinucleótidos-5’-trifosfato

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid: ácido etilendiaminotetraácetico

FAD Flavina adenina dinucleótido

FHG Flavohemoglobina

FHG1 Gen flavohemoglobina 1




FOP Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli

FOL Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici

GFP Green Fluorescent Protein, proteína verde fluorescente

hpi Horas post infección

I Litro

IGS Intergenic Spacer, región espaciadora intergénica

ITS Internal transcribed spacer

Kb 1 kb Plus DNA ladder

Kg Kilogramo

LB Medio de cultivo de Luria-Bertani

MAPK Proteína quinasa activada por mitógenos

Mb Megabases (1.000.000 pares de bases)

MCC Medio de cocultivo

MI Medio de Inducción

ml Mililitro


XVIII

mM Milimolar

MM Medio Mínimo

MMG Medio Mínimo más glucosa

MMG+A Medio Mínimo más glucosa con amonio

MMG+N Medio Mínimo más glucosa con nitrato

MOPS Ácido-3-morfolinopropanosulfónico

NO Óxido nítrico

NAD Nicotina adenina dinucleótido

ORF Open Reading Frame, marco de lectura abierta

Pb Pares de bases

PCR Polymerase Chain Reaction, reacción en cadena de la polimerasa

PDA Papa dextrose agar

PDB Caldo Papa dextrosa

PGM Medio crecimiento plantas

rpm Revoluciones por minuto

RAPD Random amplified polymorphic DNA, ADN polimórfico amplificado al azar

RH Respuesta de hipersensibilidad

RNI Especies reactivas de nitrógeno

ROS Reactive oxygen species, especies reactivas de oxígeno

RT-PCR Retrotranscriptase- PCR, transcripción inversa

RT-qPCR PCR cuantitativa

SAR Systemic adquired resistence, resistencia sistémica adquirida

SCAR Sequence characterized amplified region, región amplificada, caracterizada y secuenciada

SDS Dodecilsulfato Sódico

SNP Nitroprusiato sódico

TE Tris-EDTA

TAE Tris-ácido acético-EDTA

Tm Melting temperature, temperatura de fusión

Tris Tris (hidroximetil) aminometano

αα Aminoácido

μg Microgramo

μM Micromolar

µl Microlitro

RESUMEN

Resumen

XIX

RESUMEN

Entre los factores bióticos que determinan mayores pérdidas económicas en los cultivos

agrícolas se encuentran los hongos fitopatógenos. F. oxysporum constituye un complejo

de especies con una considerable variación morfológica y fisiológica, cuyos individuos

pueden crecer y multiplicarse como saprófitos sobre materia orgánica o bien colonizando

plantas. El colectivo de estirpes patógenas puede infectar más de 100 especies vegetales

distintas, e incluso hospedadores animales como el hombre. Individualmente, este abanico

de posibilidades de infección se restringe a una especie o unas pocas especies del mismo

género, lo cual permite la clasificación de las distintas estirpes de F. oxysporum en formas

especiales que poseen una rango de infección muy estrecho. En particular, F. oxysporum

f. sp. phaseoli, el objeto de estudio del presente trabajo, infecta y coloniza unas pocas

especies del género Phaseolus, y, típicamente, P. vulgaris, provocando la marchitez

vascular de la judía. Esta enfermedad presenta una incidencia notable en todas las

regiones del mundo en las que se cultivan judías.

Los procesos de infección y colonización de las plantas atacadas son muy parecidos en

todas las formas especiales de F. oxysporum. El hongo, habitual en los suelos, es capaz

de penetrar las raíces del vegetal, especialmente a través de heridas o de las

discontinuidades entre las raíces laterales y la raíz principal. Una vez dentro del tejido

cortical avanza hacia el cilindro central radicular para diseminarse a continuación por los

haces vasculares de la planta. La colonización de los haces xilemáticos del huésped

provoca la obstrucción de los mismos y la reducción del aporte de agua y nutrientes a las

partes aéreas de la planta, dando lugar a la marchitez característica de las infecciones

causadas por F. oxysporum, lo cual finaliza en muchas ocasiones con la muerte de la

planta.

El tipo de colonización eminentemente vascular característico de F. oxysporum no permite

una fácil adscripción a cualquiera de las categorías de patógenos descritas, esto es,

biotrofos, hemibiotrofos y necrotrofos. En ocasiones se considera su estilo de vida

infeccioso como hemibiotrófico. La primera parte de su ciclo colonizador podría

considerarse biotrófica; sin embargo, no está claro que en una segunda etapa degrade y

destruya activamente los tejidos de la planta, como para considerarla típicamente

necrotrófica.


XX

La agresión por organismos patógenos desencadena en las plantas infectadas una

compleja respuesta de defensa. Entre los mecanismos que participan en la misma

destacan la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y de óxido nítrico (NO),

moléculas muy reactivas, con un papel señalizador fundamental y que orquestan y

coordinan los procesos que participan en la respuesta defensiva, en particular en la

activación de la respuesta de hipersensibilidad (HR). El NO, en particular, resulta muy

importante por la multiplicidad de papeles que desempeña. Desde el punto de vista de la

respuesta defensiva vegetal, juega un doble papel: por una parte resulta esencial en la

activación del programa de muerte celular programada que conduce a la muerte de las

células que entran en contacto con el patógeno y, por otra, presenta una elevada toxicidad

sobre la mayor parte de los microorganismos patógenos. Además, el NO tiene una

intervención destacada en procesos de diferenciación y desarrollo en los organismos,

incluídos los propios patógenos, lo cual implica que la modulación de su concentración

necesariamente esté sometida a una estricta regulación.

Teniendo en cuenta que el NO es un gas que se difunde con suma facilidad y que la

modulación de su concentración implica tanto al NO exógeno, producido por la planta

infectada como parte de su respuesta defensiva, como al endógeno, producido por los

procesos metabólicos del patógeno, resulta imprescindible el concurso de mecanismos de

detoxificación. Las enzimas de tipo flavohemoglobina son enzimas con actividad

dioxigenasa de NO dependiente de NADPH, FAD y O2, que detoxifican NO produciendo

nitrato. Estas enzimas están presentes únicamente en hongos y bacterias, no habiendo

sido descritas ni en sistemas animales ni en plantas. En los distintos microorganismos en

los que la actividad y la función de estas enzimas han sido investigadas se ha comprobado

que son codificadas por genes de copia única o por pequeñas familias génicas y que

confieren protección frente a condiciones de estrés nitrosativo. En modelos de patógenos

animales las flavohemoglobinas son unos poderosos agentes detoxificadores de NO con

un claro efecto en virulencia. En Cryptococcus neoformans, un patógeno humano, la

enzima flavohemoglobina protege al hongo del daño nitrosativo producido por el NO

liberado por los macrófagos. En el caso del Erwinia chrisanthemi, patógeno vegetal de

naturaleza biotrofa, la enzima flavohemoglobina resulta esencial para que el patógeno

pueda infectar a su planta huésped.

Debido a la importancia biológica de las proteínas tipo flavohemoglobina en el metabolismo

del NO, el objetivo de nuestro trabajo de investigación fue determinar el papel de las

proteínas flavohemoglobinas en F. oxysporum. Mediante análisis bioinformático e

http://scholar.google.es/scholar?q=flavohemoglobin+cryptococcus+neoformans&hl=es&as_sdt=0&as_vis=1&oi=scholart&sa=X&ved=0ahUKEwjNnPz_ltfLAhUDwBQKHRTQDokQgQMIHTAA

Resumen

XXI

hibridación tipo Southern se han identificado en este hongo fitopatógeno cuatro genes

codificadores de enzimas tipo flavohemoglobina (FHG), siendo el organismo eucariota con

más copias de genes FHG descritos hasta el momento. Los cuatro genes carecen de

intrones y son de copia única. Las proteínas correspondientes, denominadas FHG1, FHG2,

FHG3 y FHG4, presentan los tres dominios funcionales de una proteína tipo

flavohemoglobina. FHG1, FHG2 y FHG3 tienen localización citoplasmática, mientras que

FHG4 posee una secuencia señal de localización mitocondrial. El análisis filogenético

agrupa a las proteínas FHG1, FHG2 y FHG3 en un clado que incluye a la mayor parte de

las flavohemoglobinas de hongos, incluidas las dos o tres flavohemoglobinas descritas en

otras especies del género Fusarium. La flavohemoglobina FHG4 se ubica en un clado

diferente junto a proteínas FHG de especies del género Aspergillus, proteínas de

localización mitocondrial que están más relacionadas con las flavohemoglobinas de

bacterias desnitrificantes.

Los patrones de expresión de los genes FHG de F. oxysporum son indicativos de la

existencia de mecanismos de regulación de la expresión en respuesta a distintos estímulos:

desarrollo, fuente de nitrógeno y exposición a NO. Los genes FHG1, FHG2 y FHG3

responden transcripcionalmente a NO exógeno. Esta inducción de la transcripción por

exposición a NO es una respuesta esperada para genes que codifican componentes

esenciales de mecanismos de detoxificación de NO. No obstante, cada uno de ellos

muestra un patrón de expresión específico y diferencial. Cuantitativamente la respuesta de

FHG1 a NO es la más intensa, sólo se produce en la fase de germinación de los

microconidios y no está sometida a represión metabólica por presencia de amonio en el

medio de cultivo. FHG1 no se expresa en la fase de desarrollo del micelio, ni en ausencia

ni en presencia de NO. FHG2 también responde transcripcionalmente a NO y solo lo hace

de forma clara en la fase de germinación de los microconidios, fase en la que la presencia

de amonio tampoco bloquea la inducción de la expresión en respuesta a NO. Cabe pensar

que ambos genes está implicados, en este estadio de desarrollo, en un mecanismo de

defensa inducible en respuesta a NO, el cual es independiente de la presencia de amonio,

y que las enzimas codificadas participan en la detoxificación del NO al que las esporas del

hongo son expuestas.

En la fase de crecimiento FHG2 muestra un patrón de expresión diferente, con niveles

máximos en medio mínimo con glucosa y en ausencia de fuente de nitrógeno. Durante esta

fase la expresión de FHG2 está reprimida en presencia de amonio. Sorprendentemente,

esta represión se mantiene aún en presencia de NO. Es decir, en la fase de micelio, FHG2


XXII

muestra respuestas transcripcionales que sugieren que participa en procesos específicos

de esta etapa de desarrollo, probablemente más relacionadas con el metabolismo del

nitrógeno en general que con una respuesta específica de defensa frente a NO.

FHG3 muestra un patrón de expresión similar en esporas y en micelio y con una respuesta

a la exposición a NO muy limitada. Sí muestra una respuesta a amonio, cuya presencia

estimula su expresión durante la germinación de las esporas, estimulación que no se

observa en los genes FHG1 y FHG2. Por lo tanto, FHG3 también muestra respuestas que

sugieren una posible participación en metabolismo del nitrógeno en general, no

específicamente en detoxificación de NO. Sin embargo, la respuesta observada no deriva

de una posible represión metabólica por presencia de amonio sino, más bien al contrario,

de estimulación de la expresión en presencia de esta fuente de nitrógeno. FHG4 no se

expresa a niveles detectables en ninguna de las condiciones consideradas. Teniendo en

cuenta que todas estas condiciones son aerobias y dada la presencia de señales de

localización mitocondrial en la proteína deducida, es posible proponer que FHG4 participa

en procesos relacionados con desnitrificación y con eliminación de NO específicos del

metabolismo mitocondrial. Estas variadas respuestas transcripcionales sugieren que la

disponibilidad de cuatro genes FHG puede proporcionar a F. oxysporum una notable

versatilidad metabólica en la utilización de fuentes de nitrógeno, la cual puede resultar útil

en determinadas condiciones ambientales.

Se ha comprobado que las cepas FOP-SP1 y FOP-SP4 son sensibles a NO y que la

exposición a NO exógeno determina una reducción moderada en la eficiencia de

germinación de microconidios en ambas cepas, lo que supone que éste altera o modula la

actividad de componentes esenciales para que se produzca la germinación de los

microconidios. Esta sensibilidad es superior en la estirpe poco patógena FOP-SP4 que en

la muy patógena FOP-SP1. Utilizando el método de transformación mediada por A.

tumefaciens (ATM) se han obtenido mutantes nulos en los genes FHG en ambas cepas del

patógeno. La evaluación del comportamiento de los distintos mutantes en condiciones de

estrés nitrosativo en medios con amonio o nitrato indica que los mutantes ∆FHG1 y ∆FHG2

son hipersensibles a NO, resultados que demuestran que las flavohemoglobinas FHG1 y

FHG2 juegan un papel importante en la detoxificación de NO en F. oxysporum y que son

las responsables de mantener la concentración de NO en el interior de la célula dentro de

unos niveles compatibles con el normal funcionamiento del metabolismo celular. Los

mutantes ∆FHG1 muestran una mayor sensibilidad a NO exógeno que los mutantes

∆FHG2, lo que indica que FHG1 tiene una contribución más relevante en la detoxificación

Resumen

XXIII

de NO exógeno que FHG2. Los mutantes ∆FHG3 y ∆FHG4 no muestran hipersensibilidad

a NO en las condiciones evaluadas, lo que sugiere que FHG3 y FHG4 no desempeñan un

papel importante en la detoxificación de NO exógeno.

La caracterización fisiológica de los mutantes ∆FHG demuestra que en la eliminación de

los niveles de NO que afectan a los componentes de la maquinaria celular implicada en el

programa de germinación juega un papel fundamental la enzima FHG1, ya que en los

mutantes ΔFHG1 lo que en realidad se produce es un bloqueo de la germinación, no un

retraso. Este bloqueo se observa en las dos cepas de F. oxysporum y en presencia de una

u otra fuente de nitrógeno. El hecho de que este bloqueo se produzca en cepas que poseen

alelos de tipo silvestre para los otros tres genes FHG supone que FHG1 es responsable

específicamente de eliminar el NO que afecta a estos componentes esenciales de la

maquinaria de germinación y que su función no es asumida, o compensada, ni siguiera

parcialmente, por alguna de las otras tres enzimas FHG de F. oxysporum. En medios de

cultivo con nitrato, pero no con amonio, la exposición a NO sí determina una reducción en

la eficiencia de germinación de los mutantes ∆FHG2, si bien de menor magnitud que la

observada en los mutantes ∆FHG1. Una hipótesis que explica estos resultados consiste en

que FHG2 es responsable de detoxificar NO que afecta a la germinación, NO que no puede

detoxificar FHG1 y que tiene que ver con el metabolismo del nitrato en los mutantes

∆FHG2. Por su parte, el análisis de los mutantes correspondientes demuestra que las

flavohemoglobinas FHG3 y FHG4 no juegan un papel importante en la eliminación del NO

que afecta a la germinación de los microconidios en FOP-SP1 y en FOP-SP4.

La mayor sensibilidad que las estirpes FOP-SP1 y FOP-SP4 muestran frente a NO

exógeno encaja con un papel activo de esta molécula en la respuesta defensiva de la judía

frente a F. oxysporum f. sp. phaseoli. Si es así, la pérdida de la capacidad para detoxificar

NO por parte de los mutantes ∆FHG1 y ∆FHG2 debería suponer una disminución de la

capacidad de los mismos para eliminar el NO que la planta huésped produce durante el

establecimiento y progreso de la interacción. Cabría esperar entonces una disminución en

la agresividad de las cepas mutantes ∆FHG sobre su huésped. Sin embargo, se ha

comprobado que la deleción de los genes FHG no altera la capacidad de infección de las

estirpes FOP-SP1 y FOP-SP4. Por lo tanto, asumimos que los genes FHG no tienen un

efecto destacable en la patogenicidad de F. oxysporum y concluimos que las enzimas FHG

no pueden ser consideradas como factores de virulencia en este hongo fitopatógeno. El

hecho de que los mutantes muestren el mismo comportamiento que las cepas de tipo

silvestre durante la interacción nos lleva a considerar que, o bien los niveles de NO


XXIV

producidos durante la interacción con el huésped no son lo suficientemente elevados como

para limitar el progreso del patógeno o bien F. oxysporum dispone de otros sistemas de

detoxificación de NO.

Ciertamente las enzimas FHG de F. oxysporum no parecen jugar un papel esencial en el

establecimiento de la interacción entre el patógeno y su huésped. La consideración de la

existencia de varias copias de genes codificadores de FHG, de la regulación diferencial de

la expresión de unos y otros en respuesta a distintos estímulos, entre ellos la fase de

desarrollo, la fuente de nitrógeno y la exposición a NO, y de la información derivada de la

caracterización fisiológica de los mutantes alterados en la producción de

flavohemoglobinas, permiten relacionar la función de estas enzimas más bien con procesos

metabólicos básicos, esencialmente procesos relacionados con el metabolismo del

nitrógeno, que condicionan a su vez procesos de desarrollo esenciales, como la

germinación de los microconidios. La disponibilidad de varias enzimas FHG puede conferir

ventajas adaptativas en condiciones ambientales y de acceso a nutrientes muy diversas,

contribuyendo a proporcionar a F. oxysporum una versatilidad metabólica muy notable.

INTRODUCCIÓN

Introducción

- 1 -

1 INTRODUCCIÓN

1.1 Hongos fitopatógenos

A nivel mundial los hongos fitopatógenos constituyen un grupo de microorganismos ubicuo

y extremadamente versátil, de nutrición heterótrofa y ocupan la mayor parte de los

ecosistemas terrestres. La mayoría de las más de 100.000 especies conocidas de hongos

son saprofitos estrictos, es decir, viven sobre una matriz de tejido orgánico muerto al que

ayudan a descomponerse. Muchos de ellos son macroscópicos y algunos también

comestibles. Aproximadamente 10% (8.000 especies) del total de especies de hongos

conocidas son capaces de colonizar tejidos vegetales y sólo una fracción menor es capaz

de producir enfermedades en las plantas (Schäfer, 1994; Knogge, 1996a).

A pesar de tratarse de un número restringido de especies, los patógenos fúngicos tienen

un gran impacto en la economía mundial. Según estimaciones de la FAO, la agricultura

mundial pierde cada año el 12% de su producción por daños causados por hongos

fitopatógenos, más que por cualquier otro agente. Estos daños se producen a pesar de la

masiva utilización de fungicidas cuyo mercado global supera anualmente los 20.000

millones de dólares.

1.2 El género Fusarium

El género Fusarium comprende un amplio y heterogéneo grupo de hongos ascomicetos

(clase Sordariomicetos, orden Hipocreales, familia Nectriaceae), con amplia distribución en

el mundo y una gran importancia desde el punto de vista económico. Incluye numerosas

especies, la mayoría de ellas patógenas de plantas capaces de causar marchitez vascular

en un gran número de cultivos y producir toxinas letales para algunos animales (Michielse

and Rep, 2009). Fusarium también produce una gran cantidad de metabolitos secundarios

tóxicos como tricotecenos y fumonisinas que pueden contaminar productos agrícolas.

Algunos de ellos como los tricotecenos pueden también actuar como factores de virulencia

en enfermedades de plantas (Baayen et al., 2000; Desmond et al. 2008). También incluye

estirpes no patógenas, saprófitas y parásitas de otros organismos, incluido el ser humano

(Ortoneda et al., 2004; O`Donnell et al., 2007). Algunas especies pueden completar el

ciclo sexual, mientras que la mayoría presentan reproducción asexual. Debido a las graves


- 2 -

pérdidas económicas originadas por la infección con esta especie, y a la facilidad para su

cultivo y manejo en el laboratorio, ha suscitado un gran interés en el estudio de los

mecanismos de infección de este patógeno de raíz, convirtiéndose en un excelente modelo

de experimentación para conocer el proceso de patogénesis. Además, recientemente se

han desarrollado diversas herramientas genómicas que mejoran la investigación en esta

especie, entre las que destacan la completa secuenciación y anotación del genoma de

Fusarium verticillioides, Fusarium graminearum y diversas formas especiales del complejo

de especies de Fusarium oxysporum por el Broad Institute

(https:://www.broad.mit.edu/annotation) (Ma et al., 2010).

1.2.1 Morfología

Los hongos del género Fusarium son haploides y producen macroconidios característicos

en forma de huso: hialinos, alargados y septados y en la mayoría de las especies se

producen en una estructura denominada esporodoquio. También producen microconidios

y estructuras de resistencia denominadas clamidosporas. Booth lo describió en 1982 como

un género con esporas asexuales hialinas, septadas y con una célula basal muy

característica por la estructura de “tacón”. Es posible realizar una identificación morfológica

para la determinación de especies, centrada en la forma y en el tamaño de los macro y

microconidios, las hifas y la formación y disposición de las clamidosporas (Booth et al.,

1984).

1.2.2 Taxonomía del género Fusarium

Dada su importancia como patógeno y su complejidad taxonómica, el género Fusarium

sigue siendo objeto de numerosas clasificaciones. En 1809, Link realizó una primera

clasificación morfológica centrada en la forma de los conidios, que describió como

“fusiformes y hialinos”. En 1841, Fries incluyó al género dentro del orden Tuberculariaceae.

Casi un siglo después, en 1935, Wollenweber y Reinking dividieron el género en 11

secciones, 65 especies, 55 variedades y 22 formae speciales. Gerlach y Niremberg (1982),

así como Nelson et al. (1983) desarrollaron un sistema taxonómico basado también en

características morfológicas. En 1990, Nelson distinguió 14 especies.

En la actualidad, se han descrito alrededor de 150 especies morfológicas y/o

filogenéticamente diferentes bien caracterizadas y aceptadas por los taxónomos (Seifert y

Lévesque, 2004), subdivididas en 16 secciones (Nelson et al., (1994). Cada sección es un

Introducción

- 3 -

complejo de especies relacionadas entre sí. Las secciones en las que se divide el género

Fusarium son: Eupionnotes, Macroconia, Spicarioides, Submicrocera, Pseudomicrocera,

Arachnites, Sporotrichiella, Roseum, Arthrosporiella, Gibbosum, Discolor, Letritium,

Liseola, Elegans, Martiella, Ventricosum.

Según Leslie & Summerell (2006), la clasificación de Fusarium sería la siguiente:

División Ascomycota

Subdivisión Pezizomycota

Clase Sordariomycetes

Subclase Hypocreomycetidae

Orden Hypocreales

Familia Nectriaceae

Género Fusarium

Especie F. oxysporum, F. verticillioides, F. graminearum, F. solani etc.

Los marcadores moleculares se han convertido en importantes herramientas que permiten

estimar la variabilidad genética, realizar estudios filogenéticos y de diagnóstico molecular.

Cabe destacar la utilización de isoenzimas (Laday y Szecsi, 2002), de RAPD (random

amplified polymorphism DNA) (Voigt et al., 1995; Alves-Santos et al., 2002a), el análisis de

las regiones intergénicas espaciadoras del ARN ribosómico (ITS e IGS) mediante RFLP

(restriction fragment length polymorphism) (Appel y Gordon, 1995; Alves-Santos et al.,

2002a; Mirete et al., 2003), la comparación de secuencias codificadoras de copia única

ricas en intrones, tales como los genes codificadores de la calmodulina, la β-tubulina, la

histona H3 o el gen EF-1α (Guadet et al., 1989; Gordon y Martyn, 1997) y, más

recientemente, los microarrays de ADN (Lievens et al., 2003). Muchas de las especies de

Fusarium descritas en los últimos años han sido descubiertas gracias a técnicas de análisis

filogenéticos (O´Donnell et al., 1998; Benyon et al., 2000; O´Donnell, 2000; Suga et al.,

2002; Tan y Niessen, 2003). Recientemente se ha creado una base de datos. Muchas de

las especies de Fusarium descritas en los últimos años han sido descubiertas gracias a

técnicas de análisis filogenéticos (O´Donnell et al., 1998; Benyon et al., 2000; O´Donnell,

2000; Suga et al., 2002; Tan y Niessen, 2003). Actualmente el EF-1α es considerado como

el gen esencial en análisis multigénicos por las siguientes razones: 1) La presencia de una

única copia en el genoma de Fusarium, 2) la no detección de copias ortólogas, 3) su riqueza

de regiones intrónicas y alto nivel de polimorfismo entre especies estrechamente cercanas


- 4 -

y 4) la posibilidad de generar cebadores universales, que permiten realizar estudios

filogenéticos del género (Geiser et al., 2004; O’Donnell et al., 2004).

1.2.3 Especies anamórficas y teleomórficas del género Fusarium

La clasificación según el tipo de reproducción se considera más descriptiva que

taxonómica. En algunas especies se han descrito sus estados teleomórficos o de

reproducción sexual conocida (Seifert y Gams, 2001). Así las formas anamórficas y

teleomórficas de este género se han clasificado juntas o en el grupo de basidiomicetes o

en el de ascomicetes y parecen formar un grupo monofilético (Samuels y Blackwell, 2001).

En las especies del género de las que se conoce su estado teleomórfico, como F. solani,

F. graminearum o F. verticilloides (Nectria haematococca, Giberella zeae, y Giberella

fujikuroi, respectivamente), se produce la fusión de los núcleos que da lugar a un núcleo

diploide que entrará posteriormente en meiosis. Las bases genéticas que controlan los

mecanismos de reproducción sexual en los ascomicetos filamentosos han sido

esclarecidas en los últimos años. Los encargados de regular la reproducción sexual son

los productos de los genes que determinan el tipo apareante (“mating type”, MT), que

consisten en un locus con dos alelos funcionales, a menudo designados como MAT-1 y

MAT-2 (Yoder et al., 1986; Glass et al., 1990; Kerenyi et al., 2004; Hornok et al., 2007;

Keszthelyi et al., 2007). Estos genes determinan la habilidad de dos cepas para fusionar

sus núcleos y formar una célula diploide (Nelson, 1996; Coppin et al., 1997).

En las formas anamórficas del género Fusarium en las que no ocurre la meiosis, que es el

principal mecanismo generador de intercambio genético, deben existir otros mecanismos

que permitan la adquisición de variabilidad genética. En F. oxysporum se han descrito

fenómenos de intercambio genético como la heterocariosis y la parasexualidad (Burnett,

1984) y la actividad de elementos transponibles o transposones (Daboussi y Capy, 2003),

duplicaciones, deleciones y transposiciones (Kistler et al., 1995). La heterocariosis es la

fusión de hifas sin cariogamia. Los individuos resultantes de este proceso se denominan

heterocariontes vegetativos por ser estables cuando se mantienen por un periodo de

tiempo indefinido. De esta forma los hongos que son haploides pueden obtener ciertos

beneficios propios de la diploidía y si dos cepas son capaces de formar un heterocarionte

vegetativo pertenecerán a un mismo grupo de compatibilidad vegetativa o VCG (vegetative

compatibility group). Si, por el contrario, tras la fusión de las hifas se produce la lisis celular,

estas estirpes se consideran incompatibles (Leslie, 1993; Glass et al., 2000). Los VCG han

sido utilizados por numerosos autores para estudiar la variabilidad intra-específica del

Introducción

- 5 -

género (Puhalla, 1985; Ploetz et al., 1988; Woo et al., 1996; Alves-Santos et al., 2002a).

En los heterocariontes vegetativos no se descarta que se produzcan fenómenos de

intercambio genético, conocido como parasexualidad, que es un tipo de intercambio que

ha sido observado en cepas de F. oxysporum, dando como resultado reorganizaciones

cromosómicas y recombinación (Teunissen et al., 2002).

1.3 El complejo de especies F. oxysporum

1.3.1 Descripción y características taxonómicas

F. oxysporum Schlechtend.:Fr. es un complejo de especies anamórficas con considerable

variación morfológica y fisiológica, las cuales están distribuidas por todos los suelos del

mundo. Son capaces de crecer saprofíticamente o colonizar un hospedero (planta o animal),

de reproducción asexual, con hifas hialinas y septadas, y sin ciclo sexual conocido. Las

cepas patógenas colectivamente podrían parasitar más de 100 hospederos diferentes

(Michielse y Rep, 2009). F. oxysporum es un patógeno del suelo, que se ha convertido

en un excelente modelo de experimentación puesto que ofrece la doble posibilidad de

estudiar tanto el proceso de infección de estos patógenos en plantas como en pacientes

inmunodeprimidos (Ortoneda et al., 2004).

Uno de los problemas más importantes para el estudio de la biología de F. oxysporum es

la dificultad de definir qué es una población al no existir criterios morfológicos que permitan

la diferenciación a nivel intra-específico. Para intentar ordenar y explicar toda esta

variabilidad se utiliza el concepto de formas especiales.

La nomenclatura utilizada para designar a las formas especiales es un trinomio en latín,

con el nombre de la especie seguido de una referencia al hospedero que parasitan.

Distintos investigadores han propuesto que los aislados que atacan a una determinada

especie de huésped representan un grupo monofilético natural. Datos recientes

demuestran que dentro de algunas formas especiales de F. oxysporum (F. oxysporum f.

sp. melonis, F. oxysporum f. sp. lycopersici y F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici) existen

aislados de orígenes independientes (Kistler, 2001). Por lo tanto la asociación de

determinadas cepas con un hospedador no implica necesariamente un origen monofilético.

Las formas especiales son cepas morfológicamente indistinguibles que se caracterizan por

su adaptación a diferentes hospederos (Deighton, et al., 1962). Serían, por lo tanto, un


- 6 -

conjunto de cepas que atacan a una especie vegetal o a lo sumo a varias especies de un

mismo género. Aunque también este concepto se usa para definir cepas que producen una

patología diferente aunque parasiten a la misma especie vegetal. Esta definición se refiere

fundamentalmente a capacidades fisiológicas del hongo y no tiene un valor taxonómico,

pero tradicionalmente ha sido un concepto útil para los fitopatólogos (Gordon y Martyn,

1997). Originalmente se aceptó que las formas especiales patogénicas de F. oxysporum

se habían originado a partir de formas especiales no patogénicas o saprófitas en procesos

evolutivos muy largos, principalmente en los centros de origen de las plantas hospedantes

(Nelson, 1990). Sin embargo, las relaciones filogenéticas entre aislados han demostrado

que la capacidad para infectar una especie vegetal ha surgido independientemente

varias veces a lo largo de la evolución (Baayen et al., 2000; O´Donnell et al., 1998).

Este fenómeno se relaciona con la existencia de cromosomas específicos presentes

exclusivamente en el genoma de determinadas estirpes, que son portadoras de genes

relacionados con patogénesis que confieren especificidad para el hospedador (Ma et

al., 2010). En la tabla 1 se muestran algunas formas especiales representativas del género

Fusarium.

Tabla 1. Grupo representativo de formas especiales del complejo de especies de F. oxysporum

Fusarium oxysporum f.sp. albedinis Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum

Fusarium oxysporum f.sp. asparagi Fusarium oxysporum f.sp. tulipae

Fusarium oxysporum f.sp. batatas Fusarium oxysporum f.sp. tuberosi

Fusarium oxysporum f.sp. cubense Fusarium oxysporum f.sp. strigae

Fusarium oxysporum f.sp. cyclaminis Fusarium oxysporum f.sp. ricini

Fusarium oxysporum f.sp. herbemontis Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici

Fusarium oxysporum f.sp. dianthi Fusarium oxysporum f.sp. pisi

Fusarium oxysporum f.sp. betae Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli

Fusarium oxysporum f.sp. cannabis Fusarium oxysporum f.sp. passiflorae

Fusarium oxysporum f.sp. cepae Fusarium oxysporum f.sp. palmarum

Fusarium oxysporum f.sp. ciceris Fusarium oxysporum f.sp. niveum

Fusarium oxysporum f.sp. citri Fusarium oxysporum f.sp. nicotianae

Fusarium oxysporum f.sp. coffea Fusarium oxysporum f.sp. narcissi

Fusarium oxysporum f.sp. gladioli Fusarium oxysporum f.sp. melonis

Fusarium oxysporum f.sp. lactucae Fusarium oxysporum f.sp. lycopersici

Fusarium oxysporum f.sp. lentis Fusarium oxysporum f.sp. medicaginis

Fusarium oxysporum f.sp. lini Fusarium oxysporum f. sp. quitoense

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._albedinis

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._vasinfectum

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._asparagi

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._tulipae&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._batatas

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._tuberosi&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._cubense

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._strigae&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._cyclaminis

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._ricini&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._herbemontis&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._dianthi

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._pisi

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._betae

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._phaseoli&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._cannabis

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._passiflorae&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._cepae&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._palmarum&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._ciceris

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._niveum&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._citri

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._nicotianae&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._coffea

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._narcissi&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._gladioli&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._melonis&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Fusarium_oxysporum_f.sp._lactucae&action=edit&redlink=1

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._lycopersici

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._lentis

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._medicaginis

https://en.wikipedia.org/wiki/Fusarium_oxysporum_f.sp._lini

Introducción

- 7 -

1.3.1.1 Morfología

F. oxysporum forma un micelio de textura algodonosa que puede variar de color, desde

blanco a rosa pálido hasta un púrpura intenso, según el aislado. Las condiciones

ambientales, es una variable que afectan la velocidad de crecimiento, así como la forma,

tamaño y abundancia de esporas y número de septos de sus hifas (Agrios, 1997). F.

oxysporum produce tres tipos de esporas asexuales: microconidios, macroconidios y

clamidosporas. Los microconidios, con una o dos células, son los más abundantes. Se

producen con mayor frecuencia y en cualquier circunstancia y presentan formas ovaladas

y cilíndricas. Los macroconidios son las esporas típicas del género pero las menos

abundantes, de aspecto fusiforme, septadas, constituidas por 2 a 5 células, puntiagudas e

inclinadas hacia los extremos. Las clamidosporas se forman por la tabicación y

engrosamiento de una parte de una hifa. Presentan una forma esférica y con pared

engrosada y pueden sobrevivir durante largos periodos de tiempo dependiendo de las

condiciones ambientales (Nelson, 1981; Agrios, 1997).

1.3.1.2 Ciclo de vida

F. oxysporum tiene un ciclo de vida complejo que podría dividirse en dos fases, una como

parásito dentro de un hospedero específico y otra de crecimiento saprofítico (Figura 1). La

fase saprófita empieza cuando los tejidos infectados de la planta comienzan a morir. El

hongo produce clamidosporas cuando los niveles de nutrientes empiezan a disminuir en el

tejido moribundo y son liberadas al suelo junto a restos de hifas cuando la planta muere

(Beckman, 1987).

La clamidosporas permanecen en estado de dormancia durante largos periodos de tiempo

en condiciones ambientales desfavorables (Price, 1984). Si las condiciones son favorables

para el hongo pueden germinar y el hongo comenzará su fase de vida saprofita. La

germinación de las clamidosporas se produce en presencia de restos vegetales o un

huésped apropiado. La persistencia de clamidosporas y micelio en zonas relativamente

profundas del suelo dificulta la tarea de erradicar la enfermedad de los cultivos, por lo que

resulta de gran importancia el desarrollo de tratamientos y técnicas agrícolas para

minimizar la presencia de inóculo en el suelo. Ante la proximidad de las raíces y señales

quimio-atrayentes producidas por exudados de las raíces el estado de dormancia de las

clamidosporas es interrumpido y el hongo colonizará la planta pudiendo infectar al

hospedero y entrar en la fase parásita, o bien, si el huésped no es el apropiado, continuar


- 8 -

como saprofito (Beckman, 1987). Recientes estudios demuestran que las peroxidasas

producidas por los exudados de raíces tienen actividad quimio-atrayente para la orientación

del crecimiento de F. oxysporum hacia las raíces de la planta (Turrá et al., 2015)

Figura 1. Ciclo de vida de F. oxysporum (Beckman, 1987).

1.3.1.3 Capacidad infectiva: la fusariosis vascular

El desarrollo de la enfermedad es el resultado de la interacción del hongo con la planta

según una secuencia de etapas que pueden resumirse en seis (Schäfer, 1994; Knogge,

1996b), algunas de las cuales son comunes al proceso de infección de hongos

fitopatógenos en general (Schäfer, 1994).

1. Reconocimiento de las raíces de su hospedador mediante señales químicas

producidas por la planta.

2. Adherencia de las hifas a la superficie de la raíz y posterior entrada.

3. Penetración en el córtex radicular y degradación de barreras físicas (endodermis)

para alcanzar el tejido vascular.

4. Superación de las barreras defensivas de la planta para penetrar en las células del

xilema.

5. Proliferación de las hifas en el xilema y producción de microconidios que germinarán

y propagarán la infección.

6. Secreción de pequeños péptidos o fitotoxinas que potencian la virulencia.

Introducción

- 9 -

Las etapas iniciales del proceso de infección se han podido visualizar mediante microscopía

confocal empleando la proteína verde fluorescente (GFP, green fluorescent protein) en F.

oxysporum f. sp. lycopersici (Di Pietro et al., 2001a) y F. oxysporum f. sp. phaseoli (Niño-

Sánchez et al., 2015). En este último sistema ha sido posible realizar el seguimiento del

proceso de infección en raíz y tallo de judía, observándose desde las primeras etapas de

infección diferencias entre aislados patógenos y no patógenos (Niño-Sánchez et al., 2015).

F. oxysporum es capaz de detectar la presencia de una planta hospedadora incluso antes

de establecer un contacto físico. Esto se debe a que los exudados de las raíces producen

peroxidasas que son sustancias quimio-atrayentes que ponen en funcionamiento las

rutas de transducción de señales del hongo y éste responde mediante la activación de

los genes apropiados que regulan los mecanismos de patogenicidad (Turrá et al., 2015).

Actualmente se conocen dos tipos de rutas: la cascada de la adenosina monofosfato-

proteína quinasa A (AMPc-PKA) y la ruta de la proteína quinasa activada por mitógenos

(MAPK) (Di Pietro et al., 2001).

Los hongos patógenos emplean diferentes mecanismos para unirse a la superficie de la

planta hospedadora. En cualquier caso, la penetración del hongo en la planta precisa del

contacto y la adhesión de las esporas y/o de la primera hifa que resulta de su germinación

(tubo germinativo) a la superficie vegetal, formándose una densa red de hifas que parece

necesaria para iniciar la penetración (Czymmek et al., 2007; Olivain and Alabouvette, 1999;

Rodríguez-Gálvez y Mendgen, 1995). Estudios de microscopia electrónica ha demostrado

la ausencia de estructuras especializadas de penetración en F. oxysporum (Olivain and

Alabouvette, 1999; Niño-Sánchez et al., 2015). Sin embargo, se ha identificado la formación

de hifas que penetran a través de heridas, aberturas naturales o penetración directa a través

de los tejidos intactos de la epidermis de la raíz y la formación de un septo en el punto de

penetración (Pareja Jaime et al., 2010; Pérez-Nadales and Di Pietro, 2011; Niño-Sánchez

et al., 2015).

Por otro lado, F. oxysporum debe adaptarse al ambiente hostil del interior de la planta, para

lo cual activa su maquinaria de ataque mediante la producción de enzimas que degradan

la pared celular vegetal, como poligalacturonasas, pectinasas, xilanasas y proteasas

(Rispail et al., 2009), la producción de enzimas que degradan los compuestos tóxicos de

las plantas, como tomatinasas y lacasas, y el refuerzo de su pared celular para resistir los

daños causados por estas sustancias tóxicas (Cañero and Roncero, 2008; Pareja-Jaime et

al., 2008). Después de superar las defensas del hospedero, F. oxysporum invade la corteza


- 10 -

radical creciendo por los espacios inter e intracelulares alcanzando los vasos del xilema a

través de orificios y utilizándolos como avenidas para crecimiento de hifas y transporte de

microconidios para colonizar el tallo y las partes aéreas de la planta (Pastor-Corrales and

Abawi, 1987; Agrios, 1997).

En el estadio de plántula, los vegetales infectados por F. oxysporum pueden marchitarse

y morir poco tiempo después de la aparición de los primeros síntomas. En plantas de

mayor edad aparecen el atrofiamiento y amarilleo de las hojas inferiores, la formación de

raíces adventicias, la marchitez de las hojas y tallos más jóvenes, la defoliación, la necrosis

marginal de las hojas restantes y finalmente la muerte de la planta (Agrios, 1997). La

infección generalmente se desplaza en sentido ascendente a través de la planta, siendo

el oscurecimiento del tejido vascular un síntoma característico de la marchitez.

1.3.1.4 Genes esenciales en patogenicidad y virulencia de F.

oxysporum

Las estrategias de genética directa y reversa han permitido la identificación de genes de

patogenicidad en especies del genero Fusarium. Dos clases de genes de patogenicidad

han sido propuestos (1) genes de patogenicidad básica que son compartidos por especies

del género Fusarium y otros hongos, y (2) genes de patogenicidad específicos del género

Fusarium sobre hospederos específicos (Michielse and Rep, 2009; Kazan et al., 2012).

Los genes de patogenicidad básicos detectan señales endógenas y exógenas, como las

proteínas quinasas activados por mitógenos (MAPK) (Di Pietro et al., 2001; Hou et al., 2002;

Urban et al., 2002), proteínas RAS (pequeñas GTPasas), proteínas G (Wiemann et al.,

2010), componentes del complejo velvet (LaeA/VeA/VelB) (Lee et al., 2012;), las proteínas

quitin sintasas CHS1, CHS2, CHS7 (Martin-Urdíroz et al.,2008), CHSV (Pareja-Jaime et

al., 2010) y los componentes de la vía cAMP (adenosina monofosfato cíclico). A menudo,

las mutaciones de estos genes afectan también a la morfología (García-Martínez et al.,

2012).

Los genes especializados de patogenicidad están involucrados directamente en la

interacción patógeno-planta hospedadora. Así, en F. oxysporum han sido identificados

varios genes codificadores de enzimas implicadas en la degradación de la pared celular

(CWDE) como endo y exopoligalacturonasas, pectinasas, xilanasas, proteasas y pectato

liasa cuyos productos génicos juegan papeles importantes en las fases de penetración y

Introducción

- 11 -

colonización de la raíz (Beckman, 1987; Di Pietro et al., 2003). Importantes progresos se

han realizado en la identificación de factores especialmente requeridos para patogenicidad,

entre los que podemos citar los genes SIX1 y SIX6 (Houterman et al., 2008; Niño et al.,

2015), los genes FMK1 y ARG1, que controlan pasos claves en la patogénesis de F.

oxysporum (Namiki et al., 2001) y los factores de transcripción FOW2 en F. oxysporum f.

sp. melonis y SGE1 en F. oxysporum f. sp. lycopersici, específicamente requeridos para

patogenicidad. Los mutantes de ambos genes pierden completamente la patogenicidad

sobre su hospedero (Imazaki et al., 2007) (SGE1 también está involucrado en la producción

de microconidios).

Los estudios realizados por nuestro grupo muestran que la familia de reguladores

transcripcionales FTF es fundamental para la virulencia y el patrón de colonización vascular

en F. oxysporum. Las distintas copias funcionales de FTF1 codifican el regulador maestro

de una serie de efectores (genes SIX) cuyo concurso es fundamental para una elevada

agresividad en la colonización de la planta infectada (Niño-Sánchez et al., 2016). Además,

el patrón de colonización de los mutantes silenciados en FTF es muy parecido al que

muestran las estirpes poco virulentas (Niño-Sánchez et al., 2015), las cuales carecen de

las copias de FTF1 (Ramos et al., 2007).

En la Tabla 2 se resumen los genes caracterizados en F. oxysporum que son esenciales

en la colonización y patogenicidad del hospedero. En muchos casos, los genes con un

efecto significativo sobre la patogénesis han resultado ser los que regulan la expresión de

un conjunto de otros genes. Entre ellos, se encuentran los que intervienen en la

transducción de señales o los responsables de factores de transcripción.

Tabla 2. Genes de patogenicidad y virulencia identificados en F. oxysporum (tomado de Michielse and Rep, 2009).

Gene Función Efecto inactivación Referencia

AGR1 Arginosuccinato liasa Reducción virulencia Namiki et al., 2001

CHS1 Quitin sintasa Clase I Reducción Virulencia Martin-Urdíroz et al.,2008

CHS2 Quitin sintasa Clase II Reducción virulencia Martin-Urdíroz et al.,2008

CHS7 Proteína como chaperona Reducción virulencia Martin-Urdíroz et al.,2008

CHSV Quitin sintasa Clase 7 Reducción virulencia Pareja-Jaime et al., 2010

CLC1 Canal de cloruro Reducción virulencia Canero and Roncero, 2008b

CTF1 Factor transcripción Full virulencia Rocha et al., 2008

CTI6 Factor transcripción Reducción virulencia Michielse et al., 2009


- 12 -

DCW1 Proteína de pared celular Reducción virulencia Michielse et al., 2009

FCD1 Quinona-celobiosa Full virulencia Kawabe et al., 2006

EBR1 Factor transcripción Reducción virulencia Zhao et al., 2011

FGA1 Subunidad α proteína G Reducción virulencia Jain et al., 2002

FGA2 Subunidad α proteína G Resistencia a shock

térmico

Jain et al., 2005

FGB1 Subunidad β proteína G Reducción virulencia Jain et al., 2003

FMK1 Proteína quinasa Afecta colonización raíz Di Pietro et al., 2001a

FNR1 Factor de transcripción Reducción virulencia Divon et al., 2006

FOW1 Transportador mitocondrial Reducción virulencia Inoue et al., 2002

FOW2 Factor de transcripción Afectado en el

crecimiento

Imazaki et al., 2007

FPD1 Regulador de transporte

cloruro

Reducción virulencia C.B. Michielse et al., 2009

FRP1 Proteína F-box Afecta colonización y

penetración

Duyvesteijn et al., 2005

FSO1 Fusarium so1 Fusión de hifas Rosales and Di Pietro, 2008

FTF1 Factor de transcripción Reducción virulencia Ramos et al., 2007

GAS1 Β-1,3-

glucanosyltransferasa

Reducción virulencia Caracuel et al., 2005

ICL1 Isocitrato liasa Full virulencia Jonkers et al., 2009

LCC1 Lacasa Full virulencia Cañero and Roncero, 2008a



PacC Factor de transcripción Incrementa la virulencia Caracuel et al., 2003

PEX12 Peroxina Full virulencia, reduce

crecimiento saprofitico

Di Pietro y Roncero, 1998

PEX26 Peroxina Reduce virulencia Michielse et al., 2009

PG1 Endopoligalacturonasa Full virulencia Di Pietro y Roncero, 1998

PG5 Endopoligalacturonasa Full virulencia Garcia-Maceira et al., 2000

PGX4 Endopoligalacturonasa Full virulencia Garcia-Maceira et al., 2000

PL1 Pectato liasa Full virulencia Huertas-González et al.,

1999

PRT1 Serín proteasa Full virulencia Di Pietro et al., 2001

REN1 Factor transcripción Full virulencia, no

produce macro y

microconidios

Ohara et al., 2004

RH01 Proteína G Reducción virulencia Martínez-Rocha et al., 2008

Introducción

- 13 -

RHR1 Factor transcripción Uso de fuente carbono Pardo y Orejas, 2014

SGE1 Factor transcripción Reduce conidiación Michielse et al., (no publicado

SIX1 Secreción de pequeñas

proteínas

Full virulencia Rep et al., 2005

SIX6 Secreción de pequeñas

proteínas

Reducción virulencia Gawehns et al., 2014

SNF1 Proteína quinasa Reducción virulencia Ospina-Giraldo et al., 2003

STI35 Biosíntesis tiamina Full virulencia Ruíz-Roldan et al., 2008

STUA Factor transcripción Full virulencia Ohara y Tsuge, 2004

TOM1 Enzima tomatinasa Reducción virulencia Pareja-Jaime et al., 2008

WC1 Fotoreceptor Full virulencia Ruíz-Roldan et al., 2008b

XLNR Factor transcripción Full virulencia Calero-Nieto et al., 2008

XYL3 Endoxylanasa 10 Full virulencia Gómez -Gómez et al., 2002



1.4 Genómica de F. oxysporum: genoma nuclear y genoma adaptativo,

expansiones génicas

En la actualidad la disponibilidad de secuencias completas de 11 genomas del género

Fusarium, así como la disponibilidad de mapas genéticos y físicos completos, proporcionan

una excelente oportunidad para la identificación de nuevos genes implicados en procesos

de patogenicidad y virulencia, así como en la producción de micotoxinas de importancia

médica e industrial. Se ha comprobado que las distintas especies de Fusarium varían en

el tamaño de sus genomas y en el número de cromosomas (Ma et al., 2013). En F.

oxysporum f. sp. lycopersici se han identificado 15 cromosomas que componen un genoma

nuclear de 61 Mb. F. verticillinoides cuenta con 11 cromosomas que componen un genoma

nuclear de 42 Mb y F. graminearum con 4 cromosomas y un genoma nuclear de 36 Mb (Ma

et al., 2013). El genoma de F. oxysporum es el más grande de todos los genomas de

Fusarium analizados y presentan una identidad del 91 % con el genoma de F.verticillioides,

y del 85 % con el genoma de F. graminearum (Ma et al., 2013).

La identificación de cromosomas supernumerarios provee clara evidencia de la

compartamentalización del genoma tanto a nivel funcional y estructural, esencialmente por

la división del genoma en dos componentes, (1) un genoma central que codifica funciones

necesarias para crecimiento y supervivencia y (2) un componente accesorio que codifica

factores de patogenicidad/virulencia y metabolitos secundarios. Akagi et al (2009) reportan


- 14 -

que la transferencia de cromosomas numerarios podría proporcionar un mecanismo para

la evolución de la patogenicidad de las especies de Fusarium (Han et al., 2001). Esta

hipótesis ha sido comprobada experimentalmente sobre Solanum lycopersicum in vitro

mediante la transferencia de cromosomas supernumerarios entre cepas de F. oxysporum

(Ma et al., 2010). Probablemente los cromosomas supernumerarios potencien la virulencia

específica sobre el hospedero (Han et al., 2001) y pueden haber sido importantes para la

adaptación específica a un hospedero determinado dentro del complejo de especies de F.

oxysporum y la rápida emergencia de nuevos patógenos (Ma et al., 2010). Los

cromosomas supernumerarios presentan una serie de características que los hacen

particularmente interesantes en este contexto: (1) carecer de genes constitutivos

involucrados en procesos metabólicos secundarios, (2) presentar altos contenidos de

Guanina y Citosina (G+C), (3) carecer de sintenia con especies relacionadas y (4) contener

un gran número de elementos transponibles (Jonkers et al., 2014) que probablemente

fueron obtenidos por vía de transferencia horizontal. Los cromosomas transferidos

lateralmente de una cepa patógena a una cepa no patógena pueden convertir a la cepa no

patógena en patógena (Ma et al., 2010).

El 40 % del genoma de F. oxysporum f. sp. lycopersici está estructurado por cromosomas

extras conocidos como regiones LS-Fol (específicos del linaje de Fol) que son diferentes a

los cromosomas del genoma central. Las regiones LS-Fol incluyen los cromosomas 3, 6,

14 y 15, y partes del cromosoma 1 (parte 27) y cromosoma 2 (parte 31) y en conjunto

alcanzan un tamaño de 19 Mb. La región LS-Fol contiene más del 74 % de elementos

transposables. Alrededor del 28 % de todo el genoma de Fol contiene secuencias

repetitivas, incluido muchos retro-transposones como las secuencias LINES (elementos

nucleares dispersos largos) y SINES (elementos nucleares dispersos cortos) (Ma et al.,

2010).

1.5 F. oxysporum f. sp. phaseoli

F. oxysporum f. sp. phaseoli es el agente causal de la marchitez vascular de plantas de

judía (Phaseolus vulgaris L.) y está presente en todos los cultivos de judías en el mundo

(Pastor-Corrales and Abawi, 1987; Alves-Santos et al., 2002b). La inadecuada rotación de

cultivos, especialmente en áreas de irrigación con central pivotante, y la falta de medidas

de control de la diseminación del patógeno han convertido a la marchitez vascular

producida por Fusarium en judía en una de las enfermedades más importantes

económicamente en el mundo sobre este cultivo (Pastor-Corrales and Abawi, 1987). La

Introducción

- 15 -

primera descripción de la fusariosis vascular de la judía la realizó Harter en 1928 en

California (Harter, 1929; revisado en Aloj et al., 1983) y la caracterización del patógeno la

llevaron a cabo Kendrich y Snyder (Kendrick y Snyder, 1942).

1.5.1 Sintomatología y clasificación

La sintomatología de la enfermedad es típica de la marchitez vascular producida por F.

oxysporum, con la aparición de procesos de amarilleamiento, clorosis y decaimiento. El

hongo penetra por la raíz y el hipocótilo a través de heridas y aberturas naturales y se

multiplica en el tejido vascular de la planta hasta que lo colapsa. Aunque la temperatura

óptima para el desarrollo de la enfermedad es de unos 20ºC, el máximo desarrollo micelial

de F. oxysporum f. sp. phaseoli ocurre a 28 ºC (Hagedorn, 1991). Al igual que en otras

formas especiales, en F. oxysporum f. sp. phaseoli es posible establecer una clasificación

en «razas» en función de la capacidad patogénica de los aislados sobre una serie de

variedades diferenciales de judía (Aloj et al., 1987; Gordon and Martyn, 1997; Alves-Santos

et al., 2002a). Hasta el momento se han identificado 7 razas: Ribeiro and Hagerdon

describieron en 1979 la raza 1 en Carolina del Sur (EEUU) y en Brasil la raza 2 (Ribeiro

and Hagerdorn, 1979). La raza 3 se descubrió en Colombia (Pastor-Corrales and Abawi,

1987), la raza 4 en Colorado EE.UU. (Salgado and Schwartz, 1993), la raza 5 en Grecia

(Woo et al., 1996) y las razas 6 y 7, las últimas descritas hasta el momento, en aislados

procedentes de España y Grecia, respectivamente (Alves-Santos et al., 2002a).

1.5.2 La importancia del cultivo de la judía

La judía (Phaseolus vulgaris L.), pertenece a la familia Leguminosae, es autógama y de

germinación epigea. La temperatura óptima de crecimiento está entre los 15.6 y 21.1 ºC

(Michaelis, 1991). Las variedades cultivadas son herbáceas anuales, de crecimiento

determinado, y sus semillas presentan una gran variabilidad en cuanto a tamaño, forma y

color según las variedades. Constituyen un alimento de bajo coste y rico en proteínas y

carbohidratos. Los registros arqueológicos más antiguos datan del 8.000 a.C. en Perú, y

de 7.000 a.C. en México, y parecen indicar que la domesticación se produjo en estas dos

regiones del continente americano: la región andina y la región mesoamericana (Michaelis,

1991). La judía fue introducida en España y Portugal desde los primeros viajes al continente

americano, y los estudios del patrón de faseolinas parecen indicar que provienen de

cultivares situados en Chile (Gepts and Bliss, 1988). Los mayores productores de judía a

nivel mundial son Brasil y la India con unas 3.000.000 toneladas anuales. La producción


- 16 -

en España en el 2004 alcanzó las 17.700 toneladas y la superficie cultivada unas 11.100

ha (FAOSTAT, 2004), representando el 15 % de la producción en la Unión Europea. Entre

las variedades más valoradas se encuentran las judías de “El Barco de Ávila”, como la

Riojana o Blanca Riñón, la Blanca Redonda, la Plancheta o Planchada, la Morada Larga,

la Morada Redonda, el Judión del Barco y la Arrocina.

El problema sanitario más importante del cultivo de la judía en “El Barco de Ávila” es la

Fusariosis Vascular (Díaz-Mínguez et al., 1996), también denominado “quema” o

“rastrojera”. La marchitez vascular no es una enfermedad nueva y su importancia

económica ya fue reconocida en 1926 cuando se hizo un estudio acerca de los daños

causados en las cosechas de judías de esta zona (Benlloch and Cañizo, 1926).

Probablemente los suelos ácidos, la abundancia de agua para el riego y las labores

culturales tradicionales son los que han favorecido la gran incidencia de la enfermedad en

esta comarca.

Por la importancia económica y alimentaria de este cultivo nuestro grupo de investigación

se interesó en el estudio de este patógeno en cultivos de judía de esta zona desde hace

20 años mediante inspecciones sistemáticas y periódicas de campos de judías de los

alrededores de “El Barco de Ávila” y de los pueblos colindantes de la comarca (La Carrera,

Solana de Ávila, Navalonguilla, Tormellas, Bohoyo, Los Llanos del Tormes, etc.). En

aquellos casos en los que se detectaron plantas con síntomas, se tomó como muestra

generalmente la planta completa. In situ pudo observarse que los amarilleamientos y la

marchitez estaban acompañados por decoloraciones de los haces vasculares que

afectaban al tallo de la planta enferma en grados distintos.

A partir de las muestras recolectadas se purificaron más de 140 aislados de F. oxysporum.

Muchos de ellos resultaron no ser patógenos, como confirmaron los resultados de los

ensayos de infección de dos variedades de judía «Blanca Riñón» y «Blanca Redonda»,

mientras que algunos reprodujeron en infecciones contraladas en condiciones de

laboratorio los mismos síntomas de la enfermedad detectados en campo (Díaz-Mínguez

et al., 1996). En función de los resultados obtenidos los aislados pueden subdividirse en

dos grupos según su grado de virulencia y el índice de progreso de enfermedad según la

escala CIAT (van Schoonhoven y Pastor-Corrales, 1987): estirpes muy virulentas y

estirpes poco virulentas. Los datos obtenidos en nuestro laboratorio mostraron que los

aislados procedentes de “El Barco de Ávila” se encuentran entre los más virulentos de los

analizados hasta ahora en todo el mundo. De hecho, su comportamiento patogénico

Introducción

- 17 -

parecía diferente al de otros aislados de F. oxysporum f. sp. phaseoli (Woo et al., 1996),

lo que finalmente indicó que estos aislados contituyen una nueva raza, la raza 6 de FOP

(Alves-Santos et al., 2002a). Además de poseer una amplia colección de aislados (no

patógenos, patógenos poco virulentos y patógenos muy virulentos) muy bien

caracterizadas fisiológica y genéticamente (Alves-Santos, 1999), disponemos también,

fruto de análisis previos, de marcadores moleculares de tipo RAPD que permiten distinguir

entre aislados de F. oxysporum f. sp. phaseoli patógenos y no patógenos (Alves-Santos

et al., 2002a). En la Tabla 3 se muestran las estirpes obtenidas de cultivos de judía en la

comarca de “El Barco de Ávila” consideradas como representativas de los grupos

indicados.

Tabla 3. Estirpes representativas de F. oxysporum f. sp. phaseoli aislados de cultivos de judía de la comarca de “El Barco de Ávila”.

Cepa Origen Patogenicidad Año Raza VCG

*FOP-SP1 El Barco de Ávila Muy virulento 1993 6 0167

FOP-SP2 El Barco de Ávila Muy virulento 1996 6 0167

FOP-SP3 El Barco de Ávila Muy virulento 1996 6 0168

*FOP-SP4 El Barco de Ávila Poco virulento 1994 6 0166

FOP-SP5 El Barco de Ávila Poco virulento 1994 6 0166




FOP-SP9 Navalonguilla Poco virulento 1994 6 0166

AB82 El Barco de Ávila NO patógeno 1995 - 0167

AB92 El Barco de Ávila No patógeno 1995 - 0167

AN6 Navalonguilla No Patógeno 1994 - 1

* Estirpes utilizadas en este trabajo.

1.6 El óxido nítrico

1.6.1 Descripción

El óxido nítrico (NO) es una molécula formada por dos átomos, un átomo de oxígeno (O) y

otro de nitrógeno (N). El oxígeno tiene 6 electrones y el nitrógeno tiene 7 electrones; cuando

estos dos átomos reaccionan entre sí, sus electrones se aparean para formar una molécula

de NO•, que contiene un electrón desapareado. La presencia del electrón desapareado


- 18 -

permite al NO• interaccionar rápidamente con otros átomos que son abundantes en los

sistemas biológicos, tales como el Nitrógeno (N) y el azufre (S) que forman parte de las

proteínas. La reacción del NO con las proteínas u otras moléculas se llama nitración y este

proceso le confiere actividad fisiológica (Stamler et al., 1992).

El NO también reacciona con átomos metálicos como el hierro (Fe), el cual forma parte de

proteínas que se conocen como ferroproteínas o hemoproteínas, fundamentales en la

regulación de un gran número de funciones biológicas y la generación de señales químicas

intracelulares. Por otro lado, el NO reacciona rápidamente con el oxígeno molecular (O2) y

con los radicales libres superóxido (•O2-) e hidroxilo (•OH), los cuales son sumamente

tóxicos (Stamler et al., 1992).

1.6.2 Funciones fisiológicas del NO

El NO es una molécula pequeña, con una vida media de 5 segundos, que difunde

libremente a través de la membrana plasmática. Por estas razones, alcanza rápidamente

las moléculas que se encuentran en el interior de la célula, a diferencia de las proteínas y

algunas hormonas que regulan la fisiología celular. La complejidad en la acción de estas

moléculas requiere de receptores en la superficie celular para poder entrar o salir, no así

en el caso del NO, cuyas propiedades químicas lo convierten en un excelente mediador de

respuestas celulares produciendo una amplia gama de efectos biológicos. Por ello, la

síntesis y regulación del NO es de suma importancia para el organismo. El NO, además de

ser producido en los vasos sanguíneos de los mamíferos, también se sintetiza en los

macrófagos, células inmunes que responden ante la agresión por algunos agentes

patógenos (MacMicking et al., 1997). En otros sistemas biológicos se produce por diversos

mecanismos. Así, las enterobacterias y las bacterias denitrificantes pueden sintetizarlo

mediante sistemas enzimáticos sencillos, tales como la nitrato y nitrito reductasa (Spiro,

2007). Las plantas también lo producen a través de la nitrato reductasa cuando las

concentraciones intracelulares de nitrito son muy elevadas (Meyer et al., 2005).

En humanos, el NO cumple varias funciones fisiológicas: actúa como neurotransmisor,

tiene actividad vasodilatadora, es estimulante de la síntesis de músculo liso vascular, inhibe

la actividad plaquetaria, participa en la génesis de enfermedades como hipertensión y en

el shock séptico y colabora en la regulación del reclutamiento de células inflamatorias

dentro de la pared vascular, entre otras (Vallance and Collier, 1994; Court et al., 2002). El

NO también es generado por macrófagos y neutrófilos como parte de la respuesta inmune,

Introducción

- 19 -

y resulta tóxico para bacterias y patógenos humanos (Ignarro, 1990; Napoli et al., 2009).

En plantas el NO está implicado en varios procesos fisiológicos tales como la resistencia a

enfermedades, estrés abiótico, muerte celular, respiración, senescencia, desarrollo de la

raíz y germinación de semillas, entre otras (Freschi et al., 2010; Zafra et al., 2010; Besson-

Bard et al., 2008). En hongos el NO participa en varias funciones fisiológicas como

desarrollo asexual de esporas, formación de cuerpos de fructificación, supresión de la

formación de pseudomicelio y germinación de microconidios. A pesar de la importancia del

NO en una gran variedad de procesos fisiológicos fúngicos, sus mecanismos de actuación

son en gran parte todavía desconocidos (Samalova et al., 2012).

1.6.2.1 Síntesis de NO en animales, plantas y hongos

En animales, la biosíntesis de NO está catalizada por la óxido nítrico sintasa (NOS), la cual

oxida L-arginina a L-citrulina con producción de NO (Moncada et al., 1991). Se han

identificado tres isoformas de NOS: dos constitutivas, NOS neuronal (nNOS) y endotelial

(eNOS), implicadas en el control de la vasodilatación y en la neurotransmisión,

respectivamente, y cuya actividad está controlada por la concentración de Ca2+ (Stuehr,

1999; Alderton et al., 2001). Existe una tercera NOS de expresión inducible (iNOS), cuya

actividad no es afectada por Ca2+ pero sí controlada por hormonas peptídicas producidas

en respuesta a infecciones (Macmicking et al., 1995). Las enzimas NOS requieren para su

activación de cofactores como la flavina mononucleótido (FMN), flavina adenina

dinucleótido (FADH) y tetrahidrobiopterina (BH4). Todas las NOS poseen dos dominios:

oxigenasa (con un centro hemo) y reductasa (contiene sitios de unión para NADPH, FAD

y FMN). Ambos dominios están conectados por un sitio de unión a calmodulina (Alderton

et al., 2001).

En plantas, a diferencia de lo que sucede en sitemas animales, existen varios mecanismos

de producción de NO. Estos pueden dividirse en dos grupos de acuerdo al sustrato

implicado: (1) producción de NO a partir de L-arginina, y (2) producción de NO a partir de

nitrato (NO3). La existencia de enzimas de tipo NOS en plantas ha sido analizada mediante

el uso de anticuerpos anti-NOS de animales (Kuo et al., 1995), la detección de la actividad

NOS en extractos vegetales (Cueto et al., 1996; Ribeiro et al., 1999; Simontacchi et al.,

2004) y mediante el uso de inhibidores específicos (Cueto et al., 1996, Bright et al., 2006,

Valderrama et al., 2007). A nivel subcelular, la actividad NOS ha sido asociada a

peroxisomas (Corpas et al., 2001), cloroplastos (Jasid et al., 2006), mitocondrias (Kaiser et

al., 2006) y citoplasma (Ribeiro et al., 1999). Sin embargo, a pesar de los indicios


- 20 -

acumulados sobre la existencia de NOS en plantas, aún no se ha identificado la proteína

responsable de esta actividad.

La actividad de la enzima nitrato reductasa (NR) sí ha sido identificada como una fuente

importante de producción de NO en plantas. Klepper (1990) reportó que durante

tratamientos con herbicidas, las plantas de soja alteradas en la NR emitían menores niveles

de NO que plantas de tipo silvestre. La capacidad de la NR para producir NO a partir de

nitrito y NADH es más importante cuando las plantas se someten a condiciones de anoxia

(Rockel et al., 2002).

La producción no-enzimática de NO a partir de formas oxidadas del nitrógeno también

parece ocurrir en plantas. Los pigmentos carotenoides son capaces de producir NO a partir

de NO2, en una reacción dependiente de la luz (Cooney et al., 1994). Además, se ha

observado generación de NO a partir de nitrito en el apoplasto de células de la aleurona

bajo condiciones reductoras y a un pH de 5,5 (Bethke et al., 2004). Parecería ser que la

contribución de las distintas fuentes de NO en plantas dependería de la especie, célula o

tejido involucrado, y de las condiciones de crecimiento y fisiológicas de la planta (Neill et

al., 2003).

La información disponible sobre la síntesis de NO en hongos patógenos es muy limitada,

pero existen evidencias experimentales que demuestran que los hongos del género

Aspergillus spp. (A. niger, A. flavus y A. oryzae) y Glomerella graminícola obtienen NO a

través de una vía dependiente de L-arginina usando un complejo sistema “NOS-like” (Lapp

et al., 2014). Existen evidencias de síntesis de NO dependiente de la L-arginina en

mutantes de Coniothyrium minitans que muestran defectos en la conidiación; estas

alteraciones se corrigen cuando se suministra a los mutantes L-arginina o NO, lo cual

sugiere que se requiere la oxidación de L-arginina a NO para la conidiación (Gong et al.,

2007). En concordancia con este fenotipo, los inhibidores NOS de mamíferos provocan

reducción de los niveles de NO celular y retraso y reducción de la conidiación (Gong et al.,

2007; Li et al., 2010). La actividad NOS-like ha sido evaluada en otras especies de hongos

con inhibidores anti-NOS de mamíferos como L-NAME y 1-[2-(trifluorometil) fenil]-

Imidazole). La presencia de L-NAME inhibe la actividad de NOS y suprime la síntesis de

NO en Saccharomyces cerevisiae (Kanadia et al., 1998), Neurospora crassa, Phycomyces

blakesleeanus (Li et al., 2010), Trichoderma harzianum (Samolski et al., 2009), en el hongo

acuático Blastocladiella emersonii (Vieira et al., 2009), en Blumeria graminis (Prats et al.,

2008) y en Colletotrichum coccodes (Wang and Higgins, 2005). Sin embargo, la presencia

Introducción

- 21 -

de L-NAME en cultivos de Botrytis cinerea no afecta a la producción de NO (Turión-Gómez

et al., 2011). Samalova et al. (2012) demostraron que Magnoporte oryzae no utiliza la vía

dependiente de NOS y tampoco la vía dependiente de la NR para la síntesis de NO

endógeno. Recientemente se ha demostrado que en A. nidulans la enzima NR está

implicada en la síntesis de NO (Marcos et al., 2016).

1.6.2.2 NO en la interacción planta-patógeno

Cuando la célula vegetal detecta la presencia de un patógeno, se activa una potente

reacción de defensa inducida conocida como respuesta hipersensible (HR). La HR es más

severa en el tejido que está directamente en contacto con el patógeno y más flexible en los

tejidos no infectados de la planta (Mur et al., 2008). Básicamente este tipo de reacción

permite potenciar las barreras, tanto químicas como estructurales, que los tejidos vegetales

mantienen en forma constitutiva. Uno de los procesos activados durante esta respuesta

defensiva es la producción de altas concentraciones de potentes agentes oxidantes como

las especies reactivas de oxígeno (ROS). Además, la planta produce altas concentraciones

de otras hormonas como etileno, óxido nítrico (NO), ácido jasmónico y sus derivados (JA),

y otros antibióticos o fitoalexinas (Belenghi et al., 2007). Como producto de la acción de la

HR se activa el mecanismo de muerte celular denominado muerte celular programada o

apoptosis ampliamente estudiado en mamíferos. El concepto fue desarrollado a principios

del siglo XX (Stakman, 1915) y desde entonces ha sido extensamente estudiado (Mur et

al., 2008).

La muerte de células vegetales inducida durante la HR depende de la producción de NO y

de especies reactivas de oxigeno (Delledonne et al., 2001). En sistemas animales, el NO

reacciona con el anión superóxido (O2-), resultando en la formación del peroxinitrito

(ONOO−), el cual es altamente tóxico para células de mamíferos y puede resultar en

apoptosis o daños celulares (Bonfoco et al., 1995). En el caso de sistemas vegetales, el

O2- se transforma en H2O2 por medio de la superóxido dismutasa (SOD) durante la HR,

reaccionando el NO con el H2O2 para producir ONOO− (Delledonne et al., 2001). Las

concentraciones de ONOO− entre 1 y 1000 μM son tóxicas para células animales,

provocando la muerte celular (Lin et al., 1995). Sin embargo, las células vegetales

muestran una gran resistencia a ONOO−, ya que se ha demostrado que las suspensiones

de células de soja resisten hasta 1 mM de ONOO− (Delledonne et al., 2001). Asimismo, los

mutantes de A. thaliana carentes del gen de la peroxiredoxina II E (PrxIIE), la cual detoxifica

ONOO− en planta, no muestran diferencias en muerte celular con el tipo silvestre tanto en


- 22 -

muestras sin tratamiento como en muestras tratada con 3 mM de ONOO− (Romero-Puertas

et al., 2007).

La familia de proteínas caspasas actúa en la regulación de los programas de muerte celular

de mamíferos (Martin and Green, 1995). Las caspasas están inactivadas en células sanas

y se activan durante condiciones de estrés o infección, produciéndose la liberación de

citocromo C desde las mitocondrias, el cual interacciona con la proteína codificada por

Apaf1 para activar la cascada de caspasas (Adams and Cory, 2002). Los genomas de

plantas no contienen homólogos a las caspasas, pero se pueden encontrar proteínas

similares como las metacaspasas, cuya actividad en Arabidopsis está regulada por NO

mediante la S-nitrosilación (Belenghi et al., 2007). Las metacaspasas, responsables de la

señalización en los programas de muerte celular (Chichkova et al., 2004), son insensibles

al NO cuando están maduras, aunque pueden permanecer inactivas mediante S-

nitrosilación (Belenghi et al., 2007).

El óxido nítrico tiene efectos en el crecimiento y desarrollo de la planta, en buena medida

en interacción con otras hormonas, y regula procesos relacionados con la muerte celular

programada, con el cierre estomático y con la germinación de la semillas, (Cevahir et al.,

2007). Los mecanismos en los que afecta el NO a los procesos de transducción de señales

implican proteínas de señalización clave como proteínas quinasas y canales permeables

de Ca2+, así como la movilización de mensajeros secundarios que incluyen Ca2+, cAMP y

cADPR (Courtois et al., 2008). La S-nitrosilación consiste en la unión covalente de una

molécula de NO al grupo tiol de la cisteína (Mannick and Schonhoff, 2002) y constituye el

aspecto más extendido y funcionalmente importante de la modificación postranscripcional

por NO (Hess et al., 2005). Es un proceso reversible, recuperándose los grupos tiol de la

cisteína y formándose S-nitrosoglutatión (GSNO) gracias a la actividad en A. thaliana de la

GSNO reductasa 1 (AtGSNOR1), la cual está a su vez implicada en la protección contra

patógenos (Feechan et al., 2005). La peroxiredoxina, PrxIIE, es responsable de la

degradación de ONOO−. Sin embargo el NO es capaz de autorregular sus propios radicales

mediante la desactivación de proteínas como la PrxIIE (Romero-Puertas et al., 2007).

1.6.3 Fuentes de nitrógeno utilizadas por los hongos

Los organismos vivos dependen de nitrógeno, ya que es un elemento integral de

numerosas moléculas necesarias para la vida, como aminoácidos, ácidos nucleicos o

Introducción

- 23 -

proteínas. Cuando se dispone de nitrógeno reducido todas las vías involucradas en la

asimilación de fuentes alternativas, incluida la vía de asimilación de nitrato, sufren un

proceso de regulación negativa. Esta regulación es partciularmente evidente en los hongos.

En base al efecto que tienen sobre el metabolismo del nitrógeno se puede distinguir entre

fuentes de nitrógeno preferidas, que desencadenan la regulación negativa del catabolismo

de compuestos alternativos de nitrógeno, o no preferidas (Magasanik and Kaiser, 2002).

La glutamina es una de las fuentes nitrogenadas preferidas por excelencia. Se trata de un

producto final de la confluencia entre las vías metabólicas del carbono y del nitrógeno y a

partir de ella la célula puede sintetizar biomoléculas tan importantes como aminoácidos,

purinas, pirimidinas. Además, la velocidad de crecimiento de la mayoría de los

microorganismos asimiladores en un medio con glutamina como única fuente de nitrógeno

es superior a la detectada en medios con otras fuentes de nitrógeno menos reducidas

(Magasanik, 2002). Otra fuente preferida es el amonio que puede incorporarse a los

esqueletos carbonados, procedentes del ciclo de Krebs, reaccionando con el α-

cetoglutarato dando lugar a glutamato por acción de la glutamato deshidrogenasa, o

reaccionando directamente con el glutamato para generar glutamina por acción de la

glutamina sintetasa. Sin embargo en ausencia de las fuentes primarias de nitrógeno varias

fuentes alternativas o secundarias de nitrógeno como nitrato, purinas, aminoácidos y

aminas, pueden ser utilizados por los organismos una vez que las fuentes primarias se han

agotado (Cove, 1970; Marzluf, 1997; Wong, et al., 2008). La llamada represión catabólica

por nitrógeno es la responsable de que la célula no sintetice permeasas y enzimas

exclusivas para la asimilación y metabolismo de fuentes de nitrógeno no preferidas,

evitando el gasto innecesario de energía por parte de la célula (Marzluf, 1997; Magasanik,

1992; Magasanik, 2005; Godard et al., 2007). En los hongos filamentosos la regulación del

catabolismo del nitrógeno está mediada por los factores GATA, AreA y Nit2. Se trata de

reguladores positivos que median la señal de desrepresión activando la expresión de los

genes del catabolismo del nitrógeno en ausencia de fuentes de nitrógeno preferidas (Kudla

et al., 1990; Minehart and Magasanik, 1991; Marzluf, 1997). La señal de desrepresión es

contrarrestada en el momento en el que una fuente preferente de nitrógeno vuelve a estar

presente en el medio (Dunn-Coleman et al., 1981; Xiao et al., 1995; Andrianopoulus et al.,

1998). Los mutantes deficientes del gen areA son incapaces de utilizar otras fuentes de

nitrógeno que no sea amonio o L-glutamina (Kudla et al., 1990).

Las enzimas y permeasas que controlan la vía catabólica del nitrógeno requiere de dos

señales positivas: (1) La detección de ausencia de fuentes primarias de nitrógeno como

amonio y L-glutamina (desrepresión), y (2) la expresión solamente de las enzimas de una


- 24 -

vía catabólica específica de muchos candidatos potenciales dentro del circuito regulatorio

del nitrógeno (ejemplo nitrato o nitrito). Para el metabolismo del nitrato o nitrito se necesita

la acción sinérgica de AreA y NirA (Narendja, 2002; Berger 2006). Por otro lado, NirA es

un factor de transcripción especifico de la vía y actúa de manera cooperativa con AreA

mediando la activación trascripcional del grupo de genes implicados en la asimilación del

nitrato (Bernreiter, et al., 2007).

1.6.4 La desnitrificación del nitrato en procariotas

La denitrificación anaerobia es un proceso respiratorio alternativo en procariotas en

ausencia de O2. Durante este proceso las procariotas reducen nitratos (NO3-) a nitritos

(NO2-), óxido nitroso (N2O) y dinitrógeno (N2) (Zumft, 1997), mediante cuatro reacciones

catalizadas por las enzimas nitrato reductasa (Nar), nitrito reductasa (Nir), óxido nítrico

reductasa (Nor) y óxido nitroso reductasa (Nos), respectivamente (Shoun et al., 1992;

Zumft, 1997). La mayoría de las especies de organismos desnitrificantes son facultativos,

con posibilidad de emplear oxígeno o nitrato y nitrito como aceptor final de electrones. La

producción energética (ATP) a partir de nitrato y nitrito es menor que la obtenida a partir de

oxígeno, y mayor que la obtenida a partir de la reducción de sulfato.

La reducción de NO3 esta acoplada a la producción de ATP, lo que permite a la célula

crecer en ausencia de O2. La capacidad de desnitrificar está muy extendida entre varias

subclases de proteobacterias y en las arqueobacterias (Zumft, 1997). Aunque la

denitrificación es una característica propia de las bacterias anaerobias facultativas, y se

considera que sólo ocurre en ausencia de O2, se han descrito algunas especies del género

Paracoccus capaces de desnitrificar en condiciones aeróbicas (Shoun et al., 1992).

La capacidad desnitrificante también está presente en hongos ascomicetes, zygomycetes,

Basidiomycetes y hongos imperfectos, favoreciendo la capacidad de adaptación de estos

organismos a ambientes pobres en oxígeno (Ronald y Laughlin, 2002).

Introducción

- 25 -

1.6.5 Desnitrificación y producción de NO en F. oxysporum

Los cambios rápidos en la disponibilidad de oxígeno constituyen un desafío permanente

para muchos organismos que viven en el suelo. Las bacterias anaerobias facultativas

pueden adaptarse inmediatamente a los rápidos cambios en la concentración de oxígeno,

mediante la alteración de su metabolismo energético (Takaya et al., 2002). Por el contrario,

se sabe mucho menos acerca de los mecanismos adaptativas en eucariotas, aunque

muchos eucariotas inferiores pueden sobrevivir en condiciones anóxicas. La mayoría de

estos eucariotas anaerobios se han adaptado de forma permanente a ambientes extremos

(Takaya et al., 2002).

F. oxysporum fue el primer eucariota en el cual se demostró actividad desnitrificadora en

condiciones anaerobias (Shoun and Tanimoto, 1991), la cual fue posteriormente

encontrada en otros organismos del grupo (Shoun et al., 1992), tales como A. oryzae y

Cylindrocarpon tonkinense. Estos hongos muestran actividad desnitrificante reduciendo

nitrato y nitrito a nitrógeno gaseoso (Shoun, 1992; Nakanishi et al., 2010). En F. oxysporum

la denitrificación se realiza a través de la conversión del nitrato (NO3) a nitrito (NO2),

catalizada por la nitrato reductasa, y de éste a óxido nitroso (N2O), reacción catalizada por

la nitrito reductasa (Zhou et al., 2001). F. oxysporum no tiene actividad óxido nitroso

reductasa, por lo que el óxido nitroso (N2O) resultante se liberaría al ambiente, a diferencia

de lo que ocurre en bacterias, las cuales liberan nitrógeno gaseoso. La conversión de nitrito

a óxido nitroso tiene lugar en dos fases, una primera en la cual el nitrito se convierte en

óxido nítrico, y una segunda en la cual éste se convierte en óxido nitroso. De esta forma,

la actividad desnitrificante constituye un mecanismo de producción de NO. La reducción

del NO a óxido nitroso depende de una forma única de nitrito reductasa (nor), la P450-nor.

Aunque en un principio se pensó que esta actividad constituía un mecanismo de

detoxificación de NO, en realidad el sistema desnitrificante de F. oxysporum está localizado

en las mitocondrias, acoplado a la cadena de transporte de electrones, por lo que permite

a la célula respirar anaeróbicamente y producir ATP bajo hipoxia, (Kobayashi et al., 1995),

de la misma forma que ocurre en bacterias. Estudios realizados por Zhou et al. (2001)

demostraron que los cultivos suplementados con NO3 como única fuente de nitrógeno y

expuesto a condiciones limitantes de O2 mostraron concentraciones elevadas de óxido

nitroso (N2O) en relación con la cantidad de NH4. En altas concentraciones de O2 no se

detectó la presencia de NH4 y tampoco de N2O. En la siguiente reacción se muestra el

proceso de la desnitrificación desasimilatoria del nitrato en F. oxysporum.


- 26 -

También se ha demostrado que, en condiciones anaeróbicas, se puede producir

desnitrificación asimilatoria o fermentación del amonio, es decir, la reducción del NO3 a

NO2 y de éste a amonio (NH4) en ausencia absoluta de oxígeno (O2). La fermentación del

amonio se lleva a cabo por las enzimas nitrato reductasa (Nar) y nitrito reductasa (Nir),

obteniéndose como producto final el amonio (NH4), que es introducido en los esqueletos

de las cadenas carbonadas (Zhou et al., 2002). La evidencia obtenida muestra que F.

oxysporum es capaz de adaptarse a la presencia de condiciones variables de oxígeno. En

ausencia completa de oxígeno tiene lugar la fermentación del amonio, la cual es

reemplazada por la desnitrificación disimilatoria a medida que se incrementa el aporte de

oxígeno, hasta llegar a una respiración totalmente aerobia cuando la presencia de oxígeno

es suficiente (Zhou et al., 2002). En la siguiente reacción se muestra el proceso de la

desnitrificación asimilatoria o fermentación del amonio en F. oxysporum.

El metabolismo asimilatorio o fermentación del amonio fue evaluado en 17 cepas de

hongos más o menos relacionados con F. oxysporum, cultivados en ausencia de O2

(anoxia). Los resultados mostraron que 15 de ellas eran capaces de convertir el nitrato en

amonio en ausencia de O2 (Zhou et al., 2002).

1.7 Las flavohemoglobinas

1.7.1 Origen de las flavohemoglobinas

Las flavohemoglobinas forman parte de la superfamilia de las globinas que emergieron a

partir de un dominio globina de un antecesor bacteriano (Vinogradov et al., 2005). La

superfamilia de las globinas está dividida en tres linajes (Vinogradov et al., 2008). En el

primer linaje se encuentran las proteínas flavohemoglobinas (FHG´s) formada por un

dominio hemoglobina N-terminal que reversiblemente se une al O2 y un dominio activo

redox C-terminal con potenciales sitios de unión para FAD y NAD(P)H. Estas proteínas

están ampliamente distribuidas en bacterias, levaduras y hongos. Su función está

Introducción

- 27 -

relacionado con la protección a estrés nitrosativo (Poole, 1994). En el segundo linaje se

agrupan las globinas con un dominio globina N-terminal acoplado a un dominio de la

protoglobina. Estas globinas están ausentes en eucariotas y están distribuidas en

arqueobacterias y bacterias (Poole and Hughes, 2000). En el tercer linaje se encuentran

las llamadas hemoglobinas truncadas (TrHbs) con un solo dominio globina, que forman

parte de una nueva familia de pequeñas proteínas hemoglobina de 20 a 30 aminoácidos y

que están ampliamente distribuidas en bacterias y otros organismos (Wittenberg et al.,

2002; Vinogradov et al., 2007).

1.7.2 Estructura de las flavohemoglobinas

Las proteína flavohemoglobina (hmp) de Escherichia coli es la hemoglobina mejor

estudiada del grupo de las FHG´s. Está formada por dos dominios, cada uno de los cuales

es incapaz de detoxificar NO por sí solo, siendo imprescindible para la actividad catalítica

de las flavohemoglobinas la actividad de sus dos dominios (Hernandez-Urzua et al., 2003).

Los dos dominios de hmp son (1) el dominio de la globina y (2) el dominio de oxidoreducción

subdividido a su vez en dos subdominios independientes estructural y funcionalmente, el

primer subdominio de unión a FAD (FAD_binding_6) y el segundo subdominio de unión a

NAD (NAD_binding_1). El grupo hemo y el dominio FAD se aproximan a una distancia

mínima de 5,9 Å promoviendo la transferencia de electrones de FAD al grupo hemo en un

ambiente predominantemente polar dado por varias cadenas de aminoácidos. En el

subdominio de unión a FAD se han identificado varios aminoácidos conservados: tirosina

(Tyr) 206, glutamato (Glu) 388, glutamina (Gln) 205, arginina (Arg) 204 y serina (Ser) 207

y en el subdominio de unión a NAD el glutamato (Glu) 388 está muy conservado (Gardner

et al., 2005). La Figura 2 muestra la estructura tridimensional de la hmp de E. coli derivada

de datos experimentales obtenidos mediante rayos X (Ilari et al., 2002).


- 28 -

Figura 2. Estructura tridimensional de la flavohemoglobina de E. coli. El dominio globina se muestra en color rojo. El dominio de oxidoreducción se representa en color turquesa (Ermler et al., 1995).

1.7.3 Funciones de las flavohemoglobinas

Las proteínas flavohemoglobinas (FHG´s) se encuentran ampliamente distribuidas en

microorganismos procariotas y eucariotas. En bacterias las proteínas FHG´s están

relacionadas con la eliminación del oxido nítrico (NO). En hongos el papel funcional de las

flavohemoglobinas aún es una cuestión controvertida (Cassanova et al., 2005; Smagghe

et al., 2008). La mayoría de las investigaciones apuntan a que las funciones de las FHG´s

en hongos están relacionadas con el metabolismo del NO, estrés nitrosativo y oxidativo,

señalización celular, germinación, conidiación y desarrollo sexual (Cassanova et al., 2005;

Smagghe et al., 2008; Marcos et al., 2016).

1.7.3.1 Respuesta de las flavohemoglobinas al estrés nitrosativo

y oxidativo

El primer gen codificador de una enzima FHG fue identificado en la bacteria E. coli (gen

hmp) (Vasudevan et al., 1991). La caracterización molecular y funcional de la enzima fue

planteada una decada más tarde, describiéndose como una dioxigenasa de NO

dependiente de NADPH, FAD y O2, cuya función es proteger a la bacteria del estrés

Introducción

- 29 -

nitrosativo mediante la conversión del NO en nitrato (NO3) (Gardner et al., 1998; Hausladen

et al., 1998). En condiciones aeróbicas el gen hmp es inducido por NO (Gardner et al.,

1998; Hausladen et al., 1998; Membrillo-Hernandez et al., 1998). En condiciones

anaeróbicas la flavohemoglobina de E. coli consume NO generando N2O con la

participación de NADH (Durner et al., 1999). Los mutantes de la FHG de E. coli no sólo

acumulan mayor cantidad de NO, sino que son incapaces de producir NO detectable,

limitación que se correlaciona con una reducción de la actividad de la enzima nitrito

reductasa responsable de la producción de NO (Corker y Poole, 2003).

En la bacteria Salmonella typhimurium se ha demostrado que los mutantes deficientes de

la flavohemoglobina (hmp) son capaces de producir NO tanto aeróbicamente como

anaeróbicamente, lo que implica que esta flavohemoglobina interviene en el control de la

concentración de NO (Gilberthorpe y Poole, 2008).

En la bacteria Bacillus subtilis el gen hmp es inducido bajo condiciones aeróbicas y

anaeróbicas en respuesta a tratamientos con NO (Moore et al., 2004). Sin embargo, este

mismo estudio muestra que la respuesta al estrés del NO gas y del donador SNP son

diferentes. A pesar de que ambos tratamientos inducen el regulón σβ, el NO gas lo hace

mediante la vía energética y el SNP mediante la vía de estrés ambiental. La diferencia de

la respuesta trascripcional dependiendo de la fuente de NO ha sido también observada en

S. cerevisiae (Sarver y DeRisi, 2005). Este fenómeno es debido probablemente a la

cantidad de NO liberada por el donador y el tiempo de exposición a NO que tiene cada

donador determinado por su vida media (Fitzhugh and Keefer, 2000).

La flavohemoglobina de S. cerevisiae (yhb1) protege a la levadura del estrés nitrosativo

producido por el NO en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. También se ha demostrado

que yhb1 facilita la denitrosilación de proteínas. Se ha comprobado que los mutantes son

sensibles a estrés nitrosativo y que muestran un incremento en la concentración de las

proteínas S-nitrosiladas al ser comparados con las cepas silvestres (Liu et al., 2000). La

flavohemoglobina yhb1 se localiza en dos compartimentos celulares distintos: el citosol y

la matriz mitocondrial (Cassanova et al., 2005). La localización mitocondrial de yhb1 tiene

implicaciones en el control de la cadena respiratoria, ya que el NO que degrada es capaz

de inhibir la citocromo C oxidasa y la respiración (Boveris et al., 2000; Szibor et al., 2001)

y de reaccionar con el superóxido para formar peroxinitrito (Cadenas et al., 2000). De esta

forma, en ausencia de la flavohemoglobina los niveles de NO se incrementan (Liu et al.,

2000), se inhibe la citocromo C oxidasa, se incrementa la producción de superóxido y,


- 30 -

consecuentemente, los niveles de peroxinitrito. Así, la levadura puede reducir los niveles

de superóxido no sólo mediante la superóxido dismutasa sino reduciendo su formación vía

cadena respiratoria al eliminar NO mediante la flavohemoglobina. De este modo, yhb1 es

esencial para la supervivencia de la célula bajo condiciones de estrés oxidativo y nitrosativo

(Liu et al., 2000). La distribución de la flavohemoglobina entre el citosol y la matriz

mitocondrial se regula diferencialmente dependiendo de las condiciones de anoxia y del

tipo de genoma mitocondrial, permitiendo de manera indirecta la eliminación del estrés

oxidativo (Cassanova et al., 2005). Las proteínas localizadas en uno y otro compartimiento

subcelular son codificadas por el mismo gen, ya que la mutación de yhb1 elimina ambas

proteínas y la reintroducción del gen restaura la aparición de la proteína en el citosol y en

la matriz mitocondrial (Cassanova et al., 2005). La flavohemoglobina de S. cerevisiae

(yhb1) muestra expresión constitutiva que no se ve incrementada con tratamientos con el

donador de NO DETA/NO en cultivos logarítmicos o estacionarios bajo condiciones

aeróbicas o anaeróbicas (Liu et al., 2000). Por el contrario, la respuesta de S. cerevisiae al

tratamiento con DPTA/NONOate incrementa la expresión de yhb1 unas 10 veces (Sarver

y DeRisi, 2005). Este comportamiento puede ser debido a las diferencias en los donadores

de NO, medios de cultivo, cepas de levadura, sensibilidad del método de medida o

condiciones de cultivo utilizadas. La expresión de yhb1 tampoco es significativamente

afectada por químicos que imponen estrés oxidativo como el H2O2, paraquat y menadiona

(Buisson and Labbe-Bois, 1998). Sin embargo, la expresión de yhb1 es menor en cultivos

anaeróbicos de la levadura que en aeróbicos (Liu et al., 2000).

C. albicans posee tres genes que codifican proteínas de tipo flavohemoglobina, pero

sólamente Cayhb1 es inducido por NO y es el responsable de la detoxificación del NO

producido por los macrófagos. Los mutantes delecionados del gen Cayhb1 son

hipersensibles a NO (DETA) (Ullman et al., 2004). En A. oryzae y A. nidulans se ha

reportado la presencia de dos genes tipo FHG. La flavohemoglobina FHb1 de A. oryzae, al

igual que la flavohemoglobina fhbA de A. nidulans, están presentes en el citosol y muestran

altos niveles de expresión en medios suplementados con NO3, siendo mayor la expresión

en medios con un pH ligeramente ácido. Ambos genes (FHb1 y fhbA) codifican las

flavohemogloginas responsables de proteger al hongo del estrés nitrosativo mediante la

conversión del NO a NO3 (Schinko et al., 2010). Las flavohemoglobinas FHb2 y fhbB de A.

oryzae y de A. nidulans, respectivamente, han sido localizadas en la matriz mitocondrial y

su función aún resulta una cuestión controvertida. Ambas muestran una secuencia señal

mitocondrial y probablemente están implicadas en la detoxificación de NO en la mitocondria

(Zhou et al., 2009; Schinko et al., 2013). Schinko et al. (2010) y Marcos et al. (2016)

Introducción

- 31 -

reportaron que la expresión del gen fhbA de A. nidulans es inducido por el gen NirA y no

por AreA. Sin embargo, en el promotor del gen fhbA se localizan cuatro secuencias señal

de unión para AreA. Los autores demuestran que AreA regula la expresión de fhbA durante

la fase de conidiación y no durante la fase de desarrollo (Schinko et al., 2010; Marcos et

al., 2016). También se ha demostrado que fhbA es inducido en presencia de elevadas

concentraciones de NO2 y pH ligeramente ácido (Schinko et al., 2010). En A. fumigatus la

flavohemoglobina fhbA protege al hongo del estrés nitrosativo producido por el NO,

mostrando altos niveles de expresión sobre nitrato y nitrito. Los mutantes delecionados del

gen fhbA muestran un incremento en la sensibilidad a DETA-NO comparado con la cepa

de tipo silvestre, indicando que la flavohemoglobina fhbA juega un rol importante en la

defensa contra las especies reactivas de nitrógeno (Lapp et al., 2014).

En B. cinerea la flavohemoglobina (BCFHG1) es la proteína responsable de la

detoxificación de NO, protegiendo al hongo del estrés nitrosativo. Los mutantes con pérdida

de función de BCFHG1 son sensibles a NO (Turrión-Goméz and Benito, 2011). Bcfhg1 se

expresa en todas las fases de desarrollo en ausencia de NO exógeno, mostrando un

máximo de expresión durante la ventana termporal de germinación (entre las 4 y las 6 h de

culvito en medio mínimo líquido), y la exposición a NO exógeno determina un aumento de

sus niveles de expresión (Turrión-Gómez et al., 2010).

1.7.3.2 Papel de las flavohemoglobinas en patogenicidad

Las flavohemoglobinas juegan un papel importante en los organismos patógenos,

protegiéndoles del estrés nitrosativo creado por el hospedero como mecanismo de defensa

(Arasimowicz‐Jelonek and Floryszak‐Wieczorek, 2014). Así se ha comprobado en la

bacteria fitopatógena Erwinia chrysanthemi, sistema en el que la flavohemoglobina

codificada por el gen HmpX es inducida durante la infección y es esencial para el desarrollo

de la bacteria (Boccara et al., 2005), ya que inactiva el NO y previene la inhibición de la

respiración celular que éste causa. Pero además, la flavohemoglobina del patógeno puede

condicionar la respuesta del huésped. Así, en plantas de Saintpaulia ionantha inoculadas

con mutantes deficientes en el gen HmpX de E. chrysantemi se acumulan altos niveles de

NO y se observa activación del programa de muerte celular (Boccara et al., 2005). Las

plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan el gen hmp de E. coli muestran una

reducción en los niveles de NO acumulado in planta y una atenuación del choque de NO

producido por el patógeno (Zeier et al., 2004). Tomando todos estos datos en su conjunto


- 32 -

podemos deducir que las flavohemoglobinas son unos potentes detoxificadores del NO que

reducen la Respuesta Hipersensible (HR) en plantas y el estrés nitrosativo en el patógeno.

La flavohemoglobina (yhb1) de C. neoformans es esencial para la virulencia del hongo en

ratones al degradar el NO producido por la iNOS, ya que la virulencia de los mutantes

deficientes en el gen YHB1 disminuye en animales de tipo silvestre y se reestablece en

animales iNOS-/- (de Jesus-Berrios et al., 2003). Es interesante destacar que en el mismo

trabajo se indica que el estudio y caracterización de dobles mutantes de la

flavohemoglobina y de la superóxido dismutasa, responsable esta última de la protección

de C. neoformans al estrés oxidativo, demuestran un efecto sinérgico de ambos sistemas

en la reducción de la virulencia sobre ratones.

La reducción de vilurencia de los mutantes de flavohemoglobina se ha descrito en C.

albicans (Hromatka et al., 2005; Ullmann et al., 2004). Como hemos indicado

anteriormente, en el genoma de C. albicans se han identificado tres genes FHG, pero sólo

uno, Cayhb1, es inducido por NO y responsable de la degradación de NO. La eliminación

de este gen determina una reducción de la virulencia (Ullmann et al., 2004). Sin embargo,

los mutantes del gen Cayhb1 de C. albicans no recuperan la virulencia en mutantes de

ratón carentes de NOS2, lo que supone que en el modelo de investigación utilizado la

producción de NO por parte del huésped no es un determinante fundamental de la

virulencia del patógeno y que la reducción de virulencia observada en los mutantes

analizados debe ser consecuencia de algún otro proceso de naturaleza aún por determinar

(Hromatka et al., 2005).

En la bacteria patógena humana S. enterica su flavohemoglobina es necesaria para la

infección de ratones, restaurándose la virulencia en mutantes de ratones carentes de la

iNOS (Bang et al., 2006).

1.7.3.3 Papel de las flavohemoglobinas en la regulación del

desarrollo

Varios estudios realizados con proteínas tipo flavohemoglobina de microorganismos

procariotas y eucariotas demuestran que estas proteínas además de estar implicadas en

la protección frente al estrés nitrosativo producido por el hospedador infectado, también

están implicadas en funciones de desarrollo y crecimiento. Investigaciones realizadas por

Membrillo-Hernández et al. (2009) mostraron que el gen hmp de E. coli regula el

Introducción

- 33 -

crecimiento de la bacteria en la fase estacionaria, ya que los mutantes deficientes en hmp

muestran un ligero retraso en el crecimiento (Membrillo-Hernández et al., 1999). En C.

albicans se ha mostrado que el producto génico de CaYHB1 regula el desarrollo de la

levadura, puesto que los mutantes deficientes en este gen muestran un desarrollo

hiperfilamentoso (Hromatka et al., 2005). El producto génico del gen fHb1 de A. oryzae

regula el desarrollo de hifas, ya que los mutantes deficientes en FHb1 presentan

alteraciones morfológicas en el micelio (Zhou et al., 2009). En A. nidulans la

flavohemoglobina FhbA regula la conidiación y el desarrollo de hifas. El gen fhbA es

fuertemente expresado en la fase inicial del desarrollo y su expresión decrece luego

gradualmente, mientras que fhbB se expresa de forma moderada en la fase inicial del

desarrollo y su función parece estar más relacionada con la regulación de la transición de

la fase de crecimiento vegetativo a conidiación. Los mutantes deficientes en fhbA y fhbB

muestran un crecimiento superficial y anormal del micelio (Marcos et al., 2016). También

se ha reportado que el gen fhbA regula la formación de cuerpos de fructificación (Baidya et

al., 2011).

En C. coccodes utilizando aproximaciones farmacológicas se ha demostrado que el NO

juega un papel importante durante la germinación, ya que el exceso de NO retrasa la

germinación y el uso de secuestradores de NO acelera la germinación, lo que supone que

el NO participa en los procesos fisiológicos de germinación y desarrollo (Wang and Higgins,

2005). En C. minitans la adición de NO exógeno inhibe la formación de conidios (Gong et

al., 2007). El papel del NO en la formación y desarrollo de estructuras reproductivas y

esporas también se ha evidenciado en N. crassa (Niennemann and Maier, 1996), P.

blakesleeanus (Maier et al., 2001) y Flammulina velutipes (Song et al., 2000). La ameba

Dictyostelium discoideum posee dos genes que codifican proteínas tipo flavohemoglobina

(DdFHa y DdFHb) cuya función está relacionada con la protección a estrés nitrosativo,

metabolismo de la glucosa, crecimiento y desarrollo celular. Los mutantes deficientes de

DdFHa y DdFHb muestran un marcado incremento en el tamaño de la célula, reducida

viabilidad bajo altas concentraciones de glucosa y sensibilidad a estrés nitrosativo. La

expresión tanto de DdFHa como de DdFHb es inducida bajo condiciones sumergidas,

incrementándose sus niveles de expresión de 3 a 4 veces en relación con los niveles

observados en las células utilizadas como control (Lijima et al., 2000).


- 34 -

OBJETIVOS

Objetivos

- 35 -

OBJETIVOS

Las proteínas de tipo flavohemoglobina están ampliamente distribuidas en

microorganismos procariotas y eucariotas. Las evidencias experimentales acumuladas

demuestran que éstas constituyen uno de los principales sistemas enzimáticos de

detoxificación de NO en estos grupos de organismos. Mediante esta investigación

pretendemos determinar cuáles son las funciones fisiológicas en las que participan las

proteínas de tipo flavohemoglobina en el hongo fitopatógeno F. oxysporum f. sp. phaseoli.

Son objetivos del presente trabajo los siguientes:

1. Identificación de genes codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina, genes

FHG, en las estirpes SP1, muy virulenta, y SP4, poco virulenta, del F. oxysporum f.

sp. phaseoli.

2. Determinación de los patrones de expresión de los genes FHG durante el

crecimiento saprofítico en las estirpes SP1 y SP4 del patógeno en respuesta a NO

exógeno y durante su interacción con la planta hospedera.

3. Obtención de mutantes deficientes en los genes FHG en ambas estirpes de F.


4. Caracterización funcional y fisiológica de los mutantes deficientes en los genes FHG

de ambas estirpes de F. oxysporum f. sp. phaseoli durante el crecimiento saprofitico

y durante la interacción con la planta hospedera.


- 36 -

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales y Métodos

- 37 -

2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Organismos

2.1.1 Plantas

Para los ensayos de infección se utilizaron plantas de judía (P. vulgaris L.) de la variedad

“blanca riñón”.

2.1.2 Hongos

En la Tabla 4 se muestran las estirpes de F. oxysporum utilizadas en esta investigación,

las mismas que fueron colectadas por nuestro laboratorio de plantas de judía (P. vulgaris)

infectadas en la zona de El Barco de Ávila (Alves-Santos et al., 1999), y conservadas a -

80ºC.

Tabla 4. Estirpes silvestres y transformantes de F. oxysporum utilizadas en esta investigación

Aislado Origen Genotipo Patogenicidad Año Raza VCG

FOP-SP1 La Carrera

(CIALE) Silvestre

Patógeno muy virulento 1993 6 0167

FOP-SP4 La Carrera

(CIALE) Silvestre

Patógeno poco virulento 1994 6 0166

FOP-SP13 Villafranca

(CIALE) Silvestre

Patógeno súper virulento 6 0169

AB82 El Barco de

Ávila

(CIALE)

Silvestre No patógeno 1995 -- 0167

4287 (F. oxysporum f. sp.

lycopersici)

J. Tello

(INIA) Silvestre Patógeno muy virulento 2 0030

FOP-SP1-∆FHG1-130 CIALE Knockout Patógeno muy virulento 2015 6 0167






- 38 -

FOP-SP1-∆FHG-818 CIALE Knockout Patógeno muy virulento 2015 6 0167



FOP-SP4-∆FHG1-239 CIALE Knockout Patógeno poco virulento 2015 6 0166








FOP-SP1-∆FHG2-51-

FHG1RNAi-1 CIALE Silenciado Patógeno muy virulento 2015 6 0167

FOP-SP1-∆FHG2-51

FHG1RNAi-7 CIALE Silenciado Patógeno muy virulento 2015 6 0167

FOP-SP4-∆FHG2-314-

FHG1RNAi-2 CIALE Silenciado Patógeno poco virulento 2015 6 0166

FOP-SP4-∆FHG2-314-

FHG1RNAi-18 CIALE Silenciado Patógeno poco virulento 2015 6 0166

FOP-SP1-∆FHG1-131-C1 CIALE

Complementado Patógeno poco virulento 2015

6 0167

FOP-SP1-∆FHG1-131-C2 CIALE Complementado Patógeno poco virulento 2015

6 0167


6 0166


6 0166

2.1.3 Bacterias

E. coli cepa DH5α (F-, supE44 ΔlacU169 (φ80 lacZΔM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-

1 relA1) fue utilizada en todos los experimentos de transformación bacteriana.


- 39 -

Agrobacterium tumefaciens cepa AGL-1 (C58, RecA, rif, carb, pTiBo542DT-DNA,

Succinamopine) (Lazo et al., 1991) fue utilizada para la transformación de F. oxysporum

con vectores binarios.

2.2 Medios de cultivo

2.2.1 Plantas

Las semillas de judía de la variedad “Blanca Riñón” fueron esterilizadas con hipoclorito de

sodio al 5% y lavadas varias veces con agua destilada estéril y sembradas en bandejas

con vermiculita, un sustrato inerte esterilizado mediante dos ciclos de autoclave de 60

minutos de duración. Éstas fueron mantenidas en las cámaras de germinación de 8 a 10

días a una temperatura de 22 a 25ºC, una humedad relativa de 60 a 70% y un fotoperiodo

de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad en el invernadero experimental del Instituto

Hispano Luso de Investigaciones Agrarias (CIALE), de la Universidad de Salamanca.

Para el cultivo hidropónico las plántulas de judía infectadas con las estirpes silvestres de

F. oxysporum mantenidas en medio de cultivo de crecimiento de plantas (PGM) (Yedidia

et al., 1999).

2.2.2 Hongos

2.2.2.1 Cultivo en medio sólido de F. oxysporum

Para el crecimiento de F. oxysporum se utilizaron placas de Petri con medio de cultivo PDA

(Potato Dextrose Agar, Difco), inoculadas con 10 µl de una suspensión de microconidios

de cada una de las estirpes de F. oxysporum e incubadas por 10 días a 25ºC. Pasado este

tiempo las placas fueron mantenidas durante 4 - 8 días a 4ºC para favorecer la producción

de microconidios.

Para la selección de transformantes nulos y silenciados de F. oxysporum se utilizó PDA

con 75 μg/ml de higromicina B (Roche) o 200 a 600 μg/ml de phleomycina (InvivoGen). Los

antibióticos fueron añadidos al medio de cultivo una vez esterilizado en autoclave.


- 40 -

Para ensayos de crecimiento saprofítico de cepas silvestres y transformantes nulos y

silenciados se utilizó medio mínimo con 1% glucosa (MMG): 2g/l MgSO4·7H2O; 4 g/l

KH2PO4; 0,3 g/l de CaCl2 2H2O; 0,01 g/l FeCl3 6H2O y 10 g/l de C6H12O6, suplementado con

1,84 g/l (10mM) de tartrato de amonio ((NH4)2C4H4O6) (MMG+A) ó 0,89 g/l (10 mM) de

nitrato de sodio (NaNO3) (MMG+N) como fuente única de nitrógeno y 15 g/l de agar

bacteriológico.

2.2.2.2 Cultivo en medio líquido de F. oxysporum

Para la producción de micelio se utilizó el medio de cultivo PDB (Potato Dextrose Broth,

Difco) con agitación constante a 25ºC y 120 rpm, y para la producción abundante de

microconidios se incubó a 25ºC y 180 rpm. Para evitar la contaminación por bacterias se

añadieron al medio 20 μg/ml del antibiótico Cloranfenicol.

Para ensayos de expresión de genes FHG se utilizó medio mínimo con 1% glucosa (MMG)

y el medio mínimo con 1% glucosa suplementado con 10 mM de tartrato de amonio

(MMG+A) como fuente de nitrógeno y 500 µM de nitroprusiato sódico (SNP) (Sigma) como

donador de óxido nítrico (NO) exógeno. Los tratamientos control fueron realizados en las

mismas condiciones sin SNP.

Para ensayos de germinación de microconidios de las cepas silvestres y transformantes

nulos y silenciados se utilizó medio mínimo con 1% glucosa suplementado con 10 mM de

tartrato de amonio (MMG+A) o 10 mM de nitrato de sodio (MMG+N) y 250 µM de DETA

como donador de oxido nítrico (NO). Los tratamientos control fueron realizados en las

mismas condiciones sin DETA.

2.2.2.3 Obtención de cultivos monospóricos

Para la obtención de cultivos monoconídicos, se realizaron diluciones seriadas de esporas

previamente obtenidas por filtración en embudos con lana de vidrio. 10 µl de la dilución

fueron extendidos en placas con medio Agar-Agua, las cuales se incubaron 12 horas a

25ºC. Transcurrido este tiempo se observaron las esporas germinadas en lupa binocular

(Leica, Germany) y con un bisturí estéril se tomó un microconidio que fue transferido a una

placa con medio PDA. Para cultivos monospóricos de transformantes nulos y silenciados

se añadió al medio Agar Agua con 50 µg/ml de higromicina B. Los cultivos monoconídicos

se incubaron a 25ºC.


- 41 -

2.2.3 Bacterias

2.2.3.1 Cultivo de E. coli DHα5

E. coli fue cultivada en medio LB (Luria-Bertani) líquido o sólido en experimentos de

transformación y producción de ADN plasmídico. El medio LB está compuesto de 10 g/l de

Bacto Tryptone (Difco), 5 g/l de Bacto yeast Extract (Difco), 10 g/l de NaCl (Pancreac). Para

medio sólido se añadieron 15 g/l de agar bacteriológico. La temperatura de incubación fue

de 37ºC y para cultivos en medio líquido las células se mantuvieron en agitación constante

de 200 a 250 rpm.

2.2.3.2 Cultivo de A. tumefaciens cepa AGL-1

A. tumefasciens fue cultivado en medio LB (Luria-Bertani) líquido o sólido a 28ºC. Los

cultivos en medio líquido se mantuvieron con agitación constante de 200 rpm. Para medio

sólido se añadieron 15 g/l de agar bacteriológico. Para la selección de colonias resistentes

a ampicilina o kanamicina se añadió al medio de cultivo sólido o líquido una concentración

de 100 μg/ml ampicilina (Sigma) o de 50 μg/ml de kanamicina (Sigma) después de haber

sido esterilizado el medio de cultivo.

Para los ensayos de cocultivo de A. tumefaciens con microconidios de F. oxysporum f. sp.

phaseoli estirpes muy virulenta FOP-SP1 y poco virulenta FOP-SP4 se utilizaron los

medios de cultivo Medio minimo (MM), medio de inducción (MI) y medio de cocultivo (MCC)

mostrados en la Tabla 5.

Tabla 5. Medios de cultivo utilizados en la transformación de F. oxysporum mediada por A. tumefaciens.

Reactivos Medio Mínimo

(MM) 100 ml

Medio Inducción

(MI) 100 ml

Medio Cocultivo

(MCC) 1 litro

Buffer K 1 ml 1 ml 10 ml

Buffer M-N 2 ml 2 ml 20 ml

CaCl2 1 % 100 µl 100 µl 1 ml

Glucosa 20 % 1 ml 500 µl 5 ml

FeSO4 0,01 % * 1 ml 1 ml 10 ml

Elementos traza * 500 µl 500 µl 5 ml

NH4NO3 20 % 250 µl 250 µl 2.5 ml


- 42 -

MES 1M - 4 ml 40 ml

Glicerol 50 % - 1 ml 10 ml

Acetosiringona 40 * - 100 µl 1 ml

Kanamicina 50 * 100 µl 100 µl 1 ml

Agar bacteriológico - - 15 g

Agua MiliQ estéril 94,15 ml 89,45 ml 894,5 ml

*FeSO4 0,01%, Elementos traza, Acetosiringona 40 y Kanamicina 50 se añaden al medio después

de esterilizar en autoclave. Buffer K: 200 g/l de K2HPO4; 145 g/l de KH2PO4 pH 7.Buffer M-N: 30

g/l de MgSO4·7H2O; 15 g/l de NaCl. Elementos traza: 0,05 g/l de FeCl3, 0,728 g/l de KCl, 1,546 g/l

de H3BO3, 0,846 g/l de MnSO4 H2O, 0,375 g/l de ZnSO4 7H2O, 0,125 g/l de CuSO4 5H2O, 0,081 g/l

de H2MoO4, y 0,001 g/l de CoCl2 6H2O.

2.3 Ensayos de germinación

2.3.1 Obtención de microconidios de F. oxysporum

El cultivo de F. oxysporum se realizó en placas petri con medio PDA a 25ºC durante 10

días. Los microconidios fueron recuperados en condiciones de esterilidad en la cabina de

flujo laminar. Los microconidios fueron recogidos añadiendo 10 ml de agua destilada estéril

por placa. Con la ayuda de una espátula se separó el micelio del medio de cultivo y la

suspensión de microconidios se filtró a través de embudos con la lana de vidrio estéril, lo

que permite obtener microconidios limpios y de tamaño uniforme. La suspensión de

microconidios se lavó 3 veces con agua destilada estéril mediante centrifugación de 15

minutos a 4.000 rpm. Los microconidios sedimentados fueron transferidos a tubos

eppendorf con agua MiliQ estéril y conservados temporalmente a 4ºC.

Para la cuantificación de los microconidios se realizaron diluciones 1:100 o 1:50, y se

depositaron volúmes de 10 µl de la dilución en una cámara de recuento celular

(hematocitómetro) (Thoma, Germany). El recuento de los microconidios se realizó con el

microscopio óptico con el lente de 40X. Los microconidios son viables a 4ºC por 48 horas.

Transcurrido este tiempo su viabilidad se reduce notablemente. Para su conservación a

largo plazo se prepararon suspensiones de microconidios en glicerol al 20 % que fueron

almacenadas a -80ºC.


- 43 -

2.3.2 Cultivo estático de F. oxysporum

Una suspensión de 2x108 microconidios/ml en agua destilada estéril fue utilizada como

stock inicial de cada una de las estirpes de F. oxysporum. La germinación de microconidios

fue evaluada en medio mínimo con 1% glucosa suplementado con 10 mM de tartrato de

amonio (MMG+A) o 10 mM de nitrato de sodio (MMG+N) como única fuente de nitrógeno.

Para analizar el efecto del NO sobre la germianción se preparó en cada caso una

suspensión de 2x106 microconidios/ml en MMG+A o MMG+N a la que se añadieron 12,5 µl

de DETA 10 mM (concentración final DETA 250 µM). De cada muestra se tomó una gotita

de 100 µl de la suspensión de microconidios correspondiente que fue depositada en el

centro de una placa petri de 40 mm x 14 mm (aproximadamente 20.000 esporas). Las

placas fueron colocadas en una caja de plástico con papel de filtro humedecido con agua

destilada estéril, para mantener una humedad relativa alta, e incubadas a 25ºC. El

tratamiento de las muestras control fueron realizadas en las mismas condiciones de cultivo

sin DETA.

El número de microconidios germinados y no germinados se evaluó a las 4, 6, 8, 10 y 12

horas. De cada una de las cepas analizadas se tomaron 9 µl de cultivo que fueron

depositados en una cámara de recuento celular. Las muestras fueron observadas en el

microscopio óptico con el lente 20x y se tomaron 4 a 5 fotografías de diferentes campos.

Posteriormente se realizó el conteo de esporas germinadas y esporas sin germinar en cada

tiempo.

2.4 Ensayos de crecimiento saprofítico

2.4.1 Ensayos de sensibilidad a estrés nitrosativo

Previamente se realizó un pre-cultivo en placas Petri con medio de cultivo mínimo con 1%

glucosa (MMG), suplementado con 10 mM de tartrato de amonio o 10 mM de nitrato de

sodio como fuente de nitrógeno. Para ello con la ayuda de un asa bacteriológica se tomó

una alícuota de cada uno de los cultivos stock conservados a -80ºC y se depositó en el

centro de la placa Petri con el medio de cultivo correspondiente y se incubó a 25ºC durante

4 a 5 días.


- 44 -

Para evaluar la sensibilidad de los transformantes nulos y silenciados a estrés nitrosativo

en medio solido se utilizó el donador de óxido nítrico SNP (Nitroprusiato de sodio, Sigma).

Éste fue esterilizado por filtración y añadido a una concentración de 500 µM al medio de

cultivo mínimo con 1 % glucosa (MMG) suplementado con 10 mM de tartrato de amonio o

10 MM de nitrato de sodio como fuente de nitrógeno (después de su esterilización en el

autoclave y cuando había alcanzado una temperatura de entre 45 y 50ºC).

Con la ayuda de un sacabocados se tomó un cilindro de agar con medio de cultivo y micelio

a partir del borde interno de la colonia en crecimiento que fue depositado en el centro de

cada placa de Petri con el medio apropiado. Éstas fueron incubadas a 25ºC con luz

continua. Para cada medio y estirpe a ser evaluados se prepararon tres placas de medio

de cultivo con y sin donador exógeno de NO.

La evaluación del crecimiento saprofítico se realizó midiendo dos diámetros

perpendiculares de cada colonia a los 2, 3, 4, y 5 días después de la siembra.

2.5 Ensayos de infección in planta

Los patogenicidad y virulencia de las cepas de F. oxysporum fueron evaluadas según el

método original de Pastor-Corrales y Abawi (Pastor-Corrales and Abawi, 1987) y

modificado según se describe en Alves-Santos et al., (1999).

Para la producción abundante de microconidios se inoculo F. oxysporum en medio de

cultivo GOX 6 % pH 7,00: (Sacarosa 60 g/l, Peptona 3 g/l; 0,5 g/l MgSO4·7H2O; 0,5 g/l

KCl; 7 g/l NaNO3; 0,5 g/l KH2PO4) e incubado por 2 a 3 días a 25ºC y 180 rpm. Los

microconidios se filtraron en embudos con lana de vidrio y se lavaron 3 veces con agua

destilada estéril, con centrifugaciones de 15 minutos a 4.000 rpm. El sedimiento de células

fue transferido a un tubo eppendorf de 1,5 ml con agua MiliQ estéril. Se realizaron

diluciones de 1:100 o 1:50 y se cuantificó la concentración de microconidios en una

cámara de recuento celular con la ayuda de un microscopio óptico con un aumento de

40X. Los microconidios se conservaron a 4ºC hasta el momento de la infección.

2.5.1 Ensayos de infección en invernadero

Las raíces de plántulas cultivadas durante 8-10 días tras la siembra (hojas cotiledónicas

expandidas al 75 %) se lavaron con agua destilada estéril para eliminar restos de


- 45 -

vermiculita y con unas tijeras estériles se cortaron los ápices radiculares. Las raíces así

cortadas se sumergieron en una suspensión de 1x106 microconidios/ml de F. oxysporum

durante 5 minutos. Pasado este tiempo las plántulas fueron transferidas a macetas

individuales. Las judías se cultivaron en invernadero durante 5 semanas a partir de la fecha

de inoculación, a una temperatura media de 25ºC, humedad relativa de 60-70 % y

fotoperiodo de la menos 12 h de luz. La evaluación se realizó semanalmene durante cinco

semanas consecutivas utilizando la escala CIAT (Pastor-Corrales and Abawi, 1987). La

escala CIAT se basa en la evaluación del porcentaje de hojas de la planta que muestran

síntomas de la infección (clorosis, amarilleamiento, marchitez, necrosis) y se asigna un

índice del 1 al 9 según los distintos porcentajes de hojas afectadas. 1: planta sana; 2: 5 %

de las hojas afectadas; 3: 10 %; 4: 15 al 20 %; 5: 25 %; 6: 25 al 40 %; 7: 50 %; 8: 75 % y

9: 100 % planta muerta (Alves-Santos et al., 1999).

2.5.2 Ensayos de infección en medio hidropónico

Los ensayos de infección y mantenimiento de plantas de judía inoculadas en medio

hidropónico se realizaron según se describe en Niño-Sánchez et al. (2015). Las raíces se

lavaron con agua destilada estéril y con tijeras estériles se cortaron los ápices radiculares.

Las raíces se sumergieron en una suspensión de 1x106 microconidios/ml de F. oxysporum

durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo las plántulas fueron transferidas a tubos falcon

de 50 ml con 30 ml de medio de cultivo PGM cubiertos con papel aluminio. Los tubos falcon

fueron sellados con cinta parafilm. Éstos fueron incubados a 25ºC con un fotoperiodo de

16 horas luz y 8 horas oscuridad y 80 % de humedad relativa durante 21 días. Se tomaron

muestras de raíz, hipocotílo y tallo a los siguientes tiempos: raíz, 1, 2 y 3 días; hipocotilo,

5 y 7 días; tallo, 14 y 21 días. Las muestras recogidas fueron inmediatamente sumergidas

en nitrógeno liquido y conservadas a -80ºC hasta su utilización.

2.6 Extracción de ácidos nucleicos

2.6.1 ADN genómico de F. oxysporum

Se utilizaron tres métodos de extracción de ADN genómico y tres métodos de extracción

de ADN plasmídico.


- 46 -

2.6.1.1 Método “TENSP”

Se utiliza para obtener ADN limpio y poco degradado que será utilizado como molde en la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o para digestiones con enzimas de restricción.

Aproximadamente 200 a 300 mg de micelio congelado a -80ºC fueron triturados en un

mortero con nitrógeno líquido. El micelio pulverizado se transfirió a un tubo eppendorf de

1,5 ml con 600 µl de solución de lisis TENSP (100 mM de Tris-HCl pH 8,0; 50 mM de EDTA,

1 % de PVP; 10 mM de β-Mercaptoetanol) y la muestra fue homogenizada en el vórtex

durante 15 segundos e incubada a 65ºC con agitación constante durante 30 minutos.

Se añadieron 500 µl de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1); cada muestra fue

homogenizada con una pipeta y centrifugada durante 10 minutos a 10.000 rpm a 4ºC. El

sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo y se añadió 1 volumen de

Fenol/Cloroformo/Alcohol isoamílico (25:24:1). Después de agitar brevemente los tubos,

las muestras fueron sometidas a una centrifugación durante 5 minutos a 12.000 rpm y 4ºC.

Este paso se repitió nuevamente con las mismas condiciones. El sobrenadante fue

transferido a un nuevo tubo con 500 µl de cloroformo/alcohol isoamílico (54:1). Después de

una breve agitación las muestras fueron centrifugadas de nuevo durante 5 minutos a

12.000 rpm y 4ºC y finalmente el sobrenadante en cada caso fue transferido a un nuevo

tubo.

Posteriormente se añadieron 2.5 volúmenes de etanol absoluto y 150 µl de acetato de

sodio 5,2 M y se incubó durante 2 horas a -80ºC o toda la noche.

Las muestras fueron centrifugadas 15 minutos a 14.000 rpm y 4ºC, se eliminó el

sobrenadante y el DNA precipitado se lavó con etanol 70 %, centrifugando finalmente las

muestras 2 minutos a 14.000 rpm. El sedimento resultante en cada caso se secó a

temperatura ambiente o en el SpeedVac de 2 a 3 minutos y fue resuspendido en 50 o 100

µl de H2O MiliQ estéril o en TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1mM).

El DNA fue tratado con 1 µl (1 µl por cada 10 µg de DNA) de RNAsa (10 mg/ml) e incubado

a 37ºC durante 30 minutos. Las muestras fueron conservadas a -20ºC.


- 47 -

2.6.1.2 Método CTAB

El método CTAB es adecuado para extraer y purificar ADN de hongos filamentosos y está

especialmente indicado para eliminar los polisacáridos y los compuestos polifenólicos que

pueden reducir la pureza del ADN y, por tanto, su calidad.

El micelio de F. oxysporum cultivado en medio líquido y conservado a -80ºC fue triturado

en un mortero con nitrógeno líquido. El micelio pulverizado fue transferido a un tubo

eppendorf de 1,5 ml con 300 µl de buffer CTAB (200 ml/l de Tris-base 1 M, 100 ml/l de

EDTA pH 8,0; 0,5 M, 20 g/l de CTAB); 300 µl de buffer STE (127,56 g/l de Sorbitol; 24,2

g/l de Tris-base; 3,36 g/l de EDTA) y 150 µl de N-Lauroylsarcosine 5 %. Las muestras

fueron homogenizadas con una pipeta e incubadas a 65ºC por 1 hora con agitación

constante. Posteriormente se añadieron 750 µl de cloroformo/alcohol isoamílico (24:1), se

homogenizó la mezcla en el vortex durante 15 segundos, y ésta se centrifugó durante 15

minutos a 12.000 rpm. Este tratamiento puede repetirse una o dos veces para mejorar la

calidad y pureza del ADN. El sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo eppendorf de

1,5 ml y se añadieron 600 µl de isopropanol y 150 µl de acetato de amonio 7,5 M. La mezcla

fue incubada a temperatura ambiente 20 minutos y sometida a centrifugación durante 20

minutos a 12.000 rpm. El sedimento resultante fue lavado con 500 µl de etanol 70 % (este

lavado se puede repetir 1 o 2 veces), centrifugando durante 10 minutos a 12.000 rpm

después de cada lavado. Finalmente, una vez eliminado el etanol, el pellet fue secado a

temperatura ambiente o en el speedvac, resuspendido en 50 a 100 µl de agua o TE (1 mM

EDTA, 10 mM Tris-HCl), y sometido a un tratamiento con RNasa como se indicó en el caso

del procedimiento anterior.

2.6.1.3 Extracción de ADN genómico mediante método rápido

Aproximadamente 200 mg de micelio de cada transformante fue transferido a tubos

eppendorf con 30 µl de Tris-HCl 10X, el micelio fue homogeneizado en el medio y agitado

fuertemente durante 30 segundos en el vórtex de tal manera que los microconidios se

liberen en el medio. Las muestras se calentaron durante 1 a 3 minutos en el microondas y

fueron agitadas vigorosamente en el vórtex durante 30 s. A continuación las suspensiones

se centrifugaron durante 15 minutos a 12600 rpm a 4ºC y en cada caso el sobrenadante

con ADN genómico fue transferido a un nuevo tubo y se almacenó a -20ºC.


- 48 -

2.6.2 Extracción de ADN Plasmídico

Para la obtención de ADN plasmídico multiplicado en E. coli se utilizó el método de lisis

alcalina y el kit comercial NucleoSpin®Plasmid. Para la obtención de grandes cantidades

de ADN plasmídico de plásmidos con un número reducido de copias por célula se utilizó el

Kit comercial NucleoBond®Xtra Midi/Maxi (Macherey-Nagel, Germany).

2.6.2.1 Minipreparación de ADN plasmídico mediante lisis alcalina

Se inocularon 5 ml de medio de cultivo LB, suplementado con 100 μg/ml de ampicilina o 50

μg/ml de kanamicina, con células de E. coli portadoras del vector de resistencia a ampicilina

o kanamicina de interés. Los cultivos se incubaron durante 12 a 16 horas a 37ºC y 200 rpm.

El cultivo se centrifugó a 4.000 rpm durante 5 minutos, se eliminó el sobrenadante y se

añadieron 250 μl de solución I (solución de resuspensión) compuesta por: 50 mM Tris-HCl

pH 7.5, 10 mM EDTA pH 8 y 100 µg/ml de RNAsa. La suspensión de células fue

homogenizada con una pipeta e incubada durante 5 minutos a temperatura ambiente.

Se añadieron 250 μl de solución II (solución de lisis) compuesta por 0,2 N NaOH y 1 % SDS.

La suspensión se mezcló suavemente y se incubó a temperatura ambiente durante 5

minutos. Se añadieron 250 μl de solución III (solución de neutralización) compuesta por 1,3

M de acetato de potasio pH 4,8. El contenido de cada tubo se mezcló por inversión y se

centrifugó a 12.000 rpm durante 15 minutos. El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo

con 800 µl de isopropanol. La suspensión se mezcló por inversión y se centrifugó durante

15 minutos a 12.000 rpm. El isopropanol fue eliminado y se añadieron 800 μl de etanol 70

%. Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a 12.000 rpm, se eliminó el etanol y

los sediementos se dejaron secar al ambiente o en el SpeedVac. El ADN fue finalmente

resuspendido en 50 μl de agua MiliQ.

2.6.2.2 Minipreparación de ADN plasmídico con el kit comercial

NucleoSpin®Plasmid

El kit comercial NucleoSpin®Plasmid (Macherey-Nagel, Germany) se utilizó siguiendo las

recomendaciones del fabricante.


- 49 -

Células de E. coli portadoras del vector de clonación de interés se inocularon en 5 ml de

medio LB suplementado con 100 μg/ml de ampicilina o 50 μg/ml y se incubaron durante 12-

16 horas a 37ºC y 200-250 rpm.

Los cultivos para la obtención de plásmido se centrifugaron durante 5 minutos a 4.000 rpm.

Se eliminó el medio de cultivo y el sedimento de células fue resuspendido en 500 µl de buffer

A1. La suspensión fue homogeneizada con una pipeta. Seguidamente se añadieron 500 µl

de buffer A2 y la suspensión se mezcló mediante inversiones de 6 a 8 veces de los tubos

y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se añadieron 600 µl de buffer A3 y

la suspensión se homogenizó manualmente mediante inversiones hasta obtener un lisado

totalmente blanco.

La mezcla se centrifugó 5 minutos a 11.000 g y el sobrenadante fue transferido a una

columna de purificación. Ésta fue centrifugada durante 1 minuto a 11.000 g, se eliminó el

sobrenadante y se añadieron 500 µl de buffer AW, previamente calentado a 50ºC. La

columna se centrifugó durante 1 minuto a 11.000 g, se descartó el eluido y se lavó la

columna añadiendo 600 µl de buffer A4 y centrifugando durante 1 minuto a 11.000 g. Se

descartó el eluido y la columna vacía se centrifugó a 11.000 g durante 2 minutos para

eliminar los restos del buffer A4.

La columna fue transferida a un tubo eppendorf de 1,5 ml y se incubó durante 5 minutos a

70ºC para eliminar los restos de etanol. Se añadieron entonces 50 µl de buffer AE o agua

MiliQ estéril, previamente calentado a 70ºC, y la columna se incubó 5 minutos a 70ºC para

facilitar que el ADN plasmídico se separe de la resina de la columna y sea eluido en el buffer

o agua. Finalmente la columna se centrifugó 1 minuto a 11.000 g. La solución con ADN

plasmídico purificado se conservó a -20ºC.

2.6.2.3 Preparación de grandes cantidades de ADN de plásmidos

de reducido número de copia

Se utilizó el Kit comercial NucleoBond®Xtra Midi/Maxi (Macherey-Nagel, Germany)

siguiendo las recomendaciones del fabricante.

Las células de E. coli portadoras de los vectores de clonación PRF-HU2 y PRF-HU fueron

inoculadas en 200 ml de medio de cultivo LB suplementado con 100 μg/ml de ampicilina o

50 μg/ml de kanamicina e incubadas durante 16 horas a 37ºC y 250 rpm hasta alcanzar una


- 50 -

DO600 de 0,4, momento en el que se añadieron al cultivo 200 μl de cloranfenicol 170 μg/ml,

prolongando entonces la incubación durante 6 horas más a 37ºC y 250 rpm para la

replicación del plásmido.

Transcurrido este tiempo el cultivo fue transferido a tubos falcon de 50 ml y las células

sedimentadas mediante centrifugación durante 5 minutos a 4000 rpm. El pellet de células

se resuspendió en 4 ml de buffer RES y las células fueron homogeneizadas en el buffer con

la ayuda de una pipeta hasta obtener una suspensión homogénea. Se añadieron 4 ml de

buffer de lisis y la mezcla se homogeneizó mediante 8 inversiones sucesivas, incubándola

posteriormente durante 5 minutos a temperatura ambiente. Luego se añadieron 4 ml de

buffer NEU, se mezcló suavemente la suspensión resultante mediante 8 inversiones y ésta

fue incubada 5 minutos a temperatura ambiente.

La suspensión se centrifugó durante 15 minutos a 4.000 rpm para separar el ADN

plasmídico de los restos celulares. La suspensión se transfirió a un filtro previamente

equilibrado con 12 ml de buffer EQU. Se añadieron 5 ml de buffer EQU, seguido de 8 ml de

buffer WASH, se eliminó el residuo y se añadieron 5 ml de buffer ELU. Una vez terminada

la filtración se desecha el tubo NucleoBond.

El volumen resultante de buffer ELU con los plásmidos se mezcló con 3,5 ml de isopropanol

y la suspensión resultante fue incubada a temperatura ambiente durante 2 minutos.

Posteriormente ésta fue repartida en tubos Eppendorf de 1,5 ml que fueron centrifugados

durante 15 minutos a 12.000 rpm. El sedimento fue lavado con 800 µl de etanol 70 % y los

tubos centrifugados durante 10 minutos a 12.000 rpm. Se eliminó el etanol y los precipitados

de ADN fueron secados a temperatura o en el speedVac. Finalmente éstos fueron

resuspendidos en 20 a 40 µl de agua MiliQ estéril y conservados a -20ºC.

2.6.3 Tratamientos enzimáticos del ADN

2.6.3.1 Tratamiento con RNAsa A

Para preparar el stock de RNAsa A se disolvieron 100 mg de RNAsa A liofilizada (Roche,

Germany) en 10 ml de agua MiliQ y la solución resultante se calentó a 100ºC durante 15

minutos para eliminar las DNasas. La suspensión resultante se dejó enfriar a temperatura

ambiente y se conservó a -20ºC.


- 51 -

El tratamiento de las muestras de ADN para eliminar RNA se realizó añadiendo volúmenes

variables de la solución de RNAsa 10 µg/µl (1 µl de RNAsa por cada 10 µg de ADN) e

incubando la mezcla a 37ºC durante 15 a 60 minutos. Para la inactivación de la DNAsa se

realizó una incubación a a 65ºC durante15 minutos.

2.6.3.2 Digestión con enzimas de restricción

Las enzimas de restricción se usaron siguiendo las recomendaciones del proveedor

(Promega, Takara y Biolabs). En cada reacción de digestión se añadió 10 % de tampón de

digestión, las unidades de enzima de restricción necesarias y la cantidad adecuada de ADN

disuelto en agua o buffer TE. La digestión se incubó a 37ºC generalmente toda la noche.

En el caso de digestiones simultáneas con dos enzimas, el tampón utilizado fue aquél en el

que las enzimas presentan la máxima actividad. En el caso de que no existiera tampón

compatible para las dos enzimas, las digestiones se realizaron en dos pasos.

2.6.3.3 Ligaciones

Las reacciones de la ligación se realizaron con la enzima T4 ADN ligasa, que cataliza la

formación de uniones fosdiéster entre los extremos 5’-fosfato y 3’-hidroxilo en ADN o ARN

de doble cadena con extremos cohesivos o romos. Las casas comerciales Roche y Takara

suministran en cada caso un kit de ligación que incluye la ligasa DNA T4, un tampón 10X

con ATP (600 mM de Tris-HCl, 50 mM de MgCl2, 50 mM de DDT, 10 mM de ATP, pH 7,5).

Las reacciones se prepararon en un volumen final de 10 µl con 1 µl de buffer 10X, 10 a 40

ng de ADN del vector, al menos una cantidad equimolar de ADN a insertar y 1 U/µl de ligasa.

La reacción se incubó a 4ºC durante 12 a 16 horas para ligaciones con PGM-T Easy y a

16ºC para ligación con los vectores PRF-HU2, pEA-FU y pVIR-RNAi.

2.6.3.4 Defosforilación con fosfatasa alcalina (CIEF)

La fosfatasa alcalina es una enzima clasificada dentro de las hidrolasas que cataliza la

hidrólisis del enlace éster fosfórico entre un grupo orgánico y un grupo fosfórico a pH

alcalino, liberando fosfato al medio. Se utilizó para eliminar el grupo fosfato terminal de los

extremos 5` del ADN y así evitar la recircularización de plásmidos digeridos con una sola

enzima de restricción. De esta forma se favorece la clonación de fragmentos de ADN

obtenidos mediante digestión con enzimas de restricción que producen extremos romos. La

https://es.wikipedia.org/wiki/Enzima


- 52 -

reacción de defosforilación se realizó en un volumen final de 10 µl, con 1 µg de ADN

digerido, 1 µl de tampón 10X y 2 µl de fosfatasa alcalina CIP (Roche) diluida hasta

0,01U/pmol (0,5 M Tris-HCl pH 9,0; 10 mM MgCl2; 1 mM ZnCl2 y 10 mM espermicida) y agua

MiliQ. Se incubó a 37ºC durante 30 minutos. La desactivación de la enzima se realizó

mediante incubación a 65ºC durante 15 minutos. Los fragmentos de ADN tratados fueron

purificados utilizando el kit comercial NucleoSpin® Gel and PR clean-up (Macherey-Nagel).

2.6.4 Obtención de ARN total de F. oxysporum

Para la obtención de ARN total de F. oxysporum se utilizaron los siguientes métodos: el

método Trizol (Invitrogen) y el método basado en la utilización del kit SV Total RNA Isolation

System (Promega).

2.6.4.1 Método Trizol

El Trizol es una solución mono-básica de fenol e isocianato de guanidina que durante la

homogeneización de la muestra mantiene la integridad del ARN al mismo tiempo que altera

la estabilidad de las células y rompe los componentes celulares. El volumen de la muestra

no debe exceder del 10 % del volumen del trizol. La adición de cloroformo seguida de

centrifugación separa la muestra en dos fases, una de ellas acuosa y la otra orgánica. El

ARN permanece exclusivamente en la fase acuosa y puede ser recuperado por precipitación

con alcohol isopropílico.

Las muestras de micelio o tejido vegetal congelado a -80ºC fueron trituradas en un mortero

con nitrógeno líquido. El micelio o tejido vegetal pulverizado fue transferido a un tubo

eppendorf de 1,5 ml, al que se añadió 1 ml de Trizol® Reagent (Ambion RNA life

technologies), mezclando cuidadosamente con una pipeta para homogeneizar la muestra.

Ésta fue incubada a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir la disociación

completa de las proteínas. A continuación la muestra fue centrifugada durante 10 minutos a

12.000 rpm y 4ºC y el sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo que fue incubado

durante 5 minutos en hielo. Se añadieron 200 µl de cloroformo por cada ml de Trizol utilizado

y se agitó la muestra manualmente o en un vórtex durante 15 segundos, siendo incubada

posteriormente durante 5 minutos en hielo. A continuación se centrifugó durante 15 minutos

a 12.000 rpm y 4ºC. La muestra se separa ahora en dos fases, una fase roja que


- 53 -

corresponde al trizol-cloroformo y una fase incolora que corresponde a la fase acuosa. El

ARN permanece exclusivamente en la fase incolora.

La fase acuosa fue transferida a un nuevo tubo y se añadió 1 volumen de cloroformo/alcohol

isoamílico (24:1). El tubo se agitó en el vortex, fue centrifugado durante 10 minutos a 12.000

rpm y 4ºC y la fase acuosa fue transferida a un nuevo tubo eppendorf. Dependiendo de la

pureza y calidad del ARN que deseamos obtener el tratamiento con 1 volumen

cloroformo/alcohol isoamílico (24:1) se puede repetir 1 o 2 veces. Se añadieron al

sobrenadante 250 µl de isopropanol y 250 µl de citrato de sodio (citrato de sodio 0,8 M y

NaCl 1,2 M) y se incubó la mezcla durante 10 minutos o toda la noche. Pasado este tiempo

se centrifugó durante 15 minutos a 12.000 rpm y 4ºC. Se eliminó la fase acuosa y se añadió

1 ml de etanol 70 %. La suspensión fue centrifugada durante 5 minutos a 7.500 rpm y 4ºC

y el sedimento resultante se resuspendió en 25 a 50 µl de agua MiliQ tratada con DEPC 0,1

%. El ARN así preparado se conservó a -80ºC hasta su utilización.

2.6.4.2 Obtención de ARN con el kit comercial SV Total RNA

Isolation System (Promega)

El Kit comercial SV Total RNA Isolation System (Promega) permite obtener ARN de buena

calidad y pureza de forma rápida y sencilla. Se realizó la extracción de ARN de micelio o

tejido de planta siguiendo las recomendaciones del fabricante.

El micelio o tejido de planta conservados a -80ºC fueron triturados en un mortero con

nitrógeno líquido. El polvo resultante fue transferido a un tubo eppendorf de 1,5 ml con 175

µl de buffer de lisis de ARN (RLA+BME) y la muestra fue homogeneizada con ayuda de una

pipeta o por inversión. Se añadieron 350 µl de buffer de dilución de ARN (RDA, blue),

mezclando la muestra por inversión de 3 a 4 veces e incubando 3 minutos a 70ºC. Se

centrifugó 10 minutos a 13.000 rpm. La fase transparente fue transferida a un tubo

eppendorf con 200 µl de etanol 95 % (etanol absoluto 99 % + agua DEPC 0,1 %), se mezcló

la muestra con una pipeta para homogeneizar la muestra, se transfirió la suspensión a una

columna y ésta fue centrifugada durante 1 minuto a 13.000 rpm. Se eliminó el lisado y se

añadieron 600 µl de tampón de lavado de ARN (RWA+etanol 95 %). La columna se

centrifugó durante 1 minuto a 13.000 rpm, se eliminó el sobrenadante y se añadieron 50 µl

de DNAsa (40 µl de Yellow core buffer; 5 µl de MnCl2 0,09 M; 5 µl de DNAsa I), y se incubó

15 minutos a temperatura ambiente. La inactivación de la DNAsa se realizó añadiendo 200


- 54 -

µl de solución DNAsa stop (DSA + etanol 95 %) y centrifugando durante 1 minuto a 13.000

rpm. El filtro con el ARN fue lavado 2 veces con 600 µl y 250 µl de tampón de lavado (RWA

+ etanol 95 %) y centrifugado durante 2 minutos a 13.000 rpm. El sedimento de ARN fue

recuperado en 50 µl de agua libre de RNAsas.

2.6.4.3 Tratamiento de ARN con DNAasa

El ARN fue tratado con DNAsa utilizando el kit DNA-free™ Kit TURBO™ DNase Treatment

and Removal Reagents (Ambion Life Technologies, USA). Las muestras fueron tratadas

con 1 µl de DNAsa a 37ºC durante 30 minutos. Transcurrido este tiempo se añadieron 5 µl

del inactivador de la DNAsa y las muestras se incubaron durante 2 minutos a temperatura

ambiente. Posteriormente fueron centifugadas durante 1 minuto a 13.000 rpm y el

sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo eppendorf. El ARN se conservó a -80ºC.

2.6.4.4 Cuantificación de ácidos nucleicos

Para estimar la pureza del ADN se utilizó un espectrofotómetro NanoDrop N-1000. Los

valores de absorbancia de 1,8 a 2,0 a 260 nm y 280 nm, respectivamente, son indicativos

de ADN puro. Los valores inferiores indican la presencia de proteínas o de otros

contaminantes. Una segunda valoración de la pureza de ácidos nucleicos es la estimación

de la relación Absorbancia 260/ Absorbancia 230. Los valores de 2,0 a 2,2 indican pureza.

Una relación inferior supone la presencia de contaminantes como carbohidratos o fenol.

La integridad del ADN también se puede evaluar mediante electroforesis en gel de agarosa.

Si el ADN está integro, se debe observar una banda estrecha de alto peso molecular. Si

está fragmentado se observará una banda más o menos ancha y más o menos difusa, en

función del grado de degradación, pudiendo aparecer a lo largo de todo el carril de

electroforesis. El ADN fragmentado dificulta la amplificación de productos de PCR de alto

peso molecular, afectando la reproducibilidad de las técnicas.

2.7 Electroforesis de ácidos nucleícos

2.7.1 Electroforesis de ADN

Las electroforesis de ADN se realizaron en geles de agarosa de 0,6 al 2 % preparados en

tampón TAE 1X (40 mM Tris-acetato y 1 mM EDTA). Se utilizaron cubetas horizontales de


- 55 -

15 o 30 cm de largo, con tampón de electroforesis TAE 1X. El ADN se mezcló en proporción

6:1 con el tampón de carga de electroforesis (30 % glicerol; 0,25 % azul de bromofenol y

0,25 % xylene cyanol, Sigma). Se cargaron las muestras en el gel de agarosa incluyendo

en cada gel un pocillo para el marcador de peso molecular (1 kb Plus DNA ladder, Fisher).

Los geles se sometieron a campos eléctricos de 80 a 100 voltios dependiendo del rango de

tamaños a resolver y de la cantidad de ADN. Después de 45 a 60 minutos los geles se

tiñeron con bromuro de etidio en una concentración de 0,1 a 0,5 mg/ml en TAE 1X, durante

20 minutos. El ADN se visualizó por medio de luz ultravioleta y se captaron las imágenes

por medio del sistema Kodak de grabación digital de imágenes.

2.7.2 Electroforesis de ARN

Las electroforesis de ARN se realizaron en condiciones desnaturalizantes, siguiendo el

procedimiento descrito en Sambrook y colaboradores (1989) y las indicaciones mostradas

en el manual de marcaje de sondas DIG (Roche Molecular Biochemicals). Los geles de ARN

proporcionan la matriz y las condiciones desnaturalizantes para una correcta separación y

detección del ARN. Se prepararon geles de agarosa al 1 % en tampón MOPS 1X (20 mM

MOPS, 5 mM acetato sódico, 1 mM EDTA pH 7) con 2 % de formaldehído y 0,5 µg/ml de

bromuro de etidio.

Las muestras de ARN fueron ajustadas a una concentración de 1 µg/µl y se mezclaron en

2 volúmenes de tampón de carga para Northern Blot. Para 500 µl de tampón se añadieron

250 µl de formamida deionizada, 83 µl de formaldehído, 50 µl glicerol 100 %, 10 µl de azul

de bromofenol y 57 µl de agua DEPC 0,1 %. Las muestras se incubaron durante 10 minutos

a 65ºC para desnaturalizar el ARN, se incubaron en hielo y se depositaron en el gel. El

tampón de electroforesis utilizado fue MOPS 1x. Las muestras migraron a 40 voltios durante

4 horas en una campana de extracción. Debido a la poca conductibilidad eléctrica del

tampón MOPS, cada 15 minutos se removió el tampón del polo positivo al negativo. La

integridad del ARN se comprobó en el transluminador de luz ultravioleta.

2.7.3 Purificación de fragmentos de ADN de geles de agarosa

Las muestras de ADN a ser recuperadas fueron preparadas en gel de agarosa del 0,7 % en

TAE 1X (la concentración puede variar en función del tamaño del fragmento que se desea

purificar). Las condiciones de la electroforesis se realizaron garantizando la máxima

resolución y separación del fragmento a ser recuperado. Una vez que el gel había sido


- 56 -

teñido con bromuro de etidio se procedió a recuperar el fragmento deseado cortando la

sección del gel de agarosa correspondiente, que fue depositada en un tubo eppendorf de

1,5 ml. El fragmento recuperado fue purificado con el kit comercial NucleoSpin® Gel and PR

clean-up siguiendo las recomendaciones del fabricante.

2.8 Vectores de clonacion

2.8.1 Vector de clonación pGEM-T Easy

El vector de clonación pGEM-T Easy (Promega) linearizado se utilizó para la clonación de

fragmentos amplificados por PCR siguiendo las especificaciones de la casa comercial.

pGEM-T Easy se caracteriza por tener una desoxitimidina 3` terminal en ambos extremos,

característica que mejora la eficiencia de clonación de productos de PCR debido a que las

polimerasas termoestables frecuentemente añaden un residuo de desoxiadenosina de

forma no dependiente de molde en los extremos 3` de los fragmentos amplificados. Posee

el gen de resistencia a ampicilina como marcador seleccionable (Figura 3). Además tiene

una región codificante del péptido α de la enzima β-galactosidasa (lacZ) cuya inactivación

insercional permite identificar por color los clones recombinantes. El tamaño del vector es

de 3015 pb.

Figura 3. Mapa circular del plásmido pGEM-T easy.

2.8.2 Vector de clonación pRF-HU2

El vector de clonación PRF-HU2 es un vector binario de 6.323 pb utilizado para la clonación

de dos fragmentos de ADN en un solo paso (Frandsen et al., 2008) (Figura 4, Panel I).


- 57 -

Posee un gen de resistencia a kanamicina (KanR) como marcador seleccionable en E. coli;

un gen de resistencia a higromicina B (hph) como marcador seleccionable en hongos y un

gen de iniciación de la replicación del plásmido (TrfA). El vector PRF-HU2 posee dos sitios

únicos de clonación (UCS´s), uno de ellos situado cerca del borde izquierdo (LB) y el otro

situado cerca del borde derecho (RB). Cada sitio único de clonación presenta una diana

para la enzima de restricción PacI, flanqueada por dianas para la enzima de restricción

Nt.BbvCI (Biolabs, Inglaterra). Los bordes LB y RB constituyen los límites del T-DNA (ADN

transferido). El T-DNA es un fragmento de ADN derivado del plásmido Ti de A. tumefaciens

que es transferido desde la bacteria hacia la célula vegetal huésped.

La digestión de PRF-HU2 con PacI y Nt.Bbv.CI divide el plásmido en 2 fragmentos lineales

de ADN, cada uno con 2 extremos cohesivos de 9 pares de bases, de las cuales 7 son

idénticas en todos los extremos y dos son características de cada extremo (Figura 4B-2).

Estas dos bases características de cada extremo proporcionan la direccionalidad de la

reacción de clonación, asegurando que los fragmentos de ADN a clonar que previamente

han sido generados mediante amplificación por PCR y digestión con la mezcla de enzimas

USER se liguen al vector y al fragmento con el gen de resistencia a higromicina en la

ordenación correcta, tal y como se indica en la Figura 4.

A


- 58 -

Figura 4. Panel A: Mapa circular del plásmido PRF-HU2. Panel B: Estrategia de clonación utilizando el plásmido PRF-HU2 (tomado de Frandsen et al., 2008). 1: Amplificación de las regiones flanqueantes 5´-3´ del gen blanco con cebadores específicos que contienen una extensión de deoxiuridina en orientación 5´. 2: Tratamiento con User Cloning de los insertos amplificados por PCR de las regiones flanqueantes 5´-3´ para generar un extremo 3ćohesivo. 3: Digestión plásmido PRF-HU2 con enzimas PacI y Nt.BbvCI con dos sitios únicos de clonación (LB y RB). Cada UCS´s con un sitio restricción PacI (color rojo) y dos sitios para Nt.BbvCI (color azul) y dos pares de bases unicas que asegura la direccionalidad de la clonación de los insertos (color amarillo, verde, gris y rosa). La digestión del vector resulta en la generación de dos fragmentos con extremos cohesivos 3´de 9 pares de bases. 4: Ligación de los productos amplificados de las regiones flanquenates 5´- 3´ al vector PRF-HU2 previamente linearizado con enzimas PacI y Nt.BbvCI. 5: Transformación de E. coli. 6: Verificación de transformantes por PCR de colonia con los cebadores utilizados para amplificar de las regiones flanqueantes 5ý 3´.

2.8.3 Vector de clonación pEA-FU

El plásmido pEA-FU se deriva del plásmido PRF-HU. El casete de resistencia a fleomicina

fue amplificado por PCR a partir de ADN plasmídico del vector pVIR-RNAi (Casado del

Castillo, sin publicar) con los cebadores PHLEO-RNAi-F, que incluye un sitio de restricción

SphI en su extremo 5’, y 3-Fleomicina-R, que incluye un sitio de restricción ApaI en su

extremo 5’, purificado y clonado en el vector pGEM-T. Posteriormente el inserto fue liberado

con ApaI y SphI, recuperado de gel y ligado al esqueleto del vector PRF-HU sin el casete

B 1 3

2

4

5

6


- 59 -

de resistencia a Higromicina B (el casete de resistencia a higromicina fue retirado por

digestión con las enzimas de restricción ApaI y SphI), obteniéndose el vector pEA-FU. El

vector pEA-FU posee un sitio único de clonación (UCS) con sitios de restricción únicos para

las enzimas PacI y Nt.Bbv.CI. Tiene un gen de resistencia a kanamicina (KanR) como

marcador seleccionable en E. coli y un gen de iniciación de la replicación del plásmido (TrfA).

El casete de resistencia a fleomicina esta formado por el promotor del gen codificador de la

enzima glyceraldehydephosphate deshydrogenase (Pgpd) de A.awamori; el gen (ble) como

marcador seleccionable en hongos y el terminador transcripcional del gen codificador de la

enzima cytochrome oxidase (Tcyc1) de S. cerevisiae. El vector pEA-FU linearizado posee

extremos cohesivos de 9 pb, lo que proporciona la direccionalidad de la clonación en la

reacción con sistema USER Friendly Cloning y asegurando el correcto clonaje del fragmento

de ADN durante la reacción de clonación. El vector tiene un tamaño de 5.459 pb (Figura 5).

Figura 5. Mapa de construcción del plásmido pEA-FU. Panel A se muestra el plásmido PRF-HU con el casete de resistencia a higromicina que fue eliminado por digestión enzimática con las enzimas de restricción ApaI y SphI. Panel B se muestra el plásmido pVIR-RNAi del cual se amplificó el casete de resistencia a fleomicina con los cebadores PHLEO-RNAi-F que posee un sitio de restricción SphI en el extremo 5ý Fleomicina-R que posee un sitio de restricción ApaI en el extremos 5´. Panel C se muestra el plásmido pEA-FU que fue utilizado para ensayos de complementación.


- 60 -

2.8.4 Vector de silenciamiento pVIR-RNAi

El vector de silenciamiento pVIR-RNAi (Casado del Castillo, sin publicar) posee un gen de

resistencia a kanamicina (KanR) como marcador seleccionable en E. coli; un gen de

iniciación de la replicación del plásmido (TrfA). El casete de resistencia a fleomicina esta

formado por el promotor del gen codificador de la enzima glyceraldehydephosphate

deshydrogenase (Pgpd) de A. awamori; el gen (ble) como marcador seleccionable en

hongos y el terminador transcripcional del gen codificador de la enzima cytochrome oxidase

(Tcyc1) de S. cerevisiae. Este vector presenta un casete de silenciamiento formado por el

promotor del gen codificador de la enzima glyceraldehydephosphate deshydrogenase

(Pgpd) de A. awamori y el promotor del gen que codifica la enzima isopenicillin N-synthetase

(PpcbC) de P. chrysogenum, orientados en sentidos opuestos. Entre ambos promotores se

ubica un sitio único de clonación NcoI, en el cual se inserta el fragmento de ADN del gen

diana a ser silenciado. El vector pVIR-RNAi tiene un tamaño de 7.254 pb (Figura 6).

Figura 6. Mapa circular plásmido pVIR-RNAi utilizado para silenciamiento genético.

2.9 Transformaciones

2.9.1 Preparación de células competentes de E. coli

Para la preparación de células competentes de E. coli se siguió el siguiente procedimiento.

Una alícuota de E. coli almacenada a -80ºC se sembró en una placa petri con medio LB que

fue incubada toda la noche a 37ºC. Al siguiente día se inoculó una colonia única en 5 ml de

medio de cultivo líquido SOB y el cultivo se incubó toda la noche a 37ºC y 200 rpm. Se tomó


- 61 -

1 ml de preinóculo que se añadió a 250 ml de medio de cultivo SOB (20 g/l de Triptona, 5

g/l de Extracto de levadura, 0,5 g/l de NaCl, 2,3 ml de glucosa 40 %; 10 ml de KCl 250 mM,

ajustado el pH a 7,0 y esterilizado en autoclave. A este medio posteriormente se le añade 5

ml de MgCl2 2M) extendiendo la incubación 10 a 12 horas a 37ºC y 200 rpm (hasta alcanzar

una DO600nm = 0,6). A partir de este momento se trabajó todo el tiempo en hielo (el rotor y la

centrífuga deben estar refrigerados). Los 250 ml de cultivo bacteriano fueron transferidos a

4 tubos para la centrífuga (Beckman Avanti®J-25I, USA) y fueron incubados en hielo

durante 10 minutos antes de proceder a su centrifugación a 3.000 rpm durante 10 minutos

y 4°C en un ROTOR JLA-16-250.

Se eliminó el medio de cultivo y las células sedimentadas fueron resuspendidas en 80 ml

de buffer TB frio (PIPES 10 mM, CaCl2 15 mM, KCl 250 mM, ajustar el pH a 6,7 con KOH

1M, y añadir finalmente 55 mM de MnCl2 4H2O). La suspensión fue homogeneizada

agitando manualmente (no se debe usar el vórtex), incubada en hielo durante 10 minutos y

centrifugada a 3.000 rpm y 4ºC. Se eliminaron los restos de tampón y las células fueron

transferidas a 20 ml de buffer TB frio, homogeneizando la suspensión de células de nuevo

agitando manualmente. A continuación se añadieron 1,4 ml de DMSO 7%. Las células

fueron resuspendidas mediante agitación manual, incubadas en hielo durante 10 minutos y

a continuación repartidas en alícuotas de 10 y 100 µl en tubos eppendorf que fueron

congelados en nitrógeno líquido y posteriormente almacenados a -80°C.

2.9.2 Digestión de los vectores de clonación PRF-HU2, pVIR-RNAi y

pEA-FU

Aproximadamente 10 µg de ADN del vector de clonación PRF-HU2 fueron digeridos con 70

U (7 µl) de la enzima PacI en un volumen total de 200 µl a 37ºC durante toda la noche. Al

día siguiente se añadieron 20 U (2 µl) de la enzima PacI y 40 U (4 µl) de la enzima Nt.Bbv.CI

y la suspensión se incubó durante 3 horas. La digestión completa del vector PRF-HU2 fue

verificada mediante electroforesis en gel de agarosa. Una vez comprobada la digestión total

del plásmido, el ADN digerido fue purificado sobre columna con el kit comercial

NucleoSpin®Gel and PR clean-up, siguiendo las recomendaciones del fabricante. La

concentración final del vector digerido fue aproximadamente de 100 ng/µl en un volumen

final de 100 µl. El vector pVIR-RNAi utilizado para la obtención de transformantes

silenciados fue linearizado con la enzima NcoI. El plásmido pEA-FU, utilizado para la

complementación de los mutantes deficientes en el gen FHG1, fue digerido con las enzimas

PacI y Nt.Bbv.CI como se ha indicado en el caso del plásmido pRF-HU2.


- 62 -

2.9.3 Ensayos de clonación con el sistema “USER Friendly Cloning”

2.9.3.1 Diseño de oligonucleótidos con un adaptador de uridina

Los oligonucleótidos para la construcción de mutantes deficientes en los genes que

codifican las enzimas tipo flavohemoglobina de F. oxysporum f. sp. phaseoli fueron

diseñados en base al genoma anotado de F. oxysporum f. sp. lycopersici depositado en la

base de datos del Broad Institute de la Universidad de Harvard (U.S.A.)

(www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_group). A partir de las secuencias de

las regiones flanqueantes 5´ y 3’ de cada gen se diseñaron oligonucleótidos específicos a

los que se añadió en cada caso un adaptador de 9 pb en el extremo 5´ (Primer 1:

GGTCTTAAU; primer 2: GGCATTAAU; primer 3: GGACTTAAU; primer 4: GGGTTTAAU).

Cada adaptador incluye un nucleótido de Deoxiuridina para permitir la direccionalidad de la

clonación con el sistema USER Cloning (Biolabs, Inglaterra). La síntesis de los

oligonucleotidos fue realizada por la empresa Integrated DNA Technologies. Las secuencias

de los oligonucleótidos diseñados para cada uno de los cuatro genes codificadores de

enzimas de tipo flavohemoglobina de F. oxysproum se presentan en la Tabla 6.

2.9.3.2 Amplificación de las regiones flanqueantes

Los fragmentos correspondientes de las regiones flaqueantes 5’ y 3’ de cada uno de los

genes FHG necesarios para la creación de los vectores de remplazamiento génico utilizando

el sistema USER Friendly Cloning fueron amplificados por PCR con la enzima pfuTurbo Cx

Hoststart ADN polimerasa (Agilent Technologies), que reconoce nucleótidos de

deoxiuridina. La ampificación de las regiones flanqueantes 5´-3´se realizaron con el

siguiente progama de PCR: un ciclo inicial de 5 minutos a 95 ºC, seguido de 35 ciclos de

95ºC (desnaturalización) 30 segundos y 35 ciclos de 55ºC a 58 ºC dependiendo del cebador

(Tabla 6) y una la extensión a 72ºC durante 1 a 1,5 minutos. Los productos de PCR fueron

visualizados en gel de agarosa 1 % en TAE 1X, verificando que tuvieran el tamaño adecuado

y la concentración suficiente para las reacciones de clonación. Los productos de PCR fueron

purificados con el kit comercial NucleoSpin® Gel and PR clean-up, siguiendo las

instrucciones del fabricante.

http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_group

http://frodo.wi.mit.edu/primer3/).%20Los%20primers%20fueron%20elaborados%20por%20la%20empresa

http://frodo.wi.mit.edu/primer3/).%20Los%20primers%20fueron%20elaborados%20por%20la%20empresa

http://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos


- 63 -

2.9.3.3 Reacción de ligación con USER Friendly Cloning

La reacción de ligación de vector PRF-HU2 linearizado con los insertos 5´ y 3ámplificados

por PCR de cada uno de los genes se realizó con el kit USER Friendly Cloning (Biolabs,

Inglaterra) en un volumen final de 20 µl conteniendo 8 µl del Vector linearizado; 4 µl del

Producto de PCR 1; 4 µl del Producto de PCR 2; 1 µl de Enzima USER Friendly Cloning; 1

µl de Buffer 10X y 2 µl de H2O MiliQ estéril. La reacción de ligación se llevó a cabo en un

termociclador incubando a 37ºC durante 30 minutos a 37ºC y seguidamente a 25ºC durante

20 minutos.

2.9.4 Transformación de E. coli

Las transformaciones con E. coli se realizaron mediante el método de choque térmico. Para

ello se mezclaron 100 µl de células competentes de E. coli con 20 µl de reacción de ligación

(Vector linearizado + productos de PCR) y la suspensión se incubó durante 30 minutos en

hielo. Las células fueron incubadas entonces a 42ºC durante 2 minutos e inmediatamente

en hielo durante 2 minutos. Se añadieron 450 µl de medio de cultivo LB y la suspensión de

transformación se incubó durante 1 hora y 30 minutos a 37ºC y 200 rpm. Las células se

sembraron en placas petri con medio LB suplementado con el antibiótico adecuado y éstas

fueron incubadas durante 16 horas a 37ºC.

2.9.5 Transformación de A. tumefaciens

2.9.5.1 Preparación de células competentes

Para la preparación de células competentes de A. tumefaciens una alícuota de la cepa AGL-

1 se sembró en una placa petri con medio LB y ésta se incubó a 28ºC durante toda la noche.

A partir de una colonia se realizó un precultivo en 2 ml de medio LB. Se tomaron 20 µl de

precultivo y se inocularon en 100 ml de medio de cultivo líquido LB suplementado con 50

µg/ml de rifampicina y 200 µg/ml de carbenicilina. Se incubó toda la noche a 28ºC y 200 rpm

en la oscuridad hasta que el cultivo alcanzó una DO600nm= 0,75.

El medio de cultivo con A. tumefaciens se distribuyó en dos tubos específicos para la

centrífuga Beckman (Beckman Avanti®J-25I, USA), rotor JLA-16.250, en los que fue

centrifugado durante 5 minutos a 5.000 rpm y 4ºC. Se eliminó el medio de cultivo y las


- 64 -

células fueron lavadas 3 veces con agua MiliQ, con centrifugaciones de 5 minutos a 5.000

rpm y 4ºC. A continuación las células fueron resuspendidas en 50 ml de glicerol 10 % frio,

homogeneizando la suspensión con agitación manual, repartidas en alícuotas de 40 µl en

tubos eppendorf de 1.5 ml y almacenadas a -80ºC.

2.9.5.2 Electroporación de A. tumefaciens

Para la electroporación se añadieron de 100 a 200 ng de ADN plasmídico (en un volumen

igual o inferior a 4 µl) con la construcción de interés en 40 µl de células electrocompetentes

de A. tumefasciens. La mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación fría (mantenida

a 4ºC). Sé aplicó un pulso de 8-12 ms a 1.800 V, 25 µFD, capacitancia 125 µFD y 400 Ω.

Las células se recuperaron añadiendo 1 ml de LB e incubando la suspensión resultante

durante 2 horas a 28ºC y 180 rpm. Posteriormente las células fueron extendidas sobre

placas con medio LB suplementado con 50 µg/ml de kanamicina e incubadas durante 2 días

a 28ºC.

2.9.5.3 Transformación de F. oxysporum mediada por A.

tumefaciens (ATM)

Se utilizó la metodología de transformación de hongos mediante A. tumefaciens propuesta

por Mullins et al. (2001) y modificada según se ha descrito previamente (Ramos et al., 2007).

Una vez seleccionada la colonia de A. tumefaciens portadora de la construcción de interés

derivada del plásmido PRF-HU2, ésta se cultivó en 2 ml de Medio Mínimo (MM)

suplementado con 50 µg/ml de kanamicina (ver Tabla 5) durante 2 días a 28ºC y 180 rpm.

Pasado este tiempo se midió la densidad densidad óptica (DO600nm) en un espectrofotómetro

y el cultivo se diluyó con Medio de Inducción (MI) suplementado con 200 µM/ml de

acetosiringona (inductor de genes de virulencia) hasta alcanzar una DO600nm= 0,15. La

células en MI se incubaron por 6 horas a 28ºC y 180 rpm.

Mientras las células de A. tumefaciens crecen en MI, los microconidios de F. oxysporum

fueron recuperados de placas PDA con agua MiliQ estéril, filtradas en un embudo con lana

de vidrio estéril y cuantificados en un microscopio óptico con la ayuda de un hemocitómetro.

La suspensión de microconidios frescos fue ajustada a una concentración de 1x106

microconidios/ml en medio de inducción (MI).


- 65 -

2.9.5.4 Ensayo de cocultivo de A. tumefaciens con F. oxysporum

Se mezclaron 100 µl de la suspensión de 1 x 106 microconidios/ml con 100 µl del cultivo de

A. tumefaciens en MI. La mezcla (200 µl) se extendió sobre una membrana de nitrocelulosa

(0,45 µm de poro) colocada en placas de Petri con Medio de Cocultivo. Las placas se

incubaron por 48 horas a 25ºC en la oscuridad cubiertas con papel aluminio para evitar la

exposición a la luz y que el hongo crezca muy rápido e inhiba el crecimiento de la bacteria.

Pasado este tiempo las membranas de nitrocelulosa fueron transferidas a placas de Petri

con medio PDA suplementado con 100 µg/ml de higromicina B (como agente de selección

para transformantes), 200 µM de cefotaxima y 100 µg/ml de moxalactam (para matar las

células de Agrobacterium) e incubadas a 25ºC hasta la aparición de colonias resistentes a

higromicina B. Los transformantes individuales resistentes a higromicina B fueron

transferidos a nuevas placas de Petri con medio PDA con 100 µg/ml de higromicina B e

incubados por 5 días a 25ºC.

2.9.5.5 Identificación de transformantes

Los transformantes individuales resistentes a higromicina B fueron evaluados mediante

reacciones de PCR a partir de ADN genómico extraído haciendo uso de un método de

extracción rápido (descrito en la sección 2.6.1.3 de Materiales y Métodos) utilizando

oligonucleótidos diseñados sobre las regiones flanqueantes 5´ y 3´ del alelo silvestre y de

la región codificante del gen de resistencia a higromicina del alelo mutante de tal manera

que solamente se obtendrán productos de amplificación en los mutantes en los que han

ocurrido eventos de recombinación homóloga simultánemante en la región flanqueante 5’

y en la región flanqueante 3’ entre la copia del alelo silvestre del gen de interés y la copia

mutante clonada en el plásmido de remplazamiento.

La detección de eventos de recombinación homóloga simultáneamente en las regiones

flanqueantes 5´ y 3´ permite la selección de transformantes en los que ha sido reemplazado

el alelo silvestre por el alelo mutante. En cada caso se seleccionaron los transformantes

positivos que fueron cultivados en medio liquido PDB con 50 µg/ml de higromicina B. El

micelio fue recuperado en papel filtro y macerado en un mortero con nitrógeno liquido. El

ADN fue extraído con el método CTAB, tratado con RNAsa y cuantificado en el

espectrofotómetro NanoDrop-1000 (Thermo Scientific).


- 66 -

La ausencia del alelo silvestre y el número de inserciones de T-DNA en el genoma del

huésped fueron evaluadas mediante hibridaciones tipo Southern Blot. Los transformantes

con inserción de una sola copia de T-DNA fueron purificados mediante 3 a 4 rondas de

cultivos monospóricos para eliminar la heterocariosis.

2.10 Construcción de mutantes dobles

2.10.1 Silenciamiento genético

El silenciamiento genético del gen FHG1 se realizó sobre el fondo genético de los

transformantes nulos en el gen ∆FHG2. El inserto de silenciamiento de la región codificante

del gen FHG1 fue amplificado por PCR con los cebadores FO17SilenF y FO17SilenR (ver

Tabla 6), a los que se les añadió un sitio de restricción para la enzima NcoI en sus extremos

5’. Se amplificó un fragmento de 281 pb que fue purificado y clonado en el plásmido pGEM-

Teasy. El inserto liberado mediante digestión con la enzima NcoI, recuperado de gel y

purificado con el kit comercial NucleoSpin® Gel and PR clean-up fue ligado en el sitio NcoI

del vector pVIR-RNAi previamente linearizado con la enzima NcoI, obteniéndose el vector

pEA-RNAi. Con el plásmido pEA-RNAi se transformó A. tumefaciens siguiendo el

procedimiento mostrado en el apartado 2.9.5.2 de Materiales y Métodos. La transformación

mediada por A. tumefaciens de las cepas ΔFHG2 de F. oxysporum y el análisis de

transformantes se realizaron siguiendo los procedimientos mostrados en las secciones

2.9.5.3, 2.9.5.4 y 2.9.5.5 de Materiales y Métodos.

2.11 Complementación de genes

La complementación es una técnica de genética reversa utilizada para devolver la

funcionalidad de los genes que han sido reemplazados por disrupción génica. Un

fragmento de 3.6 kb de ADN genómico de F. oxysporum SP1 que incluye la región

codificante del gen FHG1 flanqueada por un un fagmento de 1300 pb de su región

promotora y de un fragmento de 1034 pb de la región terminadora fue amplificado por PCR

utilizando los oligonucleotidos COMP-FOXG-17-F y COMP-FOXG-17-R, en cuyo extremo

5’ en cada caso se ha introducido un sitio de restricción PacI (ver Tabla 6), fue amplificado

con la enzima PCR Extender Polymerase Mix (5 prime). El producto de PCR fue purificado

y ligado en el vector pGEM-T. El fragmento liberado por digestión con la enzima PacI fue

clonado en el plásmido pEA-FU, previamente digerido con PacI, dando lugar al plásmido

pEA-FU-FHG1. Este plásmido fue introducido en las cepas mutantes ΔFHG1 de F.


- 67 -

oxysporum SP1 y SP4 mediante transformación mediada por A. tumefaciens siguiendo los

procedimientos descritos en las secciones previas.

2.12 Reaccion en cadena de la polimerasa (PCR)

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica "in vitro" que permite

amplificar mediante procedimientos químicos un fragmento de ADN. Las distintas variantes

utilizadas en el presente trabajo se detallan a continuación.

2.12.1 PCR estándar

Las amplificaciones de ADN mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se

realizaron utilizando distintas enzimas polimerasas de ADN dependiendo del objetivo de la

amplificación. Para amplificaciones en las que se precisaba una gran fidelidad se utilizó la

enzima PCR Extender Polymerase Mix (5 prime) y para amplificar secuencias en las que

se añadió un nucleótido dUTP a los cebadores se utilizó la enzima pfuTurbo Cx Hoststart

ADN polimerasa (Agilent Technologies). Para todas las demás reacciones de PCR se utilizó

la ADN polimerasa de Biotools (Biotools).

Las reacciones se realizaron en volúmenes de 25 o 50 μl con 0,2 mM dNTPs, 0,2 μM de

cada uno de los dos cebadores y concentraciones variables de polimerasa. Cada enzima

tiene su tampón específico con la concentración de MgCl2 necesaria para una reacción

eficiente.

La cantidad de ADN molde usado varió según el tipo de ADN y su pureza. La cantidad de

ADN usada en el caso de ADN genómico fue entre 50 y 100 ng y para ADN de plásmido

fue entre 0,01 y 10 ng. En el caso de que la muestra de ADN contuviera impurezas que

pudieran inhibir la PCR, el ADN se diluyó con agua MiliQ estéril para tener una mejor

reacción. Cuando se quiso comprobar la clonación de un fragmento de ADN en un vector

de E. coli se añadió directamente 1 μl de cultivo celular a la mezcla de reacción.

Se utilizado un termociclador modelo GeneAmp PCR System 9700 de Applied Biosystems

y un termociclador modelo Mastercycler Gradient de Eppendorf. En los ciclos del programa

de PCR la desnaturalización se realizó a 94ºC durante 30 segundos, la hibridación del

cebador durante 30 segundos a una temperatura que osciló entre 55ºC y 61ºC


- 68 -

dependiendo de la pareja de cebadores y la extensión a 72ºC durante peridodos variables

de tiempo, considerando 1 minuto por cada 1.000 nucleótidos de tamaño del fragmento de

ADN que se va a amplificar. Normalmente se aplicaron entre 30 y 35 ciclos, seguidos de

una última fase de extensión de entre 5 y 7 minutos de duración. Los distintos

oligonucleótidos utilizados en esta investigación fueron sintetizados por la empresa

Integrated DNA Technologies y se detallan en la Tabla 6.

2.12.2 RT-PCR

La reacción RT-PCR consiste en la amplificación mediante PCR de fragmentos de cDNA

generados por retrotranscripción (RT) de un ARN mensajero original. Se realizó con el kit

PrimeScriptTM (Takara).

La síntesis de cDNA se llevó a cabo en reacciones con un volumen final de 10 µl que

contenían 500 ng de ARN total, 2 µl de tampón 5X, 0,5 µl de Oligo dT 50 µM, 0,25 µl de la

enzima PrimeScript RT y agua tratada con DEPC al 0,1% hasta completar el volumen. Las

reacciones se realizaron en un termociclador con dos ciclos de temperatura: 15 minutos a

37ºC y 5 minutos a 85ºC. Los productos de retrotranscripción se almacenaron a -80ºC hasta

su utilización.

2.12.3 PCR en Tiempo Real

Se siguieron los procedimientos descritos por de Vega Bartol y colaboradores (de Vega-

Bartol et al., 2012). Las reacciones para determinar la recta patrón y las reacciones de PCR

cuantitativa propiamente dichas fueron realizadas en el equipo StepOne PlusTM de Applied

Biosystems utilizando el KAPA SYBR FAST Prim 2X qPCR Master Mix. Para la amplificación

en tiempo real se diseñaron oligonucleótidos específicos para los genes en estudio y para

el gen endógeno utilizado como control. Éstos fueron diseñados de acuerdo a las

recomendaciones para reacciones de PCR en tiempo real.

Las reacciones se realizaron en placas de 96 pocillos. Para la amplificación se utilizó el kit

KAPA que incluye la enzima con el tampón apropiado y sólamente hay es necesario añadir

los oligonucleótidos correspondientes y completar el volumen establecido con agua MiliQ.

Las reacciones se realizaron en volúmenes finales de 10 µl, utilizando como molde cDNA

sintetizado a partir de ARN total, según se describe en la sección anterior. Se optimizó el

procedimiento preparando en primer lugar una master mix con el tampón y el agua MiliQ



- 69 -

necesarios para el número de reacciones planificadas, calculando 3 reacciones para cada

gen y condición a ser analizados. Para un volumen final de 10 µl de reacción se utilizaron 5

µl de tampón 2X, 2,8 µl de agua MiliQ, 0,6 µl 10 µmol de cada uno de los cebadores y 1 µl

de cDNA. Se repartieron 10 µl de reacción en cada uno de los tres pocillos de la placa, para

así obtener las tres repeticiones propuestas para cada gen y condición.

Las condiciones de amplificación se introdujeron en el termociclador mediante el programa

StepOneTM software v2.2.3, con el siguiente perfil: un ciclo inicial a 95ºC durante 5 minutos

seguido de 40 ciclos con una fase de desnaturalización a 95ºC durante 30 s y una fase de

extensión a 60ºC durante 30 s.

La cuantificación relativa de la expresión de los genes en estudio se realizó mediante el

método Ct. Los valores Ct son determinados por la identificación del ciclo en el cual la

emisión de la intensidad del marcador fluorescente se eleva por encima del ruido de fondo

en la fase exponencial de la reacción de la PCR. En otras palabras, el valor Ct está

representado por el ciclo en el cual la producción de fluorescencia cruza el umbral

establecido. Es importante considerar que un valor Ct superior a 40 ciclos indica que no hay

amplificación y por consiguiente no deben incluirse en los cálculos.

El software Step One mide la amplificación del gen objetivo y del gen endógeno tanto en las

muestras experimentales como en la muestra tomada como referencia. Para ello utiliza el

método 2-ΔΔCt, en el cual se comparan directamente los Cts del gen objetivo y del gen de

referencia (ΔCt) en cada muestra, y posteriormente se compara los ΔCt de las muestras

experimentales con respecto a la muestra control. Este modelo supone una eficiencia

óptima e idéntica (correspondiente al 100 %) en la eficiencia de reacción en las PCR en

tiempo real tanto del gen en estudio como del gen de referencia, lo cual se puede verificar

mediante la recta patrón.

2.12.4 Secuenciación

La secuenciación de fragmentos de ADN fue llevada a cabo en un equipo “3100 Genetic

Analyzer” de la casa Applied Biosystems del Servicio de Secuenciación de la Universidad

de Salamanca. Se utilizaron como ADN molde productos de amplificación por PCR

previamente purificados (100 ng) o ADN plasmídico (400 a 600 ng), los cuales se

prepararon en un volumen final de 8 µl con 3,2 pmol de cebador. La información generada

http://www.monografias.com/trabajos/contamacus/contamacus.shtml

http://www.monografias.com/trabajos14/nuevmicro/nuevmicro.shtml

http://www.monografias.com/trabajos54/produccion-sistema-economico/produccion-sistema-economico.shtml


- 70 -

fue proporcionada en forma de cromatograma y visualizada y editada con el programa

informático Geneious.

2.12.5 Oligonucleótidos utilizados en este trabajo

Los oligonucleótidos utilizados en este trabajo como cebadores para la amplificación de

fragmentos de ADN mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fueron

suministrados por la casa comercial Integrated DNA Technologies. La Tabla 6 presenta el

listado de los mismos indicando su nombre, secuencia (5’-3’), Temperatura de anillamiento

y una descripción de su utilización.

Tabla 6. Oligonucleótidos utilizados en este trabajo de investigación.

Nombre Secuencia (5’-3’) Tm (ºC)

Descripción

FHG2qPCR-FW CCTACTGATGGCAAGCCTCTG 60 PCR cuantitativa expresión gen FHG2

FHG2qPCR-RV GACCCTGAAGCTTGACACTGA 60 PCR cuantitativa expresión gen FHG2

FHG2-FW CCTACTGATGGCAAGCCTCTG 59 Marcaje de sonda gen FHG2

FHG2-RV CTCGAGGAATGCCCTGACATT 59 Marcaje de sonda gen FHG2

FHG4qPCR-FW GAAGGCAGCCATTTCCCGCA 60 PCR cuantitativa expresión gen FHG4

FHG4qPCR-RV CGGCGAGTTGGCGGTATGCA 60 PCR cuantitativa expresión gen FHG4

FHG4-FW GAAGGCAGCCATTTCCCGCA 59 Marcaje de sonda gen FHG4

FHG4-RV ACCACGGGCGCTGTATTGTT 59 Marcaje de sonda gen FHG4

FHG1qPCR-FW CTTGATTGGCACCTACCCCG 60 PCR cuantitativa expresión gen FHG1

FHG1qPCR-RV GATCTTCCGTAACCTTCAGACTG 60 PCR cuantitativa expresión gen FHG1

FHG1-FW CTTGATTGGCACCTACCCCG 59 Marcaje de sonda ge FHG1

FHG1-RV TCGGAGGCTGACATACTGACC 59 Marcaje de sonda gen FHG1

FHG3qPCR-FW TCGGAGGCGATGCCCTCAACC 60 PCR cuantitativa expresión gen FHG4

FHG3qPCR-RV CATGGGAGTGACACCGACACC 60 PCR cuantitativa expresión gen FHG4

FHG3-FW CTCCTCGACCTGACTACTACC 59 Marcaje de sonda gen FHG4

FHG3-RV GTTGCCCTTGACGCAGAGC 59 Marcaje de sonda gen FHG4

FHG135 **GGTCTTAAUATGAGCGATCTCGGTTGGTC

58 Amplificación región flanqueante 5´ gen FHG2



- 71 -

RHG135 **GGCATTAAUTGACAGCTGGATCTTGGTGG


FHG133 **GGACTTAAUTGCTGTCGTCTTTTTGCAGC


RHG133 **GGGTTTAAUCAATCTCAACAAGCGGTGGC


FHG155 **GGTCTTAAUTGACTTGATGCATCCAGGGC


RHG155 **GGCATTAAUGGCCGAGACATACGTTCTTCG


FHG153 **GGACTTAAUACTCCTGAGTTCACGACTGG


RHG153 **GGGTTTAAUGGCATTCTGTTAAACTACCGC


FHG175 **GGTCTTAAUGATAAGCAATGCTGAATAATGG


RHG175 **GGCATTAAUCTCCGATCACCCTCAGTGC


FHG173 **GGACTTAAUTGAGATGACATATCCTCGTG


RHG173 **GGGTTTAAUATGTTCGTCTGCAAATGGGAC


FHG185 **GGTCTTAAUCCTTGAGAGTCTAAGACGGGC


RHG185 **GGCATTAAUATGACACAGCAAGGGCATGGC


FHG183 **GGACTTAAUGTTTCGACGACACATTGGGC


RHG183 **GGGTTTAAUAGGTGTATACGCAACAGCCTC


HphAC CGGGCAGTTCGGTTTCAGGC 61 Amplificación PCR gen higromicina

HphBC CGTCTGGACCGATGGCTGTG 61 Amplificación PCR gen higromicina

FHG2-KN-FW TGACCTGGTACAACGCACCG 58 Selección de transformantes FHG2

RHG2-KN-RV CCGTGTCGGGTGAGACAAGACT 58 Selección de transformantes FHG2

FHG1-KN-FW TGCAGTCTGCTGGGTTGGCG 56 Selección de transformantes FHG1

RHG1-KN-RV CAGCATTTGACCTCGTTCGG 56 Selección de transformantes FHG1

FHG4-KN-FW GTTCCTAGAACTAAGTCTTTGCC

58 Selección de transformantes FHG4

RHG4-KN-RV GTTCGAGAACAGAACTTGGGC 58 Selección de transformantes FHG4

FHG3-KN-FW TAGTGCCGACAGGACGCTAC 58 Selección de transformantes FHG3

RHG3-KN-RV AGACATGTCACGACGAAGTGAC 58 Selección de transformantes FHG3

RF-2-RV TCCTTGCATGCACCATTCCTTG 58 Verificación orientación insertos construcción

RF-1-FW CACCGCCTGGACGACTAAAC 58 Verificación orientación insertos construcción

RF-1HU-R CGGGCCTCTTCGCTATTACG 58 Verificación orientación insertos construcción

RF-2HU-F GTTTCTGGCGCGTTTGCAGG 58 Verificación orientación insertos construcción


- 72 -

EF1αQ1-F CATCGGCCACGTCGACTCT 60 Amplificación PCR gen factor elongación EFα1

EF1αQ2-R AGAACCCAGGCGTACTTGAA 60 Amplificación PCR gen factor elongación EFα1

EF2B-RV GGAAGTACCAGTGATCATGTT 58 Amplificación PCR gen factor elongación EFα1

PHLEO-RNAi-FW *AGCTGCATGCTTAAAGCCTTCGAGCGTCCCAAA

58 Amplificación PCR ORF gen Phleomycin

3-Fleomicina-RV *GGGGCCCCAGTGAATTCGAGCTCGCT

58 Amplificación PCR ORF gen Phleomycin

FO17Silen-FW *TACTCCATGGACGCCACCTATATCGACAAGC

59 Amplificación PCR inserto Silenciamiento FHG1

FO17Silen-RV *CTTGCCATGGCTCCAGCCATCCCATTCGC

59 Amplificación PCR inserto Silenciamiento FHG1

RNAi-U4-RV GGTCTTAATGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCT

58 Verificación construcción silenciamiento E. coli

RNAi-FWD *GTGCATGCCTCCAGGTTGTCTCAGCATAAACACC

58 Verificación construcción silenciamiento E. coli

Fleo-FW CGCCGATCTCGGTCATGG 59 Amplificación PCR ORF gen Phleomycin

Fleo-RV CCAAGTTGACCAGTGCCGTTCC 59 Amplificación PCR ORF gen Phleomycin

COMP-FOXG-17-F *TTCAAGTTAATTAATGCAGTCTGCTGGGTTGGCG

57 Amplificación gen completo FHG1

COMP-FOXG-17-R *GCCAGCTTAATTAACAGCATTTGACCTCGTTCGG

57 Amplificación gen completo FHG1

** Extensión de Uridina, * Sitio de restricción, FW o F = cebador forward; RV o R= cebador reverse

2.13 Hibridación de ácidos nucleicos

2.13.1 Marcaje de sondas

Las sondas se marcaron con un método no radioactivo basado en la incorporación de un

dUTP unido a la digoxigenina (DIG, Roche) en los fragmentos de ADN. La digoxigenina es

un esteroide encontrado en la naturaleza en las plantas Digitalis purpurea y Digitalis lanata.

Se enlaza en la posición C5 de la uridina mediante un brazo que contiene 11 átomos de

carbono. Los nucleótidos marcados con DIG pueden ser incorporados a las sondas de

ácidos nucleicos por DNA polimerasas y por RNA polimerasas.

Antes de la elaboración de las sondas se optimizaron las condiciones de la reacción de

marcaje mediante PCR. Una vez comprobado que se obtenía un único producto de

amplificación y en cantidad suficiente en una reacción de PCR estándar, se procedió a

sustituir en la reacción de PCR la mezcla de dNTPS por la la mezcla de nucleótidos del kit

de marcaje “Polymerase Chain Reaction Digoxigenin Labeling Mix (Roche)”. Como control

positivo de amplificación por PCR se realizó una reacción con dNTPS normales. Se

comprobó en gel de agarosa 1% en TAE 1x el correcto marcaje de la sonda, ya que el


- 73 -

tamaño de la banda marcada con DIG es siempre de mayor peso molecular que la banda

amplificada con dNTPs normales. Las sondas fueron almacenadas a -20ºC hasta su

utilización.

2.13.2 Hibridación Southern blot

La técnica fue desarrollada por Southern (Southern, 1975). Para su realización se ha

seguido el protocolo descrito por Sambrook (Sambrook et al., 1989) y las recomendaciones

de la casa comercial Roche recogidas en el manual de usuario “Dig User´s manual” (dNTPs

marcados con digoxigenina).

Las muestras de ADN digerido con enzimas de restricción se sometieron a electroforesis

en un gel de agarosa al 0,9 % en TAE 1X. Los geles fueron teñidos en bromuro de etidio y

visualizados en el transluminador de luz UV. Posteriormente el gel fue expuesto a luz UV

de 260 nm de longitud de onda durante 5 a 7 minutos con el fin de crear roturas en las

moléculas de ADN y favorecer así la transferencia de fragmentos de ADN relativamente

grandes.

Los geles se sumergieron en solución de desnaturalización (NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M)

durante 1 h en agitación a temperatura ambiente y posteriormente en solución de

neutralización (Tris-HCl 1 M pH 7,5 NaCl 1,5 M) en las mismas condiciones. Después de

estos tratamientos se procedió a transferir el ADN a una membrna de nylon. La unidad de

transferencia consistió en una bandeja que contenía el tampón de transferencia SSC 10X

(NaCl 1,5 M; citrato sódico 0,15 M pH 7,0) sobre la que se sujetó una placa de plástico.

Sobre ésta se colocó una pieza de papel Whatman 3MM cuyos extremos se sumergían en

el tampón de transferencia. El gel se colocó sobre el papel Whatman 3MM y sobre él se

dispuso una pieza de membrana de nylon Hybond-N (Amersham International) y 3 piezas

de papel Whatman previamente humedecidas en tampón SSC 10X, todas de las mismas

dimensiones que el gel. Se eliminaron las burbujas de aire entre las distintas capas. El gel

se rodeó con láminas de plástico y sobre el conjunto gel-membrana se colocó una resma

de papel absorbente y un peso de aproximadamente 500 g. Transcurridas 16 h se procedió

a la fijación irreversible del ADN a la membrana mediante exposición a luz UV en un

Stratalinker. Estas membranas se guardaron a temperatura ambiente hasta su utilización.

A continuación, los pasos seguidos en todos los casos fueron prehibridación, hibridación,

lavado de filtros, detección y eliminación de sonda. La prehibridación y posterior hibridación


- 74 -

de las membranas a las cuales habían sido transferidos los ácidos nucleicos se realizaron

en tubos de vidrio perfectamente cerrados, con agitación moderada y constante, utilizando

50 ml de buffer de prehibridación para mantener las membranas siempre húmedas. La

temperatura de prehibridación y de hibridación de ADN fue 65ºC para sondas homólogas

y 60ºC para sondas heterólogas.

El tampón de prehibridación e hibridación consta para un volumen total de 50 ml, de 32 ml

de H20 MiliQ, 12,5 ml de tampón SSC 20X, 5 ml de Blocking reagent (Roche) 10 %, 500 µl

de N-laurilsarcosina 10 % y 100 µl de SDS 10 %. La prehibridación se realizó a 65ºC

durante 1 hora y treinta minutos con agitación constante. Seguidamente la solución de

prehibridación fue retirada y reemplazada por la solución de hibridación con la sonda

diluida, previamente desnaturalizada durante 10 minutos a 100ºC. La hibiridación se

extendió durante 16 horas en el horno de hibridación con agitación constante. Trancurrrido

este tiempo, se retiró la solución de hibridación y ésta se conservó a -20ºC para su posible

reutilización.

El lavado de la membrana para eliminar los restos de sonda consistió en 2 incubaciones

de 5 minutos a temperatura ambiente con solución de lavado 2X SSC (2X SSC, SDS 0,1%

(p/v), seguida de 2 lavados de 15 minutos a 65ºC con solución 0.1X SSC (0,1X SSC, SDS

0,1 % (p/v).

La detección se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante, como se describe a

continuación. Las soluciones empleadas en la detección se diluyeron en tampón 1 (ácido

maleico 100 mM, NaCl 150 mM pH 7,5). Las membranas se equilibraron en tampón de

lavado (tampón 1 con Tween 20 0,3 % (v/v)) durante 5 minutos y se incubaron en tampón

2 durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear la membrana. Pasado este

tiempo las membranas se incubaron en tampón 2 (Tampón 1 + Blocking Reagent 10 %)

con el anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con la enzima fosfatasa alcalina (Anti

Digoxigenin AP, Roche) (dilución 1:20.000) durante 30 minutos. A continuación, las

membranas se lavaron don veces con tampón de lavado durante 15 minutos para eliminar

el anticuerpo que no se hubiera unido a la sonda.

Las membranas se equilibraron en tampón 3 (Tris-HCl 100 mM, NaCl 10 mM pH 9,5)

durante 5 minutos. La membrana se colocó sobre una lámina de plástico y se añadió el

sustrato quimioluminiscente CDP-Star (Roche). Este sustrato es muy sensible a la acción


- 75 -

de le enzima fosfatasa alcalina, cuya acción modifica el sustrato produciéndose emisión de

luz visible. Las membranas se incubaron en la oscuridad durante 5 minutos a temperatura

ambiente.

Seguidamente se retiró el exceso de líquido de las membranas y éstas fueron transferidas

a una nueva lámina de plástico. Las posibles señales emitidas fueron visualizadas en el

equipo de bioluminiscencia Intelligent Dark Box II (Fujifilm).

Para eliminar la sonda de las membranas, éstas fueron lavadas 2 veces con tampón SSC

0,1X calentado a 100ºC durante 20 minutos en agitación. Las membranas fueron entonces

reutilizadas o guardadas a 4ºC.

2.13.3 Hibridación Northern blot

Las muestras de ARN fueron separadas mediante electroforesis en geles de agarosa en

condiciones desnaturalizantes tal y como se indica en la sección 2.7.2 de Materiales y

Métodos. En este caso todas las soluciones utilizadas fueron tratadas con agua DEPC al

0,1% para eliminar las RNAsas. Previo a su utilización para preparar las soluciones

correspondientes, el stock de agua DEPC 0,1 % fue incubado durante una hora a 37ºC o

toda la noche a temperatura ambiente y esterilizado en autoclave.

Una vez finalizada la electroforesis del ARN el gel se incubó dos veces en solución SSC

20X durante 15 minutos. La metodología para la transferencia fue esencialmente la misma

que la descrita para la transferencia de ADN, incluyendo únicamente 2 lavados adicionales

del gel, una vez concluida la electroforesis, en solución SSC 20X durante 15 minutos y la

utilización de solución SSC 20X como tampón de transferencia.

La prehibridación y la hibridación se realizaron con el tampón de hibridación Standard

buffer + 50 % formamida deionizada, SSC 5X, SDS 0,02 %, Blocking Reagent 2 % y N-

laurilsarcosina 0,1 %. La prehibridación se realizó a 50ºC durante una hora y treinta

minutos. La sonda se desnaturalizó a 95ºC durante 10 minutos y se añadió a la solución

de prehibridación. La hibridación se realizó en tubos de hibridación incubados en el horno

de hibridación durante 16 horas. Una vez finalizada se recuperó la solución de hibridación

y se conservó a -20ºC para futuros usos.


- 76 -

Los procedimientos de lavado y detección fueron esencialmente los mismos que se

realizaron para llevar a cabo las hibridaciones Southern Blot, al igual que los

procedimientos para la eliminación de la sonda del filtro.

2.14 Microscopía

2.14.1 Microscopía óptica

La estimación de la concentración de microconidios de las estirpes de F. oxysporum, así

como los mutantes generados, se realizó en hemocitómetros con la ayuda de un

microscopio óptico marca LEICA.

La observación y separación de bloques de agar con microconidios germinados en agar-

agua para la obtención de cultivos monoconídicos se realizó con la ayuda de un

estereomicroscopio marca LEICA.

2.15 Análisis de datos

2.15.1 Diseño de oligonucleótidos

Los oligonucleótidos utilizados como cebadores en reacciones de PCR se diseñaron con

ayuda de los programas informáticos Geneious (Biomatters), Vector NTI Suite 9 (Invitrogen)

y Primer-BLAST del NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/).

2.15.2 Diseño de plásmidos

Para el diseño y representación gráfica de plásmidos y construcciones se utilizaron los

programas VectorNTI Suite 9 (Invitrogen) y Geneious (Biomatters).

2.15.3 Alineamiento de secuencias

Los alineamientos de secuencias se realizaron mediante el programa ClustalW2

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/) (Thompson et al., 1994).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/


- 77 -

2.15.4 Búsqueda y comparación de secuencias

Las comparaciones de secuencias usando las diferentes variantes del algoritmo BLAST

(BLASTN, BLASTX, BLASTP) se realizaron en la página web del NCBI

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).

La identificación de secuencias señal de localización mitocondrial se realizo con el programa

TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) y con el programa MITOFATES

(http://mitf.cbrc.jp/MitoFates/cgi-bin/top.cgi).

2.15.5 Diseño de árboles filogenéticos

Para la construcción de árboles filogenéticos se utilizó el programa Fasttree

http://www.microbesonline.org/fasttree/ (Price et al., 2009).

2.15.6 Búsqueda de secuencias de F. oxysporum

El acceso al genoma de F. oxysporum f. sp. lycopersici se realizó a través de la página web

del Broad Institute de la Universidad de Harvard, sección “Fungal Genome Initiative” usando

el link (https://www.broadinstitute.org/scientific-community/science/projects/fungal-genome-

initiative/fungal-genomics). En la actualidad la página del Broad Institute no está en

funcionamiento, aunque los genomas secuenciados y anotados de distintos aislados de F.

oxysporum continúan siendo accesibles en el JGI (Joint Genome Institute),

http://genome.jgi.doe.gov/Fusox2/Fusox2.home.html, y en la página web Fungi DB (Fungal

and Oomycete Genomics Resources), http://www.fungidb.org/fungidb/ (Stajich et al., 2012).

2.15.7 Cuantificación de ADN y ARN

Para la cuantificación de ADN, cDNA y ARN se utilizó el software del espectrofotómetro

NanoDrop N-1000.

2.15.8 Edición de texto y tablas

Para la edición de texto en este trabajo se ha utilizado el editor de texto Word 13. Para el

manejo de tablas de datos y la elaboración de los distintos tipos de representaciones

gráficas presentadas en el mismo se ha hecho uso de Excel 13.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/

https://www.broadinstitute.org/scientific-community/science/projects/fungal-genome-initiative/fungal-genomics

https://www.broadinstitute.org/scientific-community/science/projects/fungal-genome-initiative/fungal-genomics

http://genome.jgi.doe.gov/Fusox2/Fusox2.home.html


- 78 -

2.15.9 Análisis estadístico

El análisis estadístico ANOVA y la discriminación de medias mediante el test de Tukey en

el estudio de crecimiento saprofitico y germinación de microconidios de mutantes

deleccionados y silenciados se realizó con el software Bioestadístico INFOSTAT 2014

desarrollado bajo la plataforma Windows. El analisis estadístico pareado entre las distintas

cepas silvestres y mutantes se realizó aplicando la prueba T-Test de

Student (http://www.studentsttest.com).

http://www.studentsttest.com/

RESULTADOS

Resultados

- 79 -

3 RESULTADOS

Debido al reconocido papel del NO en distintos patosistemas y la escasa información

científica existente sobre la función que cumplen los mecanismos de detoxificación del NO

en hongos filamentosos, nuestro grupo de investigación inició este trabajo con el fin de

caracterizar estructural y funcionalmente los genes codificadores de la enzimas de tipo

flavohemoglobina en el hongo patógeno de judía (Phaseolus vulgaris) F. oxysporum f. sp.

phaseoli.

3.1 Identificación de los genes codificadores de enzimas tipo

flavohemoglobina de F. oxysporum f. sp. phaseoli

3.1.1 Análisis de las bases de datos de secuencias de genomas de

Fusarium

A lo largo de la última década ha sido posible secuenciar el genoma de aislados

representativos de varias especies del género Fusarium. El complejo de especies F.

oxysporum ha atraído especial atención dada su importancia como agente fitopatógeno y

en la actualidad se dispone de información sobre el genoma de 10 aislados representativos

de formas especiales que infectan plantas, de un aislado con capacidad de biocontrol (Fo

47) y de un aislado patógeno de humanos (Fo human). La base de datos del Broad Institute

(http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_group/) también recoge

información sobre la secuencia del genoma de la cepa 7600 de F. verticilloides y de la cepa

PH-1 (NRRL 31084) de F. graminearum. Todas estas cepas fueron seleccionadas

inicialmente como cepas de trabajo en un proyecto centrado en el análisis comparativo del

genoma de aislados del género Fusarium.

En la parte inicial de nuestro trabajo, y con el objeto de identificar genes codificadores de

enzimas de tipo flavohemoglobina en el genoma de nuestros aislados de F. oxysporum f.

sp. phaseoli, decidimos analizar el genoma de la cepa 4287 de F. oxysporum f. sp.

lycopersici estudiando las anotaciones automáticas efectuadas y depositadas en la base

de datos del Broad Institute y buscando genes anotados como codificadores de enzimas

con actividad “NO dioxigenasa” o con actividad “flavohemoglobina”. Cabe mencionar que

las versiones de este genoma depositadas en la base de datos del Broad Institute han sido

actualizadas en varias ocasiones en los últimos años. Así, en la versión del año 2012

http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_group/


- 80 -

nuestro análisis permitió identificar la presencia de cuatro genes “de tipo

flavohemoglobina”. En la versión 2015 se identifican únicamente 3 genes. Detectadas

estas inconsistencias, que atribuimos a variaciones debidas a los distintos programas

utilizados para la anotación automática de los genomas y su actualización, nuestro grupo

de investigación decidió continuar trabajando con los cuatro genes identificados en la

versión del año 2012, todos ellos caracterizados por codificar proteínas que presentan los

dominios funcionales característicos específicos de proteínas de tipo flavohemoglobina.

Los códigos de los cuatro genes identificados en el genoma de F. oxysporum f. sp.

lycopersici son: FOXG_17028.3, FOXG_13752.3, FOXG_18012.3 y FOXG_15840.2 (Tabla

7). Con los mismos criterios de búsqueda se analizó el genoma de las cepas secuenciadas

de F. verticilloides (7600) y F. graminearum (PH-1). En estos casos se identificaron 3 y 2

“genes codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina”, respectivamente. Los códigos

identificativos de todos ellos se incluyen en la Tabla 7. En la misma, los genes identificados

en las distintas cepas se presentan ordenados en función de la similitud que presentan

entre ellos (es decir, en la misma fila de la tabla se presentan los genes de las distintas

cepas que pueden ser considerados como ortólogos).

Tabla 7. Códigos de genes codificadores de proteínas tipo flavohemoglobina del género Fusarium. Columna 1: F. oxysporum f. sp. lycopersici, columna 2: F. verticillinoides; columna 3: F. graminearum.

F. oxysporum f. sp.

lycopersici

F. verticillioides

7600

F. graminearum

PH-1

FOXG_17028.3 (1)* FVEG_13827.5 (1)*

FOXG_13752.3 (2)* FVEG_11186.5 (2)* FGSG_04458.3 (2)*

FOXG_18012.3 (3)* FVEG_14660.5 (3)* FGSG_00765.3 (1)*

FOXG_15840.2 (4)*

* La numeración entre paréntesis corresponde a la utilizada en el árbol filogenético Figura 18

3.1.2 Detección mediante PCR de genes codificadores de enzimas de

tipo flavohemoglobina de F. oxysporum f. sp. phaseoli

Decidimos determinar si existen en el genoma de F. oxysporum f. sp. phaseoli genes

ortólogos de los cuatro genes codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina

detectados en el genoma de F. oxysporum f. sp. lycopersici. Consideramos interesante

https://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_group/FeatureRedirect.html?sp=S7000009710132979











Resultados

- 81 -

estudiar esta situación en cuatro cepas de F. oxysporum f. sp. phaseoli con características

fisiológicas muy distintas: la cepa FOP-SP1 (muy virulenta), FOP-SP4 (poco virulenta),

FOP-SP13 (supervirulenta) y AB82 (no patógena). Con este objetivo analizamos en detalle

la secuencia de nucleótidos de cada uno de los cuatro genes de F. oxysporum f. sp.

lycopersici y diseñamos para cada gen dos cebadores que permitían amplificar mediante

PCR específicamente un fragmento de ADN de cada gen. La Tabla 8 muestra los nombres

de los oligonucleótidos diseñados y en la Tabla 6 de la sección de Materiales y Métodos

se presentan las secuencias de los mismos.

Tabla 8. Códigos de los oligonucleótidos diseñados sobre los genes codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina de F. oxysporum f. sp. lycopersici y utilizados en reacciones de PCR para detectar los genes ortólogos en F. oxysporum f. sp. phaseoli.

Genes de F. oxysporum

f. sp. lycopersici

Nombre del

oligonucleótido

FOXG_17028.3 FHG1-FW

FHG1-RV


FHG2-RV


FHG3-RV


FHG4-RV

Con estas cuatro combinaciones de oligonucleótidos se llevaron a cabo reacciones de PCR

utilizando como molde ADN genómico de la cepa FOP-SP1 de F. oxysporum f. sp. phaseoli.

Las reacciones de PCR se realizaron en un volumen final de 25 µl conteniendo 2,5 µl de

buffer 10X, 10 µM de cada oligo, 200 µM de dNTPs, 10 ng de DNA genómico y 0,5 U de

DNA polimerasa (DNA Polymerase bitools 1 U/µl). El perfil del programa de PCR fue: 1

ciclo de desnaturalización de 5 min a 94ºC, seguido de 35 ciclos de amplificación

consistentes en 30 seg a 94ºC, 30 seg a 58ºC y 1 min a 72ºC y un ciclo final de extensión

de 5 min a 72ºC.

La Figura 7 muestra los productos de amplificación obtenidos separados mediante

electroforesis en gel de agarosa. En cada caso se obtuvo un producto único de

amplificación, de tamaño diferente con cada combinación particular de cebadores: 481

pares de nucleótidos con la pareja específica de FOXG_17028.3, 511 pares de nucleótidos






- 82 -

con la pareja específica de FOXG_13752.3, 661 pares de nucleótidos con la pareja

específica de FOXG_18012.3 y 591 pares de nucleótidos con la pareja específica de

FOXG_15840.2.

Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa de los productos de amplificación por PCR de secuencias derivadas de la región codificante de los genes codificadores de proteínas de tipo flavohemoglobina utilizando ADN genómico de F. oxysporun f. sp. phaseoli (FOP-SP1) y las combinaciones de oligonucleótidos específicas de (A): gen FOXG_17028.3, (B): gen FOXG_13752.3, (C): gen FOXG_18012.3 y (D): gen FOXG_15840.2. En el carril M: marcador de peso molecular 1 kp plus DNA ladder (Invitrogen).

El hecho de que con cada combinación de cebadores se generara un único producto de

amplificación, producto de amplificación diferente y específico de cada combinación de

cebadores, junto con el hecho de que éstos hayan sido diseñados teniendo en cuenta la

secuencia de cuatro genes diferentes codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina

de F. oxysporum f. sp. lycopersici, nos permite proponer que ésta es probablemente la

situación también en F. oxysporum f. sp. phaseoli cepa FOP-SP1. Asumimos así

inicialmente la existencia de cuatro genes “FHG” en el genoma de FOP-SP1, codificadores

de enzimas tipo flavohemoglobina, que fueron denominados de la siguiente manera:

Gen FHG1: ortólogo de FOXG_17028.3












Resultados

- 83 -

3.1.3 Caracterización del entorno genómico de los genes

codificadores de flavohemoglobinas de F. oxysporum f. sp.

phaseoli

Para caracterizar el entorno genómico de cada uno de los cuatro posibles genes

codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina en las cuatro cepas de F. oxysporum f.

sp. phaseoli objeto de estudio en este trabajo (FOP-SP1, FOP-SP4, FOP-SP13 y AB82)

en comparación con F. oxysporym f. sp. lycopersici y para determinar si éstos están

presentes en copia única, se llevó a cabo un análisis de hibridación tipo Southern. Para

ello se utilizaron como sondas los fragmentos de ADN genómico amplificados mediante

PCR con las cuatro combinaciones de cebadores descritas en la sección 3.1.2 de

Resultados (ver Figura 7) (marcadas también mediante PCR) que fueron probadas sobre

filtros de nylon a los que habían sido transferidos los fragmentos resultantes de las

digestiones de ADN genómico de las cuatro cepas de F. oxysporum f. sp. phaseoli y de la

estirpe 4287 de F. oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) con las enzimas de restricción HindIII

y BamHI.

La Figura 8 recoge los resultados obtenidos en las hibridaciones llevadas a cabo con cada

una de las cuatro sondas. De su estudio se derivan diversas consideraciones de interés.

En primer lugar, en cada caso el patrón de hibridación obtenido es específico de cada

sonda, lo que permite proponer que cada sonda detecta una región particular del genoma

de las estirpes analizadas y, por lo tanto, que existen cuatro genes codificadores de

enzimas de tipo flavohemoglobina en el genoma de las cuatro estirpes de F. oxysporum f.

sp. phaseoli analizadas, así como en la estirpe 4287 de F. oxysporum f. sp. lycopersici.

En segundo lugar, con ninguna de las cuatro sondas se detecta hibridación cruzada en

condiciones de alta astringencia, lo que supone que los cuatro genes, aun teniendo cierto

grado de similitud, son lo suficientemente diferentes en su secuencia de nucleótidos como

para no ser detectados de forma cruzada en condiciones de hibridación restrictivas.

En tercer lugar, en las digestiones con la enzima HindIII se detecta en todos los casos una

única banda de hibridación (lo que supone que la enzima en ningún caso corta en la

secuencia interna de la sonda). Es posible deducir, entonces, que son genes de copia única

y que no existen secuencias muy relacionadas en el genoma de las estirpes analizadas.


- 84 -

Y finalmente, los patrones de hibridación son esencialmente idénticos entre las cinco cepas

analizadas en relación con las dos digestiones consideradas en estas hibridaciones. Sólo

se detecta un polimorfismo (RFLP) entre los patrones de hibridación de las cuatro cepas

de F. oxysporum f. sp. phaseoli y el de la cepa de F. oxysporum f. sp. lycopersici en la

hibridación llevada a cabo con la sonda derivada del gen FHG1, el correspondiente a la

banda BamHI de 12.300 nucleótidos característica de esta última, de un tamaño

ligeramente superior a la banda detectada en la cuatro estirpes de F. oxysporum f. sp

phaseoli. Es interesante destacar que entre las cuatro estirpes de F. oxysporum f. sp.

phaseoli también se detecta un polimorfismo, tanto en la digestión con la enzima HindIII

como en la digestión con la enzima BamHI, en la hibridación llevada a cabo con la sonda

derivada del gen FHG4, y que marca una diferencia entre la estirpe AB82, la única estirpe

no patogénica, y todas las demás, incluida la cepa 4287 de FOL (Figura 8).

Figura 8. Análisis tipo Southern de los genes codificadores de enzimas flavohemoglobina en las diferentes estirpes de F. oxysporum f. sp. phaseoli. En la parte izquierda de cada panel se muestran las hibridaciones correspondientes a digestiones de ADN genómico realizadas con la enzima HindIII, y en la parte derecha las digestiones de ADN genómico realizadas con la enzima BamHI. A: hibridación con la sonda derivada del gen FHG1; B: hibridación con la sonda derivada del gen FHG2; C: hibridación con la sonda derivada del gen FHG3; D: hibridación con la sonda derivada del gen FHG4. Los números del 1 al 5 corresponden a las muestras de ADN genómico de las estirpes FOP-SP1 (1), FOP-SP4 (2), FOP-SP13 (3), AB82 (4) y F. oxysporum f. sp. lycopersici (4287) (5).

Resultados

- 85 -

En resumen, los resultados presentados en la Figura 8 permiten asegurar que el genoma

de los cuatro estirpes de F. oxysporum f. sp. phaseoli analizadas, FOP-SP1, FOP-SP4,

FOP-SP13 y AB82, incluye cuatro genes de copia única codificadores de enzimas de tipo

flavohemoglobina. La situación es, por lo tanto, la misma que la descrita en la estirpe de F.

oxysporum f. sp. lycopersici utilizada como referencia en este trabajo y cuya consideración

nos ha permitido identificar de forma sencilla los genes ortólogos en F. oxysporum f. sp

phaseoli antes de disponer del genoma de esta forma especial.

3.2 Análisis estructural de los genes codificadores de

flavohemoglobinas de F. oxysporum f. sp. phaseoli

En el curso de este trabajo y una vez identificados mediante PCR e hibridación Southern

los cuatro genes codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina en F. oxysporum f. sp

phaseoli fue posible disponer de la secuencia completa del genoma de las estirpes FOP-

SP1, FOP-SP4, FOP-SP13 y AB82. Estas secuencias fueron obtenidas en el curso de un

proyecto de investigación sobre genómica de hongos fitopatógenos que desarrolla nuestro

grupo de investigación (AGL2012-39876-C02-01). Un análisis detallado de la secuencia

del genoma de la estirpe FOP-SP1 permitió confirmar la presencia en el mismo de cuatro

genes codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina, los genes que hemos

denominado previamente FHG1, FHG2, FHG3 y FHG4. La secuencia de nucleótidos de la

región codificante y de las regiones flanqueantes en dirección 5’ y en dirección 3’ de cada

gen fueron rescatadas, revisadas detalladamente y anotadas. Se presenta a continuación

la secuencia de cada uno de ellos.


- 86 -

3.2.1 Secuencia de los genes FHG de F. oxysporum f. sp. phaseoli

3.2.1.1 Gen FHG1 de FOP-SP1

La región codificante del gen FHG1 consta de 1266 nucleótidos y carece de intrones. Su

traducción da lugar a una secuencia de proteína deducida de 422 aminoácidos (Figura 9).

Figura 9. Secuencia de nucleótidos del gen FHG1 y secuencia de aminoácidos de la proteína deducida. La secuencia de la región codificante (1266 nt) está representada en negro y numerada a partir del codón de iniciación ATG. Los codones de iniciación y terminación de la traducción se muestran subrayados en color rojo. La secuencia de aminoácidos de la proteína deducida se muestra en color rojo debajo de la secuencia de nucleótidos. Se incluyen 756 nucleótidos de la región 5’ flanqueante y 555 nucleótidos de la región 3’ flanqueante. Las posibles cajas CAAT y TATA identificadas en la región promotora se presentan marcadas en color rojo y subrayado.

Resultados

- 87 -




Figura 10. Secuencia de nucleótidos del gen FHG2 y secuencia de aminoácidos de la proteína deducida. La secuencia de la región codificante (1247 nt) está representada en negro y numerada a partir del codón de iniciación ATG. Los codones de iniciación y terminación de la traducción se muestran subrayados en color rojo. La secuencia de aminoácidos de la proteína deducida codificada se muestra en color rojo debajo de la secuencia de nucleótidos. Se incluyen 723 nucleótidos de la región 5’ flanqueante y 846 nucleótidos de la región 3’ flanqueante. Las posibles cajas CAAT y TATA identificadas en la región promotora se presentan marcadas en color rojo y subrayado.


- 88 -




Figura 11. Secuencia de nucleótidos del gen FHG3 y secuencia de aminoácidos de la proteína deducida. La secuencia de la región codificante (1365 nt) está representada en negro y numerada a partir del codón de iniciación ATG. Los codones de iniciación y terminación de la traducción se muestran subrayados en color rojo. La secuencia de aminoácidos de la proteína deducida se muestra en color rojo debajo de la secuencia de nucleótidos. Se incluyen 807nucleótidos de la región 5’ flanqueante y 609 nucleótidos de la región 3’ flanqueante. Las posibles cajas CAAT y TATA identificadas en la región promotora se presentan marcadas en color rojo y subrayado. La posible secuencia de poliadenilación AATAAA se muestra en color morado y subrayada.

Resultados

- 89 -




Figura 12. Secuencia de nucleótidos del gen FHG4 y secuencia de aminoácidos de la proteína deducida. La secuencia de la región codificante (1290 nt) está representada en negro y numerada a partir del codón de iniciación ATG. Los codones de iniciación y terminación de la traducción se muestran subrayados en color rojo. La secuencia de aminoácidos de la proteína deducida codificada se muestra en color rojo debajo de la secuencia de nucleótidos. Se incluyen 751 nucleótidos de la región 5’ flanqueante y 669 nucleótidos de la región 3’ flanqueante. Las posibles cajas CAAT y TATA identificadas en la región promotora se presentan marcadas en color rojo y subrayado.

-741

-666

-591

-516

-441

-366

-291

-216

-141

-66

ACGGAAGATTCTGGC CAGTGAACATATAAT AGTGACATGATCACA CCACTTCAAGCTCCA GAGTGCGAGGGAAGC

ATTAGTATCGGAAAG GAAGCTCCGGCTTTG AGCGCCTATCAGAGG TTAAAAATCAAGTCG TGTTAAGTTCTTGGT

TATCCTGTCCCTAAA TCAATTCATTAACCA AAGAAAAACGTAAAG CTCTATTAACAGTTA TATAACTCTCTAAAG

GAATACACCGTAACC CAGATGTAATCGAAT AGACAGAATATACTC GTTTTGTATCGAAAA TGGTCTGATCGGCTC

CCTGTATGTAACATG GCGTTTTGCGCAAGC AGAAGAGGTTAATCA CAGAGTAAAGGTTAG CTTCTATTCAATCCC

AAAATTATGTTACTA AGCGCTATAATCAAA GTGAATTCAAGGGTT AGCACTACCGCATAG GTGTCTGTTTTGGGG

TTTCTTGCCGAGGTA GCCGGGCGAGGTAAA GGTAGTCATTTTCAC ACTGCTGGTCATCCA CTTAGTATGTGAAAT

AATGTAATCAAGAAA GGAAGCCATTGGTAC AAACCACTCGTGGAT GATGTTAGTGAGGTC ATATATGTGTAACGT

CCAAATTCATTATGG CATCATATGGCAGTC CATTGGACGCCTCCG CACGCTATGCCAACT ATAAATCTCCCCGCA

GCAGCTTCAGATGAC CTTGAAATGAATGCA TTCATAGCCATTGCA ACCGGCCCAAAATAA TTCAAC

1

1

76

26

151

51

226

76

301

101

376

126

451

151

526

176

601

201

676

226

751

251

826

276

901

301

976

326

1051

351

1126

376

1201

401

1276

426

ATGCTGGCTCGGACC ATTATCTGGCGTGCT GGACGCGGGGCGCTC TATCAGCTGCATCGA AGAACGTATGTCTCG

M L A R T I I W R A G R G A L Y Q L H R R T Y V S

ACCGCACTGACTCCG GAGCAGATCAAAGTC GTCCAATCGACCATA CCCGCACTGGAAAAA CACGGCGTCGAGATT

T A L T P E Q I K V V Q S T I P A L E K H G V E I

ACAACGCTCTTCTAT CGCCAATTGCTCAAT AAACACCCTGAGCTC AAGAACATCTTCAAC ACTGCCCATCAAGAT

T T L F Y R Q L L N K H P E L K N I F N T A H Q D

ACAGGCGAGCAGCCA GCCGCCCTCGCGCAC GCCGTGTGGGCATAT GCCGCCAATATTGAG AACCCCGATGCCATG

T G E Q P A A L A H A V W A Y A A N I E N P D A M

AAGGCAGCCATTTCC CGCATTGGACATAAA CATGCGAGCTTGGGA GTTACCGCAGACCAA TATACCGTCGTCGGC

K A A I S R I G H K H A S L G V T A D Q Y T V V G

CAAGGGTTACTCTCG GCGATCAAGCAAATC CTCGGGGACGGAGTT AATTCGAAGGTCTTG GATGCTTGGGAAGCT

Q G L L S A I K Q I L G D G V N S K V L D A W E A

GCATACCGCCAACTC GCCGAGTATTTCATT AATTTTGAGGAAGGA TTGTATCAAGAGGCC ATGGCGACACCCGGC

A Y R Q L A E Y F I N F E E G L Y Q E A M A T P G

GGCTGGAAAGGATGG CGCAAGTTCTTCATC TCTGACAAAGTGAGA GAGAGCGAGGAAATT ATCTCATTCCATCTC

G W K G W R K F F I S D K V R E S E E I I S F H L

ACGCCAGCCGACAAG GGAGCCCTGCCATCC TACAAGCCTGGCCAG TTTGTCAGCATCCGA TGCTTTATGCCTGAG

T P A D K G A L P S Y K P G Q F V S I R C F M P E

CTTGGGGCATACCAG CCCCGGCAATATAGT CTATCTGACGTGCCA AATGGAAAGTATTTT CAAATTTCCGTTAAA

L G A Y Q P R Q Y S L S D V P N G K Y F Q I S V K

AGAGAATTCGCATCG GATATAAAACCGGCC GGCCGAGTATCCAAT GTTCTTCACGATTCG CTGCCGGAGGGGTCG

R E F A S D I K P A G R V S N V L H D S L P E G S

GAGGTGGATATCAGC ATGCCATTTGGTGAT TTCGTCTTGGACATC AACAATACAGCGCCC GTGGTGTTTATTAGC

E V D I S M P F G D F V L D I N N T A P V V F I S

GGAGGAGTCGGACTG ACACCTATGATGGCA ATGCTGAAGAAGATA ACGGAGGAAGGAAAA CCGAGGAAAGTGGTG

G G V G L T P M M A M L K K I T E E G K P R K V V

TTCATCCATGCTGCA CGCAACTCACGAGTC CATGCTATGAAAGAT ACCCTCATCGAGATT GTGAGAGACCATCCG

F I H A A R N S R V H A M K D T L I E I V R D H P

GAAGTCACCCGCCTT GTTTACTATGAGCGG GTTGAAGAAGACGAT ATATTGGGGCTTGAT TACGATCACGAGGGG

E V T R L V Y Y E R V E E D D I L G L D Y D H E G

CGCGTGGACCTTGCA GAGGTTAAGCATAAG GTGATTCTGCCAGAA GCGAATTACTACATC TGCGGGCCACCGCCG

R V D L A E V K H K V I L P E A N Y Y I C G P P P

TTTATGAATTCACAG AGCCAGGCACTTCGG GATTTGGGTGTTGAG GAGAAACACATTCAC ATGGAGGTATTTGGG

F M N S Q S Q A L R D L G V E E K H I H M E V F G

TCGCCAACTTCCTGA

S P T S *

1291

1366

1441

1516

1591

1666

1741

1816

1981

TGCTATATGGAAGTT TCCCCTTATCTACAA CAGCTTAACTTTTAA CTTAACCCCGCAATT CCAACTATTCCCTGG

CCAGGCTATCGCGAC ATTGCCAAGCCTGGT TCTCACACTCCTGAG TTCACGACTGGTTGC GCTCTGGCAGATTGT

TGCGTCGGTTATAAG TACCCAAGCCCCAGC ACTGCTTTCTTTGTC ATACCATTAGTAGTA TACAGTCAGAATTAG

TGTCTCTCATTGTCT TTCTGCTACGTGAAC TTGAGCGATCATCAT CAAGGGACTGAGGTA CTCTAATGTGTTCTC

TATTGGTGACGATAC TTCAAATGATCTGAT CGGACTGATTGATCG ATGTAAAACTGCTAG TCCTACTAAAGGGAA

ATGTCCCTTATTGTC ACGGGTAGATCAATA TCTGGGGTCTATGCC ATTGCGGATCATGAT AATCCTCATTTGGAT

CAGGCCATTAAGTTC CCAATCTACAAGCCT TCCAGTAATCTGCGC AAATGGTTTGACAAG ATAAGCAACTCTGCT

TACGTGATGCTGAAG AGGTGAAGTTGCAAG ATGTCATAATTTGCA ATGAATGAGGAGTCT GATCCACTGGACTCT

GTGTGAACGCCGACA ATTTGACAGTTTGAT CTGATACTTCACATT AGCAGTGACTAAAAA CACAGATAG


- 90 -

3.2.2 Análisis de la región codificante de los genes FHG

Estructuralmente los genes FHG de F. oxysporum f. sp. phaseoli de FOP-SP1 son muy

similares: todos ellos carecen de intrones y las correspondientes regiones estructurales

tienen tamaños muy parecidos entre sí (1266, 1247, 1365 y 1290 nucleótidos para los

genes FHG1, FHG2, FHG3 Y FHG4, respectivamente) y similares a los tamaños de la

regiones codificantes de otros genes codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina

de hongos (Gardner et al., 2005).

Cuando se comparan las secuencias de nucleótidos de los genes de FHG de FOP-SP1

con los genes ortólogos de FOL se comprueba que en todos los casos existe un nivel de

semejanza muy elevado, como cabe esperar tratándose de estirpes del mismo complejo

de especies, si bien correspondientes a formas especiales distintas, aunque variable según

el gen. Se detectan 17 sustituciones nucleotídicas cuando se comparan el gen FHG1 y el

gen FOXG_17028.3, 4 cuando se comparan el gen FHG2 y el gen FOXG_13752.3, 12

cuando se comparan el gen FHG3 y el gen FOXG_18012.3 y 20 cuando se comparan el

gen FHG4 y el gen FOXG_15840.2.

El alineamiento de las secuencias de nucleótidos de los cuatro genes de FHG de FOP-SP1

y FOP-SP4 indica que el grado de identidad entre ellos es superior al 30 % y que los genes

FHG1, FHG2 y FHG3 están más relacionados entre sí que con el gen FHG4 (ver Tabla 9).

Tabla 9. Porcentajes de identidad entre las secuencias de nucleótidos de las regiones codificantes de los genes FHG1, FHG2, FHG3 Y FHG4.

FGH1 FHG2 FHG3 FHG4

FHG1 100 %

FHG2 48 % 100 %

FHG3 35 % 47 % 100 %

FHG4 33 % 35 % 33 % 100 %

Resultados

- 91 -

3.2.3 Análisis de las regiones promotora y terminadora de los genes

FHG

En la Tabla 10 se presentan las posiciones en las que se identifican secuencias

relacionadas con el control de la transcripción de forma general, tanto en la región

promotora (cajas TATA y CAAT) como en la región terminadora (secuencia consenso de

señal de poliadenilación “AATAAA”) de cada uno de los cuatro genes de FHG. Es posible

destacar que en las regiones promotoras de los cuatro genes se identifican varias cajas

TATA y CAAT en localizaciones compatibles con su posible función reguladora de la

transcripción. En la región terminadora, por su parte, sólo se identifica la secuencia

consenso señal de poliadenilación característica de organismos eucariotas (Heidmann et

al., 1992) en el caso del gen FGH3. Debemos recordar que esta secuencia consenso señal

de poliadenilación no está siempre presente en todos los terminadores de los genes de

hongos, en los que otras secuencias relacionadas (AATAAT, AATATT, AATACT) pueden

desempeñar la función de señalización del lugar de poliadenilación, y que sí se identifican

en la región terminadora de los genes FHG.

Tabla 10. Ubicación de las hipotéticas cajas TATA y CAAT en la región promotora y secuencias consenso señal de poliadenilación reconocidas en los genes FHG1, FHG2, FHG3 y FHG4.

Secuencia consenso Gen FHG1 Gen FHG2 Gen FHG3 Gen FHG4

Caja TATA

-88 a -85

-133 a -129

-137 a -134,

-630 a -626

-119 a -116 -121 a -117

-230 a -227

-151 a -148

-297 a -294

-474 a -471

Caja CAAT

-118 a -115

-306 a -303

-568 a -565

-334 a -331

-545 a -541

-620 a -617

-63 a -60

-132 a -129

-359 a -356

-571 a -567

Secuencia señal de

poliadenilación AATAAA +352 a +355

El análisis de las regiones promotoras mediante el programa MatInspector (Cartharius et

al., 2005) permitió la identificación de posibles secuencias señal de unión a factores de

transcripción. Entre las secuencias más importantes se han identificado aquellas

relacionadas con la activación de genes inducidos por nitrógeno. Estas secuencias podrían

estar implicadas en la activación de los genes FHG en procesos relacionados con el

metabolismo del nitrógeno. Igualmente se detectan secuencias señal de unión a factores


- 92 -

de transcripción relacionados con la respuesta a situaciones de estrés. Asimismo,

muestran secuencias señal de unión a factores de transcripción que inducen la activación

de genes de regulación de la fase G1 del ciclo celular. Las secuencias indicadas, y sus

localizaciones en las regiones promotoras correspondientes, se muestran en las Tablas 11,

12, 13 y 14.

Tabla 11. Predicción de factores de transcripción que pueden unirse a la región promotora del gen FHG1. En la primera columna se indica el nombre de la familia de factores de transcripción que reconocen la secuencia señal consenso. En la segunda y tercera columna se muestra el inicio y fin de la secuencia. En la cuarta columna se muestra la orientación de la cadena en la que se localiza la secuencia. En la quinta columna se indica la ratio de semejanza de la secuencia detectada con la secuencia consenso señal. En la última columna se indica la secuencia consenso.


Resultados

- 93 -




- 94 -

3.3 Análisis de las proteínas deducidas codificadas por los genes FHG1,

FHG2, FHG3 y FHG4

3.3.1 Dominios funcionales de las proteínas FHG

Las secuencias de aminoácidos deducidas codificadas por los genes FHG1, FHG2, FHG3

y FHG4 tienen un tamaño de 422, 416, 456 y 430 aminoácidos, respectivamente. En la

Tabla 15 se presenta la información sobre la composición aminoacídica de cada una de las

cuatro proteínas.

Tabla 15. Composición aminoacídica de las proteínas codificadas por los genes FHG1, FHG2, FHG3 Y FHG4.

Resultados

- 95 -

En la Figura 13, se muestra el alineamiento de las secuencias de las proteínas codificadas

por los genes FHG1, FHG2, FHG3 y FHG4, las cuales muestran porcentajes de identidad

al 40 %. Las proteínas FHG1 y FHG2 muestran el mayor porcentaje de semejanza con el

53,41 %, en tanto que el menor corresponde a FHG1 y FHG3, con el 40,73 % (ver Tabla

13).

Tabla 16. Porcentaje de semejanza de las secuencias aminoacídicas deducidas de las proteínas codificadas por los genes FHG1, FHG2, FHG3 y FHG4 de FOP-SP1.

FGH1 FHG2 FHG3 FHG4

FHG1 100 %

FHG2 53,41 % 100 %

FHG3 40,73 % 47,30 % 100 %

FHG4 43,11 % 41,37 % 40,20 % 100 %

Figura 13. Alineamiento de secuencias de las proteínas tipo flavohemoglobina de FOP-SP1. El color rojo representa el 90 % de consenso y el azul más del 50 % de consenso en las secuencias de aminoácidos. Los códigos de las secuencias utilizadas corresponden a los genes codificadores de enzimas tipo flavohemoglobina de F. oxysporum f. sp. phaseoli: FHG1, FHG2, FHG3 y FHG4.


- 96 -

El tamaño de las cuatro proteínas deducidas es similar. La más pequeña es la proteína

FHG2, de 416 aminoácidoss, y la de mayor tamaño es la proteína FHG3, de 456

aminoácidos. El estudio de los alineamientos y del grado de conservación de aminoácidos

demuestra que la estructura general de las proteínas es similar en los cuatro casos (Figura

13). La proteína FHG3 tiene una extensión exclusiva de 37 aminoácidos en el extremo C-

carboxilo de la proteína. Por su parte, la proteína FHG4 presenta una extensión particular

en su extremo N-amino de 22 aminoácidos. Como veremos más adelante, esta extensión

marca una diferencia fundamental en relación con las otras tres secuencias FHG.

El análisis de las secuencias de aminoácidos deducidas permite identificar en las cuatro

proteínas tres dominios funcionales bien definidos, localizados en posiciones muy

similares, y con tamaños muy parecidos: un dominio globina (globin) en el extremo amino

de la proteína, un dominio oxidoreductasa de unión a FAD (FAD_binding_6) en la región

central y un dominio oxidoreductasa de unión a NAD (NAD_binding_1) en el extremo

carboxilo. La Figura 14 muestra una representación simplificada de la organización de cada

una de las cuatro proteínas analizadas y de la localización de los dominios funcionales

conservados que se han identificado en cada caso.

Figura 14. Dominios funcionales característicos de las proteínas de tipo flavohemoglobina, y sus posiciones relativas, identificados en las proteínas deducidas codificadas por los genes (A): FHG1, (B): FHG2, (C): FHG3 y (D): FHG4 de FOP-SP1.

Resultados

- 97 -

En la Tabla 17 se resume la información relacionada con la posición de cada uno de los

tres dominios funcionales identificados en la proteína correspondiente y el valor E que el

análisis bioinformático asigna en cada caso.

Tabla 17. Dominios funcionales presentes en las proteínas FHG1, FHG2, FHG3 y FHG4.

Gen Inicio Fin E-Value Dominios

FHG1

7 104 8,7051e-07 Globin

153 263 0,000221694 FAD_binding_6

279 396 4,98703e-10 NAD_binding_1

FHG2

7 104 1,42061e-08 Globin

153 269 2,65117e-05 FAD_binding_6

283 385 1,53381e-09 NAD_binding_1

FHG3

10 101 0,00250719 Globin

153 270 2,73308e-07 FAD_binding_6

282 387 1,3732e-08 NAD_binding_1

FHG4

32 129 2,45399e-10 Globin

182 288 8,79661e-10 FAD_binding_6

298 407 8,17601e-20 NAD_binding_1

El programa CCD del NCBI (National Center for Biotechnology Information) (Marchler-

Bauer et al., 2015) permite visualizar en forma de alineamientos locales las semejanzas

entre los dominios funcionales recogidos en la base de datos y los posibles dominios

funcionales presentes en las secuencias de aminoácidos objeto de análisis en cada caso.

Las Figuras 15, 16 y 17 muestran los alineamientos obtenidos en el análisis llevado a cabo

con la proteína FHG1. Los resultados obtenidos en los análisis de FHG2, FHG3 y FHG4

son análogos y no se muestran.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/


- 98 -

Figura 15. Dominios globina identificados en proteínas representativas con el programa CCD semejantes al dominio globina presente en la proteína codificada por el gen FHG1. Los códigos de cada secuencia corresponden a los siguientes organismos: 1X9F_I Lumbricus terrestris; query: FHG1; gi 121275 Tubifex tubifex; gi1707910 Nippostrongylus brasiliensis; gi 121251 Trichostrongylus colubriformis; gi 121213 Calyptogena soyoae; GVH_A Escherichia coli; 3VHB_A Vitreoscilla stercoraria; gi 17433294 Casuarina glauca; gi 1707913 Anadara trapezia.

Figura 16. Dominios oxidoreductasa FAD (FAD_binding_ 6) identificados en proteínas representativas con el programa CCD semejantes al dominio oxidoreductasa FAD (FAD_binding_ 6) presente en la proteína codificada por el gen FHG1. Los códigos de cada secuencia corresponden a los siguientes organismos. 1QX4_B Rattus norvegicus; query-FHG1; gi 74546820 Pyrococcus abyssi; gi 75345543 Pseudomonas putida; gi 3024428 Pseudomonas pseudoalcaligenes; gi75424276 Xanthobacter autotrophicus Py2; gi75343291 Cupriavidus necator; gi 1174724 Pseudomonas mendocina; gi 75344585 Pseudomonas aeruginosa; gi75342160 Ralstonia sp.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=6386




Resultados

- 99 -

Figura 17. Dominio oxidoreductasa NAD (NAD_binding_ 1) identificados en proteínas representativas con el programa CCD semejantes al dominio oxidoreductasa NAD (NAD_binding_ 1) presente en la proteína codificada por el gen FHG1. Los códigos de cada secuencia corresponden a los siguientes organismos. 2XNJ_B Escherichia Coli; query- FHG1; gi 122065674 Ustilago maydis; 30ZV_A Ralstonia eutropha H16; 1GVH_A Escherichia coli; gi1174724 Pseudomonas mendocina; gi 1174855 Aliivibrio fischeri; gi 1174854 Photorhabdus luminescens; gi 548358 Neurospora crassa OR74A; gi 128189 Hordeum vulgare.

3.3.2 Localización subcelular de las proteínas FHG

Las secuencias de las cuatro proteínas FHG fueron analizadas utilizando herramientas

bioinformáticas desarrolladas para predecir la localización subcelular de proteínas. En

primer lugar se evaluó la localización subcelular de las proteínas FHG de FOP utilizando el

programade predicción MultiLoc2 (http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/MultiLoc2).

Tabla 18. Valores de probabilidad de localización subcelular de las proteínas FHG estimados con el programa de predicción MultiLoc2.



- 100 -

La Tabla 18 muestra que las proteínas FHG1, FHG2 y FHG3 muestran valores de

probabilidad de localización citoplasmática elevados (superior a 0,8 en lo tres casos). Por

su parte, la proteína FHG4 presenta un valor de probabilidad de localización mitocondrial

muy alto, de 0,79.

Para confirmar la predicción de localización mitocondrial de la proteína FHG4 se analizaron

las cuatro secuencias FHG con otros dos programas de predicción. La Tabla 19 muestra

los valores de probabilidad de localización mitocondrial obtenidos. En primer lugar, el

análisis llevado cabo con TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) permite

proponer que la proteína FHG4 se localiza en la mitocondria, ya que el valor de probabilidad

de localización mitocondrial es muy alto (0,909). Para las otras tres proteínas FHG los

valores de probabilidad correspondientes son muy bajos. Por su parte, el programa

MITOFATES (http://mitf.cbrc.jp/MitoFates/cgi-bin/) confirma la posible localización

subcelular de FHG4, ya que calcula un valor de probabilidad de 0,980 para la presencia de

una presecuencia mitocondrial en el extremo amino de esta proteína, en la región

correspondiente a la extensión específica característica de esta proteína FHG y ausente

en las otras tres proteínas analizadas. MITOFATES identifica, además, un sitio de corte de

la proteína peptidasa mitocondrial en la posición 22 de la secuencia.

Tabla 19. Valores de probabilidad de localización mitocondrial, estimados con el programa de predicción TargetP, y de presencia de una presecuencia mitocondrial, estimados con el programa MITOFATES, de las proteínas FHG de FOP.

Proteína Probabilidad de localización

mitocondrial (TargetP)

Probabilidad de presecuencia mitocondrial

(MITOFATES)

FHG1 0,103 0,000

FHG2 0,135 0,068

FHG3 0,431 0,181

FHG4 0,909 0,980

Todo ello permite proponer que las proteínas FHG1, FHG2 y FHG3 son proteínas

citoplasmáticas mientras que la proteína FHG4 es una proteína de localización

mitocondrial.

http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/

http://mitf.cbrc.jp/MitoFates/cgi-bin/

Resultados

- 101 -

3.4 Análisis filogenético de los genes codificadores de flavohemoglobinas

Los genes FHG1, FHG2, FHG3 y FHG4 muestran un elevado nivel de semejanza con

genes ortólogos identificados en procariotas, eucariotas y protozoarios y las proteínas

codificadas presentan los tres dominios funcionales característicos de las proteínas de tipo

flavohemoglobina identificadas en otros organismos.

Utilizando las secuencias depositadas en bases de datos públicas, de 61 proteínas de tipo

flavohemoglobina de hongos, bacterias y protozoarios se construyó un árbol filogenético

con el programa Fasttree (http://www.microbesonline.org/fasttree/) e inferido con el método

Neighbor-Joining empleando el modelo Jones-Taylor Thorton (JTT), con un bootstrap de

1000 repeticiones para calcular la fiabilidad del árbol (Figura 18). El árbol filogenético se

resuelve en cuatro clados monofiléticos, que ubica a las proteínas codificadas por los genes

FHG1, FHG2 y FHG3 en el clado 2, que a su vez se subdivide en 4 subclados. Cada una

de las proteínas se ubica en un subclado diferente junto a proteínas de especies

pertenecientes al mismo género, como F. verticillioides y F. graminearum.

La proteína FHG1 (Fusarium oxysporum 1) se posiciona en el subclado 4 junto a las

proteínas de F. verticilloides y Verticillum dhaliae, mostrando con ellas un porcentaje de

identidad del 92,39 % y 54,39 %, respectivamente. La proteína FHG2 (Fusarium oxysporum

2) se posiciona en el subclado 3 junto a las proteínas de Nectria haematococca, F.

graminearum y F. verticillioides, mostrando con ellas unos porcentaje de identidad del

86,23 %, 92,27 % y 98,79 %, respectivamente. La proteína FHG3 (Fusarium oxysporum 3)

se posiciona en el subclado 1 junto a las correspondientes proteínas de Trichoderma

reesei, Chaetomium globosum, Neurospora crassa, Podospora anserina, F. graminearum

y F. verticillinoides, con las que presenta unos porcentajes de identidad de 41,87 %, 54,61

%, 61,20 %, 67,47 %, 92,95 % y 97,79 %, respectivamente.

El clado 3 se subdivide en tres subclados. La proteína FHG4 (Fusarium oxysporum 4) se

encuentra ubicada en el subclado 2 junto a las proteínas de A. fumigatus, A. nidulans, A.

oryzae y A. terreus y con las que muestra una identidad del 62,94%, 64,32 %, 67,37 % y

68,9 %, respectivamente. En este mismo clado se encuentran las proteínas codificadas por

los genes ortólogos de Chromobacterium violaceum, Borella avium, Burkholderia graminis,

Sinorhizobium melitoti y Echerichia coli y Salmonella enterica, con las que está relacionada

pero de forma más distante (Figura 18).

http://www.microbesonline.org/fasttree/

http://www.elsevier.es/es-revista-tip-revista-especializada-ciencias-quimico-biologicas-93-pdf-90370805-S300


- 102 -

Clado 1

Clado 2

Clado 3

Clado 4 4414

Subclado 1

Subclado 2

Subclado 3

Subclado 4

Subclado 1

Subclado 2

Subclado 3

Resultados

- 103 -

Figura 18. Árbol filogénetico de las proteinas de tipo flavohemoglobina.

Los números en los nodos indican el valor de boostrap que proporciona la fiabilidad de la intersección. La longitud de la ramas indica la distancia filogénetica. Números de acceso de las secuencias de proteinas utilizadas: AAP41066 Cryptococcus neoformans 1, CAP74387 Botrytis cinerea 1, XP_001588433 Sclerotinia sclerotiorum 1, XP_664773 Aspergillus nidulans 1,

Afug03410 Aspergillus fumigatus 1, XP_001274889 Aspergillus clavatus 1, CAF25490 Aspergillus niger 2, GAA83221 Aspergillus kawachii 1, AO090011000202 Aspergillus oryzae 1, XP_001211325 Aspergillus terreus 1, XP_001400872 Aspergillus niger 1, XP_001912543 Podospora anserina 1, XP_001220963 Chaetomium globosum 2, XP_963988 Neurospora crassa 1, EGR49938 Trichoderma reesei 2, FGSG_00765 Fusarium graminearum 1, FHG3 Fusarium oxysporum 3, FVG_14660 Fusarium verticillioides 3, MGG_00198 Magnaporthe oryzae 1, GGTG_02162 Magnaporthe graminis 1, MAPG_06211 Magnaporthe poae 1, XP_957939 Neurospora crassa 2, XP_001904160 Podospora anserina 2, XP_001228021 Chaetomium globosum 1, XP_003048388 Nectria haematococca 1, FGSG_04458 Fusarium graminearum 2, FHG2 Fusarium oxysporum 2, FVEG_11186 Fusarium verticillioides 2, EGR46261 Trichoderma reesei 1, EFZ03946 Metarhizium anisopliae 1, EFY87064 Metarhizium acridum 1, VDAG_10220 Verticillium dahliae 1, FHG1 Fusarium oxysporum 1, FVEG_13827 Fusarium verticillioides 1, NP_903158 Chromobacterium violaceum 1, YP_786548 Bordetella avium 1, ZP_02884306 Burkholderia graminis 2, AAP93662 Sinorhizobium melitoti 1, XP_001216520 Aspegillus terreus 2, Afug06080 Aspergillus fumigatus 2, XP_661126 Aspergillus nidulans 2, FHG4 Fusarium oxysporum 4, AO090012000171 Aspergillus oryzae 2, ZP_02882530 Bukholderia graminis 1, AEJ57821 Escherichia coli 1, AAC24484 Salmonella enterica typhimurium 1, NP_241924 Bacillus halodurans 1, YP_001374491 Bacillus cytotoxicus 1, YP_003921355 Bacillus amyloliquefaciens 1, ADM37384 Bacillus subtilis 1, BAA83810 Dictyostelium discoideum 1, BAA83811 Dictyostelium discoideum 2, EDN61819 Saccharomyces cerevisiae 1, YP_078209 Bacillus licheniformis 1, XP_719397 Candida albicans 1, XP_711060 Candida albicans 2, XP_711046 Candida albicans 3, CAD55817 Pseudomonas stutzeri 1, YP_003376358 Xanthomonas albilineans 1, NP_285566 Deinococcus radiodurans 1.


- 104 -

3.5 Análisis de expresión de los genes FHG

Una vez identificada la presencia de los cuatro genes codificadores de enzimas de tipo

flavohemoglobina, FHG1, FHG2, FHG3 y FHG4, en las estirpes de F. oxysporum f. sp.

phaseoli, nos propusimos determinar la naturaleza de las funciones fisiológicas en las que

la detoxificación del NO pueda jugar un papel relevante en este hongo. Consideramos sus

posibles funciones tanto durante el crecimiento saprofítico del hongo como durante la

interacción del mismo con su huésped. Como una primera fuente de información sobre la

función de cada uno de los cuatro genes FHG decidimos llevar a cabo un análisis de

expresión detallado de los mismos.

3.5.1 Condiciones para el análisis durante el crecimiento saprofítico

y en respuesta a NO

Las enzimas de tipo flavohemoglobina constituyen uno de los mecanismos de

detoxificación de NO más importantes, si no el principal, en los microorganismos, y la

expresión de los genes codificadores de flavohemoglobinas en distintos sistemas es

inducida por exposición a NO exógeno. Se ha comprobado, por otra parte, que el NO juega

un papel relevante en procesos de diferenciación y desarrollo, en particular en la

germinación de las esporas en hongos. Por estas razones decidimos evaluar y cuantificar

inicialmente la expresión de los genes FHG durante el desarrollo y la germinación en F.

oxysporum f. sp. phaseoli durante el ciclo de vida saprofítico. Para lo cual es necesario

determinar previamente las condiciones experimentales más apropiadas para llevar a cabo

esta cuantificación.

Decidimos estudiar dos estirpes diferentes de F. oxysporum f. sp. phaseoli: una estirpe muy

virulenta, la estirpe FOP-SP1, y una estirpe poco virulenta, la estirpe FOP-SP4, y en ambos

casos se evaluaría la eficiencia y la cinética de la germinación de los microconidios en

medio de cultivo líquido. Después de tener en cuenta distintas variables y consideraciones

y de evaluar algunos experimentos preliminares decidimos utilizar de forma rutinaria las

siguientes condiciones experimentales:

1. Como medio de cultivo base se utilizó el medio de cultivo mínimo líquido

suplementado con glucosa 1 % como fuente de carbono (MMG) (ver sección

2.2.2.2 de Materiales y Métodos).

Resultados

- 105 -

2. Para comprobar el efecto de la fuente de nitrógeno sobre la eficiencia de

germinación los medios fueron suplementados en su caso con 10 mM de tartrato

de amonio o 10 mM de nitrato de sodio.

3. Para evaluar el efecto del NO se añadió al medio de cultivo (desde el inicio de la

incubación) 500 µM de nitroprusiato sódico (SNP) como donador de NO.

4. Los efectos de la fuente de nitrógeno y del donador de NO fueron estimados

cuantificando el porcentaje de esporas germinadas a distintos tiempos desde el

inicio del cultivo: 4, 6, 8, 10, 12 y 24 horas.

Se llevaron a cabo tres réplicas biológicas de un experimento de evaluación de germinación

de microconidios de las estirpes FOP-SP1 y FOP-SP4 en las condiciones indicadas. Las

Figuras 19 y 20 presentan los resultados obtenidos.

Fígura 19. Germinación de microconidios de FOP-SP1 en medio minimo con 1 % de glucosa (MMG) y MMG suplementado con 10 mM de nitrato de sodio (MMG+N) o 10 mM de tartrato de amonio (MMG+A). En los tres casos los cultivos se realizaron en ausencia y en presencia de 500 µM de SNP. La evaluación de la germinación se realizó a los tiempos indicados (h). Los histogramas representan los valores medios de tres experimentos y sus desviaciones estándar.

En general la germinación en ambas cepas es similar en las condiciones de cultivo

evaluadas. En cada caso se observa que es indispensable la presencia de una fuente de

nitrógeno para que se active el programa de germinación, y que en ausencia de nitrógeno

el programa de germinación no se inicia o el resultado es mínimo. En los medios

suplementados bien con amonio o con nitrato en ausencia de NO exógeno la germinación

se produce de forma progresiva, iniciándose a las 6 horas. A las 10 horas en medios con

nitrato un 47,54 % de los microconidios en el caso de la cepa FOP-SP1 y un 40,18 % de


- 106 -

los microconidios en el caso de FOP-SP4 han germinado. En medios suplementados con

amonio entre estos porcentajes son del 61,94 % y 61,82 %, respectivamente. La eficiencia

de germinación es, por lo tanto, más alta en medios suplementados con amonio. A las 24

horas prácticamente todos los microconidios han germinado en ambas cepas y en ambos

medios, formándose micelio activo en desarrollo.

Las mismas cepas (FOP-SP1 y FOP-SP4) expuestas a NO exógeno muestran un retraso

significativo en la germinación de microconidios en todos los tiempos evaluados. Alas 10

horas de cultivo en medio suplementado con nitrato los porcentajes de germinación son

del 30 % y 16 % para FOP-SP1 y FOP-SP4, respectivamente. En medios suplementados

con amonio los porcentajes son del el 35 % y 26 % de los microconidios han germinado,

respectivamente, mostrando mayor sensibilidad a NO exógeno la cepa silvestre FOP-SP4.

En definitiva, la adición de NO exógeno retrasa significativamente la germinación en las

tres condiciones evaluadas (medios sin N y medios suplementados con amonio o nitrato).

A las 24 horas todos los microconidios han germinado, probablemente porque el NO se ha

degradado. No obstante, las diferencias en la longitud del tubo germinativo en las muestras

tratadas con NO en relación con las muestras no tratadas con NO son evidentes. Las

primeras son siempre inferiores, consecuencia del retraso en la entrada en germinación

que determina la exposición a NO (datos no mostrados).

Figura 20. Germinación de microconidios de FOP-SP4 en medio mínimo suplementado con 1 % de glucosa (MMG) o en MMG suplementado con 10 mM de tartrato de amonio (MMG+A) o 10 mM de nitrato de sodio (MMG+N). En los tres casos los cultivos se realizaron en ausencia y en presencia de 500 µM de SNP. La evaluación de la germinación se realizó a los tiempos indicados (h). Los histogramas representan los valores medios de tres experimentos y sus desviaciones estándar.

Resultados

- 107 -

3.5.2 Análisis de expresión de los genes FHG durante el crecimiento

saprofítico y en respuesta a NO

Teniendo en cuenta estas observaciones decidimos llevar a cabo el análisis de expresión

de los genes FHG en las estirpes FOP-SP1 y FOP-SP4 en dos momentos de desarrollo

diferentes, durante la germinación de las esporas (elegimos el tiempo 9 h por corresponder

a un momento en que el programa de germinación ha comenzado y la germinación es muy

evidente en ausencia de NO) y las 18 h, momento en el cual las esporas han germinado y

el micelio está ramificándose y creciendo activamente. Corresponden a dos estadios de

desarrollo claramente diferentes sobre los que se evaluarán los niveles de expresión de los

genes FHG en respuesta a los factores considerados. Como fuente de Nitrógeno (N) se

seleccionó el tartrato de amonio porque la eficiencia de germinación en su presencia es

superior en todos los tiempos considerados (Ver Figuras 19 y 20).

Los cultivos se realizaron en matraces con 50 ml de medio mínimo con 1 % glucosa (MMG),

suplementado con 10 mM de tartrato de amonio con y sin exposición a NO (SNP) exógeno,

inoculados con 1 x 106 microconidios/ml de las estirpes de F. oxysporum f. sp. phaseoli

(FOP-SP1) y (FOP-SP4) e incubados a 25ºC con agitación constante de 120 rpm. Las

muestras se recolectaron a las 9 y 18 horas en nitrógeno líquido y se conservaron a -80ºC

hasta su utilización.

A partir de estas muestras se obtuvieron las preparaciones de ARN total para el análisis de

expresión de los genes FHG1, FHG2, FHG3 Y FHG4, tanto mediante hibridación Northern

como mediante PCR a tiempo real (RT-qPCR). Para el análisis mediante Northern se

prepararon filtros de nylon a los que se transfirieron 10 µg de ARN total de las muestras de

interés (ver Figuras 21, 22, 23 y 24). Como control de carga se utilizó la intensidad de las

bandas del ARN ribosómico 18S y 28S en geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio

antes de ser transferidos a las membranas. Las hibridaciones fueron llevadas a cabo en

todos los casos en condiciones restrictivas. Se utilizaron como sondas de hibridación

amplicones específicos de cada gen, obtenidos mediante PCR con las parejas de

oligonucleótidos mostrados en la Tabla 6 y marcados con digoxigenina. Para el análisis

mediante RT-qPCR se diseñaron oligonucleótidos a partir de las secuencias de las

regiones codificantes de cada uno de los cuatro genes FHG y que permitían amplificar

fragmentos específicos de cada gen (ver Tabla 6). Los datos de expresión relativa fueron

normalizados en relación con la expresión del gen de expresión constitutiva Efα1 (Factor

de elongación alfa 1) y fueron referidos en cada caso al valor de expresión de cada gen en


- 108 -

la condición de cultivo durante 9 horas en MM suplementado con 1 % de glucosa (MMG).

Asimismo se comprobó que la eficiencia de amplificación para todas las parejas de

oligonucleótidos fuera superior al 95 %.

3.5.2.1 Expresión de FHG1

La Figura 21 presenta el análisis de expresión del gen FHG1 en las estirpes FOP-SP1 y

FOP-SP4. En ambas estirpes la situación observada es esencialmente la misma. Se

comprueba que FHG1 no se expresa a niveles detectables mediante Northern en

ausencia de NO y que su expresión se induce a niveles elevados (detectables mediante

hibridación Northern) por exposición a NO. Esta inducción sólo se produce en la fase de

germinación, no en la fase de desarrollo del micelio, lo que supone que o bien el micelio

es insensible a NO o bien en ese momento ya se ha degradado el NO añadido al medio

de cultivo inicialmente.

Figura 21. Análisis de expresión del gen FHG1 de las estirpes FOP-SP1 (Panel A) y FOP-SP4 (panel B) durante el desarrollo y en condiciones de estrés nitrosativo. En cada panel la figura de la izquierda presenta los resultados de una hibridación Northern blot y el histograma de la derecha los resultados de la cuantificación de la expresión mediante RT-qPCR. Las muestras de RNA utilizadas en ambos tipos de análisis corresponden a muestras derivadas de esporas cultivadas durante 9 o 18 h en medio mínimo suplementado con 1 % glucosa (M) o medio mínimo suplementado con 1 % glucosa y con 10 mM de tartrato amónico (M+A), en ausencia o en presencia de 500 µM de SNP(+S). Los datos de RT-qPCR mostrados representan las medias de 3 experimentos (réplicas biológicas). Los datos de expresión representan los niveles de expresión relativa del gen FHG1 normalizados en relación con el nivel de expresión del gen Efα1 y referidos a los valores de expresión de FHG1 a 9 horas en medio M (MMG).

Resultados

- 109 -

El análisis de expresión mediante qPCR confirma el patrón detectado mediante hibridación

Northern, permitiendo esta técnica realizar una cuantificación de los niveles de expresión

del gen en relación con una condición de referencia (los valores representados muestran

los valores medios de expresión en tres réplicas biológicas independientes). Se comprueba

que el patrón de expresión de FHG1 es muy parecido en ambas estirpes y que en ambos

casos sólo hay un aumento importante de expresión durante la fase de germinación y en

respuesta a NO exógeno. El nivel de inducción es mayor en la estirpe FOP-SP4

(aproximadamente 20X en MMG en presencia de NO y 30X en MMG+A en presencia de

NO) que en la estirpe FOP-SP1 (6X y 7X, respectivamente), pero la respuesta en ambas

estirpes es esencialmente la misma.


El análisis del patrón de expresión del gen FHG2 en las condiciones indicadas se presenta

en la Figura 22. También en este caso el perfil de expresión es esencialmente el mismo en

ambas estirpes. El análisis comparado entre ellas mediante hibridación Northern blot

resulta menos informativo en primera aproximación porque la intensidad de las bandas de

hibridación detectadas en el caso de la estirpe FOP-SP1 es, en conjunto, menor, pero

ciertamente el perfil de expresión en ambas estirpes es similar.

Tomando como sistema de referencia la estirpe FOP-SP4, se comprueba que la expresión

de FHG2 está regulada durante el desarrollo. Ésta es máxima en micelio cultivado durante

18 h en medio mínimo con glucosa y en ausencia de donador de NO, y resulta reprimida

en presencia de amonio, condición, debemos recordar, que estimula la germinación. Es

interesante destacar que en la fase de micelio, cuando éste es cultivado en medio mínimo

con glucosa la exposición a NO reprime la expresión de FHG2 (o anula la inducción

observada en ausencia de NO). En presencia de amonio, condición en la que la expresión

de FHG2 es reprimida, la exposición a NO sí tiene un efecto inductor de la expresión.

Durante la fase de germinación de las esporas el perfil de expresión es diferente.

Considerando los datos de cuantificación mediante RT-qPCR se comprueba que en

ausencia de NO exógeno la adición de amonio al medio de cultivo también reprime la

expresión de FHG2, aunque la magnitud de la represión es menor que en la fase de micelio

en desarrollo. Sin embargo, tanto en presencia como en ausencia de amonio la adición de

NO exógeno induce la expresión de FHG2.


- 110 -

Es resumen, en el caso de FHG2 se detecta una regulación de la expresión durante el

desarrollo (probablemente consecuencia de una sensibilidad diferente al NO en las dos

fases consideradas, esporas en germinación y micelio) sobre la cual se superpone una

regulación por fuente de nitrógeno. Ésta determina que en la fase de micelio la adición de

amonio reprima la expresión de FHG2 y que también lo haga la adición de NO en ausencia

de amonio que determina que la adición de amonio reprima la expresión de FHG2 y que la

exposición a NO en presencia de amonio aumente la expresión de FHG2. Sólo en el caso

de la fase de desarrollo de micelio y en ausencia de amonio la exposición a NO no

determina un aumento de la expresión de FHG2.

Figura 22. Análisis de expresión del gen FHG2 de las estirpes FOP-SP1 (Panel A) y FOP-SP4 (panel B) durante el desarrollo y en condiciones de estrés nitrosativo. En cada panel la figura de la izquierda presenta los resultados de una hibridación Northern blot y el histograma de la derecha los resultados de la cuantificación de la expresión mediante RT-qPCR. Las muestras de RNA utilizadas en ambos tipos de análisis corresponden a muestras derivadas de esporas cultivadas durante 9 o 18 h en medio mínimo suplementado con 1 % glucosa (M) o medio mínimo suplementado con 1 % glucosa y con 10 mM de tartrato amónico (M+A), en ausencia o en presencia de 500 µM de SNP (+S). Los datos de RT-qPCR mostrados representan las medias de 3 experimentos (réplicas biológicas). Los datos de expresión representan los niveles de expresión relativa del gen FHG2 normalizados en relación con el nivel de expresión del gen Efα1 y referidos a los valores de expresión de FHG2 a 9 horas en medio M (MMG).


Los patrones de expresión de FHG3 en las estirpes FOP-SP1 y FOP-SP4 se presentan en

la Figura 23. Los patrones de expresión en ambas estirpes son similares. Aunque es

posible considerar algunas diferencias en la magnitud de los valores de expresión

Resultados

- 111 -

(inducción) entre ambas cepas, el comportamiento general que muestran una y otra en las

condiciones analizadas es similar. En este caso las esporas en germinación y el micelio en

desarrollo responden de forma similar, en particular en la estirpe FOP-SP1, lo que supone

que no existe una regulación obvia por desarrollo. Sí se observa una regulación por

amonio, cuya presencia estimula la expresión de FHG3, de forma más intensa en la fase

de esporas en germinación, y no resulta obvia, en general, una regulación por exposición

a NO. Sólo se observa una diferencia importante en el comportamiento de las dos cepas,

y es en la fase de micelio en la estirpe FOP-SP4, que parece responder de manera más

intensa a la exposición a NO en presencia de amonio. No obstante, es necesario tener en

cuenta que en esta condición lo que parece producirse es un menor nivel de inducción por

amonio, lo que acentúa la diferencia en los niveles de expresión en presencia de amonio y

de NO. Este comportamiento marca una diferencia, que podemos considerar menor, entre

las dos estirpes analizadas. En cualquier caso, el análisis conjunto de los datos obtenidos

con los dos procedimientos experimentales utilizados indica que en las dos estirpes la

presencia de amonio determina una inducción de la expresión de FHG3, más evidente

durante la fase de germinación de las esporas, y que la exposición a NO no tiene un efecto

notable en la regulación de la expresión de FHG3.

Figura 23. Análisis de expresión del gen FHG3 de las estirpes FOP-SP1 (Panel A) y FOP-SP4 (panel B) durante el desarrollo y en condiciones de estrés nitrosativo. En cada panel la figura de la izquierda presenta los resultados de una hibridación Northern blot y el histograma de la derecha los resultados de la cuantificación de la expresión mediante RT-qPCR. Las muestras de RNA utilizadas en ambos tipos de análisis corresponden a muestras derivadas de esporas cultivadas durante 9 o 18 h en medio mínimo suplementado con 1 % glucosa (M) o medio mínimo suplementado con 1 % glucosa y con 10 mM de tartrato amónico (M+A), en ausencia o en presencia de 500 µM de SNP


- 112 -

(+S). Los datos de RT-qPCR mostrados representan las medias de 3 experimentos (réplicas biológicas). Los datos de expresión representan los niveles de expresión relativa del gen FHG3 normalizados en relación con el nivel de expresión del gen Efα1 y referidos a los valores de expresión de FHG3 a 9 horas en medio M (MMG).


Finalmente, se analizó la expresión del gen FHG4 en las mismas condiciones. En este caso

los resultados obtenidos tanto por Northern blot como por RT-qPCR indican que el gen se

expresa a niveles mínimos en todas las condiciones analizadas y que no responde, a nivel

transcripcional, a ninguno de los factores evaluados en nuestro análisis. Probablemente

FHG4 codifica efectivamente una proteína de tipo flavohemoglobina, pero los procesos en

los que pueda desempeñar una función dada, sea ésta cual sea, no parecen estar

relacionados con desarrollo, con respuesta a amonio y con exposición a NO (respuesta a

condiciones de estrés nitrosativo).

Figura 24. Análisis de expresión del gen FHG4 de las estirpes FOP-SP1 (Panel A) y FOP-SP4 (panel B) durante el desarrollo y en condiciones de estrés nitrosativo. En cada panel la figura de la izquierda presenta los resultados de una hibridación Northern blot y el histograma de la derecha los resultados de la cuantificación de la expresión mediante RT-qPCR. Las muestras de RNA utilizadas en ambos tipos de análisis corresponden a muestras derivadas de esporas cultivadas durante 9 o 18 h en medio mínimo suplementado con 1 % glucosa (M) o medio mínimo suplementado con 1 % glucosa y con 10 mM de tartrato amónico (M+A), en ausencia o en presencia de 500 µM de SNP (+S). Los datos de RT-qPCR mostrados representan las medias de 3 experimentos (réplicas biológicas). Los datos de expresión representan los niveles de expresión relativa del gen FHG4 normalizados en relación con el nivel de expresión del gen Efα1 y referidos a los valores de expresión de FHG3 a 9 horas en medio M (MMG).

Resultados

- 113 -

3.5.3 Análisis de expresión de los genes FHG en plantas de judía

infectadas con estirpes de F. oxysporum f. sp. phaseoli

Los patrones de expresión de los cuatro genes FHG en relación con los factores analizados

son diferentes, lo que permite deducir que las proteínas codificadas pueden participar en

procesos distintos. En el contexto de nuestro trabajo estamos interesados de forma

particular en la posible participación de las enzimas de tipo flavohemoglobina en desarrollo

y en patogenicidad. Una vez analizados los patrones de expresión de los cuatro genes

FHG durante el crecimiento saprofítico decidimos abordar a continuación el estudio de los

niveles de expresión de los genes FHG durante la interacción del patógeno con su

huésped.

Decidimos realizar ensayos de infección sobre plantas de judía con las estirpes silvestres

de F. oxysporum FOP-SP1 y FOP-SP4 utilizando un sistema de cultivo hidropónico con el

medio de cultivo de plantas Plant growth medium PGM (descrito en la sección 2.2.1. de

Materiales y Métodos) por considerarse un sistema de cultivo limpio y libre de materia

orgánica y organismos parásitos y patógenos. Además mediante este tipo de cultivo los

experimentos son independientes de fenómenos meteorológicos como luz, temperatura y

humedad relativa, obteniéndose además muestras biológicas libres de contaminación. Otra

de las ventajas es la facilidad para realizar un seguimiento continuo del estado de

desarrollo de la planta y del progreso de la enfermedad. En ningún caso el progreso de la

enfermedad es igual al observado en experimentos de infección realizados en macetas con

medio de cultivo sólido. Ésta progresa siempre más lentamente en cultivos hidropónicos.

No obstante, la distinción entre plantas inoculadas con la estirpe muy virulenta y con la

estirpe poco virulenta, tanto en el número de hojas cloróticas como en el grado de necrosis

en el sistema vascular, puede hacerse de manera muy similar en ambos condiciones de

cultivo de las plantas.

Las raíces de plántulas de 10 días de edad se lavaron con agua destilada estéril y con

tijeras estériles se cortaron los ápices radiculares. A continuación éstos fueron sumergidos

en una solución de esporas 1 x 106 esporas/ml durante 5 minutos. Seguidamente se

retiraron y se traspasaron a tubos falcon de 50 ml con 30 ml de medio de cultivo líquido

(PGM), tubos que fueron cubiertos con papel aluminio y sellados con parafilm para evitar

la transpiración y con el objeto de mantener constante el volumen de medio de cultivo. Los

cultivos hidropónicos fueron incubados a 25ºC en un fitotrón a 60-80 % de humedad relativa

con un fotoperiodo de 16 horas luz y 8 horas oscuridad. La evaluación se realizó tomando


- 114 -

muestras de raíz a los 1, 2 y 3 días después de la inoculación, muestras de hipocotilo a los

5 y 7 días después de la inoculación y muestras de tallo a los 14 y 21 días después de la

inoculación. Las muestras de plantas inoculadas con F. oxysporum f. sp. phaseoli fueron

colectadas y conservadas a -80ºC. El ARN total se extrajo siguiendo el método descrito en

la sección 2.6.4.2 de Materiales y Métodos. La calidad del ARN se evaluó por electroforesis

en gel de agarosa en TAE 1X y por espectrofotometría en el NanoDrop N-1000.

En base a los resultados obtenidos en el análisis de expresión de los genes de FHG durante

el crecimiento saprofítico mediante análisis tipo Northern y RT-qPCR se decidió evaluar la

expresión de estos genes en la interacción con el huésped mediante RT-qPCR. La síntesis

de cDNA y el procedimiento de preparación de las reacciones de RT-qPCR se realizaron

siguiendo los procedimientos descritos en la sección 2.12.2 y 2.12.3 de Materiales y

Métodos. Los oligonucleótidos utilizados en reacciones de RT-qPCR son los que se

utilizaron para los análisis de expresión durante el crecimiento saprofitico descritos en las

secciones 3.5.1 y 3.5.2 de Resultados.

3.5.3.1 Análisis de expresión de los genes FHG en plantas de

judía infectadas con FOP-SP1

En la Figura 25 se presentan los patrones de expresión de los genes FHG de la estirpe

FOP-SP1 durante la interacción con plantas de judía variedad “blanca riñón”. En el caso

de FHG1 se observa un aumento en su nivel de expresión en raíz a los 3 dpi, duplicándose

éste en relación con la situación de refencia considerada, 1 dpi. En hipocotilo a los 7 dpi el

nivel de expresión detectado ha aumentado aún más (se triplica en relación con la situación

de referencia) y parece mantenerse constante en fases posteriores del proceso de

infección, concretamente a los 14 dpi en tallo (Panel A). En el caso de FHG2 el análisis

llevado a cabo sugiere que también parece aumentar, aunque en menor medida, su nivel

de expresión desde el día 3 dpi. Sin embargo, el análisis estadístico demuestra que las

diferencias observadas no son significativas (Panel B). La cuantificación de los niveles de

expresión de los genes FHG3 (Panel C) y FHG4 (Panel D) indica que ésta es muy uniforme

a lo largo del proceso de infección, no observándose variaciones notables en los tiempos

considerados en este estudio para ninguno de los dos genes.

Resultados

- 115 -

Figura 25. Análisis de expresión in planta mediante RT-qPCR de los genes FHG de FOP-SP1. (A): gen FHG1; (B): gen FHG2; (C): gen FHG3; y (D): gen FHG4. Los números que identifican las barras muestran los tiempos (días) después de la inoculación (dpi) en los que fueron tomadas las muestras: 1 y 3: Raíz, 7: hipocotilo y 14: tallo. Los datos presentados muestran los valores medios (± DE) de tres experimentos independientes. Los niveles de expresión de cada gen fueron normalizados tomando como referencia el nivel de expresión del gen Efα1 (Factor de elongación alpha 1), considerado de expresión constitutiva. Los niveles de expresión de cada gen en cada tiempo están referidos a su nivel de expresión en la muestra tomada 1 dpi. Diferencias significativas (“t-test” de Student) fueron observadas en las condiciones “3”; “7” y “14” dpi (** p<0.001) en el análisis de expresión del gen FHG1.

3.5.3.2 Análisis de expresión de los genes FHG en plantas de

judía infectadas conFOP-SP4

En la Figura 26 se presenta el análisis de expresión de los genes FHG de la estirpe FOP-

SP4 durante su interacción con plantas de judía variedad “blanca riñón”. Se comprueba

que la situación es muy similar a la observada en el caso de infección producida por la

estirpe FOP-SP1. Sólo se observan diferencias significativas en los niveles de expresión


- 116 -

en relación con la condición de referencia (1 dpi) en el caso del gen FHG1, cuya expresión

aumenta en raíz a los 3 dpi y lo hace aún más en hipocotilo a los 7 dpi (Panel A). Este

aumento no parece mantenerse a lo largo de tiempo, marcando una diferencia menor en

comparación con lo que sucede en la interacción con FOP-SP1, ya que decae a los 14 dpi.

En este sistema los niveles de expresión de los genes FHG2, FHG3 y FHG4 no muestran

variaciones a lo largo del tiempo durante la interacció10n (Paneles B, C y D).

Figura 26. Análisis de expresión in planta mediante qPCR de los genes FHG de FOP-SP4. (A): gen FHG1; (B): gen FHG2; (C): gen FHG3; y (D): gen FHG4. Los números que identifican las barras muestran los tiempos (días) después de la inoculación (dpi) en los que fueron tomadas las muestras: 1 y 3: Raíz; 7: hipocotilo; y 14: tallo. Los datos presentados muestran los valores medios (± SD) de tres experimentos independientes. Los niveles de expresión de cada gen fueron normalizados tomando como referencia el nivel de expresión del gen Efα1 (Factor de elongación alpha 1), considerado de expresión constitutiva. Los niveles de expresión de cada gen en cada tiempo están referidos a su nivel de expresión en la muestra tomada 1 dpi. Diferencias significativas (“t-test” de Student) fueron observadas en las condiciones “3” y “14” dpi (* p<0,05) y “7” dpi (** p<0.001) en el análisis de expresión del gen FHG1.

Resultados

- 117 -

3.6 Análisis funcional de los genes FHG

Los análisis de expresión durante el crecimiento saprofítico en medio de cultivo indican que

los cuatro genes codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina de F. oxysporum f. sp

phaseoli muestran patrones diferentes lo que permite proponer que las proteínas

codificadas puedan participar en procesos fisiológicos distintos. Con el objeto de obtener

información sobre los procesos en los que cada una de las cuatro proteínas FHG pudiera

participar decidimos llevar a cabo la caracterización funcional de los genes codificadores

de las mismas mediante la obtención y caracterización de mutantes deficientes de cada

uno de ellos. Para generar mutantes deficientes en cada uno de los genes se diseñó una

estrategia basada en el reemplazamiento génico del alelo silvestre correspondiente por un

alelo mutante en el que la región estructural completa del gen, o una parte del mismo, ha

sido sustituida por una fusión génica que permite la expresión del gen de resistencia a

higromicina B bajo el control de secuencias reguladoras funcionales en hongos

filamentosos. Esta fusión génica queda flanqueada en el plásmido de reemplazamiento

génico por secuencias de ADN genómico específicas del gen de interés, en cada caso

derivadas de las regiones inmediatamente adyacentes a los extremos 5’ y 3’ de la región

codificante.

El esquema de trabajo en todos los casos fue el mismo. Para cada gen, a partir de ADN

genómico de FOP-SP1 se amplificó un fragmento de ADN de aproximadamente 1 kb de

tamaño de la región flanqueante 5’ y un segundo fragmento de ADN del mismo tamaño de

la región flanqueante 3’. Estos fragmentos se amplificaron con oligonucleótidos específicos

diseñados a tal efecto. Para cada gen se construyó un plásmido binario clonando los

fragmentos flanqueantes 5’ y 3’ específicos a ambos lados del casete de expresión de la

higromicina. Con cada uno de estos plásmidos se transformó A. tumefaciens por

electroporación y con las cepas transformantes seleccionadas en cada caso se llevó a cabo

una transformación de FOP-SP1 y de FOP-SP4. Posteriormente, entre los transformantes

obtenidos se identificaron mediante PCR y mediante hibridación Southern aquéllos en los

que el alelo silvestre del gen considerado había sido reemplazado por el alelo mutante

construído en cada caso.

3.6.1 Construcción de los vectores de transformación

Para la construcción de los vectores de transformación previamente se amplificaron

mediante PCR fragmentos de ADN de las regiones flanqueantes 5ý 3´ de los genes FHG1,


- 118 -

FHG2, FHG3 y FHG4. Para amplificar los fragmentos de ADN genómico se diseñaron

oligonucleótidos específicos que permitían amplificar fragmentos de ADN de

aproximadamente 1 kb de tamaño. La Tabla 20 presenta los códigos de los

oligonucleótidos diseñados para llevar a cabo estas amplificaciones y los tamaños exactos

de los fragmentos amplificados. Las posiciones de anillamiento de estos oligonucleótidos

se muestran en las Figuras 29B y C, 31B y C, 33B y C y 35B y C. Las secuencias de todos

los oligonucleótidos están recogidas en la Tabla 6 de la sección 2.12.5 de Materiales y

Métodos.

Tabla 20. Códigos de los oligonucleótidos derivados de los genes FHG diseñados para la contrucción de los vectores de reemplazamiento génico y tamaños de los fragmentos amplificados por PCR.

Gen Región

flanqueante Código Tamaño

Gen FHG1

5’ FHG175

RHG175 996 pb

3’ FHG173

RHG173 998 pb

Gen FHG2

5’ FHG135

RHG135 946 pb

3’ FHG133

RHG133 948 pb

Gen FHG3

5’ FHG185

RHG185 1065 pb

3’ FHG183

RHG183 988 pb

Gen FHG4

5’ FHG155

RHG155 1037 pb

3’ FHG153

RHG153 1012 pb

En la Figura 27 se presentan los productos de amplificación obtenidos en las reacciones

de amplificación llevadas a cabo y visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa.

Resultados

- 119 -

Figura 27. Productos de PCR obtenidos a partir de ADN genómico de FOP-SP1 de las regiones flanqueantes 5´ (carriles 1) y 3´ (carriles 2) de los genes FHG con los oligonucleótidos específicos en cada caso. (A): FHG1, (B): FHG2, (C): FHG3 y (D): FHG4. Las combinaciones de cebadores utilizadas en cada amplificación son las indicadas en la Tabla 20. Los productos de PCR fueron resueltos mediante electroforesis en geles de agarosa al 1 %. M: marcador de peso molecular 1 kp plus DNA ladder (invitrogen).

Los productos de PCR de cada uno de los genes fueron purificados y ligados en el vector

pRF-HU2 previamente digerido con las enzimas de restricción PacI y NT.BbvCI utilizando

el sistema User Friendly Cloning. Con las reacciones de ligación se llevaron a cabo

transformaciones de células de E. coli cepa DH5α mediante choque térmico. Para

identificar colonias portadoras del plásmido de interés se llevó a cabo un escrutinio

mediante PCR directa sobre colonia de una muestra representativa de las colonias

obtenidas utilizando en cada caso los oligonucleótidos utilizados para amplificar los

fragmentos de ADN de las regiones flanqueantes correspondientes. Se seleccionó

finalmente una colonia positiva portadora del plásmido deseado en cada caso. Los

plásmisdos generados fueron denominados pRF-HU2-FHG1, pRF-HU2-FHG2, pRF-HU2-

FHG3 y pRF-HU2-FHG4. La Figura 28 muestra los mapas de restricción de estos

plásmidos.


- 120 -

Figura 28. Mapa de restricción de los plásmidos construidos a partir del plásmido PRF-HU2 para el reemplazamiento génico de los genes FHG de FOP-SP1 y FOP-SP4. En cada caso el casete de resistencia a higromicina está flanqueado por fragmentos de ADN genómico específicos de las regiones flanqueantes en 5’ y en 3’ de los genes FHG1 (plásmido pRF-HU2-FHG1) (A), FHG2 (plásmido pRF-HU2-FHG2) (B), FHG3 (plásmido pRF-HU2-FHG3) (C) y FHG4 (plásmido pRF-HU2-FHG4) (D).


Los plásmidos pRF-HU2-FHG1, pRF-HU2-FHG2, pRF-HU2-FHG3 y pRF-HU2-FHG4

fueron introducidos en A. tumefacción cepa AGL1 mediante electroporación siguiendo los

procedimientos descritos en la sección 2.9.5.2 de Materiales y Métodos. De entre las

colonias transformantes obtenidas con cada plásmido se seleccionó una que fue utilizada

para llevar a cabo la transformación de FOP-SP1 y FOP-SP4. La identidad del plásmido

presente en cada una de las colonias seleccionadas fue verificada mediante PCR utilizando

oligonucleótidos específicos de las regiones flanqueantes de cada uno de los cuatro genes.

Resultados

- 121 -

3.6.3 Transformación de F. oxysporum f. sp. phaseoli mediada por A.

tumefaciens

La transformación de F. oxysporum mediada por A. tumefaciens se realizó siguiendo la

metodología mostrada en los apartados 2.9.5.3 y 2.9.5.4 de Materiales y Métodos. Se

transformó tanto la estirpe FOP-SP1 como la estirpe FOP-SP4. Los transformantes

primarios que fueron apareciendo en las placas de medio selectivo en presencia de

higromicina B fueron transferidos individualmente a placas de PDA con 75 µg/ml de

higromicina e incubados durante 5 días a 25ºC. En la estirpe muy virulenta FOP-SP1 se

seleccionaron 96 transformantes para el gen FHG1, 72 transformantes para el gen FHG2,

102 transformantes para el gen FHG3 y 85 transformantes para el gen FGH4. En la estirpe

poco virulenta FOP-SP4 se seleccionaron 92 transformantes para el gen FHG1, 86

transformantes para el gen FHG2, 110 transformantes para el gen FHG3 y 112

transformantes para el gen FHG4.

3.6.4 Identificación de mutantes por reemplazamiento génico de F.

oxysporum f. sp. phaseoli

Para el análisis de los transformantes primarios y la identificación de mutantes por

reemplazamiento génico se partió de micelio tomado de placas PDA cultivadas durante 5

días. El micelio se transfirió a tubos eppendorf de 1,5 ml con Tris-HCl 10X. Este material

fue utilizado para la extracción de ADN genómico haciendo uso del método de extracción

rápido descrito en la sección 2.6.1.2 de Materiales y Métodos. El ADN genómico de cada

transformante fue utilizado para identificar mediante PCR de forma rápida transformantes

en los cuales se pudieran haber producido eventos de recombinación homóloga tanto en

el extremo flanqueante 5’ como en el extremo flanqueante 3’ entre el alelo silvestre del gen

y el alelo mutante en cada caso clonado en el plásmido de transformación correspondiente.

Para la discriminación de transformantes “candidato”, en cada uno de los de los cuatro

genes analizados se diseñaron oligonucleótidos derivados de secuencias localizadas en

las regiones flanqueantes, bien 5’ bien 3’, pero inmediatamente aguas arriba o aguas abajo

de los fragmentos de ADN clonados en el plásmido de reemplazamiento génico

correspondiente. Los códigos de los oligonucleótidos diseñados se presentan en la Tabla

21 y las posiciones que ocupan las secuencias diana de hibridación de los mismos se

muestran en las Figuras 29B y C, 31B y C, 33B y C y 35B y C. Sus secuencias se presentan

en la Tabla 6 de la sección 2.12.5 de Materiales y Métodos.


- 122 -

Tabla 21. Códigos de los oligonucleótidos derivados de los genes FHG y del gen hph utilizados para la identificación de transformantes candidato y tamaños de los productos de PCR esperados en caso de ocurrencia de recombinación homóloga en la región correspondiente.

Gen Región

flanqueante Código Tamaño

Gen FHG1

5’ FHG175-KN-FW

HphBC 2640 pb

3’ RHG173-KN-RV

HphAC 1838 pb

Gen FHG2

5’ FHG135-KN-FW

HphBC 2535 pb

3’ RHG133-KN-RV

HphAC 2462 pb

Gen FHG3

5’ FHG185-KN-FW

HphBC 2431 pb

3’ RHG183-KN-RV

HphAC 1945 pb

Gen FHG4

5’ FHG155-KN-FW

HphBC 2421 pb

3’ RHG153-KN-RV

HphAC 2097 pb

Para cada uno de los genes, la amplificación en un transformante primario dado de un

fragmento de ADN del tamaño esperado (conocido para cada gen en concreto) con una

combinación de oligonucleótidos particular que incluye el oligonucleótido derivado de la

región inmediatamente aguas arriba del fragmento de ADN genómico clonado en el

plásmido de reemplazamiento génico y correspondiente a la región flanqueante 5’ y el

oligonucleótido HphBC, derivado del casete de resistencia a higromicina, permitiría

identificar un evento de recombinación homóloga en el extremo 5’ del gen de interés entre

el alelo silvestre y el alelo mutante. De la misma manera, la amplificación en un

transformante primario dado de un fragmento de ADN del tamaño esperado (conocido para

cada gen en concreto) con una combinación de oligonucleótidos particular que incluye el

oligonucleótido derivado de la región inmediatamente aguas abajo del fragmento de ADN

genómico clonado en el plásmido de reemplazamiento génico y derivado de la región

flanqueante 3’ y el oligonucleótido HphAC, derivado del casete de resistencia a higromicina,

permitiría identificar un evento de recombinación homóloga en el extremo 3’ del gen de

interés del alelo silvestre y el alelo mutante (ver en las Figuras 29, 31, 33 y 35 la ubicación

Resultados

- 123 -

de los cebadores representados en color naranja). La amplificación simultánea de ambos

productos de amplificación permitiría identificar transformantes primarios derivados de un

evento de reemplazamiento génico que serían seleccionados para análisis posteriores.

3.6.4.1 Identificación de transformantes del gen FHG1

En la Figura 29 se presenta de forma esquemática el modo en el que deben alinearse el

alelo silvestre del gen FHG1 y la construcción generada y clonada en el plásmido pRF-

HU2-FHG1 y la estructura que presentará el alelo mutante del gen FHG1 derivado de dos

eventos de recombinación homóloga en ambas regiones flanqueantes de la región

estructural del gen, es decir, la estructura del alelo mutante de FHG1 consecuencia del

remplazamiento génico.

Figura 29. Estrategia de reemplazamiento génico del gen FHG1. A: Representación simplificada del plásmido pRF-HU2-FHG1 con la construcción de reemplazamiento del gen FHG1. B: Esquema del entorno genómico del alelo silvestre del gen FHG1. Se indican (cajas de color azul intenso) las regiones en los extremos flanqueantes 5’ y 3’ en las que debe producirse recombinación homóloga para que tenga lugar el reemplazameinto génico de FHG1. C: Estructura del alelo mutante generado mediante reemplazamiento génico como consecuencia de un doble evento de recombinación homóloga en las regiones flaqueantes 5’ y 3’ de FHG1. La ubicación de las dianas de hibridación de los cebadores utilizados para amplificación de las regiones flanqueantes 5´ y 3´ clonadas en el plásmido pRF-HU2-FHG1 se representa mediante flechas de color verde (B). La ubicación de las diana de anillamiento de los cebadores utilizados para la detección de la ocurrencia de recombinación homóloga en una región flanqueante u otra se representa mediante flechas de color naranja (B y C). Se indica la posición de las dianas de restricción de la enzima HindIII en el alelo silvestre y en el alelo resultante del remplazamiento génico (HindIII no corta el plásmido pRF-HU2-FHG1).


- 124 -

La identificación de “transformantes candidatos” en los que se ha producido el

reemplazamiento génico del gen FHG1 se realizó mediante reacciones de PCR utilizando

la combinación de cebadores FHG175-KN-FW y HphBC y RHG173-KN-RV y HphAC

mostrados en la Figura 29B y 29C. En el primer caso, la amplificación de un fragmento de

2640 pares bases correspondiente a la región flanqueante 5´ sería indicativa de

recombinación homóloga en esta región. En el segundo caso, la amplificación de un

fragmento de 1838 pares de bases correspondiente a la región flanqueante 3´ sería

indicativa de recombinación homóloga en esta región. En la Figura 30, se muestran

resueltos mediante electroforesis en geles de agarosa los productos de amplificación

obtenidos en reacciones de PCR llevadas a cabo con ambas combinaciones de cebadores

en una muestra representativa de transformantes. En un buen número de transformantes

primarios se amplificaron los dos fragmentos diagnósticos de recombinación homóloga.

Estos son transformantes en los que debe haberse producido el reemplazamiento del gen

FHG1. En total, para la estirpe muy virulenta FOP-SP1 se obtuvieron 16 transformantes

positivos candidatos de 96 analizados. Para la estirpe poco virulenta FOP-SP4 se

obtuvieron 22 transformantes positivos de 92 analizados. En la Figura 30 se muestran los

productos de PCR obtenidos a partir de ADN genómico de las cepas mutantes del gen

FHG1 de FOP-SP1 y FOP-SP4.

Figura 30. Productos de PCR obtenidos en reacciones de PCR llevadas a cabo con los oligonucleótidos FHG175-KN-FW y HphBC (línea superior en cada gel) (5’) y RHG173-KN-RV y HphAC (línea inferior en cada gel) (3’) utilizando como molde ADN genómico de los transformantes obtenidos con el plásmido pRF-HU2-FHG1. A: Transformantes FOP-SP1 (carreras 1 a 18) y B: Transformantes FOP-SP4 (carreras 1 a 18). Cómo control se incluyeron reacciones de PCR llevadas a cabo con los mismos oligonucleótidos utilizando como molde ADN genómico de la estirpes FOP-SP1 o FOP-SP4 no transformadas. M: marcador de peso molecular 1 kp plus DNA ladder (Invitrogen).

Resultados

- 125 -

3.6.4.2 Identificación de transformantes del gen FHG2 En la Figura 31 se presenta de forma esquemática el modo en el que deben alinearse el






Figura 31. Estrategia de reemplazamiento génico del gen FHG2. A: Representación simplificada del plásmido pRF-HU2-FHG2 con la construcción de reemplazamiento del gen FHG2. B: Esquema del entorno genómico del alelo silvestre del gen FHG2. Se indican las regiones en los extremos flanqueantes 5’ y 3’ en las que debe producirse recombinación homóloga para que tenga lugar el reemplazameinto génico de FHG2. C: Estructura del alelo mutante generado mediante reemplazamiento génico como consecuencia de un doble evento de recombinación homóloga en las regiones flaqueantes 5’ y 3’ de FHG2. La ubicación de las dianas de hibridación de los cebadores utilizados para amplificación de las regiones flanqueantes 5´ y 3´ clonadas en el plásmido pRF-HU2-FHG2 se representa mediante flechas de color verde (B). La ubicación de las dianas de anillamiento de los cebadores utilizados para la detección de la ocurrencia de recombinación homóloga en una región flanqueante u otra se representa mediante flechas de color naranja (B y C). Se indica la posición de las dianas de restricción de la enzima HindIII en el alelo silvestre y en el alelo resultante del remplazamiento génico (HindIII no corta el plásmido pRF-HU2-FHG2).

La identificación de “transformantes candidatos” en los que se ha producido el

reemplazamiento génico del gen FHG2 se realizó mediante reacciones de PCR utilizando

la combinación de cebadores FHG135-KN-FW y HphBC y RHG133-KN-Rv y HphAC

pRF-HU2-FHG1

Alelo WT FHG1

Alelo mutante


- 126 -

mostrados en la Figura 31B y 31C. En el primer caso, la amplificación de un fragmento de

2537 pares bases correspondiente a la región flanqueante 5´ sería indicativa de

recombinación homólogo en esta región. En el segundo caso, la amplificación de un

fragmento de 2462 pares de bases correspondiente a la región flanqueante 3´ sería

indicativa de recombinación homóloga en esta región.

En la Figura 32 se muestran resueltos mediante electroforesis en geles de agarosa los

productos de amplificación obtenidos en reacciones de PCR llevadas a cabo con ambas

combinaciones de cebadores en una muestra representativa de transformantes. También

en este caso en un buen número de transformantes primarios se amplificaron los dos

fragmentos diagnósticos de recombinación homóloga.

Figura 32. Productos de PCR obtenidos en reacciones de PCR llevadas a cabo con los oligonucleótidos FHG135-KN-FW y HphBC (línea superior en cada gel) (5’) y RHG133-KN-RV y HphAC (línea inferior en cada gel) (3’) utilizando como molde ADN genómico de los transformantes obtenidos con el plásmido pRF-HU2-FHG2. A: Transformantes FOP-SP1 (carreras 1 a 18) y B: Transformantes FOP-SP4 (carreras 1 a 18). Cómo control se incluyeron reacciones de PCR llevadas a cabo con los mismos oligonucleótidos utilizando como molde ADN genómico de las estirpes FOP-SP1 o FOP-SP4 no transformadas (wt). M: marcador de peso molecular 1 kp plus DNA ladder (Invitrogen).

Estos son transformantes en los que debe haberse producido el reemplazamiento del gen

FHG2. Los fragmentos amplificados mostraron el tamaño esperado y posiblemente ocurrió

un doble evento de recombinación homóloga. En total, para la estirpe muy virulenta FOP-

SP1 se obtuvieron 48 transformantes positivos candidatos de 72 analizados. Para la estirpe

poco virulenta FOP-SP4 se obtuvieron 42 transformantes positivos de 88 analizados.

Resultados

- 127 -


En la Figura 33 se muestran de forma esquemática el modo en el que deben alinearse el





reemplazamiento génico.

Figura 33. Estrategia de reemplazamiento génico del gen FHG3. A: Representación simplificada del plásmido pRF-HU2-FHG3 con la construcción de reemplazamiento del gen FHG2. B: Esquema del entorno genómico del alelo silvestre del gen FHG3. Se indican las regiones en los extremos flanqueantes 5’ y 3’ en las que debe producirse recombinación homóloga para que tenga lugar el reemplazameinto génico de FHG3. C: Estructura del alelo mutante generado mediante reemplazamiento génico como consecuencia de un doble evento de recombinación homóloga en las regiones flaqueantes 5’ y 3’ de FHG3. La ubicación de las dianas de hibridación de los cebadores utilizados para amplificación de las regiones flanqueantes 5´ y 3´ clonadas en el plásmido pRF-HU2-FHG3 se representa mediante flechas de color verde (B). La ubicación de las dianas de anillamiento de los cebadores utilizados para la detección de la ocurrencia de recombinación homóloga en una región flanqueante u otra se representa mediante flechas de color naranja (B y C). Se indica la posición de las dianas de restricción de la enzima HindIII en el alelo silvestre y en el alelo resultante del remplazamiento génico (HindIII no corta el plásmido pRF-HU2-FHG3).

La identificación de “transformantes candidato” en los que se ha producido el

reemplazamiento génico del gen FHG3 se realizó llevando a cabo reacciones de PCR

utilizando la combinación de cebadores FHG185-KN-FW y HphBC y RHG83-KN-RV y


- 128 -

HphAC mostrados en la Figura 33B y 33C. La amplificación de un fragmento de 2431 pares

bases correspondiente a la región flanqueante 5´ sería indicativa de recombinación

homóloga en esta región. Igualmente, la amplificación de un fragmento de 1895 pares de

bases correspondiente a la región flanqueante 3´ sería indicativa de recombinación

homóloga en esta región. En la Figura 34 se muestran resueltos mediante electroforesis

en geles de agarosa los productos de amplificación obtenidos en reacciones de PCR

llevadas a cabo con ambas combinaciones de cebadores en una muestra representativa

de transformantes. En un buen número de transformantes primarios se amplificaron los dos

fragmentos diagnósticos de recombinación homóloga.


Los transformantes en los que se detecta amplificación de ambos productos de PCR, y

éstos tienen el tamaño esperado, son aquellos en los que debe haberse producido el

reemplazamiento del gen FHG2. En total, para la estirpe muy virulenta FOP-SP1 se

obtuvieron 42 transformantes positivos de 102 analizados. Para la estirpe poco virulenta

FOP-SP4 se obtuvieron 32 transformantes positivos de 110 analizados.

Resultados

- 129 -


En la Figura 35 se presenta el esquema del modo en el que deben alinearse el alelo

silvestre del gen FHG4 y la construcción generada y clonada en el plásmido pRF-HU2-

FHG4 y la estructura que presentará el alelo mutante del gen FHG4 derivado de dos




Figura 35. Estrategia de reemplazamiento génico del gen FHG4. A: Representación simplificada del plásmido pRF-HU2-FHG4 con la construcción de reemplazamiento del gen FHG4. B: Esquema del entorno genómico del alelo silvestre del gen FHG4. Se indican las regiones en los extremos flanqueantes 5’ y 3’ en las que debe producirse recombinación homóloga para que tenga lugar el reemplazamiento génico de FHG4. C: Estructura del alelo mutante generado mediante reemplazamiento génico como consecuencia de un doble evento de recombinación homóloga en las regiones flaqueantes 5’ y 3’ de FHG4. La ubicación de las dianas de hibridación de los cebadores utilizados para amplificación de las regiones flanqueantes 5´ y 3´ clonadas en el plásmido pRF-HU2-FHG4 se representa mediante flechas de color verde (B). La ubicación de las dianas de anillamiento de los cebadores utilizados para la detección de la ocurrencia de recombinación homóloga en una región flanqueante u otra se representa mediante flechas de color naranja (B y C). Se indica la posición de las dianas de restricción de la enzima HindIII en el alelo silvestre y en el alelo resultante del reemplazamiento génico (HindIII no corta el plásmido pRF-HU2-FHG2).

La identificación de transformantes en los que se ha producido el reemplazamiento génico

del gen FHG4 se realizó llevando a cabo reacciones de PCR utilizando la combinación de

cebadores FHG155-KN-FW y HphBC y RHG153-KN-RV y HphAC mostrados en la Figura


- 130 -

35B y 35C. La amplificación de un fragmento de 2421 pares bases correspondiente a la

región flanqueante 5´ sería indicativa de recombinación homóloga en esta región. Por otro

lado, la amplificación de un fragmento de 2097 pares de bases correspondiente a la región

flanqueante 3´ sería indicativa de recombinación homóloga en esta región. Como se

observa en la Figura 36, en la que se muestran resueltos mediante electroforesis en geles

de agarosa los productos de amplificación obtenidos en reacciones de PCR llevadas a

cabo con ambas combinaciones de cebadores en una muestra representativa de

transformantes, en un buen número de transformantes primarios amplificaron los dos

fragmentos indicadores de recombinación homóloga. Estos transformantes son aquellos

en los que debe haberse producido el reemplazamiento del gen FHG4. En los mismos se

detectó la amplificación de los fragmentos derivados de una y otra regíón flanqueante y

ambos presentaban el tamaño esperado. En total, para la estirpe muy virulenta FOP-SP1

se obtuvieron 7 transformantes positivos candidatos de 110 analizados. Para la estirpe

poco virulenta FOP-SP4 se obtuvieron 5 transformantes positivos de 112 analizados.


Resultados

- 131 -

3.7 Análisis mediante hibridación Southern de los transformantes de F.

oxysporum f. sp. phaseoli

Los transformantes en los que fue posible identificar mediante PCR la ocurrencia de dos

eventos de doble recombinación homóloga en las regiones flanqueantes 5´ y 3’ bien del

gen FHG1, del gen FHG2, del gen FHG3 o del gen FHG4 fueron analizados mediante

hibridación de tipo Southern. Con el objeto de eliminar posibles núcleos no transformados

y de garantizar la homocariosis del alelo “reemplazamiento” en los transformantes

seleccionados, a partir de cada uno de ellos se obtuvieron cultivos monospóricos

seleccionando esporas individuales en medio PDA suplementado con 75 µg/ml de

higromicina B (en la mayor parte de los casos a partir de cada cepa en forma de cultivo

monospórico se obtuvo un cultivo monospórico de “segunda generación” y de éste un

cultivo monospórico de tercera generación, dados los problemas de heterocariosis que en

algunos casos hemos detectado).

Finalmente los transformantes seleccionados y purificados fueron cultivados en medio

líquido PDB con 50 µg/ml de higromicina y a partir del micelio recuperado se extrajo ADN

genómico que fue utilizado en el análisis de hibridación Southern. En todos los casos, es

decir, para la caracterización de los transformantes seleccionados para cada uno de los

cuatro genes considerados, el análisis siguió la misma estrategia. En primer lugar se

determinaría la presencia o ausencia en cada transformante de la banda de hibridación

característica del alelo silvestre mediante hibridación con una sonda derivada de la región

estructural del gen analizado. En segundo lugar se detectarían bien la banda

correspondiente al alelo silvestre, bien la banda correspondiente al alelo remplazamiento,

mediante hibridación con una sonda derivada de la región 5’ flanqueante del gen. Y

finalmente, se confirmaría la identidad de la banda remplazamiento mediante hibridación

con una sonda derivada de la región estructural del gen que determina la resistencia a

higromicina. Esta última hibridación permitiría, además, detectar la ocurrencia de

integraciones adicionales del casete de resistencia a higromicina B en el genoma de los

transformantes. Las sondas derivadas de la región codificante y de la región flanqueante

5’ de cada gen en estudio y la sonda del gen de resistencia a higromicina B fueron

marcadas mediante PCR con los cebadores mostrados en la Tabla 6 (ver Figuras 37, 38,

39 y 40 para visualizar los fragmentos de amplificación esperados en cada caso).


- 132 -

3.7.1 Análisis de los mutantes en el gen ΔFHG1

En la Figura 37 se muestran los resultados de las hibridaciones de tipo Southern llevadas

a cabo en el análisis de los transformantes 130, 131, 149 y 156 de la estirpe FOP-SP1 y

de la propia estirpe FOP-SP1 (Paneles A, B y C), así como de los transformantes 226, 239

y 244 de la estirpe FOP-SP4 y de la propia estirpe FOP-SP4 (Paneles D, E y F), con la

sonda específica de la región codificante del alelo silvestre del gen FHG1 (paneles A y D),

con la sonda del Flanco 5´ del mismo (Paneles B y E) y con la sonda del gen de resistencia

a higromicina (Paneles C y F). El ADN en todos los casos fue digerido con HindIII, enzima

de restricción para la que existe una diana de reconocimiento dentro de la región

codificante de FHG1 pero fuera de la zona correspondiente al fragmento utilizado como

sonda. En el Panel 37A se comprueba que en las cepas transformantes 149 y 156 de FOP-

SP1 se detecta la banda de hibridación correspondiente al alelo silvestre de FHG1, de 3958

pares de nucleótidos, banda que también se detecta en la cepa FOP-SP1. En las cepas

130 y 131 no se detecta esta banda, lo cual indica que en estos dos transformantes el alelo

silvestre ha sido eliminado.

La hibridación con la sonda derivada de la región flanqueante 5’ demuestra que,

efectivamente, en los transformantes 130 y 131 el alelo silvestre ha sido sustituido por el

alelo de reemplazamiento, ya que únicamente se detecta una banda de hibridación, que

tiene el tamaño esperado (5374 pares de nucleótidos) del alelo “reemplazamiento”. En los

transformantes 149 y 156 se detectan ambas bandas con la sonda derivada de la región 5’

flanqueante, la correspondiente al alelo silvestre y la correspondiente al alelo

reemplazamiento, observación compatible con una integración en tándem, consecuencia

de un único evento de recombinación homóloga bien en la región flanqueante 5’, bien en

la región flanqueante 3’, o con la ocurrencia de heterocariosis. La hibridación con la sonda

derivada de la región estructural del gen de resistencia a higromicina B (Panel 37C)

demuestra que la banda detectada en todos los transformantes con una tamaño de 5374

pares de nucleótidos es, efectivamente, la banda derivada de la copia de reemplazamiento

de FHG1 clonada en el plásmido de transformación. Por lo tanto, sólo los transformantes

130 y 131 de la estirpe FOP-SP1 son auténticos mutantes por reemplazamiento génico del

gen FHG1. El mismo tipo de análisis llevado a cabo con los transformantes 225, 239 y 244

de la estirpe FOP-SP4 demuestra que en este caso el alelo silvestre FHG1 ha sido

reemplazado por el alelo mutante en todos los transformantes identificados mediante PCR

y seleccionados. Para todos los análisis posteriores se seleccionaron dos mutantes

Resultados

- 133 -

independientes de cada estirpe, los mutantes 130 y 131 de FOP-SP1 y los mutantes 239 y

244 de FOP-SP4.

Figura 37. Análisis mediante hibridación tipo Southern de los transformantes en los que se ha determinado mediante PCR la ocurrencia de dos eventos de recombinación homóloga en las regiones 5’ y 3’ flanqueantes del gen FHG1 en las estirpes FOP-SP1 (Paneles A, B y C) y FOP-SP4 (Paneles D, E y F). Las muestras de ADN genómico (10 µg en cada caso) fueron digeridas con la enzima de restricción HindIII, separadas mediante electroforesis en gel de agarosa y transferidas a filtros de nylon. Las hibridaciones fueron llevadas a cabo con una sonda derivada de la región estructural del gen FHG1 (paneles A y D), de su región 5’ flanqueante (Paneles B y E) o de la región estructural del gen que confiere resistencia a higromicina B (paneles C y F). Los números sobre los filtros hibridados corresponden a los códigos de los transformantes seleccionados en las trasformaciones realizadas sobre la estirpe FOP-SP1 o FOP-SP4, a partir de los cuales se prepararon muestras de ADN genómico que fueron incluidas como control en los filtros correspondientes.


En la Figura 38 se muestran los resultados de las hibridaciones llevadas a cabo en el

análisis de los transformantes 50, 51, 57 y 61 de la estirpe FOP-SP1 y de la propia estirpe

FOP-SP1 (Paneles A, B y C) y de los transformantes 303, 314 y 315 de la estirpe FOP-

SP4 y de la propia estirpe FOP-SP4 (Paneles D, E y F) con la sonda específica de la región

codificante del alelo silvestre del gen FHG2 (Paneles A y D), con la sonda derivada de la

región flanqueante 5´ (Paneles B y E) y con la sonda del gen de resistencia a higromicina


- 134 -

B (Paneles C y F). El ADN en todos los casos fue digerido con HindIII, enzima de restricción

para la que existe una diana de reconocimiento dentro de la región codificante del gen

FHG2, pero fuera de la zona correspondiente al fragmento utilizado como sonda. En el

Panel 38A se comprueba que en las cepas transformantes 50, 51, 57 y 61 el alelo silvestre

ha sido eliminado. La hibridación con la sonda derivada de la región flanqueante 5’

demuestra que, efectivamente, en estos transformantes el alelo silvestre ha sido sustituido

por el alelo de reemplazamiento, ya que únicamente se detecta una banda, que tiene el

tamaño esperado (9084 pares de nucleótidos) del alelo de reemplazamiento. La hibridación

con la sonda derivada de la región estructural del gen de la higromicina B (Panel 38C)

demuestra que la banda detectada en todos los transformantes con una tamaño de 9084

pares de nucleótidos es, efectivamente, la banda derivada de la copia “reemplazamiento”

del gen FHG2 clonada en el plásmido de transformación.

Figura 38. Análisis mediante hibridación tipo Southern de los transformantes en los que se ha determinado mediante PCR la ocurrencia de dos eventos de recombinación homóloga en las regiones 5’ y 3’ flanqueantes del gen FHG2 en las estirpes FOP-SP1 (Paneles A, B y C) y FOP-SP4 (Paneles D, E y F). Las muestras de ADN genómico (10 µg en cada caso) fueron digeridas con la enzima de restricción HindIII, separados mediante electroforesis en gel de agarosa y transferidas a filtros de nylon. Las hibridaciones fueron llevadas a cabo con una sonda derivada de la región estructural del gen FHG2 (Paneles A y D), de su región 5’ flanqueante (paneles B y E) o de la región estructural del gen que confiere resistencia a higromicina B (Paneles C y F). Los números sobre los filtros hibridados corresponden a los códigos de los transformantes seleccionados en las trasformaciones realizadas sobre la estirpe FOP-SP1 o FOP-SP4, a partir de los cuales se prepararon muestras de ADN genómico que fueron incluidas como control en los filtros correspondientes.

Resultados

- 135 -

Por lo tanto, los transformantes 50, 51, 57 y 61 de la estirpe FOP-SP1 son auténticos

mutantes por remplazamiento génico de FHG2. El mismo tipo de análisis llevado a cabo

con los transformantes 302, 314 y 315 de la estirpe FOP-SP4 demuestra que en este caso

el alelo silvestre FHG2 ha sido reemplazado por el alelo mutante en todos los

transformantes identificados mediante PCR y seleccionados. Para todos los análisis

posteriores se seleccionaron dos mutantes independientes de cada estirpe, los mutantes

51 y 61 de FOP-SP1 y los mutantes 314 y 315 de FOP-SP4.


En la Figura 39 se muestran los resultados de las hibridaciones realizadas con los

transformantes 811, 812 y 818 de la estirpe FOP-SP1 y de la propia estirpe FOP-SP1

(Paneles A, B y C) y de los transformantes 705 y 728 de la estirpe FOP-SP4 y de la propia

estirpe FOP-SP4 (Paneles D, E y F) con la sonda especifica de la región codificante del

alelo silvestre del gen FHG3 (Paneles A y D), con la sonda derivada de la región

flanqueante 5´ (Paneles B y E) y con la sonda del gen de resistencia a higromicina B

(Paneles C y F). El ADN en todos los casos fue digerido con HindIII, enzima de restricción

para la que existe una diana de reconocimiento dentro de la región codificante del gen

FHG3 pero fuera de la zona correspondiente al fragmento utilizado como sonda. En el

Panel 39A se comprueba que en las cepas transformantes 811, 812 y 818 el alelo silvestre

ha sido eliminado. La hibridación con la sonda derivada de la región flanqueante 5’

demuestra que, efectivamente, en estos transformantes el alelo silvestre ha sido sustituido

por el alelo remplazamiento, ya que únicamente se detecta una banda, que tiene el tamaño

esperado (6585 pares de nucleótidos). La hibridación con la sonda derivada de la región

estructural del gen de resistencia a higromicina B (Panel 39C) demuestra que la banda

detectada en todos los transformantes tiene un tamaño de 6585 pares de nucleótidos y es,

efectivamente, la banda derivada de la copia de reemplazamiento del gen FHG3 clonada

en el plásmido de transformación. Por lo tanto, los transformantes 811, 812 y 818 de la

estirpe FOP-SP1 son auténticos mutantes por remplazamiento génico del gen FHG3. El

mismo tipo de análisis llevado a cabo con los transformantes 705 y 728 de la estirpe FOP-

SP4 demuestra que en este caso el alelo silvestre FHG3 ha sido reemplazado por el alelo

mutante en los dos transformantes identificados mediante PCR y seleccionados. Para

todos los análisis posteriores se seleccionaron dos mutantes independientes de cada

estirpe, los mutantes 812 y 818 de FOP-SP1 y los mutantes 705 y 728 de FOP-SP4.


- 136 -

Figura 39. Análisis mediante hibridación tipo Southern de los transformantes en los que se ha determinado mediante PCR la ocurrencia de dos eventos de recombinación homóloga en las regiones 5’ y 3’ flanqueantes del gen FHG3 en las estirpes FOP-SP1 (Paneles A, B y C) y FOP-SP4 (Paneles D, E y F). Las muestras de ADN genómico (10 µg en cada caso) fueron digeridas con la enzima de restricción HindIII, separados mediante electroforesis en gel de agarosa y transferidas a filtros de nylon. Las hibridaciones fueron llevadas a cabo con una sonda derivada de la región estructural del gen FHG3 (Paneles A y D), de su región 5’ flanqueante (Paneles B y E) o de la región estructural del gen que confiere resistencia a higromicina B (Paneles C y F). Los números sobre los filtros hibridados corresponden a los códigos de los transformantes seleccionados en las trasformaciones realizadas sobre la estirpe FOP-SP1 o FOP-SP4, a partir de los cuales se prepararon muestras de ADN genómico que fueron incluidas como control en los filtros correspondientes.


En la Figura 40 se muestran los resultados de las hibridaciones llevadas a cabo en el

análisis de los transformantes 619, 637 y 639 de la estirpe FOP-SP1 y de la propia estirpe

FOP-SP1 (Paneles A, B y C) y de los transformantes 508 y 516 de la estirpe FOP-SP4 y

de la propia estirpe FOP-SP4 (Paneles D, E y F), con la sonda especifica de la región

codificante del alelo silvestre del gen FHG4 (Paneles A y D), con la sonda del Flanco 5´

(Paneles B y E) y con la sonda del gen de resistencia a higromicina B (Paneles C y F). El

ADN en todos los casos fue digerido con HindIII, enzima de restricción para la que existe

una diana de reconocimiento dentro de la región codificante del gen FHG4 pero fuera de la

Resultados

- 137 -

zona correspondiente al fragmento utilizado como sonda. En el Panel 40A se comprueba

que en las cepas transformantes 619, 637 y 639 el alelo silvestre ha sido eliminado. La

hibridación con la sonda derivada de la región flanqueante 5’ demuestra que,

efectivamente, en estos transformantes el alelo silvestre ha sido sustituido por el alelo de

reemplazamiento, detectándose únicamente una banda que tiene el tamaño esperado

(6554 pares de nucleótidos). La hibridación con la sonda derivada de la región estructural

del gen de resistencia a higromicina B (Panel 40C) demuestra que la banda detectada en

todos los transformantes con un tamaño de 6554 pares de nucleótidos es, efectivamente,

la banda derivada de la copia de reemplazamiento del gen FHG4 clonada en el plásmido

de transformación.

Figura 40. Análisis mediante hibridación tipo Southern de los transformantes en los que se ha determinado mediante PCR la ocurrencia de dos eventos de recombinación homóloga en las regiones 5’ y 3’ flanqueantes del gen FHG4 en las estirpes FOP-SP1 (Paneles A, B y C) y FOP-SP4 (Paneles D, E y F). Las muestras de ADN genómico (10 µg en cada caso) fueron digeridas con la enzima de restricción HindIII, separados mediante electroforesis en gel de agarosa y transferidas a filtros de nylon. Las hibridaciones fueron llevadas a cabo con una sonda derivada de la región estructural del gen FHG4 (Paneles A y D), de su región 5’ flanqueante (Paneles B y E) o de la región estructural del gen que confiere resistencia a higromicina (Paneles C y F). Los números sobre los filtros hibridados corresponden a los códigos de los transformantes seleccionados en las transformaciones realizadas sobre la estirpe FOP-SP1 o FOP-SP4, a partir de los cuales se prepararon muestras de ADN genómico que fueron incluidas como control en los filtros correspondientes.


- 138 -

Por lo tanto, los transformantes 619, 637 y 639 de la estirpe FOP-SP1 son auténticos

mutantes por reemplazamiento génico del gen FHG4. El mismo tipo de análisis llevado a

cabo con los transformantes 508 y 516 de la estirpe FOP-SP4 demuestra que en este caso

el alelo silvestre FHG4 ha sido reemplazado por el alelo mutante en los dos transformantes

identificados mediante PCR y seleccionados. Para todos los análisis posteriores se

seleccionaron dos mutantes independientes de cada estirpe, los mutantes 619 y 637 de

FOP-SP1 y los mutantes 508 y 516 de FOP-SP4.

3.8 Caracterización fisiológica de los mutantes ∆FHG

Los cuatro genes FHG analizados en este trabajo codifican proteínas que presentan los

dominios funcionales característicos de proteínas tipo flavohemoglobina. Por lo tanto, es

posible asumir que estas proteínas están implicadas en la modulación de los niveles de

NO a los que puede resultar expuesto F. oxysporum f. sp. phaseoli (FOP). Los cuatro genes

muestran patrones de expresión diferentes en respuesta a distintos factores o estímulos,

tales como el desarrollo, la fuente de nitrógeno o la exposición a NO exógeno. Estas

observaciones sugieren que cada una de estas proteínas puede participar en el mismo

proceso fisiológico, respondiendo de manera diferente a un mismo estímulo, o en procesos

fisiológicos distintos, quizás en un caso y otro como consecuencia de cierta especialización

funcional. Para tratar de identificar los procesos fisiológicos en los que la detoxificación de

NO mediada por cada una de estas enzimas pudiera jugar un papel relevante decidimos

llevar a cabo una caracterización funcional de los mutantes deficientes en cada uno de los

cuatro genes FHG. Los aspectos sobre los que decidimos trabajar inicialmente evaluando

la ocurrencia de posibles alteraciones en comparación con las estirpes silvestres fueron:

(1) la capacidad de crecimiento saprofítico, (2) la sensibilidad frente a condiciones de estrés

nitrosativo, (3) la germinación de los microconidios y (4) la agresividad sobre judía.

Para la caracterización fisiológica de las cepas mutantes en cada gen FHG en comparación

con la correspondiente estirpe silvestre se seleccionaron en cada caso dos cepas mutantes

independientes, como hemos indicado anteriormente. El objeto de incluir dos cepas

mutantes independientes de cada gen en cada estirpe es comprobar que, en el caso de

detectar una variación dada en relación con la cepa silvestre en alguna de las cepas

mutantes, ésta es observada también en la segunda cepa mutante alterada en el mismo

gen. En una primera aproximación, la consistencia de las observaciones realizadas en

ambas cepas mutantes para un gen dado permite adscribir el fenotipo observado a la

mutación introducida. La Tabla 22 presenta las cepas mutantes seleccionadas en nuestro

Resultados

- 139 -

análisis de posibles alteraciones fisiológicas, indicando la cepa tipo silvestre de la que

derivan, el gen que ha sido eliminado en cada caso y el código que le ha sido asignado.

En todos los análisis llevados a cabo y que se describen a continuación las dos cepas

mutantes fueron comparadas con la correspondiente cepa silvestre en experimentos que

fueron repetidos al menos en tres ocasiones.

Tabla 22. Estirpes silvestres y cepas mutantes ΔFHG generadas en este trabajo y seleccionadas para su análisis fisiológico.

WT ∆FHG1 ∆FHG2 ∆FHG3 ∆FHG4

FOP-SP1 ∆FHG1-130 ∆FHG2-51 ∆FHG3-812 ∆FHG4-619

∆FHG1-131 ∆FHG2-61 ∆FHG3-818 ∆FHG4-637

FOP-SP4 ∆FHG1-239 ∆FHG2-314 ∆FHG3-705 ∆FHG4-508

∆FHG1-244 ∆FHG2-315 ∆FHG3-728 ∆FHG4-516

3.8.1 Análisis de la capacidad de crecimiento saprofítico y de la

sensibilidad a estrés nitrosativo de los mutantes ∆FHG

En primer lugar se evaluó la capacidad de crecimiento saprofítico de las cepas mutantes

en comparación con su correspondiente cepa tipo silvestre en ausencia y en presencia de

un donador de NO. La valoración del crecimiento saprofítico en ausencia de donador de

NO y, por lo tanto, la presencia de NO exógeno, nos proporcionará, en primer lugar,

información sobre posibles alteraciones nutricionales o de desarrollo que pudieran

derivarse de la mutación analizada en cada caso y, en segundo lugar, un estado de

referencia para evaluar un posible aumento en la sensibilidad frente a condiciones de

estrés nitrosativo generadas por la adición de NO exógeno y derivada de la eliminación de

una enzima flavohemoglobina dada.

Para el análisis de crecimiento saprofitico y sensibilidad frente a estrés nitrosativo se

utilizaron placas de medio de cultivo sólido. El medio de cultivo basal elegido fue medio

mínimo suplementado con 1 % glucosa (MMG). Como fuente de nitrógeno se utilizó bien

amonio, bien nitrato (ver en la sección 2.2.2.1 de Materiales y Métodos). Las cepas

seleccionadas fueron precultivadas en los medios antes mencionados en cada caso y a

partir del borde de crecimiento de la colonia se tomaron cilindros de agar con micelio en

crecimiento activo de 5 mm de diámetro que fueron transferidos al centro de las placas con


- 140 -

medio de cultivo fresco. En un caso y otro, es decir, en MMG+A o MMG+N, las distintas

cepas analizadas fueron cultivadas en ausencia y en presencia del donador de NO (SNP

500 µM). En cada experimento, para cada cepa (mutante y tipo silvestre) se sembraron

tres placas de Petri y el crecimiento fue evaluado estimando el diámetro medio de la colonia

en crecimiento a los 2, 3, 4 y 5 días. El ensayo de evaluación de crecimiento en cada

condición fue repetido al menos tres veces y los datos registrados fueron analizados

estadísticamente mediante análisis de varianza (ANOVA) y la discriminación de medias

con el test de Tukey (p<0,05). Las diferencias estadísticas entre cepas de tipo silvestre y

las distintas cepas mutantes ∆FHG en ausencia y presencia de NO exógeno se analizaron

mediante un análisis pareado con t-test de Student´s (p<0,05).

3.8.1.1 Análisis de mutantes ΔFHG de FOP-SP1

La Figura 41 muestra los resultados obtenidos en el análisis de crecimiento saprofitico de

los mutantes ∆FHG seleccionados en comparación con la cepa silvestre FOP-SP1. En el

Panel 41A los datos presentados son los derivados del cultivo de las distintas cepas en

medio suplementado con amonio como fuente de nitrógeno. El Panel 41B presenta los

datos obtenidos sobre medio suplementado con nitrato como fuente de nitrógeno. El

estudio de estos resultados ofrece varios elementos de información. En primer lugar, en

ambos medios de cultivo, MMG+A y MMG+N, y en ausencia de donador de NO, el

comportamiento de todas las cepas mutantes consideradas es similar al de la cepa

silvestre. El análisis estadístico (ANOVA) demuestra que no existen diferencias

significativas (p<0,05) en ningún caso entre los valores medios de diámetro de la colonia

obtenidos en el caso de las cepas mutantes consideradas y la cepa FOP-SP1. Por lo tanto,

la capacidad de crecimiento saprofítico de las cepas mutantes analizadas no se ve alterada

de forma significativa como consecuencia de las mutaciones en los genes FHG1, FHG2,

FHG3 o FHG4.

En segundo lugar, se comprueba que la cepa silvestre FOP-P1 es sensible a las

condiciones de estrés nitrosativo que impone la adición de NO (SNP 500 µM). Tanto en

medio con amonio como en medio con nitrato se detectan diferencias significativas (p<0,05,

t-test de Student) en el diámetro medio de colonia de la cepa FOP-SP1 en ausencia y en

presencia de NO. En medio con amonio la adición del donador de NO determina una

reducción del diámetro de la colonia de un 17,3 % y en medio con nitrato una reducción del

12,96 %. Esta reducción de crecimiento ofrece una herramienta de cuantificación de la

sensibilidad de FOP-SP1 al NO.

Resultados

- 141 -

En tercer lugar, las dos cepas mutantes deficientes en el gen ΔFHG1 (130 y 131) y las dos

cepas mutantes deficientes en el gen ΔFHG2 (51 y 61) muestran un fenotipo de

hipersensibilidad a las condiciones de estrés nitrosativo utilizadas en este trabajo. Tanto

en medio con amonio como en medio con nitrato las cepas mutantes indicadas muestran

diferencias significativas significativas (p<0,05, t-test de Student) en el diámetro de la

colonia en ausencia y en presencia de NO, presentando una reducción de crecimiento en

presencia de NO superior a la observada en la cepas tipo silvestre correspondiente. Se

comprueba que la reducción en el diámetro de la colonia observado en presencia de SNP

en medio suplementado con amonio es muy superior a la que muestra la propia cepa tipo

silvestre FOP-SP1, con una reducción del 36,73 % en el caso de la cepa ΔFHG1-130, un

40 % en el caso de la cepa ΔFHG1-131, un 33,33 % en el caso de la cepa ΔFHG2-51 y un

30,76 % en el caso de la cepa ΔFHG2-61. Las diferencias en el diámetro de la colonia entre

estas cuatro cepas no son significativas, aunque de forma consistente las dos cepas

deficientes en el gen FHG1 muestra un mayor grado de sensibilidad al donador de NO que

las dos cepas deficientes en el gen FHG2. En medio suplementado con nitrato también se

observa hipersensibilidad a estrés nitrosativo en estas cuatro cepas mutantes, si bien en

un grado ligeramente inferior (la reducción en el diámetro de la colonia observado en este

caso es de 33,33 % y 30,76 %, para los mutantes ΔFHG1-130 y ΔFHG1-131,

respectivamente, y de 26,79 % y 23,64 %, para los mutantes ΔFHG2-51 y ΔFHG2-61,

respectivamente).

Finalmente, las dos cepas mutantes deficientes en el gen ΔFHG3 (812 y 818) y las dos

cepas mutantes deficientes en el gen ΔFHG4 (619 y 637) no muestran hipersensibilidad a

condiciones de estrés nitrosativo en medio suplementado con amonio, ya que en estas

cuatro cepas el diámetro medio de la colonia en presencia de donador de óxido nítrico (NO)

no presenta diferencias significativas con el diámetro de la colonia en ausencia de NO

(Figura 41A). En presencia de nitrato como fuente de nitrógeno las dos cepas mutantes

deficientes en el gen ΔFHG3 y las dos cepas mutantes deficientes en el gen ΔFHG4

tampoco muestran sensibilidad a NO en comparación con las cepas cultivadas en ausencia

de NO (Figura 41B). En la Figura 42 se muestran los porcentajes de reducción del diámetro

de colonia en presencia de NO (500 µM de SNP) en los mutantes ΔFHG y en la cepa

control SP1 considerando los datos presentados en las Figuras 41A y 41B.


- 142 -

Figura 41. Crecimiento radial de las cepas mutantes en los genes FHG de FOP-SP1 y de la cepa control FOP-SP1 evaluados a los 5 días de crecimiento saprofitico. (A) cultivos en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de tartrato de amonio (MMG+A) y MMG+A en presencia de 500 µM de SNP (donador de NO exógeno). (B) cultivos en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de nitrato de sodio (MMG+N) y MMG+N en presencia de 500 µM de SNP (donador de NO exógeno). Los histogramas de la izquierda en los Paneles A y B en medios de cultivo MMG+A y MMG+N en ausencia del donador de NO fueron analizados estadisticamente mediante un análisis ANOVA y la discriminación de medias se realizó con el test de Tukey (p<0,05). En los histogramas de la derecha en los Paneles A y B se muestra el análisis estadístico pareado en cada cepa (tipo silvestre y mutantes) en ausencia y presencia de NO (SNP) con el t-test de Student´s (*p<0,05), (**p<0,01), (***p<0,001).

Resultados

- 143 -

Figura 42. Porcentajes de reducción del diámetro de la colonia de las cepas mutantes ∆FHG de FOP-SP1 y de la cepa tipo silvestre SP1. Panel A: Porcentajes de reducción del diámetro de la colonia en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de tartrato de amonio (MMG+A) en presencia de 500 µM de SNP (donador de NO exógeno). Panel B: Porcentajes de reducción del diámetro de la colonia en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de nitrato de sodio (MMG+N) en presencia de 500 µM de SNP (donador de NO exógeno).

3.8.1.2 Análisis de mutantes ΔFHG de FOP-SP4

Se llevó a cabo el mismo tipo de análisis para la caracterización de las cepas mutantes

deficientes en los genes FHG1, FHG2, FHG3 o FHG4 de la cepa FOP-SP4. En la Figura

43 se presentan los resultados obtenidos en estos análisis.

El estudio de la Figura 43A demuestra que la situación en la cepa FOP-SP4 y sus

transformantes es muy similar a la descrita en la cepa FOP-SP1 y en sus cepas derivadas.

Comprobamos que en cualquiera de las dos fuentes de nitrógeno consideradas, en

ausencia de NO exógeno las cepas mutantes no muestran diferencias significativas en su

capacidad de crecimiento saprofítico en relación con la cepa tipo silvestre. Comprobamos

también que la cepa silvestre FOP-SP4 muestra sensibilidad a NO en los dos medios

considerados (con amonio y con nitrato), ya que el diámetro medio de la colonia se reduce

significativamente (p<0,05, t-test de Student) en presencia del donador de NO. En este


- 144 -

caso la reducción de crecimiento observada en medio con amonio, de un 15,09 %, es de

menor magnitud que en el caso de la cepa FOP-SP1 (17,3 %). En medio con nitrato la

reducción de crecimiento determinada en la cepa FOP-SP4, 17,2 %, es superior a la

observada para la cepa FOP-SP1 (12,96 %). Por lo tanto, es posible concluir que ambas

cepas tipo silvestre son sensibles a NO y en similar medida, mostrando diferencias

menores en función de la fuente de nitrógeno en presencia de la cual una y otra son

cultivadas.

Comprobamos, además, que las cepas mutantes deficientes en el gen FHG1 (239 y 244)

y las cepas mutantes alteradas en el gen FHG2 (314 y 315) muestran hipersensibilidad

frente a condiciones de estrés nitrosativo. Tanto en amonio como en nitrato como fuente

de nitrógeno estas cepas muestran diferencias significativas en el diámetro de la colonia

(p<0,05, t-test de Student) en presencia de NO en relación con su comportamiento en

ausencia de NO. En comparación con las cepas equivalentes en el fondo genético de FOP-

SP1, se observa que el grado de reducción de crecimiento en las cepas mutantes ΔFHG1

y ΔFHG2 es ligeramente menor que en aquéllas. Así, en presencia de amonio la reducción

de diámetro medio de la colonia en condiciones de estrés nitrosativo es del 32,65 % para

la cepa ΔFHG1-239, y 34,69 % para la cepa ΔFHG1-244, 20,83 % para la cepa ΔFHG2-

314 y 20,41 % para la cepa ΔFHG2-315. En presencia de nitrato las reducciones

observadas son 31,48 % para ΔFHG1-239 y 34,54 % para ΔFHG1-244. Para las cepas

ΔFHG2-314 y ΔFHG2-315 las reducciones observadas son del 20,75 % y 19,31 %,

respectivamente (ver Figura 43A y 43B).

Finalmente, el análisis estadístico demuestra que no hay diferencias significativas (p<0,05,

t-test de Student) en la reducción del diámetro medio de la colonia entre los mutantes de

los genes ∆FHG3 y ∆FHG4 en la comparación llevada a cabo en presencia y en ausencia

del donador de NO.

En la Figura 44 se muestran los porcentajes medios de reducción del diámetro de colonia

en presencia de NO (500 µM de SNP) en los mutantes ΔFHG de SP4 y en la cepa control

SP4 considerando los datos presentados en las Figuras 43A y 43B.

En resumen, del análisis de la capacidad de crecimiento saprofitico y la evaluación de la

sensibilidad a condiciones de estrés nitrosativo de las cepas tipo silvestre FOP-SP1 y FOP-

SP4 y de los mutantes FHG de una y otra se derivan las siguientes conclusiones: (1) Las

mutaciones analizadas no afectan a funciones metabólicas básicas relacionadas con la

Resultados

- 145 -

capacidad de crecimiento saprofítico de las cepas FOP-SP1 y FOP-SP4; (2) FOP-SP1 y

FOP-SP4 son sensibles a condiciones de estrés nitrosativo, FOP-SP1 en mayor medida

que FOP-SP4; (3) en ambas cepas la función de los genes FHG1 y FHG2 está relacionada

con la capacidad de las FHG correspondientes para detoxificar NO exógeno; (4) en ambas

cepas la función de los genes FHG3 y FHG4 no está relacionada con la capacidad de las

FHG correspondientes para detoxificar NO exógeno, al menos en las condiciones

utilizadas.

Figura 43. Crecimiento radial de las cepas mutantes en los genes FHG de FOP-SP4 y de la cepa control FOP-SP4 evaluados a los 5 días de crecimiento saprofitico. (A) cultivos en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de tartrato de amonio (MMG+A) y MMG+A en presencia de 500 µM de SNP (donador de NO exógeno). (B) cultivos en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de nitrato de sodio (MMG+N) y MMG+N en presencia de 500 µM de SNP (donador de NO exógeno). Los histogramas de la izquierda en los paneles A y B en medios de cultivo MMG+A y MMG+N en ausencia del donador de NO fueron analizados estadísticamente mediante un análisis ANOVA y la discriminación de medias se realizó con el test de Tukey (p<0,05). Los histogramas de la derecha en los Paneles A y B se muestra el análisis estadístico pareado dela cepa de tipo silvestre y de las distintas cepas mutantes en ausencia y presencia de NO (SNP) con el t-test de Student´s (*p<0,05), (**p<0,01), (***p<0,001).


- 146 -

Figura 44. Porcentajes de reducción del diámetro de la colonia de las cepas mutantes ∆FHG de FOP-SP4. Panel A: Porcentajes de reducción del diámetro de la colonia en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de tartrato de amonio (MMG+A) en presencia de 500 µM de SNP (donador de NO exógeno). Panel B: Porcentajes de reducción del diámetro de la colonia en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de nitrato de sodio (MMG+N) en presencia de 500 µM de SNP (donador de NO exógeno).

3.8.2 Análisis de germinación de microconidios de mutantes ΔFHG

A continuación nos propusimos evaluar los efectos que pudiera tener el NO exógeno sobre

la germinación de microconidios en las cepas silvestres FOP-SP1 y FOP-SP4 y en las

cepas mutantes en los genes FHG de cada una de ellas. Con este objeto se diseñó una

aproximación experimental que permitiera cuantificar la germinación de microconidios a lo

largo del tiempo en las cepas consideradas, evaluando el efecto de la fuente de nitrógeno

(amonio o nitrato) y de la presencia o no de NO en el medio de cultivo mínimo líquido.

En este estudio se incluyeron las mismas cepas analizadas en la sección anterior en

relación con la capacidad de crecimiento saprofitico en medio sólido. Las dos estirpes tipo

silvestre, FOP-SP1 y FOP-SP4, y las dos cepas mutantes independientes en cada gen

FHG fueron cultivados en medio líquido tal y como se describe en la sección 2.2.2.2 de

Materiales y Métodos. El medio mínimo fue suplementado con tartrato de amonio (10 mM)

Resultados

- 147 -

o con nitrato de sodio (10 mM) en presencia y en ausencia de donador de NO. En estos

experimentos se utilizó como donador de oxido nítrico DETA (250 µM) en lugar de

nitroprusiato sódico (SNP). DETA-NO dentro del grupo de los donadores de NO es el de

mejor calidad y pureza, libera NO de forma lenta pero continua durante más tiempo, a

diferencia del donador de NO nitroprusiato sódico (SNP) que libera elevadas cantidades

de NO y durante periodos cortos de tiempo, y no provoca efectos secundarios dañinos para

la célula, en medio acuoso produce ion cianuro y posteriormente tiocianato que son

compuestos altamente tóxicos para la supervivencia de la célula (Moncada et al., 1991;

Perazzolli et al., 2004). La germinación de los microconidios se evaluó a las 4, 6, 8, 10 y

12 horas. En cada momento considerado se llevaron a cabo los recuentos considerando

como microconidios germinados aquéllos que presentaron un tubo germinativo con una

longitud igual o superior al tamaño del microconidio no germinado. Se realizaron tres

réplicas con diferentes muestras biológicas tanto de las cepas mutantes como de las cepas

silvestres FOP-SP1 y FOP-SP4. Los datos generados fueron analizados estadísticamente

mediante análisis de varianza (ANOVA) y la discriminación de medias se realizó con el test

de Tukey (p<0,05). Las diferencias estadisticas en las cepas tipo silvestre y en las distintas

cepas mutantes en ausencia y en presencia de NO exógeno se realizó llevando a cabo un

análisis pareado con el t-test de Student´s (p<0,05).

3.8.2.1 Análisis de germinación de microconidios de mutantes

ΔFHG de FOP-SP1

La Figura 45 muestra los resultados obtenidos en el análisis de la germinación de

microconidios de los mutantes SP1-∆FHG seleccionados en comparación con la cepa

silvestre FOP-SP1 a las 10 horas de cultivo. En el Panel A se presentan los datos de la

germinación en medios de cultivo con amonio como única fuente de nitrógeno en ausencia

y presencia de NO (DETA 250 µM). En el Panel B se presentan los datos derivados del

mismo análisis llevado a cabo en medios de cultivo suplementados con nitrato como fuente

de nitrógeno. En ambos medios de cultivo, MMG+A y MMG+N, en ausencia del donador

de NO (DETA) el comportamiento de todas las cepas mutantes consideradas es similar al

de la cepa silvestre y el análisis estadístico demuestra que no existen diferencias

significativas (p<0,05) en la germinación de microconidios entre las cepas mutantes

∆FHG1, ∆FHG2, ∆FHG3 o ∆FHG4 y la cepa FOP-SP1. Por lo tanto, la eficiencia de la

germinación de las cepas mutantes analizadas no se ve alterada de forma significativa

como consecuencia de las mutaciones inducidas en estos genes en ausencia de NO

exógeno.


- 148 -

En la cepa silvestre FOP-SP1 la eficiencia de la germinación de microconidios es afectada

significativamente (p<0,05, T-test de Student) por la presencia de NO (DETA 250 µM) tanto

en medio con amonio como en medio con nitrato, en comparación con los cultivos en

ausencia del donador de NO. En medio con amonio la adición del donador de NO determina

un retraso en la germinación del 19,40 % y en medio con nitrato un retraso del 25,01 %.

En cuanto al comportamiento de los mutantes deficientes en el gen ΔFHG1 (130 y 131) se

observa que en presencia de NO estos mutantes muestran diferencia significativas

(p<0,05, T-test de Student) en medio con amonio en relación con la situación “ausencia de

NO exógeno”, con una reducción en la eficiencia de germinación muy superior a la que

muestra la cepa tipo silvestre FOP-SP1 (83,59 % de reducción en el caso de la cepa

ΔFHG1-130 y un 85,67 % en el caso de la cepa ΔFHG1-131 (Panel 45A). En este medio

los mutantes ΔFHG2, ΔFHG3 y ΔFHG4, también muestran un retraso en la germinación

en relación con la situación observada en ausencia de NO, pero este retraso tiene la misma

magnitud que el observado en la cepa silvestre (el análisis estadístico agrupa estas seis

cepas mutantes con la cepa silvestre). Esto supone que el NO afecta a la germinación en

FOP-SP1, determinando un retraso de la misma, y que probablemente la flavohemoglobina

codificada por FHG1 juega un papel fundamental en la eliminación del NO que retrasa la

germinación. Las flavohemoglobinas codificadas por los genes FHG2, FHG3 y FHG4 no

tienen un papel importante en la eliminación del NO que afecta a la germinación.

En medio con nitrato la situación que se observa cuando se añade el donador de NO es

similar a la descrita en medio con amonio, pero con algunas diferencias importantes. En

este caso en general el efecto de la adición de NO es más evidente (la reducción en el

porcentaje de germinación en las distinas cepas analizadas es mayor). Las cepas que

manifiestan una mayor reducción, como en el caso anterior, son las cepas mutantes

deficientes en el gen FHG1 y las que muestran una menor reducción son las cepas

deficientes en el gen FHG3 y las cepas deficientes en el gen FHG4 (que se comportan

como la cepa silvestre FOP-SP1). Las cepas deficientes en el gen FHG2 muestran un

comportamiento particular en este medio de cultivo, mostrando diferencias significativas en

la condición “presencia de NO” en relación con la condición “ausencia de NO”, con una

reducción intermedia en el porcentaje de germinación con valores intermedios entre las

correspondientes cepas ΔFHG1 y las correspondientes a los de las las cepas ΔFHG3 y

ΔFHG4 (que son iguales al de la cepa silvestre). De hecho, el análisis estadísitico detecta

la existencia de diferencias significativas (p<0,05, T-test de Student) entre medias en el

conjunto de cepas analizadas y genera un grupo particular que incluye a estas dos cepas

Resultados

- 149 -

mutantes, ΔFHG2-51 y ΔFHG2-61, diferentes a los otros dos grupos, con una reducción

de la germinación del 59,80 % para ΔFHG2-51 y para ΔFHG2-61 una reducción del

60,76%.

Figura 45. Efecto del NO en la germinación de microconidios de los mutantes de los genes FHG de FOP-SP1 y de la propia cepa silvestre FOP-SP1, evaluadas a las 10 horas de cultivo. (A) cultivos en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de tartrato de amonio (MMG+A) y MMG+A en presencia de 250 µM DETA. (B) cultivos en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de nitrato de sodio (MMG+N) y MMG+N en presencia de 250 µM DETA. Los histogramas de la izquierda en los Paneles A y B en medios de cultivo MMG+A y MMG+N en ausencia del donador de NO fueron analizados estadísticamente mediante un análisis ANOVA y la discriminación de medias se realizó con el test de Tukey (p<0,05). En los histogramas de la derecha en los Paneles A y B se muestra el análisis estadístico pareado en la cepa de tipo silvestre y en las distintas cepas mutantes en ausencia y presencia de NO (DETA) con el t-test de Student (*p<0,05; ***p<0,001).


- 150 -

En la Figura 46 se muestran los porcentajes de reducción de la germinación de

microconidios en los mutantes de los genes FHG, en presencia de 250 µM de DETA en

relación con las cepas control en ausencia del donador de NO. Los porcentajes mostrados

confirman que, efectivamente, el NO afecta a la germinación y que la flavohemoglobina

FHG1 es la enzima detexoficadora de NO que juega un papel más importantes en la

eliminación del NO que afecta a la germinación, pero en función de la fuente de nitrógeno

presente en el medio de cultivo la flavohemoglobina FHG2 también participa en esta

detoxificación: no lo hace en presencia de amonio pero sí en presencia de nitrato.

Figura 46. Porcentajes de reducción de la germinación de microconidios de las cepas mutantes ∆FHG de FOP-SP1. Panel A: Porcentajes de reducción de germinación en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de tartrato de amonio (MMG+A) en presencia de 250 µM DETA. Panel B: Porcentajes de reducción de germinación en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de nitrato de sodio (MMG+N) en presencia de 250 µM DETA.

3.8.2.2 Análisis de germinación de microconidios de mutantes

ΔFHG de FOP-SP4

En la Figura 47 se presentan los datos de germinación en la cepa FOP-SP4 y en los

transformantes derivados de ésta en medio suplementado con amonio (Panel A) y en

medio suplementado con nitrato (Panel B). El análisis estadístico ANOVA muestra que,

Resultados

- 151 -

tanto en presencia de amonio como de nitrato como única fuente de nitrógeno, en ausencia

de NO exógeno las cepas mutantes no muestran diferencias significativas (p<0,05) en su

eficiencia de germinación en relación con la cepa tipo silvestre. La adición de NO al medio

de cultivo determina una reducción importante en el porcentaje de germinación observado

en la cepa silvestre en ambos medios de cultivo (diferencias significativas en ambos casos

p<0,05, t-test de Student), reducción que es superior a la observada en el caso de la cepa

FOP-SP1 en las mismas condiciones (en medio con amonio es de un 34,88 % y en medio

con nitrato es del 36,51 %). Por lo tanto, es posible deducir que la cepa FOP-SP4 es más

sensible a NO en relación con el efecto que éste tiene sobre germinación que la cepa FOP-

SP1, tanto en medio con amonio como en medio con nitrato.

Figura 47. . Efecto del NO en la germinación de microconidios de los mutantes de los genes FHG de FOP-SP4 y de la propia cepa silvestre FOP-SP4, evaluadas a las 10 horas de cultivo. (A) Cultivos en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de tartrato de amonio (MMG+A) y MMG+A en presencia de 250 µM DETA. (B) Cultivos en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de nitrato de sodio (MMG+N) y MMG+N en presencia de 250 µM DETA. Los histogramas de la izquierda en los Paneles A y B en medios de cultivo MMG+A y MMG+N en ausencia del donador de NO fueron analizados estadísticamente mediante un análisis ANOVA y la discriminación de medias se realizó con el test de Tukey (p<0,05). En los histogramas de la derecha de los Paneles A y B se muestra el análisis estadístico pareado en la cepa de tipo silvestre y en las distintas cepas mutantes en ausencia y presencia de NO (DETA) con el t-test de Student (**p<0,01; ***p<0,001).


- 152 -

Establecida esta diferencia de sensibilidad de la cepa FOP-SP4 en comparación con la

cepa FOP-SP1, el análisis global de los datos generados en la situación “presencia de NO”

demuestra que el comportamiento de las correspondientes cepas mutantes deficientes en

cada uno de los cuatro genes FHG en la cepa FOP-SP4 es el mismo que el observado en

el caso de los mutantes en la cepa FOP-SP1. Así, en medio con amonio es la

flavohemoglobina codificada por FHG1 la enzima que probablemente es la responsable de

la detoxificación del NO que afecta a la germinación. En medio con nitrato, además de

FHG1, la flavohemoglobina codificada por el gen FHG2 parece tener un papel relevante en

la detoxificación de NO.

En la Figura 48, se presenta un resumen de los porcentajes de reducción de la germinación

de microconidios de las distintas cepas mutantes en los genes FHG derivados de la cepa

FOP-SP4 de la que se derivan los respectivos mutantes, en medios de cultivo con amonio

y nitrato en ausencia y en presencia de 250 µM DETA y mostrados en las Figuras 47A y

47B.

Figura 48. Porcentajes de reducción de la germinación de microconidios de las cepas mutantes ∆FHG de FOP-SP4. Panel A: Porcentajes de reducción de germinación en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de tartrato de amonio (MMG+A) en presencia de 250 µM DETA. Panel B: Porcentajes de reducción de germinación en medio mínimo con 1 % de glucosa, suplementado con 10 mM de nitrato de sodio (MMG+N) en presencia de 250 µM DETA.

Resultados

- 153 -

3.8.3 Ensayos de infección in planta con los mutantes ΔFHG

Los trabajos descritos en las secciones anteriores indican que las FHG codificadas por al

menos dos de los genes analizados, FHG1 y FHG2, desempeñan una función relevante en

la detoxificación de NO exógeno y en la resistencia a condiciones de estrés nitrosativo.

Además, el análisis de la eficiencia y dinámica de germinación de las cepas mutantes

correspondientes demuestra que el NO tiene un efecto notable sobre la germinación de los

microconidios, y que este efecto parece estar modulado por las enzimas de tipo

flavohemoglobina codificadas por estos dos genes. Teniendo en cuenta que el NO es

producido por la planta durante la interacción con distintos tipos de patógenos y que su

función como molécula señalizadora y ejecutora que coordina y orquesta la respuesta

defensiva de la planta es esencial (Arasimowicz‐Jelonek & Floryszak‐Wieczorek, 2014),

decidimos evaluar la agresividad de los mutantes ΔFHG de FOP-SP1 y FOP-SP4 durante

las interacciones que una y otra cepa establecen con el huésped. Para ello diseñamos una

serie de ensayos de infección de plantas de judía variedad “blanca riñón” que fueron

llevados a cabo siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 2.5.1 de Materiales y

Métodos.

En cada ensayo de infección se inocularon 10 plantas de judía con cada estirpe silvestre

considerada, FOP-SP1 y FOP-SP4, y 10 plantas con cada una de las cepas mutantes

seleccionadas (las mismas cepas mutantes analizadas en las secciones anteriores (Tabla

23). Los síntomas y el progreso de la enfermedad fueron evaluados en las plantas

inoculadas con las cepas mutantes y comparadas con los síntomas y el progreso de la

enfermedad en las plantas inoculadas con las estirpes silvestres de las que derivan los

mutantes. El ensayo con cada estirpe fue repetido 3 veces en plantas infectadas con

diferentes lotes de microconidios. El progreso de la enfermedad fue evaluado

semanalmente utilizando la escala CIAT, en la cual las plantas que muestran un índice de

1 a 3 son consideradas como resistentes al patógeno mientras que las plantas con un

índice en la escala de 3,1 a 9 son consideradas como susceptibles al patógeno.


- 154 -

Tabla 23. Valores de infección en plantas de judía variedad “Blanca Riñón” inoculadas con las cepas indicadas, estimados según la escala CIAT. En la primera columna se muestran los códigos de las cepas tipo silvestre (FOP-SP1 y FOP-SP4) y de las cepas mutantes utilizadas. En las columnas 2 a 6 se representa el valor medio de la escala CIAT de todas las plantas para el aislado considerado en la semana indicada (± DE). Control: inoculaciones llevadas a cabo con agua.

Los resultados de infección mostrados en la Tabla 23 y en la Figura 49 indican que los

mutantes ∆FHG de FOP-SP1 y de FOP-SP4 no muestran diferencias significativas en su

capacidad de infección de la planta huésped en comparación con la cepa silvestre

correspondiente.

Resultados

- 155 -

Figura 49. Evaluación de la agresividad de los mutantes ∆FHG de FOP-SP1 y FOP-SP4 (ver leyenda) sobre la variedad de judía Blanca Riñón. Como control negativo se utilizaron plantas no infectadas. Se utilizó la escala CIAT (1=planta sana a 9=planta totalmente afectada o muerta) para medir la severidad de los síntomas.

3.9 Ensayos de complementación de la mutación ΔFHG1

Los análisis de expresión llevados a cabo demuestran que FHG1 es el gen codificador de

FHGs que muestra un mayor nivel de inducción en su expresión en respuesta a la

exposición a NO exógeno. Por otra parte, los análisis de sensibilidad a condiciones de

estrés nitrosativo indican que la enzima codificada por este gen es la que juega un papel

más destacado en la resistencia a estrés nitrosativo del patógeno. Finalmente, es en los

mutantes ΔFHG1 en los que el efecto de inhibición de la germinación que observamos es

más evidente. La enzima codificada por FHG1 parece ser, por lo tanto, la enzima más

importante desde el punto de vista funcional en la resistencia a estrés nitrosativo. Para

confirmar que las alteraciones fenotípicas observadas son consecuencia, efectivamente,

de la mutación ΔFHG1, decidimos llevar a cabo un experimento de complementación de la

mutación reintroduciendo la copia silvestre del gen FHG1 en los mutantes SP1-ΔFHG1-

131 y SP4-ΔFHG1-244.

Para ello diseñamos en primer lugar dos oligonucleótidos que permiten amplificar la copia

genómica del gen FHG1. Las secuencias complementarias de estos oligonucleótidos se


- 156 -

encuentran en las regiones flanqueantes del gen FHG1, aproximadamente a 1 kb aguas

arriba del codón de iniciación del gen el primero de ellos, y a 1 kb aguas abajo del codón

de terminación del gen el segundo de ellos.

3.9.1 Construcción del vector de complementación

Los oligonucleótidos COMP-FOXG-17-F y COMP-FOXG-17-R (ver Tabla 6) poseen en su

extremo 5’ un sitio de restricción para las enzimas PacI el primero de ellos y NT.Bbv.CI el

segundo. Con estos oligonucleótidos se amplificó mediante PCR un fragmento de ADN

genómico de FOP-SP1 de 3.6 kb que incluye la región estructural del gen FHG1 y 1 kb de

la región 5’ flanqueante y 1 kb de la región flanqueante 3´. El fragmento fue purificado y

clonado en el vector pGEM-T easy. Posteriormente, el inserto clonado fue liberado

mediante digestión con las enzimas PacI y NT.Bbv.CI, recuperado de gel y ligado al vector

pEA-FU (Figura 5) (previamente linearizado con las enzimas PacI y NT.Bbv.CI) utilizando

el sistema User Friendly Cloning. Con el producto de la ligación se transformaron células

competentes de E. coli cepa DHα5. Entre los transformantes obtenidos se identificó un clon

portador del plásmido buscado, que fue denominado vector de transformación pEA-FU-

FHG1, con un tamaño de 5537 pares de bases (ver Figura 50A y Figura 50B).


El plásmido pEA-FU-FHG1 (Figura 50A) fue introducido en A. tumefacción cepa AGL1

mediante electroporación siguiendo los procedimientos descritos en la sección 2.9.5.2 de

Materiales y Métodos. De entre las colonias transformantes obtenidas con este plásmido

se seleccionó una que fue utilizada para llevar a cabo la transformación de los mutantes

∆FHG1-131 de FOP-SP1 y ∆FHG1-244 de FOP-SP4. La identidad del plásmido presente

en la colonia seleccionada fue verificada mediante PCR utilizando oligonucleótidos

específicos de las regiones flanqueantes y de la región codificante del gen FHG1.

Resultados

- 157 -

Figura 50. Panel A: Mapa de restricción del plásmido pEA-FU-FHG1 utilizado para la complementación de la mutación ΔFHG1. El fragmento de ADN que incluye la región codificante del gen FHG1, su región promotora y su región terminadora, fue amplificado con los cebadores COMP-FOXG-17-F y COMP-FOXG-17-R. El plásmido incluye el gen ble de resistencia a fleomicina para la selección de transformantes en F. oxysporum. Panel B: Representación detallada de la construcción generada para la complementación de la mutación ΔFHG1 en la que se indica la ubicación de los oligonucleótidos utilizados para la discriminación de transformantes que han incorporado la construcción para la complementación de la mutación ΔFHG1.

3.9.3 Transformación de mutantes ∆FHG1 de FOP-SP1 y FOP-SP4



transformó el mutante ∆FHG1-131 de la estirpe FOP-SP1 y el mutante ∆FHG1-244 de la

estirpe FOP-SP4. Los transformantes primarios que fueron apareciendo en las placas de

medio selectivo en presencia de fleomicina fueron transferidos individualmente a placas de

PDA con 400 a 600 µg/ml de fleomicina e incubados durante 5 días a 25ºC. De la estirpe

∆FHG1-131 se seleccionaron 10 transformantes resistentes a fleomicina y de la estirpe

∆FHG1-244 se seleccionaron 8 transformantes.

3.9.4 Identificación de transformantes que han incorporado la

construcción de complementación

La discriminación de transformantes que habían incorporado la copia silvestre del gen

FHG1 se realizó mediante PCR con los cebadores FHG1-FW y FHG1-RV, que permiten


- 158 -

amplificar un fragmento de 481 pares de bases derivado de la región codificante del mismo.

La Figura 51A, muestra los productos de amplificación obtenidos utilizando como ADN

molde en las reacciones de PCR ADN genómico de dos transformantes obtenidos en la

estirpe SP1-ΔFHG1-131, los identificados con los códigos SP1-ΔFHG1-131-C1 y SP1-

ΔFHG1-131-C2. En las carreras correspondientes se visualiza el fragmento de ADN del

tamaño esperado (481 nt), el del fragmento amplificado en la reacción preparada utilizando

como ADN molde ADN genómico de la estirpe silvestre FOP-SP1 y ausente en la reacción

de PCR preparada utilizando como ADN molde ADN genómico de la estirpe mutante SP1-

ΔFHG1-131. En la Figura 51B se presenta el análisis correspondiente llevado a cabo sobre

dos transformantes candidato obtenidos en la estirpe SP4-ΔFHG1-244, los identificados

con los códigos SP4-ΔFHG1-244-C1 y SP4-ΔFHG1-244-C2. La amplificación del

fragmento esperado es indicativa de la reintroducción del alelo silvestre del gen FHG1 en

ambas estirpes mutantes.

Las cuatro cepas seleccionadas como candidatas fueron sometidas a un análisis tipo

Southern. Éstas fueron cultivadas en medio de cultivo PDB y a partir del micelio recogido

se extrajo ADN genómico que fue utilizado en el análisis de tipo Southern. Las muestras

de ADN genómico fueron digeridas con la enzima HindIII, que no presenta sitios de

restricción dentro de la construcción de transformación, y como sonda de hibridación se

utilizó un fragmento de ADN derivado de la región 5’ flanqueante del gen FHG1, amplificado

y marcado mediante PCR utilizando los oligonucleótidos FHG175 y RHG175, que permite

detectar tanto el alelo silvestre del gen FHG1 como el alelo mutante derivado del

reemplazamiento del alelo silvestre del gen FHG1.

La Figura 51 muestra los patrones de hibridación obtenidos en el análisis de los

transformantes candidatos obtenidos en la cepa SP1-ΔFHG1-131 (Panel B) y de los

transformantes candidatos obtenidos en la cepa SP4-ΔFHG1-244 (Panel D). Se

comprueba que en ambos casos, es decir, tanto en las cepas derivadas del mutante SP1-

ΔFHG1-131 como en las cepas derivadas del mutante SP4-ΔFHG1-244, es posible

detectar la banda de hibridación que representa el alelo mutante (consecuencia del

reemplazamiento génico), la de mayor tamaño, y una segunda banda de menor tamaño

que representa el alelo silvestre introducido mediante transformación clonado en el

plásmido pEA-FU-FHG1, y que está ausente en las cepas mutantes SP1-ΔFHG1-131 y

SP4-ΔFHG1-244. En la cepa SP1-ΔFHG1-131-C2 comprobamos que la banda

correspondiente al alelo silvestre detectada en la cepa SP1-ΔFHG1-131-C1 no está

presente, lo que supone que esta cepa constituye un falso positivo identificado en el

Resultados

- 159 -

análisis mediante PCR, pero que no puede ser considerado como una cepa en la que se

ha reintroducido el alelo silvestre FHG1.

Llevado a cabo este análisis fueron seleccionados para su análisis funcional posterior un

representante de cada pareja de transformantes analizados, concretamente el

transformante SP1-ΔFHG1-131-C1 de FOP-SP1 y el transformante SP4-ΔFHG1-244-C1

de FOP-SP4.

Figura 51. Identificación de los transformantes de las cepas SP1-ΔFHG1-131 y SP4-ΔFHG1-244 que han incorporado el gen FHG1 mediante transformación con el plásmido pEA-FU-FHG1. Panel A: Productos de PCR amplificados con los cebadores FHG1-FW y FHG1-RV utilizando ADN genómico de los transformantes seleccionados, SP1-ΔFHG1-131-C1 y SP1-ΔFHG1-131-C2 (carriles 1 y 2), de la cepa mutante SP1-ΔFHG1-131 no transformada (carril 3) y de la estirpe silvestre FOP-SP1 (Carril 4). Carril M: marcador de peso molecular 1 kp plus DNA ladder (Invitrogen) Panel B: Análisis Southern de los transformantes seleccionados SP1-ΔFHG1-131-C1 y SP1-ΔFHG1-131-C2 (carriles 1 y 2), de la cepa mutante SP1 -ΔFHG1-131 (carril 3) y cepa silvestre FOP-SP1 (carriles 4). Panel C: Productos de PCR amplificados con los cebadores FHG1-FW y FHG1-RV utilizando ADN genómico de transformantes seleccionados, SP4-ΔFHG1-244-C1 y SP4-ΔFHG1-244-C2 (carriles 1 y 2), de la cepa mutante SP4-ΔFHG1-244 no transformada (carril 3) y de la estirpe silvestre SP4 (Carril 4). Carril M: marcador de peso molecular 1 kp plus DNA ladder (invitrogen). Panel D: Análisis Southern de los transformantes seleccionados, SP4-ΔFHG1-244-C1 y SP4-ΔFHG1-244-C2 (carriles 1 y 2), de la cepa mutante SP4-ΔFHG1-131 (carril 3) y de la cepa silvestre FOP-SP4 (carril 4). En las hibridaciones cuyos resultados se presentan en los paneles B y D, el ADN genómico fue digerido con la enzima HindIII y la sonda utilizada fue una sonda derivada del extremo 5’ flanqueante del gen FHG1.


- 160 -

3.9.5 Análisis fenotípico de los mutantes portadores de la

construcción de complementación de la mutación ΔFHG1

El fenotipo de los transformantes seleccionados en los que se había reintroducido el alelo

silvestre del gen FHG1 fue comparado con el de las cepas silvestres correspondientes y

con el de sus cepas mutantes ΔFHG1, en relación con los dos aspectos fisiológicos

considerados inicialmente, es decir, la sensibilidad a condiciones de estrés nitrosativo y la

eficiencia de germinación. Este análisis se llevó a cabo en las mismas condiciones

experimentales y aplicando los mismos procedimientos utilizados entonces. Así, para la

evaluación de la sensibilidad a estrés nitrosativo las cepas analizadas fueron cultivadas en

placas de Petri con medios MMG+A y MMG+N sólidos, en presencia y en ausencia del

donador de NO (SNP 500 µM). Para cada cepa y condición de cultivo se prepararon 3

placas y el crecimiento de cada colonia fue evaluado a los 4 y 5 días de cultivo. Para la

evaluación de la eficiencia de germinación las suspensiones de microconidios de las cepas

analizadas fueron cultivadas en medios MMG+A y MMG+N líquidos en presencia y en

ausencia del donador de NO (250 µM DETA) y los recuentos se efectuaron a las 10 horas

de cultivo. El experimento fue repetido tres veces.

En la figura 52 se presentan los resultados obtenidos en la evaluación de la sensibilidad a

estrés nitrosativo de las cepas SP1-ΔFHG1-131-C1 (Panel A) y SP4-ΔFHG1-244-C1

(Panel B) en comparación con sus respectivas cepas de referencia. Los datos de diámetro

de la colonia fueron tomados a los 5 días de crecimiento saprofitico en las condiciones

indicadas. En su análisis se comprueba que las dos cepas mutantes, SP1-ΔFHG1-131 y

SP4-ΔFHG1-244, y en ambos medios de cultivo (en presencia de amonio y en presencia

de nitrato como fuente de nitrógeno), manifiestan el fenotipo de hipersensibilidad a NO

observado previamente, y que este fenotipo es revertido una vez reintroducido el alelo

silvestre del gen FHG1, ya que el diámetro de colonia de las cepas SP1-ΔFHG1-131-C1 y

SP4-ΔFHG1-244-C1 es igual al de las colonias de las cepas FOP-SP1 (panel A) y FOP-

SP4 (Panel B), respectivamente. Es decir, la reintroducción del alelo silvestre permite

restaurar el fenotipo silvestre de resistencia a condiciones de estrés nitrosativo. Se puede

deducir, por lo tanto, que la reducción del crecimiento en respuesta a NO exógeno

mostrada por los mutantes SP1-∆FHG1 y SP4-∆FHG1 es consecuencia de la mutación

inducida en el gen FHG1.

Resultados

- 161 -

Figura 52. Evaluación de la sensibilidad a estrés nitrosativo de los mutantes complementados SP1-ΔFHG1-131-C1 y SP4-ΔFHG1-244-C1 cultivados en MMG+A y MMG+N en ausencia y en presencia del donador de NO (500 µM SNP). Panel A: Diámetro de la colonia de las cepas: FOP-SP1 (control), mutante nulo SP1-ΔFHG1-131 y cepa complementada SP1-ΔFHG1-131-C1. Panel B: Diámetro de la colonia de las cepas FOP-SP4 (control), mutante nulo SP4-ΔFHG1-244 y cepa complementada SP4-ΔFHG1-244-C1 en las condiciones indicadas. Los datos presentados corresponden a los valores medios de tres experimentos y sus correspondientes desviaciones estándar. Con los datos de las tres cepas analizadas en cada caso en cada medio y condición se llevó a cabo un análisis ANOVA. Medias con letra diferente en cada combinación son significativamente diferentes (p< 0,05) (test de Tukey).

En la figura 53 se presentan los resultados obtenidos en el análisis de la germinación de

microconidios de las cepas SP1-ΔFHG1-131-C1 (Panel A) y SP4-ΔFHG1-244-C1 (Panel

B) en comparación con sus respectivas cepas de referencia. Estos resultados confirman

también las observaciones realizadas inicialmente, indicando que la exposición a NO

determina una reducción de la germinación de los dos cepas silvestres utilizadas en

nuestro trabajo, FOP-SP1 y FOP-SP4, tanto en presencia de amonio como en presencia

de nitrato. La reducción es más evidente en el caso de los mutantes SP1-ΔFHG1-131 y

SP4-ΔFHG1-244. Los transformantes en los que se ha reintroducido el alelo silvestre del

gen FHG1, SP1-ΔFHG1-131-C1 y SP4-ΔFHG1-244-C1, recuperan los niveles de

germinación característicos de la correspondiente cepa silvestre en cada medio de cultivo.


- 162 -

Figura 53. Evaluación de la eficiencia de germinación de microconidios de los mutantes complementados SP1-ΔFHG1-131-C1 y SP4-ΔFHG1-244-C1 cultivados en MMG+A y MMG+N en ausencia y en presencia del donador de NO (250 µM DETA) tomados a las 10 horas de cultivo. Panel A: Porcentaje de germinación de las cepas FOP-SP1 (control), del mutante nulo SP1-ΔFHG1-131 y de la cepa complementada SP1-ΔFHG1-131-C1 en las condiciones indicadas. Panel B: Porcentaje de germinación de las cepas FOP-SP4 (control), del mutante nulo SP4-ΔFHG1-244 y de la cepa complementada SP4-ΔFHG1-244-C1 en las condiciones indicadas. Los datos presentados corresponden a los valores medios de tres experimentos y sus correspondientes desviaciones estándar. Con los datos de las tres cepas analizadas en cada caso en cada medio y condición se llevó a cabo un análisis ANOVA. Las medias con letra diferente en cada condición son significativamente diferentes (p < 0,05) (test de Tukey).

Teniendo en cuenta la caracterización llevada a cabo en las cepas transformantes en las

que se ha reintroducido el alelo silvestre del gen FHG1 es posible concluir que el fenotipo

de hipersensibilidad a NO que muestran las cepas mutantes en las que este gen ha sido

eliminado, tanto en el fondo genético FOP-SP1 como en el fondo genético FOP-SP4, y

como consecuencia del cual muestran una reducción de crecimiento en medio sólido y una

reducción de la eficiencia de germinación en medio líquido en condiciones de estrés

nitrosativo, es consecuencia exclusivamente de la mutación introducida.

Resultados

- 163 -

3.10 Obtención y caracterización de dobles mutantes ΔFHG2-FHG1RNAi.

El nivel de inducción de la expresión de FHG1 en respuesta a NO exógeno durante la fase

de germinación de las esporas, y el fenotipo de los mutantes ΔFHG1 en las cepas FOP-

SP1 y FOP-SP4, hipersensibles a condiciones de estrés nitrosativo, indican que este gen

codifica la enzima flavohemoglobina que desempeña un papel más relevante en relación

con la resistencia a condiciones de estrés nitrosativo de FOP. El gen FHG2 también

responde a nivel transcripcional a la exposición a NO exógeno, aunque de manera mucho

más limitada. Además, los mutantes ΔFHG2 muestran un cierto aumento en su sensibilidad

a condiciones de estrés nitrosativo, si bien también en este caso de forma mucho más

limitada que los mutantes ΔFHG1. Estas observaciones nos llevaron a plantear la

conveniencia de obtener mutantes dobles alterados simultáneamente en ambos genes,

FHG1 y FHG2, y analizar su fenotipo para determinar en qué medida ambas enzimas

contribuyen a la resistencia a estrés nitrosativo. El patrón de expresión de FHG2 indica que

este gen responde a otros estímulos relacionados con la fuente de carbono, la fuente de

nitrógeno y el desarrollo, además de la exposición a NO exógeno. Es posible asumir que

la enzima flavohemoglobina codificada por FHG2 pueda estar implicada en más de una

función fisiológica.

La primera estrategia experimental consistió en generar, mediante reemplazamiento

génico, mutantes alterados en FHG2 en un fondo genético ΔFHG1 (tanto en la cepa

silvestre FOP-SP1 como en la cepa FOP-SP4). Después de varios intentos de

transformación con resultados negativos (no se obtuvieron transformantes) decidimos

aplicar una estrategia alternativa, basada en silenciamiento génico. En la misma se

consideró inducir el silenciamiento del gen FHG1 sobre el fondo genético de los mutantes

∆FHG2 de FOP-SP1 y FOP-SP4. Para ello, se amplificó una secuencia de la región

codificante del gen FHG1 y se ligó a un vector de silenciamiento que posee dos promotores

en direcciones opuestas cuya actividad genera un ARN bicatenario que es reconocido por el

complejo de silenciamiento Dicer. La aplicación de esta estrategia supuso desarrollar las

siguientes fases y procedimientos: (1) diseño de cebadores para la amplificación de un

fragmento de ADN de la región codificante del gen FHG1 para su clonación en un vector

de silenciamiento; (2) construcción de un vector de silenciamiento en un plásmido portador

de un marcador de resistencia a fleomicina, dado que los mutantes deficientes en el gen

FHG2 ya poseen un gen de resistencia a higromicina B; (3) transformación de E. coli y A.

tumefaciens con los plásmidos generados; (4) transformación de mutantes deficientes en

FHG2 de FOP-SP1 y FOP-SP4 con el vector de silenciamiento; (5) identificación de


- 164 -

transformantes en los que se ha silenciado el gen FHG1; y (6) análisis fisiológico de

mutantes silenciados de FOP-SP1 y FOP-SP4.

3.10.1 Construcción del vector de silenciamiento

Con los cebadores Sil-FHG1-FW Y Sil-FHG1-RV (Tabla 6) (diseñados con un sitio de

restricción NcoI en el extremos 5’ para facilitar su clonación) se amplificó un fragmento de

281 pares de nucleótidos de la región codificante del gen FHG1 (ver Figura 54). Este

fragmento fue purificado y clonado en el vector pGEM-T easy. Una vez liberado del

plásmido derivado mediante la digestión con la enzima NcoI el inserto fue ligado al vector

pVIR-RNAi (Figura 5) (previamente linearizado con la enzima NcoI). Con la mezcla de

ligación se transformó E. coli cepa DHα5. Entre los transformantes obtenidos se identificó

una colonia portadora del plásmido deseado, que recibió el nombre de pVIR-RNAi-FHG1,

cuyo tamaño es de 7535 pares de bases (ver Figura 55A).

Figura 54. Producto de PCR amplificado a partir de ADN genómico de FOP-SP1 con los cebadores Sil-FHG1-FW y Sil-FHG1-RV visualizado en gel de agarosa 2 % (carril 1). Carril (M): Marcador de peso molecular 1 Kb Plus DNA ladder (Invitrogen).


El plásmido pVIR-RNAi-FHG1 (Figura 55A) fue introducido en A. tumefaciens cepa AGL1

mediante electroporación siguiendo los procedimientos descritos en la sección 2.9.5.2 de

Materiales y Métodos. De entre las colonias transformantes obtenidas se seleccionó una

que fue utilizada para llevar a cabo la transformación de los mutantes SP1-∆FHG2-51 de

FOP-SP1 y SP4-∆FHG2-314 de FOP-SP4. La identidad del plásmido presente en la colonia

Resultados

- 165 -

seleccionada fue verificada mediante PCR utilizando oligonucleótidos específicos de los

promotores del casete de silenciamiento y de la región codificante del gen de resistencia a

fleomicina (Figura 55B).

Figura 55. Panel A: Mapa de restricción del plásmido pVIR-RNAi-FHG1 utilizado para el silenciamiento del gen FHG1. Panel B: Representación detallada de la región clonada entre los extremos RB y LB del plásmido pVIR-RNAi-FHG1. Se indica la ubicación de los sitios de unión de los cebadores utilizados para la discriminación de transformantes que han incorporado el plásmido de la construcción de silenciamiento.

3.10.3 Transformación de mutantes ∆FHG2 con el vector de

silenciamiento pVIR-RNAi-FHG1



transformaron los mutantes deficientes del gen FHG2, tanto en la cepa FOP-SP1,

identificado como mutante SP1-∆FHG2-51, como en la cepa FOP-SP4, identificado como

mutante SP4-∆FHG2-314. Los transformantes primarios que fueron apareciendo en las

placas de medio selectivo en presencia de fleomicina fueron transferidos individualmente

a placas de PDA con 400 a 600 µg/ml de fleomicina e incubados durante 5 días a 25ºC. Se

seleccionaron 10 transformantes para cada estirpe (SP1 y SP4).


- 166 -

3.10.3.1 Identificación y selección de transformantes ΔFHG2-

FHG1RNAi

Los transformantes seleccionados fueron cultivados en medio de cultivo PBD durante 3

días a 25ºC y 120 rpm. El micelio producido fue recuperado por filtración y utilizado para la

extracción de ARN total con el protocolo descrito en el apartado 2.6.4.2 de Materiales y

Métodos. La cantidad y calidad del ARN fueron verificadas por espectrofotometría y

electroforesis en gel de agarosa 1 % en MOPS 1X.

La síntesis de cDNA a partir de ARN total y el procedimiento para la preparación de las

muestras para las reacciones de RT-qPCR se describe en los apartados 2.12.2 y 2.12.3 de

Materiales y Métodos. Los niveles de expresión del gen FHG1 en las muestras preparadas

fueron normalizados con los niveles de expresión constitutiva del gen codificador del factor

de elongación 1α (EF1α) y referidos a los valores de expresión del gen FHG1 de las cepas

silvestres correspondientes (la cepa FOP-SP1 o la cepa FOP-SP4).

En la Figura 56 se presentan los resultados de los análisis de cuantificación de los niveles

de expresión del gen FHG1 en los transformantes seleccionados a partir de las cepas

mutantes SP1-ΔFHG2-51 (Panel A) y SP4-ΔFHG2-314 (Panel B) transformadas con el

vector de silenciamiento pVIR-RNAi-FHG1. En cada panel cada barra representa el nivel

de expresión relativa del gen FHG1 en la cepa indicada en relación con el nivel de

expresión en la cepa silvestre. La expresión se cuantificó en esporas germinadas tras 9 h

de incubación en medio MMG+A+SNP, condiciones en las cuales se había comprobado

previamente que se produce el mayor incremento de expresión de FHG1 (ver en la sección

3.5.2.1 Resultados). Se comprueba que los distintos transformantes silenciados muestran

niveles de expresión variables del gen FHG1. Para los siguientes análisis se seleccionaron

los transformantes que mostraron los niveles más bajos de expresión, esto es SP1-ΔFHG2-

51-FHG1RNAi-1, SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-2, SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-3, SP1-

ΔFHG2-51-FHG1RNAi-4 y SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-7. No se seleccionaron los

transformantes identificados incialmente con los números 27 y 30 ya que, a pesar de

mostrar niveles de expresión menor a los demás transformantes seleccionados, mostraban

también alteraciones en el crecimiento y morfología del micelio aéreo muy evidentes

(quizás producto de la integración del plásmido transformante en una región sensible). En

el caso de la cepa SP4-ΔFHG2-314, se seleccionaron los transformantes que muestran los

niveles de expresión más bajos y que fueron denominados SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-

Resultados

- 167 -

2, SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-3, SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-16, SP4-ΔFHG2-314-

FHG1RNAi-17, SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-18 y SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-22.

Figura 56. . Expresión relativa del gen FHG1 en los transformantes seleccionados obtenidos con el plásmido pVIR-RNAi-FHG1 sobre el fondo genético de los mutantes SP1-∆FHG2-51 y SP4-∆FHG2-314. Las muestras de RNA utilizadas en este análisis se obtuvieron de esporas cultivadas durante 9 h en medio mínimo con 1 % glucosa, suplementado con 10 mM de tartrato amónico (MMG+A), en presencia de 500 µM de SNP. Panel A: Cepa silvestre FOP-SP1, cepa mutante SP1-∆FHG2-51 y mutantes silenciados SP1-∆FHG2-51-FHG1RNAi-1, 2, 3, 4, 7, 17, 19, 22, 27 y 30 (carreras 1 a 30). Panel B: Cepa silvestre FOP-SP4, cepa mutante SP4-∆FHG2-314 y mutantes silenciados SP4-∆FHG2-314-FHG1RNAi-1, 2, 3, 16, 17, 18, 20, 22, 31 y 32 (carreras 1 a 32). Los datos de expresión representan los niveles de expresión relativa del gen FHG1 normalizados en relación con el nivel de expresión del gen Efα1 y referidos en cada caso a los valores de expresión de las cepas silvestre

Para demostrar que en los transformantes en los que hemos detectado silenciamiento está

presente, efectivamente, la construcción de silenciamiento decidimos llevar a cabo una

caracterización de los mismos mediante PCR y mediante hibridación tipo Southern. Para

ello en primer lugar se extrajo ADN genómico de las cepas mutantes silenciadas, de las

cepas SP1-∆FHG2-51 y SP4-∆FHG2-314 y de las estirpes silvestres FOP-SP1 y FOP-SP4.

Para la caracterización mediante PCR las muestras de ADN genómico obtenidas fueron

utilizadas directamente. Para el análisis mediante hibridación Southern el ADN en cada

caso fue digerido con la enzima HindIII y separado por electroforesis en gel de agarosa 1


- 168 -

% y transferido a filtros de nylon. Los filtros resultantes fueron hibridados con una sonda

derivada de la región de los promotores de silenciamiento incluidos en el plásmido de

transformación amplificada por PCR con los cebadores RNAi-U4-FW y Sil-FHG1-RV (ver

ubicación de los cebadores en la Figura 55B).

En la Figura 57 se presentan los resultados obtenidos en esta caracterización. En el Panel

A se muestran los productos de PCR amplificados a partir del ADN genómico de la cepa

mutante SP1-∆FHG2-51 y de los transformantes SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-1, 2, 3, 4 y 7

en reacciones de PCR llevadas a cabo con los cebadores RNAi-U4-FW y Sil-FHG1-RV

diseñados a partir de la secuencia del ADN del plásmido pVIR-RNAi-FHG1. El cebador Sil-

FHG1-RV hibrida específicamente con un extremo del fragmento de ADN con la secuencia

de silenciamiento y el cebador RNAi-U4-FW hibrida con la región correspondientes al

promotor 1 del casete de silenciamiento (ver Figura 57B). Con el molde adecuado esta

combinación de cebadores permite amplificar un fragmento de 768 pares de bases. Como

se comprueba en el Panel A de la Figura 57, en todos los transformantes seleccionados se

detecta la amplificación de un fragmento de ADN del tamaño esperado. En el Panel B de

la Figura 57 se presenta el análisis Southern blot de estos mismos transformantes. En este

análisis los filtros preparados fueron probados con una sonda marcada por PCR en una

reacción llevada a cabo utilizando los cebadores RNAi-U4-FW y Sil-FHG1-RV (descritos

anteriormente y utilizados en el análisis mediante PCR). Los resultados obtenidos muestran

integración del casete de silenciamiento en diferentes posiciones en el genoma de la cepa

receptora (sólo en el caso de los transformanes 3 y 4 el tamaño de la banda de hibridación

detectada parece ser el mismo). En la Figura 57, Paneles C y D se presentan los resultados

obtenidos aplicando las mismas aproximaciones experimentales (análisis mediante PCR

en el caso del Panel C y análisis mediante hibridación Southern en el caso del Panel D) de

los transformantes SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-2, 3, 16, 17, 18 y 22. En todos los

transformantes analizados se detecta amplificación de un producto de PCR del tamaño

esperado, confirmando la presencia del casete de silenciamiento, y las bandas de

hibridación detectadas con la sonda utilizada muestran tamaños diferentes, indicativos de

integraciones del casete de silenciamiento en posiciones diferentes del genoma de la cepa

receptora.

Bansándonos en los resultados mostrados decidimos seleccionar dos transformantes

silenciados en cada cepa mutante transformada para los posteriores análisis fisiológicos.

Estos fueron los transformantes SP1-∆FHG2-51-FHG1RNAi-1 y SP1-∆FHG2-51-

Resultados

- 169 -

FHG1RNAi-7 derivados de la cepa SP1-∆FHG2-51 y los transformantes SP4-∆FHG2-314-

FHG1RNAi-2 y SP4-∆FHG2-314-FHG1RNAi-18 derivados de la cepa SP4-∆FHG1-314.

Figura 57. . Caracterización molecular de los transformantes SP1-ΔFHG2-51 y SP4-ΔFHG2-314 seleccionados en los experimentos de transformación llevados a cabo con el plásmido de silenciamiento pVIR-RNAi-FHG1. Panel A: Productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico de transformantes silenciados de SP1-ΔFHG2-51 con los cebadores RNAi-U4-FW y Sil-FHG1-RV. Carril M: Marcador de peso molecular 1kp plus DNA ladder (invitrogen). Carriles (1, 2, 3, 4 y 7) producto de amplificación de ADN en los mutantes silenciados SP1-∆FHG2-51-FHG1RNAi-1, 2, 3, 4 y 7. Panel B: Análisis mediante hibridación Southern de transformantes silenciados de SP1-ΔFHG2-51 hibridado con la sonda derivada del promotor e inserto del casete de silenciamiento. Carril 51: ADN de la cepa SP1-∆FHG2-51. Carriles (1, 2, 3, 4 y 7) ADN de los mutantes silenciados SP1-∆FHG2-51-FHG1RNAi-1, 2, 3, 4 y 7. Panel C: Producto de PCR amplificado a partir de ADN genómico de transformantes silenciados de SP4-ΔFHG2-314 con los cebadores RNAi-U4-FW y Sil-FHG1-RV. Carril M: Marcador de peso molecular 1kp plus DNA ladder (invitrogen). Carriles (2, 3, 16, 17, 18 22) producto de amplificación de ADN en los mutantes silenciados SP4-∆FHG2-314-FHG1RNAi-2, 3, 16, 17, 18 22. Panel D: Análisis mediante hibridación Southern de transformantes silenciados de FOP-SP1 hibridado con la sonda derivada del promotor e inserto del casete de silenciamiento. Carril 314: ADN de la cepa SP4-∆FHG2-314. Carriles (2, 3, 16, 17, 18y 22) ADN de los mutantes silenciados SP4-∆FHG2-314-FHG1RNAi-2, 3, 16, 17, 18 22.

3.10.3.2 Análisis fenotípico de los dobles mutantes ΔFHG2-

FHG1RNAi

Se evaluó la capacidad de crecimiento saprofítico y la sensibilidad a estrés nitrosativo de

los transformantes silenciados seleccionados en comparación con los mutantes ∆FHG2 de

los que se derivan, SP1-∆FHG2-51 y SP1-∆FHG2-314, y sus correspondientes cepas tipo

silvestre, FOP-SP1 y FOP-SP4, en ausencia y en presencia de un donador de NO. Para


- 170 -

ello todas las cepas objeto de estudio fueron cultivadas en placas Petri con medio mínimo

con 1 % de glucosa suplementado con amonio o nitrato, en presencia y ausencia del

donador de NO (500 µM de SNP) en las mismas condiciones que las descritas en la sección

3.8.1 de Resultados.

En la Figura 58 se muestran los resultados del análisis de resistencia/sensibilidad a

condiciones de estrés nitrosativo de las cepas mutantes SP1-∆FHG2-51-FHG1RNAi-1 y

SP1-∆FHG2-51-FHG1RNAi-7 de FOP-SP1 y SP4-∆FHG2-314-FHG1RNAi-2 y SP4-

∆FHG2-314-FHG1RNAi-18 de FOP-SP4 en comparación con las cepas mutantes

deficientes en el gen FHG2 de las que derivan (SP1-∆FHG2-51 y SP4-∆FHG2-314) y de

las propias cepas tipo silvestre FOP-SP1 y FOP-SP4. En el Panel A se presenta el análisis

de las distintas cepas derivadas de FOP-SP1 en medios suplementados con amonio y

nitrato como fuente de nitrógeno y en el Panel B el análisis correspondiente llevado a cabo

con las cepas derivadas de FOP-SP4.

El análisis estadístico demuestra que los mutantes silenciados de FOP-SP1 en las dos

fuentes de nitrógeno consideradas y en ausencia de NO exógeno no muestran diferencias

significativas en el diámetro de la colonia en relación con la cepa tipo silvestre y con la cepa

deficiente del gen ΔFHG2. La cepa silvestre FOP-SP1 y la cepa deficiente del gen FHG2,

SP1-ΔFHG2-51, muestran sensibilidad a NO en ambos medios (con amonio y con nitrato),

en unos niveles similares a los observados en los ensayos llevados a cabo anteriormente

(sección 3.8.1.1 de Resultados). Efectivamente, FOP-SP1 muestra sensibilidad a NO y es

más sensible aún la cepa mutante SP1-ΔFHG2-51. El análisis del comportamiento de los

mutantes silenciados permite comprobar que la cepa SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-1

muestra un aumento adicional de su sensibilidad a NO, detectándose diferencias

significativas en relación con la cepa mutante SP1-ΔFHG2-51 en el diámetro medio de la

colonia en presencia de NO (p<0,05), con una reducción del 20,5 % en medio con amonio

y del 18,42 % en medio con nitrato en relación con aquél (ver Figura 58A). El segundo

mutante silenciado seleccionado mostró un aumento de sensibilidad a NO mínimo en

relación con la cepa mutante SP1-ΔFHG2-51, no detectándose diferencias significativas

en el análisis estadístico.

El comportamiento de los mutantes silenciados de FOP-SP4 es similar al observado en los

mutantes de FOP-SP1. La cepa de tipo silvestre y la cepa mutante en el gen FHG2, SP4-

ΔFHG2-314, muestran niveles de sensibilidad a NO similares a los mostrados en ensayos

anteriores (sección 3.8.1.2 de Resultados). En cuanto al comportamiento de los mutantes

Resultados

- 171 -

silenciados en el gen FHG1 analizados, se comprueba que en los dos medios

considerados, tanto en presencia de amonio como de nitrato como fuente de nitrógeno,

ambas cepas, SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-2 y SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-18,

muestran un aumento adicional de sensibilidad a NO en comparación con la cepa SP4-

ΔFHG2-314, y que ambas cepas tienen un comportamiento muy similar que reconoce el

análisis estadístico. La reducción del diámetro de la colonia en relación con la cepa mutante

SP4-ΔFHG2-314 es del 21,62 % y del 18,9 % para las cepas SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-

2 y SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-18, respectivamente, en medio con amonio y del 15,79 %

y 18,42 % en medio con nitrato (ver Figura 58B).

Figura 58. Evaluación del crecimiento saprofitico de mutantes ΔFHG2 en los que se ha silenciado el gen FHG1. Panel A: Cepa silvestre FOP-SP1, cepa mutante SP1-∆FHG2-51 y mutantes silenciados SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-1 y SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-7. Panel B: Cepa silvestre SP4, cepa mutante SP4-∆FHG2-314 y mutantes silenciados SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-2 y FOP-SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-18. Los cultivos se realizaron en medio mínimo con 1 % glucosa con amonio (MMG+A) y medio mínimo con 1 % glucosa con nitrato (MMG+N) en ausencia y presencia de 500 µM de SNP. Los datos presentados corresponden a los valores medios de tres experimentos y sus correspondientes desviaciones estándar. Con los datos de las tres cepas analizadas en cada caso en cada medio y condición se llevó a cabo un análisis ANOVA. Las medias con letra diferente en cada condición de cultivo son significativamente diferentes (p<0,05) (test de Tukey).


- 172 -

En resumen, en los mutantes silenciados de FOP-SP1, solamente la cepa silenciada SP1-

ΔFHG2-51-FHG1RNAi-1 muestra una reducción adicional del diámetro de la colonia

estadísticamente significativa en presencia de NO, tanto en medio suplementado con

amonio como en medio suplementado con nitrato como fuente de nitrógeno, en relación

con la cepa utilizada como referencia, el mutante SP1-ΔFHG2-51. En los mutantes

silenciados de FOP-SP4, tanto la cepa SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-2 como la cepa SP4-

ΔFHG2-314-FHG1RNAi-18 muestran sensibilidad adicional a NO (SNP) en ambos medios

de cultivo en relación con la cepa de referencia, en este caso el mutante SP4- ΔFHG2-314.

Para evaluar la eficiencia de germinación de microconidios en los mutantes silenciados se

utilizaron las mismas cepas utilizadas en los ensayos de evaluación de crecimiento

saprofitico y de sensibilidad a estrés nitrosativo. Como fuente de NO se utilizó DETA 250

µM. El propósito de estos ensayos fue evaluar los efectos fisiológicos que pudiera tener el

NO exógeno sobre la germinación de microconidios en los mutantes silenciados en

comparación con las cepas deficientes en el gen ∆FHG2 en las cepas SP1 y SP4 (cepas

SP1-∆FHG2-51 y SP4-∆FHG2-314) de las cuales se derivan cada uno de los mutantes

silenciados y con sus respectivas cepas silvestres FOP-SP1 y FOP-SP4, de las mismas

que ya se conoce su comportamiento en ausencia y presencia de NO (DETA). Los medios

de cultivo, el tiempo de evaluación y el análisis estadístico fueron los mismos utilizados en

ensayos anteriores y descritos en la sección 3.8.2 de Resultados.

Los resultados obtenidos se presentan en la Figura 59. Los mutantes silenciados de FOP-

SP1 no muestran diferencias significativas en la eficiencia de germinación en ausencia de

NO en relación con su cepa tipo silvestre FOP-SP1 y con la cepa deficiente del gen ΔFHG2

correspondiente, SP1-ΔFHG2-51. Por otro lado, estas dos cepas muestran sensibilidad a

NO en los dos medios considerados (con amonio y con nitrato) y unos niveles de reducción

en la eficiencia de germinación en presencia de NO similares a los observados en ensayos

anteriores (sección 3.8.2.1 de Resultados). En cuanto a los mutantes silenciados, SP1-

ΔFHG2-51-FHG1RNAi-1 y SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-7, se comprueba que ambas cepas

muestran una reducción adicional en la eficiencia de germinación en presencia de NO

(DETA 250 µM) al ser comparadas con la cepa mutante SP1-ΔFHG2-51 (y con la propia

cepa de tipo silvestre FOP-SP1), reducción en el eficiencia de germinación de un 19,8 % y

17,1 %, respectivamente, en medio con amonio y del 24 % y 22 %, respectivamente, en

medio con nitrato (ver Figura 59A).

Resultados

- 173 -

Figura 59. Cuantificación de la germinación de microconidios de mutantes ΔFHG2 en los que se ha silenciado el gen FHG1. Panel A: Cepa silvestre FOP-SP1, cepa mutante SP1-∆FHG2-51 y mutantes silenciados SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-1 y SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-7. Panel B: Cepa silvestre SP4, cepa mutante SP4-∆FHG2-314 y mutantes silenciados SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-2 y SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-18. Los cultivos se realizaron en medio mínimo con 1 % glucosa con amonio (MMG+A) y medio mínimo con 1 % glucosa con nitrato (MMG+N) en ausencia y presencia de 250 µM de DETA. Los datos presentados corresponden a los valores medios de tres experimentos y sus correspondientes desviaciones estándar. Con los datos de las tres cepas analizadas en cada caso en cada medio y condición se llevó a cabo un análisis ANOVA. Medias con letra diferente en cada condición de cultivo son significativamente diferentes (p<0,05) (test de Tukey).

Los resultados obtenidos en el análisis de los mutantes silenciados derivados de FOP-SP4

son similares a los obtenidos con los mutantes derivados de FOP-SP1. La cepa tipo

silvestre, FOP-SP4, y la cepa deficiente en el gen FHG2, SP4-ΔFHG2-314, muestran

niveles de reducción en la eficiencia de germinación en presencia de NO similares a los

observados en ensayos anteriores (sección 3.8.2.2 de Resultados). Por su parte, los dos

mutantes silenciados, SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-2 y SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-18,

muestran en presencia de NO una reducción adicional en la eficiencia de germinación en

relación con la cepa mutante SP4-ΔFHG2-314 (y la cepa de tipo silvestre FOP-SP4),

reducción que alcanza valores del 15,7 % y 20,1 %, respectivamente, en medio con amonio

y del 22 % y 19,9 %, respectivamente, en medio con nitrato. Las diferencias con la cepa


- 174 -

SP4-ΔFHG2-314 son significativas y el análisis estadístico demuestra que ambas cepas

mutantes muestran un comportamiento muy uniforme en los dos medios de cultivo (ver

Figura 59B).

3.10.3.3 Ensayos de infección in planta con los dobles mutantes

∆FHG2-FHG1RNAi

Finalmente se evaluó la agresividad sobre judía de los transformantes ΔFHG2 silenciados

en el gen FHG1 de FOP-SP1 y FOP-SP4 seleccionados, en comparación con la

agresividad de las cepas mutantes de ΔFHG2 de las que derivan y de las propias cepas

tipo silvestre. Los procedimientos de infección de plántulas de judía y la evaluación de la

agresividad de los distintos aislados fueron los mismos utilizados previamente y descritos

en secciones anteriores.

Los datos obtenidos en la evaluación de la agresividad durante cinco semanas se

presentan en la Tabla 24. Estos datos se representan gráficamente en la Figura 60. Se

comprueba que los dos transformantes SP1-ΔFHG2-51 seleccionados (SP1-ΔFHG2-51-

FHG1RNAi-1 y SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-7) muestran la misma agresividad que la cepa

SP1-ΔFHG2-51 de la que derivan y que la cepa tipo silvestre FOP-SP1. De la misma

manera, los dos transformantes SP4-ΔFHG2-314 seleccionados (SP4-ΔFHG2-314-FHG1-

RNAi-2 y SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-18) muestran la misma agresividad que la cepa

SP4-ΔFHG2-314 de la que derivan y que la cepa tipo silvestre FOP-SP4.

Tabla 24. Ensayos de infección en plantas de judía variedad “Blanca Riñón” con los mutantes silenciados (notación). En la primera columna se muestran las cepas tipo silvestre y los mutantes analizados. En las columnas 2 a 6 se representa el valor medio de la escala CIAT de todas las plantas para el aislado considerado en la semana indicada (± DE). Control: inoculaciones llevadas a cabo con agua.

SEMANAS

Cepas 1 2 3 4 5

SP1 1±0.0 6.2±0.7 7.2±0.9 8.6±0.6 9±0.0

SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-1 1±0.0 5.5±0.6 7.3±0.7 8.1±0.7 8.9±1.0

SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-7 1±0.0 5.9±0.4 7.1±0.9 8.4±0.6 8.9±0.7

SP1-ΔFHG2-51 1±0.0 6±0.7 7.4±0.8 8.8±1.0 8.6±0.8

SP4 1±0.0 2.3±0.6 4±0.6 5.4±0.7 5.1±0.4

SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-2 1±0.0 3.3±1.0 3.8±0.5 5.1±0.6 5.5±0.5

SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-18 1±0.0 34±0.5 3.7±0.04 5.3±0.7 5.2±0.4

SP4-ΔFHG2-314 1±0.0 3±0.4 3.6±0.5 4.9±0.5 5±0.3

Control 1±0.0 1±0.0 1±0.0 1±0.0 1±0.0

Resultados

- 175 -

Figura 60. Evaluación de la agresividad de FOP-SP1 y FOP-SP4, de los mutantes SP1-ΔFHG2-51 y SP4-ΔFHG2-314 y de los transformantes silenciados seleccionados derivados de cada uno de ellos, SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-1 y SP1-ΔFHG2-51-FHG1RNAi-7, y SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-2 y SP4-ΔFHG2-314-FHG1RNAi-18, sobre la variedad de judía Blanca Riñón. Como control negativo se utilizaron plantas inoculadas con agua. Se utilizó la escala CIAT (1=planta sana a 9=planta totalmente afectada o muerta) para medir la progresión de la infección durante 5 semanas.


- 176 -

DISCUSIÓN

Discusión

- 177 -

4 DISCUSIÓN

4.1 Relaciones filogenéticas de los genes FHG de FOP

Las proteínas de tipo flavohemoglobina derivan de globinas como consecuencia de

procesos que tuvieron lugar antes de la emergencia de los archea, los eucariotas y las

bacterias (Vinogradov et al., 2005). Los ancestros de las actuales flavohemoglobinas

probablemente desaparecieron en los archea, permaneciendo en bacterias y en eucariotas

(Vinogradov et al., 2005). Es interesante destacar el hecho de que en estos últimos las

flavohemoglobinas sólo se encuentran en distintos grupos de microorganismos eucariotas,

en particular de hongos.

La reconstrucción filogenética generada en este trabajo, teniendo en cuenta las secuencias

de flavohemoglobinas representativas de distintos grupos taxonómicos, muestra en líneas

generales las relaciones observadas previamente por otros autores que han trabajado en

este grupo de proteínas en los organismos en los que estamos interesados (Turrión-Gómez

et al., 2010; te Biesebeke et al., 2010). Durante los últimos años el número de secuencias

relacionadas a disposición del investigador ha aumentado constantemente, permitiendo

llevar a cabo análisis cada vez más precisos y robustos. En nuestro estudio identificamos

en primer lugar un clado particular, el clado 4, en el que se agrupan la mayor parte de las

flavohemoglobinas de origen bacteriano. Más próximas a éstas que a las

flavohemoglobinas de otros hongos se encuentran las enzimas correspondientes descritas

en distintas especies de levaduras. La mayor parte de las secuencias de

flavohemoglobinas de hongos se integran en un agrupamiento específico de este grupo de

organismos (que se conforma con un sólido soporte estadístico). En esta agrupación, que

incluye los clados 1 y 2 mostrados en la Figura 18, se localizan las proteínas

flavohemoglobinas FHG1, FHG2 y FHG3 de FOP. Es necesario llamar la atención sobre el

hecho de que FHG4 no se incluye en esta agrupación. La proteína FHG4 se localiza en un

clado diferente, el clado 3, ubicado entre la agrupación de los clados 1 y 2 y el clado 4, y

de constitución muy particular, ya que incluye flavohemoglobinas presentes únicamente en

algunas especies del género Aspergillus y que están relacionadas con flavohemoglobinas

presentes en especies bacterianas muy concretas: Chromobacterium, Bortedella,

Burkholderia y Sinorhizobium. Las tres primeras, FHG1, FHG2 y FHG3, por un lado, y esta


- 178 -

última, FHG4, por otro, representan probablemente tipos de flavohemoglobinas de

características diferentes y presentan relaciones evolutivas particulares y diferenciales.

El número de copias de los genes FHG en hongos varía de unas especies a otras. En

ascomicetes, se ha descrito una copia en especies como S. cerevisiae (Zhu et al., 1992) y

B. cinerea (Turrión-Gómez et al., 2010), dos en P. anserina, N. crassa y F. graminearum,

tres en C. albicans (Ullman et al., 2004) y en F. verticilloides y cuatro en F. oxysporum (este

trabajo). Y observamos que entre los basidiomicetes la representación de genes FHG es

más reducida: no han sido identificados en el genoma de especies representativas, como

Ustilago maydis y Coprinus cinereus y Laccaria bicolor, y sólo se ha identificado una copia

en el genoma de la especie C. neoformans (de Jesús-Berrios et al., 2003). En aquellas

especies en las que están presentes varias copias de los genes FHG, éstas no se agrupan

en una misma rama del cladograma. En estos casos, además, una copia dada presenta

generalmente más homología con copias de otras especies que con otras copias presentes

en la misma especie. Teniendo en cuenta estas consideraciones, el estudio de nuestro

cladograma y de las relaciones filogenéticas que en él se presentan, en particular en

relación con los clados 1 y 2, se pueden proponer varias hipótesis para explicar la evolución

de los genes FHG en los fusaria: (1) Sucesivas duplicaciones y divergencia a partir de un

gen ancestral, tal y como se ha propuesto para otros genes de F. oxysporum (Niño-

Sánchez et al., 2016); (2) adquisición por transferencia horizontal, hipótesis que parece la

más razonable para explicar la aparición de regiones específicas de F. oxysporum (Lineage

Specific, LS), las cuales provendrían de otras especies del género Fusarium. Es muy

posible que ambas explicaciones sean plausibles. Proponemos, que los genes FHG de F.

oxysporum, F. verticillioides y F. graminearum que aparecen próximos en el clado 2,

procederían de un ancestro común a las tres especies, si bien uno de los tres genes se

habría perdido en F. graminearum. Por el contrario, el gen de F. oxysporum que aparece

en el clado 3 (FHG4), próximo a genes de FHG de Aspergillus y Proteobacterias, podría

haberse originado por transferencia horizontal (explicado en el siguiente párrafo).

El análisis de los genes de FHGs en especies del género Aspergillus ofrece resultados

particulares y llamativos. En las distintas especies analizadas se han descrito dos copias

de genes FHG. Aquellas de las especies A. niger y A. clavatus, junto con una copia de las

especies A. fumigatus, A. kawachii, A. oryzae y A. terreus, se agrupan en el clado 1 junto

con la única copia del gen FHG descrita en B. cinerea y en S. sclerotiorum, y no aparece

ninguna copia en el clado 2. La segunda copia descrita en las especies A. terreus, A.

fumigatus, A. nidulans y A. oryzae aparece en el clado 3, que incluye como describíamos

anteriormente, genes correspondientes a ciertos grupos bacterianos. Llama

Discusión

- 179 -

poderosamente la atención la composición de este clado, que es el clado en el que se

localiza la cuarta copia de un gen FHG de FOP. Resulta tentador, a la vista de la

composición de este clado, proponer que hayan tenido lugar procesos de transferencia

horizontal de genes entre especies de bacterias y alguna de estas especies de hongos,

probablemente en tiempos muy tempranos, que permitan explicar la relación existente

entre las secuencias correspondientes.

Como reflexionan diversos autores (Levasseur et al., 2007; Te Bieseke et al., 2010) y como

recogen los libros de texto, los modelos de genética de poblaciones predicen que no es

posible mantener copias completamente redundantes de genes dados en el genoma

durante largos periodos de tiempo, ya que se irán acumulando mutaciones deletéreas y

tenderán a ser eliminados. Y a la inversa, la divergencia funcional de copias duplicadas

favorecerá el mantenimiento de las mismas. Acorde con este razonamiento, nuestra

hipótesis de partida para el presente trabajo fue desentrañar la posible especialización

funcional de los genes codificadores de proteínas FHG en F. oxysporum.

4.2 Análisis de expresión y funcional de los genes FHG

El hecho de encontrar varios genes codificadores de una determinada proteína en el

genoma de una especie dada y de que éstos sean mantenidos en el proceso evolutivo

permite considerar que las distintas copias sean funcionales. En el caso de FOP se han

identificado cuatro copias de los genes FHG. El objetivo fundamental de nuestro trabajo ha

sido determinar en qué procesos fisiológicos participan las enzimas codificadas por estos

genes en las estirpes FOP-SP1 y FOP-SP4. Estas dos estirpes de F. oxysporum son

patógenas de la judía común (por lo tanto forman parte de la forma especial phaseoli), y

son representativas de estirpes muy virulentas y poco virulentas de esta forma especial

(Alves-Santos et al, 2002b; de Vega-Bartol, 2011). En el curso de este trabjo se han

generado evidencias experimentales de tres tipos: las derivadas del análisis bioinformático

de los genes y de las proteínas codificadas, las derivadas del análisis de expresión de los

genes FHG en respuesta a distintos factores o estímulos, y las que se derivan de la

caracterización fenotípica de los mutantes en los genes FHG.

Es necesario en este momento hacer una consideración particular. Para llevar a cabo el

análisis de expresión y el análisis funcional descrito en primer lugar fue necesario

establecer las condiciones óptimas de cultivo con el fin de conocer el comportamiento de

las estirpes FOP-SP1 y FOP-SP4 en la germinación y desarrollo. Dado que inicialmente


- 180 -

era importante conocer el efecto sobre la sensibilidad a NO y sobre desarrollo, decidimos

utilizar como medio de cultivo de referencia el medio en el que la germinación es más

eficiente. Por esta razón se llevó a cabo el análisis de expresión en medios suplementados

con amonio como fuente de nitrógeno. El amonio y/o la glutamina son las fuentes de

nitrógeno preferidas por los hongos y en su presencia es reprimida la expresión de genes

implicados en la asimilación del nitrato o nitrito (Marzluf, 1997; Berger et al., 2008). Por lo

tanto, nuestro análisis de expresión ha tenido en cuenta la condición de ausencia de fuente

de nitrógeno y la condición de presencia de amonio, pero no ha valorado el efecto de la

presencia de nitrato. Esta condición sí ha sido tenida en cuenta en el análisis fisiológico de

los mutantes.

4.3 Los genes FHG de FOP muestran patrones de expresión

diferenciales

La función principal de las proteínas de tipo FHG, ampliamente distribuidas en

microorganismos procariotas y eucariotas, es la detoxificación de NO la cual llevan a cabo

gracias a su actividad dioxigenasa dependiente de NADPH, FAD y O2. Esta actividad

dioxigenasa de la flavohemoglobina fue inicialmente descrita en la enzima hmp de E. coli

(Gardner et al., 1998; Hausladen et al., 1998) y posteriormente en las flavohemoglobinas

de Alcaligenes eutrophus (Ermler et al., 1995) y S. cerevisiae (Zhao et al., 1996). La

capacidad detoxificadora de la flavohemoglobina ha sido descrita desde entonces en

numerosas especies de bacterias (Crawford and Golberg, 1998b; Cramm et al., 1994;

Favey et al., 1995; LaCelle et al., 1996) y de hongos (Hromatka et al., 2005; Zhu et al.,

2006; Zhou et al., 2010; Turrión-Goméz et al. 2010; Lapp et al. 2014). En microorganismos

la exposición a NO determina un aumento de la expresión del gen o de los genes

codificadores de enzimas flavohemoglobinas, activando así un mecanismo inducible de

resistencia frente a condiciones de estrés nitrosativo (Crawford and Goldberg, 1998a;

Ullmann et al., 2004; Poole et al., 1996; Moore et al., 2004; Sarver and DeRisi, 2005;

Hromatka et al., 2005; Zhou et al., 2010; Turrión-Goméz et al. 2010; Lapp et al., 2014).

Los microorganismos eucariotas poseen frecuentemente varios genes codificadores de

enzimas flavohemoglobina en sus genomas. Dentro del grupo de los hongos encontramos

ejemplos de las distintas situaciones que cabe considerar. B. cinerea posee sólo uno,

Bcghg1 (Turrión-Gómez et al., 2010). Distintas especies del género Aspergillus poseen dos

genes FHG. En el caso de A. oryzae, Fhb1 codifica una flavohemoglobina de localización

citoplasmática implicada en la detoxificación de NO en el citoplasma y Fhb2 codifica una

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ermler%20U%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=8557026

Discusión

- 181 -

flavohemoglobina de localización mitocondrial que participa en la detoxificación de NO en

la mitocondria (Zhou et al., 2010). C. albicans posee tres genes FHG, pero sólo uno está

implicado en la detoxificación de NO (Ullmann et al., 2004).

F. oxysporum posee cuatro genes codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina,

conforme a los análisis efectuados con el ensamblaje de la estirpe 4287 (F. oxysporum f.

sp. lycopersici). Este número de copias fue verificado posteriormente, en el curso de este

trabajo, en otras formas especiales cuyos genomas han sido secuenciados (Broad

Institute), y de forma experimental en las estirpes de F. oxysporum f. sp. phaseoli. F.

oxysporum f. sp. phaseoli constituye el sistema en el que más copias de genes FHG se

han descrito hasta el momento. La conservación de la estructura general de la proteína y

la presencia y organización de los tres dominios funcionales característicos de este tipo de

enzimas en las proteínas de FOP sugieren que, efectivamente, las cuatro proteínas son

flavohemoglobinas con actividad dioxigenasa. El análisis de localización subcelular

establece una diferencia fundamental entre ellas, ya que FHG1, FHG2 y FHG3 tienen

localización citoplasmática mientras que FHG4 tiene localización mitocondrial. La

presencia de una pre-secuencia de localización mitocondrial no es la única característica

que separa a FHG4 de las demás proteínas FHG de FOP: las relaciones de similitud en la

secuencia de aminoácidos en conjunto también dan soporte a esta diferenciación. FHG4

está relacionada de forma más próxima con la flavohemoglobina de localización

mitocondrial de A. fumigatus (Lapp et al., 2014), A. oryzae (Zhou et al., 2010) y A. niger (Te

Bieseke et al., 2010), proteínas que, a su vez, están más relacionadas con las

flavohemoglobinas de bacterias. Nuestro análisis de expresión demuestra que FHG4 no se

expresa a niveles detectables mediante análisis Northern en ninguna de las condiciones

evaluadas y los valores de acumulación de transcrito detectados mediante qPCR no

permiten llevar a cabo una cuantificación fiable. Si FHG4 se expresa en alguna de las

condiciones analizadas, ciertamente es a niveles muy bajos. Si no responde a NO exógeno,

es posible proponer que FHG4 no forma parte en FOP de un posible sistema inducible de

respuesta a las condiciones de estrés nitrosativo que se imponen mediante la adición de

un donador de NO, pero con la información acumulada hasta el momento no podemos

elaborar una propuesta sobre los procesos fisiológicos en los que FHG4 pudiera participar.

Quizás FHG4 constituya una copia no funcional de la familia FHG en FOP. No obstante, el

hecho de que la proteína codificada sea una proteína de localización mitocondrial permite

considerar que FHG4 pudiera estar relacionada con procesos del metabolismo del NO

(incluida la defensa frente a condiciones de estrés nitrosativo localizado) que tienen lugar

específicamente en la mitocondria. Este es el papel descrito para las proteínas FHb2 y fhbB


- 182 -

en A. oryzae y A. fumigatus, respectivamente, en las cuales se ha identificado una

secuencia señal mitocondrial y que son las proteínas responsables de la detoxificación del

NO a nivel mitocondrial (Zhou et al., 2009; Zhou et al., 2010).

A la luz de los resultados obtenidos en este trabajo, la revisión de la literatura sobre

flavohemoglobinas en F. oxysporum nos coloca frente a una información que plantea

ciertas contradicciones. F. oxysporum ha sido descrito desde hace tiempo como un hongo

denitrificador (Shoun et al., 1992). La denitrificación en hongos constituye una forma de

respiración anaerobia que utiliza el nitrato como aceptor de electrones, y sus componentes

están localizados en la mitocondria (Kobayashi et al., 1995). Takaya y colaboradores, en

el curso de la caracterización de este sistema en F. oxysporum, describieron el aislamiento

y purificación de una proteína de tipo flavohemoglobina a partir de cultivos del hongo

crecido en condiciones de anaerobiosis (Takaya et al., 1997). En este trabajo los autores

llegan a purificar una flavohemoglobina, efectivamente, y determinan la secuencia de su

extremo amino terminal. Y proponen que esta flavohemoglobina es la enzima implicada en

denitrificación en F. oxysporum. Pero comprobamos que la secuencia descrita entonces

coincide exactamente con la secuencia de la proteína FHG2 que describimos en nuestro

trabajo. FHG2 carece de señal de localización mitocondrial (FHG4 es la única de las cuatro

flavohemoglobinas aquí descritas que presenta tal señal de localización mitocondrial) lo

cual suscita dudas sobre su localización en la mitocondria. Y por otra parte, el gen FHG2

se expresa en condiciones de aerobiosis y responde a NO exógeno, mientras que Takara

y colaboradores utilizan unas condiciones de cultivo descritas como aquellas que permiten

“la mejor actividad denitrificante”, esto es, condiciones de anaerobiosis. Teniendo en

cuenta estas observaciones resultan evidentes ciertas contradicciones entre la situación

descrita por estos autores y la derivada de la consideración de las cuatro copias de los

genes FHG presentes en el genoma de F. oxysporum. Es posible proponer que la

flavohemoglobina de localización mitocondrial que participa en denitrificación en

condiciones de anaerobiosis sea FHG4, pero que Takara y colaboradores en su momento

purificaran otra de las proteínas FHG de F. oxysporum, quizás incluso más abundante, que

responde a las características generales de las flavohemoglobinas, y que también se

expresa en las condiciones de cultivo que estos autores utilizaron. En cualquier caso, el

gen FHG4 muestra características peculiares que lo separan de los otros tres genes FHG

descritos en F. oxysporum.

Los genes FHG1, FHG2 y FHG3 están, efectivamente, más relacionados filogenéticamente

entre sí y responden transcripcionalmente a los estímulos considerados. Aunque de distinta

Discusión

- 183 -

manera y con magnitudes diferentes, los tres genes responden a la exposición a NO

exógeno (FHG3, en particular, lo hace de forma muy limitada). Esta inducción de la

transcripción por exposición a un donador de NO es una respuesta esperada para un gen

que codifica un componente esencial de un mecanismo de detoxificación de NO.

Cuantitativamente la respuesta de FHG1 a NO es la más fuerte y sólo se produce en la

fase de germinación de las esporas. Esta inducción no es bloqueada por la presencia de

amonio en el medio de cultivo. El gen FHG2 también responde a NO, pero sólo lo hace de

forma clara durante la fase de germinación. En esta fase la presencia de amonio tampoco

bloquea (o inhibe) la inducción de la expresión en respuesta a NO. Es decir, durante la

germinación FHG1 y FHG2 tienen una respuesta similar a la exposición a NO y a la

presencia de amonio en el medio de cultivo. Cabe pensar que ambos genes está

implicados, en este estadio de desarrollo, en un mecanismo de defensa inducible en

respuesta a NO, el cual es independiente de la presencia de amonio, y que las enzimas

codificadas participan en la detoxificación del NO al que las esporas del hongo son

expuestas. Debemos recordar en este momento que en el sistema modelo de A. nidulans

el cultivo del hongo en presencia de nitrato induce la expresión de genes de asimilación de

nitrato y que el gen FhbA, codificador de la enzima flavohemoglobina inducible de este

organismo, está co-regulado con estos genes de asimilación de nitrato. En A. nidulans se

ha comprobado, además, que la adición de amonio reprime la expresión de genes de

metabolismo de nitrógeno relacionados con la asimilación de nitrato como parte de un

mecanismo de represión metabólica por amonio. Es interesante destacar que los trabajos

llevados a cabo por Schinko et al. (2010) demuestran que la expresión de FhbA escapa a

esta represión metabólica por amonio y que su expresión se induce por exposición a NO

incluso en presencia de amonio. Los autores consideran que estas observaciones

probablemente reflejan la importancia que tiene la detoxificación de NO en este organismo,

haciendo que se induzca la expresión del gen FhbA por exposición a NO

independientemente del estado celular en relación con el metabolismo del nitrógeno. La

expresión de FHG1 y FHG2 observada en F. oxysporum durante la germinación de

conidios es muy similar a la descrita en A. nidulans, y sugiere la participación de las

proteínas codificadas por ambos genes en un mecanismo de defensa frente a condiciones

de estrés nitrosativo que debe ser independiente de una regulación por metabolismo de

nitrógeno. En nuestro trabajo no hemos evaluado la expresión de los genes de asimilación

de nitrato en presencia de amonio en F. oxysporum. No obstante, dado que se trata de un

mecanismo generalizado en hongos (Marzluf 1997; Berger et al., 2008), proponemos que

el mecanismo de regulación negativa de los genes de asimilación de nitrato por amonio

debe operar también en F. oxysporum. Es interesante destacar que en F. oxysporum hay


- 184 -

un mecanismo de activación de funciones de virulencia reprimido por amonio y que

depende de la expresión de las proteínas TOR y MeaB (López-Bergés et al., 2010). Sin

embargo, esta regulación dependiente de fuente de nitrógeno es independiente de AreA,

el activador general de genes codificadores de enzimas implicadas en la utilización de

fuentes de nitrógeno distintas a las favoritas, amonio y glutamina.

FHG2 muestra un patrón de expresión muy diferente en la otra fase de desarrollo

considerada, la fase de crecimiento del micelio, en la cual la expresión es máxima en medio

mínimo con glucosa en ausencia de fuente de nitrógeno. En esta fase la expresión de

FHG2 es reprimida en presencia de amonio, una respuesta que encaja en la represión

metabólica por amonio descrita en hongos (Marzluf, 1997) y, sorprendentemente, la

represión se mantiene aún en presencia de NO. Es decir, en la fase de micelio, en la que

no hemos podido detectar (y cuantificar) expresión de FHG1, FHG2 muestra respuestas

transcripcionales que sugieren que participa en procesos específicos de esta etapa de

desarrollo probablemente más relacionadas con el metabolismo del nitrógeno en general

que con una respuesta específica de defensa frente a NO.

Por su parte, FHG3 muestra un patrón de expresión similar en esporas y en micelio (no

hay regulación por desarrollo) y con una respuesta a la exposición a NO, como indicábamos

anteriormente, muy limitada. Sí muestra una respuesta a amonio, cuya presencia estimula

su expresión durante la germinación de las esporas, estimulación que no se observa en los

genes FHG1 y FHG2. Por lo tanto, FHG3 también muestra respuestas que sugieren una

posible participación en metabolismo del nitrógeno en general, no específicamente en

detoxificación de NO. Sin embargo, la respuesta observada no deriva de una posible

represión metabólica por presencia de amonio sino, más bien al contrario, de estimulación

de la expresión en presencia de esta fuente de nitrógeno. Estas variadas respuestas

transcripcionales sugieren que la disponibilidad de tres genes FHG (1, 2 y 3) puede

proporcionar a F. oxysporum una notable versatilidad metabólica frente a fuente de

nitrógeno, la cual puede resultar útil en determinadas condiciones ambientales.

Tomadas en conjunto, estas observaciones permiten considerar que en F. oxysporum los

genes FHG1, FHG2, y FHG3 son funcionales y han adquirido funciones específicas

relacionadas con el metabolismo del nitrógeno en general, y del NO en particular, y la fase

de desarrollo. En concreto, FHG1 y FHG2 participan específicamente en la respuesta a

estrés nitrosativo durante la germinación de esporas.

Discusión

- 185 -

4.4 Los genes FHG1 y FHG2 confieren resistencia a estrés nitrosativo

La caracterización funcional de los mutantes deficientes en los genes FHG proporciona

información adicional sobre la posible función de cada uno de ellos. En este trabajo hemos

caracterizado dos mutantes independientes en cada gen FHG en las dos cepas de interés,

FOP-SP1 y FOP-SP4. Los resultados obtenidos en ambas cepas para cada gen analizado

son muy similares.

Los trabajos realizados en este estudio demuestran que las cepas de tipo silvestre FOP-

SP1 y FOP-SP4 son sensibles al estrés nitrosativo producido por el NO, sensibilidad que

manifiestan independientemente de la fuente de nitrógeno en la que son cultivadas. Se ha

comprobado que los mutantes alterados bien en el gen FHG1, bien en el gen FHG2, pero

no lo mutantes alterados en FHG3 o en FHG4, son hipersensibles a NO exógeno. Estos

resultados sugieren que FHG1 y FHG2 son las flavohemoglobinas que juegan un papel

más importante en la detoxificación de NO exógeno en FOP y responsables de mantener

la concentración de NO en el interior de la célula dentro de unos niveles compatibles con

el normal funcionamiento del metabolismo celular.

Esta función protectora frente a condiciones de estrés nitrosativo, inferida a partir del

análisis de sensibilidad a NO llevado a cabo sobre las cepas mutantes, es la función

descrita en distintos microorganismos en los que también se han utilizado los mutantes

correspondientes para determinar la función de la proteína. Es el caso de E. coli, sistema

en el que los mutantes en el gen hmp son más sensibles a la inhibición del desarrollo por

exposición a NO (Gardner et al., 1998) y cuya caracterización ha permitido, además,

comprobar que la proteína HMP participa en la reparación de los daños causados por

estrés oxidativo en los lípidos de membrana. De igual menara se ha comprobado que en

Salmonella typhimurium la flavohemoglobina codificada por hmp protege a la bacteria del

estrés nitrosativo, metabolizando NO en crecimiento aerobio y anaerobio (Crawford and

Goldberg, 1998). En la bacteria E. chrysanthemi se ha demostrado que los mutantes

deficientes en el gen HmpX muestran sensibilidad a NO, demostrando que la proteína

flavohemoglobina HmpX es la responsable de proteger a la bacteria del estrés nitrosativo

(Boccara et al., 2005). En hongos también se han obtenido evidencias funcionales basadas

en la caracterización de mutantes, permitiendo describir en estos sistemas situaciones

distintas. Por ejemplo, en B. cinerea los mutantes deficientes en el único gen codificador

de enzimas flavohemoglobina, Bcfhg1, son hipersensibles a NO (Turrión-Gómez et al.,

2010). En C. albicans existen 3 genes codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina


- 186 -

pero sólo los mutantes en uno de ellos, el gen CaYHB1, son hipersensibles a NO e

incapaces de detoxificar NO (Ullmann et al., 2004). En distintas especies del género

Aspergillus existen dos genes codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina. En A.

oryzae la eliminación de FHb1 determina hipersensibilidad a NO, pero no la eliminación de

Fhb2 (Zhou et al., 2010). Una situación similar ha sido descrita en A. fumigatus, sistema en

el que la eliminación de FhpA determina aumento de sensibilidad a NO, pero no la

eliminación de FhpB (Lapp et al., 2014). En estas especies el segundo gen, Fhb2 y FhpB,

respectivamente, codifica una proteína flavohemoglobina de localización mitocondrial,

probablemente equivalente a la codificada por FHG4 que probablemente no tiene que ver

con detoxificación de NO exógeno (Lapp et al., 2014; Marcos et al., 2016).

Nuestro trabajo demuestra que en F. oxysporum existen dos flavohemoglobinas que

desempeñan un papel importante en la detoxificación de NO, ya que los mutantes ∆FHG1

y los mutantes ∆FHG2 son hipersensibles a NO, mostrando los mutantes ∆FHG1 una

mayor reducción de crecimiento en presencia de NO que los mutantes ∆FHG2. Esto

supone que la flavohemoglobina FHG1 tiene una contribución más relevante en la

detoxificación de NO exógeno que la proteína FHG2. El análisis fenotípico de los mutantes

∆FHG1 en los que ha reintroducido el alelo silvestre del gen FHG1 demuestra que, tanto

en la cepa FOP-SP1 como en la cepa FOP-SP4, la reintroducción del alelo silvestre

restaura completamente la función de FHG1, demostrando que la hipersensibilidad a NO

observada en los mutantes es consecuencia exclusivamente de la eliminación del gen

FHG1.

Nuestro trabajo demuestra, además, que en F. oxysporum los genes FHG3 y FHG4 no

tienen una participan relevante en la detoxificación de NO, ya que los mutantes ∆FHG3 y

∆FHG4 no manifiestan hipersensibilidad a NO exógeno. FHG3 sí responde

transcripcionalmente a la exposición a NO, pero dado el fenotipo de los mutantes ΔFHG3,

o la contribución de la enzima codificada a la capacidad de detoxificar NO es muy pequeña

o su carencia puede ser compensada por alguna, o por varias, de las otras tres enzimas

FHG de F. oxysporum.

Asimismo, se puede descartar que la presencia de varios genes codificadores de FHG en

F. oxysporum suponga una redundancia funcional en la actuación de las correspondientes

enzimas. Los mutantes ΔFHG1 y ΔFHG2 presentan un claro fenotipo de hipersensibilidad

a NO, a pesar de que los análisis genéticos demuestran que sólo un alelo FHG ha sido

alterado en cada uno de ellos. Los resultados obtenidos indican que ambas enzimas son

Discusión

- 187 -

necesarias para proporcionar una defensa total frente a condiciones de estrés nitrosativo,

si bien ambas enzimas parece que contribuyen en distinta medida. Para determinar

experimentalmente la contribución conjunta de las proteínas codificadas por FHG1 y FHG2

a la detoxificación de NO decidimos anular la función de ambos genes. En principio, la

eliminación simultánea de ambas actividades enzimáticas debería determinar una

sensibilidad a NO aún mayor en las cepas en las que ambos genes son eliminados. La

situación ideal para este tipo de estudio hubiera sido aquella en la que se hubieran

caracterizado mutantes nulos por deleción de ambos genes. No obstante, en el curso de

este trabajo no ha sido posible obtener dichos mutantes a pesar de los esfuerzos dedicados

a ello. Por ello, se decidió utilizar una estrategia alternativa basada en el silenciamiento

génico. Nuestro grupo ha publicado recientemente un trabajo en el cual se demuestra que

el silenciamiento génico es una herramienta útil para atenuar la expresión génica en F.

oxysporum (Niño-Sánchez et al., 2016). De hecho las cepas de F. oxysporum f. sp. phaseoli

utilizadas en este trabajo muestran una excelente correlación entre la reducción de la

expresión génica mediada por silenciamiento y la alteración del fenotipo correspondiente

(Niño-Sánchez et al., 2016). En consecuencia, decidimos utilizar una estrategia basada en

el silenciamiento de uno de los dos genes en un mutante delecionado en el otro gen.

Elegimos como fondo genético de partida el mutante ∆FHG2, ya que consideramos que

sería más fácil detectar y cuantificar posibles efectos adicionales (aumento de sensibilidad

a NO o reducción de porcentaje de germinación) en éste derivados del silenciamiento del

gen que tiene un efecto mayor sobre la capacidad de detoxificación de NO.

El análisis de estos transformantes, desafortunadamente, no ha permitido generar

resultados concluyentes. Por una parte, el estudio de los datos recogidos y presentados en

la figura 59 demuestran que en tres de los cuatro mutantes ΔFHG2-FHG1RNAi, dos

derivados de la cepa FOP-SP1 y dos derivados de la cepa FOP-SP4, el silenciamiento de

FHG1 determina un aumento adicional de sensibilidad a NO sobre la manifestada por los

mutantes ΔFHG2. En el segundo de los transformantes ΔFHG2-FHG1RNAi analizados en

la cepa FOP-SP1 esta reducción adicional no resulta evidente, quizás como consecuencia

de variaciones debidas a diferencias en el nivel de silenciamiento del gen FHG1 de unos

transformantes a otros, aunque ciertamente los cuatro transformantes seleccionados

fueron aquellos que mostraron un menor nivel de expresión de este gen. Por otra parte, es

difícil cuantificar con los datos obtenidos la magnitud del aumento adicional de sensibilidad

a NO que determina el silenciamiento de FHG1 en los mutantes ΔFHG2. Teniendo en

cuenta el nivel de sensibilidad determinado en la primera serie de experimentos cuando se

evaluó el comportamiento de los mutantes simples, el nivel de sensibilidad estimado ahora


- 188 -

para los transformantes silenciados no es significativamente mayor que el de los mutantes

simple ΔFHG1. No obstante, entendemos que el comportamiento de estos transformantes

debe ser analizado más en profundidad, incluyendo en los mismos ensayos todas las cepas

de interés, incluidas las cepas ΔFHG1 de FOP-SP1 y FOP-SP4, e incrementando el

número de medidas para disponer de una estadística más robusta. En este momento, por

lo tanto, no podemos ser categóricos, si bien los datos a nuestra disposición sugieren que

ambas flavohemoglobinas, FHG1 y FHG2, no actúan de forma sinérgica.

En cualquier caso, es importante destacar los datos obtenidos muestran inequívocamente

que en F. oxysporum hay dos FHGs cruciales para conferir plena capacidad de

detoxificación de NO al microorganismo.

4.5 El papel de FHG1 y FHG2 en la detoxificación de NO evidencia una

función del NO sobre germinación

La evaluación de la capacidad de crecimiento en presencia de un donador de NO de las

cepas tipo silvestre y de las cepas mutantes correspondientes demuestra que las

flavohemoglobinas en F. oxysporum participan en los mecanismos de resistencia a

condiciones de estrés nitrosativo. El papel fundamental en esta función fisiológica lo

desempeñan las enzimas FHG1 y FHG2, particularmente la enzima FHG1. La pregunta

relevante llegados a este punto es: ¿en qué procesos fisiológicos particulares es importante

la función de detoxificación de NO que llevan a cabo las enzimas flavohemoglobinas en F.

oxysporum?. Los mutantes analizados en este trabajo tanto en la cepa FOP-SP1 como en

la cepa FOP-SP4 no muestran alteraciones morfológicas y de desarrollo evidentes cuando

se cultivan en placas de medio sólido en ausencia de un donador de NO, ya sea en

presencia de amonio o de nitrato como fuente de nitrógeno. Tampoco se ve afectada la

eficiencia de germinación en medio mínimo líquido. Por lo tanto, la eliminación de forma

independiente de cada gen FHG parece que no condiciona la supervivencia y el desarrollo

de F. oxysporum en las condiciones analizadas en este trabajo. Esta observación establece

una diferencia con algunos sistemas fúngicos, en los que sí se han descrito alteraciones

en el crecimiento y desarrollo en mutantes deficientes de los genes codificadores de FHG.

Así, en C. albicans se ha descrito que los mutantes ∆Cayhb1 muestran un desarrollo

hiperfilamentoso (Hromatka et al., 2005). En A. oryzae mutantes del gen ∆FHb1 muestran

alteraciones morfológicas en el micelio (Te Biesebeke et al., 2010). En A. oryzae los

mutantes ΔFhb1 crecen más lentamente con alteraciones en la morfología de las hifas en

ausencia de NO (Zhou et al., 2010). En A. nidulans los mutantes del gen ∆fhbA producen

Discusión

- 189 -

más cuerpos de fructificación (Baidya et al., 2011). No obstante, el estudio del

comportamiento de las cepas silvestres y de las cepas mutantes en medio mínimo líquido

en presencia de NO sugiere que FHG1, y en menor medida FHG2, son importantes en F.

oxysporum para detoxificar el NO que tiene un efecto notable sobre germinación.

Nuestros resultados demuestran que el NO exógeno reduce la eficiencia de germinación

de FOP-SP1 y FOP-SP4, lo que supone que éste altera o modula la actividad de

componentes esenciales para que se produzca la germinación de las esporas. Nuestros

resultados demuestran, además, que en la eliminación de los niveles de NO que afectan a

estos componentes juega un papel fundamental FHG1, ya que en los mutantes ΔFHG1 lo

que en realidad se produce es un bloqueo de la germinación, no un retraso. Este bloqueo

se observa en las dos cepas de FOP y en presencia de una u otra fuente de nitrógeno. El

hecho de que este bloqueo se produzca en cepas que poseen alelos de tipo silvestre para

los otros tres genes FHG supone que FHG1 es responsable específicamente de eliminar

el NO que afecta a estos componentes esenciales de la maquinaria de germinación y que

su función no es asumida, o compensada, ni siguiera parcialmente, por alguna de las otras

tres enzimas FHG de F. oxysporum. Una situación muy similar ha sido observada

recientemente en B. cinerea. En este organismo, que sólo posee una enzima

flavohemoglobina, BCFGH1, la exposición del tipo silvestre a NO determina un retraso de

la germinación. Por su parte, el tratamiento del mutante ΔBcfhg1 con NO supone un

bloqueo absoluto de la germinación (Daniela Santander 2014, Tesis Doctoral). FHG1 de

FOP y BCFHG1 desempeñarían, por lo tanto, una función muy similar en la fisiología de

estas dos especies de hongos fitopatógenos.

Debemos destacar en este momento que en un medio mínimo suplementado con nitrato la

exposición a NO sí determina una reducción en la eficiencia de germinación en los

mutantes ΔFHG2, si bien mucho más moderada que la observada en los mutantes ΔFHG1.

FHG2, por lo tanto, es responsable de detoxificar un NO que afecta a la germinación, NO

que no puede detoxificar FHG1 y que tiene que ver con el metabolismo del nitrato en los

mutantes ΔFHG2. En este contexto es interesante tener en cuenta las observaciones

llevadas a cabo en A. nidulans (Schinko et al., 2010). Estos autores han proporcionado

evidencias de que las flavohemoglobinas fhbA y fhbB desempeñan un importante papel

protector de la actividad nitrato reductasa (NR) frente al daño directo causado por la

exposición a NO (o de especies reactivas de nitrógeno derivadas). Es tentador proponer

que FHG2 tenga una actividad detoxificadora de NO semejante a la de FHG1 en resistencia

a estrés nitrosativo (aunque sea FHG1 la enzima principal implicada), pero que quizás


- 190 -

desempeñe una función especializada en la protección de la NR (y quizas también de otras

enzimas implicadas en el metabolismo de nitrato) frente a NO. La eliminación de FHG2

determinaría la desaparición del efecto protector, y, consiguientemente, una reducción de

la actividad NR, lo que a su vez resultaría en una menor capacidad de metabolizar nitrato

por parte de los mutantes, y por lo tanto una eficiencia menor en la germinación. Esto

supondría que la reducción de la germinación observada en los mutantes ΔFHG2 es más

bien consecuencia de un problema nutricional y no tanto de un efecto directo del NO sobre

componentes esenciales del programa de germinación, que es lo que proponemos que

sucede en el caso de los mutantes ΔFHG1, en los que lo que se determina un bloqueo de

la germinación que se produce tanto en medio con nitrato como en medio con amonio.

El estudio de los transformantes ΔFHG2, tanto de la cepa FOP-SP1 como de la cepa FOP-

SP4, en los que se ha silenciado el gen FHG1 muestra que, efectivamente, el

silenciamiento de FHG1 determina una reducción adicional de la germinación en relación

con la observada en el mutante ΔFHG2, pero ésta no llega a alcanzar los valores de

reducción observados en mutante simple ΔFHG1. Esto supone que el silenciamiento

logrado en nuestros transformantes no es absoluto y que, efectivamente, la enzima con un

papel más importante en la detoxificación del NO que afecta a la germinación es FHG1.

4.6 El papel del NO y de las flavohemoglobinas en diferenciación y

desarrollo

Este papel “modulador” del NO sobre germinación (modulador porque en la cepa silvestre

solo reduce la eficiencia de germinación mientras que en el mutante la bloquea

completamente) que observamos en nuestro sistema ha sido descrito en otros hongos

filamentosos. Utilizando una aproximación farmacológica basada en la adición de

donadores de NO, de inhibidores de la enzima NOS y de secuestradores de formas activas

de nitrógeno, Wang y Higgins (2005) presentaron evidencias en C. coccodes que sugerían

que el NO tiene un efecto regulador sobre la germinación. Una situación muy similar ha

sido descrita en C. graminicola (Daniela Santander, 2014. Tesis Doctoral). En B. cinerea,

como comentábamos anteriormente, se han obtenido indicaciones que apuntan en el

mismo sentido, en este caso apoyadas sobre evidencias tanto farmacológicas como

genéticas (Daniela Santander, 2014. Tesis Doctoral).

Efectivamente, la aproximación farmacológica basada en la adición de NO exógeno ha sido

considerada en varios hongos a la hora de investigar la naturaleza de los procesos en los

Discusión

- 191 -

que el NO tiene un efecto. Los resultados obtenidos sugieren que el NO, también en este

grupo de organismos, regula procesos de diferenciación y/o desarrollo, aunque

dependiendo de los sistemas, en ocasiones parece ejercer una regulación en sentidos

opuestos. Así, se ha demostrado que en N. crassa la adición de NO induce la producción

de esporas asexuales (Ninnemann and Maier, 1996). En P. blakesleeanus regula el

desarrollo del esporangióforo (Maier et al., 2001). En Coniothyrium minitans induce la

conidiación (Gong et al., 2007). En A. nidulans, en uno de los estudios más completos al

respecto, se ha comprobado recientemente que la exposición a niveles elevados de NO

reduce la germinación de las esporas asexuales e induce el desarrollo de las estructuras

características de la fase de reproducción sexual, los cleistotecios (Marcos et al., 2016). En

F. oxysporum nosotros observamos una reducción en la eficiencia de la germinación de las

esporas, lo que supone que F. oxysporum y A. nidulans responden de manera similar a NO

exógeno. Dado que F. oxysporum no presenta reproducción sexual conocida, la

estimulación o no de la producción de estructuras sexuales no ha podido ser evaluada.

Es interesante destacar que la participación del NO en procesos de desarrollo y

morfogénesis se ha descrito en distintos sistemas, en particular en plantas (Beligni y

Lamattina, 2000; Pagnussat et al., 2002, 2003; He et al., 2004; Lombardo et al., 2006; Lee

et al., 2008; Fernández-Marcos et al., 2011; Giudice et al., 2011; Kwon et al., 2012). En el

contexto de nuestro trabajo resulta especialmente interesante el trabajo de Wang et al.

(2012) analizando procesos de desarrollo en la especie vegetal Camelia sinensis.

Basándose en los resultados obtenidos con un donador de NO estos autores sugieren que

el NO retrasa tanto la germinación del grano de polen como el desarrollo del tubo polínico

en C. sinensis. Esto supone que observamos efectos parecidos del NO en el desarrollo de

estructuras similares en especies pertenecientes a grupos taxonómicos muy diferentes,

plantas y hongos. Este paralelismo probablemente indique un grado de conservación de

los componentes implicados en la formación de dichas estructuras.

La aproximación farmacológica considerada en los estudios que hemos descrito utiliza

donadores de NO. En la mayor parte de los sistemas investigados la exposición a NO

exógeno determina la inducción de la expresión del gen, o de los genes, FHG, como parte

de un sistema de defensa inducible frente a estrés nitrosativo. Pero también en la mayor

parte de los sistemas vivos se ha demostrado la producción de NO endógeno, en particular

en especies de hongos en los que se ha demostrado esta producción tanto mediante la vía

oxidativa como mediante la vía reductiva (revisado en Roszer, 2012). El microorganismo

debe hacer frente también, indudablemente, al NO producido de forma endógena, haciendo


- 192 -

uso de mecanismos de detoxificación en los que participan las enzimas FHG. El control de

los niveles de NO, resultantes de la producción endógena y de la detoxificación por enzimas

FHG, permite considerar este control como un mecanismo importante en la regulación de

procesos de diferenciación y desarrollo en este grupo de organismos. En este sentido

apuntan las observaciones llevadas a cabo en B. cinerea y en A. nidulans. En el primero

se ha demostrado la producción de NO por parte del hongo, aunque no ha sido posible

determinar el mecanismo mediante el cual éste es generado (Turrión-Gómez and Benito,

2011). En este sistema la expresión de Bcfhg1 está regulada durante el desarrollo,

mostrando un máximo de expresión coincidente con la germinación en ausencia de NO

exógeno (Turrión-Gómez et al., 2010). A. nidulans también produce NO, en este caso

mediante un sistema dependiente al menos parcialmente de la actividad NR, y esta

producción está regulada durante el desarrollo, aumentando en las fases tempranas de la

transición de crecimiento vegetativo a conidiación (Marcos et al., 2016). Es interesante

destacar que en A. nidulans niaD y fhbA muestran una inducción transitoria de la expresión

durante la inducción de la conidiación. Por su parte, fhbB muestra un patrón de expresión

diferente caracterizado por una expresión moderada en la fase de inicio de la conidiación

y una fuerte inducción en fases más tardías (Marcos et al., 2016). Todo ello sugiere que en

este grupo de organismos, representados por B. cinerea y A. nidulans, el NO endógeno

puede condicionar procesos tales como la conidiación o la germinación de las esporas y

que éstos son regulados mediante la modulación de los niveles de expresión de los genes

codificadores de enzimas FHG que detoxifican el NO. En los sistemas que poseen varios

genes FHG esto puede implicar una regulación diferencial de la expresión de unos y otros,

y la asunción de papeles o funciones específicas.

F. oxysporum posee, como se demuestra en este trabajo, cuatro genes codificadores de

FHG, los cuales muestran patrones de expresión diferentes. En el curso de este trabajo

hemos obtenido, utilizando procedimientos basados en microscopía de fluorescencia, unas

primeras evidencias de que F. oxysporum también produce NO (resultados no mostrados).

Todas estas observaciones contribuyen a dibujar el comportamiento de un hongo muy

“versátil” desde un punto de vista metabólico, que puede crecer tanto en amonio como en

nitrato en condiciones de aerobiosis, que también puede desarrollarse en condiciones de

denitrificación y crecer en anaerobiosis, y que puede resultar expuesto a posibles fuentes

internas y externas de NO. La disponibilidad de distintas enzimas FHG puede conferir

ventajas adaptativas en condiciones ambientales y de acceso a nutrientes muy diversas.

Discusión

- 193 -

4.7 El papel de los genes FHG durante la interacción con el huésped

El análisis de expresión de los genes FHG de F. oxysporum in planta demuestra que los

niveles de expresión de los genes FHG2, FHG3 y FHG4 son muy estables a lo largo del

proceso de infección en los tiempos considerados en nuestro estudio, desde 1 dpi hasta

14 dpi. Sólo en el caso del gen FHG1 se detectan variaciones significativas en el nivel de

expresión, que aumenta a lo largo del tiempo (del progreso de la infección), triplicando su

nivel de expresión a 7 dpi. La situación es muy similar en ambas cepas. Dado que éstas

difieren significativamente en la virulencia frente a plantas de judía, no parece que la

expresión de los genes FHG esté correlacionada con la viruencia exhibida durante la

colonización del huésped.

Como hemos comprobado en este trabajo, FHG1 responde a nivel transcripcional de forma

específica a la exposición a NO durante el cultivo en medios sintéticos. Teniendo en cuenta

esta observación es posible proponer que durante la interacción tanto de la cepa FOP-SP1

como de la cepa FOP-SP4 de F. oxysporum con su huésped, el patógeno debe resultar

expuesto a NO. Aunque no puede descartarse que el patógeno pueda producir por sí

mismo NO a niveles superiores en respuesta a algún tipo de estímulo de la planta durante

la interacción con ésta, parece razonable asumir que es la propia planta la que produce

NO como consecuencia de la activación de los mecanismos de defensa, en el curso de los

cuales se producen y liberan cantidades importantes de AOS y RNS (Delledone et al., 1998;

Delledone et al., 2001) a los que el hongo resultará expuesto. En esta situación, y dada la

toxicidad del NO sobre los microorganismos, la eliminación de componentes importantes

en la detoxificación de NO bien podría determinar una reducción de la capacidad de

desarrollo del patógeno in planta con la consiguiente reducción de virulencia. Esta situación

ha sido descrita en algunas interacciones planta-patógeno (Favey et al., 1995; Boccara et

al., 2005) y también en algunas interacciones en las que participan microorganismos

patógenos de la especie humana (Crawford and Goldberg, 1998; de Jesús-Barrios et al.,

2003; Ullmann et al., 2004). En F. oxysporum, el trabajo descrito en esta memoria

demuestra que la eliminación de FHG1, al igual que la de los otros tres genes FHG, no

determina reducción de la capacidad de infección de ninguna de las dos estirpes

analizadas. Tampoco se observa reducción de virulencia en los mutantes ΔFHG2 en los

que se ha silenciado el gen FHG1. Es posible concluir, por lo tanto, que los genes FHG no

son factores de patogenicidad en FOP. Esta es una situación descrita recientemente en

distintos sistemas en los que a priori se suponía un papel importante de las enzimas de

tipo flavohemoglobina como factores de patogenicidad. Por ejemplo, en B. cinerea los


- 194 -

mutantes deficientes en el gen Bcfhg1, único gen codificador de una enzima

flavohemoglobina en este hongo necrótrofo, son hipersensibles a NO pero no muestran

una reducción en su patogenicidad ni virulencia (Turrión-Gómez et al., 2010). En A.

fumigatus los mutantes deficientes en los genes codificadores de enzimas

flavohemoglobina muestran la misma agresividad en sistemas modelo de infección

(ratones) que la cepa tipo silvestre (Lapp et al., 2014). Estas observaciones, que provienen

de sistemas muy diferentes, proporcionan evidencias que contradicen, al menos en parte,

la visión más clásica de la interacción, según la cual el microorganismo sufre una situación

de estrés nitrosativo, además de estrés oxidativo, durante su interacción con el huésped.

En el caso de FOP, el hecho de que los mutantes ΔFHG infecten a su huésped de igual

manera que las cepas tipo silvestre supone que, o bien los niveles de NO producidos

durante la interacción no son lo suficientemente elevados como para determinar una

limitación en su crecimiento in planta, o bien que F. oxysporum dispone de otros sistemas

de detoxificación de NO.

CONCLUSIONES

Conclusiones

- 195 -

5 CONCLUSIONES

- Las estirpes FOP-SP1 y FOP-SP4 de F. oxysporum f. sp. phaseoli poseen cuatro genes

codificadores de enzimas de tipo flavohemoglobina, FHG1, FHG2, FHG3 y FHG4. Son

cuatro genes de copia única y carecen de intrones. Las proteínas codificadas presentan la

organización en dominios funcionales característica de las enzimas de tipo

flavohemoglobina. El análisis bioinformático indica que FHG1, FHG2 y FHG3 son proteínas

de localización citoplasmática mientras que FHG4 es una proteína de localización

mitocondrial.

- El patrón de expresión de los genes FHG en relación con los factores “estado de

desarrollo”, “fuente de nitrógeno” y “exposición a NO”, es específico de cada gen y similar

en ambas cepas.

- FHG1, y en menor medida FHG2, incrementan sus niveles de expresión durante la

germinación de las esporas en respuesta a la exposición a NO. La expresión de FHG2 está

regulada, además, por la fuente de nitrógeno y el estado de desarrollo. La regulación de la

expresión de FHG3 es compleja, pero no resulta obvia, en general, una regulación por

exposición a NO. FHG4 no responde a nivel transcripcional a ninguno de los factores

evaluados en nuestro análisis.

- El nivel de expresión de FHG1 aumenta a medida que progresa la infección, tanto en la

interacción de plantas de judía FOP-SP1 como en la interacción con la estirpe FOP-SP4.

El nivel de expresión de los genes FHG2, FHG3 y FHG4 no varía a lo largo del proceso de

infección.

- Los mutantes simples deficientes en cada uno de los genes FHG de las estirpes FOP-SP1

y FOP-SP4 no muestran ninguna alteración evidente que afecte a su capacidad de

crecimiento en medios de cultivo artificiales o a su desarrollo.

- Las flavohemoglobinas FHG1 y FHG2, pero no las flavohemoglobinas FHG3 y FHG4, son

esenciales para proporcionar los niveles de resistencia frente a condiciones de estrés

nitrosativo mostrados por las estirpes silvestres FOP-SP1 y FOP-SP4. .


- 196 -

- La exposición a NO en FOP-SP1 y en FOP-SP4 determina un retraso en la germinación

de los microconidios. La caracterización funcional de los mutantes ΔFHG demuestra que

FHG1 es la flavohemoglobina que desempeña una función principal en la eliminación del

NO que afecta a la germinaciónde las esporas.

- Las flavohemoglobinas codificadas por los genes analizados en este trabajo no constituyen

factores de virulencia en F. oxysporum.

BIBLIOGRAFÍA

Bibliografía

- 197 -

6 BIBLIOGRAFÍA

Adams, J. M., & Cory, S. 2002. Apoptosomes: engines for caspase activation. Current Opinion in Cell Biology 14(6):715-720.

Agrios, G.N. 1997. Plant pathology, 4th edn. San Diego, CA, USA: Academic Press Ltd. Akagi, Y., Akamatsu, H., Otani, H., & Kodama, M. 2009. Horizontal chromosome transfer,

a mechanism for the evolution and differentiation of a plant-pathogenic fungus. Eukaryotic Cell 8(11):1732-1738.

Alderton, W. K., Cooper, C. H., & Knowles, R. 2001. Nitric oxide synthases: structure,

function and inhibition. Biochemistry Journal 357:593-615. Aloj, B., Maziano, F., Zoina, A. & Noviello, C. 1983. La tracheofusariosi del fagiolo in Italia.

Informatore Fitopatologico 11: 63-66. Aloj, B., Marziano, F., Zoina, A. and Noviello, C. 1987. Osservazioni su una nuova razza

fisiologica de Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli. "Annali" della FAcoltà di Scienze Agrarie dellÚniversità di Napoli in Portici. Serie IV, vol. XXI, pp. 51-55.

Alves-Santos, F. M., Benito, E. P., Eslava, A. P., & Díaz-Mínguez, J. 1999. Genetic Diversity

of Fusarium oxysporum Strains from Common Bean Fields in Spain. Applied and Environmental Microbiology 65(8):3335-3340.

Alves‐Santos, F. M., Cordeiro‐Rodrigues, L., Sayagués, J. M., Martín‐Domínguez, R.,

García‐Benavides, P., Crespo, M. C., & Eslava, A. P. 2002a. Pathogenicity and race characterization of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli isolates from Spain and Greece. Plant Pathology 51(5):605-611.

Alves-Santos, F. M., Ramos, B., García-Sánchez, M. A., Eslava, A. P., & Díaz-Mínguez, J.

M. 2002b. A DNA-based procedure for in planta detection of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli. Phytopathology 92(3):237-244.

Andrianopoulos, A., Kourambas, S., Sharp, J. A., Davis, M. A., & Hynes, M. J. 1998.

Characterization of the Aspergillus nidulans nmrA gene involved in nitrogen metabolite repression. Journal of Bacteriology 180(7):1973-1977.

Appel, D. J., & Gordon, T. R. 1995. Intraspecific variation within populations of Fusarium

oxysporum based on RFLP analysis of the intergenic spacer region of the rDNA. Experimental Mycology 19(2):120-128.

Arasimowicz‐Jelonek, M., & Floryszak‐Wieczorek, J. 2014. Nitric oxide: an effective weapon

of the plant or the pathogen. Molecular Plant Pathology 15(4):406-416. Baayen, R. P., O'Donnell, K., Bonants, P. J., Cigelnik, E., Kroon, L. P., Roebroeck, E. J., &

Waalwijk, C. 2000. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology 90(8):891-900.


- 198 -

Baidya, S., Cary, J. W., Grayburn, W. S., & Calvo, A. M. 2011. Role of nitric oxide and flavohemoglobin homolog genes in Aspergillus nidulans sexual development and mycotoxin production. Applied and Environmental Microbiology 77(15): 5524-5528.

Bang, I. S., Liu, L., Vazquez-Torres, A., Crouch, M. L., Stamler, J. S., & Fang, F. C. 2006.

Maintenance of nitric oxide and redox homeostasis by the Salmonella flavohemoglobin hmp gene. Journal of Biological Chemistry 281(38): 28039-28047.

Beckman, C.H. 1987. The nature of wilt diseases of plants. American Phytopathological

Society. EEUU. Belenghi, B., Romero-Puertas, M. C., Vercammen, D., Brackenier, A., Inzé, D., Delledonne,

M., & Van Breusegem, F. 2007. Metacaspase activity of Arabidopsis thaliana is regulated by S-nitrosylation of a critical cysteine residue. Journal of Biological Chemistry 282(2): 1352-1358.

Beligni, M. V. & Lamattina, L. 2000. Nitric oxide stimulates seed germination and de-

etiolation, and inhibits hypocotyl elongation, three light-inducible responses in plants. Planta 210(2): 215-21.

Benlloch, M, Cañizo JD. 1926. La enfermedad de las alubias en barco de ávila. Boletín de

la Estación de Patología Vegetal 1: 2-7.

Berger, H., Basheer, A., Böck, S., Reyes‐Dominguez, Y., Dalik, T., Altmann, F., & Strauss, J. 2008. Dissecting individual steps of nitrogen transcription factor cooperation in the Aspergillus nidulans nitrate cluster. Molecular Microbiology 69(6): 1385-1398.

Bernreiter, A., Ramón, A., Fernández-Martínez, J., Berger, H., Araújo-Bazan, L., Espeso,

E. A., & Strauss, J. 2007. Nuclear export of the transcription factor NirA is a regulatory checkpoint for nitrate induction in Aspergillus nidulans. Molecular and Cellular Biology 27(3): 791-802.

Besson-Bard, A., Pugin, A., & Wendehenne, D. 2008. New insights into nitric oxide signaling

in plants. Annual Review Plant Biology 59: 21-39. Bethke, P. C., Gubler, F., Jacobsen, J. V., & Jones, R. L. 2004. Dormancy of Arabidopsis

seeds and barley grains can be broken by nitric oxide. Plant Journal 219(5): 847-855.

Boccara, M., Mills, C.E., Zeier, J., Anzi, C., Lamb, C., Poole, R.K., & Delledonne, M. 2005.

Flavohaemoglobin HmpX from Erwinia chrysanthemi confers nitrosative stress tolerance and affects the plant hypersensitive reaction by intercepting nitric oxide produced by the host. The Plant Journal 43:226-37.

Bonfoco, E., Krainc, D., Ankarcrona, M., Nicotera, P., & Lipton, S.A. 1995. Apoptosis and

necrosis - 2 distinct events induced, respectively, by mild and intense insults with N-methyl-D-aspartate or nitric oxide superoxide in cortical cell cultures. Proceedings of the National Academy of Science of the. U. S. A. 92:7162-7166.

Booth, C., Moss, M. O., & Smith, J. E. 1984. The Fusarium problem: historical, economic

and taxonomic aspects. In The Applied Mycology of Fusarium. Symposium of the British Mycological Society held at Queen Mary College, London, September 1982. (pp. 1-13). Cambridge University Press.

Bibliografía

- 199 -

Boveris, A., Costa, L. E., Poderoso, J. J., Carreras, M. C., & Cadenas, E. 2000. Regulation of mitochondrial respiration by oxygen and nitric oxide. Annals of the New York Academy of Sciences 899(1): 121-135.

Bright, J., Desikan, R., Hancock, J. T., Weir, I. S., & Neill, S. J. 2006. ABA‐induced NO

generation and stomatal closure in Arabidopsis are dependent on H2O2 synthesis. The Plant Journal 45(1): 113-122.

Buisson, N., & Labbe-Bois, R. 1998. Flavohemoglobin Expression and Function in

Saccharomyces cerevisiae NO relationship with respiration and complex response to oxidative stress. Journal of Biological Chemistry 273(16): 9527-9533.

Burnett, J. H. 1984. Aspects of Fusarium genetics. The Applied Mycology of Fusarium In

pp. 39-69.Held at Queen Mary Collage of London. Cadenas, E., & Davies, K. J. 2000. Mitochondrial free radical generation, oxidative stress,

and aging. Free Radical Biology and Medicine 29(3): 222-230. Cañero, D. C., & Roncero, M. I. G. 2008. Functional analyses of laccase genes from

Fusarium oxysporum. Phytopathology 98(5): 509-518. Cartharius, K., Frech, K., Grote, K., Klocke, B., Haltmeier, M., Klingenhoff, A., & Werner, T.

2005. MatInspector and beyond: promoter analysis based on transcription factor binding sites. Bioinformatics 21(13): 2933-2942.

Cassanova, N., O'Brien, K. M., Stahl, B. T., McClure, T., & Poyton, R. O. 2005. Yeast

Flavohemoglobin, a Nitric Oxide Oxidoreductase, Is Located in Both the Cytosol and the Mitochondrial Matrix effects of respiration, anoxia, and the mitochondrial genome on its intracellular level and distribution. Journal of Biological Chemistry 280(9): 7645-7653.

Cevahir, G., Aytamka, E., & Erol, Ç. 2007. The role of nitric oxide in plants. Biotechnology

& Biotechnological Equipment 21(1): 13-17. Coppin, E., Debuchy, R., Arnaise, S., & Picard, M. 1997. Mating types and sexual

development in filamentous ascomycetes. Microbiology and Molecular Biology Reviews 61(4): 411-428.

Corker, H., & Poole, R. K. 2003. Nitric oxide formation by Escherichia coli dependence on

nitrite reductase, the no-sensing regulator Fnr, and flavohemoglobin Hmp. Journal of Biological Chemistry 278(34): 31584-31592.

Corpas, F. J., Barroso, J. B., & del Rıo, L. A. 2001. Peroxisomes as a source of reactive

oxygen species and nitric oxide signal molecules in plant cells. Trends in Plant Science 6(4): 145-150.

Courtois, C., Besson, A., Dahan, J., Bourque, S., Dobrowolska, G., Pugin, A., &

Wendehenne, D. 2008. Nitric oxide signalling in plants: interplays with Ca2+ and protein kinases. Journal of Experimental Botany 59(2): 155-163.

Cove, D. J. 1979. Genetic studies of nitrate assimilation in Aspergillus nidulans. Biological

Reviews 54(3): 291-327.


- 200 -

Chichkova, N.V., Kim, S.H., Titova, E.S., Kalkum, M., Morozov, V.S., Rubtsov, Y.P., Kalinina, N.O., Taliansky, M.E., & Vartapetian, A.B. 2004. A plant caspase-like protease activated during the hypersensitive response. Plant Cell 16: 157-171.

Cramm, R., Siddiqui, R. A., & Friedrich, B. 1994. Primary sequence and evidence for a

physiological function of the flavohemoprotein of Alcaligenes eutrophus. Journal of Biological Chemistry 269(10): 7349-7354.

Crawford, M. J., & Goldberg, D. E. 1998b. Role for the Salmonella flavohemoglobin in

protection from nitric oxide. Journal of Biological Chemistry 273(20): 12543-12547. Crawford, M. J., & Goldberg, D. E. 1998a. Regulation of the Salmonella typhimurium

Flavohemoglobin Gene a new pathway for bacterial gene expression in response to nitric oxide. Journal of Biological Chemistry 273(51): 34028-34032.

Cueto, M., Hernández-Perera, O., Martín, R., Bentura, M. L., Rodrigo, J., Lamas, S., &

Golvano, M. P. 1996. Presence of nitric oxide synthase activity in roots and nodules of Lupinus albus. FEBS Letters 398(2): 159-164.

Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. Y., & Kang, S. 2007. In vivo

time-lapse documentation using confocal and multi-photon microscopy reveals the mechanisms of invasion into the Arabidopsis root vascular system by Fusarium oxysporum. Fungal Genetics and Biology 44(10): 1011-1023.

Daboussi, M. J., & Capy, P. 2003. Transposable elements in filamentous fungi. Annual

Reviews in Microbiology 57(1): 275-299. de Jesús-Berrıos, M., Liu, L., Nussbaum, J. C., Cox, G. M., Stamler, J. S., & Heitman, J.

2003. Enzymes that counteract nitrosative stress promote fungal virulence. Current Biology 13(22): 1963-1968.

de Vega-Bartol, J. J., Tello, V., Niño, J., Casado, V., & Díaz-Mínguez, J. M. 2013.

Quantitative PCR Analysis of Double-Stranded RNA-Mediated Gene Silencing in Fungi. In Laboratory Protocols in Fungal Biology (pp. 279-287). Springer New York

de Vega-Bartol, J. J., Martín-Dominguez, R., Ramos, B., García-Sánchez, M. A., & Díaz-

Mínguez, J. M. 2011. New virulence groups in Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli: the expression of the gene coding for the transcription factor ftf1 correlates with virulence. Phytopathology 101(4): 470-479.

Deighton, F. C., Stevenson, J. A., & Cummins, G. B. 1962. Formae speciales and the

code. International Association for Plant Taxonomy 11(3): 70-71. Delledonne, M., Xia, Y., Dixon, R. A., Lamb, C. 1998. Nitric oxide functions as a signal in

plant disease resistance. Nature 394(6693): 585-8. Delledonne, M., Zeier, J., Marocco, A., Lamb, C. 2001. Signal interactions between nitric

oxide and reactive oxygen intermediates in the plant hypersensitive disease resistance response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 98(23): 13454-9.

Bibliografía

- 201 -

Di Pietro, A. D., Madrid, M. P., Caracuel, Z., Delgado‐Jarana, J., & Roncero, M. I. G. 2003. Fusarium oxysporum: exploring the molecular arsenal of a vascular wilt fungus. Molecular Plant Pathology 4(5): 315-325.

Di Pietro, A., García‐Maceira, F. I., Meglecz, E., & Roncero, M. I. G. 2001. A MAP kinase

of the vascular wilt fungus Fusarium oxysporum is essential for root penetration and pathogenesis. Molecular Microbiology 39(5): 1140-1152.

Díaz-Mínguez, J. M., Alves-Santos, F. M., Benito, E. P., & Eslava, A. P. 1996. Fusarium wilt

of common bean in the Castilla y Leon region of Spain. Plant Disease 80(5): 600. Dunn-Coleman, N. S., Tomsett, A. B., & Garrett, R. H. 1981. The regulation of nitrate

assimilation in Neurospora crassa: biochemical analysis of the nmr-1 mutants. Molecular and General Genetics MGG 182(2): 234-239.

Durner, J., & Klessig, D. F. 1999. Nitric oxide as a signal in plants. Current Opinion in Plant

Biology 2(5): 369-374. Ermler, U., Siddiqui, R. A., Cramm, R., & Friedrich, B. 1995. Crystal structure of the

flavohemoglobin from Alcaligenes eutrophus at 1.75 Aº resolution. The EMBO Journal 14(24): 6067.

Favey, S., Labesse, G., Vouille, V., & Boccara, M. 1995. Flavohaemoglobin HmpX: a new

pathogenicity determinant in Erwinia chrysanthemi strain 3937. Microbiology 141(4): 863-871.

Feechan, A., Kwon, E., Yun, B. W., Wang, Y., Pallas, J. A., & Loake, G. J. 2005. A central

role for S-nitrosothiols in plant disease resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 102(22): 8054-8059.

Fernández-Marcos, M., Sanz, L., Lewis, D. R., Muday, G. K., & Lorenzo, O. 2011. Nitric

oxide causes root apical meristem defects and growth inhibition while reducing PIN-FORMED 1 (PIN1)-dependent acropetal auxin transport. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 108(45): 18506-18511.

Fitzhugh, A. L., & Keefer, L. K. 2000. Diazeniumdiolates: Pro-and antioxidant applications

of the “NONOates. Free Radical Biology and Medicine 28(10): 1463-1469. Frandsen, R. J., Andersson, J. A., Kristensen, M. B., & Giese, H. 2008. Efficient four

fragment cloning for the construction of vectors for targeted gene replacement in filamentous fungi. BMC Molecular Biology 9(1): 1.

Freschi, L., Rodrigues, M. A., Domingues, D. S., Purgatto, E., Van Sluys, M. A., Magalhaes,

J. R., & Mercier, H. 2010. Nitric oxide mediates the hormonal control of Crassulacean acid metabolism expression in young pineapple plants. Plant Physiology 152(4): 1971-1985.

García-Martínez, J., Ádám, A. L., & Avalos, J. 2012. Adenylyl cyclase plays a regulatory

role in development, stress resistance and secondary metabolism in Fusarium fujikuroi. PloS One 7(1): e28849.


- 202 -

Gardner, P.R., Gardner, A.M., Martin, L.A., & Salzman, A.L. 1998. Nitric oxide dioxygenase: an enzymic function for flavohemoglobin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 95:10378-83.

Gardner, P. R. 2005. Nitric oxide dioxygenase function and mechanism of flavohemoglobin,

hemoglobin, myoglobin and their associated reductases. Journal of Inorganic Biochemistry 99(1): 247-266.

Geiser, D. M., Jiménez-Gasco, M. M., Kang, S., Makalowska, I., Veeraraghavan, N., Ward,

T. J., Zhang, N., Kuldau, A. & O´Donell, K. 2004. Fusarium-ID v. 1.0: A DNA sequence database for identifying Fusarium. European Journal of Plant Pathology 110: 473-479.

Gepts, P., & Bliss, F. A. 1988. Dissemination pathways of common bean (Phaseolus

vulgaris, Fabaceae) deduced from phaseolin electrophoretic variability. II. Europe and Africa. Economic Botany 42(1): 86-104.

Gerlach, W. & Niremberg, H. 1982. The genus Fusarium, a pictorical atlas. Mitteilungen aus

der Bioloischen Bundesansalt für Land- und Forstwirschaft. 406. Gilberthorpe, N. J., & Poole, R. K. 2008. Nitric Oxide Homeostasis in Salmonella

typhimurium roles of respiratory nitrate reductase and flavohemoglobin. Journal of Biological Chemistry 283(17): 11146-11154.

Godard, P., Urrestarazu, A., Vissers, S., Kontos, K., Bontempi, G., van Helden, J., & André,

B. 2007. Effect of 21 different nitrogen sources on global gene expression in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology 27(8): 3065-3086.

Gong, X., Fu, Y., Jiang, D., Li, G., Yi, X., & Peng, Y. 2007. L-arginine is essential for

conidiation in the filamentous fungus Coniothyrium minitans. Fungal Genetics and Biology 44(12): 1368-1379.

Gordon, T. R., & Martyn, R. D. 1997. The evolutionary biology of Fusarium

oxysporum. Annual Review of Phytopathology 35(1): 111-128. Glass, N. L., Jacobson, D. J., & Shiu, P. K. 2000. The genetics of hyphal fusion and

vegetative incompatibility in filamentous ascomycete fungi. Annual review of genetics 34(1): 165-186.

Guadet, J., Julien, J., Lafay, J. F., & Brygoo, Y. 1989. Phylogeny of some Fusarium species,

as determined by large-subunit rRNA sequence comparison. Molecular Biology and Evolution 6(3): 227-242.

Hagedorn, D. J. 1991. Compendium of bean diseases. Hall, R. (Ed). APS Press, pp. 20. Han, Y., Liu, X., Benny, U., Kistler, H. C., & VanEtten, H. D. 2001. Genes determining

pathogenicity to pea is clustered on a supernumerary chromosome in the fungal plant pathogen Nectria haematococca. The Plant Journal 25(3): 305-314.

Hausladen, A., Gow, A. J., & Stamler, J. S. 1998. Nitrosative stress: metabolic pathway

involving the flavohemoglobin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 95(24): 14100-14105.

Bibliografía

- 203 -

He, Y., Tang, R. H., Hao, Y., Stevens, R. D., Cook, C. W., Ahn, S. M., Jing, L., Yang, Z., Chen, L., Guo, F., Fiorani, F., Jackson, R. B., Crawford, N. M., & Pei, Z. M. 2004. Nitric oxide represses the Arabidopsis floral transition. Science 305(5692): 1968-71.

Heidmann, S., Obermaier, B., Vogel, K., & Domdey, H. 1992. Identification of pre-mRNA

polyadenylation sites in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Biological Chemistry 12: 4215-4229.

Hernández-Urzúa, E., Mills, C. E., White, G. P., Contreras-Zentella, M. L., Escamilla, E.,

Vasudevan, S. G., & Poole, R. K. 2003. Flavohemoglobin Hmp, but not its individual domains, confers protection from respiratory inhibition by nitric oxide in Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry 278(37): 34975-34982.

Hess, D. T., Matsumoto, A., Kim, S. O., Marshall, H. E., & Stamler, J. S. 2005. Protein S-

nitrosylation: purview and parameters. Nature Reviews Molecular Cell Biology 6(2): 150-166.

Hromatka, B.S., Noble, S.M., y Johnson, A.D. 2005. Transcriptional response of Candida

albicans to nitric oxide and the role of the YHB1 gene in nitrosative stress and virulence. Journal of Biological Chemistry 16: 4814-4826.

Houterman, P. M., Ma, L., Van Ooijen, G., De Vroomen, M. J., Cornelissen, B. J., Takken,

F. L., & Rep, M. 2009. The effector protein Avr2 of the xylem‐colonizing fungus

Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I‐2 intracellularly. The Plant Journal 58(6): 970-978.

Ignarro, L. J. 1990. Biosynthesis and metabolism of endothelium-derived nitric

oxide. Annual Review of Pharmacology and Toxicology 30(1): 535-560. Napoli, C., & Ignarro, L. J. 2009. Nitric oxide and pathogenic mechanisms involved in the

development of vascular diseases. Archives of Pharmacal Research 32(8): 1103-1108.

Iijima, M., Shimizu, H., Tanaka, Y., & Urushihara, H. 2000. Identification and

characterization of two flavohemoglobin genes in Dictyostelium discoideum. Cell Structure and Function 25(1): 47-55.

Ilari, A., Bonamore, A., Farina, A., Johnson, K. A., & Boffi, A. 2002. The X-ray Structure of

Ferric Escherichia coli Flavohemoglobin Reveals an Unexpected Geometry of the Distal Heme Pocket. Journal of Biological Chemistry 277(26): 23725-23732.

Imazaki, I., Kurahashi, M., Iida, Y., & Tsuge, T. 2007. Fow2, a Zn (II) 2Cys6‐type

transcription regulator, controls plant infection of the vascular wilt fungus Fusarium oxysporum. Molecular Microbiology 63(3): 737-753.

Jasid, S., Simontacchi, M., Bartoli, C. G., & Puntarulo, S. 2006. Chloroplasts as a nitric

oxide cellular source. Effect of reactive nitrogen species on chloroplastic lipids and proteins. Plant Physiology 142(3): 1246-1255.

Jonkers, W., Xayamongkhon, H., Haas, M., Olivain, C., Does, H. C., Broz, K., & Kistler, H.

C. 2014. EBR1 genomic expansion and its role in virulence of Fusarium species. Environmental Microbiology 16(7): 1982-2003.


- 204 -

Kaiser, W. M., Gupta, K. J., & Planchet, E. 2006. Higher plant mitochondria as a source for NO. In Nitric Oxide in Plant Growth, Development and Stress Physiology (pp. 1-14). Springer Berlin Heidelberg.

Kanadia, R. N., Kuo, W. N., Mcnabb, M., & Botchway, A. 1998. Constitutive nitric oxide

synthase in Saccharomyces cerevisiae. IUBMB Life 45(6): 1081-1087. Kazan, K., Gardiner, D. M., & Manners, J. M. 2012. On the trail of a cereal killer: recent

advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance. Molecular Plant Pathology 13(4): 399-413.

Kendrick, J. B. & Snyder, W. C. 1942. Fusarium yellows of beans. Phytopathology 32: 1010-

1014. Kerényi, Z., Moretti, A., Waalwijk, C., Oláh, B., & Hornok, L. 2004. Mating type sequences

in asexually reproducing Fusarium species. Applied and Environmental Microbiology 70(8): 4419-4423.

Keszthelyi, A., Jeney, A., Kerényi, Z., Mendes, O., Waalwijk, C., & Hornok, L. 2007. Tagging

target genes of the MAT1-2-1 transcription factor in Fusarium verticillioides (Gibberella fujikuroi MP-A). Antonie Van Leeuwenhoek, 91(4): 373-391.

Kistler, H. C. 2001. Evolution of host specificity in Fusarium oxysporum. In: Summerell BA,

Leslie JF, Backhouse WL, Burgess LW, editors. Fusarium: Paul E Nelson Memorial Symposium. St. Paul: APS Press. pp. 70–82.

Kistler, H. C., Benny, U., Boehm, E. W. A., & Katan, T. 1995. Genetic duplication in

Fusarium oxysporum. Current Genetics 28(2): 173-176. Knogge, W. 1996. Molecular basis of specificity in host/fungus interactions. European

Journal of Plant Pathology 102(9): 807-816. Kobayashi, M., & Shoun, H. 1995. The copper-containing dissimilatory nitrite reductase

involved in the denitrifying system of the fungus Fusarium oxysporum. Journal of Biological Chemistry 270(8): 4146-4151.

Kudla, B., Caddick, M. X., Langdon, T., Martinez-Rossi, N. M., Bennett, C. F., Sibley, S., &

Arst Jr, H. N. 1990. The regulatory gene areA mediating nitrogen metabolite repression in Aspergillus nidulans. Mutations affecting specificity of gene activation alter a loop residue of a putative zinc finger. The EMBO Journal 9(5): 1355.

Kuo, P. C., & Schroeder, R. A. 1995. The emerging multifaceted roles of nitric oxide. Annals

of Surgery 221(3): 220. Kwon, E., Feechan, A., Yun, B. W., Hwang, B. H., Pallas, J. A., Kang, J. G., & Loake, G. J.

2012. AtGSNOR1 function is required for multiple developmental programs in Arabidopsis. Plant Journal 236(3): 887-900.

LaCelle, M., Kumano, M., Kurita, K., Yamane, K., Zuber, P., & Nakano, M. M. 1996. Oxygen-

controlled regulation of the flavohemoglobin gene in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 178(13): 3803-3808.

Laday, M., & Szecsi, A. 2002. Identification of Fusarium species by isozyme analysis. Acta

Microbiologica et Immunologica Hungarica 49(2-3): 321-330.

Bibliografía

- 205 -

Lapp, K., Vödisch, M., Kroll, K., Strassburger, M., Kniemeyer, O., Heinekamp, T., & Brakhage, A. A. 2014. Characterization of the Aspergillus fumigatus detoxification systems for reactive nitrogen intermediates and their impact on virulence. Frontiers in Microbiology 5:469.

Lazo, G.R., Stein, P.A. & Ludwig, R.A. 1991. A DNA transformation-competent Arabidopsis

genomic library in Agrobacterium. Biotechnology 9: 963-7. Lee, J., Myong, K., Kim, J. E., Kim, H. K., Yun, S. H., & Lee, Y. W. 2012. FgVelB globally

regulates sexual reproduction, mycotoxin production and pathogenicity in the cereal pathogen Fusarium graminearum. Microbiology 158(7): 1723-1733.

Lee, U., Wie, C., Fernandez, B. O., Feelisch, M., & Vierling, E. 2008. Modulation of

nitrosative stress by S-nitrosoglutathione reductase is critical for thermotolerance and plant growth in Arabidopsis. Plant Cell 20(3): 786-802.

Leslie, J. F. 1993. Fungal vegetative compatibility. Annual Review of Phytopathology

31:127-150. Leslie, J. F., & Summerell, B. A. 2006. The Fusarium laboratory manual (Vol. 2, No. 10).

Ames, IA, USA: Blackwell Pub. Levasseur, A., Orlando, L., Bailly, X., Milinkovitch, M. C., Danchin, E. G., & Pontarotti, P.

2007. Conceptual bases for quantifying the role of the environment on gene evolution: the participation of positive selection and neutral evolution. Biological Reviews 82(4): 551-572.

Li, B., Fu, Y., Jiang, D., Xie, J., Cheng, J., Li, G., & Yi, X. 2010. Cyclic GMP as a second

messenger in the nitric oxide-mediated conidiation of the mycoparasite Coniothyrium minitans. Applied and Environmental Microbiology 76(9): 2830-2836.

Lievens, B., Brouwer, M., Vanachter, A. C., Levesque, C. A., Cammue, B. P. & Thomma,

B. P. 2003. Design and development of a DNA array for rapid detection and identification of multiple tomato vascular wilt pathogens. FEMS Microbiology Letters 223: 113-122.

Liu, J., & Zuber, P. 2000. The ClpX protein of Bacillus subtilis indirectly influences RNA

polymerase holoenzyme composition and directly stimulates σH‐dependent transcription. Molecular Microbiology 37(4: 885-897.

Lombardo, Graziano, M., Polacco, J. C., & Lamattina, L. 2006. Nitric oxide functions as a

positive regulator of root hair development. Plant Signal Behavior 1(1): 28-33. López-Berges, M. S., Rispail, N., Prados-Rosales, R. C., & Di Pietro, A. 2010. A nitrogen

response pathway regulates virulence functions in Fusarium oxysporum via the protein kinase TOR and the bZIP protein MeaB. The Plant Cell 22(7): 2459-2475.

Ma, L. J., Geiser, D. M., Proctor, R. H., Rooney, A. P., O'Donnell, K., Trail, F. & Kazan, K. 2013. Fusarium pathogenomics. Annual Review of Microbiology 67: 399-416.

Ma, L. J., Van Der Does, H. C., Borkovich, K. A., Coleman, J. J., Daboussi, M. J., Di Pietro,

A., & Houterman, P. M. 2010. Comparative genomics reveals mobile pathogenicity chromosomes in Fusarium. Nature 464(7287): 367-373.


- 206 -

MacMicking, J. D., North, R. J., La Course, R., Mudgett, J. S., Shah, S. K., & Nathan, C. F. 1997. Identification of nitric oxide synthase as a protective locus against tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 94(10): 5243-5248.

Magasanik, B. 1992. Regulation of Nitrogen Utilization. Cold Spring Harbor Monograph

Archive 21: 283-317. Magasanik, B. 2005. The transduction of the nitrogen regulation signal in Saccharomyces

cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A. 102(46): 16537-16538.

Magasanik, B., & Kaiser, C. A. 2002. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae.

Gene 290(1-2): 1-18. Maier, J., Hecker, R., Rockel, P., & Ninnemann, H. 2001. Role of nitric oxide synthase in

the light-induced development of sporangiophores in Phycomyces blakesleeanus. Plant Physiology 126: 1323-1330.

Mannick, J. B., & Schonhoff, C. M. 2002. Nitrosylation: the next phosphorylation. Archives

of Biochemistry and Biophysics 408(1): 1-6. Marchler-Bauer, A. 2015, CDD: NCBI conserved domain database. Nucleic Acids Research

43:222-6. Martín-Urdíroz, M., Roncero, M. I. G., González-Reyes, J. A., & Ruiz-Roldán, C. 2008.

ChsVb, a class VII chitin synthase involved in septation, is critical for pathogenicity in Fusarium oxysporum. Eukaryotic cell 7(1): 112-121.

Marcos, A. T., Ramos, M. S., Marcos, J. F., Carmona, L., Strauss, J., & Cánovas, D. 2016.

Nitric oxide synthesis by nitrate reductase is regulate during development in Aspergillus.Mole cular Microbiology 99(1): 15-33.

Martin, S. J., & Green, D. R. 1995. Protease activation during apoptosis: death by a

thousand cuts. Cell 82(3): 349-352. Marzluf, G. A. 1997. Genetic regulation of nitrogen metabolism in the fungi. Microbiology

and Molecular Biology Reviews 61(1): 17-32. Membrillo-Hernández, J., Coopamah, M. D., Anjum, M. F., Stevanin, T. M., Kelly, A.,

Hughes, M. N., & Poole, R. K. 1999. The flavohemoglobin of Escherichia coli confers resistance to a nitrosating agent, a “nitric oxide releaser,” and paraquat and is essential for transcriptional responses to oxidative stress. Journal of Biological Chemistry 274(2): 748-754.

Meyer, C., Lea, U. S., Provan, F., Kaiser, W. M., & Lillo, C. 2005. Is nitrate reductase a

major player in the plant NO (nitric oxide) game. Photosynthesis Research 83(2): 181-189.

Michaelis, T. E. 1991. Compendium of Bean Diseases. APS Press. Michielse, C. B., & Rep, M. 2009. Pathogen profile update: Fusarium oxysporum. Molecular

Plant Pathology 10(3): 311-324.

Bibliografía

- 207 -

Minehart, P. L., & Magasanik, B. O. R. I. S. 1991. Sequence and expression of GLN3, a positive nitrogen regulatory gene of Saccharomyces cerevisiae encoding a protein with a putative zinc finger DNA-binding domain. Molecular and Cellular Biology 11(12): 6216-6228.

Mirete, S., Patino, B., Vázquez, C., Jiménez, M., Hinojo, M. J., Soldevilla, C., & González-

Jaén, M. T. 2003. Fumonisin production by Gibberella fujikuroi strains from Pinus species. International Journal of Food Microbiology 89(2): 213-221.

Moncada, S., Rees, D. D., Schulz, R., & Palmer, R. M. 1991. Development and mechanism

of a specific supersensitivity to nitrovasodilators after inhibition of vascular nitric oxide synthesis in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A 88(6): 2166-2170.

Moore, C.M., Nakano, M.M., Wang, T., Ye, R.W., & Helmann, J.D. 2004. Response of

Bacillus subtilis to nitric oxide and the nitrosating agent sodium nitroprusside. Journal Bacteriology 186: 4655-4664.

Booth, C., Moss, M. O., & Smith, J. E. 1984. The Fusarium problem: historical, economic

and taxonomic aspects. In The applied mycology of Fusarium. Symposium of the British Mycological Society held at Queen Mary College, London, September 1982. (pp. 1-13). Cambridge University Press.

Mullins, E. D., Chen, X., Romaine, P., Raina, R., Geiser, D. M., & Kang, S. 2001.

Agrobacterium-mediated transformation of Fusarium oxysporum: an efficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer. Phytopathology 91(2): 173-180.

Mur, L. A., Kenton, P., Lloyd, A. J., Ougham, H., & Prats, E. 2008. The hypersensitive

response; the centenary is upon us but how much do we know? Journal of Experimental Botany 59(3): 501-520.

Nakanishi, Y., Zhou, S., Kim, S. W., Fushinobu, S., Maruyama, J. I., Kitamoto, K., & Shoun,

H. 2010. A eukaryotic copper-containing nitrite reductase derived from a NirK homolog gene of Aspergillus oryzae. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 74(5): 984-991.

Namiki, F., Matsunaga, M., Okuda, M., Inoue, I., Nishi, K., Fujita, Y., & Tsuge, T. 2001.

Mutation of an arginine biosynthesis gene causes reduced pathogenicity in Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Molecular Plant-Microbe Interactions 14(4): 580-584.

Napoli, C., & Ignarro, L. J. 2009. Nitric oxide and pathogenic mechanisms involved in the

development of vascular diseases. Archives of Pharmacal Research 32(8): 1103-1108.

Narendja, F., Goller, S. P., Wolschek, M., & Strauss, J. 2002. Nitrate and the GATA factor AreA are necessary for in vivo binding of NirA, the pathway‐specific transcriptional activator of Aspergillus nidulans. Molecular Microbiology 44(2): 573-583.

Neill, S. J., Desikan, R., & Hancock, J. T. 2003. Nitric oxide signalling in plants. New

Phytologist 159(1): 11-35. Nelson, P. E. 1981. Life cylcle ande epidemiology of Fusarium oxysporum. In vascular wilt,

host plants, soils, nematode interactions. Academic Press.


- 208 -

Nelson, P. E., Desjardins, A. E., & Plattner, R. D. 1996. Fumonisins, mycotoxins produced by Fusarium species: biology, chemistry, and significance. Annual review of phytopathology 31(1): 233-252.

Nelson, P. E., Dignani, M. C., & Anaissie, E. J. 1994. Taxonomy, biology, and clinical

aspects of Fusarium species. Clinical Microbiology Reviews 7(4): 479-504. Nelson, P. E., Toussoun, T. A., & Marasas, W. F. O. 1983. Fusarium species: an illustrated

manual for identification, Pennsylvania State University Press. Ninnemann, H. & Maier, J. 1996. "Indications for the occurrence of nitric oxide synthases in

fungi and plants and the involvement in photoconidiation of Neurospora crassa." Photochemmistry and Photobiology 64(2): 393-8.

Niño‐Sánchez, J., Casado‐del Castillo, V., Tello, V., de Vega‐Bartol, J. J., Ramos, B.,

Sukno, S. A., & Díaz Mínguez, J. M. 2016. The FTF gene family regulates virulence and expression of SIX effectors in Fusarium oxysporum. Molecular plant pathology.

Niño-Sánchez, J., Tello, V., Casado-del Castillo, V., Thon, M. R., Benito, E. P., & Díaz-

Mínguez, J. M. 2015. Gene expression patterns and dynamics of the colonization of common bean (Phaseolus vulgaris L.) by highly virulent and weakly virulent strains of Fusarium oxysporum. Frontiers in Microbiology 6: 234

O´Donnell, K. 2000. Molecular phylogeny of the Nectria haematococca-Fusarium solani

species complex. Mycologia 92: 919-938. O´Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E. & Ploetz, R. C. 1998. Multiple evolutionary origins

of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 95:2044-2049.

O'Donnell, K., Sarver, B. A., Brandt, M., Chang, D. C., Noble-Wang, J., Park, B. J., & Geiser,

D. M. 2007. Phylogenetic diversity and microsphere array-based genotyping of human pathogenic fusaria, including isolates from the multistate contact lens-associated US keratitis outbreaks of 2005 and 2006.Journal of Clinical Microbiology 45(7): 2235-2248.

O'Donnell, K., Sutton, D. A., Rinaldi, M. G., Magnon, K. C., Cox, P. A., Revankar, S. G., &

Padhye, A. 2004. Genetic diversity of human pathogenic members of the Fusarium oxysporum complex inferred from multilocus DNA sequence data and amplified fragment length polymorphism analyses: evidence for the recent dispersion of a geographically widespread clonal lineage and nosocomial origin. Journal of Clinical Microbiology 42(11): 5109-5120.

Olivain, C., & Alabouvette, C. 1999. Process of tomato root colonization by a pathogenic

strain of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici in comparison with a non‐pathogenic strain. New Phytologist 141(3): 497-510.

Ortoneda M., Guarro, J., Madrid, M. P., Caracuel, Z., Roncero, M. I. G., Mayayo, E., & Di

Pietro, A. 2004. Fusarium oxysporum as a multihost model for the genetic dissection of fungal virulence in plants and mammals. Infection and Immunity 72(3): 1760-1766.

Bibliografía

- 209 -

Pagnussat, G. C., Simontacchi, M., Puntarulo, S., & Lamattina, L. 2002. Nitric oxide is required for root organogenesis. Molecular Plant Pathology 129(3): 954-6.

Pareja-Jaime, Y., Roncero, M. I. G., & Ruiz-Roldán, M. C. 2008. Tomatinase from Fusarium

oxysporum f. sp. lycopersici is required for full virulence on tomato plants. Molecular Plant-Microbe Interactions 21(6): 728-736.

Pareja‐Jaime, Yolanda., Martín‐Urdíroz, Magdalena., Roncero, Mig., González‐Reyes, J.

A., & Roldán, M. D. C. R. 2010. Chitin synthase‐deficient mutant of Fusarium

oxysporum elicits tomato plant defence response and protects against wild‐type infection. Molecular Plant Pathology 11(4): 479-493.

Pastor-Corrales, M. A., & Abawi, G. S. 1987. Reactions of selected bean germ plasms to

infection by Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli. Plant Disease 71(11): 990-993. Perazzolli, M., Dominici, P., Romero-Puertas, M. C., Zago, E., Zeier, J., Sonoda, M. &

Delledonne, M. 2004. Arabidopsis nonsymbiotic hemoglobin AHb1 modulates nitric oxide bioactivity. The Plant Cell 16(10): 2785-2794.

Pérez-Nadales, E., & Di Pietro, A. 2011. The membrane mucin Msb2 regulates invasive

growth and plant infection in Fusarium oxysporum. The Plant Cell 23(3): 1171-1185. Ploetz, R. C., Trec, Ifas and Correll, J. C. 1988. Vegetative compatibility among races of

Fusarium oxysporum f.sp. cubense. Plant Disease 72(4): 325-328. Poole, R. K., & Hughes, M. N. 2000. New functions for the ancient globin family: bacterial

responses to nitric oxide and nitrosative stress. Molecular Microbiology 36(4): 775-783.

Poole, R. K., Ioannidis, N., & Orii, Y. 1994. Reactions of the Escherichia coli

flavohaemoglobin (Hmp) with oxygen and reduced nicotinamide adenine dinucleotide: evidence for oxygen switching of flavin oxidoreduction and a mechanism for oxygen sensing. Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences 255(1344): 251-258.

Poole, R.K., Anjum, M.F., Membrillo-Hernandez, J., Kim, S.O., Hughes, M.N., & Stewart, V.

1996. Nitric oxide, nitrite, and Fnr regulation of hmp (flavohemoglobin) gene expression in Escherichia coli K-12. Journal Bacteriology 178: 5487-92.

Prats, E., Carver, T. L., & Mur, L. A. 2008. Pathogen-derived nitric oxide influences

formation of the appressorium infection structure in the phytopathogenic fungus Blumeria graminis. Research in Microbiology 159(6): 476-480.

Price D. 1984. Fusarium and plant pathology: the reservoir of infection. pp. 71-93 In: Moss

MO, Smith JE. (eds.) The applied mycology of Fusarium. Cambridge University Press, Cambridge.

Price, M. N., Dehal, P. S., & Arkin, A. P. 2009. FastTree: computing large minimum evolution

trees with profiles instead of a distance matrix. Molecular Biology and Evolution 26(7): 1641-1650.

Puhalla, J. E. 1985. Classification of strains of Fusarium oxysporum based on vegetative

compatibility. Canadian Journal of Botany 63: 179-183.


- 210 -

Ramos, B., Alves-Santos, F. M., García-Sánchez, M. A., Martín-Rodrigues, N., Eslava, A. P., & Díaz-Mínguez, J. M. 2007. The gene coding for a new transcription factor (ftf1) of Fusarium oxysporum is only expressed during infection of common bean. Fungal Genetics and Biology 44(9): 864-876.

Ribeiro, R. D. L., & Hagedorn, D. J. 1979. Screening for resistance to and pathogenic

specialization of Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli, the causal agent of bean yellows. Phytopathology 69(3): 272-276.

Ribeiro, E.A., Cunha, F.Q., Tamashiro, W., & Martins, I.S. 1999. Growth phase-dependent

subcellular localization of nitric oxide synthase in maize cells. FEBS Letters 445:283-286.

Rispail, N., & Di Pietro, A. 2009. Fusarium oxysporum Ste12 controls invasive growth and

virulence downstream of the Fmk1 MAPK cascade. Molecular Plant-microbe Interactions 22(7): 830-839.

Rockel, P., Strube, F., Rockel, A., Wildt, J., & Kaiser, W. M. 2002. Regulation of nitric oxide

(NO) production by plant nitrate reductase in vivo and in vitro. Journal of Experimental Botany 53(366): 103-110.

Rodriguez-Galvez, E., & Mendgen, K. 1995. Cell wall synthesis in cotton roots after infection

with Fusarium oxysporum. Planta 197(3): 535-545. Romero-Puertas, M. C., Laxa, M., Mattè, A., Zaninotto, F., Finkemeier, I., Jones, A. M., &

Delledonne, M. 2007. S-nitrosylation of peroxiredoxin II E promotes peroxynitrite-mediated tyrosine nitration. The Plant Cell 19(12): 4120-4130.

Roszer, T. 2012. The biology of subcellular nitric oxide. London. Heidelberg, Springer. Salgado, M. O., & Schwartz, H. F. 1993. Physiologycal specialization and effects of

inoculum concentration of Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli on common beans. Plant Disease 77(5): 492-496.

Samalova, M., Johnson, J., Illes, M., Kelly, S., Fricker, M., & Gurr, S. 2013. Nitric oxide

generated by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae drives plant infection. New Phytologist 197(1): 207-222.

Samolski, I., de Luis, A., Vizcaíno, J. A., Monte, E., & Suárez, M. B. 2009. Gene expression

analysis of the biocontrol fungus Trichoderma harzianum in the presence of tomato plants, chitin, or glucose using a high-density oligonucleotide microarray. BMC Microbiology 9(1): 217.

Samuels, G. J., & Blackwell, M. 2001. Pyrenomycetes fungi with perithecia. In Systematics

and Evolution (pp. 221-255). Springer Berlin Heidelberg. Sambrook, J., Fritsch, E. F., & Maniatis, T. 1989. Molecular cloning (Vol. 2, pp. 14-9). New

Yor. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Santander, D. 2014. Estudio del metabolismo del óxido nítrico (NO) en Botrytis cinerea:

mecanismos de producción y efectos fisiológicos. Tesis Doctoral. Stamler, J. S., Simon, D. I., Osborne, J. A., Mullins, M. E., Jaraki, O., Michel, T., & Loscalzo,

J. 1992. S-nitrosylation of proteins with nitric oxide: synthesis and characterization

Bibliografía

- 211 -

of biologically active compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A 89(1): 444-448.

Sarver, A., & DeRisi, J. 2005. Fzf1p regulates an inducible response to nitrosative stress in

Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell 16(10): 4781-4791. Simontacchi, M., Jasid, S., & Puntarulo, S. 2004. Nitric oxide generation during early

germination of sorghum seeds. Plant Science 167(4): 839-847. Southern, E. M. 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated

by gel electrophoresis. Journal of Molecular Biology 98(3): 503-517. Schäfer, W. 1994. Molecular mechanisms of fungal pathogenicity to plants. Annual Review

of Phytopathology 32: 461-477. Schäfer, K., Di Pietro, A., Gow, N. A., & MacCallum, D. 2014. Murine model for Fusarium

oxysporum invasive fusariosis reveals organ-specific structures for dissemination and long-term persistence. PloS one 9(2): e89920.

Stajich, J. E., Harris, T., Brunk, B. P., Brestelli, J., Fischer, S., Harb, O. S., & Stoeckert, C.

J. 2012. FungiDB: an integrated functional genomics database for fungi. Nucleic Acids Research 40(D1): D675-D681.

Knogge, W. (1996). Fungal infection of plants. The Plant Cell 8(10): 1711. Schinko, T., Berger, H., Lee, W., Gallmetzer, A., Pirker, K., Pachlinger, R. & Strauss, J.

2010. Transcriptome analysis of nitrate assimilation in Aspergillus nidulans reveals connections to nitric oxide metabolism. Molecular Microbiology 78(3): 720-738.

Schinko, T., Gallmetzer, A., Amillis, S., & Strauss, J. 2013. Pseudo-constitutivity of nitrate-

responsive genes in nitrate reductase mutants. Fungal Genetics and Biology 54: 34-41.

Seifert, K. A., & Gams, W. 2001. The taxonomy of anamorphic fungi. In Systematics and

Evolution (pp. 307-347). Springer Berlin Heidelberg. Seifert, K. A., & Levesque, C. A. 2004. Phylogeny and molecular diagnosis of mycotoxigenic

fungi. In Molecular Diversity and PCR-detection of Toxigenic Fusarium Species and Ochratoxigenic Fungi (pp. 449-471). Springer Netherlands.

Shoun, H., Kim, D. H., Uchiyama, H., & Sugiyama, J. 1992. Denitrification by fungi. FEMS

Microbiology Letters 94(3): 277-281. Smagghe, B. J., Trent III, J. T., & Hargrove, M. S. 2008. NO dioxygenase activity in

hemoglobins is ubiquitous in vitro, but limited by reduction in vivo. PloS one 3(4): e2039.

Song, N. K., Jeong, C.S., & Choi, H.S. 2000. Identification of nitric oxide synthase in

Flammulina velutipes. Mycologia (92): 1027-1032. Spiro, S. 2007. Regulators of bacterial responses to nitric oxide. FEMS Microbiology

Reviews 31(2): 193-211.


- 212 -

Stakman, E. C., & Jensen, L. 1915. Infection experiments with timothy rust. Journal of Agricultural Research 5(5): 211

Stamler, J. S., Simon, D. I., Osborne, J. A., Mullins, M. E., Jaraki, O., Michel, T., & Loscalzo,

J. 1992. S-nitrosylation of proteins with nitric oxide: synthesis and characterization of biologically active compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A 89(1): 444-448.

Stuehr, D. J. 1999. Mammalian nitric oxide synthases. Biochimica et Biophysica Acta

(BBA)-Bioenergetics 1411(2): 217-230. Suga, H., Ikeda, S., Taga, M., Kageyama, K. and Hyakumachi, M. 2002. Electrophoretic

karyotyping and gene mapping of seven formae speciales in Fusarium solani. Current Genetics 41: 254-260.

Szibor, M., Richter, C., & Ghafourifar, P. 2001. Redox control of mitochondrial functions.

Antioxidants and Redox Signaling 3(3): 515-523. Takaya, N. 2002. Dissimilatory nitrate reduction metabolisms and their control in fungi.

Journal of Bioscience and Bioengineering 94(6): 506-510. Takaya, N., Suzuki, S., Matsuo, M., & Shoun, H. 1997. Purification and characterization of

a flavohemoglobin from the denitrifying fungus Fusarium oxysporum. FEBS Letters 414(3): 545-548.

Tan, M. K. & Niessen, M. 2003. Analysis of rDNA ITS sequences to determine genetic

relationships among, and provide a basis for simplified diagnosis of Fusarium species causing crown rot and head blight of cereals. Molecular Genetics and Genomics 107: 811-821.

Te Biesebeke, R., Levasseur, A., Boussier, A., Record, E., Van den Hondel, C. A., & Punt,

P. J. 2010. Phylogeny of fungal hemoglobins and expression analysis of the Aspergillus oryzae flavohemoglobin gene fhbA during hyphal growth. Fungal Biology 114(2): 135-143.

Teunissen, H. A., Verkooijen, J., Cornelissen, B. J. & Haring, M. A. 2002. Genetic exchange

of avirulence determinants and extensive karyotype rearrangements in parasexual recombinants of Fusarium oxysporum. Molecular Genetics and Genomics. 268: 298-310.

Thompson, J. D., Higgins, D. G., & Gibson, T. J. 1994. CLUSTAL W: improving the

sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic acids Research 22(22): 4673-4680.

Turrà, D., & Di Pietro, A. 2015. Chemotropic sensing in fungus–plant interactions. Current

Opinion in Plant Biology 26: 135-140. Turrión-Goméz, J. L., & Benito, E. P. 2011. Flux of nitric oxide between the necrotrophic

pathogen Botrytis cinerea and the host plant. Molecular Plant Pathology 12(6): 606-616.

Turrión-Goméz, J. L., Eslava, A. P., & Benito, E. P. 2010. The flavohemoglobin BCFHG1 is

the main NO detoxification system and confers protection against nitrosative

Bibliografía

- 213 -

conditions but is not a virulence factor in the fungal necrotroph Botrytis cinerea. Fungal Genetics and Biology 47(5): 484-496.

Ullmann, B. D., Myers, H., Chiranand, W., Lazzell, A. L., Zhao, Q., Vega, L. A., Lopez-Ribot,

J. L., Gardner, P. R., & Gustin, M. C. 2004. Inducible defense mechanism against nitric oxide in Candida albicans. Eukaryot Cell 3(3): 715-23.

Urban, M., Daniels, S., Mott, E., & Hammond‐Kosack, K. 2002. Arabidopsis is susceptible

to the cereal ear blight fungal pathogens Fusarium graminearum and Fusarium culmorum. The Plant Journal 32(6): 961-973.

Valderrama, R., Corpas, F. J., Carreras, A., Fernández-Ocaña, A., Chaki, M., Luque, F., &

Barroso, J. B. 2007. Nitrosative stress in plants. FEBS Letters 581(3): 453-461. Vallance, P., & Collier, J. 1994. Biology and clinical relevance of nitric oxide. BMJ: British

Medical Journal 309(6952): 453. Van Schoonhoven, A., & Pastor-Corrales, M. A. 1987. CIAT. Standard evaluation of bean

germplasm. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), Cali, Colombia. Vasudevan, S. G., Armarego, W. L., Shawl, D. C., Lilley, P. E., Dixon, N. E., & Poole, R. K.

1991. Isolation and nucleotide sequence of the hmp gene that encodes a haemoglobin-like protein in Escherichia coli K-12. Molecular and General Genetics MGG 226(12): 49-58.

Vieira, A. L., Linares, E., Augusto, O., & Gomes, S. L. 2009. Evidence of a Ca 2+-NO-cGMP

signaling pathway controlling zoospore biogenesis in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. Fungal Genetics and Biology 46(8): 575-584.

Vinogradov, S. N. 2008. Chapter Thirty-One-Tracing Globin Phylogeny Using PSIBLAST

Searches Based on Groups of Sequences. Methods in Enzymology 436: 571-583. Vinogradov, S. N., Hoogewijs, D., Bailly, X., Arredondo-Peter, R., Guertin, M., Gough, J., &

Vanfleteren, J. R. 2005. Three globin lineages belonging to two structural classes in genomes from the three kingdoms of life. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A 102(32): 11385-11389.

Vinogradov, S. N., Hoogewijs, D., Bailly, X., Mizuguchi, K., Dewilde, S., Moens, L., &

Vanfleteren, J. R. 2007. A model of globin evolution. Gene 398(1): 132-142. Voigt, K., Schleier, S., & Brückner, B. 1995. Genetic variability in Gibberella fujikuroi and

some related species of the genus Fusarium based on random amplification of polymorphic DNA (RAPD). Current Genetics 27(6): 528-535.

Wang, J., & Higgins, V. J. 2005. Nitric oxide has a regulatory effect in the germination of

conidia of Colletotrichum coccodes. Fungal Genetics and Biology 42(4): 284-292. Wang, Y., Jiang, C. J., Li, Y. Y., Wei, C. L., & Deng, W. W. 2012. CsICE1 and CsCBF1: two

transcription factors involved in cold responses in Camellia sinensis. Plant cell Reports 31(1): 27-34.


- 214 -

Wittenberg, J. B., Bolognesi, M., Wittenberg, B. A., & Guertin, M. 2002. Truncated hemoglobins: a new family of hemoglobins widely distributed in bacteria, unicellular eukaryotes, and plants. Journal of Biological Chemistry 277(2): 871-874.

Wiemann, P., Brown, D. W., Kleigrewe, K., Bok, J. W., Keller, N. P., Humpf, H. U., &

Tudzynski, B. 2010. FfVel1 and FfLae1, components of a velvet‐like complex in Fusarium fujikuroi, affect differentiation, secondary metabolism and virulence. Molecular Microbiology 77(4): 972-994.

Wong, K. H., Hynes, M. J., & Davis, M. A. 2008. Recent advances in nitrogen regulation: a

comparison between Saccharomyces cerevisiae and filamentous fungi. Eukaryotic Cell 7(6): 917-925.

Woo, S. L., Zoina, A., Del Sorbo, G., Lorito, M., Nanni, B., Scala, F. & Noviello, C. 1996.

Characterization of Fusarium oxysporum f.sp. phaseoli by pathogenic races, VCGs, RFLPs, and RAPD. Phytopathology 86(9): 966-973.

Xiao, C.L., Chandler, C.K., Price, J.F., Duval, J.R., Mertely, J.C., & Legard, D.E. 2001.

Comparison of epidemics of Botrytis fruit rot and powdery mildew of strawberry in large plastic tunnel and field production systems. Plant Disease 85: 901-909.

Yedidia, I., Benhamou, N., & Chet, I. 1999. Induction of defense responses in cucumber

plants (Cucumis sativus L.) by the biocontrol agent.Trichoderma harzianum. Applied and Environmental Microbiology 65(3): 1061-1070.

Yoder, W. T. and Christianson, L. M. 1998. Species-specific primers resolve members of

Fusarium section Fusarium. Fungal Genetic Biology 23: 68-80. Zafra, A., Rodríguez-García, M. I., & Alché, J. D. 2010. Cellular localization of ROS and NO

in olive reproductive tissues during flower development. BMC Plant Biology 10(1): 36.

Zeier, J., Delledonne, M., Mishina, T., Severi, E., Sonoda, M., & Lamb, C. 2004. Genetic

elucidation of nitric oxide signaling in incompatible plant-pathogen interactions. Plant Physiology 136(1): 2875-2886.

Zhao, X. J., Raitt, D., Burke, P. V., Clewell, A. S., Kwast, K. E., & Poyton, R. O. 1996.

Function and Expression of Flavohemoglobin in Saccharomyces cerevisiae evidence for a role in the oxidative stress response. Journal of Biological Chemistry 271(41): 25131-25138.

Zhou, S., Fushinobu, S., Kim, S. W., Nakanishi, Y., Wakagi, T., & Shoun, H. 2010.

Aspergillus oryzae flavohemoglobins promote oxidative damage by hydrogen peroxide. Biochemical and Biophysical Research Communications 394(3): 558-561.

Zhou, S., Fushinobu, S., Nakanishi, Y., Kim, S. W., Wakagi, T., & Shoun, H. 2009. Cloning

and characterization of two flavohemoglobins from Aspergillus oryzae. Biochemical and Biophysical Research Communications 381(1): 7-11.

Zhou, Z., Takaya, N., Nakamura, A., Yamaguchi, M., Takeo, K., & Shoun, H. 2002.

Ammonia fermentation, a novel anoxic metabolism of nitrate by fungi. Journal of Biological Chemistry 277(3): 1892-1896.

Bibliografía

- 215 -

Zhou, Z., Takaya, N., Sakairi, M. A. C., & Shoun, H. 2001. Oxygen requirement for denitrification by the fungus Fusarium oxysporum. Archives of Microbiology 175(1): 19-25.

Zhu, H., & Riggs, A. F. 1992. Yeast flavohemoglobin is an ancient protein related to globins

and a reductase family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A 89(11): 5015-5019.

Zhu, J., Jambhekar, A., Sarver, A., & DeRisi, J. 2006. A Bayesian network driven approach

to model the transcriptional response to nitric oxide in Saccharomyces cerevisiae. PloS One 1(1): e94.

Zumft, W. G. 1997. Cell biology and molecular basis of denitrification. Microbiology and

Molecular Biology Reviews 61(4): 533-616.

Date post:	06-Oct-2018
Category:	Documents
Upload:	vuongkhanh
View:	213 times
Download:	0 times

UNIVERSIDAD DE SALAMANCA - Repositorio Digital...

Documents